KR101634078B1

KR101634078B1 - 봉입체 형성 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR101634078B1
Application number: KR1020117011487A
Authority: KR
Inventors: 히로시 나카타케; 아키히로 메타; 키요타카 스에나가; 마사키 히라시마; 히로아키 마에다
Original assignee: 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼; 데이진 화-마 가부시키가이샤
Priority date: 2008-10-21
Filing date: 2009-10-21
Publication date: 2016-06-29
Also published as: US8748132B2; CN102257139B; JP5602635B2; WO2010047347A1; EP2363469A4; US20110262998A1; EP2363469B1; CA2741214A1; JPWO2010047347A1; KR20110086711A; CN102257139A; AU2009307423A1; AU2009307423B2; CA2741214C; EP2363469A1

Abstract

봉입체 형성 단백질의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 로이신을 프롤린 및/또는 21번째의 알라닌을 다른 아미노산으로 치환한 개변형 알칼리포스파타아제 시그널 펩티드(개변형 APSP)를 코딩하는 염기서열의 하류에 목적 단백질 유전자의 염기서열을 결합시킨 서열로 이루어지는 핵산 단편, 및 (1) 개변형 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열의 하류에 목적 단백질 유전자의 염기서열을 결합시킨 서열로 이루어지는 핵산 단편이 합입된 발현벡터를 조제하는 공정, (2) 그 발현벡터로 형질전환된 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 조제하는 공정, 및 (3) 그 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 배양해서 수득되는 배양물로부터 봉입체 형성 단백질을 정제하는 공정으로 이루어지는 봉입체 형성 단백질의 제조방법이 제공된다. 상기 다른 아미노산은 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 타이로신으로 이루어지는 그룹에서 선택된다.

Description

봉입체 형성 단백질의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING PROTEIN CAPABLE OF FORMING INCLUSION BODY}

본 발명은 원핵세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 단백질(이하, 「봉입체 형성 단백질」이라고 언급하기도 한다)의 제조방법 및 당해 제조방법에 사용하는 핵산 단편에 관한 것이다. 상세하게는, (1) 개변형 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열의 하류에 목적 단백질 유전자의 염기서열을 결합시킨 서열로 이루어지는 핵산 단편이 합입된 발현벡터를 조제하는 공정, (2) 그 발현벡터로 형질전환된 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 조제하는 공정, 및 (3) 그 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 배양해서 수득되는 배양물로부터 봉입체 형성 단백질을 정제하는 공정으로 이루어지는 봉입체 형성 단백질의 제조방법 및 상기 (1)의 핵산 단편에 관한 것이다.

상기 목적 단백질로서는 매트릭스 메탈로프로테아제-7(이하, 「MMP-7」이라고 언급하기도 한다)이 특히 바람직하고, 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 형태는 개변형 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열, 및 프로매트릭스 메탈로프로테아제-7(이하, 「proMMP-7」이라고 언급하기도 한다)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산 단편, 및 그 핵산 단편을 사용하는 MMP-7의 제조방법에 관한 것이다.

대장균 등의 그램 음성균에 있어서, 단백질을 생산하는 경우, 소망하는 단백질의 N 말단에 시그널 서열을 붙임으로써, 페리플라즘(세포주변강)이라고 불리는 내막(세포질막)과 세포벽 사이에 있는 간극에 단백질이 분비되는 경우가 있다. 그렇지만, 내막을 통한 페리플라즘으로의 목적 단백질의 수송효율은 시그널 서열과 목적 단백질의 조합에 따라 달라서, 항상 높은 수송효율을 얻는 방법은 알려져 있지 않다. 또, 대장균 등의 페리플라즘에는 단백질 분해효소(프로테아제)도 분비되는 것이 알려지고 있고, 페리플라즘에 분비된 목적 단백질이 분해를 받아버리는 경우도 있다. 한편, 목적 단백질이 변성상태로 페리플라즘으로 분비되면, 거기에서 봉입체라고 불리는 구조를 만드는 경우가 있고, 봉입체에 합입된 목적 단백질은 프로테아제에 의한 분해를 받기 어렵다고 한다. 또, 봉입체에는 고농도의 목적 단백질이 합입되어 있기 때문에, 정제효율이나 수율의 관점에서도 유리하게 사용할 수 있는 경우가 있다. 그렇지만, 목적 단백질을 대장균 등의 그램음성균에서 발현시키고, 효율적으로 봉입체를 형성시키기 위한 방법(시그널 펩티드를 개변 등)도 현시점에서 알려져 있지 않다.

이브라힘(Ibrahim) 등은 밀 배아를 사용한 무세포계의 단백질 합성에 있어서, 대장균의 내독소 서브유닛 B의 시그널의 소수성 코어영역에 있는 P8의 로이신을 프롤린으로 치환하는 것에 의해, 시그널 서열의 절단이 저해되고, 합성속도가 2배로 상승하고 있음을 나타냈다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 그렇지만, 본 결과는 무세포계에 의한 단순화된 발현계에서의 결과이기 때문에, 대장균 등이 살아 있는 세포를 사용한 발현계에 적응할 수 있다고는 할 수 없다. 또, 합성된 단백질은 가용성으로 봉입체를 형성하는 경우는 없었다. 다른 예에서는, 대장균의 리보오스 결합 단백질의 시그널 서열에 자연발생적으로 돌연변이(P17의 로이신의 프롤린으로의 돌연변이)가 발생하였을 경우, 시그널 서열의 절단저해가 일어나고, 가용성의 리보오스 결합 단백질 전구체가 세포질 내에 축적되는 것, 그 발현량은 방사선 동위원소를 사용한 라벨링에 의해 검출해야 할 만큼 미량이며, 또한 돌연변이 전의 야생형의 발현량과 동등하였던 것이 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조). 이렇게, 대장균에서의 봉입체 발현에 있어서의 원핵세포 유래 시그널 서열의 돌연변이의 영향은 아직 명확하지 않고, 특히 진핵세포 유래 구조 유전자의 발현으로의 영향은 전혀 알려져 있지 않다.

또, 숙주에 유전자를 도입한 재조합체를 제조에 사용하는 경우, 항생물질 등을 함유하는 선택 배양지를 사용하지 않을 경우에는, 재조합체가 증식과정에서 도입한 유전자를 배제해서 도입한 형질을 잃는 경우가 발생하고, 그것이 우선적으로 증식하는 것에 의해서 물질 제조의 효율이 떨어지는 경우가 있다. 그 때문에 숙주에 유전자(발현 플라스미드 등)을 도입할 때는 선택에 사용하는 항생물질 등을 분해하거나 변형하거나 하는 것에 의해서, 그 항생물질 등에 내성을 획득하기 위한 유전자도 동시에 숙주에 도입하여, 그 유전자를 보유하지 않는 숙주에 독성을 나타내는 항생물질 등(예를 들면, 암피실린이나 테트라사이클린 등)을 포함하는 선택 배양지에서 배양함으로써, 유전자를 지니고 있는 재조합체를 선택하고, 도입한 유전자를 배제한 재조합체의 발생을 억제하는 방법이 취해진다. 그러나, 항생물질은 생물에 대한 독성을 가지고 있거나, 약제 과민증(알러지)의 원인이 되거나 하는 경우도 있고, 재조합체를 사용해서 의약품이나 동물의약품, 식품을 제조해서 판매할 때는, 그 혼입이 엄격하게 관리될 필요가 있다. 그래서, 항생물질 등에서의 선택을 실시하지 않아도 도입한 유전자가 유지되는 구성이나 방법이 요구되고 있다.

