CN102007414A - 副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒 - Google Patents

副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN102007414A
CN102007414A CN2009801131708A CN200980113170A CN102007414A CN 102007414 A CN102007414 A CN 102007414A CN 2009801131708 A CN2009801131708 A CN 2009801131708A CN 200980113170 A CN200980113170 A CN 200980113170A CN 102007414 A CN102007414 A CN 102007414A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
peptide
acid sequence
seq
sequence shown
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801131708A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102007414B (zh
Inventor
牛岛稔大
今村孝
坂元隆一
坂口正士
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Original Assignee
Common financial group legal person chemical and serum therapy research institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Common financial group legal person chemical and serum therapy research institute filed Critical Common financial group legal person chemical and serum therapy research institute
Publication of CN102007414A publication Critical patent/CN102007414A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102007414B publication Critical patent/CN102007414B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1242—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/23—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from birds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/14—Disorders of ear, nose or throat

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒。具体而言，本发明提供：副鸡禽杆菌抗体的检测方法，该方法包含通过ELISA法检测由副鸡禽杆菌A型菌或/和C型菌的菌体外膜蛋白诱导的抗体，其中，所述ELISA法是以含有该外膜蛋白的非同源区域或其一部分的氨基酸序列的肽作为抗原；以及该方法中使用的检测试剂盒。

