JP2938352B2 - 組換え人マトリライシンの製造方法 - Google Patents
組換え人マトリライシンの製造方法Info
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- JP2938352B2 JP2938352B2 JP6259576A JP25957694A JP2938352B2 JP 2938352 B2 JP2938352 B2 JP 2938352B2 JP 6259576 A JP6259576 A JP 6259576A JP 25957694 A JP25957694 A JP 25957694A JP 2938352 B2 JP2938352 B2 JP 2938352B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子量２９，０００の
前駆体型（２９ｋ型）および分子量１９，０００の成熟
型（１９ｋ型）の人マトリライシンの製造に関する。さ
らに詳しくは、微生物、たとえばＥ．ｃｏｌｉで効率的
に分泌発現されるように遺伝子の塩基配列を設計し、そ
のような遺伝子を人工合成し、微生物に導入した後、そ
の菌体からマトリライシンを分離精製することを特徴と
するマトリライシンの製造に関する。
前駆体型（２９ｋ型）および分子量１９，０００の成熟
型（１９ｋ型）の人マトリライシンの製造に関する。さ
らに詳しくは、微生物、たとえばＥ．ｃｏｌｉで効率的
に分泌発現されるように遺伝子の塩基配列を設計し、そ
のような遺伝子を人工合成し、微生物に導入した後、そ
の菌体からマトリライシンを分離精製することを特徴と
するマトリライシンの製造に関する。
【０００２】本発明で得られるマトリライシンは、医化
学、生化学および薬学の研究用試薬として有用であり、
種々の動物培養細胞を器壁よりはがしたり、また、種々
の動物組織から特定の細胞を分離するための細胞分散用
の試薬として有用である。中でも特に人由来の組織や細
胞を、分化機能を保持させた状態で分散させるのに有利
である。
学、生化学および薬学の研究用試薬として有用であり、
種々の動物培養細胞を器壁よりはがしたり、また、種々
の動物組織から特定の細胞を分離するための細胞分散用
の試薬として有用である。中でも特に人由来の組織や細
胞を、分化機能を保持させた状態で分散させるのに有利
である。
【０００３】
【従来の技術】細胞間のマトリクス（ＥＣＭ）は、繊維
状の構造蛋白やプロテオグリカンなどから成り、組織の
維持、形成に不可欠である。ＥＣＭの主な構造蛋白とし
て、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンが知られ
ている。癌細胞は金属プロテアーゼ、セリンプロテアー
ゼ、チオールプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアー
ゼなどの種々のプロテアーゼを分泌するが、これらの内
で特に金属プロテアーゼはＥＣＭ蛋白の分解に関与し、
癌細胞の転移に関係していると考えられている。
状の構造蛋白やプロテオグリカンなどから成り、組織の
維持、形成に不可欠である。ＥＣＭの主な構造蛋白とし
て、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンが知られ
ている。癌細胞は金属プロテアーゼ、セリンプロテアー
ゼ、チオールプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアー
ゼなどの種々のプロテアーゼを分泌するが、これらの内
で特に金属プロテアーゼはＥＣＭ蛋白の分解に関与し、
癌細胞の転移に関係していると考えられている。
【０００４】マトリライシンは別名ｐｕｍｐ−１と呼ば
れており、ラットの子宮（Woessner.J.F., Jr., and Ta
plin, C.J.(1988) J.Biol. Chem. 263, 16918-1692
5）、人の直腸癌細胞株（Miyazaki, K., Hattori, Y.,
Umenishi, F., Yasumitsu. H.,and Umeda, M.(1990) Ca
ncer Res. 50, 7758-7764）から精製されている。Quant
inら（Quantin, B., Murphy, G., and Breathnach, R.