MMP-7은 활성부위에 아연분자를 가지는 아연형 메탈로프로테아제 패밀리에 속하는 매트릭스 메탈로프로테아제(이하, 「MMP」라고 언급하기도 한다)의 하나이다(예를 들면, 비특허문헌 3 참조). MMP는 전구체로서 생산되고, 세포외 분비 시에 시그널 서열이 프로세스되고, 이어서 프로서열이 프로세스되어 활성형이 된다. 세포외로 분비된 MMP는 세포외 매트릭스의 대사를 담당하는 것에 대해서, MMP-7은 주로 암 세포에서 분비되고, 침윤, 전이에 관여하는 것이 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 4 참조). MMP-7은 다른 많은 MMP가 가지고 있는 힌지, 헤모헥신-유사 도메인을 가지고 있지 않고, MMP 중에서는 최소의 분자단위로 이루어지고, 콜라겐이나 세포외 매트릭스를 구성하고 있는 컴포넌트(피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 오글리칸)를 기질로 한다.

MMP-7은 연골조직의 주성분인 오글리칸을 기질로 하는 것, 추간판 헤르니아의 수술 검체 유래의 마크로퍼지가 MMP-7을 발현하고 있는 것(예를 들면, 비특허문헌 5 참조) 등으로부터 헤르니아 덩어리의 자연퇴축에 관계하고 있는 것이 추측된다. 그 후에, Haro들은 MMP-7을 헤르니아 도그(hernial dog)의 추간판에 투여해서 추간판 내 수핵의 용적의 감소를 관찰하고, 추간판 헤르니아의 치료약으로서의 가능성을 나타냈다(예를 들면, 비특허문헌 6 참조). MMP-7의 의약품으로서의 개발이 소망되는 바이지만, MMP-7은 생체 중에 미량으로밖에 존재하지 않고, 생체로부터 MMP-7을 분리정제하는 것은 매우 곤란해서, 생체성분을 사용하였을 경우, 잠재적인 바이러스 오염 등 안전면에서의 문제가 걱정된다. MMP-7은 암 세포로부터도 취득할 수 있지만, 암 세포를 제조주로 하는 것은 바람직한 것은 아니다(예를 들면, 비특허문헌 7 참조).

이러한 문제를 해결하는 방법으로서 유전자 재조합 기술에 의해 MMP-7을 취득하는 시도가 이루어지고 있다. 동물세포를 사용한 계에서는, CHO세포에서 MMP-7을 발현시킨 바넷(Barnett) 등의 보고가 있지만(예를 들면, 비특허문헌 8 참조), MMP-7의 발현량은 수 mg/ℓ 정도로 적고, 의약품의 제조에 사용하는 것은 현실적인 발현계라고는 말하기 어렵다. 또 알칼리포스파타아제의 시그널 서열의 염기서열과 대장균의 코돈 사용빈도에 최적화된 proMMP-7의 유전자 서열을 연결시킨 핵산 단편을 사용하는 것에 의해, 34℃에서는 가용성의 MMP-7, 42℃에서는 불용성의 MMP-7을 발현하는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).

특허 제293852호

Ibrahim et al., J. Biol. Chem., 1987, vol. 262, p. 10189-10194 Groarke et al., EMBO J., 1985, vol. 4, p. 1875-1880 Soler et al., Biochem Biophys Res Commun, 1994, vol. 201, p. 917-923 Ii et al., Exp Biol Med (Maywood), 2006, vol. 231, p. 20-27 Haro et al., J. Spinal Disord, 1999, vol. 13, p. 245-249 Haro et al., J Orthop Res, 2005, vol. 23, p .412-419 Miyazaki et al., Cancer Research, 1990, vol. 50, p. 7758-7764 Barnett et al., Protein Exp. Purif., 1994, vol. 5, p.2 7-36.

전술한 바와 같이, proMMP-7 유전자를 대장균에 도입하였을 경우, proMMP-7은 대장균에 대한 강한 독성 때문에 발현되지 않는다. proMMP-7의 N 말단측에 시그널 펩티드를 부가하는 것에 의해, proMMP-7의 대장균에서의 발현이 가능하게 된다. 그렇지만, 단순하게 시그널 펩티드를 부가하는 것만으로는 proMMP-7의 발현량은 적고, 또 발현한 proMMP-7의 일부가 프로테아제에 의해 분해된다. 이것들의 분해는 대장균의 발현산물의 저하 혹은 봉입체로부터의 리폴딩에 있어서의 수량저하를 초래하여, 효율적인 proMMP-7의 제조방법 확립의 방해가 된다. 따라서 본 발명의 목적은 발현량의 증가와 프로테아제에 의한 분해억제를 가져올 수 있는 신규 조합의 유전자 단편과 그 유전자 단편을 사용한 목적 단백질의 원핵세포에서의 발현 방법, 나아가서는 그 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, (1) 시그널 펩티다아제의 결합부위인 서열번호 1의 PhoA-알칼리포스파타아제 시그널 펩티드(이하, 「ASPS」라고 언급하기도 한다)의 아미노산 서열 21번째의 알라닌을 임의의 아미노산, 예를 들면, 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 또는 타이로신으로 치환한 개변형 PhoA-알칼리포스파타아제 시그널 펩티드(이하, 「개변형 APSP」라고 언급하기도 한다)를 코딩하는 염기서열을, proMMP-7 유전자의 5'측에 부가한 핵산 단편을 사용해서 대장균에서 발현시키는 것에 의해, 프로테아제에 의한 proMMP-7의 분해가 억제되는 것, (2) 13번째의 로이신을 프롤린으로 치환한 개변형 APSP를 사용하는 것에 의해, proMMP-7의 발현량의 증대 및 프로테아제에 의한 분해억제의 양쪽의 효과가 수득되는 것, 및 (3) 13번째의 로이신을 프롤린으로 치환하며, 또한 21번째의 알라닌을 상기의 임의의 아미노산으로 치환한 개변형 APSP를 사용한 경우에는, 아이소프로필 티오-베타-D-갈락토시드(IPTG)에 의한 발현유도에 있어서, 어느 한쪽을 치환하였을 경우와 비교해서, proMMP-7의 발현량이 증대하는 것을 침전물침전물하였다. 또, 상기의 개변형 시그널 펩티드는 다른 봉입체를 형성하는 단백질, 예를 들면, 아비박테리움ㆍ파라갈리나룸 C형균의 HMTp210에 대해서도 동일한 효과를 가지는 것을 침전물하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 하기와 같다.

[1] 원핵세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 단백질(봉입체 형성 단백질)을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 핵산 단편으로써, 개변형 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 상기 핵산 단편.

[2] 상기 [1]에서, 원핵세포가 그램음성균인 핵산 단편.

[3] 상기 [1] 또는 [2]에서, 원핵세포가 대장균인 핵산 단편.

[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에서, 목적 단백질이 프로매트릭스 메탈로프로테아제-7(proMMP-7) 또는 아비박테리움ㆍ파라갈리나룸 C형균의 HMTp210인 핵산 단편.

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 개변형 시그널 펩티드가 원핵생물 유래의 내막을 통과하는 단백질의 시그널 펩티드를 개변한 것인 핵산 단편.

[6] 상기 [5]에서, 상기 단백질이 알칼리포스파타아제, OmpA, PelB, OmpT, LamB, OmpF 및 β-락타마아제로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것인 핵산 단편.

[7] 상기 [5]에서, 개변형 시그널 펩티드가 PhoA-알칼리포스파타아제의 시그널 펩티드를 개변한 것(개변형 APSP)인 핵산 단편.

[8] 상기 [7]에서, 개변형 APSP가 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 로이신을 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환한 것인 핵산 단편.

[9] 상기 [7]에서, 개변형 APSP가 서열번호 1의 아미노산 서열의 21번째의 알라닌을, 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 타이로신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산에 치환한 것인 핵산 단편.

[10] 상기 [7]에서, 개변형 APSP가 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 로이신을 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환하며, 또한, 21번째의 알라닌을, 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 타이로신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환한 것인 핵산 단편.