Description

副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及副鸡禽杆菌抗体的检测方法和检测试剂盒。具体来说，本发明涉及：副鸡禽杆菌抗体的检测方法，该方法包含通过ELISA法检测由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，以下也称为A.pg。旧名为副鸡嗜血杆菌(Hemphilus paragallinarum))A型菌和/或C型菌的菌体外膜蛋白(以下也称为“HMT p210多肽”)诱导的抗体，其中，所述ELISA法以含有该外膜蛋白的非同源区域或其一部分氨基酸序列的肽作为固相抗原；以及该方法中使用的检测试剂盒。根据构成该肽的氨基酸残基数，肽以二肽、三肽、寡肽、多肽等名称称呼，本发明中不对它们进行区别，均定义为肽。
背景技术
由于感染A.pg而发病的鸡传染性鼻炎是鸡的重要的呼吸系统疾病。鸡传染性鼻炎发病鸡的主要症状是鼻液流出、呈现颜面肿胀或者流泪。鸡传染性鼻炎导致鸡的生长率降低、产蛋开始的延迟、产蛋率降低或产蛋停止，其经济损失较大。
Page等人将A.pg分类为A、B和C型三种型(非专利文献1)，Sawata等人将其分类为1型和2型两种型(非专利文献2)。之后，Kume等人报道：Page等人的A型相当于Sawata等人的1型，Page等人的C型相当于Sawata等人的2型(非专利文献3和4)。目前，A.pg的A型(1型)菌(以下也称为“A.pg-A型菌”)和C型(2型)菌(以下也称为“A.pg-C型菌”)成为鸡传染性鼻炎的主要病因菌。
关于鸡传染性鼻炎的预防，以往广泛使用将A.pg-A型菌或A.pg-C型菌的菌体用福尔马林、硫柳汞(thimerosal)等灭活得到的疫苗。但是，在给予这些疫苗时，存在在接种鸡的局部形成坏死病灶(非专利文献5)等的副作用的问题，人们强烈期望开发安全性高的疫苗。
在上述状况下，人们开发了以下的疫苗等：组分疫苗(component vaccine)，只从菌体或培养上清中取出保护性抗原(protective antigen，感染防御抗原)即有效成分(component，组分)，制成疫苗；重组疫苗，通过基因重组技术克隆编码保护性抗原的基因，使该基因在细菌、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等中表达，纯化大量表达的表达产物，将其作为疫苗；或者是载体疫苗，将编码保护性抗原的基因插入到病毒载体等中。
例如德永等人从A.pg-A型菌的培养液中诱导生成红细胞凝集抑制抗体(HI抗体)，成功地纯化了可防御A.pg-A型菌引起的鸡传染性鼻炎的、来自该A型菌的分子量约130kDa的多肽(专利文献1)。并发现，克隆编码该130kDa多肽的DNA片段并在大肠杆菌中表达的该重组蛋白可以防御副鸡禽杆菌A型菌引起的鸡传染性鼻炎的感染。进一步以编码130kDa多肽的DNA片段作为探针，鉴定了HMT p210基因，该基因编码含有2,042个氨基酸的A型HMT p210多肽(具有红细胞凝集活性的菌体外膜蛋白)。还同样地从C型菌中克隆了与该DNA片段杂交的DNA片段，获得了来自C型菌的C型HMT p210基因(专利文献2)。还有报道称，将A型菌和C型菌的HMT p210基因的开放阅读框(ORF，open reading frame)的核苷酸序列进行比较，两者的同源性占全体的80％，5’一侧的约3.4kbp的区域(以下称为区域1)和3’一侧的约1.2kbp的区域(以下称为区域3)具有非常高的同源性，由两个区域夹持的约1.5kbp的区域(以下称为区域2)则同源性低(专利文献2)。
据野吕等人的报道，德永等人发现的HMT p210基因作为型特异性的疫苗的靶区域是很重要的。野吕等人还报道：通过将编码A.pg-A型HMT p210多肽的HMT p210基因的一部分即由4,801bp～5,157bp的DNA片段所编码的肽免疫鸡，则该肽具有诱导对A.pg-A型菌的HI抗体以及疫苗的效果(专利文献3)。另外，野吕等人在第143回日本兽医学会(2007年4月3～5日举办，日本)上报道：通过将编码C型HMT p210多肽的HMT p210基因的一部分即由5.5kbp的DNA片段HPC5.5所编码的肽免疫鸡，同样具有诱导对A.pg-C型菌的HI抗体和疫苗的效果。
感染了A.pg的鸡有急性的过程，并且在发病后也难以诱导抗体生成，因此以往并未进行鸡传染性鼻炎的血清诊断。而给予了疫苗的鸡中，诱导出存在于A.pg菌体表面的对红细胞凝集素(Hemagglutinin，以下称为“HA”)的抗体，在体外评价疫苗效果时，可进行利用抗HA抗体的红细胞凝集抑制试验(以下也称为“HI试验”)。HI试验中使用了新鲜鸡红细胞或戊二醛固定的鸡红细胞，但也被认为有以下的缺点：(1)在A.pg-A型菌的疫苗效果的评价中必须采用新鲜的鸡红细胞，因此需要确保供血用鸡(在与病原体隔离的状态下的饲养管理)、采血和血液处理等烦杂且较为费事；(2)受到鸡红细胞批次的影响，并且抗体效价的判定是根据测定者主观进行判定，难以获得稳定的成绩等。
另一方面，Sun等人报道了利用型特异性单克隆抗体的封闭ELISA(B-ELISA)，以此作为代替HI试验的血清诊断法(非专利文献6)。B-ELISA是以将A型菌或C型菌体超声波破碎所得的破碎物作为抗原，使用与各血清型反应的单克隆抗体，竞争性检测血清中的抗体的ELISA法。本方法与HI试验相比，灵敏度高，具有可以对应多检体优点。但是必须进行血清的添加、单克隆抗体的添加、抗小鼠IgG-HRP标记抗体的添加和显色底物的添加这四个步骤，与常规的ELISA方式比较多一个步骤，操作烦杂。另外，为了采用本方法，还必须确保型特异性单克隆抗体。在制备试剂盒方面，除抗原固相化板、参照血清之外还必须制备单克隆抗体并附在试剂盒中。并且，该B-ELISA是在各血清中检测仅与一个单克隆抗体所识别的抗原表位相对的抗体的系统。在检测与一个表位相对的抗体的系统中，由于菌体的变异而失去该表位时，则无法检测菌体感染或疫苗接种抗体的危险性更高。
专利文献1：日本特开平10-84969
专利文献2：WO98/12331
专利文献3：日本特开2005-218414
非专利文献1：Am.J.Vet.Res.，23：85～95，1962
非专利文献2：Jpn.J.Vet.Sci.，40：645～652，1978
非专利文献3：Am.J.Vet.Res.，41：757～760，1980
非专利文献4：Am.J.Vet.Res.，41：1901～1904，1980
非专利文献5：Avian Dis.，15：109～117，1971
非专利文献6：Int.Ass.Bio.(IABS)35：317～320，2007
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供可分别区别对A.pg的A型菌和C型菌的抗体的抗体检测方法。具体来说，提供一种抗体检测方法，其特征在于：该方法使用可分别区别对A.pg的A型菌和C型菌的抗体的重组抗原肽。更具体地说，提供一种抗体检测方法，其特征在于：使用含有在A.pg的A型菌和C型菌的外膜蛋白之间同源性低的区域内的氨基酸序列的重组抗原肽。
解决课题的方法
本发明人等为了实现上述目的进行了深入的研究，结果发现：在作为疫苗抗原很重要的HMT p210基因所编码的p210多肽的偏离区域2的氨基酸序列的位置，含有在A.pg-A型菌和A.pg-C型菌之间同源的氨基酸序列(SEQ ID NO：1所述的A.pg-A型菌第243～273号氨基酸序列和SEQ ID NO：2所述的A.pg-C型菌第38～68号氨基酸序列的31个氨基酸中，29个氨基酸一致，参照图3)，并且发现该氨基酸序列形成表位。并且本发明人等还发现：在由德永等人定义的区域2的C末端区域的一部分含有在A.pg-A型菌和A.pg-C型菌之间同源性高的氨基酸序列。因此，在A.pg-A型菌和A.pg-C型菌的各HMT p210多肽中，制备不含有上述两个同源的氨基酸序列的肽，使用所得肽，通过在微量板上固相化的ELISA法进行抗体测定。结果确认：可分别特异性识别由来自A.pg-A型菌的疫苗和来自A.pg-C型菌的疫苗所诱导的抗体，从而完成了本发明。因此，本申请发明如下所述。