(1989) Biochemistry 28, 5327-5334）はＣＯＳ細胞で
ｐｕｍｐ−１ｃＤＮＡを発現させた。また、Ye，Q，-
Z．ら（Ye, Q, -Z., Johnson, L. L. and Baragi, V (1
992) Biochem. Biophys. Res Commun. 186, 143-149）
はＥ．ｃｏｌｉでｐｕｍｐ−１を高発現させたが、イン
クルージョンボディが形成され、活性型は得られていな
い。
れており、ラットの子宮（Woessner.J.F., Jr., and Ta
plin, C.J.(1988) J.Biol. Chem. 263, 16918-1692
5）、人の直腸癌細胞株（Miyazaki, K., Hattori, Y.,
Umenishi, F., Yasumitsu. H.,and Umeda, M.(1990) Ca
ncer Res. 50, 7758-7764）から精製されている。Quant
inら（Quantin, B., Murphy, G., and Breathnach, R.
(1989) Biochemistry 28, 5327-5334）はＣＯＳ細胞で
ｐｕｍｐ−１ｃＤＮＡを発現させた。また、Ye，Q，-
Z．ら（Ye, Q, -Z., Johnson, L. L. and Baragi, V (1
992) Biochem. Biophys. Res Commun. 186, 143-149）
はＥ．ｃｏｌｉでｐｕｍｐ−１を高発現させたが、イン
クルージョンボディが形成され、活性型は得られていな
い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記公知の方法は以下
の点において工業的に十分とは言い難い。すなわち、天
然型、組換え型いずれの酵素の場合も、動物細胞を材料
とするとその細胞の培養のためには高価な培地を必要と
し、製造コストが高くなる。Ｅ．ｃｏｌｉを用いて組換
え型酵素を高発現させた場合は、不溶性のインクルージ
ョンボディとなり、活性型酵素が得られない。
の点において工業的に十分とは言い難い。すなわち、天
然型、組換え型いずれの酵素の場合も、動物細胞を材料
とするとその細胞の培養のためには高価な培地を必要と
し、製造コストが高くなる。Ｅ．ｃｏｌｉを用いて組換
え型酵素を高発現させた場合は、不溶性のインクルージ
ョンボディとなり、活性型酵素が得られない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような問
題点を解決する目的でなされたものであって、種々の検
討の結果、本発明者らはＥ．ｃｏｌｉにおいて活性型の
人マトリライシンを効率的に分泌発現させる方法を見い
だし、これらの知見をもとに、本発明の完成に至ったも
のである。
題点を解決する目的でなされたものであって、種々の検
討の結果、本発明者らはＥ．ｃｏｌｉにおいて活性型の
人マトリライシンを効率的に分泌発現させる方法を見い
だし、これらの知見をもとに、本発明の完成に至ったも
のである。
【０００７】以下に本発明の人マトリライシンの製造方
法を説明する。人マトリライシンの遺伝子の配列はすで
に公知である（Muller, D., Quantin, B., Gesnel, M.
C., Millon-Collard, R., Abecassis, J. and Breathna
ch, R. (1988) Biochem. J. 253, 187-192）。
法を説明する。人マトリライシンの遺伝子の配列はすで
に公知である（Muller, D., Quantin, B., Gesnel, M.
