WO2010047347A1 - 封入体形成タンパク質の製造方法 - Google Patents

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WO2010047347A1
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inclusion body
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acid fragment
protein
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博 中武
明広 米田
清剛 末永
正樹 平嶋
浩明 前田
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財団法人化学及血清療法研究所
帝人ファーマ株式会社
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein that forms an inclusion body when expressed in prokaryotic cells (hereinafter sometimes referred to as “inclusion body-forming protein”) and a nucleic acid fragment used in the production method. Specifically, (1) a step of preparing an expression vector in which a nucleic acid fragment comprising a sequence obtained by binding a base sequence of a target protein gene is downstream of a base sequence encoding a modified signal peptide, and (2) the expression An inclusion body-forming protein comprising a step of preparing an inclusion body-forming protein production host transformed with a vector, and (3) a step of purifying the inclusion body-forming protein from a culture obtained by culturing the inclusion body-forming protein production host And the nucleic acid fragment of (1) above.
  • matrix metalloprotease 7 As the target protein, matrix metalloprotease 7 (hereinafter sometimes referred to as “MMP-7”) is particularly preferred. Therefore, a particularly preferred embodiment of the present invention comprises a base sequence encoding a modified signal peptide, and The present invention relates to a nucleic acid fragment containing a base sequence encoding promatrix metalloprotease 7 (hereinafter also referred to as “proMMP-7”), and a method for producing MMP-7 using the nucleic acid fragment.
  • proMMP-7 promatrix metalloprotease 7
  • periplasm periplasmic space
  • the efficiency of transport of the target protein to the periplasm through the inner membrane varies depending on the combination of the signal sequence and the target protein, and a method for always obtaining high transport efficiency is not known.
  • periplasms such as E. coli also secrete proteolytic enzymes (proteases), and the target protein secreted into the periplasm may be degraded.
  • the target protein when the target protein is secreted into the periplasm in a denatured state, a structure called an inclusion body may be formed there, and the target protein taken into the inclusion body is said to be hardly subject to degradation by protease. Furthermore, since the inclusion body incorporates a high concentration of the target protein, it may be advantageously used in terms of purification efficiency and yield.
  • Gram-negative bacteria such as Escherichia coli (such as modifying the signal peptide).
  • a gene introduced by excluding the gene introduced by the recombinant during the growth process when a recombinant having a gene introduced into a host is used for production, and when a selective medium containing antibiotics is not used, a gene introduced by excluding the gene introduced by the recombinant during the growth process.
  • the production of the material may be reduced by preferential growth. Therefore, when a gene (expression plasmid, etc.) is introduced into the host, the antibiotics used for selection are decomposed or modified, so that a gene for acquiring resistance to the antibiotics is also introduced into the host at the same time.
  • antibiotics eg ampicillin, tetracycline, etc.
  • a recombinant carrying the gene is selected, and the introduced gene is A method is taken to suppress the generation of the excluded recombinant.
  • antibiotics may be toxic to living organisms or cause drug hypersensitivity (allergy).
  • allergy drug hypersensitivity
  • a configuration or method is desired in which the introduced gene is maintained without selection with antibiotics or the like.
  • MMP-7 is one of matrix metalloproteases (hereinafter sometimes referred to as “MMP”) belonging to the zinc-type metalloprotease family having a zinc molecule in the active site (see, for example, Non-Patent Document 3). MMPs are produced as precursors, the signal sequence is processed during extracellular secretion, and then the pro sequence is processed to the active form. MMP secreted extracellularly governs the metabolism of extracellular matrix, whereas MMP-7 is secreted mainly by cancer cells and is involved in invasion and metastasis (for example, non-patent literature) 4).
  • MMP matrix metalloproteases
  • MMP-7 does not have the hinge and hemopexin-like domains that many other MMPs have, and consists of the smallest molecular unit in MMP, which constitutes collagen and the extracellular matrix (fibronectin, vitronectin) , Laminin, aggrecan) as substrate.
  • MMP-7 is based on aggrecan, which is the main component of cartilage tissue, and macrophages derived from surgical specimens of disc herniation express MMP-7 (for example, see Non-Patent Document 5). It is presumed to be involved in the natural regression of Subsequently, Muro et al. Administered MMP-7 to the discs of hernia dogs and observed a decrease in the volume of the nucleus pulposus in the intervertebral disc, and showed the potential as a therapeutic agent for disc herniation (for example, see Non-patent Document 6). ).
  • MMP-7 As a pharmaceutical product is desired, MMP-7 is present only in trace amounts in living organisms, and it is extremely difficult to separate and purify MMP-7 from living organisms. In this case, there are concerns about safety issues such as potential virus contamination. Although MMP-7 can be obtained from cancer cells, it is not preferable to use cancer cells as production strains (see, for example, Non-Patent Document 7).
  • proMMP-7 when the proMMP-7 gene is introduced into E. coli, proMMP-7 is not expressed due to its strong toxicity to E. coli.
  • proMMP-7 By adding a signal peptide to the N-terminal side of proMMP-7, proMMP-7 can be expressed in E. coli.
  • a signal peptide when a signal peptide is simply added, the expression level of proMMP-7 is small, and a part of the expressed proMMP-7 is degraded by protease. These degradations result in a decrease in the expression product of E. coli or a decrease in yield in refolding from inclusion bodies, which hinders the establishment of an efficient proMMP-7 production method.
  • the object of the present invention is to provide a novel combination of gene fragments and a method for expressing the target protein in prokaryotic cells using the gene fragments, which can increase the expression level and suppress degradation by protease, and then It is to provide a manufacturing method.
  • PhoA-alkaline phosphatase signal peptide represented by SEQ ID NO: 1 which is a binding site of signal peptidase.
  • a modified PhoA-alkaline phosphatase signal peptide (hereinafter referred to as “modified APSP”) in which the 21st alanine in the amino acid sequence of the amino acid sequence of the amino acid sequence is substituted with any amino acid, for example, aspartic acid, glutamic acid, lysine, histidine, phenylalanine or tyrosine.
  • proMMP-7 By degrading proMMP-7 by a protease, by expressing in E. coli using a nucleic acid fragment added to the 5 ′ side of the proMMP-7 gene.
  • the modified APSP in which the 13th leucine was replaced with proline and the 21st alanine was replaced with any of the above amino acids was obtained.
  • IPTG isopropylthio-beta-D-galactoside
  • nucleic acid fragment consisting of a base sequence encoding a protein that forms an inclusion body (inclusion body-forming protein) when expressed in a prokaryotic cell, the base sequence encoding a modified signal peptide and the target protein
  • the nucleic acid fragment comprising the nucleotide sequence to be processed.
  • the nucleic acid fragment according to [1] wherein the prokaryotic cell is a gram-negative bacterium.
  • proMMP-7 promatrix metalloprotease 7
  • HMTp210 of Abibacterium paragalinalum type C.
  • modified signal peptide is a modified signal peptide of a protein that passes through a prokaryotic inner membrane.
  • nucleic acid fragment according to [5] wherein the protein is selected from the group consisting of alkaline phosphatase, OmpA, PelB, OmpT, LamB, OmpF and ⁇ -lactamase.
  • modified signal peptide is a modified signal peptide of PhoA-alkaline phosphatase (modified APSP).
  • modified APSP is obtained by substituting the 13th leucine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with any amino acid selected from the group consisting of proline, phenylalanine and tryptophan. fragment.
  • a modified APSP is obtained by replacing the 21st alanine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with any amino acid selected from the group consisting of aspartic acid, glutamic acid, lysine, histidine, phenylalanine and tyrosine.
  • the modified APSP replaces the 13th leucine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with any amino acid selected from the group consisting of proline, phenylalanine and tryptophan, and the 21st alanine is replaced with asparagine.
  • nucleic acid fragment according to [7] which is substituted with any amino acid selected from the group consisting of acid, glutamic acid, lysine, histidine, phenylalanine and tyrosine.
  • An inclusion body-forming protein production host obtained by transforming the host with the expression vector according to [12].
  • [17] A method for producing a protein that forms an inclusion body (inclusion body-forming protein) when expressed in a prokaryotic cell, comprising the following steps (1) to (3): (1) a step of preparing an expression vector incorporating the nucleic acid fragment according to any one of [1] to [11], (2) a step of preparing an inclusion body-forming protein production host transformed with the expression vector of (1), and (3) a culture obtained by culturing the inclusion body-forming protein production host of (2) A step of purifying the inclusion body-forming protein. [18] The production method according to [17], wherein the expression vector is an expression vector in which the nucleic acid fragment according to any one of [1] to [11] is incorporated downstream of the T7 promoter.
  • a nucleic acid fragment comprising a base sequence encoding a protein that forms an inclusion body (inclusion body forming protein) when expressed in a prokaryotic cell, the base encoding a modified signal peptide and a target protein
  • a nucleic acid fragment comprising a sequence, an expression vector into which the nucleic acid fragment is inserted, an inclusion body-forming protein production host transformed with the expression vector, and a method for producing an inclusion body-forming protein using the inclusion body-forming protein production host Is done.
  • the expression plasmid retention rate is improved, and it is not necessary to add antibiotics used for the purpose of plasmid retention such as ampicillin to the medium. Furthermore, the responsiveness of various induction systems for expressing the target protein is improved, and the expression level of the target protein is improved. In addition, since the target protein incorporated into the inclusion body is less decomposed by the protease and the refolding efficiency is improved, the efficiency of finally recovering the target protein having a function is improved. That is, the target protein can be easily produced by using the method of the present invention.
  • proMMP-7 pro-matrix metalloproteinase 7
  • proMMP-7 can be increased, and degradation of proMMP-7 by protease derived from E. coli can be suppressed in the process of culturing and purifying the proMMP-7-producing E. coli. Therefore, according to the method of the present invention, for example, purification of proMMP-7 and conversion of proMMP-7 to MMP-7 are facilitated, and MMP-7 can be produced efficiently.
  • FIG. 1 shows a proMMP-7-producing Escherichia coli obtained by transformation with an expression vector having a modified APSP in which only the signal peptidase binding site (21st Ala of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) is substituted with another amino acid.
  • the results of CBB staining after SDS-PAGE of the solubilized product of are shown.
  • Lane 1 MMP7A21D bacteria
  • Lane 2 MMP7A21D bacteria
  • Lane 3 MMP7A21E bacteria
  • Lane 4 MMP7A21E bacteria
  • Lane 5 MMP7A21K bacteria
  • Lane 6 MMP7A21K bacteria
  • Lane 7 MMP7 bacteria
  • Lane 8 MMP7 bacteria
  • FIG. 2 shows SDS-PAGE of a lysate of proMMP-7-producing Escherichia coli obtained by transformation with an expression vector having a modified APSP in which the 13th Leu of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with Pro. The results of CBB staining after the above are shown. Lane 1: MMP7L13P, Lane 2: MMP7L13P, Lane 3: MMP7, Lane 4: MMP7
  • FIG. 3 was obtained by transformation with an expression vector in which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was modified with both substitution of 13th Leu with Pro and substitution of 21st Ala with other amino acids.
