CN105949287B - 一种a型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用。本发明获得的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为P41。该蛋白具有很强的免疫原性，利用所述抗原蛋白制备的亚单位疫苗，能够明显增强鸡对A型副鸡禽杆菌的抵抗力，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可有效预防副鸡禽杆菌的感染。

Description

一种A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用

技术领域

本发明属于家禽传染病疫苗制备技术领域，尤其涉及一种A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用。

背景技术

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)为巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌，基本特征为无运动性、菌体呈多形性、强毒株带有荚膜。1932年De Blieck首先报道了自鼻道和鼻窦黏膜具有急性卡他性炎症、面部水肿和结膜炎的鸡群中首次分离出一种革兰氏阴性杆菌。最初的研究报道指出该病原菌生长条件中既需要X(血红素晶)因子，也需要V(烟酰胺腺嘌啉二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者将其命名为鸡嗜血杆菌(Haemophilus gallinarum)。1962年，Page等人研究发现所有IC病例的分离株生长只需要V因子。因此，有学者提议将只需要V因子的鸡嗜血杆菌命名为—个新种：副鸡嗜血杆菌(H.paragallinarum)，并被广泛接受。近年来，在南非、墨西哥等地已从患鼻炎的鸡中分离到不依赖V因子的副鸡嗜血杆菌菌株。因此，严格按照在体外生长因子需要进行嗜血菌的分类并不科学。2005年，Blackall等将副鸡嗜血杆菌的名称改为副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum)。

副鸡禽杆菌作为鸡的一种重要的呼吸道病原菌，常引起鸡的传染性鼻炎(infectious coryza,IC)，该病在世界范围内广泛传播，给养鸡业造成愈来愈严重的经济损失。目前国内已有许多养鸡场发生该病的报道。从感染部位来看，副鸡禽杆菌感染的是呼吸系统中最前沿的部位--鼻道和鼻窦黏膜，可以说是呼吸道疾病的门户病。这第一屏障被破坏，其他病原的感染率就大大增加。若与其它病原如鸡传染性支气管炎病毒、鸡支原体、鸡传染性喉气管炎等并发感染后引起鸡呼吸道疾病综合征，会给养鸡业造成更大的损失。各种日龄的鸡都易感该菌，常见于13周龄以上的鸡，通常表现为低死亡率和高发病率，产蛋率下降10％～40％。该病病理变化主要表现在上呼吸道急性卡它性炎症典型症状是黏液性鼻窦炎，鼻窦黏膜水肿充血、黏膜杆状细胞渗出，并且伴随有异噬性白细胞和巨噬细胞，产生典型的鼻炎病变。临床表现为面部单侧或双侧肿胀、流鼻涕，食欲下降、产蛋率下降。

鸡传染性鼻炎是一种呼吸道传染病，目前主要靠灭活疫苗来控制。灭活疫苗的免疫效果可能与所激发的黏膜抗体相关。研究表明A、B、C三个血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的灭活菌体不存在型间交叉免疫，只存在型内交叉免疫保护。目前国际上普遍使用的灭活疫苗绝大多数都包含了A型和C型，随着国内外陆续发现有大量B型Apg的流行和发生，国际上影响较大的疫苗公司已经开始提供包含A、B、C三种血清型的三价灭活疫苗。另一方面，由于副鸡禽杆菌含有LPS等毒素物质，大量接种所带来毒副作用也会影响鸡的产蛋与生长，因此导致了生产上免疫失败时有发生。鸡传染性鼻炎灭活疫苗对野外鸡群感染的预防效果大约为70-80％，在其效力检验中由于环境和评价方法的不尽一致可能会有不同的结果。

因此，需要研究更为安全有效的副鸡禽杆菌疫苗，既不影响鸡的产蛋与生长，又能提高对鸡传染性鼻炎的防疫效果。

发明内容

为弥补现有的副鸡禽杆菌疫苗免疫效果欠佳的不足，本发明提供一种人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，该抗原蛋白免疫原性强，能够覆盖多种副鸡禽杆菌变异株，利用该抗原蛋白可制备对A型副鸡禽杆菌预防效果显著的亚单位疫苗。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

一种A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，其活性组分包括权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。

