JP2002154983A - ヘモフィルス・パラガリナルムワクチン - Google Patents

ヘモフィルス・パラガリナルムワクチン

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JP2002154983A
JP2002154983A JP2000352095A JP2000352095A JP2002154983A JP 2002154983 A JP2002154983 A JP 2002154983A JP 2000352095 A JP2000352095 A JP 2000352095A JP 2000352095 A JP2000352095 A JP 2000352095A JP 2002154983 A JP2002154983 A JP 2002154983A
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chicken
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serotypes
haemophilus
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Hideji Iwaki
秀治 岩城
Masanori Kobayashi
雅典 小林
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Abstract

(57)【要約】 【課題】ヘモフィルス・パラガリナルム感染症に対する
鶏の防御用ワクチンを提供する。 【解決手段】血清型A、BおよびCの赤血球凝集素を同時
に発現するヘモフィルス・パラガリナルムの死菌を含む
鳥類防御用ワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する分野】本発明は、血清型A、BおよびCの
赤血球凝集素を同時に発現するヘモフィルス・パラガリ
ナルムの死菌を含む鳥類防御用ワクチン、該ワクチンを
含む混合ワクチンおよび血清型A、BおよびCの赤血球凝
集素を発現するヘモフィルス・パラガリナルムに関す
る。
【0002】
【従来技術】ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophi
lus paragallinarum、以下Hpgと略す)は家禽の重要な
呼吸器系疾病の一つである伝染性コリーザの起因菌であ
り、罹患鶏は主に鼻汁の漏出、顔面の腫脹あるいは流涙
などの症状を示す。また鶏伝染性コリーザは家禽の育成
率の低下、産卵開始の遅延、産卵率の低下あるいは産卵
停止をもたらし、その経済的損失は大きい。Hpgの血清
の凝集反応に基づいて、Page(Am. J. Vet. Res. , 23:
85-95, 1962)により血清型A、BおよびCに、またSawata
らにより1および2型に型別されている(Jpn. J. Vet.
Sci. 40:645-652, 1978)。PageのA型はSawataらの1型
に、PageのC型はSawataらの2型に相当すると考えられて
いる(K. Kume et al., Am. J. Vet. Res., 41:757-76
0, 1980 , A. Sawata et al., Am. J. Vet. Res.,41:
1901-1904, 1980)。鶏伝染性コリーザの予防にはHpgを
培養し、回収した菌体をホルマリンやチメロサールで不
活化したワクチンが広く応用されている。しかし、これ
らHpgの感染防御は血清型特異的であり、ある血清型に
属するHpgで免疫した鶏は、他の血清型に属するHpgの感
染を受けたとき、これを防御できない。従って、伝染性
コリーザに対する十分な防御のためには、すべての血清
型から誘導した免疫を付与されなければならない。その
ため、近年、ワクチン接種の省力化を目的として、血清
型の異なるHpgならびにニューカッスル病ウイルスや鶏
伝染性気管炎ウイルス等のワクチンを混合することによ
って、注射回数を減らすことをねらった混合ワクチンが
開発され、野外で広く使用されている。
【0003】混合ワクチンにおいては注射量を増やすこ