  • the results of CBB staining after SDS-PAGE of the lysate of proMMP-7-producing Escherichia coli are shown.
  • Lane 1 MMP7L13P-A21D
  • Lane 2 MMP7L13P-A21E
  • Lane 3 MMP7L13P-A21K
  • Lane 4 MMP7L13P-A21H
  • Lane 5 MMP7L13P-A21F
  • Lane 6 MMP7L13P-A21Y
  • Lane 7 MMP7 bacteria
  • FIG. 4 shows the proMMP- obtained by transforming the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with an expression vector obtained by substituting the 13th Leu with Pro, replacing the 21st Ala with glutamic acid, and modifying both.
  • 7 shows the result of CBB staining after the lysate of 7-produced Escherichia coli was subjected to SDS-PAGE.
  • Lane 1 MMP7 bacteria
  • Lane 2 MMP7L13P bacteria
  • Lane 3 MMP7A21E bacteria
  • Lane 4 MMP7L13P-A21E bacteria
  • FIG. 5 shows a sample of BL21 (DE3) Escherichia coli disrupted cells into which expression plasmids pET-CorC4000, pET-nALP-CorC4000, and pET-ALP-CorC4000 have been introduced, respectively, followed by SDS-PAGE, followed by CBB staining. The results are shown.
  • a feature of the present invention is that an inclusion body-forming protein production host is prepared using a nucleic acid fragment in which a base sequence encoding a target protein is bound downstream of a base sequence encoding a modified signal peptide, and the inclusion body-forming protein It is to produce inclusion body-forming protein or target protein using a culture of a production host as a material.
  • any signal peptide derived from any protein can be used as long as the target protein can be transferred from the cytoplasm to the periplasm or the outside of the cell body by passage through the membrane in an expression system using E. coli. Good.
  • Any prokaryotic signal peptide can be a candidate peptide, but in particular, proteins that pass through the prokaryotic inner membrane, such as alkaline phosphatase (DA et al., Nature, vol.321, 706-708), PhoA-alkali Phosphatase (Oka et al., 1985, Proc Natl Acad Sci U S A.
  • an alkaline phosphatase signal peptide is used, and more preferably, a PhoA-alkaline phosphatase signal peptide is used.
  • Various isozymes exist in prokaryotic alkaline phosphatase, and any isozyme-derived signal peptide may be used.
  • the method of the present invention can be used for inclusion body-forming proteins derived from all eukaryotic cells.
  • the target protein gene when expressed as it is, it works toxic to prokaryotic cells, and is effective when it is proliferated or decreased in expression level, or when the target protein is degraded and the production level decreases.
  • the target protein having such properties include proMMP-7, Abibacterium paragalinalum type C HMTp210, HIV-1 protease, T cell receptor, antibacterial peptide, and human apoptosis regulatory protein BOX.
  • the gene sequences of these target proteins may be the original codons or sequences optimized for the codon usage of E. coli.
  • embodiments of the inclusion body-forming protein in which proMMP-7 is bound to the downstream of the modified APSP will be mainly described.
  • the gene encoding proMMP-7 can be obtained by PCR using a commercially available kidney-derived cDNA library (HumanMTC Panel I, Catalog Number: K1420-1, BD).
  • the primer used for PCR has a base sequence of proMMP-7 disclosed in a database (Accession Numbers; NM0002423; proMMP-7), and can be designed based on this sequence.
  • Primers used for PCR can be easily obtained by requesting a DNA-synthesizer commissioned organization (for example, QIAGEN). At this time, a base sequence of an appropriate restriction enzyme recognition site is added to the 5 ′ and 3 ′ terminal sides depending on the purpose.
  • a primer having a base sequence represented by P1 (SEQ ID NO: 2) and P2 (SEQ ID NO: 3) to which recognition sites for restriction enzymes NdeI and BamHI were added was used.
  • the nucleic acid fragment amplified by PCR is cloned into a cloning vector, for example, pCRII-TOPO (Invitrogen), and the base sequence is determined by a DNA sequencer (ABI Prism-377 Applied Biosystems).
  • the proMMP-7 gene is confirmed by comparing the obtained base sequence result with the existing proMMP-7 base sequence.
  • proMMP-7 gene a nucleic acid fragment encoding proMMP-7 (hereinafter sometimes referred to as “proMMP-7 gene”) is obtained.
  • the base sequence encoding human proMMP-7 is shown in SEQ ID NO: 21, and the amino acid sequence of human MMP-7 is shown in SEQ ID NO: 22.
  • APSP or modified APSP is added to the 5 ′ end of the proMMP-7 gene by PCR using the proMMP-7 gene as a template.
  • the site-directed mutagenesis method is used.
  • the signal peptidase of E. coli is known to recognize the well-conserved P3-P1 site of the signal sequence, and when the site is mutated, the signal peptide is not cleaved (Shen et al., Biochemistry, 1991, vol.30, 11775-11781).
  • a typical signal peptide is known to have a hydrophobic core region in which amino acid residues having a hydrophobic side chain appear relatively frequently.
  • the function of a signal sequence can also be inhibited by mutating an amino acid in the signal sequence to an amino acid having a different polarity (PUZISS et al., J. Bacteriol., 1989, 2303-2311).
  • the site for introducing a mutation into APSP may be any site as long as it can retain the function of inhibiting the degradation of proMMP-7 by protease.
  • a mutation is introduced into the binding site of the signal peptidase, more preferably the 21st Ala.
  • methods for introducing mutations include amino acid substitution, deletion, and addition, and any method can be used.
  • the 21st Ala is substituted with another amino acid.
  • an amino acid selected from the group consisting of aspartic acid, glutamic acid, lysine, histidine, phenylalanine and tyrosine is preferable.
  • proMMP-7 translation promoting effect as a fusion protein and increase the plasmid retention rate
  • proteases by substituting amino acids that change the three-dimensional structure of APSP, it is possible to simultaneously increase the expression level of proMMP-7 (translation promoting effect as a fusion protein and increase the plasmid retention rate) and suppress degradation by proteases.
  • Proline, phenylalanine, tryptophan, and the like are mentioned as such amino acids that are prone to change in the three-dimensional structure. Proline is preferred.
  • the amino acid substitution site may be a site composed of amino acids other than proline, and is preferably the 13th leucine.
  • the most preferred embodiment of the modified APSP of the present invention is a modified APSP in which the 13th leucine is replaced with proline and the 21st alanine is replaced with any of the above amino acids.
  • the proline may be phenylalanine or tryptophan.
  • one or more amino acids may be added to the N-terminus of APSP shown in SEQ ID NO: 1 or the N-terminus from which the methionine at the N-terminus has been removed.
  • Such an APSP is also used as the modified APSP of the present invention by modifying the amino acid corresponding to the 13th leucine and / or 21st alanine of the APSP shown in SEQ ID NO: 1 as described above. can do.
  • Examples of such other types of APSP are those derived from E.coli_UTI89 strain (Acc. No. YP_539434), E. coli_CFT073 strain (Acc. No.
  • APSPs listed here have a sequence that matches the 2nd to 21st amino acid sequence of APSP shown in SEQ ID NO: 1, and further has a sequence in which 24 amino acids are added to the N-terminus (SEQ ID NO: 20). However, if it functions as APSP, it is not limited to these.
  • the proMMP-7 gene to which APSP thus obtained or modified APSP introduced with various amino acid substitutions is added is incorporated into an appropriate expression vector, and host cells are transformed with the expression vector to express proMMP-7. Is done.
  • APSP derived from prokaryotic cells is used, so that E. coli is preferably used as the host cell.
  • E. coli is preferably used as the host cell.
  • various expression vectors having trp promoter, T7 promoter, and cspA promoter have been developed and marketed for E. coli expression, and may be appropriately selected from these.
  • E. coli such as BL21, HMS174, DH5 ⁇ , HB101, JM109 or the like is selected as a host according to the expression vector. Transformation of E. coli can be performed using a commercially available competent cell according to the attached method. Medium used for culturing E. coli (for example, LB, SOC, SOB, etc.), reagent used for selection of transformants (for example, ampicillin), and reagent used for expression induction (for example, indole acetic acid (IAA)) As isopropylthio-beta-D-galactoside (IPTG), a commercially available product may be used. The pH of the medium is used in a range suitable for the growth of E. coli (pH 7.2-7.6).
  • a known method may be used when transforming a host cell.
  • a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using lipofectin-based liposomes, a protoplast polyethylene glycol fusion method, an electroporation method, and the like can be used, and an appropriate method may be selected depending on the host cell to be used.
  • pET22b Merck, product code: 69744-3
  • BL21 DE3
  • Overnight Express Autoinduction System 1 that induces expression with lactose as an expression system (Merck, product) ProMMP-7 was expressed using the code: 71300-3).
  • a surfactant for example, Triton® X100, BugBuster (Merck)
  • a chelating agent for example, EDTA
  • lysozyme or the like
  • ProMMP-7 inclusion body collected in the sediment was solubilized with Sample-Buffer for SDS-PAGE, a certain amount was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, stained with Coomassie Brilliant Blue, molecular size and The expression and the degree of expression of proMMP-7 protein are confirmed from the stained image.
  • a method based on an antigen-antibody reaction such as ELISA, Western blot, or dot blot may be used in addition to the method based on the molecular size described above. Both are general methods for detecting foreign proteins expressed in Escherichia coli, and may be appropriately selected according to the purpose.
  • proMMP-7-producing Escherichia coli In order to recover MMP-7 from the proMMP-7-producing Escherichia coli thus obtained, the following method is used. First, proMMP-7-producing Escherichia coli is cultured, and the proliferated microbial cells are crushed by an appropriate method, and inclusion bodies composed of proMMP-7 are released outside the microbial cells. In conventional gene recombination techniques using Escherichia coli, a resistance gene for an antibiotic such as ampicillin has been used as a selection marker gene for selection of a gene recombinant. However, the use of antibiotics has become an obstacle to the development of industrial production technology due to the spread to the environment and concerns about the safety as a produced pharmaceutical product.
  • an antibiotic-free medium with sufficient consideration for safety as a medium for industrial production.
  • a method of dissolving with a chemical substance, a surfactant, an enzyme, or the like, or a method of physical treatment such as French press or ultrasonic treatment is used, and any method may be used.