所述A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的终浓度为10μg/ml。

用于编码所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因。

所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种表达权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组表达载体，其特征在于，其表达外源蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述重组表达载体是大肠杆菌重组表达载体pET28a-P41，是利用NcoI和XhoI酶切获得SEQ ID NO：2所示的核苷酸片段，并连接到pET28a的NcoI与XhoI酶切位点之间所得。

一种表达权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，其包含权利要求7所述的重组表达载体pET28a-P41。

权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获得权利要求6或7所述的重组表达载体，导入到表达系统中诱导表达获得所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。

本发明利用在线抗原表位预测软件http://www.cbs.dtu.dk/services/ BepiPred/，对A型副鸡禽杆菌Hmtp210的基因(GenBank:KJ867495.1，全长6129bp)及其全蛋白序列(2042个氨基酸残基)进行抗原表位分析，筛选免疫原性较强的抗原表位，并根据经验截取其中部分抗原表位，以便所得的抗原蛋白的大小适合于大量制备并具有良好的免疫活性，最后将优化的各抗原表位进行拼接，获得了SEQ ID NO：1所示的一段融合肽，作为人工A型副鸡禽杆菌抗原蛋白，命名为P41。对该抗原蛋白P41的抗原特性进行实验分析，Western Blotting实验证明了该抗原蛋白具有较好的免疫原性，使用该抗原蛋白免疫试验鸡后能保护试验鸡只不受同型副鸡禽杆菌感染。

实验数据还表明，该抗原蛋白P41能够针对多株流行的副鸡禽杆菌，如Hp8、221、0083等A型菌株，且保护效果优于全菌常规灭活疫苗。利用本发明的抗原蛋白P41制备亚单位疫苗，能够明显增强鸡对副鸡禽杆菌的抵抗力，有效预防副鸡禽杆菌的感染。在本发明的一个实施例中，攻毒保护率实验表明，采用P41抗原蛋白免疫的鸡群在A型副鸡禽杆菌攻毒后，所有鸡只没有出现鼻炎症状，保护率为100％；采用全菌常规灭活疫苗免疫的鸡群在攻毒后3天内有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70～80％；而未进行免疫的对照组鸡群在攻毒后全部出现鼻炎症状，发病率为100％。免疫组与非免疫组的保护率有极显著差异。因此，本发明的抗原蛋白是一种很好的免疫保护性抗原，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可以作为副鸡禽杆菌亚单位疫苗的候选抗原。

本发明还提供一种副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其活性组分包括上述副鸡禽杆菌抗原蛋白P41。在本发明的一些实施例中，将所述抗原蛋白P41与弗氏完全佐剂或不完全佐剂进行等体积混合乳化，制备副鸡禽杆菌亚单位疫苗。在本发明的另一些实施例中，所述抗原蛋白P41还可以与本领域已知的能够作为禽类疫苗的其它蛋白或灭活菌联用，制备联合疫苗。

所述亚单位疫苗中副鸡禽杆菌抗原蛋白的终浓度优选为10μg/ml。

本发明还提供所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的制备方法。其表达系统可以采用原核表达系统或真核表达系统，原核表达系统优选大肠埃希氏菌BL21(DE3)，真核表达系统可以是酵母菌或原生质体。相应地，选用与之匹配的表达载体、转化条件、表达条件及蛋白提取方法进行抗原蛋白的制备。

附图说明

图1.本发明实施例提供的pET28a质粒图谱。

图2.本发明重组抗原蛋白P41基因PCR扩增结果，其中1为目的基因的扩增片段，M为DNA分子量标准。

图3.表达质粒pET-28a双酶切鉴定结果，1为pET-28a质粒的NcoI/XhoI双酶切结果；M为DNA分子量标准。

图4.pET-28a-p41NcoI/XhoI双酶切鉴定结果，1为重组质粒的双酶切结果；M为DNA分子量标准。

图5.本发明重组蛋白SDS-PAGE分析图，其中M为蛋白分子量标准；1为诱导前总蛋白；2为37℃诱导后裂解上清；3为37℃诱导裂解后沉淀。

图6.重组蛋白纯化过程SDS-PAGE分析图，其中M为蛋白标准分子量，1为10mM咪唑洗脱液，2为25mM咪唑洗脱液，3为100mM咪唑洗脱液，4为500mM咪唑洗脱液。