[11] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에서, 목적 단백질을 코딩하는 염기서열이 개변형 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열의 하류에 위치하는 핵산 단편.

[12] 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 핵산 단편이 합입된 발현벡터.

[13] 상기 [12]에 기재된 발현벡터로 숙주를 형질전환하는 것에 의해 수득되는 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.

[14] 상기 [13]에서, 숙주가 원핵세포인 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.

[15] 상기 [13] 또는 [14]에서, 숙주가 그램음성균인 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.

[16] 상기 [13] 내지 [15] 중 어느 하나에서, 숙주가 대장균인 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.

[17] 하기의 (1)∼(3)의 공정으로 이루어지는, 원핵세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 단백질(봉입체 형성 단백질)의 제조방법:

(1) 상기 [1] 내지 [11]중 어느 하나에 기재된 핵산 단편이 합입된 발현벡터를 조제하는 공정,

(2) 상기 (1)의 발현벡터로 형질전환된 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 조제하는 공정, 및

(3) 상기 (2)의 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 배양해서 수득되는 배양물로부터 봉입체 형성 단백질을 정제하는 공정.

[18] 상기 [17]에서, 상기 발현벡터가 T7 프로모터의 하류에 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 핵산 단편이 합입된 발현벡터인 제조방법.

[19] 상기 [17] 또는 [18]에서, 숙주가 원핵세포인 제조방법.

[20] 상기 [17] 내지 [19] 중 어느 하나에서, 숙주가 그램음성균인 제조방법.

[21] 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 하나에서, 숙주가 대장균인 제조방법.

[22] 상기 [17] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 항생물질 비함유 배지 중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

본 발명에 따르면, 원핵세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 단백질(봉입체 형성 단백질)을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 핵산 단편으로써, 개변형 시그널 펩티드와 목적 단백질을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 상기 핵산 단편, 그 핵산 단편을 삽입한 발현벡터, 그 발현벡터로 형질전환한 봉입체 형성 단백질 생산 숙주, 및 그 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 사용한 봉입체 형성 단백질의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 방법을 사용하는 것에 의해, 발현 플라스미드 보유율이 향상하여, 암피실린 등 플라스미드 보유를 목적으로 해서 사용하는 항생물질을 배지에 첨가하지 않아도 좋아진다. 또, 목적 단백질을 발현시키기 위한 각종 유도 시스템의 응답성이 좋아져서, 목적 단백질의 발현량이 향상한다. 또 봉입체에 합입되는 목적 단백질의 프로테아제에 의한 분해가 적어지고, 리폴딩 효율도 향상하기 때문에, 최종적으로는 기능을 가진 목적 단백질로 회수되는 효율이 향상된다. 즉, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 목적 단백질을 용이하게 제조할 수 있게 된다.

예를 들면, 개변형 APSP를 코딩하는 염기서열의 하류에 프로매트릭스 메탈로프로테아제-7(proMMP-7) 유전자의 염기서열을 결합시킨 염기서열로 이루어지는 핵산 단편을 사용하는 것에 의해, proMMP-7 생산 대장균에 있어서의 proMMP-7의 발현량을 증대시킬 수 있고, 또 그 proMMP-7 생산 대장균의 배양 및 배양물로부터의 정제과정에 있어서, 대장균 유래의 프로테아제에 의한 proMMP-7의 분해를 억제할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법에 따르면, 예를 들면, proMMP-7의 정제나 proMMP-7의 MMP-7으로의 변환이 용이하게 되어, 효율적으로 MMP-7를 제조하는 것이 가능하게 된다.

도 1은 시그널 펩티다아제 결합부위(서열번호 1의 아미노산 서열의 21번째의 Ala) 만을 다른 아미노산 치환한 개변형 APSP를 가지는 발현벡터로 형질전환해서 수득된 proMMP-7 생산 대장균의 가용화물을 SDS-PAGE에 걸은 후, CBB염색을 실시한 결과를 나타낸다. 레인1: MMP7A21D균, 레인2: MMP7A21D균, 레인3: MMP7A21E균, 레인4: MMP7A21E균, 레인5: MMP7A21K균, 레인6: MMP7A21K균, 레인7: MMP7균, 레인8: MMP7균
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 Leu를 Pro로 치환한 개변형 APSP를 가지는 발현벡터로 형질전환해서 수득된 proMMP-7 생산 대장균의 가용화물을 SDS-PAGE에 걸은 후, CBB염색을 실시한 결과를 나타낸다. 레인1: MMP7L13P균, 레인2: MMP7L13P균, 레인3: MMP7균, 레인4: MMP7균
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 Leu의 Pro으로의 치환과 21번째의 Ala의 다른 아미노산으로의 치환의 양쪽 개변을 실시한 발현벡터로 형질전환해서 수득된 proMMP-7 생산 대장균의 가용화물을 SDS-PAGE에 걸은 후, CBB염색을 실시한 결과를 나타낸다. 레인1: MMP7L13P-A21D균, 레인2: MMP7L13P-A21E균, 레인3: MMP7L13P-A21K균, 레인4: MMP7L13P-A21H균, 레인5: MMP7L13P-A21F균, 레인6: MMP7L13P-A21Y균, 레인7: MMP7균
도 4는 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 Leu의 Pro으로의 치환 및 21번째의 Ala의 글루탐산으로의 치환 및 양쪽 개변을 실시한 발현벡터로 형질전환해서 수득된 proMMP-7 생산 대장균의 가용화물을 SDS-PAGE에 걸은 후, CBB염색을 실시한 결과를 나타낸다. 레인1: MMP7균, 레인2: MMP7L13P균, 레인3: MMP7A21E균, 레인4: MMP7L13P-A21E균
도 5는 발현 플라스미드 pET-CorC4000, pET-nALP-CorC4000, 및 pET-ALP-CorC4000을 각각 도입한 BL21(DE3) 대장균의 균체 파쇄액의 일부를 SDS-PAGE에 걸은 후, CBB염색을 실시한 결과를 나타낸다.

본 발명의 특징은 개변형 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열의 하류에 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 결합시킨 핵산 단편을 사용하고, 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 제작하고, 그 봉입체 형성 단백질 생산 숙주의 배양물을 재료로 하여, 봉입체 형성 단백질 또는 목적 단백질을 제조하는 것에 있다.

개변형 시그널 펩티드로서는 대장균을 사용한 발현계에 있어서, 목적 단백질을 막 통과에 의해 세포질 내로부터 페리플라즘 또는 균체 외로 이동시킬 수 있는 것이라면 어느 단백질 유래의 시그널 펩티드일 수 있다. 원핵세포 유래 시그널 펩티드이라면 모두 후보 펩티드가 될 수 있지만, 특히, 원핵생물 유래의 내막을 통과하는 단백질, 예를 들면, 알칼리포스파타아제(DA 등, Nature, vol. 321, 706-708), PhoA-알칼리포스파타아제(Oka 등, 1985, Proc Natl Acad Sci USA. vol. 82, 7212-7216), OmpA(Ghrayeb 등, 1984, EMBO J., vol. 3, 2437-2442), PelB(Better 등, 1988, Scienc, vol. 240, 1041-1043), OmpT(Johnson 등, 1990, Protein Expression Purif, vol. 7, 104-113), LamB 와 OmpF(Hoffman 등, 1985, Proc Natl Acad Sci USA. vol. 82, 5107-5111), β-락타마아제(Villa-komaroff 등, 1978, Proc Natl Acad Sci USA. vol. 75, 3727-3731) 등에 유래하는 시그널 펩티드를 들 수 있다. 바람직하게는 알칼리포스파타아제의 시그널 펩티드를 사용할 수 있고, 더 바람직하게는 PhoA-알칼리포스파타아제의 시그널 펩티드를 사용할 수 있다. 원핵세포 유래의 알칼리포스파타아제에는 여러 종류의 아이소자임이 존재하지만, 어느 아이소자임 유래의 시그널 펩티드를 사용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 모든 진핵세포 유래의 봉입체 형성 단백질에 대해서 사용할 수 있다. 특히, 목적 단백질 유전자를 그대로 발현시켰을 때에 원핵세포에 있어서 독성적으로 작용, 증식이나 발현량의 저하를 초래하는 경우나 목적 단백질이 분해를 받아서 생산량이 저하될 경우에 사용하면 효과적이다. 이러한 성질을 가지는 목적 단백질로서 proMMP-7, 아비박테리움ㆍ파라갈리나룸 C형균의 HMTp210, HIV-1 프로테아제, T세포 리셉터, 항균 펩티드, 인간 세포사 조절 단백질 BOX 등을 들 수 있다. 이것들의 목적 단백질의 유전자 서열은 오리지널 코돈인 상태로도 좋지만, 대장균의 코돈 사용빈도에 최적화한 서열이라도 상관없다. 이하, 주로 개변형 APSP의 하류에 proMMP-7을 결합시킨 봉입체 형성 단백질에 대해서 형태를 기술한다.