C., Millon-Collard, R., Abecassis, J. and Breathna
ch, R. (1988) Biochem. J. 253, 187-192）。
【０００８】しかしながら、人の遺伝子をEscherichia
coli（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させようとしても、一般的
には発現効率が低く、遺伝子産物を工業生産レベルにま
で高めることはきわめて困難である。
coli（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させようとしても、一般的
には発現効率が低く、遺伝子産物を工業生産レベルにま
で高めることはきわめて困難である。
【０００９】そこでＥ．ｃｏｌｉで効率よく発現させる
ために、Ｅ．ｃｏｌｉの至適コドンを用いて人マトリラ
イシンの遺伝子の配列を設計した。その際、成熟型酵素
を直接発現させると、正しい立体構造が取れずにインク
ルージョンボディが形成されることが予想されるので前
駆体型を発現する配列とした。また、Ｅ．ｃｏｌｉで効
率的に分泌発現させるために、Ｅ．ｃｏｌｉのアルカリ
性ホスファターゼのシグナルペプチドをＮ末端側に付加
した。細胞内で合成された前駆体酵素はシグナルペプチ
ダーゼによってシグナルペプチドが切断されて、ペリプ
ラズムに蓄積するよう設計した。
ために、Ｅ．ｃｏｌｉの至適コドンを用いて人マトリラ
イシンの遺伝子の配列を設計した。その際、成熟型酵素
を直接発現させると、正しい立体構造が取れずにインク
ルージョンボディが形成されることが予想されるので前
駆体型を発現する配列とした。また、Ｅ．ｃｏｌｉで効
率的に分泌発現させるために、Ｅ．ｃｏｌｉのアルカリ
性ホスファターゼのシグナルペプチドをＮ末端側に付加
した。細胞内で合成された前駆体酵素はシグナルペプチ
ダーゼによってシグナルペプチドが切断されて、ペリプ
ラズムに蓄積するよう設計した。
【００１０】そして、このような設計にしたがって人マ
トリライシン遺伝子配列を含有する合成遺伝子を現実に
作製することに成功しただけでなく、発現ベクタの選
択、該合成遺伝子を発現ベクタに挿入して組換えプラス
ミドの作製、これを宿主に導入して形質転換体の作成、
形質転換体の培養及び遺伝子の発現をそれぞれ確認した
だけでなく、更に、人マトリライシン封入体について
は、その可溶化、再生による活性型酵素の取得について
も研究を行い、成功するに至った。
トリライシン遺伝子配列を含有する合成遺伝子を現実に
作製することに成功しただけでなく、発現ベクタの選
択、該合成遺伝子を発現ベクタに挿入して組換えプラス
ミドの作製、これを宿主に導入して形質転換体の作成、
形質転換体の培養及び遺伝子の発現をそれぞれ確認した
だけでなく、更に、人マトリライシン封入体について
は、その可溶化、再生による活性型酵素の取得について
も研究を行い、成功するに至った。
【００１１】本発明は、特に発現がむつかしい合成遺伝
子にあって、遺伝子組換え技術の面でも様々な工夫をこ
らしてその発現に現実に成功しただけでなく、更に生化
学上の工夫をこらして従来得ることができなかった活性
型（成熟型）人マトリライシンの製造にはじめて成功し
たものである。以下、本発明を実施例により詳しく説明
する。
子にあって、遺伝子組換え技術の面でも様々な工夫をこ
らしてその発現に現実に成功しただけでなく、更に生化
学上の工夫をこらして従来得ることができなかった活性
型（成熟型）人マトリライシンの製造にはじめて成功し
たものである。以下、本発明を実施例により詳しく説明
する。
【００１２】
【実施例１】
【００１３】（１）人マトリライシンの遺伝子の設計 Ｅ．ｃｏｌｉで効率よく発現させるために、Ｅ．ｃｏｌ
ｉの至適コドンを用いて人マトリライシンの遺伝子の配
列を設計した。すなわち、１９ｋ型（活性型）マトリラ
イシンを直接発現させるのではなく、前駆体型（不活性
型）である２９ｋ型マトリライシンの遺伝子を基本配列
とし、そして、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に分泌発現させる
ために、Ｅ．ｃｏｌｉのアルカリ性ホスファターゼのシ
グナルペプチドをＮ末端側に付加した。発現ベクタに組
み込むために、Ｎ末端側にＥｃｏＲＩ、Ｃ末端側にＢａ
ｍＨＩの認識配列を導入した。人工合成遺伝子の塩基配
列を確認するときに必要なサブクローニングの為の制限
切断部位として、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ、
ＳｍａＩ、ＳｐｈＩの認識配列をコード領域内に導入し
た。
ｉの至適コドンを用いて人マトリライシンの遺伝子の配
列を設計した。すなわち、１９ｋ型（活性型）マトリラ
イシンを直接発現させるのではなく、前駆体型（不活性
型）である２９ｋ型マトリライシンの遺伝子を基本配列