图7.本发明重组抗原蛋白P41Western-blotting检测结果，其中，M为蛋白标准分子量，1为纯化后的P41抗原蛋白。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不以任何方式限制本发明的范围。

实验材料

1.质粒与菌株

本发明采用的pET28a质粒(Pharmacia公司产品，购自北京百灵克生物技术有限责任公司)；图1为本发明实施例提供的pET28a质粒图谱。

大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态购自北京天根生物技术有限公司。

本发明所用菌株为副鸡禽杆菌221，0083、Hp8、Modesto菌株，购自中国北京中国兽医药品监察所，属于商业菌株。

2.主要试剂与耗材

氯化钠、EDTA二钠盐、乙醇、甲醇、丽春红S、三氯乙酸(TCA)，购自上海国药公司。

Tris碱(Tris-HCL)、二硫苏糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸钠、乙酸钠，购自上海生工生物工程技术有限公司。

甘氨酸、考马斯亮蓝R-250，购自AMRESCO公司。

牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制剂(PMSF)、甲醛，购自Sigma公司。

蛋白酶K(贮存液浓度为20mg/ml，使用液浓度为1mg/mI)，购自上海华舜生物工程有限公司。

卡纳青霉素(kanamycin)、胎牛血清、诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，购自Invitrogen公司。

吸头与离心管，购自AxyGen公司。

Taq酶及10Taq酶Buffer、NcoI、Xho I等核酸内切酶及相关Buffer、T4连接酶及10×T4连接酶Buffer、Rnase、DNA marker(DL-2000、DL-15000)均为宝生物(大连)有限公司产品。

柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡IgG购自Sigma公司。

底物液配制：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄.12H₂O 14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。

大肠杆菌培养基：LB液体培养液及固体培养基：每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

副鸡禽杆菌培养基TSB、TSA，及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。

纯化副鸡禽杆菌抗原蛋白采用Sepharose 4B纯化柱(Amershan pharmacia公司产品)购自北京百灵克生物技术有限公司。

PBS缓冲液：NaCI 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

Western-blotting缓冲液：

电转缓冲液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇。配制1000mL转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37g SDS，加200mL甲醇，加ddH₂O至总量为1 000mL。

TBS(pH8.0)缓冲液：10mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl。

TBST缓冲液：在上述TBS中加入终浓度为0.05％Tween-20即可。

丽春红S(10×)贮存液：2g丽春红S，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加dd H₂O至100mL。

3.试验动物：6周龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通SPF鸡实验动物中心。

本发明实施例中未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可以商购获得，或通过本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、副鸡禽杆菌抗原表位的预测

利用在线预测软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)对A型副鸡禽杆菌221株外膜蛋白的编码基因(GenBank No.KJ867495.1)进行抗原表位预测，根据预测结果多次优化，从获得的几百个抗原表位中筛选免疫原性较强的表位，根据经验截取其中部分表位，使最后拼接而成的抗原蛋白易于表达并具有良好的免疫活性。

将优化的抗原表位序列进行拼接，获得了副鸡禽杆菌重组抗原蛋白P41，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2、副鸡禽杆菌重组抗原蛋白P41的原核表达

1.目的基因及其引物的合成

将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列送华大科技(北京)有限公司进行全序列合成，得到长度为1085bp的副鸡禽杆菌重组抗原蛋白P41的目的基因。

根据目标基因的序列设计上、下游引物，并在上、下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点，得到SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物，由华大科技(北京)有限公司合成。

2.重组表达质粒的构建

2.1目标蛋白编码基因的PCR扩增

以步骤1中人工合成的P41目的基因为模板，按照下列反应体系和程序进行PCR扩增，获得大量的目的基因片段。

PCR反应体系：

PCR各个成分的用量：(其中引物浓度为1OD溶于400μl ddH₂O)

PCR扩增程序：

2.2换载酶切

将步骤2.1中获得的PCR产物按照下列反应体系和反应条件进行酶切。

PCR产物片段酶切体系(50ul)：

以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h。

2.3酶切后的PCR产物回收

采用北京天根生化技术有限公司的普通DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照试剂盒说明书的步骤进行，具体操作如下：