となく、それぞれ単味のワクチンと同等の免疫効果を得
ることが重要である。そのためには、混合用の血清型の
異なる各抗原を増量するか、良いアジュバントを選択し
て用いることが必要となる。しかし、Hpgのようなグラ
ム陰性菌は抗原量を増やすと、それに伴って接種局所の
壊死病巣形成(M. Matumoto and R. Yamamoto, Avian D
is., 15:109-117, 1971)といった副作用が強くなる傾
向にあり、安全性が問題視されている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】前述のとおり、従来の
Hpg菌体をチメロサールやホルマリンで不活化したワク
チンでは、複数の血清型Hpgを混合しなければ、異なる
血清型Hpgによる感染を防御できなかった。さらに、大
量の菌体を鶏に接種することになり、接種部位に副作用
が強く生じるという問題点があった。
【0005】
【課題を解決する手段】本発明は、異なる血清型Hpgに
よる感染を防御でき、かつ菌体量の少なく安全なワクチ
ンの提供を目的とする。具体的には、1種類の菌株でHp
gの血清型A、BおよびCの感染を防御できるワクチンの提
供を目的とする。異なる血清型Hpgによる感染を防御で
き、かつ菌体量の少なく安全なワクチンを提供するため
には、一種類のHpgにおいて異なる血清型の感染防御抗
原を発現する菌株を用い、これを他のワクチンとともに
適当なアジュバントと混合すれば、上記副作用の軽減し
たワクチンとすることができる。本発明者らは、1種類
の菌株でHpgの血清型A、BおよびCの感染を防御できるワ
クチンの提供を目的として研究した結果、本発明を見出
し、これを完成した。
【0006】すなわち、本発明は、 (1)血清型A、BおよびCの赤血球凝集素を同時に発現
するヘモフィルス・パラガリナルムの死菌を含む鳥類防
御用ワクチン; (2)ヘモフィルス・パラガリナルムが、ヘモフィルス
・パラガリナルム K460株(FERM P-17575)である上記
(1)記載のワクチン; (3)鳥類が、鶏である上記(1)または(2)に記載
のワクチン。 (4)鶏伝染性コリーザ用ワクチンである上記(1)か
ら(3)のいずれかに記載のワクチン; (5)上記(1)から(4)のいずれかに記載のワクチ
ンを含む混合ワクチン; (6)ニューカッスル病ワクチンおよび/または鶏伝染
性気管炎ワクチンを含む上記(5)に記載の混合ワクチ
ン; (7)血清型A、BおよびCの赤血球凝集素を同時に発現
するヘモフィルス・パラガリナルム;および (8)ヘモフィルス・パラガリナルム K460株(FERM P-
17575)である請求項7記載のヘモフィルス・パラガリ
ナルム、に関する。
【0007】本発明において、「血清型A、BおよびCの
赤血球凝集素を同時に発現するヘモフィルス・パラガリ
ナルム」とは、 血清型Aのモノクローナル抗体と血清型
Cのモノクローナル抗体の両方に反応するヘモフィルス
・パラガリナルムであり、かつ該ヘモフィルス・パラガ
リナルムで鳥類を免疫すると該鳥類の血清中に血清型B
の赤血球凝集抑制抗体が付与されるヘモフィルス・パラ
ガリナルムを意味する。「死菌」とは、不活性化により
感染力を失った菌体を意味し、不活性化は、チメロサー
ル、ホルマリン等の薬物や熱、放射線等の物理的処理に
より成し得る。「鳥類」とは、家禽を意味し、具体的に
は、鶏、ガチョウ、キジ、ウズラなどが例示される。
「鳥類防御用ワクチン」とは、家禽の疾患感染防御を目
的として調製されたワクチンを意味し、好ましくは鶏伝
染性コリーザ用ワクチンが例示される。「ワクチン」と
は、伝染病の予防のために使用される抗原の諸形態の総
称であり、本発明のワクチンには、ヘモフィルス・パラ
ガリナルムの死菌の他に、アジュバントが添加されてい
てもよく、アジュバントとしては、アルミニウムアジュ
バント、フロイントアジュバント、フロイント不完全ア
ジュバントなどが例示される。その他ワクチンには、生
理食塩水またはリン酸緩衝食塩水などが添加されていて
もよい。「混合ワクチン」は、複数の疾病感染防御を目
的として、調製されるワクチンであり、本発明において
は、鶏伝染性コリーザ用ワクチンの他に、ニューカッス
ル病ワクチン、鶏伝染性気管炎ワクチン、EDS−76