とし、そして、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に分泌発現させる
ために、Ｅ．ｃｏｌｉのアルカリ性ホスファターゼのシ
グナルペプチドをＮ末端側に付加した。発現ベクタに組
み込むために、Ｎ末端側にＥｃｏＲＩ、Ｃ末端側にＢａ
ｍＨＩの認識配列を導入した。人工合成遺伝子の塩基配
列を確認するときに必要なサブクローニングの為の制限
切断部位として、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ、
ＳｍａＩ、ＳｐｈＩの認識配列をコード領域内に導入し
た。
【００１４】この人マトリライシンの遺伝子を含有する
塩基配列を、アミノ酸配列とともに、下記表１、表２に
示される配列表の配列番号１に示す。
塩基配列を、アミノ酸配列とともに、下記表１、表２に
示される配列表の配列番号１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】（２）人マトリライシンをＥ．ｃｏｌｉで
分泌発現させるためのプラスミドの構築
分泌発現させるためのプラスミドの構築
【００１８】Ｅ．ｃｏｌｉのアルカリ性ホスファターゼ
のシグナルペプチドの遺伝子を付加した人マトリライシ
ンの全長遺伝子を約５０ベースの長さの２８本のオリゴ
ヌクレオチドに分類し（図１、図２）、それぞれをＤＮ
Ａ自動合成機を用いて合成し、図３に示す手順で、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより順次ＤＮＡ断片を連結して、人工
合成遺伝子を創製した。
のシグナルペプチドの遺伝子を付加した人マトリライシ
ンの全長遺伝子を約５０ベースの長さの２８本のオリゴ
ヌクレオチドに分類し（図１、図２）、それぞれをＤＮ
Ａ自動合成機を用いて合成し、図３に示す手順で、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより順次ＤＮＡ断片を連結して、人工
合成遺伝子を創製した。
【００１９】発現ベクタとしては、λＰＲプロモータ
と、クローニング部位として、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、
ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩサイトをもつｐλ
ＰＲを用いた。この発現ベクタをＥｃｏＲＩ、とＢａｍ
ＨＩで切断し、人マトリライシンの合成遺伝子を挿入し
てｐλＰＲ−ＭＡＴを作製した。ライゲーション反応
は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、１４℃、１６時間行
った。この反応生成物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｎ９９ｃ
Ｉ+（Ｆ-，ｓｔｒＡ，ｇａ１Ｋ２λ-，ＩＮ（ｒｒｎＤ
−ｒｒｎＥ）１）の形質転換を行った。得られた形質転
換菌のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法により分離し、
制限切断により目的遺伝子が挿入されていることを確認
した後、再度、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ４８３０−１（Ｆ-ｓ
ｕo ｈｉｓ-，ｉｌｖ-，ｇａｌＫ-，（ｃｈｌＤ−ｐｇ
ｌ），（λ，Ｂａｍ，Ｎ+，ｃ１８５７，Ｈ１）の形質
転換を行った。
と、クローニング部位として、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、
ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩサイトをもつｐλ
ＰＲを用いた。この発現ベクタをＥｃｏＲＩ、とＢａｍ
ＨＩで切断し、人マトリライシンの合成遺伝子を挿入し
てｐλＰＲ−ＭＡＴを作製した。ライゲーション反応
は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、１４℃、１６時間行
った。この反応生成物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｎ９９ｃ
Ｉ+（Ｆ-，ｓｔｒＡ，ｇａ１Ｋ２λ-，ＩＮ（ｒｒｎＤ
−ｒｒｎＥ）１）の形質転換を行った。得られた形質転
換菌のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法により分離し、
制限切断により目的遺伝子が挿入されていることを確認
した後、再度、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ４８３０−１（Ｆ-ｓ
ｕo ｈｉｓ-，ｉｌｖ-，ｇａｌＫ-，（ｃｈｌＤ−ｐｇ
ｌ），（λ，Ｂａｍ，Ｎ+，ｃ１８５７，Ｈ１）の形質
転換を行った。