  • any method may be used.
  • the cells can be more effectively disrupted.
  • a general buffer solution such as Tris buffer solution, phosphate buffer solution, glycine buffer solution and carbonate buffer solution is used.
  • Inclusion bodies are recovered as precipitates by centrifuging the inclusion body-containing solution.
  • the collected inclusion body is once dissolved in a solution containing a reducing agent and a denaturing agent.
  • a reducing agent cysteine, glutathione, dithiothreitol, 2-mercaptoethanol and the like can be used. Some of these may be used in combination.
  • the concentration of the reducing agent depends on the amount of inclusion bodies to be dissolved, but is used in the range of 10 to 200 mM.
  • the denaturing agent urea, guanidine hydrochloride and the like can be used. Such urea and guanidine hydrochloride are used in concentration ranges of 4-8M and 2-6M, respectively.
  • the buffer solution the same buffer solution as that used in the recovery of the inclusion body is used.
  • the temperature at the time of dissolution is not particularly limited as long as it is 40 ° C. or lower. The dissolution time may be set while observing the dissolution state of the inclusion body, and is usually stirred for 30 minutes to 1 hour.
  • refolding of proMMP-7 that is, construction of a normal three-dimensional structure is performed by adding a refolding buffer containing a surfactant and metal ions to the lysate of the inclusion body.
  • a surfactant used at this time, bridge 35 and zinc acetate, cobalt chloride and the like as metal ions are used in a concentration range of 0.5 to 2% and 0.05 mM to 0.2 mM, respectively.
  • the type and concentration of the buffer solution for refolding may be the same as those used for dissolving the inclusion bodies.
  • the pH of the buffer is used in the range of 7.0 to 9.0. Refolding is performed by leaving it to stand for one day or more.
  • purification methods generally used in protein chemistry such as centrifugation, salting out, ultrafiltration, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion
  • a combination of methods such as exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and hydroxyapatite chromatography is used.
  • the amount of the obtained protein or polypeptide is measured using a protein measuring reagent such as BCA-Protein-Assay-Reagent-Kit (Pierce-Biotechnology, Inc.), Protein-Assay-Kit (BIO-RAD, Inc).
  • proMMP-7 can be purified by adsorbing proMMP-7 on a cation column, washing and then eluting at a high salt concentration (Oneda et al., J Biochem., 1999, vol.126, 905-911). ).
  • proMMP-7 is converted to MMP-7.
  • a conversion method a method in which a proMMP-7-containing solution is kept at 37 ° C. in the presence of 1 mM (4-aminophenyl) mercuric acetate (APMA) or 0.2 ⁇ M trypsin, or a method in which a proMMP-7-containing solution is kept at 53 ° C. (Crabbe Et al., Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507), any method may be used.
  • the incubation time is in the range of 1 to 48 hours, but is appropriately adjusted depending on the concentration of reagents and proMMP-7, the treatment amount, and the like. Trypsin treated with N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) is used.
  • TPCK N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone
  • MMP-7 As a method of measuring the activity of MMP-7, a fluorescent substrate (Dnp-Pro-Leu-Gly -Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH 2: SEQ ID NO: 23) fluorescence measuring apparatus cleavage by MMP-7 of (Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507).
  • an MMP-7 activity measurement kit (ANASPEC) based on this principle is commercially available, and the activity is measured according to the attached protocol.
  • ANASPEC MMP-7 activity measurement kit
  • the HMTp210 gene of Abibacterium paragalinalum type C it can be obtained by performing PCR using total RNA, mRNA or genomic DNA extracted from the cells. Primers used for PCR are designed based on the base sequence of HMTp210 gene derived from HPG-C type bacteria disclosed by Tokunaga et al. (Japanese Patent Publication No. 10-514499). Cloning of the HMTp210 gene, construction of an expression vector, expression and purification of the HMTp210 protein may be performed in the same manner as in proMMP-7.
  • MMP-7 and HMTp210 obtained by the method of the present invention can be formulated into pharmaceutical formulations for therapeutic, diagnostic or other uses.
  • MMP-7 usually contains physiologically compatible substances, such as sodium chloride, glycine, etc., and is buffered to meet physiological conditions for formulations for intravenous administration. Dissolved in an aqueous solution having a pH. From the viewpoint of ensuring long-term stability, it may be considered to take the form of a lyophilized preparation as the final dosage form.
  • guidelines for intravenously administered compositions are established by government regulations, such as “Biological Formulation Standards”. Specific uses of the pharmaceutical composition containing MMP-7 of the present invention as an active ingredient include administration therapy to patients with intervertebral hernia.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
  • proMMP-7 expression vector (pETMMP7) with APSP >> The proMMP-7 gene was amplified by PCR using primers P1 (SEQ ID NO: 2) and P2 (SEQ ID NO: 3) from a kidney cDNA library (HumanMTC Panel I, Catalog #: K1420-1, BD). The amplified DNA was inserted into a cloning vector (pCRII-TOPO, Invitrogen), and the base sequence of the obtained DNA was determined. The nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer.
  • a homology search of the nucleotide sequence and the nucleotide sequence of proMMP-7 registered in the database was performed to obtain a plasmid (pCRproMMP-7) in which the proMMP-7 gene was inserted.
  • primer P3 sequence
  • APSP PhoA-alkaline phosphatase signal peptide
  • primer P4 SEQ ID NO: 5
  • DNA amplified in the same manner as described above was inserted into a cloning vector, and the base sequence of the obtained DNA was determined.
  • the obtained plasmid was cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI, and inserted into expression vector pET22b (Merck, product code: 69744-3) previously cleaved with the same restriction enzymes.
  • a plasmid (pETMMP7) into which the proMMP-7 gene was inserted was obtained.
  • ⁇ Construction of expression vector pETMMP7 having modified APSP> Modification of signal peptidase recognition site
  • the signal peptidase recognition site (21st alanine (Ala) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) of APE of pETMMP7 obtained in Example 1 was added to the GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System ( Invitrogen) was used to introduce mutations. Mutation is introduced by PCR using a primer containing a mutated sequence and a reverse primer having the same sequence as the primer sequence and using methylated pETMMP7 as a template. Aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), and lysine (Lys) were substituted respectively.
  • the precipitate was solubilized with Sample IV Buffer for SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), subjected to 15% acrylamide gel SDS-PAGE, and CBB staining was performed.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • CBB staining was performed.
  • MMP7A21D, MMP7A21E, and MMP7A21K obtained by transformation with an expression vector having a modified APSP in which only the signal peptidase binding site (21st Ala) was substituted with other amino acids were used as non-modified APSP.
  • the amount of proMMP-7 degradation product (molecular weight 28-30 kD) was reduced compared to MMP7 bacteria obtained by transformation with an expression vector having (see FIG. 1).
  • MMP7L13P obtained by transformation with an expression vector having a modified APSP in which the 13th Leu is replaced with Pro increases and degrades the expression level of proMMP-7 (molecular weight 31 kD) compared to MMP7. (See FIG. 2).
  • the MMP7L13P-A21E and MMP7 bacteria obtained in Example 3 were suspended in 100 mL of LB medium containing 50 ⁇ g / mL Ampicillin in 500 mL Erlenmeyer flasks and cultured for 6 hours, and then each culture solution was seeded on an LB agar plate. . Each colony was inoculated on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL Ampicillin and examined for colony growth. As a result, the proportion of colonies grown was 100 for MMP7L13P-A21E and 28 for MMP7.
  • the MMP7L13P-A21E bacteria obtained in Example 3 were suspended in 100 mL of LB medium not containing Ampicillin and cultured for 6 hours, and then 10 ⁇ L of each culture was cultured in the same manner as described above to subculture the cells. The subculture was repeated 6 times, and each culture solution was seeded on an LB agar plate. Each colony was inoculated on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL Ampicillin and examined for colony growth. As a result, the number of colonies grown was 92.
  • Activation by mercury MMP7 bacteria and MMP7L13P-A21E bacteria were expressed by Overnight Express Autoinduction System 1, and the cells were crushed by BugBuster to prepare a sediment.
  • the sediment was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of inclusion body solution (6M guanidine hydrochloride, 0.1MDTT) per 1 mg of the sediment.
  • the inclusion body lysate was diluted 10-fold with a refolding buffer (0.1 mM zinc acetate, 0.2 M NaCl, 10 mM CaCl 2 , 1% Brij35 / 50 mM Tris-HCl, pH 7.5).
  • proMMP-7 was activated with mercury and the fluorescence of the cleaved fluorescent substrate was measured with a fluorescence measuring instrument.
  • ProMMP-7 manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd. was used as a standard product.
  • the concentration of proMMP-7 in the refolding solution of MMP7 was 36.2 ⁇ g / mL, and that of MMP7L13P-A21E was 383.2 ⁇ g / mL.
  • the yield of proMMP-7 in the refolding solution increased about 10 times.
  • Abibacterium paragalinalum type C HMTp210 expression (1) Construction of Abibacterium paragalinarum C type HMTp210 expression vector Genomic DNA was extracted from Abibacterium paragarinarum C type 53-47 according to a conventional method, and S1 and S2 primers (SEQ ID NOs: 16 and 17) were used. A 4000 bp fragment (hereinafter, CorC4000) of the HMTp210 gene, which is a protective antigen gene, was amplified by PCR.
  • the PCR product is cleaved with the restriction enzymes NcoI and XhoI, and inserted into the expression vector pET11d (Merck, product code: 69439-3) previously cleaved with the same restriction enzyme to obtain a plasmid (pET-CorC4000) into which the CorC4000 gene has been inserted. It was.
  • the PCR product was cleaved with the restriction enzyme BamHI, inserted into the BamHI site of pET15b-nALP, and a plasmid (pET-nALP-CorC4000) in which the nucleotide sequence encoding the unmodified APSP and the Knob-S134 gene were inserted Obtained.
  • the sediment was crushed with BugBuster, and the sediment was obtained by centrifugation.
  • the prepared solution was subjected to 5-20% acrylamide gel SDS-PAGE, followed by CBB staining, and the expression level of Knob-S134 with and without APSP addition was compared.
  • the E. coli obtained by transformation with pET-ALP-S134 with modified APSP was compared to E. coli transformed with pET15b-S134 without APSP and pET-nALP-S134 with unmodified APSP.
  • an increase in the expression level was observed (see FIG. 5).
  • the method for producing a protein that forms an inclusion body when expressed in a prokaryotic cell of the present invention can be used as a method for efficiently producing various industrially useful foreign proteins in E. coli.
  • it is suitable for the production of promatrix metalloprotease 7, which is a precursor of matrix metalloproteinase 7.