proMMP-7을 코딩하는 유전자는 시판의 신장 유래의 cDNA 라이브러리(Human MTC Panel I, Catalog number: K1420-1, BD사)를 사용하여, PCR를 실시하는 것에 의해 취득할 수 있다. PCR에 사용하는 프라이머는 데이터베이스(Accession Numbers; NM002423; proMMP-7)에 proMMP-7의 염기서열이 개시되어 있으므로, 이 서열에 의거해 설계할 수 있다. PCR에 사용하는 프라이머는 DNA 합성 수탁기관(예를 들면, QIAGEN사) 등에 의뢰하면 용이하게 입수 가능하다. 이 때, 목적에 따라서 5' 및 3'말단측에 적절한 제한효소 인식부위의 염기서열이 부가된다. 본원 실시예에서는 제한효소 NdeI 및 BamHI의 인식부위를 부가한 P1(서열번호 2) 및 P2(서열번호 3)의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 사용하였다. PCR에 의해 증폭한 핵산 단편은 클로닝 벡터, 예를 들면 pCRII-TOPO(Invitrogen사)에 클로닝하고, DNA 시퀀서(ABI Prism 377 Applied Biosystems)에 의해 염기서열의 결정이 수행된다. proMMP-7 유전자의 확인은 수득된 염기서열의 결과와 기존의 proMMP-7의 염기서열을 비교하는 것에 의해 이루어진다. 이렇게 해서 proMMP-7을 코딩하는 핵산 단편(이하, 「proMMP-7유전자」라고 언급하기도 한다)이 취득된다. 또 인간 proMMP-7을 코딩하는 염기서열을 서열번호 21에, 인간MMP-7의 아미노산 서열을 서열번호 22에 나타낸다.

이어서, proMMP-7유전자를 주형으로 하여, PCR에 의해, proMMP-7유전자의 5'말단측에 APSP 또는 개변형 APSP의 부가가 수행된다. 개변형 APSP의 조제에 있어서 아미노산 서열에 돌연변이를 도입할 때는, 부위지정 돌연변이 생성법이 사용된다. 실제로는 본 기술을 응용한 Invitrogen사의 Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System, Takara사의 Site-Directed Mutagenes is System(Mutan-Super Express Km, Mutan-Express Km, Mutan-K 등), Stratagene사의 Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit, Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit, 등의 시판의 키트를 사용하고, 첨부된 프로토콜에 따라서 수행된다. 실시예에서는 Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System을 사용하였다.

대장균의 시그널 펩티다아제는 시그널 서열이 잘 보존되어 있는 P3-P1 부위를 인식하는 것이 알려지고 있고, 그 부위에 돌연변이를 제공하면 시그널 펩티드는 절단되지 않게 된다(Shen 등, Biochemistry, 1991, vol. 30, 11775-11781). 전형적인 시그널 펩티드는 소수적인 성질의 측쇄를 가지는 아미노산 잔기가 비교적 고빈도로 나타나는 소수성 코어영역을 가지는 것이 알려져 있다. 또, 시그널 서열 내의 아미노산을 극성이 다른 아미노산으로 변이시키는 것에 의해, 시그널 서열의 기능을 저해시킬 수도 있다(PUZISS 등, J. Bacteriol., 1989, 2303-2311) .

PSP에 돌연변이를 넣는 부위로서는 proMMP-7의 프로테아제에 의한 분해를 억제하는 기능을 지닐 수 있으면, 어느 쪽의 부위일 수도 있다. 바람직하게는 시그널 펩티다아제의 결합부위, 더 바람직하게는 21번째의 Ala에 돌연변이가 도입된다. 돌연변이를 도입하는 방법으로서 아미노산의 치환, 결실, 부가 등을 들 수 있지만, 어느 쪽의 방법도 취할 수 있다. 바람직하게는, 21번째의 Ala가 다른 아미노산으로 치환된다. 치환되는 아미노산으로서는 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 타이로신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산이 바람직하다.

또, APSP의 입체구조를 변화시키는 아미노산으로 치환하는 것에 의해, proMMP-7의 발현량의 증가(융합 단백질로서의 번역 촉진 효과와 플라스미드 보유율 증가)과 프로테아제에 의한 분해의 억제를 동시에 실시할 수 있다. 이러한 입체구조의 변화를 일으키기 쉬운 아미노산으로서 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판(tryptophan) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 프롤린이다. 이러한 아미노산의 치환 부위로서는 프롤린 이외의 아미노산으로 구성되는 부위가 가능하지만, 바람직하게는, 13번째의 로이신이다.

또, APSP의 13번째의 로이신을 프롤린으로 치환하며, 또한 21번째의 알라닌을 상기의 어느 하나의 아미노산으로 치환한 개변형 APSP를 proMMP-7의 N 말단측에 결합시켰을 경우, IPTG에 의한 발현유도에 있어서, 어느 한쪽을 치환하였을 경우와 비교해서, 발현량을 올릴 수 있다. 따라서, 본 발명의 개변형 APSP의 가장 바람직한 형태는 13번째의 로이신의 프롤린으로의 치환과 21번째의 알라닌의 상기의 어느 하나의 아미노산으로의 치환이 된 개변형 APSP이다. 상기한 바와 같이, 프롤린은 페닐알라닌 또는 트립토판일 수도 있다.

또, APSP는 유래에 따라서는 서열번호 1의 상기 APSP의 N 말단 또는 N 말단의 메티오닌을 제거한 N 말단에, 1 이상의 아미노산이 부가되어 있는 것도 있다. 그러한 APSP도 서열번호 1의 APSP의 13번째의 로이신 및/또는 21번째의 알라닌에 상당하는 아미노산을, 전술한 바와 같이 치환하는 개변을 실시하는 것에 의해, 본 발명의 개변형 APSP으로 사용할 수 있다. 그러한 다른 종의 APSP의 예로서, E.coli_UTI89주(Acc. No. YP_539434), E.coli_CFT073주(Acc. No. NP_752424), Shigella flexneri 2a Str301(Acc. No. NP_706185)에 유래하는 것을 들 수 있다. 여기에서 언급한 다른 종의 APSP는 서열번호 1의 APSP에 있어서의 2∼21번째의 아미노 서열과 일치하는 서열을 지니고, 또 그 N 말단에 24아미노산이 부가된 서열(서열번호 20)로 이루어지지만, APSP로서 기능하면 이것들에 한정되지 않는다.