(1)副鸡禽杆菌抗体的检测方法，其特征在于，该方法包含使下述肽A或B的至少一种抗原与检体反应的抗体测定方法：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
(2)上述(1)所述的检测方法，其特征在于：肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。
(3)上述(1)所述的检测方法，其特征在于：肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。
(4)上述(1)所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
(5)上述(1)所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列的肽；
肽B：
为含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列的肽。
(6)上述(4)所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽。
(7)上述(5)所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列的肽。
(8)上述1～7中任一项所述的检测方法，其特征在于：肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
(9)上述1～8中任一项所述的检测方法，其特征在于：抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。
(10)上述1～9中任一项所述的检测方法，其特征在于：检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。
(11)副鸡禽杆菌抗体测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒使用下述肽A或B的至少一种作为抗原：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分、含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
(12)上述(11)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。
(13)上述(11)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。
(14)上述(11)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
(15)上述(11)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列的肽；
肽B：
为含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列的肽。
(16)上述(14)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽。
(17)上述(15)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列的肽。
(18)上述11～17中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
(19)上述11～18中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。
(20)上述11～19中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。
发明效果
根据本发明，可以提供副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒。本发明中使用的来自A.pg-A型菌和A.pg-C型菌的肽互相不含有同源的氨基酸序列，因此与由来自A.pg-A型菌的疫苗和A.pg-C型菌的疫苗所诱导的抗体分别特异性结合。因此，本发明的检测方法和试剂盒不仅是在单独将各疫苗给予鸡时，在给予将两者混合的疫苗时也可以分别识别并测定存在于鸡血清中的各个菌体的抗体效价。
另外，根据本发明，使用纯化重组抗原的结果，与使用A.pg菌体破碎物的以往的技术相比，可以使更高浓度的抗原固相化，因此可以构建抗体的检测灵敏度更高的抗体测定系统。另外，本申请发明的抗体的检测方法对于抗原肽具有识别A.pg的血清型的能力，因此与使用型特异性单克隆抗体的B-ELISA相比更为简便，且从菌体的抗原变异的角度考虑，可以更确实地检测出对A.pg的抗体。
并且，通过本发明的检测方法，不仅可以识别给予疫苗后的鸡血清，也可以识别A.pg感染鸡血清中的抗体。
附图说明
图1是表示HMT p210多肽及其片段以及各片段的位置关系的图。涂黑部分表示区域2内的同源序列，网格部分表示区域2的C末端同源区域。图中所述的氨基酸SEQ ID NO相当于专利文献2的序列表SEQ ID NO：1(A型菌)和序列表SEQ ID NO：5(C型菌)中公开的氨基酸SEQ ID NO。
图2是表示由大肠杆菌纯化的各多肽的SDS-PAGE结果的图。M：标志物，泳道1：P-AΔ6b-1b，泳道2：P-CΔ6b-1b
图3是表示由HMT p210基因编码的氨基酸序列的非同源区域中同源的氨基酸序列及其位置的图。图中所述的氨基酸SEQ ID NO相当于专利文献2序列表SEQ ID NO：1(A型菌)和序列表SEQ ID NO：5(C型菌)中公开的氨基酸SEQ ID NO。
图4是观察以A型菌攻击前血清的多肽P-AΔ6b-2#作为抗原的ELISA值与A型菌攻击后的防御发病的相关性的图。图中的“●”表示未发病的鸡，“○”表示发病的鸡。
图5是观察以C型菌攻击前血清的多肽P-CΔ6b-1b作为抗原的ELISA值与C型菌攻击后的防御发病的相关性的图。图中的“●”表示未发病的鸡，“○”表示发病的鸡。
具体实施方式
本申请发明的特征在于：通过以下述的肽作为抗原的抗体测定方法的副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒，所述肽是将由来自A.pg的HMT p210基因所编码的氨基酸序列中的少许存在于非同源区域中的A.pg-A型菌和A.pg-C型菌之间的同源的氨基酸序列除去而得到的肽。
本申请发明的副鸡禽杆菌抗体的检测方法中，使用由来自A.pg-A型菌和/或A.pg-C型菌的HMT p210基因所编码的氨基酸序列的非同源区域或其一部分作为抗原。这里，非同源区域定义为从夹持在5’一侧的约3.4kbp的DNA区域所编码的氨基酸序列(区域1)和3’一侧的约1.2kbp的DNA区域所编码的氨基酸序列(区域3)的两个区域的、约1.5kbp的DNA区域(区域2)所编码的氨基酸序列中除去C末端一侧的同源序列而得到的约1.3kbp的区域(SEQ ID NO：1(A型菌)和SEQ ID NO：2(C型菌))(参照图1)。以下，将编码该非同源区域的氨基酸序列的基因称为“A.pg-1.3基因”，在对A型菌和C型菌的两者进行区别时，分别称为“A.pg-A1.3基因”、“A.pg-C1.3基因”。
从A.pg感染鸡中分离的3株A型菌(221株、O53株和W株)的相当于HMT p210基因的非同源区域的核苷酸序列在O53株和W株之间完全一致，在两株和221株之间仅有一个碱基发生变异。而3株C型菌(53-47株、Modest株和NK-1株)之间的同源区域的核苷酸序列只是Modest株和NK-1株相对于53-47株有3个碱基(1个氨基酸)缺失。因此，可以说同一血清型之间的非同源区域高度保守，本申请发明中，可以使用同一血清型内的任何菌株。