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Abstract

　封入体形成タンパク質の製造方法を提供する。 配列番号1で示されるアミノ酸配列の13番目のロイシンをプロリン及び／又は21番目のアラニンを他のアミノ酸に置換した改変型アルカリフォスファターゼシグナルペプチド（改変型APSP）をコードする塩基配列の下流に目的タンパク質遺伝子の塩基配列を結合させた配列からなる核酸断片、並びに（１）改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に目的タンパク質遺伝子の塩基配列を結合させた配列からなる核酸断片が組み込まれた発現ベクターを調製する工程、（２）該発現ベクターで形質転換された封入体形成タンパク質産生宿主を調製する工程及び（３）該封入体形成タンパク質産生宿主を培養して得られる培養物から封入体形成タンパク質を精製する工程からなる封入体形成タンパク質の製造方法。上記の他のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選ばれる。

Description

封入体形成タンパク質の製造方法
　本発明は、原核細胞で発現させたときに封入体を形成するタンパク質（以下、「封入体形成タンパク質」と称することもある）の製造方法及び当該製造方法に用いる核酸断片に関する。詳細には、（１）改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に目的タンパク質遺伝子の塩基配列を結合させた配列からなる核酸断片が組み込まれた発現ベクターを調製する工程、（２）該発現ベクターで形質転換された封入体形成タンパク質産生宿主を調製する工程及び（３）該封入体形成タンパク質産生宿主を培養して得られる培養物から封入体形成タンパク質を精製する工程からなる封入体形成タンパク質の製造方法並びに前記（１）の核酸断片に関する。
　上記目的タンパク質としては、マトリックスメタロプロテアーゼ７（以下、「MMP-7」と称することもある）が特に好ましく、それゆえ、本発明の特に好ましい態様は、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列、およびプロマトリックスメタロプロテアーゼ７（以下、「proMMP-7」と称することもある）をコードする塩基配列を含む核酸断片、ならびにその核酸断片を用いるMMP-7の製造方法に関する。
　大腸菌等のグラム陰性菌において、タンパク質を生産する場合、目的のタンパク質のN末端にシグナル配列をつけることで、ペリプラズム（細胞周辺腔）と呼ばれる内膜（細胞質膜）と細胞壁の間にある間隙にタンパク質が分泌される場合がある。しかしながら、内膜を介したペリプラズムへの目的のタンパク質の輸送の効率は、シグナル配列と目的タンパク質の組合せによって異なり、常に高い輸送効率を得る方法は知られていない。また、大腸菌などのペリプラズムにはタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）も分泌されることが知られており、ペリプラズムに分泌された目的タンパク質が分解を受けてしまうこともある。一方、目的タンパク質が変性状態でペリプラズムに分泌されると、そこで封入体と呼ばれる構造を作る場合があり、封入体に取り込まれた目的タンパク質はプロテアーゼによる分解を受けにくいといわれる。さらに、封入体には高濃度の目的タンパク質が取り込まれていることから、精製効率や収率の点でも有利に用いられることがある。しかしながら、目的タンパク質を大腸菌などのグラム陰性菌で発現させて、効率よく封入体を形成させるための方法（シグナルペプチドを改変等）も現在のところ知られていない。
　Ibrahimらは、小麦胚芽を用いた無細胞系のタンパク質合成において、大腸菌の内毒素サブユニットBのシグナルの疎水性コア領域にあるP8のロイシンをプロリンに置換することにより、シグナル配列の切断が阻害され、合成速度が２倍に上昇することを示した（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、本結果は無細胞系による単純化された発現系での結果であるため、大腸菌などの生きた細胞を用いた発現系に適応できるとは限らない。また、合成されたタンパク質は可溶性で封入体を形成することはなかった。他の例では、大腸菌のリボース結合タンパク質のシグナル配列に自然発生的に変異(P17のロイシンのプロリンへの変異)が生じた場合、シグナル配列の切断阻害が起こり、可溶性のリボース結合タンパク質前駆体が細胞質内に蓄積されること、その発現量は放射線同位元素を用いたラベリングによって検出しなくてはならないほど微量で、且つ変異前の野生型の発現量と同等であったことが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。このように、大腸菌での封入体発現における原核細胞由来シグナル配列の変異の影響は未だ明確ではなく、とりわけ真核細胞由来構造遺伝子の発現への影響は全く知られていない。
　また、宿主に遺伝子を導入した組換え体を製造に用いる場合、抗生物質などを含有する選択培地を用いない場合には、組換え体が増殖の過程で導入した遺伝子を排除して導入した形質を失うことが発生し、それが優先的に増殖することによって物質製造の効率が落ちることがある。そのため、宿主に遺伝子（発現プラスミド等）を導入する際には選択に用いる抗生物質などを分解したり修飾したりすることによって、その抗生物質等に耐性を獲得するための遺伝子も同時に宿主に導入して、該遺伝子を保有しない宿主に毒性をしめす抗生物質等（例えばアンピシリンやテトラサイクリン等）を含む選択培地で培養することで、遺伝子を保持している組換え体を選択し、導入した遺伝子を排除した組換え体の発生を抑制する方法が取られる。しかし、抗生物質は生物に対する毒性を有していたり、薬剤過敏症（アレルギー）の原因になったりすることもあり、組換え体を用いて医薬品や動物医薬品、食品を製造して販売する際には、その混入が厳しく管理される必要がある。そのことから、抗生物質などでの選択を行わなくても導入した遺伝子が維持される構成や方法が望まれている。
　MMP-7は、活性部位に亜鉛分子をもつ亜鉛型メタロプロテアーゼファミリーに属するマトリックスメタロプロテアーゼ（以下、「MMP」と称することもある）の一つである（例えば、非特許文献３参照）。MMPは前駆体として産生され、細胞外分泌時にシグナル配列がプロセスされ、次いでプロ配列がプロセスされて活性型になる。細胞外に分泌されたMMPは細胞外マトリックスの代謝を司るのに対して、MMP-7は主に癌細胞より分泌され、浸潤、転移に関与することが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。MMP-7は他の多くのMMPが持っているヒンジ、ヘモペキシン様ドメインを持っておらず、MMPの中では最小の分子単位からなり、コラーゲンや細胞外マトリックスを構成しているコンポーネント（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、アグリカン）を基質とする。
　MMP-7は、軟骨組織の主成分であるアグリカンを基質とすること、椎間板ヘルニアの手術検体由来のマクロファージがMMP-7を発現していること（例えば、非特許文献５参照）等からヘルニア塊の自然退縮に関わっていることが推測される。その後、波呂らは、MMP-7をヘルニアイヌの椎間板に投与して椎間板内髄核の容積の減少を観察し、椎間板ヘルニアの治療薬としての可能性を示した（例えば、非特許文献６参照）。MMP-7の医薬品としての開発が望まれるところであるが、MMP-7は生体中に微量にしか存在せず、生体からMMP-7を分離精製することは極めて困難であり、生体成分を用いた場合、潜在的なウイルス汚染など安全面における問題が懸念される。MMP-7は癌細胞からも取得できるが、癌細胞を製造株とするのは好ましいことではない（例えば、非特許文献７参照）。
　このような問題を解決する方法として遺伝子組み換え技術によりMMP-7を取得する試みが行われている。動物細胞を用いた系では、CHO細胞でMMP-7を発現させたBarnettらの報告がある（例えば、非特許文献８参照）が、MMP-7の発現量は数mg/L程度と少なく、医薬品の製造に用いるのは現実的な発現系とは言い難い。また、アルカリフォスファターゼのシグナル配列の塩基配列と大腸菌のコドン使用頻度に最適化されたproMMP-7の遺伝子配列とを連結させた核酸断片を用いることにより、34℃では可溶性のMMP-7、42℃では不溶性のMMP-7を発現することが報告されている（例えば、特許文献１参照）。
特許第２９３８５２号公報 Ibrahim et al., J. Biol. Chem., 1987, vol. 262, p.10189-10194 Groarke et al., EMBO J., 1985, vol.4, p.1875-1880 Soler  et al., Biochem Biophys Res Commun、1994、vol.201, p.917-923 Ii et al., Exp Biol Med (Maywood)、2006、vol.231, p.20-27 Haro et al., J. Spinal Disord, 1999, vol.13, p.245-249 Haro et al., J Orthop Res, 2005, vol.23, p.412-419 Miyazaki et al., Cancer Research, 1990, vol.50, p.7758-7764 Barnett et al., Protein Exp. Purif., 1994,vol.5, p.27-36
　前述したように、proMMP-7遺伝子を大腸菌に導入した場合、proMMP-7は大腸菌に対する強い毒性のために発現しない。proMMP-7のＮ末側にシグナルペプチドを付加することにより、proMMP-7の大腸菌での発現が可能となる。しかしながら、単にシグナルペプチドを付加しただけでは、proMMP-7の発現量は少なく、また発現したproMMP-7の一部がプロテアーゼにより分解される。これらの分解は大腸菌の発現産物の低下もしくは封入体からのリフォールディングにおける収量低下をもたらし、効率的なproMMP-7の製造方法確立の妨げになる。したがって、本発明の目的は、発現量の増加とプロテアーゼによる分解抑制をもたらすことが出来る、新規な組み合わせの遺伝子断片とその遺伝子断片を用いた目的タンパク質の原核細胞での発現方法、引いてはその製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、（１）シグナルペプチダーゼの結合部位である配列番号1で示されるPhoA-アルカリフォスファターゼシグナルペプチド（以下、「ASPS」と称することもある）のアミノ酸配列の21番目のアラニンを任意のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はチロシンに置換した改変型PhoA-アルカリフォスファターゼシグナルペプチド（以下、「改変型APSP」と称することもある）をコードする塩基配列を、proMMP-7遺伝子の5'側に付加した核酸断片を用いて大腸菌で発現させることにより、プロテアーゼによるproMMP-7の分解が抑制されること、（２）13番目のロイシンをプロリンに置換した改変型APSPを用いることにより、proMMP-7の発現量の増大及びプロテアーゼによる分解の抑制の両方の効果が得られること、及び（３）13番目のロイシンをプロリンに置換し、且つ21番目のアラニンを上記の任意のアミノ酸に置換した改変型APSPを用いた場合は、イソプロピルチオ－ベータ-D-ガラクトシド（IPTG）による発現誘導において、何れか一方を置換した場合に比べて、proMMP-7の発現量が増大することを発見した。更に、上記の改変型シグナルペプチドは、他の封入体を形成するタンパク質、例えば、アビバクテリウム・パラガリナルムC型菌のHMTp210に対しても同様の効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明は、以下の通りである。
〔１〕原核細胞で発現させたときに封入体を形成するタンパク質（封入体形成タンパク質）をコードする塩基配列からなる核酸断片であって、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を含む前記核酸断片。
〔２〕原核細胞がグラム陰性菌である、〔１〕記載の核酸断片。
〔３〕原核細胞が大腸菌である、〔１〕又は〔２〕記載の核酸断片。
〔４〕目的タンパク質がプロマトリックスメタロプロテアーゼ７（proMMP-7）又はアビバクテリウム・パラガリナルムC型菌のHMTp210である、〔１〕ないし〔３〕の何れかに記載の核酸断片。
〔５〕改変型シグナルペプチドが、原核生物由来の内膜を通過するタンパク質のシグナルペプチドを改変したものである、〔１〕ないし〔４〕の何れかに記載の核酸断片。
〔６〕前記タンパク質が、アルカリフォスファターゼ、OmpA、PelB、OmpT、LamB、OmpF及びβ-lactamaseからなる群より選ばれるものである、〔５〕記載の核酸断片。