(1)用0.8％的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5ml灭菌离心管中，称取重量。

(2)向离心管中加入3倍体积的溶胶液；(如重为0.1g的凝胶，体积可视为100μl，依此类推)。55℃-60℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未完全溶解的胶块，可多放置几分钟或是补加溶胶液，直至胶块溶解完全(若胶块的体积过大，可先将胶块切成碎块)。

(3)将向吸附柱中加入上步所得的溶液(吸附柱预先放入收集管中)，室温静置1min，然后12000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱重新放回到收集管中。

(4)向吸附柱中加入700μL的漂洗液(已加入无水乙醇)，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液。

(6)将吸附柱放回收集管中，12000r/min空离心2min，尽量的去除漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放入一个无菌的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000r/min离心2min收集DNA溶液。

离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

结果参见图2，图2为本发明重组抗原蛋白P41基因PCR扩增结果，由图2可知，PCR扩增结果显示该片段的大小约为1085bp左右，与理论上预期的Apg P41基因序列大小1085bp基本一致。

2.4表达载体的酶切及回收

载体的酶切体系(50μl)：

以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h。

PET28a酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。回收酶切的载体片段，方法及步骤同2.3PCR产物回收的方法及步骤。

2.5目的片段与载体连接

将回收纯化好的目的基因片段和载体按照下列体系和条件进行连接。

连接体系(20μl)：

上述连接混合液放在22℃PCR仪1h即可。

2.6转化并筛选阳性克隆

取感受态细胞Top10 100μl加入到1.5ml EP管中，将连接后的重组质粒pET28a-P41各5-10μl加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90sec，冰浴3min-5min。加入400μl LB，于37℃200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4℃25000rpm离心10min，弃去400μl上清，用剩余的100μl重悬沉淀并涂布于含有25μg/ml Kana的LB琼脂平板。37℃增殖1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养1 4h-1 6h至菌落出现。

2.7重组质粒的酶切鉴定

质粒的提取：使用碱裂解法(参照《分子克隆实验指南》第三版.黄培唐等译，北京，科学出版社，2002版介绍的方法)进行，具体操作步骤如下：

(1)用灭菌牙签在LB平板上随机挑取数个单茵落，分别接种于3ml 25μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

(2)将菌液转入1.5ml离心管内，于4℃8000rpm离心1-3min，弃上清，再将剩余的1.5ml菌液重复离心，倒立离心管于吸水纸上，使液体流尽。

(3)加100μl冰预冷的溶液I，涡旋使菌体充分悬浮，再加入200μl新配制的溶液II，反复颠倒离心管数次，冰浴5min，最后加150μl冰预冷的溶液III，温和颠倒离心管数次，冰浴10min。

(4)于4℃以12000rpm离心10min，吸取上清至另一支1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混和均匀，室温静置5min。

(5)室温12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，按照常规真空干燥或自然干燥方法干燥。

(6)沉淀用200μl含Rnase(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解，56℃水浴30min或37℃水浴1h以除去RNA。

(7)加7.5mol/L NH₄Ac 100μl，室温静置5min，再于室温12000rpm离心5min。

(8)吸取上清到另一1.5ml的EP管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，冰浴置10min。

(9)于4℃12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20μl ddH₂0或TE(pH8.0)，置-20℃冰箱保存备用。

重组质粒的双酶切鉴定：利用NcoI+XhoI酶切重组质粒，酶切后应出现预期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。

挑取PCR鉴定的阳性菌落，提取质粒，分别用NcoI和XhoI对重组质粒进行双酶切，结果参见图4。由图4可知，pET28a质粒片段大小为5369bp，P41基因的大小为1085bp，与预期结果一致。

3.重组表达菌株的构建

取感受态细胞BL21(DE₃)100μl加入到1.5ml EP管中，将重组质粒pET28a-P41各0.5μl加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3min-5min。

将其涂布于含有25μg/ml Kana的LB琼脂平板。37℃置1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。