【００２０】（３）形質転換菌の培養 プラスミドｐλＰＲ−ＭＡＴで形質転換した大腸菌Ｎ４
８３０−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎ
４８３０−１／ｐλＰＲ−ＭＡＴと命名し、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４７９４と
して寄託した。この形質転換菌を、アンピシリンを１ｍ
ｌあたり５０μｇ含むＬＢ培地中で、３０℃で１６時間
培養した。このようにして得た菌体液を、アンピシリン
を１ｍｌあたり５０μｇ含むＬＢ培地に３％接種し、３
０℃で６時間培養後、３４℃または４２℃で１〜４時間
培養した。
８３０−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎ
４８３０−１／ｐλＰＲ−ＭＡＴと命名し、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４７９４と
して寄託した。この形質転換菌を、アンピシリンを１ｍ
ｌあたり５０μｇ含むＬＢ培地中で、３０℃で１６時間
培養した。このようにして得た菌体液を、アンピシリン
を１ｍｌあたり５０μｇ含むＬＢ培地に３％接種し、３
０℃で６時間培養後、３４℃または４２℃で１〜４時間
培養した。
【００２１】（４）マトリライシンの精製と性質 マトリライシンの発現の誘導を３４℃で行った場合は、
２９ｋ型のプロマトリライシンが可溶性として発現され
た。４２℃で発現の誘導を行った場合は、３１ｋ型のシ
グナルペプチドの付加したマトリライシンが不溶性とし
て発現された。３１ｋ型マトリライシンは以下に示す方
法により変性条件下で精製後、再生することにより、活
性型酵素が得られた。
２９ｋ型のプロマトリライシンが可溶性として発現され
た。４２℃で発現の誘導を行った場合は、３１ｋ型のシ
グナルペプチドの付加したマトリライシンが不溶性とし
て発現された。３１ｋ型マトリライシンは以下に示す方
法により変性条件下で精製後、再生することにより、活
性型酵素が得られた。
【００２２】菌体の３倍量の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミルにより菌を破砕し
た。１５，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離し、
上清と沈澱に分けた（可溶性の２９ｋ型プロマトリライ
シンが発現している場合はこの上清から精製する）。得
られた沈澱から以下の処理により封入体を得る。まず１
Ｍ蔗糖溶液に沈澱を懸濁し、１０，０００ｒｐｍで１５
分間遠心して沈澱を得る。２％トリトンＸ−１００、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液懸濁し、４℃で約１８時間攪拌す
る。１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈澱を得
る。１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で３回洗浄することにより
封入体が得られる。得られた封入体を８Ｍ尿素、０．０
１％ Ｂｒｉｊ３５を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）で溶解し、緩衝液Ａで平衡
化したＳＰセファロースカラムにアプライした。目的蛋
白質はこの条件でＳＰセファロースカラムに吸着した。
緩衝液Ａでカラムを十分に洗浄後、０〜０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌの直線濃度勾配で溶出した。目的蛋白質画分を、ダ
イアフローＹＭ−１０メンブレンを用いて膜濃縮を行っ
た。濃縮したサンプルを、緩衝液Ａで平衡化したＳｕｐ
ｅｒｄｅｘ ２００カラムを用いた分子篩クロマトグラ
フィにかけた。以上の工程により、シグナルペプチドが
付加した３１ｋ型のプロマトリライシンを精製した。
０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミルにより菌を破砕し
た。１５，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離し、
上清と沈澱に分けた（可溶性の２９ｋ型プロマトリライ
シンが発現している場合はこの上清から精製する）。得
られた沈澱から以下の処理により封入体を得る。まず１
Ｍ蔗糖溶液に沈澱を懸濁し、１０，０００ｒｐｍで１５
分間遠心して沈澱を得る。２％トリトンＸ−１００、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液懸濁し、４℃で約１８時間攪拌す
る。１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈澱を得