〔７〕改変型シグナルペプチドが、PhoA-アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドを改変したもの（改変型APSP）である、〔５〕記載の核酸断片。
〔８〕改変型APSPが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の１３番目のロイシンをプロリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換したものである、〔７〕記載の核酸断片。
〔９〕改変型APSPが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の２１番目のアラニンを、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換したものである、〔７〕記載の核酸断片。
〔１０〕改変型APSPが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の１３番目のロイシンをプロリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換し、且つ、２１番目のアラニンを、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換したものである、〔７〕記載の核酸断片。
〔１１〕目的タンパク質をコードする塩基配列が、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に位置する、〔１〕ないし〔１０〕の何れかに記載の核酸断片。
〔１２〕〔１〕ないし〔１１〕の何れかに記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクター。
〔１３〕〔１２〕記載の発現ベクターで宿主を形質転換することにより得られる、封入体形成タンパク質産生宿主。
〔１４〕宿主が原核細胞である、〔１３〕記載の封入体形成タンパク質産生宿主。
〔１５〕宿主がグラム陰性菌である、〔１３〕又は〔１４〕記載の封入体形成タンパク質産生宿主。
〔１６〕宿主が大腸菌である、〔１３〕ないし〔１５〕の何れかに記載の封入体形成タンパク質産生宿主。
〔１７〕下記の（１）～（３）の工程からなる、原核細胞で発現させたときに封入体を形成するタンパク質（封入体形成タンパク質）の製造方法：
（１）〔１〕ないし〔１１〕の何れかに記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクターを調製する工程、
（２）前記（１）の発現ベクターで形質転換された封入体形成タンパク質産生宿主を調製する工程、及び
（３）前記（２）の封入体形成タンパク質産生宿主を培養して得られる培養物から封入体形成タンパク質を精製する工程。
〔１８〕前記発現ベクターが、T7プロモーターの下流に〔１〕ないし〔１１〕の何れかに記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクターである、〔１７〕記載の製造方法。
〔１９〕宿主が原核細胞である、〔１７〕又は〔１８〕記載の製造方法。
〔２０〕宿主がグラム陰性菌である、〔１７〕ないし〔１９〕の何れかに記載の製造方法。
〔２１〕宿主が大腸菌である〔１７〕ないし〔２０〕の何れかに記載の製造方法。
〔２２〕封入体形成タンパク質産生宿主を抗生物質不含培地中で培養することを特徴とする、〔１７〕ないし〔２１〕の何れかに記載の製造方法。
　本発明に従えば、原核細胞で発現させたときに封入体を形成するタンパク質（封入体形成タンパク質）をコードする塩基配列からなる核酸断片であって、改変型シグナルペプチドと目的タンパク質をコードする塩基配列からなる前記核酸断片、該核酸断片を挿入した発現ベクター、該発現ベクターで形質転換した封入体形成タンパク質産生宿主、及び該封入体形成タンパク質産生宿主を用いた封入体形成タンパク質の製造方法が提供される。
　本発明の方法を用いることにより、発現プラスミド保持率が向上し、アンピシリンなどプラスミド保持を目的として使用する抗生物質を培地に添加しなくてもよくなる。さらに、目的タンパク質を発現させるための各種誘導システムの応答性がよくなり、目的タンパク質の発現量が向上する。また、封入体へ組み込まれる目的タンパク質のプロテアーゼによる分解が少なくなり、リフォールディング効率も向上するため、最終的には、機能を持った目的タンパク質として回収される効率が向上する。すなわち、本発明の方法を用いることによって、目的タンパク質を容易に製造することが出来るようになる。
　例えば、改変型APSPをコードする塩基配列の下流にプロマトリックスメタロプロテアーゼ７（proMMP-7）遺伝子の塩基配列を結合させた塩基配列からなる核酸断片を用いることにより、proMMP-7産生大腸菌におけるproMMP-7の発現量を増大させることができ、また、該proMMP-7産生大腸菌の培養及び培養物からの精製過程において、大腸菌由来のプロテアーゼによるproMMP-7の分解を抑制することができる。したがって、本発明の方法に従えば、例えば、proMMP-7の精製やproMMP-7のMMP-7への変換が容易となり、効率よくMMP-7を製造することが可能となる。
図１は、シグナルペプチダーゼ結合部位（配列番号1で示されるアミノ酸配列の21番目のAla）のみを他のアミノ酸置換した改変型APSPを有する発現ベクターで形質転換して得られたproMMP-7産生大腸菌の可溶化物をSDS-PAGEにかけた後、CBB染色を行った結果を示す。レーン１：MMP7A21D菌、レーン２：MMP7A21D菌、レーン３：MMP7A21E菌、レーン４：MMP7A21E菌、レーン５：MMP7A21K菌、レーン６：MMP7A21K菌、レーン７：MMP7菌、レーン８：MMP7菌
図２は、配列番号1で示されるアミノ酸配列の13番目のLeuをProに置換した改変型APSPを有する発現ベクターで形質転換して得られたproMMP-7産生大腸菌の可溶化物をSDS-PAGEにかけた後、CBB染色を行った結果を示す。レーン１：MMP7L13P菌、レーン２：MMP7L13P菌、レーン３：MMP7菌、レーン４：MMP7菌
図３は、配列番号1で示されるアミノ酸配列の13番目のLeuのProへの置換と21番目のAlaの他のアミノ酸への置換の両改変を行った発現ベクターで形質転換して得られたproMMP-7産生大腸菌の可溶化物をSDS-PAGEにかけた後、CBB染色を行った結果を示す。レーン１：MMP7L13P-A21D菌、レーン２：MMP7L13P-A21E菌、レーン３：MMP7L13P-A21K菌、レーン４：MMP7L13P-A21H菌、レーン５：MMP7L13P-A21F菌、レーン６：MMP7L13P-A21Y菌、レーン７：MMP7菌
図４は、配列番号1で示されるアミノ酸配列の13番目のLeuのProへの置換及び21番目のAlaのグルタミン酸への置換及び両改変を行った発現ベクターで形質転換して得られたproMMP-7産生大腸菌の可溶化物をSDS-PAGEにかけた後、CBB染色を行った結果を示す。レーン１：MMP7菌、レーン２：MMP7L13P菌、レーン３：MMP7A21E菌、レーン４：MMP7L13P-A21E菌
図５は、発現プラスミドpET-CorC4000、pET-nALP-CorC4000、およびpET-ALP-CorC4000をそれぞれ導入したBL21(DE3)大腸菌の菌体破砕液の一部をSDS-PAGEにかけた後、CBB染色を行った結果を示す。
　本発明の特徴は、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に目的タンパク質をコードする塩基配列を結合させた核酸断片を用いて、封入体形成タンパク質産生宿主を作製し、該封入体形成タンパク質産生宿主の培養物を材料として、封入体形成タンパク質又は目的タンパク質を製造することにある。
　改変型シグナルペプチドとしては、大腸菌を用いた発現系において、目的タンパク質を膜通過により細胞質内からペリプラズム又は菌体外に移動させることができるものであれば何れのタンパク質由来のシグナルペプチドであってもよい。原核細胞由来シグナルペプチドであれば全て候補ペプチドとなりうるが、とりわけ、原核生物由来の内膜を通過するタンパク質、例えば、アルカリフォスファターゼ（DAら, Nature, vol.321, 706-708）、PhoA-アルカリフォスファターゼ（Okaら、1985、Proc Natl Acad Sci U S A. vol.82, 7212-7216), OmpA（Ghrayeb ら、1984、EMBO J.、vol.3、2437-2442), PelB（Betterら,1988, Scienc, vol. 240, 1041-1043)、OmpT（Johnsonら、1990、Protein Expression Purif, vol. 7, 104-113), LamBとOmpF（Hoffmanら、1985、Proc Natl Acad Sci U S A. vol.82, 5107-5111), β-lactamase（Villa-komaroffら、1978、Proc Natl Acad Sci U S A. vol.75, 3727-3731）等に由来するシグナルペプチドが挙げられる。好ましくは、アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドが用いられ、より好ましくはPhoA-アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドが用いられる。原核細胞由来のアルカリフォスファターゼには種々のアイソザイムが存在するが、何れのアイソザイム由来のシグナルペプチドを使用してもよい。
　本発明の方法は、全ての真核細胞由来の封入体形成タンパク質に対して使用できる。特に、目的タンパク質遺伝子をそのまま発現させたときに原核細胞にとって毒性的に働き、増殖や発現量の低下をきたす場合や目的タンパク質が分解を受けて産生量が低下する場合に使用すると効果的である。このような性質を有する目的タンパク質として、proMMP-7、アビバクテリウム・パラガリナルムC型菌のHMTp210、HIV-1プロテアーゼ、T細胞レセプター、抗菌ペプチド、ヒトアポトーシス調節タンパク質BOX等が挙げられる。これらの目的タンパク質の遺伝子配列は、オリジナルコドンのままでもよいし、大腸菌のコドン使用頻度に最適化した配列でも構わない。以下、主として改変型APSPの下流にproMMP-7を結合させた封入体形成タンパク質について態様を記述する。
　proMMP-7をコードする遺伝子は、市販の腎臓由来のcDNAライブラリー（HumanMTC Panel I, Catalog number:K1420-1, BD社）を用いて、PCRを行うことにより取得できる。PCRに用いるプライマーは、データーベース(Accession Numbers; NM002423;proMMP-7)にproMMP-7の塩基配列が開示されているので、この配列に基づき設計することができる。PCRに用いるプライマーは、DNA 合成受託機関（例えば、QIAGEN 社）などに依頼すれば容易に入手可能である。このとき、目的に応じて5'及び3'末側に適切な制限酵素認識部位の塩基配列が付加される。本願実施例では、制限酵素NdeI及びBamHIの認識部位を付加したP1（配列番号2）及びP2（配列番号3）で示される塩基配列からなるプライマーを使用した。PCRにより増幅した核酸断片は、クローニングベクター、例えば、pCRII-TOPO（Invitrogen社）にクローニングし、DNAシークエンサー（ABI Prism 377　アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列の決定が行われる。proMMP-7遺伝子の確認は、得られた塩基配列の結果と既存のproMMP-7の塩基配列とを比較することにより行われる。こうしてproMMP-7をコードする核酸断片（以下、「proMMP-7遺伝子」と称することもある）が取得される。また、ヒトproMMP-7をコードする塩基配列を配列番号21に、ヒトＭＭＰ－７のアミノ酸配列を配列番号22に示す。
　次いで、proMMP-7遺伝子を鋳型として、PCRにより、proMMP-7遺伝子の5'末側にAPSP又は改変型APSPの付加が行われる。改変型APSPの調製においてアミノ酸配列に変異を導入するときは、サイトダイレクティドミュータジェネシス法が使用される。実際には、本技術を応用したInvitrogen社のGeneTailor Site-Directed Mutagenesis System、Takara 社の Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-Super Express Km、Mutan-Express Km、Mutan-K など)、Stratagene 社の QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit、QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit、などの市販のキットを用い添付のプロトコールに従って行われる。実施例では、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis Systemを使用した。