4.目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化

4.1目的基因的诱导表达：将含重组抗原蛋白pET28a-P41的表达菌株接种于含有25μg/mlKana的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μl接种于10mL含有25μg/ml Kana的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0.8mmol，继续培养3h后收集菌体。

4.2表达产物的SDS-PAGE电泳分析

(1)SDS-PAGE及Western Blot相关溶液配制

10％过硫酸胺(APS)：过硫酸胺0.1g，加ddH₂O至1ml于EP管中，现配现用。

1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：Tris 18.17g，溶于80ml ddH₂O中，浓HCl调pH至8.8，定容至100ml，室温保存。

1mol/L Tris-HCl(pH6.8)：Tris 12.1g，溶于80ml ddH₂O中，浓HCl调pH至6.8，定容至100ml，室温保存。

1mol/L Tris-HCl(pH7.5)：Tris 30.29g，溶于200ml ddH₂O中，浓HCl调pH至7.5，定容至250ml，室温保存。

10％SDS：SDS 10g，加ddH₂O定容至100ml，50℃水浴溶解后室温保存。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加ddH₂O定容至1000ml，临用时稀释5倍。

1mol/L DTT：称DTT 7.71g溶于50ml 0.01mol/LNaAc(pH5.2)后过滤除菌，分装成小份于-20℃保存。

2×SDS上样缓冲液：1mol/L Tris-HCl(pH6.8)10ml，SDS 4g，溴酚蓝0.2g，甘油20ml，加ddH₂O至100ml，临用时加1mol/L DTT使其终浓度为0.2mol/L。

考马斯亮蓝染液：甲醇30ml，ddH₂O 60ml，10ml冰乙酸，充分混匀后加入0.25g考马斯亮蓝，用滤纸过滤后至棕色瓶内室温保存。

脱色液：甲醇30ml，ddH₂O 60ml，10ml冰乙酸，充分混匀。

蛋白转印缓冲液：Tris 5.82g，甘氨酸2.93g，甲醇300ml，加ddH₂O定容至1000ml。

TBS：1mol/L Tris-HCl(pH7.5)10ml，NaCl 8.8g，加ddH₂O定容至1000ml。

TBST:20％Tween-20 2.5ml，加TBS定容至1000ml，充分混匀。

封闭液：5g脱脂奶粉加入到100ml TBS中，充分溶解后4℃保存。

稀释液：1g脱脂奶粉加入到100ml TBS中，充分溶解后4℃保存。

(2)SDS-PAGE电泳样品的制备：

将诱导后的重组大肠杆菌于8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mmol/LTris-Cl(pH7.5)重悬，并加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，离心30min。分别取少量裂解后的上清和沉淀，加入2×蛋白电泳上样缓冲液125μl，DTT 25μl及TE液100μl，震荡混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，进行SDS-PAGE电泳分析。

(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳

SDS-PAGE凝胶配制方法如表1所示：

表1 SDS-PAGE凝胶配制方法

15％的分离胶配制：将各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加纯化水。然后,再配制5％浓缩胶：将表中相关各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面(先将分离胶上面的纯化水倒干净)，灌满后插入加样梳。

待浓缩胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品：电泳电压200V，电流在20mA-40mA范围内，电泳1h，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。

(4)聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色

卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液染色30min，再用脱色液进行脱色1min，观察结果。

结果如图5所示，将含有阳性重组质粒的大肠埃希菌以1mM IPTG诱导37℃诱导表达后，并经SDS-PAGE检测，结果约在41Ku处见表达条带，与预期蛋白大小相一致，未诱导菌没有此蛋白。诱导后裂解上清中的蛋白含量高于沉淀，纯化时可以直接使用裂解上清，省去包涵体变性复性的步骤。

4.3重组蛋白的制备及纯化

1)挑取含阳性重组表达质粒的重组菌的单菌落，接种于3mL Kana/LB培养基中，37℃活化过夜后，1:100稀释到Kana/LB中，37℃、230r/min振摇培养至对数生长期(OD₆₀₀ 0.6～1)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃、230r/min振摇诱导培养6-8h。分别于诱导前和诱导后不同时间取出1mL,5,000r/min离心10min收集菌体，弃上清后加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，用12％的十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检查，并用Quantity One-4.3.1(BIO-RAD)软件分析表达产量。