ワクチン、マイコプラズマ・ガリセプチカムワクチン、
トリレオウイルスワクチン、鶏伝染性ファブリキウス嚢
病ワクチン、鶏腎炎ウイルスワクチンなどが含まれてい
てもよい。本発明において、「ヘモフィルス・パラガリ
ナルム K460株」とは、1種類の菌株でHpg血清型A、Bお
よびCの赤血球凝集素を同時に発現するヘモフィルス・
パラガリナルムを意味し、A型、B型およびC型すべての
赤血球凝集抑制活性を有する抗体を提供できる菌株であ
る。該菌株は、茨城県つくば市東1丁目1番3号の工業
技術院生命工学工業技術研究所に、平成11年9月22
日付けで、受託番号FERM P-17575として寄託されてい
る。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明ヘモフィルス・パラガリナ
ルムの確認 本発明の血清型A、BおよびCの赤血球凝集素を同時に発
現するヘモフィルス・パラガリナルムであることの確認
は、公知の方法による。血清型AおよびCの赤血球凝集
素の発現は、モノクローナル抗体を用いたdot-immunobl
ot(T.Yamaguchi et al., Avian Dis., 34:52-57, 198
9.、M.Takagi etal., Vet.Microbiol., 27:327-338, 19
91.)や蛍光抗体法による二重染色(例えば、A型のモノ
クローナル抗体とC型のモノクローナル抗体の両方を菌
体に反応させた後、血清型AをローダミンラベルIgG2a、
血清型CをFITCラベルIgG1で検出するとき、同一菌体上
に両方の特異蛍光が観察される)によっても確認でき
る。すなわち、血清型AおよびCの赤血球凝集素が発現
されていれば、A型のモノクローナル抗体とC型のモノク
ローナル抗体の両方に反応する。Hpg 221株などの血清
型Aの菌株は、A型のモノクローナル抗体とのみ反応し、
Hpg Modesto株などの血清型Cの菌株は、C型のモノクロ
ーナル抗体のみ反応する。これに対して、本発明のK460
株はA型のモノクローナル抗体とC型のモノクローナル抗
体の両方に反応する。一方、血清型Bの赤血球凝集素の
発現は、菌株により鶏等の鳥類を免疫し、血清中の赤血
球凝集抑制抗体を測定した際に、B型赤血球凝集素に対
する反応が認められることで確認できる。具体的には、
Yamaguchiら(T.Yamaguchiet al., Avian Di
s., 34:964-968,1990.)の方法により、血清型Bの赤血
球凝集抑制抗体の付与の有無を確認することができる。
【0009】培養 本菌株、ヘモフィルス・パラガリナルム K460株より鶏
伝染性コリーザワクチンを製造することができるが、そ
の製造は、常法に準じて行なうことができる。菌の培養
は、この種の菌の培養に用いられる培地を使用できる。
具体的には、鶏肉汁に抗体陰性の鶏血清を1%添加した
培地が用いられる。鶏肉汁培地は、食塩、ポリペプトン
S、ポリペプトンなどを加えることができ、121℃、
15分滅菌したものを用いる。培養は、37℃で、一夜
振盪培養、攪拌培養または静置培養することにより行な
う。
【0010】ワクチンの製造 培養菌液はチメロサール、ホルマリン等で死菌とした
後、適当なアジュバント(例えば、水酸化アルミニウム
ゲルやWO、WOW、OW型のオイルアジュバントやカルボキ
シビニルポリマー等の高分子が使用される)を加える。
このようにして調整した免疫原、すなわちワクチンは、
鶏に非経口的に投与される。例えば、下腿部筋肉内、胸
部筋肉内、皮下などに注射されることにより、血清型
A、B、Cすべてに対する抗体を付与できる。接種量は、
40日齢未満は0.5ml、40日齢以上は1.0mlを基準量と
する。
【0011】
【実施例】本発明を以下の実施例により更に説明する。
【0012】実施例1 Hpg K460株を鶏血清加鶏肉汁培地(鶏肉汁1000ml中、ポ
リペプトン10g、NaCl5g、鶏血清10mlを含む)中で、37
℃ 一夜攪拌培養した。鶏血清加鶏肉汁寒天培地(上記
鶏血清加鶏肉汁培地100ml中に1gの寒天を含む)で菌数
を測定後、0.2%の割にホルマリンを加えて不活化(死
菌調整)した。不活化は、鶏血清加鶏肉汁寒天培地上に
発育しないことで確認した。K460株は、dot-immunoblot