　大腸菌のシグナルペプチターゼは、シグナル配列のよく保存されているP3-P1部位を認識することが知られており、その部位に変異を与えるとシグナルペプチドは切断されなくなる（Shenら、Biochemistry, 1991, vol.30, 11775-11781）。典型的なシグナルペプチドは、疎水的な性質の側鎖を持つアミノ酸残基が比較的高頻度で現れる疎水性コア領域を有することが知られている。また、シグナル配列内のアミノ酸を極性の異なるアミノ酸に変異させることにより、シグナル配列の機能を阻害させることもできる（PUZISSら、J. Bacteriol., 1989, 2303-2311）。
　APSPに変異を入れる部位としては、proMMP-7のプロテアーゼによる分解を抑制する機能を保持することができるならば、いずれの部位であってもよい。好ましくは、シグナルペプチダーゼの結合部位、更に好ましくは、21番目のAlaに変異が導入される。変異を導入する方法として、アミノ酸の置換、欠失、付加などが挙げられるが、いずれの方法も取り得る。好ましくは、21番目のAlaが他のアミノ酸に置換される。置換されるアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸が好ましい。
　また、APSPの立体構造を変化させるアミノ酸に置換することにより、proMMP-7の発現量の増加（融合タンパク質としての翻訳促進効果とプラスミド保持率増加）とプロテアーゼによる分解の抑制を同時に行うことができる。このような立体構造の変化を起こしやすいアミノ酸としてプロリン、フェニルアラニン、トリプトファンなどが挙げられるが、好ましくはプロリンである。斯かるアミノ酸の置換部位としては、プロリン以外のアミノ酸で構成される部位が可能であるが、好ましくは、13番目のロイシンである。
　さらに、APSPの13番目のロイシンをプロリンに置換し、且つ21番目のアラニンを上記の何れかのアミノ酸に置換した改変型APSPをproMMP-7のＮ末側に結合させた場合、IPTGによる発現誘導において、何れか一方を置換した場合に比べて、発現量を上げることができる。したがって、本発明の改変型APSPの最も好ましい態様は、13番目のロイシンのプロリンへの置換と21番目のアラニンの上記の何れかのアミノ酸への置換がなされた改変型APSPである。上述したように、プロリンは、フェニルアラニン又はトリプトファンであってもよい。
　なお、APSPは、由来によっては、配列番号1に示される上記APSPのN末端またはN末端のメチオニンを除去したN末端に、1以上のアミノ酸が付加されているものもある。そのようなAPSPも、配列番号1に示されるAPSPの13番目のロイシン及び／又は21番目のアラニンに相当するアミノ酸を、上述の通り置換する改変を行うことにより、本発明の改変型APSPとして使用することができる。そのような他種のAPSPの例として、E.coli_UTI89株（Acc. No. YP_539434）、E. coli_CFT073株（Acc. No. NP_752424）、Shigella flexneri 2a Str301（Acc. No. NP_706185）に由来するものが挙げられる。ここに挙げた他種のAPSPは、配列番号1に示されるAPSPにおける2～21番目のアミノ配列と一致する配列を保持し、さらにそのN末端に24アミノ酸が付加された配列（配列番号20）からなるが、APSPとして機能すればこれらに限定されない。
　こうして得られたAPSP又は種々のアミノ酸置換を導入した改変型APSPが付加されたproMMP-7遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによって、proMMP-7の発現が行なわれる。本発明では、原核細胞由来のAPSPを用いるので、宿主細胞としては、大腸菌を用いるのが好ましい。宿主として大腸菌を用いる場合は、大腸菌発現用に、trpプロモーター、T7プロモーター、cspAプロモーターを有する種々の発現ベクターが開発・市販されているのでこれらの中から適宜選択して使用すればよい。発現ベクターに合わせて適当な大腸菌、例えば、BL21、HMS174、DH5α、HB101、JM109 などが宿主として選択される。大腸菌の形質転換は、市販のコンピテントセルを用い、添付の方法に従って行うことができる。大腸菌の培養に使用される培地（例えば、LB、SOC、SOB など）及び形質転換体の選択に用いられる試薬（例えば、アンピシリンなど）や発現誘導に使用される試薬（例えば、インドール酢酸（IAA）、イソプロピルチオ－ベータ-D-ガラクトシド（IPTG））は、一般に市販されているものを使用すればよい。また、培地のpHは、大腸菌の増殖に適した範囲（pH7.2-7.6）で用いられる。
　宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。本願実施例では、発現ベクターとしてpET22ｂ（メルク社、製品コード；69744-3）、宿主細胞として、BL21(DE3)、発現システムとして、ラクトースで発現誘導を行うOvernight Express Autoinduction System 1（メルク社、製品コード；71300-3）を用いてproMMP-7を発現させた。
　proMMP-7を発現している組換え大腸菌のスクリーニングは、以下のように行われる。発現誘導剤（本願実施例に使用した発現システムではOvernight Express Autoinduction System 1を使用）の存在下に、培養・増殖した菌体の濁度（OD600nm）を測定し、一定の菌量の培養液を高速遠心分離により回収する。その菌体に一定の蒸留水を加え懸濁した後、超音波処理又はフレンチプレス、マントンゴーリン等のホモジナイザーにより菌体を破砕し、高速遠心（15000rpm、15分間）により沈渣を回収する。蒸留水に、適宜界面活性剤（例えば、Triton X100、BugBuster（メルク社)）、キレート剤（例えば、EDTA）、リゾチーム等を添加してもよい。沈渣に回収したproMMP-7（封入体を形成）をSDS-PAGE用のSample Bufferで可溶化し、その一定量をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーブリリアントブルーで染色した後、分子サイズ及び染色像からproMMP-7タンパク質の発現及び発現の程度が確認される。なお、proMMP-7の確認（または検出）には、上記の分子サイズに基づく方法以外に、ELISA法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法などの抗原抗体反応に基づく方法が取られることもある。いずれも大腸菌で発現させた外来タンパク質を検出する際の一般的な方法であり、目的に応じて適宜選択すればよい。
　こうして得られたproMMP-7産生大腸菌からMMP-7を回収するには以下の方法がとられる。まず、proMMP-7産生大腸菌を培養し、増殖させた菌体を適切な方法で破砕し、proMMP-7からなる封入体を菌体外に放出させる。これまでの大腸菌を用いた遺伝子組換え技術では遺伝子組換え体の選抜に用いる選択マーカー遺伝子として、アンピシリン等の抗生物質に対する耐性遺伝子が用いられてきた。しかしながら、抗生物質を使用することは、環境への拡散や、作出された医薬品としての安全性に対する懸念もあり、工業的な生産技術の開発に当たっての障害になっている。また、組換え体を用いて医薬品や動物医薬品、食品を製造して販売する際には、その混入を厳しく管理することが必要になる。こうした背景により、工業的生産を行う場合の培地として、安全性に十分に配慮した抗生物質不含培地を用いるのが好ましい。菌体の破砕には、例えば、化学物質、界面活性剤、酵素などで溶解させる方法またはフレンチプレスや超音波処理などの物理的処理による方法が取られるが、何れの方法でもよい。これらの方法をいくつか組合せることにより、より効果的に菌体を破砕することができる。封入体含有破砕液の遠心分離と洗浄を繰り返すことにより大部分の菌体成分が除去される。洗浄には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液など一般的な緩衝液が使用される。封入体は、封入体含有溶液を遠心分離することにより、沈殿として回収される。
　回収した封入体は、一旦、還元剤及び変性剤を含有する溶液で溶解される。斯かる還元剤として、システイン、グルタチオン、ジチオスレイトール及び２－メルカプトエタノールなどを使用することができる。これらは幾つかを組合わせて使用してもよい。還元剤の濃度は、溶解する封入体の量に依存するが、10～200mMの範囲で使用される。変性剤としては、尿素、グアニジン塩酸塩などを用いることができる。斯かる尿素及びグアニジン塩酸塩は、それぞれ4～8M及び2～6Mの濃度範囲で使用される。また、緩衝液としては、封入体の回収で使用するものと同様の緩衝液が使用される。溶解時の温度は、40℃以下であれば特に制限する必要はない。溶解時間は、封入体の溶解状況を見ながら設定すればよく、通常、30分～１時間攪拌される。
　次に、封入体の溶解液に、界面活性剤、金属イオンを含むリフォールディングバッファーを加えることにより、proMMP-7のリフォールディング、すなわち正常な立体構造の構築が行われる。この時使用する界面活性剤としてブリッジ35、金属イオンとして酢酸亜鉛、塩化コバルトなどが、それぞれ0.5～2％及び0.05mM～0.2mMの濃度範囲で使用される。リフォールディングするときの緩衝液の種類及び濃度は、封入体を溶解するときと同じものを使用すればよい。緩衝液のpHは、7.0～9.0の範囲で使用される。リフォールディングは、１日以上静置することにより行われる。
　リフォールディング溶液からproMMP-7を精製する際には、一般に、タンパク質化学において使用される精製方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などの方法を組み合わせた方法が使用される。得られたタンパク質やポリペプチドの量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、Protein Assay Kit (BIO-RAD, Inc)などのタンパク質測定試薬を用いて測定される。例えば、陽イオンカラムにproMMP-7を吸着させ、洗浄後、高塩濃度で溶出することによりproMMP-7を精製することができる（Onedaら、J Biochem., 1999, vol.126, 905-911）。
　次いで、proMMP-7のMMP-7への変換が行われる。変換方法としては、proMMP-7含有溶液を1mM (4-aminophenyl)mercuric acetate（APMA）又は0.2μMトリプシン存在下、37℃で保温する方法やproMMP-7含有溶液を53℃で保温する方法（Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507）が挙げられるが、何れの方法を用いてもよい。保温時間は1-48時間の範囲で行われるが、試薬及びproMMP-7の濃度や処理量等により適宜調節される。トリプシンはN-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone（TPCK）処理したものが使用される。
　MMP-7の活性を測定する方法としては、蛍光基質（Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2: 配列番号23）のMMP-7による切断を蛍光測定装置により測定する方法がある（Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507）。実際には、斯かる原理に基づくMMP-7活性測定Kit（ANASPEC社）が市販されているので、これを用い、添付のプロトコールに従って、活性の測定が行われる。こうして変換されたMMP-7をproMMP-7から分離精製するときは、前述のタンパク質精製方法が使用される。
　アビバクテリウム・パラガリナルムC型菌のHMTp210遺伝子を取得する場合は、菌体から抽出した全RNA、mRNA又はゲノムDNAを出発材料としてPCRを行うことにより取得できる。PCRに用いるプライマーは、徳永らが開示したHPG-C型菌由来のHMTp210遺伝子の塩基配列に基づいて設計される（特表平10-514499）。HMTp210遺伝子のクローニング、発現ベクターの構築、HMTp210タンパク質の発現及び精製はproMMP-7と同様の方法に従えばよい。
　本発明の方法により得られたMMP-7及びHMTp210は、治療、診断又は他の用途のために製薬学的調合剤に処方することができる。例えば、MMP-7は、静脈内投与のための調合剤に対しては、通常、生理学的に適合しうる物質、例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み、かつ生理学的条件に適合しうる緩衝されたpHを有する水溶液中に溶解される。また、長期安定性の確保の観点から、最終的剤型として凍結乾燥製剤の形態をとることも考慮されうる。なお、静脈内に投与される組成物のガイドラインは政府の規則、例えば「生物学的製剤基準」によって確立されている。本願発明のMMP-7を有効成分として含有する医薬品組成物の具体的な用途としては、椎間板ヘルニア患者などへの投与療法が挙げられる。