A.pg-A1.3基因以及含有该基因的DNA片段可通过以下方法获得。A.pg的增殖可以使用适当含有聚胨、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、谷氨酸钠、酵母提取物、氯化钠、鸡汤、βNAD、鸡血清等的培养基。本申请发明中，为了进行小、中容量的菌体增殖，使用含鸡血清的鸡肉汤培养基(1000mL培养基中含有5g聚胨S、1g酪蛋白氨基酸、5g氯化钠、5g L-谷氨酸钠、1g葡萄糖、10g酵母提取物、175mL鸡汤、25mL鸡血清、0.025％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD))。培养条件通常在温度37℃、时间16～24小时的范围内设定，这可根据使用目的、培养形态、接种的菌量、培养基规模等适当调节。
培养液中的菌体通过离心(8,000rpm，20分钟)回收在沉淀物中。HMT p210基因可按照Sambrook等人叙述的常规的基因重组技术(Molecular Cloning，A Laboratory Manual Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，1989)，以由菌体提取的总RNA、mRNA或基因组DNA作为起始材料来制备。实际中可使用市售的试剂盒。例如RNA的提取可以使用TRIzol试剂(インビトロジエン公司)、ISOGEN(ニツポンジ一ン公司)、StrataPrep Total RNA Purification Kit(StrataPrep总RNA纯化试剂盒)(东洋纺)等的试剂，染色体DNA的提取可以使用セパジ一ン试剂盒(三光纯药)、ISOPLANT(和光纯药)，mRNA的纯化可以使用mRNA Purification Kit(mRNA纯化试剂盒)(アマシヤムバイオサイエンス公司)、Poly(A)Quick mRNA Isolation Kit(Poly(A)Quick mRNA分离试剂盒)(东洋纺)、mRNA Separator Kit(mRNA分离试剂盒)(クロンテツク公司)等的试剂盒，转换为cDNA可以使用SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning(インビトロジエン公司)、cDNA Synthesis Kit(cDNA合成试剂盒)(宝酒造)、SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits(SMART PCR cDNA合成和文库构建试剂盒)(クロンテツク公司)、Directionary cDNA文库构建系统(ノバジエン公司)、GeneAmp PCR Gold(アプライドバイオシステムズ公司)等。
更具体来说，使用セパジ一ン试剂盒(三光纯药)等，从通过离心回收的菌体中提取的染色体DNA，将其用适当的限制酶(优选使用EcoRI)切断，插入到市售的克隆载体中(例如，λgt11；ニユ一イングランドバイオラブス(NEB)公司)，制备DNA文库。以所得DNA片段为模板，使用LA Taq(タカラバイオ株式会社)，按照所附的流程，通过PCR法扩增各种大小的DNA片段。PCR中使用的引物可根据德永等人公开的来自A.pg-A型菌和A.pg-C型菌的HMT p210基因的核苷酸序列(专利文献1)设计。PCR用引物如果委托DNA合成受托机构(例如，シグマジエノシスジヤパン公司)等，则可以容易地获得。此时，在上游侧引物的5’末端和下游侧引物的5’可以附加适当的限制酶切位点的核苷酸序列。PCR扩增产物克隆到基因克隆载体、pCR-XL-TOPO(インビトロジエン株式会社)中，可获得插入了各种DNA片段的质粒pCRDNT。所得DNA片段的核苷酸序列先克隆到pBluescript II SK+(ストラタジ一ン公司)或pCR2.1-TOPO(インビトロジエン公司)中，然后由DNA测序仪(ABI Prism 377アプライドバイオシステムズ公司)确定。
如后所述，只要不会导致灵敏度降低或非特异性反应的增大，一部分中导入了氨基酸变异的肽也可以作为本申请发明的抗体测定方法中的抗原使用。在肽的特定的氨基酸中导入变异时，通常是采用向编码该肽的DNA片段的核苷酸序列中导入变异的位点定向诱变法(site-directed mutagenesis)。实际中可以使用应用了该技术的Takara公司的位点定向诱变系统(Site-Directed Mutagenesis System)(Mutan-Super Express Km、Mutan-Express Km、Mutan-K等)、Stratagene公司的QuickChange Multi位点定向诱变试剂盒、QuickChange XL位点定向诱变试剂盒、Invitrogen公司的GeneTailor位点定向诱变系统等市售的试剂盒，按照所附的流程来进行。
在获得编码在A.pg-A型菌和A.pg-C型菌之间不含有同源氨基酸序列的各种肽的氨基酸序列的DNA片段时，可以从非同源区域(分别为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列(A型菌)和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(C型菌))中设计引物，使其不含有上述同源序列，以上述A.pg-1.3基因以及含有该基因的DNA片段作为模板，通过常规的PCR法进行。如果是较短的氨基酸序列，则也可以通过人工合成制备该DNA片段。本申请发明中，表1显示了制备的DNA片段和引物。
将这样得到的DNA片段插入适当的表达载体中，将其导入宿主，由此可以进行各DNA片段的表达。表达载体例如可以使用pQE30(キアゲン公司)或pET22b(ノバジエン公司或タカラバイオ株式会社制备)等，也可以适当选择。外源蛋白或肽的表达常用细菌、酵母、动物细胞、植物细胞和昆虫细胞等，可以结合使用目的进行选择。在转化宿主细胞时可以利用公知的方法。例如可以利用磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用脂转染系统的脂质体的方法、原生质体的聚乙二醇融合法、电穿孔法等，可根据所使用的宿主细胞选择适当的方法。在表达本申请发明的各DNA片段时，可以使用可大量表达的大肠杆菌。关于大肠杆菌表达用，已经开发并销售具有trp启动子、T7启动子、cspA启动子等的各种表达载体，因此可以从中适当选择使用。根据表达载体，可选择适当的大肠杆菌、例如BL21、HMS174、DH5α、HB101、JM109等作为宿主。大肠杆菌的转化可以使用市售的感受态细胞，按照所附的方法进行。这样，可以获得生产目标多肽的重组大肠杆菌。在大肠杆菌的培养中所使用的培养基(例如，LB、SOC、SOB等)、转化体的选择所使用的试剂(例如氨苄青霉素等)以及诱导表达所使用的试剂(例如，吲哚乙酸(IAA)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG))通常可以使用市售商品。培养基的pH在适合大肠杆菌增殖的范围(pH 6～8)内使用。
表达目标肽(目标产物)的重组大肠杆菌的筛选如下进行。在表达诱导剂(本发明中使用的表达系统中使用IPTG)存在下、通过离心(10,000rpm，5分钟)回收培养、增殖的菌体，向其中加入一定量的蒸馏水，使其悬浮，然后通过超声波处理或者弗氏压碎器(French Press)、マントンゴリン(Manton Golin)等的匀浆器破碎菌体，通过离心(15,000rpm，15分钟)分离、回收在沉淀或上清中。蒸馏水中可以添加适当的表面活性剂(例如，Triton X100)、螯合剂(例如，EDTA)、溶菌酶等。对一定量的回收到上清和沉淀中的表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色，然后确认分子大小以及由染色图像确认目标产物的表达。关于目标产物的确认(或检测)除基于上述的分子大小的方法之外，还可以采取基于ELISA法、蛋白质印迹法、斑点杂交法等抗原抗体反应的方法。这均是检测在任何大肠杆菌中表达的外源蛋白或多肽时的常规方法，可以根据目标适当选择。