2)收集500mL经诱导表达6h后的菌液，8000r/min离心10min，沉淀用5mL的10mmol/L PBS溶解，超声波破碎后，12,000r/min离心10min后，收集每次离心后的上清，然后进行SDS-PAGE电泳检测。

3)利用镍琼脂糖亲和层析原理处理经超声波裂解后的菌体上清液，具体操作如下：

①取5mLNi-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。

②样品(裂解液上清)上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。

③10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子,流速10mL/min。

④Wash Buffer洗杂,流速5ml/min，收集洗脱液。

⑤Elution Buffer洗脱,流速2ml/min，收集洗脱液。

⑥将纯化后的蛋白置于透析袋中，在PBS,缓冲液(pH＝7.4)中缓慢透析，收集透析后的样品进行SDS-PAGE分析。

注：Binding Buffer(PBS，0.5％Triton X-100，pH＝7.4)

Wash buffer-10(PBS，10mM咪唑，pH＝7.4)

Wash buffer-25(PBS，25mM咪唑，pH＝7.4)

Elution Buffer-100(PBS，100mM咪唑，pH＝7.4)

Elution Buffer-500(PBS，500mM咪唑，pH＝7.4)

结果如图6所示，浓度为500mM咪唑的洗脱液洗脱效果最好；P41蛋白经纯化后，获得了较纯的目的蛋白。

实施例3、重组抗原蛋白的特性分析

1.用Western-blot方法分析重组抗原蛋白的抗原性

将上述纯化的重组抗原蛋白P41按照常规方法进行SDS-PAGE电泳，其步骤是：

1)转移：切出6张Whatman 3M滤纸和1张硝酸纤维膜(NC膜)，滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶，用铅笔在滤膜一角作标记，确保转印后膜与凝胶的相对方向；将硝酸纤维膜在纯化水中浸泡5min；在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液，将6张Whatman 3M滤纸浸泡于其中。然后按照如下步骤安装转移电泳槽：平放石墨电极的底座(阳极)，依次放3层3M滤纸、硝酸纤维膜、聚丙烯酰胺凝胶和3层3M滤纸。彻底排除各层间的气泡：将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极一转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65mA/cm²-1.0mA/cm²的参数接通电流，电泳转移0.5h-2h。

2)丽春红染色：转移结束后，取下NC膜，于去离子水中漂洗2次-3次后，转移至丽春红染色液中染色5min-10min，观察转印效果，并用铅笔标出蛋白Marker位置；室温下用去离子水漂洗硝酸纤维膜直至颜色褪去；将NC膜置于5％的脱脂奶粉中，室温封闭2h；洗膜：弃封闭液，用1×TBST洗NC膜3遍，每次5min；

3)一抗孵育：将NC膜放入用5％的脱脂奶粉稀释的鸡抗Apg型菌阳性血清(本实验室用Apg 221株免疫SPF鸡制备，可对外提供；也可以自己制备)(体积比1:50)，37℃孵育1h；

洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min：

4)二抗孵育：将膜转入5％的脱脂奶粉稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG抗体(体积比1：5000)，37℃孵育2h；洗膜取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min；

5)显色：将NC膜置于新配置的DAB显色液中，置暗处显色，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用1×TBST、冲洗以终止反应。

2.重组蛋白抗血清的制备

1)疫苗的制备及免疫试验

重组抗原蛋白疫苗的制备：将重组抗原蛋白P41与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中抗原蛋白终浓度为10μg/ml。第二次免疫用疫苗采用弗氏不完全佐剂。

免疫方法：给所述的42日龄试验SPF鸡接种弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白疫苗(接种量为0.2ml/只)；2周后腹腔接种弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白疫苗(接种量为0.2ml/只)；间隔10天后于翅静脉采血，收集血清。

血清特异性抗体的检测：采用ELISA方法，具体步骤为：

使用纯化的重组抗原蛋白P41 1μg/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA 37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装于-20℃保存。