이렇게 해서 수득된 APSP 또는 여러 아미노산치환을 도입한 개변형 APSP이 부가된 proMMP-7유전자를 적당한 발현벡터에 합입하고, 당해 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하는 것에 의해서, proMMP-7의 발현이 이루어진다. 본 발명에서는 원핵세포 유래의 APSP를 사용하므로, 숙주세포로서는 대장균을 사용하는 것이 바람직하다. 숙주로서 대장균을 사용하는 경우에는, 대장균 발현용으로 trp프로모터, T7 프로모터, cspA프로모터를 가지는 여러 가지의 발현벡터가 개발ㆍ시판되고 있으므로 이것들 중에서 적당하게 선택해서 사용할 수 있다. 발현벡터에 맞추어서 적당한 대장균, 예를 들면, BL21, HMS174, DH5α, HB101, JM109 등이 숙주로서 선택된다. 대장균의 형질전환은 시판의 컴피턴트 셀을 사용하여, 첨부한 방법에 따라서 실시할 수 있다. 대장균의 배양에 사용되는 배지(예를 들면, LB, SOC, SOB 등) 및 형질전환체의 선택에 사용할 수 있는 시약(예를 들면, 암피실린 등)이나 발현유도에 사용되는 시약(예를 들면, 인돌아세트산(IAA), 아이소프로필티오-베타-D-갈락토시드(IPTG))는 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 또, 배지의 pH는 대장균의 증식에 적합한 범위(pH7.2-7.6)에서 사용된다.

숙주세포를 형질전환할 때에는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 인산 칼슘법, DEAE덱스트란법, 리포펙틴계의 리포솜을 사용하는 방법, 프로토플래스트 폴리에틸렌글리콜 융합법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있고, 사용하는 숙주세포에 의해 적당한 방법을 선택할 수 있다. 본원 실시예에서는, 발현벡터로서 pET22b(메르크사, 제품코드; 69744-3), 숙주세포로서 BL21(DE3), 발현시스템으로서 락토오스에서 발현유도를 실시하는 Overnight Express Autoinduction System 1(메르크사, 제품코드; 71300-3)을 사용해서 proMMP-7을 발현시켰다.

proMMP-7을 발현하고 있는 재조합 대장균의 스크리닝은 아래와 같이 수행된다. 발현 유도제(본원 실시예에 사용한 발현 시스템에서는 Overnight Express Autoinduction System 1을 사용)의 존재 하에, 배양ㆍ증식한 균체의 탁도(OD600nm)을 측정하고, 일정한 균량의 배양액을 고속원심분리에 의해 회수한다. 그 균체에 일정한 증류수를 첨가하여 현탁한 후, 초음파처리 또는 French press, Menton Gaulin 등의 호모게나이저에 의해 균체를 파쇄하고, 고속원심(15000rpm, 15분간)에 의해 침전물을 회수한다. 증류수에, 적당하게 계면활성제(예를 들면, Triton X100, BugBuster(메르크사)), 킬레이트제(예를 들면, EDTA), 리소자임 등을 첨가할 수 있다. 침전물에 회수한 proMMP-7(봉입체를 형성)을 SDS-PAGE용의 샘플 완충제로 가용화하고, 그 일정량을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 걸고, 쿠마시-브릴리언트 블루로 염색한 후, 분자사이즈 및 염색상으로부터 proMMP-7 단백질의 발현 및 발현의 정도가 확인된다. 또, proMMP-7의 확인(또는 검출)에는 상기의 분자사이즈에 의거하는 방법 이외에, ELISA법, 웨스턴 블롯법, 도트 블롯법 등의 항원항체 반응에 의거하는 방법이 취해지는 경우도 있다. 어느 것이나 대장균에서 발현시킨 외래 단백질을 검출할 때의 일반적인 방법으로, 목적에 따라서 적당하게 선택할 수 있다.

이렇게 해서 수득된 proMMP-7 생산 대장균으로부터 MMP-7을 회수하기 위해서는 이하의 방법이 취해진다. 우선, proMMP-7 생산 대장균을 배양하고, 증식시킨 균체를 적절한 방법으로 파쇄하고, proMMP-7로 이루어지는 봉입체를 균체 외로 방출시킨다. 지금까지의 대장균을 사용한 유전자 재조합 기술에서는 유전자 재조합체의 선발에 사용하는 선택 마커 유전자로서, 암피실린 등의 항생물질에 대한 내성 유전자가 사용되어 왔다. 그렇지만, 항생물질을 사용하는 것은 환경으로의 확산이나, 제작된 의약품으로서의 안전성에 대한 걱정도 있고, 공업적인 생산기술의 개발에 있어서의 장애가 되고 있다. 또, 재조합체를 사용해서 의약품이나 동물의약품, 식품을 제조해서 판매할 때는, 그 혼입을 엄격하게 관리하는 것이 필요하게 된다. 이러한 배경에 의해, 공업적 생산을 실시하는 경우의 배지로서, 안전성에 충분하게 배려한 항생물질 비함유 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 균체의 파쇄에는 예를 들면 화학물질, 계면활성제, 효소 등으로 용해시키는 방법 또는 French press나 초음파처리 등의 물리적 처리에 의한 방법이 취해지지만, 어느 방법일 수 있다. 이것들의 방법을 몇 가지 조합시키는 것에 의해, 더 효과적으로 균체를 파쇄할 수 있다. 봉입체 함유 파쇄액의 원심분리와 세정을 반복하는 것에 의해 대부분의 균체성분이 제거된다. 세정에는 트리스 완충액, 인산 완충액, 글리신 완충액, 탄산 완충액 등 일반적인 완충액이 사용된다. 봉입체는 봉입체 함유 용액을 원심분리하는 것에 의해, 침전으로서 회수된다.

회수한 봉입체는 일단, 환원제 및 변성제를 함유하는 용액으로 용해된다. 이러한 환원제로서 시스테인, 글루타티온, 디티오트레이톨 및 2-메르캅토에탄올 등을 사용할 수 있다. 이것들은 몇 개를 조합시켜서 사용할 수도 있다. 환원제의 농도는 용해하는 봉입체의 양에 의존하지만, 10∼200mM의 범위에서 사용된다. 변성제로서는 요소, 구아니딘 염산염 등을 사용할 수 있다. 이러한 요소 및 구아니딘 염산염은 각각 4∼8M 및 2∼6M의 농도범위에서 사용된다. 또, 완충액으로서는 봉입체의 회수에서 사용하는 것과 동일한 완충액이 사용된다. 용해시의 온도는 40℃이하라면 특별히 제한할 필요는 없다. 용해시간은 봉입체의 용해상황을 보면서 설정할 수 있고, 통상, 30분∼1시간 교반된다.

다음에 봉입체의 용해액에, 계면활성제, 금속이온을 포함하는 리폴딩 버퍼를 첨가하는 것에 의해, proMMP-7의 리폴딩, 즉 정상인 입체구조의 구축이 이루어진다. 이때 사용하는 계면활성제로서 브리지 35, 금속이온으로서 아세트산아연, 염화코발트 등이, 각각 0.5∼2% 및 0.05mM∼0.2mM의 농도범위에서 사용된다. 리폴딩할 때의 완충액의 종류 및 농도는 봉입체를 용해할 때와 동일한 것을 사용할 수 있다. 완충액의 pH는 7.0∼9.0의 범위에서 사용된다. 리폴딩은 1일 이상 정치하는 것에 의해 이루어진다.

리폴딩 용액으로부터 proMMP-7을 정제할 때는, 일반적으로, 단백질 화학에 있어서 사용되는 정제방법, 예를 들면 원심분리, 염석법, 한외여과법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환 크로마토그래피법, 겔여과 크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 소수 크로마토그래피법, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피법 등의 방법을 조합시킨 방법이 사용된다. 수득된 단백질이나 폴리펩티드의 양은, BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce Biotechnology, Inc), Protein Assay Kit(BIO-RAD, Inc) 등의 단백질 측정시약을 사용해서 측정된다. 예를 들면 양이온 칼럼에 proMMP-7을 흡착시켜, 세정 후, 고농도로 용출하는 것에 의해 proMMP-7을 정제할 수 있다(Oneda 등, J Biochem., 1999, vol. 126, 905-911).