により確認した(表1)。
【表1】 表1から明らかなようにK460株は、血清型Aの221株およ
び血清型CのS1株と性状が異なり、両方の性質を持つこ
とが判明した。
【0013】実施例2 生菌数で108CFU/mlに調整したK460株死菌液30%を含むW
O型オイルアジュバントワクチンを作製し、その0,5mlを
SPF鶏群由来4週齢鶏の下腿部筋肉内に1回接種した。ワ
クチン接種群40羽と非接種対照群40羽について、1週間
おきに血清を採取し、赤血球凝集抑制(HI)試験を行な
った。HI試験のためのHA抗原は、221株(血清型
A)、24268株(血清型B)、S1株(血清型C)およ
びK460株を使用した。その結果、K460株ワクチン接種鶏
はK460株を含む血清型A,B,CすべてのHI抗体が付与され
たと結論された(図1)。さらに、ワクチン接種から5
週と6週後に血清型A(221株)、B(24268
株)、C(S1株)およびK460株の攻撃による防御試験を
行なった。攻撃菌は、鶏血清加鶏肉汁培地で37℃一夜静
置培養した培養液(菌量は生菌数で108CFU/0.5ml以
上)を鶏の鼻に滴下した。それぞれの攻撃群にはワクチ
ン接種群5羽と無接種対照群5羽の鶏を使用した。
【表2】 防御能は、攻撃後7日間観察したHpg特異的な臨床症状の
出現の有無および鶏の眼窩下洞からの菌回収の成績によ
った。攻撃菌の血清型を確認する目的で、回収菌のdot-
immunoblotを行なった。表2から、K460株ワクチン接種
鶏は血清型A、BおよびCすべての菌株の攻撃を防御し
た。また、回収された菌はすべて攻撃菌の血清型で異な
る血清型の菌株を含んでいなかった。
【0014】
【発明の効果】本発明のK460株を抗原としたワクチン
は、外部-膜蛋白や精製ポリペプチドのような複雑な精
製工程を必要とせず、1種類の全菌体を用いるだけで、
K460株およびPageの血清型A、BおよびCすべてのHI活性
を有する抗体を提供する。1種類の菌株だけを用いるこ
とにより、大量の菌体を接種する必要がなく、より副作
用が少なく、安全なワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、K460株ワクチン接種鶏のHI抗体価の
推移を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/569 G01N 33/569 F //(C12N 1/20 (C12N 1/20 E C12R 1:01) C12R 1:01) Fターム(参考) 4B065 AA01X AC20 BD13 CA24 CA43 CA45 4C085 AA03 BA18 CC04 DD03 EE01 FF02 GG01

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】血清型A、BおよびCの赤血球凝集素を同時
    に発現するヘモフィルス・パラガリナルムの死菌を含む
    鳥類防御用ワクチン。
  2. 【請求項2】ヘモフィルス・パラガリナルムが、ヘモフ
    ィルス・パラガリナルムK460株(FERM P-17575)である
    請求項1記載のワクチン。
  3. 【請求項3】鳥類が、鶏である請求項1または2に記載
    のワクチン。
  4. 【請求項4】鶏伝染性コリーザ用ワクチンである請求項
    1から3のいずれかに記載のワクチン。
  5. 【請求項5】請求項1から4のいずれかに記載のワクチ
    ンを含む混合ワクチン。
  6. 【請求項6】ニューカッスル病ワクチンおよび/または
    鶏伝染性気管炎ワクチンを含む請求項5に記載の混合ワ
    クチン。
  7. 【請求項7】血清型A、BおよびCの赤血球凝集素を同時
    に発現するヘモフィルス・パラガリナルム。
  8. 【請求項8】ヘモフィルス・パラガリナルム K460株(F
    ERM P-17575)である請求項7記載のヘモフィルス・パ
    ラガリナルム。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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