由重组大肠杆菌纯化目标产物时，通常采用将蛋白质化学中使用的纯化方法、例如离心、盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法、疏水层析法、羟基磷灰石法等方法组合的方法。所得蛋白质或多肽的量可使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc)、蛋白质测定试剂盒(BIO-RAD，Inc)等蛋白测定试剂进行测定。
为了使目标物的纯化容易进行，还可以以与其它多肽或肽融合的形式表达。表达上述融合蛋白的载体可以例举：可附加寡组氨酸的His-tag表达系统(ノバジエン公司)、可表达附加了FLAG标志的融合蛋白的系统(シグマ公司)、可制备与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白的GST融合蛋白质纯化系统(アマシヤムフアルマシア公司)、MagneHis蛋白质纯化系统(プロメガ公司)等。例如如在本发明的实施例中进行的，以与寡组胺酸的融合蛋白的形式表达后，使用镍亲和柱(GEヘルスケア バイオサイエンス公司)可以特异性纯化目标多肽。
如此得到的不含有A.pg-A型菌和A.pg-C型菌之间的同源氨基酸序列的区域的各种肽可用于鸡传染性鼻炎疫苗抗体的检测或用于进行A.pg感染鸡的血清学诊断的抗体测定。具体来说可以适用ELISA法、蛋白质印迹法、斑点杂交法等的抗体测定方法。需要应对多个检体时，优选采用使肽固相化的微量板法的ELISA法。
微量板中固相化的肽可以使用含有由A.pg-1.3基因所编码的氨基酸序列中的非同源区域的肽及其一部分。通常由6～10个左右的氨基酸可以形成被抗体识别的表位(在线上(http://www.genosys.jp/products/spots/spots_faq.html)公开了被抗体识别的表位有3～6个氨基酸即足够)，因此本申请发明中可以使用非同源区域的一部分、含有连续的6个氨基酸以上的氨基酸序列的肽。为了提高特异性，优选由含有非同源区域中的连续的10个氨基酸以上的肽，进一步优选由含有连续的20个氨基酸以上的肽形成表位。
最优选使用由AΔ6b-2#编码的多肽(P-AΔ6b-2#)、由CΔ6b-1b编码的多肽(P-CΔ6b-1b)、以及由AΔ7b-1b编码的多肽(P-AΔ7b-1b)、以及含有由包含它们的A.pg-1.3基因编码的氨基酸序列中的非同源区域的肽的一部分。只要不会导致在抗体检测方面出现障碍的灵敏度降低或非特异性反应增大，也可以使用这些肽的一部分中导入了氨基酸变异的变异肽。这些肽可以根据目的将两种以上的肽分别组合使用。例如确定鸡传染性鼻炎的病因菌时，优选单独使用各肽，或者分别独立使用将来自A.pg-A型菌的肽之间或者来自A.pg-C型菌的肽之间混合得到的混合物。如果只是要调查鸡传染性鼻炎感染的流行病学或鸡传染性鼻炎疫苗的效果，也可以进一步将来自A.pg-A型菌和A.pg-C型菌的混合物混合使用。
给予疫苗后的免疫血清通常可以以1～3次、2～4周的间隔将上述的肽与佐剂的混合物给予适当的动物皮下、皮内、腹腔内等，然后将采集的血液进行离心(14,000rpm，5分钟)获得。佐剂可以使用弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝(例如，ImjectAlum(ピア一ス公司))等。
副鸡禽杆菌感染动物的血清也可以同样地将血液离心获得。
更具体来说，可以进行各种方法的ELISA，可以是任何方法。例如首先将检体(免疫血清或A.pg感染血清)添加到将肽固相化的微量板中，清洗后添加标记的抗鸡抗体作为二次抗体。还可以通过与抗肽特异性抗体组合，通过竞争法的ELISA来实施，该竞争法的ELISA是将检体和标记抗肽(固相抗原)抗体同时或分别添加到使肽固相化的微量板中，或者，抗肽抗体未标记时，添加对抗肽抗体的标记二次抗体。
肽在微量板上的固相化通常通过以抗原量1～10μg/ml、在室温(25℃左右)下放置30分钟～2小时，或在低温(4℃左右)下放置12～24小时来进行。用于抑制非特异性反应的封闭试剂例如有：ブロツクエ一ス(雪印公司)、ELISA用封闭试剂(ロシユ·ダイアグノステイツクス公司)、牛血清白蛋白溶液、脱脂乳溶液等，可以适当选择使用。各反应后的清洗可使用PBS、TBS或其中含有Polysorbate(Tween 20)或防腐剂(叠氮化钠)等的试剂，反应终止可以使用2～3mol的硫酸进行。作为二次抗体，用HRP、荧光标记、RI、生物素化标记的抗鸡IgG单克隆抗体，例如抗鸡IgG-HRP(ベツチル公司)等市场有销售，因此可以使用上述抗体。例如HRP的底物有OPD(邻苯二胺)和TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)，分别以492nm、450nm测定吸光度。
首先，可以在微量板上固定肽的抗体，采用使上述肽与该抗体结合的双抗体夹层的ELISA法。这种情况下，肽的抗体可以使用多克隆抗体和单克隆抗体的任意一种。多克隆抗体可通过与上述免疫血清同样的方法获得，免疫所使用的动物例如有鸡、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猴等。单克隆抗体可以是从用A.pg菌体或多肽免疫的动物中采集脾细胞或淋巴细胞等抗体生成细胞，按照Milstein等人的方法(Method Enzymol.，73，3～46，1981)，与骨髓瘤细胞株等融合，通过制备生成本申请发明中使用的肽的抗体的杂交瘤来获得。还可以通过利用噬菌体展示技术的抗体制备技术(Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual Edited by Brian K.Kay等人、Antibody Engineering：A PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY等人、ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A.K.BORREBAECK)可以制备与本申请发明中使用的肽结合的抗体。
采用如此建立的ELISA法的抗A.pg抗体的测定方法可以用于疫苗抗体或由A.pg感染诱导的抗体的检测。以下按照实施例进一步详细说明本发明，但并不限于下述的实施例。
实施例1
A.pg-13基因及其区域内DNA片段的制备
按照德永等人的方法(日本特开平10-84969)制备A.pg-A型菌221菌株和A.pg-C型菌53-47株的基因组DNA文库。简单来说，使用セパジ一ン试剂盒(三光纯药)，从通过离心(8,000rpm，20分钟)回收的菌体中提取染色体DNA，用限制酶Sau3AI消化，制备DNA文库。以该DNA文库的DNA片段为模板，使用LA Taq(タカラバイオ株式会社)，按照所附的流程，通过PCR法扩增含有A.pg-1.3基因的一部分的片段。PCR反应是使用LA PCR试剂盒版本2(宝酒造制备)，在96℃下反应1分钟，然后将96℃40秒、56℃60秒、72℃120秒的反应进行30个循环，然后进行72℃10分钟的反应。图1表示各DNA片段的位置关系。各DNA片段的扩增以及其中使用的PCR引物如表1所示。各引物中附加了限制酶识别序列。
[表1]
  DNA片段   5’引物   3’引物
  AΔ6b-1b   5’AΔ6b-1b-P(SEQ ID NO：5)   3’AΔ6b-1b-P(SEQ ID NO：6)
  AΔ3-0   5’AΔ3-0-P(SEQ ID NO：7)   3’AΔ3-0-P(SEQ ID NO：8)
  AΔ5-0   5’AΔ5-0-P(SEQ ID NO：9)   3’AΔ5-0-P(SEQ ID NO：10)
  AΔ5-1   5’AΔ5-1-P(SEQ ID NO：11)   3’AΔ5-1-P(SEQ ID NO：12)
  AΔ6b-1b   5’CΔ6b-1b-P(SEQ ID NO：13)   3’CΔ6b-1b-P(SEQ ID NO：14)
  AΔ5-1   5’CΔ5-1-P(SEQ ID NO：15)   3’CΔ5-1-P(SEQ ID NO：16)
  AΔ6-0   5’CΔ6-0-P(SEQ ID NO：17)   3’CΔ6-0-P(SEQ ID NO：18)