る。１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で３回洗浄することにより
封入体が得られる。得られた封入体を８Ｍ尿素、０．０
１％ Ｂｒｉｊ３５を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）で溶解し、緩衝液Ａで平衡
化したＳＰセファロースカラムにアプライした。目的蛋
白質はこの条件でＳＰセファロースカラムに吸着した。
緩衝液Ａでカラムを十分に洗浄後、０〜０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌの直線濃度勾配で溶出した。目的蛋白質画分を、ダ
イアフローＹＭ−１０メンブレンを用いて膜濃縮を行っ
た。濃縮したサンプルを、緩衝液Ａで平衡化したＳｕｐ
ｅｒｄｅｘ ２００カラムを用いた分子篩クロマトグラ
フィにかけた。以上の工程により、シグナルペプチドが
付加した３１ｋ型のプロマトリライシンを精製した。
【００２３】分子篩クロマトグラフィにかけて得られた
３１ｋ型プロマトリライシンを含む画分を集め、０．５
Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で、４℃で約１７時間透析を行うと、３１ｋ型のプロ
マトリライシンは可溶性として再生された。
３１ｋ型プロマトリライシンを含む画分を集め、０．５
Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で、４℃で約１７時間透析を行うと、３１ｋ型のプロ
マトリライシンは可溶性として再生された。
【００２４】得られた３１ｋ型プロマトリライシンは、
０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2と１０ｍＭＣａＣｌ2の存在下
で、３７℃で反応させると、約１時間で２９ｋ型にプロ
セシングされ、約１７時間で１９ｋ型にまでプロセシン
グされた。
０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2と１０ｍＭＣａＣｌ2の存在下
で、３７℃で反応させると、約１時間で２９ｋ型にプロ
セシングされ、約１７時間で１９ｋ型にまでプロセシン
グされた。
【００２５】
【発明の効果】本発明の方法によれば、コストのかかる
動物細胞を培養する必要がなく、高純度の人マトリライ
シンを工業的規模で容易に製造することができる。
動物細胞を培養する必要がなく、高純度の人マトリライ
シンを工業的規模で容易に製造することができる。
【図１】組換え人マトリライシンの遺伝子の塩基配列お
よびアミノ酸配列を示した図である。
よびアミノ酸配列を示した図である。
【図２】同上続きを示した図である。
【図３】本発明に係る発現プラスミドの構築図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有する人マトリライシン遺伝子領域を含む塩基配列を
有するＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡを含んだ組換え
ベクター。 - 【請求項３】 組換えベクターが人マトリライシン遺伝
子を含有する塩基配列を含んだ組換えプラスミドｐλＰ
Ｒ−ＭＡＴであることを特徴とする請求項２に記載の組
換えベクター。 - 【請求項４】 請求項２又は３に記載のベクターを宿主
微生物に導入してなる形質転換体。 - 【請求項５】 宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉであることを特徴とする請求項４に記載の形質
転換体。 - 【請求項６】 形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ Ｎ４８３０−１／ｐλＰＲ−ＭＡＴ。 - 【請求項７】 請求項４〜６のいずれか１項に記載の形
質転換体を使用することを特徴とする人マトリライシン
の製造方法。 - 【請求項８】 発現されるマトリライシンがプロ型(前
駆体型)であり、オートプロセシング機構によって活性
型酵素が得られるものであることを特徴とする請求項７
に記載の方法。 - 【請求項９】 マトリライシンのアミノ酸配列のＮ末端
側にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのシグナルペプ
チドの配列を持ち、ペリプラズムに分泌されることを特
徴とする請求項７又は８に記載の方法。 - 【請求項１０】 シグナルペプチドとして、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのアルカリ性ホスファターゼの
シグナルペプチドの配列を用いることを特徴とする請求
項９に記載の方法。
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