　以下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
《APSPを有するproMMP-7発現ベクター（pETMMP7）の構築》
　腎臓のcDNAライブラリー（HumanMTC Panel I, Catalog#: K1420-1, BD社）よりプライマーP1（配列番号2）とP2（配列番号3）を用いてproMMP-7遺伝子をPCRにより増幅した。増幅されたDNAをクローニングベクター（pCRII-TOPO, Invitrogen）に挿入し、得られたDNAの塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、DNAシークエンサーを用いて行った。当該塩基配列とデーターベース（Accession Numbers: NM002423）に登録されているproMMP-7の塩基配列のホモロジー検索を行い、proMMP-7遺伝子が挿入されたプラスミド（pCRproMMP-7）を得た。
　次に、pCRproMMP-7を鋳型として、制限酵素NdeI認識配列、PhoA-アルカリフォスファターゼシグナルペプチド（APSP）配列をコードする塩基配列及びproMMP-7のN末端配列をコードする塩基配列からなるプライマーP3（配列番号4）と制限酵素BamHI認識配列及びproMMP-7のC末端配列をコードする塩基配列からなるプライマーP4（配列番号5）を用いて、PCRを行った。上記と同様に増幅されたDNAをクローニングベクターに挿入し、得られたDNAの塩基配列を決定した。塩基配列に変異がないことを確認した後、得られたプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、予め同じ制限酵素で切断した発現ベクターpET22b（メルク社、製品コード；69744-3）に挿入し、proMMP-7遺伝子が挿入されたプラスミド（pETMMP7）を得た。
《改変型APSPを有する発現ベクターpETMMP7の構築》
（１）シグナルペプチダーゼ認識部位の改変
　実施例１で得たpETMMP7のAPSPのシグナルペプチダーゼ認識部位（配列番号1で示されるアミノ酸配列の21番目のアラニン（Ala））に、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System（Invitrogen社）を用いて、変異を導入した。変異配列を含むプライマーとそのプライマー配列と一部同じ配列を持つ逆向きのプライマーで、メチル化されたpETMMP7を鋳型にPCRを行うことにより、変異が導入される。アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、リジン（Lys）にそれぞれ置換した。
　（２）シグナル配列に構造変化を与える改変
　前記（１）と同様の方法により、APSPの13番目のロイシン（Leu）をプロリン（Pro）に置換した。
　（３）シグナルペプチダーゼ認識部位とシグナル配列に構造変化を与える改変
　前記（１）と同様の方法により、21番目のアラニンをそれぞれAsp, Glu, Lys, ヒスチジン（His）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）に、且つAPSPの13番目のロイシンをプロリンに置換した。それぞれの改変型APSPを有する発現ベクター、APSPにおける改変内容、改変に用いたプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
《非改変型及び改変型APSPを有するpETMMP7の発現》
　実施例１で得た非改変型のAPSPを有するpETMMP7、実施例２で得た改変型APSPを有するpETMMP7で大腸菌（BL21(DE3)）を形質転換し、proMMP-7の発現を行った。形質転換に用いた発現ベクター及び得られたproMMP-7産生大腸菌を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　発現誘導は、Overnight Express Autoinduction System 1（メルク社；製品コード71300-3）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。簡単には、125ｍLの三角フラスコに50μg/mL Ampicillin（和光純薬株式会社）を含むLB培地50ｍLに各コロニーを懸濁し、Kitの試薬を添加し、37℃で16時間培養した。その菌体液のOD600nmを測定し、OD600nm＝20、1mLに相当する菌体を遠心分離により沈渣に回収した。沈渣を200μLのBugBusterにより破砕し、遠心分離により沈査を得た。沈渣をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用のSample Bufferで可溶化し、15%アクリルアミドゲルSDS-PAGEにかけ、CBB染色を行った。その結果、シグナルペプチダーゼ結合部位（21番目のAla）のみを他のアミノ酸置換した改変型APSPを有する発現ベクターで形質転換して得られたMMP7A21D菌、MMP7A21E菌、MMP7A21K菌は、非改変型のAPSPを有する発現ベクターで形質転換して得られたMMP7菌に比べて、proMMP-7の分解物（分子量28-30kD）の量が減少した（図１参照）。
　また、13番目のLeuをProに置換した改変型APSPを有する発現ベクターで形質転換して得られたMMP7L13P菌は、MMP7菌に比べて、proMMP-7（分子量31kD）の発現量の増加と分解の抑制が認められた（図２参照）。更に、13番目のLeuのProへの置換と21番目のAlaの他のアミノ酸への置換の両改変を行った発現ベクターで形質転換して得られたMMP7L13P-A21D菌、MMP7L13P-A21E菌、MMP7L13P-A21K菌、MMP7L13P-A21H菌、MMP7L13P-A21F菌、MMP7L13P-A21Y菌を、ラクトース誘導（Overnight Express Autoinduction System 1）を行ったときには、proMMP-7発現量の増加と分解の抑制効果が増強された（図３参照）。また、MMP7菌, MMP7L13P菌, MMP7A21E菌, MMP7L13P-A21E菌を、IPTG誘導を行ったときには、MMP7L13P-A21E菌において、発現量の増加が認められた（図４参照）。
《proMMP-7産生大腸菌のプラスミドの保持率》
　実施例３で得たMMP7L13P-A21E菌及びMMP7菌を、それぞれ500ｍLの三角フラスコに50μg/mL Ampicillinを含むLB培地100ｍLに懸濁し、6時間培養した後、各培養液をLB寒天プレートに播種した。それぞれのコロニーを100個、50μg/mL Ampicillinを含むLB寒天プレートに植え継いで、コロニーの増殖を調べた。その結果、コロニーが増殖した割合は、MMP7L13P-A21E菌で100個、MMP7菌で28個であった。
　実施例３で得たMMP7L13P-A21E菌を、Ampicillinを含まないLB培地100ｍLに懸濁し、6時間培養した後、各培養液10μLを前記と同様に培養して菌体を継代した。その継代培養を6回繰り返した後、各培養液をLB寒天プレートに播種した。それぞれのコロニーを100個、50μg/mL Ampicillinを含むLB寒天プレートに植え継いで、コロニーの増殖を調べた。その結果、コロニーが増殖した割合は、92個であった。
《proMMP-7からMMP-7への変換》
（１）水銀による活性化
　MMP7菌, MMP7L13P-A21E菌をOvernight Express Autoinduction System 1により発現させ、BugBusterにより菌体を破砕し、沈渣を調製した。その沈渣1mgに対して10μLの封入体溶解液（6M塩酸グアニジン、0.1MDTT）の割合で、沈渣を溶解した。その封入体溶解液をリフォールディングバッファー（0.1mM zinc acetate, 0.2M NaCl, 10mM CaCl2, 1% Brij35/50mM Tris-HCl, pH7.5）で10倍に希釈した。その溶液をMMP-7活性測定Kit（Enzolyte520MMP-7 Assay Kit, ANASPEC社、製品コード71153）のプロトコールに従い、水銀でproMMP-7を活性化し、切断された蛍光基質の蛍光を蛍光測定機器で測定した。標準品としてオリエンタル酵母社製のproMMP-7を用いた。その結果、MMP7菌のリフォールディング溶液のproMMP-7の濃度は36.2μg/mLであり、MMP7L13P-A21E菌では、383.2μg/mLであった。リフォールディング溶液でのproMMP-7の収量は約10倍に増加した。
　（２）加熱による自己活性化
　上記（１）で得た封入体溶解液をリフォールディングバッファー（0.1mM zinc acetate 0.2M NaCl 10mM CaCl2 1% Brij35/50mM Tris-HCl pH7.5）で100倍に希釈した。リフォールディング溶液を53℃2時間保温することにより、proMMP-7の自己活性化を行った。その溶液を水銀を添加しないで、MMP-7活性測定Kitの基質を添加し、その蛍光を測定した。標準品としてオリエンタル酵母社製のMMP-7を用いた。その結果、MMP7菌の保温溶液のMMP-7の濃度は27μg/mLであり、MMP7L13P-A21E菌では126μg/mLであった。
《アビバクテリウム・パラガリナルムC型菌HMTp210発現》
（１）アビバクテリウム・パラガリナルムC型菌HMTp210発現ベクターの構築
　アビバクテリウム・パラガリナルムC型菌53-47株より常法に従ってゲノムDNAを抽出し、S1及びS2プライマー（配列番号16、17）を用いて、防御抗原遺伝子であるHMTp210遺伝子の4000bp断片（以下、CorC4000）をPCRにより増幅した。PCR産物を制限酵素NcoI及びXhoIで切断し、予め同じ制限酵素で切断した発現ベクターpET11d（メルク社、製品コード；69439-3）に挿入しCorC4000遺伝子が挿入されたプラスミド（pET-CorC4000）を得た。
　（２）改変型APSP、または非改変型APSPを有するHMTp210発現ベクターの構築
　pET-CorC4000よりS3及びS4プライマー（配列番号18、19）を用いて、CorC4000遺伝子をPCRにより増幅した。PCR産物を制限酵素BamHIで切断し、pET15b-ALPのBamHI部位に挿入し、改変型APSPをコードする塩基配列及びHMTp210遺伝子が挿入されたプラスミド（pET-ALP-CorC4000）を得た。さらに、同PCR産物を制限酵素BamHIで切断し、pET15b-nALPのBamHI部位に挿入し、非改変型APSPをコードする塩基配列及びKnob-S134遺伝子が挿入されたプラスミド（pET-nALP-CorC4000）を得た。
　（３）CorC4000の発現
　発現プラスミドpET-CorC4000、pET-nALP-CorC4000、およびpET-ALP-CorC4000をそれぞれ導入したBL21(DE3)大腸菌を50μg/mlのAmpicillinを含むCircle Grow（CG）培地3ml中に播種し、OD600nmの濁度が0.5-1.0になるまで37℃にて培養した。その後、終濃度1mMとなるようにイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシドを添加して、さらに16時間培養し、CorC4000の発現を誘導した。そして、培養した大腸菌を遠心分離により集菌した。沈渣をBugBusterにより破砕し、遠心分離により沈渣を得た。沈渣をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用のSample Bufferで可溶化し、菌体液がOD600nm＝20となるよう調製した。調製した液は5-20%アクリルアミドゲルSDS-PAGEに供試後、CBB染色を行い、APSP付加の有無によるKnob-S134の発現量を比較した。その結果、改変型APSPを有するpET-ALP-S134で形質転換して得られた大腸菌は、APSPを付加しないpET15b-S134および非改変型APSPを有するpET-nALP-S134で形質転換した大腸菌に比べて、発現量の増加が認められた（図５参照）。
　本発明の原核細胞で発現させたときに封入体を形成するタンパク質の製造方法は、種々の産業上有用な外来タンパク質を大腸菌で効率よく生産する方法として利用することができる。特に、マトリックスメタロプロテアーゼ７の前駆体であるプロマトリックスメタロプロテアーゼ７の製造に適している。

Claims (22)

  1. 　原核細胞で発現させたときに封入体を形成するタンパク質（封入体形成タンパク質）をコードする塩基配列からなる核酸断片であって、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を含む前記核酸断片。
  2. 　原核細胞がグラム陰性菌である、請求項１記載の核酸断片。