  AΔ6b-2#   5’AΔ6b-2#-P(SEQ ID NO：19)   3’AΔ6b-2#-P(SEQ ID NO：20)
  AΔ7b-1b   5’AΔ7b-1b-P(SEQ ID NO：21)   3’AΔ7b-1b-P(SEQ ID NO：22)
实施例2
各DNA片段的表达
将实施例1所得的各DNA片段用适当的限制酶消化，通过0.8％琼脂糖电泳分离，使用Quantum Prep Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Co试剂盒洗脱并回收扩增片段。将所得片段预先用相同的限制酶消化，将5’末端与去磷酸化的的质粒pQE30(キアゲン公司制备，6个His-tag序列存在于紧邻起始密码子的下边)或pET22b连接，使用该片段转化大肠杆菌JM109株。进一步将含有扩增片段的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的Circle Grow培养基(フナコシ株式会社)中培养一夜，第二天加入IPTG，使终浓度为1mM，进一步培养2.5小时。离心(10,000rpm，5分钟)后舍弃上清，将沉淀物悬浮于培养液的1/10量的裂解缓冲液A(Lysis buffer A)(8M尿素、100mMNaH2PO4、10mM Tris、10mM咪唑，pH 8.0)中，溶解菌体。离心(15,000rpm，15分钟)后回收细胞裂解物上清。将回收的细胞裂解物上清与1mL Ni-NTA琼脂糖凝胶混合，使其吸附在凝胶上，然后填充到带有底栓的柱中。将柱清洗后用洗脱液(8M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris、10mM咪唑，pH 8.0)回收洗脱组分，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。A型、C型、各片段中作为ELISA抗原使用的AΔ6b-1b和CΔ6b-1b的表达产物的电泳图谱如图2所示。
实施例3
抗多肽鸡血清的制备
将实施例2所得的多肽P-AΔ5-1用PBS稀释，浓度为10μg/剂量，进一步加入氢氧化铝凝胶，终浓度为20％，将其以3周的间隔对5周龄的SPF鸡的颈部皮下进行免疫，共进行2次。对于其它多肽P-AΔ3-0、P-AΔ5-0、P-CΔ5-1和P-CΔ6-0用PBS稀释，浓度为10μg/剂量，然后制备与油佐剂乳化的乳化液(每1剂量(0.5mL)中含有0.01g抗原、0.001mL以下福尔马林、0.01mL Polysorbate 80、0.04mL失水山梨醇倍半油酸酯、0.36mL轻质液体石蜡、余量为磷酸缓冲液)，对5周龄的SPF鸡的颈部皮下给予1次。在9～11周龄时采血，得到各多肽的免疫血清。
实施例4
通过ELISA确认与各多肽免疫血清的反应性
将实施例2所得的多肽P-AΔ6b-1b、P-AΔ6b-2#、P-AΔ7b-1b和P-CΔ6-1b用50mM碳酸氢盐缓冲液稀释，浓度为1.0～2.5μg/mL，分别向96孔板中加入100μL并使其固相化。在室温下吸附1小时，然后舍弃反应液，用200μL的PBS-T(8.1mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、0.05％Tween 20)清洗，然后加入200μL含5％脱脂乳的PBS-T进行封闭。舍弃封闭液，将血清用含1％脱脂乳的PBS-T稀释50～100倍，向各孔中分别添加100μL，在室温下反应1小时。除去反应液后用PBS-T清洗3次，将抗鸡IgG-HRP标记抗体用含1％脱脂乳的PBS-T稀释10,000～20,000倍，分别添加100μL。在暗处、室温下反应1小时。除去反应液后用PBS-T清洗3次，分别添加100μL显色底物液(100mM柠檬酸、200mM磷酸氢二钠、0.004％邻苯二胺、过氧化氢)，在室温下反应30分钟。分别添加100μL 3M硫酸，终止显色。用96孔板读数仪(96well plate reader)(日本モレキユ一ラ一デバイス公司制备)测定492nm的波长，其结果如表2所示。
[表2]
Figure BPA00001237900700191
*1：按照实施例5的方法测定(其中，以血清稀释100倍、抗鸡IgG-HRP标记抗体稀释50,000倍实施)
*2：未进行
含有A.pg-A型菌的区域2的SEQ ID NO：1所述的第243～271号氨基酸序列和A.pg-C型菌的区域2的SEQ ID NO：2所述的第38～68号氨基酸序列(31个氨基酸中有30个氨基酸一致，参照图3)的同源氨基酸序列的多肽(P-AΔ6b-1b)与用含有区域2的多肽(P-AΔ3-0、P-AΔ5-1、P-AΔ5-0、P-CΔ5-1和P-CΔ6-0)免疫的任何血清均未发生反应。于此相对，不含有上述同源氨基酸序列的多肽(P-AΔ6b-2#、P-AΔ7b-1b和P-CΔ6b-1b)分别与各菌发生特异性反应。多肽P-AΔ6b-2#和P-AΔ7b-1b均与A.pg-A型菌感染血清结合。
实施例5
通过ELISA确认疫苗血清与防御的相关性
制备使用了灭活菌体的市售的油佐剂疫苗(Oilvacks 7，财团法人化学及血清疗法研究所)和加入了实施例2所得的多肽AΔ5-1和CΔ5-1代替Oilvacks 7的A.pg抗原(A型菌和C型菌的灭活菌体)的相同组成的疫苗，在5周龄的SPF鸡的颈部皮下注射1次。市售疫苗除给予1剂量之外，还给予稀释为1/100和1/1,000的疫苗，多肽是给予分别稀释为3、0.3和0.03μg/只的含A型和C型混合多肽的疫苗。9周龄时采血，然后鼻腔内给予0.2mL A.pg-A型菌211株(1.5×109CFU/mL)或A.pg-C型菌53-47株(5.0×109CFU/mL)的菌液，一周后观察颜面肿胀、鼻液流出、流泪等临床症状。
所得血清按照以下方法用于ELISA测定。将实施例2所得的多肽P-AΔ6b-2#和P-CΔ6b-1b用50mM碳酸氢盐缓冲液稀释，浓度为1.0μg/mL，分别以50μL加入到96孔板中，使其固相化。在4℃下吸附一夜，然后舍去反应液，用300μL的PBS-T(8.1mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、0.05％Tween 20)清洗，然后加入300μL含5％脱脂乳的PBS-T进行封闭。舍去封闭液，将血清用含5％脱脂乳的PBS-T稀释1,000倍，向各孔中分别加入50μL，在室温下反应1小时。除去反应液后用PBS-T清洗3次，将抗鸡IgG-HRP标记抗体用含5％脱脂乳的PBS-T稀释25,000倍，分别添加50μL。在暗处、室温下反应30分钟。除去反应液后用PBS-T清洗3次，分别添加100μL显色底物液(TMB+底物色素原，DAKO公司)，在室温下反应15分钟。分别添加100μL 3M硫酸，终止显色。用96孔板读数仪(日本モレキユ一ラ一デバイス公司制备)测定450nm的波长。
如图4和图5所示，在受A型菌和C型菌攻击的任一种鸡中，攻击前的血清ELISA值低于0.1的鸡确认完全发病，受到感染。而攻击前的血清ELISA值超过0.1的鸡未见发病。由此可以认为，通过使用本发明的ELISA系统，可以评价疫苗抗体的防御发病的水平。
产业实用性
本申请发明的检测方法可以用于鸡的免疫状态的检测，该免疫是用疫苗进行免疫，该疫苗由本申请发明中使用的、含有氨基酸序列的多肽构成。本申请发明的检测方法是通过测定由于A.pg感染而发生鸡传染性鼻炎的鸡的血清来用于发病机理或流行病学的研究。
Figure IPA00001237900200011
Figure IPA00001237900200021
Figure IPA00001237900200031
Figure IPA00001237900200041
Figure IPA00001237900200051
Figure IPA00001237900200061
Figure IPA00001237900200071
Figure IPA00001237900200081
Figure IPA00001237900200101