이어서, proMMP-7의 MMP-7으로의 변환이 수행된다. 변환방법으로서는 proMMP-7 함유용액을 1mM(4-아미노페닐)머큐릭 아세테이트(APMA) 또는 0.2㎛ 트립신 존재 하, 37℃에서 보온하는 방법이나, proMMP-7 함유용액을 53℃에서 보온하는 방법(Crabbe 등, Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507)을 들 수 있지만, 어느 방법을 사용할 수 있다. 보온시간은 1-48시간의 범위에서 수행되지만, 시약 및 proMMP-7의 농도나 처리량 등에 따라 적당하게 조절된다. 트립신은 N-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(TPCK) 처리한 것이 사용된다.

MMP-7의 활성을 측정하는 방법으로서는, 형광기질(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH₂: 서열번호 23)의 MMP-7에 의한 절단을 형광측정장치에 의해 측정하는 방법이 있다(Crabbe 등, Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507). 실제로는, 이러한 원리에 의거하는 MMP-7 활성측정 키트(ANASPEC사)가 시판되고 있으므로, 이것을 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서, 활성의 측정이 수행된다. 이렇게 해서 변환된 MMP-7을 proMMP-7로부터 분리 정제할 때는, 전술의 단백질 정제방법이 사용된다.

아비박테리움ㆍ파라갈리나룸 C형균의 HMTp210 유전자를 취득하는 경우에는, 균체로부터 추출한 전체 RNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 출발재료로 하여 PCR를 실시하는 것에 의해 취득할 수 있다. PCR에 사용하는 프라이머는 Tokunaga 등이 개시한 HPG-C형균 유래의 HMTp210 유전자의 염기서열에 의거하여 설계된다(일본공개특허공보 제H10-514499호). HMTp210 유전자의 클로닝, 발현벡터의 구축, HMTp210 단백질의 발현 및 정제는 proMMP-7와 동일한 방법에 따를 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 수득된 MMP-7 및 HMTp210은 치료, 진단 또는 다른 용도를 위해서 제약학적 조합제로 처방할 수 있다. 예를 들면 MMP-7은 정맥내 투여를 위한 조합제에 대해서는, 통상, 생리학적으로 적합할 수 있는 물질, 예를 들면 염화나트륨, 글리신 등을 포함하며, 또한 생리학적 조건에 적합할 수 있는 완충된 pH를 가지는 수용액 중에 용해된다. 또 장기 안정성의 확보의 관점으로부터, 최종 적제형으로서 동결건조제제의 형태를 취하는 것도 고려될 수 있다. 또, 정맥내에 투여되는 조성물의 지침은 정부의 규칙, 예를 들면 「생물학적 제재기준」에 의해 확립되어 있다. 본원발명의 MMP-7을 유효성분으로 함유하는 의약품 조성물의 구체적인 용도로서는 추간판 헤르니아 환자 등에 대한 투여요법을 들 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 따라서, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 하기의 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

《APSP를 가지는 proMMP-7 발현벡터(pETMMP7)의 구축》

신장의 cDNA 라이브러리(Human MTC Panel I, Catalog#: K1420-1, BD사)사로부터 프라이머 P1(서열번호 2)과 P2(서열번호 3)를 사용해서 proMMP-7 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다. 증폭된 DNA를 클로닝 벡터(pCRII-TOPO, Invitrogen)에 삽입하고, 수득된 DNA의 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 결정에는 DNA 시퀀서를 사용해서 실시하였다. 당해 염기서열과 데이터베이스(Accession Numbers: NM002423)에 등록되어 있는 proMMP-7의 염기서열의 상동성 검색을 실시하고, proMMP-7 유전자가 삽입된 플라스미드(pCRproMMP-7)를 얻었다.

다음에, pCRproMMP-7을 주형으로 하고, 제한효소 NdeI 인식서열, PhoA-알칼리포스파타아제 시그널 펩티드(APSP) 서열을 코딩하는 염기서열 및 proMMP-7의 N-말단서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 프라이머 P3(서열번호 4)과 제한효소BamHI 인식서열 및 proMMP-7의 C-말단서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 프라이머 P4(서열번호 5)를 사용하여, PCR를 실시하였다. 상기와 동일하게 증폭된 DNA를 클로닝 벡터에 삽입하고, 수득된 DNA의 염기서열을 결정하였다. 염기서열에 돌연변이가 없는 것을 확인한 후, 수득된 플라스미드를 제한효소 NdeI 및 BamHI로 절단하고, 미리 같은 제한효소로 절단한 발현벡터 pET22b(메르크사, 제품코드; 69744-3)에 삽입하고, proMMP-7 유전자가 삽입된 플라스미드(pETMMP7)를 얻었다.

실시예 2

《개변형 APSP를 가지는 발현벡터 pETMMP7의 구축》

(1) 시그널 펩티다아제 인식부위의 개변

실시예 1에서 얻은 pETMMP7의 APSP의 시그널 펩티다아제 인식 부위(서열번호1의 아미노산 서열의 21번째의 알라닌(Ala))에, GeneTailor 부위지정 돌연변이 생성 시스템(Invitrogen사)을 사용하고, 돌연변이를 도입하였다. 돌연변이 서열을 포함하는 프라이머와 그 프라이머 서열과 일부 동일한 서열을 가지는 역방향의 프라이머에서, 메틸화된 pETMMP7을 주형에 PCR를 실시하는 것에 의해, 돌연변이가 도입된다. 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu), 리신(Lys)으로 각각 치환하였다.

(2) 시그널 서열에 구조변화를 제공하는 개변

상기 (1)과 동일한 방법에 의해, APSP의 13번째의 로이신(Leu)을 프롤린(Pro)으로 치환하였다.

(3) 시그널 펩티다아제 인식 부위와 시그널 서열에 구조변화를 제공하는 개변

상기 (1)과 동일한 방법에 의해, 21번째의 알라닌을 각각 Asp, Glu, Lys, 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 타이로신(Tyr)으로, 또한 APSP의 13번째의 로이신을 프롤린으로 치환하였다. 각각의 개변형 APSP를 가지는 발현벡터, APSP에 있어서의 개변내용, 개변에 사용한 프라이머를 표 1에 나타낸다.

실시예 3

《비개변형 및 개변형 APSP를 가지는 pETMMP7의 발현》

실시예 1에서 얻은 비개변형의 APSP를 가지는 pETMMP7, 실시예 2에서 얻은 개변형 APSP를 가지는 pETMMP7에서 대장균(BL21(DE3))을 형질전환하고, proMMP-7 의 발현을 실시하였다. 형질전환에 사용한 발현벡터 및 수득된 proMMP-7 생산 대장균을 표 2에 나타낸다.

발현 유도는 Overnight Express Autoinduction System 1(메르크사; 제품코드 71300-3)을 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 수행하였다. 간단하게는, 125㎖의 삼각 플라스크에 50㎍/㎖ 암피실린(와코쥰야쿠주식회사)을 포함하는 LB배지 50㎖에 각 콜로니를 현탁하고, Kit의 시약을 첨가하고, 37℃에서 16시간 배양하였다. 그 균체액의 OD600nm을 측정하고, OD600nm=20, 1㎖에 상당하는 균체를 원심분리에 의해 침전물에 회수하였다. 침전물을 200㎕의 BugBuster에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 침사를 얻었다. 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔전기 영동(SDS-PAGE)용의 샘플 완충제로 가용화하고, 15% 아크릴아미드겔 SDS-PAGE에 걸고, CBB 염색을 실시하였다. 그 결과, 시그널 펩티다아제 결합부위(21번째의 Ala) 만을 다른 아미노산 치환된 개변형 APSP를 가지는 발현벡터로 형질전환해서 수득된 MMP7A21D균, MMP7A21E균, MMP7A21K균은 비개변형의 APSP를 가지는 발현벡터로 형질전환해서 수득된 MMP7균에 비해서, proMMP-7의 분해물(분자량 28-30kD)의 량이 감소하였다(도 1 참조).