  3. 　原核細胞が大腸菌である、請求項１又は２に記載の核酸断片。
  4. 　目的タンパク質がプロマトリックスメタロプロテアーゼ７（proMMP-7）又はアビバクテリウム・パラガリナルムC型菌のHMTp210である、請求項１ないし３の何れか一項記載の核酸断片。
  5. 　改変型シグナルペプチドが、原核生物由来の内膜を通過するタンパク質のシグナルペプチドを改変したものである、請求項１ないし４の何れか一項記載の核酸断片。
  6. 　前記タンパク質が、アルカリフォスファターゼ、OmpA、PelB、OmpT、LamB、OmpF及びβ-lactamaseからなる群より選ばれるものである、請求項５記載の核酸断片。
  7. 　改変型シグナルペプチドが、PhoA-アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドを改変したもの（改変型APSP）である、請求項６記載の核酸断片。
  8. 　改変型APSPが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の１３番目のロイシンをプロリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換したものである、請求項７記載の核酸断片。
  9. 　改変型APSPが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の２１番目のアラニンを、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換したものである、請求項７記載の核酸断片。
  10. 　改変型APSPが、配列番号1で示されるアミノ酸配列の１３番目のロイシンをプロリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換し、且つ、２１番目のアラニンを、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びチロシンからなる群より選ばれる何れかのアミノ酸に置換したものである、請求項７記載の核酸断片。
  11. 　目的タンパク質をコードする塩基配列が、改変型シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に位置する、請求項１ないし１０の何れか一項記載の核酸断片。
  12. 　請求項１ないし１１の何れか一項記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクター。
  13. 　請求項１２記載の発現ベクターで宿主を形質転換することにより得られる、封入体形成タンパク質産生宿主。
  14. 　宿主が原核細胞である、請求項１３記載の封入体形成タンパク質産生宿主。
  15. 　宿主がグラム陰性菌である、請求項１３又は１４に記載の封入体形成タンパク質産生宿主。
  16. 　宿主が大腸菌である、請求項１３ないし１５の何れか一項記載の封入体形成タンパク質産生宿主。
  17. 　下記の（１）～（３）の工程からなる、原核細胞で発現させたときに封入体を形成するタンパク質（封入体形成タンパク質）の製造方法：
    （１）請求項１ないし１１の何れか一項記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクターを調製する工程、
    （２）前記（１）の発現ベクターで形質転換された封入体形成タンパク質産生宿主を調製する工程、及び
    （３）前記（２）の封入体形成タンパク質産生宿主を培養して得られる培養物から封入体形成タンパク質を精製する工程。
  18. 　前記発現ベクターが、T7プロモーターの下流に請求項１ないし１１の何れか一項記載の核酸断片が組み込まれた発現ベクターである、請求項１７記載の製造方法。
  19. 　宿主が原核細胞である、請求項１７又は１８記載の製造方法。
  20. 　宿主がグラム陰性菌である、請求項１７ないし１９の何れか一項記載の製造方法。
  21. 　宿主が大腸菌である請求項１７ないし２０の何れか一項記載の製造方法。
  22. 　封入体形成タンパク質産生宿主を抗生物質不含培地中で培養することを特徴とする、請求項１７ないし２１の何れか一項記載の製造方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015178414A1 (ja) * 2014-05-21 2015-11-26 一般財団法人化学及血清療法研究所 マトリックスメタロプロテアーゼ７（ｍｍｐ－７）会合体の単量体化方法
CN105949287A (zh) * 2016-06-29 2016-09-21 北京市农林科学院 一种a型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114032252B (zh) * 2021-11-01 2022-04-22 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种重组状态人源mmp-7蛋白的表达方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0293852A (ja) 1988-09-30 1990-04-04 Toshiba Corp 計算機システム
JPH1051499A (ja) 1996-08-02 1998-02-20 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 衛星回線接続装置
WO2003100021A2 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Restoragen, Inc. Methods and dna constructs for high yield production of polypeptides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR970009083B1 (en) * 1994-04-28 1997-06-05 Korea Advanced Inst Sci & Tech Novel alkaline protease gene and expression thereof in e.coli
JP2938352B2 (ja) 1994-09-30 1999-08-23 オリエンタル酵母工業株式会社 組換え人マトリライシンの製造方法
JPH1084969A (ja) 1996-09-19 1998-04-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst ヘモフィルス・パラガリナルム由来新規ポリペプチド及びその製法
US6358726B1 (en) * 1997-06-10 2002-03-19 Takara Shuzo Co., Ltd. Thermostable protease

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0293852A (ja) 1988-09-30 1990-04-04 Toshiba Corp 計算機システム
JPH1051499A (ja) 1996-08-02 1998-02-20 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 衛星回線接続装置
WO2003100021A2 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Restoragen, Inc. Methods and dna constructs for high yield production of polypeptides

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARNETT ET AL., PROTEIN EXP. PURIF., vol. 5, 1994, pages 27 - 36
BETTER ET AL., SCIENCE, vol. 240, 1988, pages 1041 - 1043
CRABBE ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 31, 1992, pages 8500 - 8507
DA ET AL., NATURE, vol. 321, pages 706 - 708
GHRAYEB ET AL., EMBO J., vol. 3, 1984, pages 2437 - 2442
GROARKE ET AL., EMBO J., vol. 4, 1985, pages 1875 - 1880
HALFMANN, G. ET AL.: "Targeting of interleukin-2 to the periplasm of Escherichia coli.", J. GEN. MICROBIOL., vol. 139, no. 10, October 1993 (1993-10-01), pages 2465 - 2473, XP008045309 *
HARO ET AL., J ORTHOP RES, vol. 23, 2005, pages 412 - 419
HARO ET AL., J. SPINAL DISORD, vol. 13, 1999, pages 245 - 249
HOFFMAN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 5107 - 5111
IBRAHIM ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 262, 1987, pages 10189 - 10194
II ET AL., EXP BIOL MED (MAYWOOD, vol. 231, 2006, pages 20 - 27
JOHNSON ET AL., PROTEIN EXPRESSION PURIF, vol. 7, 1990, pages 104 - 113
MIYAZAKI ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 50, 1990, pages 7758 - 7764
OKA ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 7212 - 7216
ONEDA ET AL., J. BIOCHEM., vol. 126, 1999, pages 905 - 911
PUZISS ET AL., J. BACTERIOL., 1989, pages 2303 - 2311
SHEN ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 30, 1991, pages 11775 - 11781
SOLER ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 201, 1994, pages 917 - 923
VILLA-KOMAROFF ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 75, 1978, pages 3727 - 3731

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015178414A1 (ja) * 2014-05-21 2015-11-26 一般財団法人化学及血清療法研究所 マトリックスメタロプロテアーゼ７（ｍｍｐ－７）会合体の単量体化方法
KR20170003665A (ko) 2014-05-21 2017-01-09 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼 매트릭스 메탈로프로테아제7(mmp-7)　회합체의 단량체화 방법
JPWO2015178414A1 (ja) * 2014-05-21 2017-04-20 一般財団法人化学及血清療法研究所 マトリックスメタロプロテアーゼ７（ｍｍｐ−７）会合体の単量体化方法
RU2724543C2 (ru) * 2014-05-21 2020-06-23 КМ Байолоджикс Ко., Лтд. Способ мономеризации агрегата матриксной металлопротеиназы 7 (mmp-7)
US10774321B2 (en) 2014-05-21 2020-09-15 Km Biologics Co., Ltd. Method for monomerizing matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) aggregate
CN105949287A (zh) * 2016-06-29 2016-09-21 北京市农林科学院 一种a型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用

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