将加强免疫一周后的鸡采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设弗氏佐剂对照和空白对照。

37℃反应30min。

洗板3次后加入体积比1:5,000稀释的兔抗鸡IgY(H+L)-HRP，37℃反应30min。

洗板5次后加100μl底物液，避光显色10min后加入2％H₂SO₄终止反应，于630nm读数。

样品与对照组OD值之比大于2的血清判为血清ELISA抗体阳性。

本发明重组抗原蛋白P41Western-blotting检测结果参见图7。由图7可知，重组质粒表达蛋白的大小为41Ku，而采自鸡康复阳性血清与表达蛋白约在41Ku处发生了反应与预期结果相符。说明本发明的重组抗原蛋白具有良好的抗体结合活性。

实施例4、重组抗原蛋白对SPF鸡免疫效力试验

1.重组抗原蛋白疫苗制备及免疫方法

1.1重组抗原蛋白疫苗的制备

将重组抗原蛋白P41与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中抗原蛋白终浓度为10μg/ml用于首次免疫，第二次免疫使用弗氏不完全佐剂，其余组分与首免相同。

全菌灭活疫苗制备：将副鸡禽杆菌221株菌经纯培养后，挑取单个菌落8～10个，涂于TSA平板上(含10％灭活牛血清)。37℃培养16h～18h后，用灭菌的0.01mol/L PBS将平板上的菌苔洗下，稀释至7.5×10⁹cfu/ml，用甲醛灭活(3‰)24h～48h，然后与弗氏佐剂按1：1体积混合乳化，终浓度达到3.0×10⁹cfu/ml。

1.2免疫方法

42日龄SPF试验鸡90只，分为3组，每组30只。分别是P41蛋白组，全菌灭活菌苗组和PBS对照组。各组试验鸡胸部肌肉分别免疫弗氏佐剂乳化的亚单位疫苗(P41)、全菌灭活疫苗(221)或PBS各0.5ml/只；4周后相同剂量、相同途径加强免疫。期间每两周翅静脉取血，用于血清特异性抗体的监测。

血清抗体的检测采用ELISA方法，同实施例3。

1.3免疫鸡攻毒试验

对加强免疫4周后的SPF鸡进行攻毒试验。各试验组内再分成3组进行攻毒，每组10只，分别在眶下窦接种1×10⁶CFU剂量的A型副鸡禽杆菌株菌221株，Hp8株和0083株。连续观察三天，记录试验鸡的临床特征及死亡情况，评价重组抗原蛋白的免疫保护力，结果参见表2，表2为本发明重组蛋白P41亚单位疫苗免疫SPF鸡后对Apg菌株攻毒的保护结果。

表2本发明重组蛋白P41免疫SPF鸡后对Apg菌株攻毒的保护结果

*重组蛋白免疫组获得免疫保护的试验鸡数与PBS对照组比较，差异显著。

由表2可知，本发明提供的重组蛋白作为抗原的疫苗免疫效果显著。分别用原核表达的重组蛋白P41免疫，2次免疫后用A型Apg强毒攻击，非免疫对照组所有试验鸡陆续发病。P41免疫组A型攻毒后没有鸡只表现出鼻炎症状，保护率为100％；全菌灭活疫苗免疫组在攻毒后3天内有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70～80％。重组蛋白的保护率优于全菌灭活疫苗的保护效果，与非免疫组相比，有极显著差异。由于纯化蛋白不含全菌体所携带的脂多糖等成分，本发明制备的亚单位疫苗没有副反应，而全菌灭活疫苗会有一过性食欲下降，精神萎靡等副反应。从制备成本上说，亚单位疫苗由于培养诱导容易，培养基便宜，容易纯化等特点，也低于常规灭活菌苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，其活性组分包括权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。

3.根据权利要求2所述的A型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的终浓度为10μg/ml。

4.用于编码权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.一种表达权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组表达载体，其特征在于，其表达外源蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，是大肠杆菌重组表达载体pET28a-P41，是利用NcoI和XhoI酶切获得SEQ ID NO：2所示的核苷酸片段，并连接到pET28a的NcoI与XhoI酶切位点之间所得。

8.一种表达权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，其包含权利要求7所述的重组表达载体pET28a-P41。

9.权利要求1所述的人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获得权利要求6或7所述的重组表达载体，导入到表达系统中诱导表达获得所述人工A型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。