또, 13번째의 Leu를 Pro로 치환한 개변형 APSP를 가지는 발현벡터로 형질전환해서 수득된 MMP7L13P균은 MMP7균에 비해서, proMMP-7(분자량 31kD)의 발현량의 증가와 분해의 억제가 인정되었다(도 2 참조). 또 13번째의 Leu의 Pro에의 치환과 21번째의 Ala의 다른 아미노산에의 치환의 양쪽개변을 실시한 발현벡터로 형질전환해서 수득된 MMP7L13P-A21D균, MMP7L13P-A21E균, MMP7L13P-A21K균, MMP7L13P-A21H균, MMP7L13P-A21F균, MMP7L13P-A21Y균을, 락토오스 유도(Overnight Express Autoinduction System 1)을 실시하였을 때에는, proMMP-7 발현량의 증가와 분해의 억제효과가 증강되었다(도 3 참조).　또한 MMP7균, MMP7L13P균, MMP7A21E균, MMP7L13P-A21E균을 IPTG 유도를 실시하였을 때에는, MMP7L13P-A21E균에 있어서, 발현량의 증가가 인정되었다(도 4 참조).

실시예 4

《proMMP-7생산 대장균의 플라스미드의 보유율》

실시예 3에서 얻은 MMP7L13P-A21E균 및 MMP7균을 각각 500㎖의 삼각 플라스크에 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB배지 100㎖에 현탁하고, 6시간 배양한 후, 각 배양액을 LB 한천 플레이트에 파종하였다. 각각의 콜로니를 100개, 50㎍/㎖암피실린을 포함하는 LB한천 플레이트에 이식하고, 콜로니의 증식을 조사하였다. 그 결과, 콜로니가 증식한 비율은 MMP7L13P-A21E균에서 100개, MMP7균에서 28개이었다.

실시예 3에서 얻은 MMP7L13P-A21E균을, 암피실린을 포함하지 않는 LB배지 100㎖에 현탁하고, 6시간 배양한 후, 각 배양액 10㎕을 상기와 동일하게 배양해서 균체를 계대하였다. 그 계대배양을 6회 반복한 후, 각 배양액을 LB 한천 플레이트에 파종하였다. 각각의 콜로니를 100개, 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트에 이식하고, 콜로니의 증식을 조사하였다. 그 결과, 콜로니가 증식한 비율은 92개이었다.

실시예 5

《proMMP-7로부터 MMP-7으로의 변환》

(1) 수은에 의한 활성화

MMP7균, MMP7L13P-A21E균을 Overnight Express Autoinduction System 1에 의해 발현시키고, BugBuster에 의해 균체를 파쇄하고, 침전물을 조제하였다. 그 침전물 1mg에 대해서 10㎕의 봉입체 용해액(6M 염산 구아니딘, 0.1MDTT)의 비율로 침전물을 용해하였다. 그 봉입체 용해액을 리폴딩 버퍼(0.1mM 아세트산아연, 0.2M NaCl, 10mM CaCl₂, 1% Brij35/50mM Tris-HCl, pH7.5)로 10배로 희석하였다. 그 용액을 MMP-7 활성 측정 키트(Enzolyte 520MMP-7 Assay Kit, ANASPEC사, 제품코드 71153)의 프로토콜에 따라서, 수은으로 proMMP-7을 활성화하고, 절단된 형광기질의 형광을 형광측정기기로 측정하였다. 표준품으로서 Oriental효모사의 proMMP-7을 사용하였다. 그 결과, MMP7균의 리폴딩 용액의 proMMP-7의 농도는 36.2㎍/㎖이고, MMP7L13P-A21E균에서는 383.2㎍/㎖이었다. 리폴딩 용액에서의 proMMP-7의 수량은 약 10배로 증가하였다.

(2) 가열에 의한 자기 활성화

상기 (1)에서 얻은 봉입체 용해액을 리폴딩 버퍼(0.1mM 아세트산아연 0.2M NaCl 10mM CaCl₂ 1% Brij35/50mM Tris-HCl pH7.5)로 100배로 희석하였다. 리폴딩 용액을 53℃에서 2시간 보온하는 것에 의해, proMMP-7의 자기 활성화를 실시하였다. 그 용액을 수은을 첨가하지 않고, MMP-7 활성측정 Kit의 기질을 첨가하고, 그 형광을 측정하였다. 표준품으로서 Oriental효모사의 MMP-7을 사용하였다. 그 결과, MMP7균의 보온용액의 MMP-7의 농도는 27㎍/㎖이고, MMP7L13P-A21E균에서는 126㎍/㎖이었다.

실시예 6

《아비박테리움ㆍ파라갈리나룸 C형균 HMTp210 발현》

(1) 아비박테리움ㆍ파라갈리나룸 C형균 HMTp210 발현벡터의 구축

아비박테리움ㆍ파라갈리나룸 C형균 53-47주에서 통상의 방법에 따라서 게놈 DNA를 추출하고, S1 및 S2 프라이머(서열번호 16, 17)을 사용하고, 방어 항원유전자인 HMTp210 유전자의 4000bp 단편(이하, CorC4000)을 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 제한효소 NcoI 및 XhoI로 절단하고, 사전에 동일한 제한효소로 절단한 발현벡터 pET11d(메르크사, 제품코드; 69439-3)에 삽입하여 CorC4000 유전자가 삽입된 플라스미드(pET-CorC4000)를 얻었다.

(2) 개변형 APSP, 또는 비개변형 APSP를 가지는 HMTp210 발현벡터의 구축

pET-CorC4000에서 S3 및 S4프라이머(서열번호 18, 19)을 사용하고, CorC4000 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 제한효소 BamHI로 절단하고, pET15b-ALP 의 BamHI 부위에 삽입하고, 개변형 APSP를 코딩하는 염기서열 및 HMTp210 유전자가 삽입된 플라스미드(pET-ALP-CorC4000)를 얻었다. 또, 동 PCR산물을 제한효소 BamHI로 절단하고, pET15b-nALP 의 BamHI 부위에 삽입하고, 비개변형 APSP를 코딩하는 염기서열 및 Knob-S134 유전자가 삽입된 플라스미드(pET-nALP-CorC4000)를 얻었다.

(3) CorC4000 의 발현

발현 플라스미드 pET-CorC4000, pET-nALP-CorC4000, 및 pET-ALP-CorC4000을 각각 도입한 BL21(DE3) 대장균을 50㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 Circle Grow(CG)배지 3㎖ 중에 파종하고, OD600nm의 탁도가 0.5-1.0이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후에 최종농도 1mM이 되도록 아이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드를 첨가하고, 추가로 16시간 배양하고, CorC4000의 발현을 유도하였다. 그리고 배양한 대장균을 원심분리에 의해 집균하였다. 침전물을 BugBuster에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 침전물을 얻었다. 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)용의 샘플 완충제로 가용화하고, 균체액이 OD600nm=20이 되도록 조제하였다. 조제한 액은 5-20% 아크릴아미드겔 SDS-PAGE에 제공하여 시험 후, CBB 염색을 실시하고, APSP 부가의 유무에 의한 Knob-S134의 발현량을 비교하였다. 그 결과, 개변형 APSP를 가지는 pET-ALP-S134로 형질전환해서 수득된 대장균은 APSP를 부가하지 않는 pET15b-S134 및 비개변형 APSP를 가지는 pET-nALP-S134로 형질전환한 대장균에 비해서, 발현량의 증가가 인정되었다(도 5 참조).