Claims (20)

1.副鸡禽杆菌抗体的检测方法，其特征在于，该方法包含使下述的肽A或B的至少一种抗原与检体反应的抗体测定方法：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。
3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。
4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
5.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列的肽；
肽B：
为含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列的肽。
6.权利要求4所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽。
7.权利要求5所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列的肽。
8.权利要求1～7中任一项所述的检测方法，其特征在于：肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
9.权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其特征在于：抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。
10.权利要求1～9中任一项所述的检测方法，其特征在于：检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。
11.副鸡禽杆菌抗体测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒使用下述肽A或B的至少一种作为抗原：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分、含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
12.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。
13.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。
14.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽；
肽B：
为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第38～68号氨基酸序列的肽。
15.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第8～236号氨基酸序列的肽；
肽B：
为含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列第69～452号氨基酸序列的肽。
16.权利要求14所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第243～273号氨基酸序列的肽。
17.权利要求15所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链：
肽A：
为含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第274～445号氨基酸序列的肽。
18.权利要求11～17中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
19.权利要求11～18中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。
20.权利要求11～19中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于：检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。
CN200980113170.8A 2008-02-08 2009-02-06 副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒 Expired - Fee Related CN102007414B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-029589 2008-02-08
JP2008029589 2008-02-08
PCT/JP2009/052091 WO2009099204A1 (ja) 2008-02-08 2009-02-06 アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法およびキット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102007414A true CN102007414A (zh) 2011-04-06
CN102007414B CN102007414B (zh) 2015-06-17