(산업상의 이용가능성)

본 발명의 원핵세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 단백질의 제조방법은 여러 산업상 유용한 외래 단백질을 대장균으로 효율적으로 생산하는 방법으로 이용할 수 있다. 특히, 매트릭스 메탈로프로테아제-7의 전구체인 프로매트릭스 메탈로프로테아제-7의 제조에 적합하다.

SEQUENCE LISTING <110> JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE TEIJIN PHARMA LIMITED <120> A method for the preparation of inclusion body forming protein <130> 669339 <150> JP 2008-270941 <151> 2008-10-21 <160> 23 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of a signal peptide of alkaline phosphatase <400> 1 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the cloning of a pro-matrix metalloproteinase-7 gene <400> 2 ccataggtcc aagaacaatt gtctctg 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the cloning of a pro-matrix metalloproteinase-7 gene <400> 3 caatccaatg aatgaatgaa tggatg 26 <210> 4 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of an alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 4 catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc 60 aaggccctgc cgctgcctca g 81 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of an alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 5 ggatccctat ttctttcttg aattac 26 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 6 cttggtcaca ggggtaaaca gtaacggtaa ga 32 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 7 cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag 33 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 8 cggtaagagt gccagtgcaa tagtgctttg tttc 34 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 9 ctgtttaccc ctgtgaccaa ggatctgccg ctgcc 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 10 ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 11 ctgtttaccc ctgtgaccaa gaaactgccg ctgcc 35 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 12 ttgcactggc actcttaccg ccgctgttta cccctg 36 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 13 ctgtttaccc ctgtgaccaa gcatctgccg ctgcc 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 14 ctgtttaccc ctgtgaccaa gtttctgccg ctgcc 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 15 ctgtttaccc ctgtgaccaa gtatctgccg ctgcc 35 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the cloning of a HMTp210 gene of Avibacterium paragallinarum type C <400> 16 caaccatgga aggagaggtg gaaatta 27 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the cloning of a HMTp210 gene of Avibacterium paragallinarum type C <400> 17 cgcggatccc taaccttgag tgctagatgc tgtaggtgc 39 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the construction of an expression vector with a HMTp210 gene of Avibacterium paragallinarum type C <400> 18 cgcggatcca ctaattataa tgacaaa 27 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the construction of an expression vector with a HMTp210 gene of Avibacterium paragallinarum type C <400> 19 ggaagatctc taaccttgag tgctagatgc 30 <210> 20 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of amino acid residues No. 2-21 to whose N-terminus twenty four amino acid residues are added <400> 20 Met Ser Arg Pro Arg Leu Ile Val Ala Leu Phe Leu Phe Phe Asn Val 1 5 10 15 Phe Val His Gly Glu Asn Lys Val Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala 20 25 30 Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala 35 40 <210> 21 <211> 750 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ctgccgctgc ctcaggaggc gggaggcatg agtgagctac agtgggaaca ggctcaggac 60 tatctcaaga gattttatct ctatgactca gaaacaaaaa atgccaacag tttagaagcc 120 aaactcaagg agatgcaaaa attctttggc ctacctataa ctggaatgtt aaactcccgc 180 gtcatagaaa taatgcagaa gcccagatgt ggagtgccag atgttgcaga atactcacta 240 tttccaaata gcccaaaatg gacttccaaa gtggtcacct acaggatcgt atcatatact 300 cgagacttac cgcatattac agtggatcga ttagtgtcaa aggctttaaa catgtggggc 360 aaagagatcc ccctgcattt caggaaagtt gtatggggaa ctgctgacat catgattggc 420 tttgcgcgag gagctcatgg ggactcctac ccatttgatg ggccaggaaa cacgctggct 480 catgcctttg cgcctgggac aggtctcgga ggagatgctc acttcgatga ggatgaacgc 540 tggacggatg gtagcagtct agggattaac ttcctgtatg ctgcaactca tgaacttggc 600 cattctttgg gtatgggaca ttcctctgat cctaatgcag tgatgtatcc aacctatgga 660 aatggagatc cccaaaattt taaactttcc caggatgata ttaaaggcat tcagaaacta 720 tatggaaaga gaagtaattc aagaaagaaa <210> 22 <211> 173 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Tyr Ser Leu Phe Pro Asn Ser Pro Lys Trp Thr Ser Lys Val Val Thr 1 5 10 15 Tyr Arg Ile Val Ser Tyr Thr Arg Asp Leu Pro His Ile Thr Val Asp 20 25 30 Arg Leu Val Ser Lys Ala Leu Asn Met Trp Gly Lys Glu Ile Pro Leu 35 40 45 His Phe Arg Lys Val Val Trp Gly Thr Ala Asp Ile Met Ile Gly Phe 50 55 60 Ala Arg Gly Ala His Gly Asp Ser Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn 65 70 75 80 Thr Leu Ala His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Leu Gly Gly Asp Ala 85 90 95 His Phe Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asp Gly Ser Ser Leu Gly Ile 100 105 110 Asn Phe Leu Tyr Ala Ala Thr His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Met 115 120 125 Gly His Ser Ser Asp Pro Asn Ala Val Met Tyr Pro Thr Tyr Gly Asn 130 135 140 Gly Asp Pro Gln Asn Phe Lys Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile 145 150 155 160 Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser Asn Ser Arg Lys Lys 165 170 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A DNP-protein of fluorescent substrate used for measuring the activity of MMP-7 <400> 23 Pro Leu Gly Leu Trp Ala Arg 1 5

Claims

원핵세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 단백질(봉입체 형성 단백질)을 코딩하는 염기서열로 이루어진 핵산 단편으로서,
다음의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 변형된 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 로이신을 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환한 것인 변형된 시그널 펩티드,
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열의 21번째의 알라닌을 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 타이로신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환한 것인 변형된 시그널 펩티드, 및
(c) 서열번호 1의 아미노산 서열의 13번째의 로이신을 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환하며, 또한, 21번째의 알라닌을 아스파라긴산, 글루탐산, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 타이로신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환한 것인 변형된 시그널 펩티드,
및 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산 단편.
제 1 항에 있어서, 원핵세포가 그램음성균인 핵산 단편.
제 1 항에 있어서, 원핵세포가 대장균인 핵산 단편.
제 1 항에 있어서, 목적 단백질이 프로매트릭스 메탈로프로테아제-7(proMMP-7) 또는 아비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum) C형균의 HMTp210인 핵산 단편.
제 1 항에 있어서, 목적 단백질을 코딩하는 염기서열이 변형된 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열의 하류에 위치하는 핵산 단편.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 단편이 도입된 발현벡터.
제 6 항에 기재된 발현벡터로 숙주를 형질전환하는 것에 의해 수득된 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.
제 7 항에 있어서, 숙주가 원핵세포인 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.
제 7 항에 있어서, 숙주가 그램음성균인 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.
제 7 항에 있어서, 숙주가 대장균인 봉입체 형성 단백질 생산 숙주.
(1) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 단편이 도입된 발현벡터를 조제하는 공정,
(2) 상기 (1)의 발현벡터로 형질전환된 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 조제하는 공정 및
(3) 상기 (2)의 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 배양해서 수득되는 배양물로부터 봉입체 형성 단백질을 정제하는 공정으로 이루어지는,
원핵세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 단백질(봉입체 형성 단백질)의 제조방법.
제 11 항에 있어서, 발현벡터가 T7 프로모터의 하류에 상기 핵산 단편이 도입된 발현벡터인 제조방법.
제 11 항에 있어서, 숙주가 원핵세포인 제조방법.
제 11 항에 있어서, 숙주가 그램음성균인 제조방법.
제 11 항에 있어서, 숙주가 대장균인 제조방법.
제 11 항에 있어서, 봉입체 형성 단백질 생산 숙주를 항생물질 비함유 배지중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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