Family

ID=40952272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980113170.8A Expired - Fee Related CN102007414B (zh) 2008-02-08 2009-02-06 副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8298778B2 (zh)
EP (1) EP2251693B1 (zh)
JP (1) JP5379698B2 (zh)
KR (1) KR101528169B1 (zh)
CN (1) CN102007414B (zh)
ES (1) ES2437148T3 (zh)
MX (1) MX2010008687A (zh)
WO (1) WO2009099204A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105949287A (zh) * 2016-06-29 2016-09-21 北京市农林科学院 一种a型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用
CN107219364A (zh) * 2017-04-14 2017-09-29 杨凌职业技术学院 检测a型副鸡嗜血杆菌抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用
CN107402301A (zh) * 2017-08-06 2017-11-28 潘金文 一种家禽病原体高通量检测芯片及其应用
CN110540579A (zh) * 2018-05-29 2019-12-06 普莱柯生物工程股份有限公司 一种副鸡禽杆菌抗原蛋白、含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物、及其制备方法和应用
CN114184791A (zh) * 2020-09-15 2022-03-15 北京市农林科学院 一种检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法与应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107266538B (zh) * 2016-07-28 2020-09-11 北京市农林科学院 鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法
PE20191840A1 (es) * 2018-06-19 2019-12-31 Farm Veterinarios S A C Kit diagnostico diferencial y rapido para deteccion de la coriza infecciosa y el sindrome de cabeza hinchada en la industria avicola
CN114236128B (zh) * 2021-11-30 2022-07-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白抗体的阻断elisa试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1208436A (zh) * 1996-09-19 1999-02-17 财团法人化学及血清疗法研究所 来自副鸡嗜血杆菌的新多肽及其制备方法
JP2005218414A (ja) * 2004-02-09 2005-08-18 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk ヘモフィルス・パラガリナラムａ型菌由来の感染防御抗原である組み換え蛋白

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS64467A (en) 1987-11-20 1989-01-05 Kitasato Inst:The Measuring system using hemagglutinin of agglutinin deficient strain to fresh red blood cells of haemophilus paragallinarum
JP2002154983A (ja) 2000-11-20 2002-05-28 Shionogi & Co Ltd ヘモフィルス・パラガリナルムワクチン

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1208436A (zh) * 1996-09-19 1999-02-17 财团法人化学及血清疗法研究所 来自副鸡嗜血杆菌的新多肽及其制备方法
JP2005218414A (ja) * 2004-02-09 2005-08-18 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk ヘモフィルス・パラガリナラムａ型菌由来の感染防御抗原である組み換え蛋白

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAGE ET AL.: "Haemophilus infections in chickens.I.CHaracteristics of 12 Haemophilus isolates recovered from diseased chichens", 《AMERICAN JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105949287A (zh) * 2016-06-29 2016-09-21 北京市农林科学院 一种a型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用
CN105949287B (zh) * 2016-06-29 2019-05-24 北京市农林科学院 一种a型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用
CN107219364A (zh) * 2017-04-14 2017-09-29 杨凌职业技术学院 检测a型副鸡嗜血杆菌抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用
CN107402301A (zh) * 2017-08-06 2017-11-28 潘金文 一种家禽病原体高通量检测芯片及其应用
CN110540579A (zh) * 2018-05-29 2019-12-06 普莱柯生物工程股份有限公司 一种副鸡禽杆菌抗原蛋白、含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物、及其制备方法和应用
CN110540579B (zh) * 2018-05-29 2022-09-06 普莱柯生物工程股份有限公司 一种副鸡禽杆菌抗原蛋白、含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物、及其制备方法和应用
CN114184791A (zh) * 2020-09-15 2022-03-15 北京市农林科学院 一种检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2251693A1 (en) 2010-11-17
US8298778B2 (en) 2012-10-30
US20110201034A1 (en) 2011-08-18
WO2009099204A1 (ja) 2009-08-13
JPWO2009099204A1 (ja) 2011-05-26
ES2437148T3 (es) 2014-01-09
EP2251693A4 (en) 2011-04-20
KR101528169B1 (ko) 2015-06-11
MX2010008687A (es) 2011-02-22
JP5379698B2 (ja) 2013-12-25
KR20100134584A (ko) 2010-12-23
EP2251693B1 (en) 2013-11-13
CN102007414B (zh) 2015-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102007414B (zh) 副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒
US20040197769A1 (en) Diagnostic test for West Nile virus
KR20070026802A (ko) 한타바이러스 감염을 진단하기 위한 방법 및 시약
CN101821623A (zh) 用于精子性别选择的材料和方法
US20140377740A1 (en) Soluble and membrane-anchored forms of lassa virus subunit proteins
CN1326997C (zh) 编码鸭瘟立默氏菌外膜蛋白的OmpA基因及应用方法
Deneke et al. Evaluation of recombinant LigB antigen-based indirect ELISA and latex agglutination test for the serodiagnosis of bovine leptospirosis in India
CN102731615A (zh) Prrsv的检测试剂和检测方法
KR101667122B1 (ko) 개선된 백신 진단
WO2008119358A2 (en) Surface-located streptococcus pneumoniae polypeptides for use in vaccine compositions
CN102964435A (zh) 截短型溶血链球菌溶菌素o及利用其的检测试剂盒
CN101308138A (zh) 登革病毒IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒
CN109134647B (zh) Ns1蛋白的结合蛋白
CN110642927A (zh) 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用
EP1837400A1 (en) Novel tannase gene and protein thereof
CA2540703C (en) Methods and compositions for mycoplasma pneumoniae exotoxins
KR101080071B1 (ko) 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법
US7094576B2 (en) Methods and compositions for detecting larval Taenia solium with a cloned diagnostic antigen
WO2004028467A2 (en) Diagnosis of bovine viral diarrhea virus
CN109810196A (zh) 一种水稻Cu/Zn-SOD多克隆抗体的制备方法和应用
CN110343715A (zh) pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原及其多克隆抗体的制备方法
US6514697B1 (en) Methods for detection of Crytosporidium species and isolates and for diagnosis of Cryptosporidium infections
CN108828228A (zh) 预测或诊断无精症或少精症的nanos2标志物及其应用
RU2804845C1 (ru) Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА
RU2798510C1 (ru) Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура A N 2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200312

Address after: Kumamoto, Japan

Patentee after: THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC Research Institute

Address before: Kumamoto Prefecture, Japan

Patentee before: THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC Research Institute

TR01 Transfer of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150617

Termination date: 20210206

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee