WO2015178414A1 - マトリックスメタロプロテアーゼ７（ｍｍｐ－７）会合体の単量体化方法 - Google Patents

マトリックスメタロプロテアーゼ７（ｍｍｐ－７）会合体の単量体化方法 Download PDF

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正樹 平嶋
英樹 竹尾
玲子 松山
亘 森河
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    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24023—Matrilysin (3.4.24.23)

Definitions

  • the present invention relates to a method for monomerizing an association of matrix metalloprotease 7 (hereinafter sometimes referred to as “MMP-7”). Specifically, a method for monomerizing an MMP-7 aggregate, comprising treating the aggregate of MMP-7 in a solution containing a low concentration monovalent cation compound or in the same solution not containing the compound. The present invention also relates to a method for producing MMP-7 incorporating the monomerization method, and an MMP-7-containing (pharmaceutical) composition obtained by further dissolving a sugar alcohol or a saccharide in the solution.
  • MMP-7 matrix metalloprotease 7
  • MMP-7 is one of matrix metalloproteases (hereinafter sometimes referred to as “MMP”) belonging to the zinc-type metalloprotease family having a zinc molecule in the active site (see, for example, Non-Patent Document 1). MMPs are produced as precursors, the signal sequence is processed during extracellular secretion, and then the pro sequence is processed to the active form. MMP secreted extracellularly governs the metabolism of extracellular matrix, whereas MMP-7 is secreted mainly by cancer cells and is involved in invasion and metastasis (for example, non-patent literature) 2).
  • MMP-7 does not have the hinge and hemopexin-like domains that many other MMPs have, and consists of the smallest molecular unit in MMP, which constitutes collagen and the extracellular matrix (fibronectin, vitronectin) , Laminin, aggrecan) as substrate.
  • MMP-7 is based on aggrecan, the main component of cartilage tissue, and macrophages derived from surgical specimens of disc herniation express MMP-7 (for example, see Non-Patent Document 3). It is presumed to be involved in the natural regression of Subsequently, Muro et al. Administered MMP-7 to the disc of a hernia dog and observed a decrease in the volume of the nucleus pulposus in the intervertebral disc, and showed the possibility as a therapeutic agent for disc herniation (for example, see Non-Patent Document 4). ).
  • MMP-7 As a pharmaceutical product is desired, MMP-7 is present only in trace amounts in living organisms, and it is extremely difficult to separate and purify MMP-7 from living organisms. In this case, there are concerns about safety issues such as potential virus contamination. Although MMP-7 can be obtained from cancer cells, it is not preferable to use cancer cells as production strains (see, for example, Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 6 expressing MMP-7 in CHO cells, base matrix of alkaline phosphatase signal sequence and pro-matrix metalloprotease 7 optimized for codon usage of E. coli (Which may also be referred to as “proMMP-7”), which is expressed as soluble proMMP-7 at 34 ° C. and insoluble proMMP-7 at 42 ° C.
  • ProMMP-7 pro-matrix metalloprotease 7 optimized for codon usage of E. coli
  • Patent Document 1 reports of expressing a large amount of inclusion bodies by using a nucleic acid fragment obtained by linking a modified signal peptide and the gene sequence of proMMP-7 (for example, see Patent Document 2). is there.
  • Non-Patent Document 7 To convert proMMP-7 to active MMP-7, incubate at 37 ° C in the presence of 1 mM (4-aminophenyl) mercuric acetate (APMA) or 0.2 ⁇ M trypsin, or keep a solution containing proMMP-7 at 53 ° C. Methods (see, for example, Non-Patent Document 7) have been reported, in which activated low concentrations (less than 1 mg / ml) of MMP-7 (also known as Matrilysin) are stored for 6 months at -20 ° C. And when stored at room temperature for 28 days, it was revealed that there was no change in its activity and electrophoresis.
  • activated low concentrations less than 1 mg / ml
  • MMP-7 also known as Matrilysin
  • compositions containing MMP-7 those containing tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (tris hydrochloride), calcium chloride and sodium chloride have been reported (for example, Patent Documents 3 to 5, It is known that metalloproteases such as MMP-7 are stabilized by the coexistence of calcium chloride and sodium chloride in the case of solution compositions (see, for example, Patent Document 6).
  • pharmaceuticals are usually near the osmotic pressure of body fluids mainly from the viewpoint of safety, and sodium chloride is generally used as an osmotic pressure regulator of solution compositions.
  • compositions disclosed in these documents are: Most of them contain a monovalent cation compound such as sodium chloride at a concentration that is isotonic with or higher than that of the body fluid. Moreover, the composition currently disclosed by these literature does not contain sugar alcohol or saccharides.
  • MMP-7 is monovalent, such as sodium chloride, as in the case of a conventional pharmaceutical preparation, particularly a solution composition of the above-mentioned metalloprotease.
  • Containers such as vials ordinarily used when preserving gels or preparations in devices usually used in the production of proteins and their preparations, and forming aggregates when the cationic compound is isotonic with body fluids at about 150 mM or more
  • a method for monomerizing an MMP-7 aggregate in which MMP-7 is adsorbed on the production apparatus and the adsorption to the MMP-7 production apparatus during MMP-7 production is suppressed. It has been an object to provide a method for producing MMP-7 that has been incorporated, and an MMP-7-containing (medicine) composition in which formation and adsorption of MMP-7 are suppressed.
  • MMP-7 aggregates are dissociated and treated by treatment with a solution such as Tris buffer (pH 6 to 8) containing a low concentration of monovalent cation chloride (such as sodium chloride and potassium chloride). Form a mass. Monomers are similarly formed when treated with the same solution containing no monovalent cation chloride.
  • the MMP-7 aggregate monomerization method (hereinafter sometimes simply referred to as “monomerization method”) by the above treatment is incorporated into the production process of MMP-7. The production efficiency can be increased.
  • MMP-7 monomer maintains high enzyme activity.
  • saccharides such as mannitol and sucrose or sugar alcohol in the above Tris buffer, not only the formation of aggregates of MMP-7 but also the adsorption of MMP-7 to the gel and vial wall is suppressed. Is done.
  • composition containing a monovalent cation chloride having a concentration lower than about 150 mM, which is isotonic with a body fluid when it is used as an aqueous solution, and a sugar alcohol or saccharide It becomes a pharmaceutical preparation with suppressed adsorption.
  • MMP-7-containing (pharmaceutical) compositions are as follows. [1] MMP-7 association, comprising treating an association of matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) with a solution containing a monovalent cation compound of 130 mM or less or a solution not containing a monovalent cation compound Monomerization method of coalescence. [2] The monomerization method according to [1], wherein the MMP-7 aggregate is treated with a solution containing a monovalent cation compound of 130 mM or less.
  • [3] The monomerization method according to [1], wherein the MMP-7 aggregate is treated with a solution containing no monovalent cation compound.
  • [4] The monomerization method according to [1] or [2], wherein the concentration of the monovalent cation compound is 100 mM or less.
  • [5] The monomerization method according to [1], [2] or [4], wherein the concentration of the monovalent cation compound is 80 mM or less.
  • [6] The monomerization method according to [1], [2], [4] or [5], wherein the concentration of the monovalent cation compound is 40 mM or less.
  • the monovalent cation compound is selected from the group consisting of sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium phosphate and potassium phosphate, [1], [2 ], [4], [5] or [6].
  • Method [9] The monomerization method according to [8], wherein the monovalent cation chloride is selected from the group consisting of sodium chloride and potassium chloride.
  • Monomerization method [18] The monomerization method according to [16] or [17], wherein the sugar alcohol and / or saccharide is 2% or more. [19] The monomerization method according to [18], wherein the sugar alcohol and / or saccharide is 2 to 7%. [20] The monomerization method according to any one of [17] to [19], wherein the sugar alcohol and / or saccharide is mannitol or sucrose. [21] The monomerization method according to [20], wherein the mannitol is 2 to 5% and the sucrose is 2 to 7%. [22] A method for producing MMP-7, comprising a step comprising the monomerization method according to any one of [1] to [21].
  • MMP-7-containing medicine containing matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) as an active ingredient in a solution containing a monovalent cation compound of 130 mM or less or a solution not containing a monovalent cation compound )Composition.
  • MMP-7-containing (pharmaceutical) composition according to [26] containing MMP-7 as an active ingredient in a solution containing a monovalent cationic compound of 130 mM or less.
  • the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition according to [26] containing MMP-7 as an active ingredient in a solution not containing a monovalent cation compound.
  • the monovalent cation compound is selected from the group consisting of sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium phosphate and potassium phosphate, [26] or [27 ] MMP-7 containing (pharmaceutical) composition of description.
  • the sugar alcohol and / or saccharide is selected from the group consisting of sucrose, lactose, maltose, xylose, trehalose, mannitol, sorbitol, xylitol, maltitol, lactitol, and oligosaccharide alcohol.
  • MMP-7-containing (pharmaceutical) composition [41] The MMP-7-containing (pharmaceutical) composition according to [39] or [40], wherein the sugar alcohol and / or saccharide is 2% or more. [42] The MMP-7-containing (pharmaceutical) composition according to [41], wherein the sugar alcohol and / or saccharide is 2 to 7%.
  • An MMP-7-containing (pharmaceutical) solid composition that can be dissolved in a solvent and the composition at the time of dissolution is the composition according to any one of [26] to [44].
  • a therapeutic agent for intervertebral hernia comprising the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition according to any one of [26] to [45].
  • a method for easily monomerizing MMP-7 aggregates By incorporating this method into the production process of MMP-7, productivity and recovery efficiency of MMP-7 are obtained. Can be raised.
  • MMP-7 monomerized by this method has a higher specific activity as an enzyme of MMP-7 than when MMP-7 aggregates are present, and thus a high-quality MMP-7 preparation is obtained.
  • MMP-7 maintains its shape as a monomer.
  • high enzyme activity can be maintained and adsorption of MMP-7 to the storage container can be suppressed. Therefore, the buffer used in the monomerization method of the present invention is useful as a storage solution for the MMP-7 preparation.
  • the MMP-7 composition containing a low concentration of sodium chloride and a sugar alcohol or a saccharide in the case of an aqueous solution of the present invention suppresses the formation of MMP-7 aggregates, and further to a container for MMP-7. It is useful as a solution composition for pharmaceutical use and a preparation composition thereof, in which the adsorption of is suppressed.
  • FIG. 1 shows the effect of inhibiting the formation of MMP-7 aggregates by sodium chloride (NaCl) and potassium chloride (KCl) based on the analysis results of the molecular weight of MMP-7 measured by the dynamic light scattering method.
  • FIG. 2 shows the influence of calcium chloride (CaCl 2 ) on the suppression of MMP-7 aggregate formation based on the analysis results of the molecular weight of MMP-7 measured by dynamic light scattering.
  • FIG. 3 shows the influence of MMP-7 concentration on the formation of aggregates of MMP-7 based on the analysis results of the molecular weight of MMP-7 measured by size exclusion chromatography.
  • FIG. 1 shows the effect of inhibiting the formation of MMP-7 aggregates by sodium chloride (NaCl) and potassium chloride (KCl) based on the analysis results of the molecular weight of MMP-7 measured by the dynamic light scattering method.
  • FIG. 2 shows the influence of calcium chloride (CaCl 2 ) on the suppression of MMP-7 aggregate formation based on
  • FIG. 4 shows that when each MMP-7 at 0.1 mg / ml, 2 mg / ml, and 20 mg / ml is diluted with Tris buffer containing 150 mM sodium chloride (NaCl) or 40 mM NaCl, the concentration of sodium chloride is reduced. The influence which it has on the enzyme activity of MMP-7 is shown.
  • FIG. 5 shows the effect of suppressing adsorption of MMP-7 to the gel by mannitol. A: 5 mM Tris buffer (pH7) / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl, B: 5mM Tris buffer (pH7) / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 3.5% mannitol.
  • FIG. 5 5 mM Tris buffer (pH7) / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 3.5% mannitol.
  • FIG. 6 shows the effect of suppressing adsorption of MMP-7 to the vial wall by mannitol and sucrose.
  • FIG. 7 shows the effect of suppressing the adsorption of MMP-7 to the vial wall at each concentration of mannitol and sucrose.
  • FIG. 8 shows the influence of MMP-7 on the enzyme activity at each concentration of mannitol and sucrose.
  • FIG. 9 shows the influence of mannitol on the inhibition of formation of MMP-7 aggregates.
  • the present invention provides a method for monomerizing MMP-7 aggregates, a method for producing MMP-7 incorporating the monomerization method, and an MMP-7-containing (pharmaceutical) composition.
  • Treating 7 aggregates with a solution containing a low concentration of monovalent cation compound, sugar alcohol or saccharide hereinafter also referred to as “monomerization solution”
  • MMP- It is characterized by preserving 7 and making it an MMP-7 composition containing a low concentration monovalent cation compound and a sugar alcohol or saccharide when made into an aqueous solution.
  • MMP-7 aggregates can be detected by measuring the molecular weight of MMP-7 using methods such as dynamic light scattering, size exclusion chromatography, ultracentrifugation, etc. This is done by comparing with the molecular weight of the monomer (approximately 19 kDa).
  • the molecular weight in the sample measured by the dynamic light scattering method showed a value between 19 kDa and 38 kDa
  • MMP-7 was present as a monomer and showed a value of 38 kDa or more.
  • the above criteria are based on the accuracy of the measured value obtained by the dynamic light scattering method. If the value is more than a dimer, it is assumed that an obvious aggregate is formed, and a value smaller than that. In this case, it was a monomer.
  • MMP-7 monomerization is performed by treating the MMP-7 aggregate with a monomerization solution.
  • “treating the MMP-7 aggregate with the monomerization solution” means exposing the MMP-7 aggregate to the monomerization solution, and dissolving in the solution. Including. When the MMP-7 aggregate is dissolved in a solution containing a monovalent cation compound with a high concentration exceeding 130 mM, buffer exchange with an ultrafiltration membrane or a dialysis membrane is performed using a monomerization solution. Including performing. Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, carbonate buffer, and the like can be used as a buffer for keeping the pH of the monomerization solution constant.
  • the concentration of the buffer is in the range of 5 to 25 mM, preferably 5 to 20 mM.
  • the pH is in the range of 5-9, preferably 6-8. More preferably, a Tris buffer that exhibits an effect on improving the stability of the metalloprotease is selected, and the concentration of the Tris buffer is in the range of 5 to 10 mM and the pH is in the range of 6 to 8 (see Special Table 2011-521906). ).
  • the “monovalent cation compound” means a compound composed of a monovalent cation and a paired anion.
  • sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, sodium carbonate, carbonic acid examples include potassium, sodium phosphate, and potassium phosphate.
  • the “monovalent cation chloride” means a compound composed of a monovalent cation and chloride ion.
  • a monovalent cation chloride for example, a monovalent cation compound used in the present invention. Any of these may be used, but it is preferable to use a monovalent cation chloride. Specifically, sodium chloride and potassium chloride are most preferable.
  • a low concentration monovalent cation compound is used to dissociate MMP-7 aggregates into monomers.
  • MMP-7 dissociated into monomers is maintained as a monomer in a monomerization solution containing a low concentration monovalent cation compound.
  • a solution such as a monomerization solution and water that does not contain a monovalent cation compound. Therefore, a single unit of MMP-7 aggregate using a monomerization solution that does not contain a monovalent cation compound (in the present invention, the monomerization solution includes a liquid such as water).
  • a merging method is also encompassed in the present invention.
  • the solution containing a low concentration monovalent cation compound and the same solution not containing a monovalent cation compound may be simply referred to as “monomerization solution”.
  • the range of the treatment concentration of the monovalent cation compound can be expanded.
  • Preferred is a divalent cation compound, more preferred is a divalent calcium ion compound, and most preferred is calcium chloride.
  • the “multivalent cation compound” means a compound composed of a polyvalent cation and an anion paired with the monovalent cation compound.
  • a monovalent cation compound of 40 mM or less when water is used as the monomerization solution, a monovalent cation compound of 40 mM or less is used, and by adding calcium chloride to the monomerization solution, 1 of 40 mM or more is used. Treatment with a monomerizing solution containing a valent cation compound is enabled. More specifically, when it contains 5 mM to 10 mM calcium chloride, it contains a monovalent cation compound of 80 mM or less, when it contains 10 mM to 30 mM calcium chloride, it contains a monovalent cation compound of 100 mM or less, and 30 mM calcium chloride. In this case, a monomerization solution containing a monovalent cation compound of 130 mM or less can be used.
  • Example 2 shows that the addition of calcium chloride enhanced the effect of dissociating MMP-7 aggregates into monomers and the effect of inhibiting the formation of MMP-7 monomer aggregates. Moreover, it can be read from the results of Example 2 (FIG. 2) that this effect is proportional to the concentration of calcium chloride. That is, by using a high concentration of calcium chloride, a greater effect of MMP-7 monomerization and maintenance of MMP-7 monomer can be expected. From the above, the concentration of the monovalent cation compound is 130 mM or less, preferably 100 mM or less, more preferably 80 mM or less, and most preferably 40 mM or less in the case of an aqueous solution. In addition, although it is not necessary to contain a monovalent cation compound, the inclusion is preferable from the viewpoint of quality as a pharmaceutical composition.
  • a monomerization solution comprising 5 to 25 mM Tris buffer (pH 6 to 8) containing 30 to 40 mM sodium chloride and 5 to 30 mM calcium chloride, or the same monomerization excluding sodium chloride It is preferable to use a preparation solution.
  • the monomerization method of the MMP-7 aggregate of the present invention can be incorporated into the production process of MMP-7 in order to produce a high-quality MMP-7 monomer efficiently.
  • the general production method of MMP-7 obtained by genetic recombination technology is as follows: cultivation of bacterial cells, release of inclusion bodies, dissolution and refolding of inclusion bodies, purification of proMMP-7, self-activation of MMP of proMMP-7 -7 conversion and MMP-7 purification / concentration.
  • proMMP-7-producing E. coli is prepared. Generally, it can be prepared by introducing proMMP-7 gene inserted into an expression vector into E. coli according to a conventional method. However, since proMMP-7 is highly toxic to E. coli, production efficiency may be extremely reduced. In order to solve this problem, devices such as adding a signal peptide to the N-terminal side of proMMP-7 are performed. In the case of proMMP-7, the expression level of proMMP-7 is increased by simply adding a signal peptide. In addition, a phenomenon that part of the expressed proMMP-7 is degraded by protease is observed.
  • proMMP-7-producing Escherichia coli having an increased expression level of proMMP-7 and an effect of inhibiting the degradation of proMMP-7 by protease as a raw material for MMP-7 production.
  • proMMP-7-producing E. coli can be prepared according to the method described in WO2010 / 047347 (more specifically, see Preparation Examples).
  • the proMMP-7-producing Escherichia coli thus obtained is purified as a result of repeated cloning, stored as a working cell bank, and used as a large-scale inoculum for MMP-7 preparation.
  • the working cell bank stock solution is usually used under conditions used for the storage of recombinant E. coli, for example, in a solution containing 7-10% dimethyl sulfoxide or 10-50% glycerol, in a freezer at -80 to -20 ° C. Freeze-dried in liquid nitrogen or in an ampoule and stored in a refrigerator at 2-10 ° C.
  • Culturing of proMMP-7-producing E. coli on a production scale is performed in two stages: pre-culture on a small scale and main culture on a large scale.
  • a general LB medium of recombinant E. coli in some cases antibiotics such as ampicillin may be added to maintain the plasmid
  • a medium in which substances that cause side effects are eliminated as much as possible examples include glucose medium containing various trace metals (magnesium, calcium, copper, sodium, etc.), LB medium, M9 medium, and the like.
  • As culture conditions a range suitable for the growth of Escherichia coli is used.
  • culture conditions of pH (pH 6 to 8), temperature (30 to 45 ° C.), and time (4 to 16 hours) are possible. These culture conditions are appropriately adjusted by the culture scale, expression induction treatment, and the like.
  • An expression inducer is used to efficiently express proMMP-7. Examples of the expression inducer include isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) and lactose.
  • the following method is used to recover MMP-7 from proMMP-7-producing Escherichia coli cultured and expanded in large quantities by main culture.
  • proMMP-7-producing Escherichia coli is cultured, and the proliferated microbial cells are crushed by an appropriate method, and inclusion bodies composed of proMMP-7 are released outside the microbial cells.
  • chemical substances for example, EDTA as a chelating agent
  • surfactants for example, Triton X100
  • enzymes for example, lysozyme
  • any method may be used. By combining several of these methods, the cells can be more effectively disrupted.
  • the collected inclusion body is once dissolved in a solution containing a reducing agent and a denaturing agent.
  • a reducing agent cysteine, glutathione, dithiothreitol, 2-mercaptoethanol and the like can be used. These may be used in combination.
  • the concentration of the reducing agent depends on the amount of inclusion bodies to be dissolved, but is used in the range of 10 to 200 mM.
  • the denaturing agent urea, guanidine hydrochloride and the like can be used. Such urea and guanidine hydrochloride are used in concentration ranges of 4-8M and 2-6M, respectively.
  • a buffer similar to that used in the collection of inclusion bodies for example, a phosphate buffer or a Tris buffer (pH 7.0 to 9) is used.
  • the temperature at the time of dissolution is not particularly limited as long as it is 40 ° C. or lower.
  • the dissolution time may be set while observing the dissolution state of the inclusion body, and is usually stirred for 30 minutes to 1 hour.
  • refolding of proMMP-7 that is, construction of a normal three-dimensional structure is performed by adding a refolding buffer containing a surfactant and metal ions to the lysate of the inclusion body.
  • a surfactant used at this time, bridge 35 and zinc acetate, cobalt chloride and the like as metal ions are used in a concentration range of 0.5 to 2% and 0.05 mM to 0.2 mM, respectively.
  • the type and concentration of the buffer solution for refolding may be the same as those used for dissolving the inclusion bodies.
  • the refolding process is performed by leaving it for one day or more.
  • proMMP-7 When purifying proMMP-7 from a refolding solution, purification methods generally used in protein chemistry, such as centrifugation, salting-out, ultrafiltration, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion A combination of methods such as exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and hydroxyapatite chromatography is used.
  • the proMMP-7 of the present invention can be purified by using a process consisting of ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography and ultrafiltration membrane treatment. Both chromatographies may be performed according to conventional methods.
  • the amount of the obtained protein or polypeptide is measured using a protein measuring reagent such as BCA-Protein-Assay-Reagent-Kit (Pierce-Biotechnology, Inc) or Protein-Assay-Kit (BIO-RAD, Inc).
  • a protein measuring reagent such as BCA-Protein-Assay-Reagent-Kit (Pierce-Biotechnology, Inc) or Protein-Assay-Kit (BIO-RAD, Inc).
  • proMMP-7 is converted to MMP-7.
  • a proMMP-7-containing solution is kept at 37 ° C. in the presence of 1 mM (4-aminophenyl) mercuric acetate (APMA) or 0.2 ⁇ M trypsin, or a proMMP-7-containing solution is kept at 53 ° C. (Crabbe Et al., Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507), and any method may be used.
  • APMA 4-aminophenyl mercuric acetate
  • trypsin 0.2 ⁇ M trypsin
  • a proMMP-7-containing solution is kept at 53 ° C.
  • 30 to 200 mM sodium chloride may be added (Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507, WO 2010/047347 A1).
  • the incubation time is in the range of 1 to 5 hours, but is appropriately adjusted depending on the concentration of reagents and proMMP-7, the treatment amount, and the like. Trypsin treated with N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) is used.
  • TPCK N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone
  • the converted MMP-7 forms an aggregate in a high salt solution, and this tendency is strong when the concentration of MMP-7 in the solution is 1 mg / ml or more.
  • the presence of MMP-7 aggregates leads to a decrease in productivity and quality in the production and formulation of MMP-7.
  • the monomerization method of the present invention is incorporated after the treatment step with a monovalent cation compound of 130 mM or more. More specifically, it is preferably incorporated immediately after conversion of proMMP-7 to MMP-7 by self-activation.
  • the treatment by the monomerization method of the present invention is preferably performed for 20 mg / ml or less of MMP-7, but when treating 20 mg / ml or more of MMP-7, as described above, calcium chloride is used.
  • concentration of the MMP-7 By controlling the concentration of the MMP-7, the same effect of inhibiting the formation of aggregates of MMP-7 can be expected.
  • the solution containing the monomer of MMP-7 thus obtained is used as a raw material for formulation through a purification and concentration step of MMP-7 using an ultrafiltration membrane or the like, if necessary. Also in this step, the monomerization solution of the present invention is used. Once the monomerized MMP-7 is stored in the monomerization solution, it is maintained as a monomer, and no decrease in enzyme activity is observed over a long period of time. Therefore, the monomerization solution of the present invention can be used to preserve MMP-7 before formulation and to produce a (pharmaceutical) composition containing MMP-7 as an active ingredient. -7 can be maintained.
  • sugar alcohols and saccharides are converted into gels widely used for the production of MMP-7. Adsorption suppression effect and adsorption suppression effect on the walls of vials and the like used for formulation.
  • sugar alcohols and saccharides include sucrose, lactose, maltose, xylose, trehalose, mannitol, sorbitol, xylitol, maltitol, lactitol, oligosaccharide alcohol and the like. Mannitol and sucrose are preferable, and mannitol is particularly preferable.
  • MMP-7 When formulating MMP-7 at a low concentration (for example, 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml), loss due to adsorption of MMP-7 to the vial wall is assumed. It is particularly effective to contain sugar alcohols and sugars. In the case of MMP-7, 2% or more, preferably 2 to 7% of a sugar alcohol or saccharide that exhibits an effect of inhibiting adsorption to the vial wall, preferably 2 to 7%, which is an adjustable range of the body osmotic pressure, is added. In the present invention, a monomerization solution to which 2 to 5% mannitol or 2 to 7% sucrose capable of maintaining the activity of MMP-7 is preferably used is used. More preferably, a monomerization solution consisting of 5 to 25 mM Tris buffer (pH 6 to 8) containing 2 to 5% mannitol, 30 to 40 mM sodium chloride and 5 to 30 mM calcium chloride is used.
  • Tris buffer pH 6
  • MMP-7 dissolved in the monomerization solution can be used as it is as the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition of the present invention, suppressing the formation of aggregates of MMP-7, the activity of MMP-7 MMP-7-containing (medicine) composition is composed of 2% or more sugar alcohol and / or saccharide, and 30 from the viewpoint of maintaining, suppressing adsorption of MMP-7 to a container, etc., and ensuring the quality as a pharmaceutical aqueous solution composition. It preferably contains ⁇ 40 mM monovalent cation compound (sodium chloride or potassium chloride).
  • the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition of the present invention comprises 2-5% mannitol or 2-7% sucrose, 30-40 mM chloride. Preferably it contains sodium and 5-30 mM calcium chloride.
  • the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition of the present invention can be stored in a liquid state, lyophilized or frozen. At that time, in order to maintain the stability and isotonicity of the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition as a pharmaceutical product, in addition to humans and other animals such as stabilizers, isotonic agents and preservatives. Compounds which are acceptable to be administered can be added.
  • the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition of the present invention is a solid composition that can be dissolved in a solvent and the composition at the time of dissolution becomes the above-described liquid MMP-7-containing (pharmaceutical) composition of the present invention. Including.
  • This solid composition can be obtained by removing the solvent from the liquid MMP-7-containing (pharmaceutical) composition of the present invention by freeze-drying or the like.
  • a solvent is a solvent in the pharmaceutical additive dictionary, and examples thereof include water and ethanol.
  • the MMP-7-containing (pharmaceutical) composition of the present invention thus obtained has a specific enzyme activity of MMP-7 in which MMP-7 aggregate formation and adsorption are suppressed, and is used to treat disc herniation. It can be used as a medicine or diagnostic agent.
  • ⁇ Preparation example (1) Construction of APSP-containing proMMP-7 expression vector (pETMMP7) Primers P1 (SEQ ID NO: 1) and P2 (SEQ ID NO: 2) from a kidney cDNA library (HumanMTC Panel I, Catalog #: K1420-1, BD) ) was used to amplify the proMMP-7 gene by PCR. The amplified DNA was inserted into a cloning vector (pCRII-TOPO, Invitrogen), and the base sequence of the obtained DNA was determined. The base sequence was determined using a DNA sequencer.
  • a homology search of the nucleotide sequence and the nucleotide sequence of proMMP-7 registered in the database was performed to obtain a plasmid (pCRproMMP-7) in which the proMMP-7 gene was inserted.
  • primer P3 sequence
  • APSP PhoA-alkaline phosphatase signal peptide
  • SEQ ID NO: 4 primer P4
  • the obtained plasmid was cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI, and inserted into expression vector pET22b (Merck, product code: 69744-3) previously cleaved with the same restriction enzymes.
  • a plasmid (pETMMP7) into which the proMMP-7 gene was inserted was obtained.
  • the precipitate was solubilized with Sample IV Buffer for SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), subjected to 15% acrylamide gel SDS-PAGE, and CBB staining was performed. As a result, it was confirmed that the expression level of proMMP-7 was increased and the inhibitory effect on degradation was enhanced.
  • MMP-7 ProMMP-7-producing Escherichia coli obtained by the method described in the preparation example was used as an inoculum to grow and grow in a glucose medium, and isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG ) To induce proMMP-7 expression.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the cells were collected from the culture and crushed with a French press. The crushed liquid was centrifuged, and the inclusion bodies were collected in the sediment.
  • the inclusion bodies were then dissolved in 6 M guanidine hydrochloride containing 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) and 0.1 M dithiothreitol, and 50 mM HEPES containing 0.1 mM zinc acetate, 10 mM calcium chloride, 0.2 M sodium chloride and 1.0% Brij35.
  • a buffer pH 7.5
  • proMMP-7 was purified by ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography by a conventional method. The obtained proMMP-7 was heat-treated at 47 to 48 ° C. to self-activate to obtain MMP-7.
  • the obtained MMP-7 was repeatedly diluted and concentrated with an ultrafiltration membrane using 5 mM Tris buffer (pH 7) containing 40 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 and 3.5% mannitol, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • MMP-7 aggregates The influence of sodium chloride and potassium chloride on the formation of MMP-7 aggregates was analyzed by using dynamic light scattering method (equipment: Wyatt Technology DynaPro (Protein Solutions) Titan, cell; Wyatt Technology 12uL Cell 8.5mm Center Height, measurement temperature; 20 ° C).
  • the molecular weight of MMP-7 in each sample was measured and analyzed. Based on the molecular weight of MMP-7 monomer (about 19 kDa), the case where the molecular weight was 38 kDa or less was determined as a monomer.
  • the molecular weight of MMP-7 was 20 to 29 kDa, which was found to exist as a monomer.
  • Sample 3 was prepared by diluting the MMP-7 solution obtained in Example 1- (1) with a solution of calcium chloride and sodium chloride in water. Sample 3: 1 mg / ml MMP-7 / each concentration CaCl 2 (0-30 mM) / each concentration NaCl (0-160 mM)
  • MMP-7 aggregates are formed in the presence of NaCl at 130 mM or higher, but the formation of MMP-7 aggregates is suppressed by coexisting with 30 mM or lower ( ⁇ 30 mM) of CaCl 2. Became clear. That is, the calcium chloride of the said density
  • Example 1- (1) The MMP-7 solution obtained in Example 1- (1) was diluted with a solution containing 10 mM CaCl 2 and each concentration of sodium chloride to prepare Sample 4 containing each concentration of MMP-7.
  • Sample 4 Each concentration MMP-7 (10, 15, 20 mg / ml) / 10 mM CaCl 2 / each concentration NaCl (50-250 mM)
  • Size exclusion chromatography method HPLC equipment; HEWLETT PACKED 1100 series, carrier: TOYOPARL HW50S, treatment temperature: 25 ° C, flow rate 0.5 mL / min, detection of the effect of MMP-7 concentration on MMP-7 aggregate formation inhibitory effect (Wavelength 280 nm).
  • the column size was 5 mm in diameter and 150 mm in length, and the column was equilibrated with a solution containing 5 mM Tis-HCl (pH 7), 10 mM CaCl 2 , 40 to 500 mM NaCl in 3.5% mannitol.
  • the concentration of sodium chloride at which MMP-7 forms an aggregate was calculated using the peak (or reading peak) near 2 minutes after the start of chromatography as the aggregate of MMP-7, and using the area of the peak as an index. .
  • the sample 4 was left overnight at 4 ° C., and then the same experiment as described above was performed. The same result as in FIG. 3 was obtained.
  • Example 1- (1) The MMP-7 solution obtained in Example 1- (1) was diluted with 5 mM Tris buffer (pH 7) containing 40 mM NaCl and 10 mM CaCl 2 to prepare Sample 5 containing MMP-7 at each concentration. .
  • Sample 5 Each concentration of MMP-7 (0.1, 2, 20 mg / ml) / 10 mM CaCl 2/40 mM NaCl / 5 mM Tris buffer (pH 7)
  • Each concentration of MMP-7 solution is diluted to 0.1 mg / ml with 50 mM Tris buffer (pH 7) containing 150 mM NaCl and 10 mM CaCl 2 or 10 mM Tris buffer (pH 7) containing 40 mM NaCl and 10 mM CaCl 2. (Primary dilution), each solution was further diluted to 5 ng / ml with 50 mM Tris buffer (pH 7) containing 150 mM NaCl and 10 mM CaCl 2 (secondary dilution).
  • ANASPEC cleavage activity against a fluorescent substrate (Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH 2 ; SEQ ID NO: 7) was measured according to the attached protocol.
  • the enzyme activity decreased in 2 mg / ml or more of MMP-7 diluted with Tris buffer (pH 7) containing 150 mM NaCl in the primary dilution (FIG. 4).
  • This decrease in enzyme activity is consistent with the formation of MMP-7 aggregates.
  • a decrease in enzyme activity is not observed at a concentration of 0.1 mg / ml or less, it is suggested that at the concentration of MMP-7, formation of an aggregate by at least 150 mM NaCl is not caused.
  • Example 1- (1) ⁇ Effect of sodium chloride concentration in MMP-7 concentration process with ultrafiltration membrane ⁇
  • the MMP-7 solution obtained in Example 1- (1) was diluted with 5 mM Tris buffer (pH 7) containing 10 mM CaCl 2 to prepare Sample 6 containing each concentration of sodium chloride.
  • Sample 6 4 mg / ml MMP-7 / 10 mM CaCl 2 / each concentration NaCl (40 mM, 80 mM, 200 mM, 500 mM) / 5 mM Tris buffer (pH 7)
  • MMP-7 could be concentrated in a shorter time when sodium chloride with a low concentration was used, and it took a long time to concentrate at a high salt concentration (Table 1).
  • the symbol (-) in Table 1 indicates the end of concentration.
  • Example 2 Inhibition of adsorption of MMP-7 to the vessel wall
  • the MMP-7 solution obtained in Example 1- (1) was diluted with 5 mM Tris buffer (pH 7) containing 10 mM CaCl 2 , 40 mM NaCl, mannitol and sucrose. Dilute to prepare a solution of sample 8-10 (1 ml) in a vial. These concentrations were adjusted so that the osmotic pressure of each sample was the same.
  • a control (sample 10) diluted with the same Tris buffer without mannitol and sucrose was used as a control.
  • Sample 8 50 ⁇ g / ml MMP-7 / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 5mM Tris buffer (pH7) /3.5% mannitol
  • Sample 9 50 ⁇ g / ml MMP-7 / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 5mM Tris buffer ( pH7) /6.6% sucrose sample
  • each solution in the vial was diluted in two steps. 5 mM Tris buffer (pH 7) containing 10 mM CaCl 2 and 40 mM NaCl for primary dilution, 1% Block Ace (Block Ace powder: DS Pharma Biomedical) / TBS-T (0.05% Tween 20/50 mM Tris) for secondary dilution / 150 mM NaCl) was used. MMP-7 in the solution was quantified by ELISA.
  • rabbit anti-MMP-7 antibody obtained by immunizing rabbits with MMP-7, and this rabbit anti-MMP-7 antibody labeled with a biotin labeling reagent (Biotin (Long Arm) NHS-Water Soluble: Vector)
  • biotin labeling reagent Biotin (Long Arm) NHS-Water Soluble: Vector
  • HRP substrate solution horseradish peroxidase (HRP) -labeled streptavidin (Horseradish Peroxidase Streptavidin, Concentrate; Vector), and HRP substrate solution (Peroxidase Substrate Solution B: KPL) were used.
  • HRP substrate solution Peroxidase Substrate Solution B: KPL
  • Example 1- (1) The MMP-7 solution obtained in Example 1- (1) was diluted with 10 mM CaCl 2 , 40 mM NaCl, and 5 mM Tris buffer (pH 7) containing mannitol or sucrose, and a solution of samples 12 to 16 ( 1 ml) was prepared. A sample diluted with the same Tris buffer containing no mannitol and sucrose (sample 11) was used as a control for each sample.
  • Sample 11 50 ⁇ g / ml MMP-7 / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 5mM Tris buffer (pH 7)
  • Sample 12 50 ⁇ g / ml MMP-7 / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 5mM Tris buffer (pH 7) / 1% mannitol
  • Sample 13 50 ⁇ g / ml MMP-7 / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 5mM Tris buffer (pH 7) / 2% mannitol
  • Sample 14 50 ⁇ g / ml MMP-7 / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 5mM Tris buffer (pH 7) / 2% sucrose samples 15: 50 ⁇ g / ml MMP-7 / 10mM CaCl 2 / 40mM NaCl / 5mM Tris buffer (pH 7) / 5% mannito
  • each solution in the vial was diluted in two steps. Dilute to 5 ng / ml with 50 mM Tris buffer (pH 7) containing 0.01% Briji35, 0.01% BSA, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 in the primary dilution, and cleave activity against fluorescent substrate (MMP- 7 enzyme activity).
  • the fluorescent substrate (MOCAc-Pro-Leu-Gly -Leu-A 2 pr (Dnp) -Ala-Arg-NH 2 obtained from Peptide Institute; (7-Methoxycoumarin-4- yl) acetyl-L- prolyl-L-leucylglycyl-L- leucyl- [N ⁇ - (2,4-dinitrophenyl) -L-2,3-diaminopropionyl] -L-alanyl-L-arginine amide; SEQ ID NO: 9) was used.
  • Block Ace Block Ace powder: DS Pharma Biomedical
  • TBS-T 0.05% Tween20 / 50 mM Tris / 150 mM NaCl
  • Example 1 ⁇ Effect of mannitol on the inhibition of MMP-7 aggregate formation ⁇
  • the MMP-7 solution obtained in Example 1- (1) was buffer-exchanged with 5 mM Tris buffer (pH 7) containing NaCl, 5 mM CaCl 2 , and 3.5% mannitol at various concentrations using a spin filter.
  • Samples 17 to 22 were prepared by diluting with the same Tris buffer. The same treatment with the same Tris buffer containing no mannitol (sample 17) was used as a control for each sample.
  • Sample 17 10 mM NaCl / 1 mg / ml MMP-7 / 5 mM CaCl 2
  • Sample 18 10 mM NaCl / 1 mg / ml MMP-7 / 5 mM CaCl 2 /3.5% mannitol
  • Sample 19 40 mM NaCl / 1 mg / ml MMP-7 / 5 mM CaCl 2 /3.5% mannitol
  • Sample 20 80 mM NaCl / 1 mg / ml MMP -7 / 5mM CaCl 2 /3.5% mannitol sample 21: 120mM NaCl / 1mg / ml MMP-7 / 5mM CaCl 2 /3.5% mannitol sample 22: 180mM NaCl / 1mg / ml MMP-7 / 5mM CaCl 2 /3.5% mannitol
  • MMP-7 was measured for the molecular weight of MMP-7 by the dynamic light scattering method described in Example 1- (2). As a result, MMP-7 was shown to form an aggregate with 40 mM or more of sodium chloride (FIG. 9).
  • the monomerization method of the MMP-7 aggregate of the present invention can be used for the production and formulation of MMP-7.

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Abstract

　MMP-7の会合体を単量体化する方法を提供する。MMP-7の会合体を、低濃度の１価陽イオン塩化物（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）を含む緩衝液、または１価陽イオン塩化物を含有しない同緩衝液で処理することからなるMMP-7の単量体化方法、該単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法、及び前記緩衝液に溶解したMMP-7含有（医薬）組成物。低濃度のMMP-7含有（医薬）組成物を調製する場合は、糖アルコールや糖類を添加した上記緩衝液が用いられる。

Description

マトリックスメタロプロテアーゼ７（ＭＭＰ－７）会合体の単量体化方法
　本願発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ７（以下、「MMP-7」と称することもある）の会合体を単量体化する方法に関する。詳細には、MMP-7の会合体を低濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液または当該化合物を含有しない同溶液中で処理することからなる、MMP-7会合体の単量体化方法、該単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法、及び前記溶液にさらに糖アルコール又は糖類を溶解したMMP-7含有（医薬）組成物に関する。
　MMP-7は、活性部位に亜鉛分子をもつ亜鉛型メタロプロテアーゼファミリーに属するマトリックスメタロプロテアーゼ（以下、「MMP」と称することもある）の一つである（例えば、非特許文献１参照）。MMPは前駆体として産生され、細胞外分泌時にシグナル配列がプロセスされ、次いでプロ配列がプロセスされて活性型になる。細胞外に分泌されたMMPは細胞外マトリックスの代謝を司るのに対して、MMP-7は主に癌細胞より分泌され、浸潤、転移に関与することが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。MMP-7は他の多くのMMPが持っているヒンジ、ヘモペキシン様ドメインを持っておらず、MMPの中では最小の分子単位からなり、コラーゲンや細胞外マトリックスを構成しているコンポーネント（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、アグリカン）を基質とする。
　MMP-7は、軟骨組織の主成分であるアグリカンを基質とすること、椎間板ヘルニアの手術検体由来のマクロファージがMMP-7を発現していること（例えば、非特許文献３参照）等からヘルニア塊の自然退縮に関わっていることが推測される。その後、波呂らは、MMP-7をヘルニアイヌの椎間板に投与して椎間板内髄核の容積の減少を観察し、椎間板ヘルニアの治療薬としての可能性を示した（例えば、非特許文献４参照）。MMP-7の医薬品としての開発が望まれるところであるが、MMP-7は生体中に微量にしか存在せず、生体からMMP-7を分離精製することは極めて困難であり、生体成分を用いた場合、潜在的なウイルス汚染など安全面における問題が懸念される。MMP-7は癌細胞からも取得できるが、癌細胞を製造株とするのは好ましいことではない（例えば、非特許文献５参照）。
　このような問題を解決する方法として遺伝子組み換え技術によりMMP-7を取得する試みが行われている。CHO細胞でMMP-7を発現させたBarnettらの報告（例えば、非特許文献６参照）、アルカリフォスファターゼのシグナル配列の塩基配列と大腸菌のコドン使用頻度に最適化されたプロマトリックスメタロプロテアーゼ７（以下、「proMMP-7」と称することもある）の遺伝子配列とを連結させた核酸断片を用いることにより、３４℃では可溶性のproMMP-7、４２℃では不溶性のproMMP-7として発現させた報告（例えば、特許文献１参照）及び改変型シグナルペプチドとproMMP-7の遺伝子配列とを連結させた核酸断片を用いることにより、封入体として大量に発現させた報告（例えば、特許文献２参照）等がある。
　proMMP-7から活性型MMP-7への変換は、1mM (4-aminophenyl)mercuric acetate（APMA）又は0.2μMトリプシン存在下、37℃で保温する方法やproMMP-7含有溶液を５３℃で保温する方法（例えば、非特許文献７参照）が報告されており、彼らは、活性化した低濃度（1mg/ml以下）のMMP-7（別名Matrilysin）は、－20℃で6か月間保存した場合及び室温で28日間保存した場合、その活性及び電気泳動における変化がなかったことを明らかにした。この変化に関する明確な記載はないが、電気泳動の結果からMatrilysinの分解が見られなかったことを示唆したものと考えられる。その他にも、proMMP-7やMMP-7の精製に関しては、Kihira、Onedaらの方法（例えば、特許文献１、非特許文献８参照）をはじめとして種々の報告があり、実験レベルにおいて一定のMMP-7の精製方法は確立されている。一般には、実験レベルでのMMP-7の精製方法をスケールアップして大量生産が行われる。しかしながら、MMP-7を大量に製造する方法は、決して確立されているとは言い難く、MMP-7の大量製造における問題点や解決策に関する報告は殆ど見られない。
　また、MMP-7を含有する組成物については、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス塩酸塩）、塩化カルシウム及び塩化ナトリウムを含むものが報告されており（例えば、特許文献３～５、非特許文献７，９参照）、MMP-7のようなメタロプロテアーゼは、溶液組成物の場合、塩化カルシウム及び塩化ナトリウムの共存により安定化することが知られている（例えば、特許文献６参照）。特に医薬品は主に安全性の観点で通常体液の浸透圧付近とされ、塩化ナトリウムは溶液組成物の浸透圧調整剤として一般的であるところ、実際これらの文献に開示されている組成物は、塩化ナトリウムをはじめとする１価陽イオン化合物を体液と等張かそれ以上の濃度で含んでいるものが殆どである。また、これらの文献に開示されている組成物は、糖アルコール又は糖類を含んでいない。
特許第2938352号公報 WO 2010／047347A1号公報 特開2000-344672号公報 特開2000-226329号公報 特開2002-173424号公報 特開2005-6509号公報
Soler et al., Biochem Biophys Res Commun, 1994, vol.201, p.917-923 Ii et al., Exp Biol Med (Maywood), 2006, vol.231, p.20-27 Haro et al., J Spinal Disord, 1999, vol.13, p.245-249 Haro et al., J Orthop Res, 2005, vol.23, p.412-419 Miyazaki et al., Cancer Research, 1990, vol.50, p.7758-7764 Barnett et al., Protein Exp Purif, 1994, vol.5, p.27-36 Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507 Oneda et al., J Biochem, 1999, vol.126, 905-911 Browner et al., Biochemistry, 1995, vol.34, 6602-6610
　本願発明者らは、MMP-7を含有する医薬品の開発検討の過程で、MMP-7は、従来の医薬品製剤、特には前述のメタロプロテアーゼの溶液組成物のように、塩化ナトリウム等の１価陽イオン化合物が体液と等張の150mM程度以上の場合会合体を形成すること、及び、蛋白やその製剤の製造時に通常用いられる装置中のゲル又は製剤の保存時に通常用いられるバイアル瓶等の容器にMMP-7が吸着することに気づき、MMP-7製造時における、MMP-7の製造装置への吸着が抑制されたMMP-7会合体の単量体化方法、該単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法、及びMMP-7の会合体形成及び吸着が抑制されたMMP-7含有（医薬）組成物を提供することが課題となった。
　本願発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、下記（１）～（４）を見出し、本願発明を完成するに至った。
（１）MMP-7会合体は、低濃度の１価陽イオン塩化物（塩化ナトリウム及び塩化カリウム等）を含むトリス緩衝液（pH6～8）等の溶液で処理することにより、解離して単量体を形成する。１価陽イオン塩化物を含有しない同溶液で処理した場合においても同様に単量体を形成する。
（２）上記の処理によるMMP-7会合体の単量体化方法（以下、単に「単量体化方法」と称することもある）をMMP-7の製造工程に組み入れることにより、MMP-7の製造効率を上げることができる。特に、単量体化方法を、自己活性化によりproMMP-7をMMP-7に変換した直後の限外ろ過膜処理工程に組み入れることにより、より大きな効果が得られる。
（３）MMP-7単量体は高い酵素活性を維持する。
（４）上記のトリス緩衝液にマンニトール、スクロース等の糖類又は糖アルコールを含有させることにより、MMP-7の会合体形成抑制だけでなく、MMP-7のゲル及びバイアル器壁への吸着が抑制される。すなわち、水溶液とした場合に体液と等張となる150mM程度より低い濃度の１価陽イオン塩化物と、糖アルコール又は糖類とを含有する組成物とすることにより、MMP-7の会合体形成及び吸着が抑制された医薬製剤となる。
　したがって、本願発明は、MMP-7会合体を単量体化する方法（単量体化方法）、単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法及び上記の緩衝液を用いて調製されるMMP-7含有（医薬）組成物を包含するものであり、以下の通りである。
[１]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液でマトリックスメタロプロテアーゼ－７（MMP-7）の会合体を処理することを含む、MMP-7会合体の単量体化方法。
[２]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液でMMP-7の会合体を処理する、[１]に記載の単量体化方法。
[３]１価陽イオン化合物を含有しない溶液でMMP-7の会合体を処理する、[１]に記載の単量体化方法。
[４]前記１価陽イオン化合物の濃度が、100mM以下である、[１]又は[２]に記載の単量体化方法。
[５]前記１価陽イオン化合物の濃度が、80mM以下である、[１]、[２]又は[４]に記載の単量体化方法。
[６]前記１価陽イオン化合物の濃度が、40mM以下である、[１]、[２]、[４]又は[５]に記載の単量体化方法。
[７]前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、[１]、[２]、[４]、[５]又は[６]に記載の単量体化方法。
[８]前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、[１]、[２]、[４]、[５]又は[６]に記載の単量体化方法。
[９]前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、[８]に記載の単量体化方法。
[１０]前記溶液が、更に塩化カルシウムを含有する、[１]から[９]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１１]前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、[１０]に記載の単量体化方法。
[１２]前記溶液が、緩衝液である、[１]から[１１]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１３]前記緩衝液が、5～25mMのトリス緩衝液である、[１２]に記載の単量体化方法。
[１４]前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、[１]から[１３]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１５]前記溶液が、30～40mM塩化ナトリウム及び5～30mM塩化カルシウムを含有する5～25ｍMトリス緩衝液（pH6～8）である、[１３]又は[１４]に記載の単量体化方法。
[１６]前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、[１]から[１５]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１７]前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、[１６]に記載の単量体化方法。
[１８]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、[１６]又は[１７]に記載の単量体化方法。
[１９]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2～7％である、[１８]に記載の単量体化方法。
[２０]前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、[１７]から[１９]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[２１]前記マンニトールが2～5％、前記スクロースが2～7%である、[２０]に記載の単量体化方法。
[２２][１]から[２１]の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程を含む、MMP-7の製造方法。
[２３]前記工程が、130mM以上の１価陽イオン化合物含有液を用いた処理工程後に行われる、[２２]に記載の製造方法。
[２４]下記（１）～（５）の工程を包含する、[２２]又は[２３]に記載の製造方法。
（１）proMMP-7封入体産生細胞を破砕する工程、
（２）proMMP-7封入体を溶解／リフォールディング処理する工程、
（３）proMMP-7を精製する工程、
（４）proMMP-7を自己活性化してMMP-7とする工程、及び
（５）[１]から[２１]の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程
[２５]前記（５）の工程が、限外ろ過膜を用いた濃縮工程である、[２４]に記載の製造方法。
[２６]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にマトリックスメタロプロテアーゼ－７（MMP-7）を有効成分として含有する、MMP-7含有（医薬）組成物。
[２７]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、[２６]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[２８]１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、[２６]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[２９]前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、[２６]又は[２７]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３０]前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、[２６]又は[２７]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３１]前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、[３０]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３２]更に、塩化カルシウムを含有する、[２６]から[３１]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３３]前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、[３２]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３４]前記溶液が、緩衝液である、[２６]から[３３]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３５]前記緩衝液が、5～25mMのトリス緩衝液である、[３４]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３６]前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、[２６]から[３５]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３７]前記MMP-7の濃度が1μg/ml～1mg/mlである、[３６]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３８]前記溶液が、30～40mM塩化ナトリウム及び5～30mM塩化カルシウムを含有する5～25mMトリス緩衝液（pH6～8）である、[３５]、[３６]又は[３７]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３９]前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、[２６]から[３８]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４０]前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、[３９]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４１]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、[３９]又は[４０]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４２]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2～7％である、[４１]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４３]前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、[４０]から[４２]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４４]前記マンニトールが2～5％、前記スクロースが2～7%である、[４３]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４５]溶剤に溶解し得て、その溶解時の組成物が[２６]から[４４]の何れか一項に記載の組成物である、MMP-7含有（医薬）固体組成物。
[４６][２６]から[４５]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物を含有する、椎間板ヘルニアの治療剤。
　本願発明に従えば、MMP-7の会合体を容易に単量体化する方法が提供されるので、当該方法をMMP-7の製造工程に組み入れることにより、MMP-7の生産性や回収効率を上げることができる。
　また、当該方法により単量体化されたMMP-7は、MMP-7の会合体が存在する場合に比べてMMP-7の酵素としての比活性が高く、高品質のMMP-7製剤を得るための好適な材料となり得る。
　更に、本願発明の態様の一つである、低濃度の塩化ナトリウム、及び糖アルコール又は糖類を含む緩衝液中でMMP-7を保存することにより、MMP-7は単量体としての形状を維持するだけでなく、高い酵素活性を維持し、またMMP-7の保存容器への吸着を抑制することができる。したがって、本願発明の単量体化方法に使用される緩衝液は、MMP-7製剤の保存液として有用である。そして、本願発明の、水溶液とした場合に低濃度の塩化ナトリウム、及び糖アルコール又は糖類を含むMMP-7組成物は、MMP-7の会合体形成が抑制され、さらにMMP-7の容器等への吸着が抑制された、医薬用途の溶液組成物及びその調製用組成物として有用である。
図1は、動的光散乱法により測定したMMP-7の分子量の解析結果に基づく、塩化ナトリウム（NaCl）及び塩化カリウム（KCl）によるMMP-7会合体の形成抑制効果を示す。 図2は、動的光散乱法により測定したMMP-7の分子量の解析結果に基づく、MMP-7会合体の形成抑制における塩化カルシウム（CaCl2）の影響を示す。 図3は、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定したMMP-7の分子量の解析結果に基づく、MMP-7の会合体形成におけるMMP-7濃度の影響を示す。 図4は、0.1mg/ml、2mg/ml、20mg/mlの各MMP-7を、150mM塩化ナトリウム（NaCl）または40mM NaClを含有するトリス緩衝液で希釈したときに、当該濃度の塩化ナトリウムがMMP-7の酵素活性に及ぼす影響を示す。 図5は、マンニトールによるMMP-7のゲルへの吸着抑制効果を示す。A：5mMトリス緩衝液(pH7)/10mM CaCl2/40mM NaCl、B：5mMトリス緩衝液(pH7)/10mM CaCl2/40mM NaCl/3.5%マンニトール。 図6は、マンニトール及びスクロースによるMMP-7のバイアル器壁への吸着抑制効果を示す。 図7は、マンニトール及びスクロースの各濃度におけるMMP-7のバイアル器壁への吸着抑制効果を示す。 図8は、マンニトール及びスクロースの各濃度におけるMMP-7の酵素活性に及ぼす影響を示す。 図9は、MMP-7会合体の形成抑制におけるマンニトールの影響を示す。
　本願発明は、MMP-7会合体の単量体化方法、該単量体化方法を組み入れたMMP-7の製造方法及びMMP-7含有（医薬）組成物を提供するものであり、MMP-7会合体を低濃度の１価陽イオン化合物、さらには糖アルコール又は糖類を含有する溶液（以下、「単量体化用溶液」と称することもある）で処理すること、同溶液にMMP-7を保存すること及び水溶液とした場合に低濃度の１価陽イオン化合物と糖アルコール又は糖類を含有するMMP-7組成物とすることに特徴がある。
　MMP-7会合体の検出は、動的光散乱法、サイズ排除クロマトグラフィー法、超遠心分析法等の方法を用いて、MMP-7の分子量を測定し、アミノ酸配列から求められるMMP-7単量体の分子量（約19kDa）と比較することにより行われる。本願発明においては、動的光散乱法で測定した試料中の分子量が19kDa～38kDaの間の数値を示した場合にMMP-7は単量体として存在すると判定し、38kDa以上の数値を示した場合にMMP-7は会合体を形成していると判定した。上記の判定基準は、動的光散乱法による測定値の真度を考慮したもので、二量体以上の値を示した場合は明らかな会合体を形成しているとし、それよりも小さな値の場合は単量体とした。
　MMP-7の単量体化は、MMP-7会合体を単量体化用溶液で処理することにより行われる。本願発明において、「MMP-7会合体を単量体化用溶液で処理する」とは、MMP-7会合体を単量体化用溶液にさらすことを意味し、その溶液で溶解することを含む。そして、MMP-7会合体が130mMを超える高濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液に溶解されている場合、単量体化用溶液を用いて限外ろ過膜や透析膜等によるバッファー交換を行うことを含む。該単量体化用溶液のpHを一定に保つための緩衝剤として、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液及び炭酸緩衝液等の使用が可能である。これらの中から単量体化処理を行う際のpHに合わせて適宜選択すれば良い。該緩衝液の濃度は、5～25mM、好ましくは、5～20mMの範囲である。pHは、5～9、好ましくは、6～8の範囲である。より好ましくは、メタロプロテアーゼの安定性の向上に効果を発揮するトリス緩衝液が選択され、該トリス緩衝液の濃度は5～10mM、pHは6～8の範囲である（特表2011-521906参照）。
　本願発明において「１価陽イオン化合物」とは、１価の陽イオンと対となる陰イオンとからなる化合物を意味し、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウム等を挙げることができる。また、「１価陽イオン塩化物」とは、１価の陽イオンと塩化物イオンからなる化合物を意味し、１価陽イオン塩化物の場合、例えば、本願発明に使用する１価陽イオン化合物は何れのものを使用しても良いが、１価陽イオン塩化物を使用するのが好ましい。具体的には、塩化ナトリウム及び塩化カリウムであり、最も好ましいのは塩化ナトリウムである。
　MMP-7会合体を単量体に解離するために低濃度の１価陽イオン化合物が使用される。単量体に解離したMMP-7は、低濃度の１価陽イオン化合物を含有する単量体化用溶液において単量体として維持される。同じ効果が、１価陽イオン化合物を含有しない単量体化用溶液及び水等の液を用いた場合にも得られる。したがって、１価陽イオン化合物を含有しない単量体化用溶液（本願発明では、該単量体化用溶液に水等の液が含まれるものとする）を用いたMMP-7会合体の単量体化方法も本願発明に包含される。以下、低濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液及び１価陽イオン化合物を含有しない同溶液を、単に「単量体化用溶液」と称することもある。
　単量体化用溶液に、多価陽イオン化合物を添加することにより、１価陽イオン化合物の処理濃度の範囲を広げることができる。好ましくは、2価陽イオン化合物であり、より好ましくは、2価カルシウムイオン化合物であり、最も好ましくは、塩化カルシウムである。なお、「多価陽イオン化合物」は、上記の１価の陽イオン化合物と同様に多価の陽イオンと対となる陰イオンとからなる化合物を意味する。
　具体的には、単量体化用溶液として水を用いた場合は、40mM以下の１価陽イオン化合物が使用され、単量体化用溶液に塩化カルシウムを添加することにより、40mM以上の１価陽イオン化合物を含有させた単量体化用溶液での処理を可能にする。より具体的には、5mM～10mM塩化カルシウムを含有する場合は80mM以下の１価陽イオン化合物、10mM～30mM塩化カルシウムを含有する場合は100mM以下の１価陽イオン化合物、及び30mM塩化カルシウムを含有する場合は130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する単量体化用溶液の使用が可能となる。この結果は、塩化カルシウムの添加により、MMP-7会合体を単量体に解離する効果及びMMP-7単量体の会合体形成を抑制する効果が増強されたことを示す。また、実施例２の結果（図2）から、本効果は塩化カルシウムの濃度に比例することを読み取ることができる。すなわち、高濃度の塩化カルシウムを使用することにより、MMP-7の単量体化及びMMP-7単量体の維持のより大きな効果を期待することができる。以上より、１価陽イオン化合物の濃度としては、水溶液にした場合130mM以下、好ましくは100mM以下、さらに好ましくは80mM以下、最も好ましくは40mM以下である。なお、１価陽イオン化合物は含有しなくても良いが、含有する方が医薬組成物としての品質の観点で好ましい。
　本願発明においては、30～40mM塩化ナトリウム及び5～30mM塩化カルシウムを含む、5～25mMトリス緩衝液（pH6～8）からなる単量体化用溶液、または塩化ナトリウムを除いた同単量体化用溶液を使用するのが好ましい。
　本願発明のMMP-7会合体の単量体化方法は、効率よく、高品質のMMP-7単量体を製造するために、MMP-7の製造工程に組み込むことができる。遺伝子組み換え技術により得られるMMP-7の一般的な製造方法は、菌体の培養、封入体の放出、封入体の溶解とリフォールディング、proMMP-7の精製、自己活性化によるproMMP-7のMMP-7への変換、MMP-7の精製・濃縮等の工程により行われる。
　より具体的には、以下のMMP-7の製造工程で使用される。まず、proMMP-7産生大腸菌が作製される。一般には、常法に従って発現ベクターに挿入されたproMMP-7遺伝子を大腸菌に導入することにより作製することができる。しかしながら、proMMP-7は、大腸菌に対して強い毒性を有するために生産効率が極端に低下することがある。これを解消するためにproMMP-7のＮ末側にシグナルペプチドを付加するなどの工夫が行われるが、proMMP-7の場合、単にシグナルペプチドを付加しただけでは、proMMP-7の発現量は上昇せず、また発現したproMMP-7の一部がプロテアーゼにより分解されるという現象が認められる。このような現象は、効率的なMMP-7の製造方法の確立の妨げになる。したがって、proMMP-7の発現量の増大やプロテアーゼによるproMMP-7の分解抑制効果が増強されたproMMP-7産生大腸菌をMMP-7製造の原料に用いるのが好ましい。かかるproMMP-7産生大腸菌は、WO2010/047347に記載の方法に従って調製することができる（より具体的には、調製例を参照）。
　こうして得られたproMMP-7産生大腸菌は、クローニングを繰り返して純化した後にワーキングセルバンクとして保存され、MMP-7製剤化のための大量培養の種菌として用いられる。ワーキングセルバンクの保存液としては、通常、組み換え大腸菌の保存に用いられる条件、例えば、7～10％ジメチルスルフォキシドや10～50%グリセロールを含む溶液中で、－80～－20℃の冷凍庫や液体窒素中、あるいはアンプル内に凍結乾燥して2～10℃の冷蔵庫で保存される。
　proMMP-7産生大腸菌の製造スケールでの培養は、小スケールでの前培養と大スケールでの本培養の2段階で行われる。前培養には、proMMP-7産生大腸菌の増殖には組換え大腸菌の一般的なLB培地（プラスミド保持のためにアンピシリン等抗生物質を添加する場合がある）を使用しても良いが、本培養においては、副作用の原因となる物質をできる限り排除した培地を用いるのが好ましい。このような培地として、例えば、種々の微量金属（マグネシウム、カルシウム、銅、ナトリウム等）を含むグルコース培地、LB培地、M9培地等が挙げられる。培養条件としては、大腸菌の増殖に適した範囲が用いられるが、例えば、pH（pH6～8）、温度（30～45℃）、時間（4～16時間）の培養条件が可能である。これらの培養条件は、培養スケールや発現誘導の処理等により適切に調節される。効率的にproMMP-7の発現を行うために発現誘導剤が使用されるが、該発現誘導剤としてイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（IPTG）、ラクトース等が挙げられる。
　本培養により大量に培養・増殖したproMMP-7産生大腸菌からMMP-7を回収するには以下の方法がとられる。まず、proMMP-7産生大腸菌を培養し、増殖させた菌体を適切な方法で破砕し、proMMP-7からなる封入体を菌体外に放出させる。菌体の破砕には、化学物質（例えば、キレート剤としてEDTA）、界面活性剤（例えば、Triton X100）、酵素（例えば、リゾチーム）などで溶解させる方法またはフレンチプレスや超音波処理などの物理的処理による方法が取られるが、いずれの方法でも良い。これらの方法をいくつか組合せることにより、より効果的に菌体を破砕することができる。封入体含有破砕液の限外ろ過膜分画や遠心分離により、濃縮と洗浄を繰り返すことにより大部分の菌体成分が除去される。洗浄には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液など一般的な緩衝液が使用される。また、限外ろ過膜の孔径や遠心分離の条件は多数報告されているので、これらの条件を参考にすれば良い。大量に処理する場合は、限外ろ過膜分画により封入体を回収するのが好ましい。
　回収した封入体は、一旦、還元剤及び変性剤を含有する溶液で溶解される。斯かる還元剤として、システイン、グルタチオン、ジチオスレイトール及び２－メルカプトエタノールなどを使用することができる。これらは幾つかを組合せて使用しても良い。還元剤の濃度は、溶解する封入体の量に依存するが、10～200mMの範囲で使用される。変性剤としては、尿素、グアニジン塩酸塩などを用いることができる。斯かる尿素及びグアニジン塩酸塩は、それぞれ4～8M及び2～6Mの濃度範囲で使用される。また、緩衝液としては、封入体の回収で使用するものと同様の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液（pH7.0～9）が使用される。溶解時の温度は、40℃以下であれば特に制限する必要はない。溶解時間は、封入体の溶解状況を見ながら設定すれば良く、通常、30分～1時間攪拌される。
　次に、封入体の溶解液に、界面活性剤、金属イオンを含むリフォールディングバッファーを加えることにより、proMMP-7のリフォールディング、すなわち正常な立体構造の構築が行われる。この時使用する界面活性剤としてブリッジ35、金属イオンとして酢酸亜鉛、塩化コバルトなどが、それぞれ0.5～2％及び0.05mM～0.2mMの濃度範囲で使用される。リフォールディングするときの緩衝液の種類及び濃度は、封入体を溶解するときと同じものを使用すればよい。リフォールディング処理は、１日以上静置することにより行われる。
　リフォールディング溶液からproMMP-7を精製する際には、一般に、蛋白質化学において使用される精製方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などの方法を組み合わせた方法が使用される。本願発明のproMMP-7は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及び限外ろ過膜処理からなる工程を用いることにより精製することができる。両クロマトグラフィーは、常法に従って行えば良い。得られた蛋白質やポリペプチドの量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、Protein Assay  Kit (BIO-RAD, Inc)などの蛋白測定試薬を用いて測定される。
　次いで、proMMP-7のMMP-7への変換が行われる。変換方法としては、proMMP-7含有溶液を1mM (4-aminophenyl)mercuric acetate(APMA)又は0.2μMトリプシン存在下、３７℃で保温する方法やproMMP-7含有溶液を53℃で保温する方法（Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507）が挙げられるが、いずれの方法を用いても良い。この時、30～200mMの塩化ナトリウムを添加することがある（Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507、WO 2010/047347 A1）。保温時間は1～5時間の範囲で行われるが、試薬及びproMMP-7の濃度や処理量等により適宜調節される。トリプシンはN-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone（TPCK）処理したものが使用される。
　MMP-7の酵素活性を測定する方法としては、蛍光基質(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2；配列番号7)のMMP-7による切断を蛍光測定装置により測定する方法がある(Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507)。実際には、斯かる原理に基づくMMP-7活性測定Kit（ANASPEC社）が市販されているので、これを用い、添付のプロトコールに従って、活性の測定が行われる。こうして変換されたMMP-7をproMMP-7から分離精製するときは、前述の蛋白精製方法が使用される。
　変換されたMMP-7は、高塩濃度の溶液中で会合体を形成し、MMP-７の溶液中の濃度が、1mg/ml以上になるとその傾向が強い。MMP-7の会合体の存在は、MMP-7の製造・製剤化において生産性や品質の低下に繋がる。前述したように、塩化カルシウムの共存下、130mM以下の１価陽イオン化合物を含む単量体化用溶液中では、MMP-7会合体は、単量体化し、MMP-7単量体として維持されるが、130mMを超える濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液中では、MMP-7会合体を形成する可能性が高いことが示唆される。よって、130mM以上の１価陽イオン化合物による処理工程後に本願発明の単量体化方法が組み込まれる。より具体的には、自己活性化によるproMMP-7のMMP-7への変換直後に組み込むのが好ましい。
　本願発明の単量体化方法による処理は、20mg/ml以下のMMP-7に対して行うのが好ましいが、20mg/ml以上のMMP-7を処理する場合は、前述したように、塩化カルシウムの濃度を調節することにより、同様のMMP-7の会合体形成抑制効果を期待することができる。
　こうして得られたMMP-7の単量体を含む溶液は、必要に応じて、限外ろ過膜等によるMMP-7の精製と濃縮工程を経て製剤化の原料とされる。かかる工程においても本願発明の単量体化用溶液が使用される。一旦、単量体化したMMP-7は、単量体化用溶液中に保存する限り、単量体として維持され、且つ、長期にわたり酵素活性の低下も認められない。したがって、本願発明の単量体化用溶液は、製剤化前のMMP-7の保存、及びMMP-7を有効成分として含有する（医薬）組成物の製造に使用することにより、高品質のMMP-7を維持することができる。
　本願発明のMMP-7会合体の単量体化方法及び該単量体化方法を組み入れたMMP-7の製造方法において、糖アルコールや糖類は、MMP-7の製造に汎用されるゲルへの吸着抑制効果及び製剤化に使用されるバイアル等の器壁への吸着抑制効果を有する。このような糖アルコール及び糖類として、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、オリゴ糖アルコールなどが挙げられる。好ましくは、マンニトール及びスクロース、特に好ましくはマンニトールである。
　低濃度（例えば、1μg/ml～1mg/ml）のMMP-7を製剤化する場合は、MMP-7のバイアル器壁への吸着によるロスが想定されるため、単量体化用溶液に上記の糖アルコールや糖類を含有させるのは特に有効である。MMP-7の場合、バイアル器壁への吸着阻止効果を示す2%以上、好ましくは、体内浸透圧の調節可能な範囲である2～7%の糖アルコール又は糖類が添加される。本願発明においては、好ましくは、MMP-7の活性を維持することができる2～5％のマンニトール又は2～7%のスクロースを添加した単量体化用溶液が使用される。より好ましくは、2～5％マンニトール、30～40mM塩化ナトリウム及び5～30mM塩化カルシウムを含む、5～25mMトリス緩衝液（pH6～8）からなる単量体化用溶液が使用される。
　当該単量体化用溶液に溶解されたMMP-7は、本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物としてそのまま使用することができ、MMP-7の会合体形成抑制、MMP-7の活性維持、MMP-7の容器等への吸着抑制、医薬水溶液組成物としての品質の確保の観点で、MMP-7含有（医薬）組成物は、2％以上の糖アルコール及び／又は糖類、及び30～40mMの1価陽イオン化合物（塩化ナトリウム又は塩化カリウム）を含むのが好ましい。より具体的には、MMP-7の濃度が20mg/ml以下の場合、本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、2～5％マンニトール又は2～７%のスクロース、30～40mM塩化ナトリウム及び5～30mM塩化カルシウムを含むのが好ましい。本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、液状、凍結乾燥、あるいは凍結して保存することが可能である。その際に、MMP-7含有（医薬）組成物の医薬品としての安定性や等張性を維持するために、追加的に安定化剤、等張剤及び保存剤等のヒトや他の動物に対して投与することが許容される化合物が添加されうる。本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、溶剤に溶解し得てその溶解時の組成物が上述の本願発明の液体のMMP-7含有（医薬）組成物となる、固体組成物を含む。この固体組成物は、本願発明の液体のMMP-7含有（医薬）組成物を凍結乾燥等により溶剤を除去する等で得られる。溶剤とは、医薬品添加物辞典において溶剤とされているもので、水、エタノール等が挙げられる。
　こうして得られた本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、MMP-7の会合体形成や吸着が抑制された特異的なMMP-7の酵素活性を有するものであり、椎間板ヘルニアの治療薬または診断薬として使用され得るものである。
　以下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
　≪調製例≫
（１）APSPを有するproMMP-7発現ベクター（pETMMP7）の構築
　腎臓のcDNAライブラリー（HumanMTC Panel I, Catalog#: K1420-1, BD社）よりプライマーP1（配列番号1）とP2（配列番号2）を用いてproMMP-7遺伝子をPCRにより増幅した。増幅されたDNAをクローニングベクター（pCRII-TOPO, Invitrogen）に挿入し、得られたDNAの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、DNAシークエンサーを用いて行った。当該塩基配列とデーターベース（Accession Numbers: NM002423）に登録されているproMMP-7の塩基配列のホモロジー検索を行い、proMMP-7遺伝子が挿入されたプラスミド（pCRproMMP-7）を得た。
　次に、pCRproMMP-7を鋳型として、制限酵素NdeI認識配列、PhoA-アルカリフォスファターゼシグナルペプチド（APSP）配列をコードする塩基配列及びproMMP-7のN末端配列をコードする塩基配列からなるプライマーP3（配列番号3）と制限酵素BamHI認識配列及びproMMP-7のC末端配列をコードする塩基配列からなるプライマーP4（配列番号4）を用いて、PCRを行った。上記と同様に増幅されたDNAをクローニングベクターに挿入し、得られたDNAの塩基配列を決定した。塩基配列に変異がないことを確認した後、得られたプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、予め同じ制限酵素で切断した発現ベクターpET22b（メルク社、製品コード；69744-3）に挿入し、proMMP-7遺伝子が挿入されたプラスミド（pETMMP7）を得た。
　（２）改変型APSPを有する発現ベクターpETMMP7（L13P-A21E）の構築及び発現
　GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System（Invitrogen社）を用い、添付のプロトコールに従って、上記（１）で得たpETMMP7のAPSP配列（Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ile-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Phe-Thr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala；配列番号8）のシグナルペプチダーゼ認識部位に変異を導入した（APSP配列で示されるアミノ酸配列の13番目のロイシン（Leu）をプロリン（Pro）に、21番目のアラニン（Ala）をグルタミン酸（Glu）に置換した）。APSPの改変には、5'側プライマーとしてM2（配列番号5）及び3'側プライマーとしてP6（配列番号6）の配列を用いた。得られた改変型APSPを有するpETMMP7（L13P-A21E）で大腸菌（BL21(DE3)）を形質転換し、proMMP-7を発現する組み換え大腸菌（MMP7L13P-A21E菌）を得た。
　発現誘導は、Overnight Express Autoinduction System 1（メルク社；製品コード71300-3）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。簡単には、125ｍLの三角フラスコに50μg/mL Ampicillin（和光純薬株式会社）を含むLB培地50ｍLに各コロニーを懸濁し、Kitの試薬を添加し、37℃で16時間培養した。その菌体液のOD600nmを測定し、OD600nm＝20、１mLに相当する菌体を遠心分離により沈渣に回収した。沈渣を200μLのBugBusterにより破砕し、遠心分離により沈査を得た。沈渣をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用のSample Bufferで可溶化し、15%アクリルアミドゲルSDS-PAGEにかけ、CBB染色を行った。その結果、proMMP-7発現量の増加と分解の抑制効果の増強が確認された。
　本調製例においては、以下の配列からなるプライマーを使用した。
P1: ccataggtcc aagaacaatt gtctctg（配列番号1）
P2: caatccaatg aatgaatgaa tggatg（配列番号2）
P3: catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc aaggccctgc cgctgcctca g（配列番号3）
P4: ggatccctat ttctttcttg aattac（配列番号4）
M2: ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc（配列番号5）
P6: cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag（配列番号6）
≪１価陽イオン塩化物によるMMP-7会合体の形成抑制効果≫
（１）MMP-7の製造
　調製例に記載の方法により得たproMMP-7産生大腸菌（MMP7L13P-A21E菌）を種菌としてグルコース培地で培養・増殖し、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（IPTG）によるproMMP-7の発現誘導を行った。培養液から菌体を回収し、フレンチプレスにより破砕した。該破砕液を遠心分離し、沈渣に封入体を回収した。次いで、封入体を0.1M Tris-HCl(pH7.5)及び0.1Mジチオスレイトールを含む6M塩酸グアニジンで溶解し、0.1mM酢酸亜鉛、10mM塩化カルシウム、0.2M塩化ナトリウム及び1.0%Brij35を含む50mMHEPES緩衝液（pH7.5）でリフォールディングした後、常法により、proMMP-7をイオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーで精製した。得られたproMMP-7を47～48℃で加熱処理して自己活性化を行い、MMP-7を得た。得られたMMP-7は、40mM NaCl、10mM CaCl2及び3.5%マンニトールを含む5mMトリス緩衝液（pH7）を用いて、限外ろ過膜による希釈と濃縮を繰り返し、－80℃で保存した。
　（２）MMP-7会合体の測定
　上記（１）で得られた高濃度のMMP-7溶液を、5mM塩化カルシウム（CaCl2）を含む水に塩化ナトリウム（NaCl）または塩化カリウム（KCl）を溶解した溶液で希釈し、試料1及び試料2を調製した。
試料1：1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／各濃度NaCl（10～160mM）
試料2：1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／各濃度KCl（10～160mM）
　MMP-7の会合体形成における塩化ナトリウム及び塩化カリウムの影響を、上記の各試料100μlを用いて動的光散乱法（機材；Wyatt Technology DynaPro(Protein Solutions) Titan、セル；Wyatt Technology 12uL Cell 8.5mm Centre Height、測定温度；20℃）により調べた。各試料中のMMP-7の分子量を測定・解析し、MMP-7の単量体の分子量（約19kDa）に基づいて分子量38kDa以下の場合を単量体と判定した。その結果、10mM～80mM NaCl溶液中では、MMP-7の分子量は20～29kDaとなり、単量体として存在することが判明した。塩化カリウムを用いた場合も同様に10mM～80mM KCl溶液中において単量体で存在するとの結果が得られた（図1）。図中の点線は、分子量38kDaを示す。
≪MMP-7会合体の形成抑制における塩化カルシウムの影響≫
　実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、水に塩化カルシウム及び塩化ナトリウムを溶解した溶液で希釈し、試料3を調製した。
試料3：1mg/ml MMP-7／各濃度CaCl2(0～30mM)／各濃度NaCl(0～160mM)
　各濃度の塩化カルシウム存在下における、MMP-7会合体形成抑制への影響を実施例１-（２）の方法に従って調べた。
　その結果、0mM CaCl2のとき40mM以下のNaClで、5mM CaCl2のとき80mM以下のNaClで、10mM CaCl2のとき100mM以下のNaClで、20mM CaCl2のとき120mM以下のNaClで、及び30mM CaCl2のとき130mM以下のNaClでそれぞれ単量体を形成することが示された。また、単に水で希釈した場合もMMP-7単量体の形成が認められた。以上より、130mM以上のNaCl存在下でMMP-7の会合体は形成されるが、これに30mM以下（～30mM）のCaCl2を共存させることによりMMP-7会合体の形成は抑制されることが明らかになった。すなわち、当該濃度の塩化カルシウムは、より効果的にMMP-7の単量体を維持し、且つ安定化させる効果を有する（図2）。
≪MMP-7会合体形成におけるMMP-7濃度の影響≫
　実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を10mM CaCl2及び各濃度の塩化ナトリウムを含有する溶液で希釈し、各濃度のMMP-7を含有する試料4を調製した。
試料4：各濃度MMP-7(10、15、20mg/ml)／10mM CaCl2／各濃度NaCl(50～250mM)
　MMP-7会合体形成抑制効果に対するMMP-7の濃度の影響を、サイズ排除クロマトグラフィー法（HPLC機材；HEWLETT PACKED 1100 series、担体；TOYOPARL HW50S、処理温度；25℃、流速0.5mL/min、検出波長280nm）により調べた。カラムサイズは、直径5mm、長さ150mmのものを使用し、カラムの平衡化は、5mM Tis-HCl（pH7）、10mM CaCl2、3.5%マンニトールに40～500mM NaClを含む溶液で行った。
　本条件では、分子量60kDa～80kDaのタンパク質はボイド容量に出現する（クロマトグラフィー開始後、1.8分）。よって、クロマトグラフィー開始後2分近傍のピーク（またはリーディングピーク）をMMP-7の会合体とし、該ピークの面積を指標にして、MMP-7が会合体を形成する塩化ナトリウムの濃度を算出した。
　その結果、MMP-7の濃度に依存して塩化ナトリウムによるMMP-7会合体の形成抑制効果は弱くなるが、20mg/ml以下のMMP-7においては、0～80mMのNaClによりMMP-7は単量体として存在することが判明した（図3）。実施例２の結果（図2）から、塩化カルシウムの濃度を増加することにより、MMP-7の単量体が維持される塩化ナトリウムの濃度も比例的に増加することは明白であり、本実施例において30mMCaCl2の濃度を使用した場合、100mM NaCl存在下においても20mg/mlのMMP-7は単量体として存在することが推測される。更に、20mg/ml以上のMMP-7を使用した場合、塩化カルシウムの濃度を増加することにより、MMP-7を単量体として維持されることが推測される。
　試料4を4℃で一晩放置した後に、上記と同実験を行ったが、図3と同様の結果が得られた。
≪MMP-7の会合体形成による酵素活性への影響≫
　実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、40mM NaCl、10mM CaCl2を含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、各濃度のMMP-7を含有する試料5を調製した。
試料5：各濃度MMP-7（0.1、2、20mg/ml)／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）
　各濃度のMMP-7溶液を、150mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液（pH7）または40mM NaCl、10mM CaCl2を含む10mMトリス緩衝液（pH7）で0.1mg/mlとなるように希釈した後（１次希釈）、更に、各溶液を150mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液（pH7）で5ng/mlに希釈し（2次希釈）、当該希釈液について、MMP-7活性測定Kit（ANASPEC社）を用い、添付のプロトコールに従って、蛍光基質(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2；配列番号7)に対する切断活性を測定した。
　その結果、１次希釈において150mM NaClを含むトリス緩衝液（pH7）で希釈した2mg/ml以上のMMP-7では酵素活性が低下した（図4）。この酵素活性の低下は、MMP-7会合体の形成と一致する。一方で、0.1mg/ml以下の濃度では酵素活性の低下が見られないことから、当該濃度のMMP-7においては、少なくとも150mM NaClによる会合体の形成は起こらないことが示唆される。
≪限外ろ過膜によるMMP-7の濃縮工程における塩化ナトリウム濃度の影響≫
　実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2を含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試料6を調製した。
試料6：4mg/ml MMP-7／10mM CaCl2／各濃度NaCl（40mM、80mM、200mM、500mM）／5mMトリス緩衝液（pH7）
　試料6の各4mlを、限外ろ過膜（Amicon Ultra-4 10K）を用いて遠心濃縮（2500g）を行い、一定時間毎にろ液の容量と濃縮液の吸光度を測定した。
　その結果、濃度の薄い塩化ナトリウムを用いた方が、短時間でMMP-7を濃縮することができ、高塩濃度では濃縮に長時間を要した（表1）。表１の記号（－）は、濃縮終了を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
≪マンニトールによるMMP-7の吸着抑制効果≫
（１）MMP-7のゲルへの吸着抑制
　実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2及び40mM NaClを含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、試料7を調製した。
試料7：5.5mg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl
　試料7の1mlを、予め10mM CaCl2及び40mM NaClを含む5mMトリス緩衝液（pH7）で平衡化したカラム（HW40F、26x6cm、東ソー株式会社）にかけ、同トリス緩衝液で洗浄後、3.5%マンニトールを含有する同トリス緩衝液で溶出（流速5ml/min）した。
　その結果、ゲルに吸着したMMP-7がマンニトールにより溶出された（図5）。この結果は、マンニトールが、MMP-7のゲルへの吸着抑制効果を有することを示唆する。
　（２）MMP-7の器壁への吸着抑制
　実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2、40mM NaCl及びマンニトール、スクロースを含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、バイアル中に試料8～10の溶液（１ml）を調製した。各試料の浸透圧が同じになるようにこれらの濃度を調整した。マンニトール、スクロースを含まない同トリス緩衝液で希釈したもの（試料10）をコントロールとした。
試料8：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）／3.5%マンニトール
試料9：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）／6.6%スクロース
試料10：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）
　室温で3時間放置後、バイアル中の各溶液を2段階で希釈した。1次希釈に10mM CaCl2、40mM NaClを含む5mMトリス緩衝液（pH7）、2次希釈に1%ブロックエース(ブロックエース粉末:DSファーマバイオメディカル社)／TBS-T(0.05% Tween20/50mM Tris/150mM NaCl)を用いた。溶液中のMMP-7をELISAにより定量した。ELISAには、MMP-7をウサギに免疫して得られたウサギ抗MMP-7抗体、該ウサギ抗MMP-7抗体をビオチン標識試薬(Biotin (Long Arm) NHS-Water Soluble:ベクター社)で標識したビオチン標識ウサギ抗MMP-7抗体、西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン(Horseradish Peroxidase Streptavidin, Concentrate；ベクター社)、及びHRP基質溶液(Peroxidase Substrate Solution B:KPL社)を用いた。ELISA反応のコントロールとして濃度の明らかなMMP-7のELISA用スタンダードを用いた。該MMP-7の濃度は、吸光度を測定することにより算出した。
　その結果、無添加(試料10)に比べて、マンニトール(試料8)、スクロース(試料9)を添加した場合、MMP-7の回収率が高く、これらの吸着抑制効果が確認された（図6）。
　次いで、MMP-7の器壁への吸着阻止に対するマンニトール及びスクロースの有効濃度及びMMP-7の酵素活性への影響を調べた。実施例１－（１）で得られたMMP-7溶液を、マンニトールまたはスクロースを含む10mM CaCl2、40mM NaCl及び5mMトリス緩衝液(pH7)で希釈し、バイアル中に試料12～16の溶液(1 ml)を調製した。マンニトール、スクロースを含まない同トリス緩衝液で希釈したもの（試料11）を、各試料のコントロールとした。
試料11：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
試料12：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／1% マンニトール
試料13：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／2% マンニトール
試料14：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／2% スクロース
試料15：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／5% マンニトール
試料16：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／7% スクロース
　室温で3時間放置後、バイアル中の各溶液を2段階で希釈した。１次希釈液に0.01％ Briji35、0.01％ BSA、150mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液(pH7)で5ng/mlに希釈し、実施例４と同様に蛍光基質に対する切断活性（MMP-7の酵素活性）を測定した。本試験では、ペプチド研究所から入手した蛍光基質（MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2；(7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-prolyl-L-leucylglycyl-L-leucyl-[Nβ-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl]-L-alanyl-L-arginine amide；配列番号9)を用いた。また、2次希釈に1%ブロックエース（ブロックエース粉末：DSファーマバイオメディカル社）／TBS-T(0.05% Tween20/50mM Tris/150mM NaCl)を用い、上記ELISAにより溶液中のMMP-7を定量した。
　その結果、無添加（試料11）に比べ、2～5% マンニトール(試料13、15)、2～7% スクロース（試料14、16）を添加した場合、MMP-7の回収率が高く、これらの器壁への吸着抑制効果が確認された（図7）。また同添加によりMMP-7の酵素活性の低下は認められなかった（図8）。
≪MMP-7会合体の形成抑制におけるマンニトールの影響≫
　実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、スピンフィルターを用いて、各濃度のNaCl、5mM CaCl2、3.5％マンニトールを含む5mMトリス緩衝液（pH7）でバッファー交換した後、同トリス緩衝液で希釈し、試料17～22を調製した。マンニトールを含まない同トリス緩衝液で同様に処理したもの（試料17）を各試料のコントロールとした。
試料17：10mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2
試料18：10mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料19：40mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料20：80mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料21：120mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料22：180mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
　各試料を実施例１－（２）に記載の動的光散乱法により、MMP-7の分子量を測定した。その結果、MMP-7は、40mM以上の塩化ナトリウムにより会合体を形成することが示された（図９）。
　本願発明のMMP-7会合体の単量体化方法は、MMP-7の製造及び製剤化に利用され得る。

Claims (46)

　130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液でマトリックスメタロプロテアーゼ－７（MMP-7）の会合体を処理することを含む、MMP-7会合体の単量体化方法。
　130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液でMMP-7の会合体を処理する、請求項１に記載の単量体化方法。
　１価陽イオン化合物を含有しない溶液でMMP-7の会合体を処理する、請求項１に記載の単量体化方法。
　前記１価陽イオン化合物の濃度が、100mM以下である、請求項１又は２に記載の単量体化方法。
　前記１価陽イオン化合物の濃度が、80mM以下である、請求項１、２又は４に記載の単量体化方法。
　前記１価陽イオン化合物の濃度が、40mM以下である、請求項１、２、４又は５に記載の単量体化方法。
　前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、請求項１、２、４、５又は６に記載の単量体化方法。
　前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、請求項１、２、４、５又は６に記載の単量体化方法。
　前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、請求項８に記載の単量体化方法。
　前記溶液が、更に塩化カルシウムを含有する、請求項１から９の何れか一項に記載の単量体化方法。
　前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、請求項１０に記載の単量体化方法。
　前記溶液が緩衝液である、請求項１から１１の何れか一項に記載の単量体化方法。
　前記緩衝液が、5～25mMのトリス緩衝液である、請求項１２に記載の単量体化方法。
　前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、請求項１から１３の何れか一項に記載の単量体化方法。
　前記溶液が、30～40mM塩化ナトリウム及び5～30mM塩化カルシウムを含有する5～25mMトリス緩衝液（pH6～8）である、請求項１３又は１４に記載の単量体化方法。
　前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、請求項１から１５の何れか一項に記載の単量体化方法。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、請求項１６に記載の単量体化方法。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、請求項１６又は１７に記載の単量体化方法。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、2～7％である、請求項１８に記載の単量体化方法。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、請求項１７から１９の何れか一項に記載の単量体化方法。
　前記マンニトールが2～5％、前記スクロースが2～7%である、請求項２０に記載の単量体化方法。
　請求項１から２１の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程を含む、MMP-7の製造方法。
　前記工程が、130ｍM以上の１価陽イオン化合物含有液を用いた処理工程後に行われる、請求項２２に記載の製造方法。
　下記（１）～（５）の工程を包含する、請求項２２又は２３に記載の製造方法。
（１）proMMP-7封入体産生細胞を破砕する工程、
（２）proMMP-7封入体を溶解／リフォールディング処理する工程、
（３）proMMP-7を精製する工程、
（４）proMMP-7を自己活性化してMMP-7とする工程、及び
（５）請求項１から２１の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程
　前記（５）の工程が、限外ろ過膜を用いた濃縮工程である、請求項２４に記載の製造方法。
　130ｍM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にマトリックスメタロプロテアーゼ－７（MMP-7）を有効成分として含有する、MMP-7含有（医薬）組成物。
　130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、請求項２６に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、請求項２６に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、請求項２６又は２７に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、請求項２６又は２７に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、請求項３０に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　更に、塩化カルシウムを含有する、請求項２６から３１の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、請求項３２に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記溶液が緩衝液である、請求項２６から３３の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記緩衝液が、5～25mMのトリス緩衝液である、請求項３４に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、請求項２６から３５の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記MMP-7の濃度が1μg/ml～1mg/mlである、請求項３６に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記溶液が、30～40mM塩化ナトリウム及び5～30mM塩化カルシウムを含有する5～25mMトリス緩衝液（pH6～8）である、請求項３５、３６又は３７に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、請求項２６から３８の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、請求項３９に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、請求項３９又は４０に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、2～7％である、請求項４１に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、請求項４０から４２の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　前記マンニトールが2～5％、前記スクロースが2～7%である、請求項４３に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
　溶剤に溶解し得て、その溶解時の組成物が請求項２６から４４の何れか一項に記載の組成物である、MMP-7含有（医薬）固体組成物。
　請求項２６から４５の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物を含有する、椎間板ヘルニアの治療剤。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10276774A (ja) * 1997-04-03 1998-10-20 Toyobo Co Ltd 新規な糖化蛋白質および該物質を用いた分析用試薬
JP2000344672A (ja) * 1999-05-28 2000-12-12 Meiji Milk Prod Co Ltd マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤
JP2005006509A (ja) * 2003-06-16 2005-01-13 Arkray Inc メタロプロテアーゼの保存方法、および前記方法を用いたメタロプロテアーゼ試薬溶液
JP2005528109A (ja) * 2002-05-30 2005-09-22 アステックス テクノロジー リミテッド シトクロムｐ４５０タンパク質の精製法および結晶化法
JP2008206491A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Toyobo Co Ltd ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化方法
JP2009517086A (ja) * 2005-12-01 2009-04-30 バイオマトリカ， インコーポレイテッド ライフサイエンスのための試料保存と試料管理との統合
WO2010047347A1 (ja) * 2008-10-21 2010-04-29 財団法人化学及血清療法研究所 封入体形成タンパク質の製造方法
WO2012167271A1 (en) * 2011-06-02 2012-12-06 Baxter International Inc. Formulations of recombinant furin
JP2013518893A (ja) * 2010-02-04 2013-05-23 ビオマリン プハルマセウトイカル インコーポレイテッド 原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ変異体の組成物、及び、その組成物を用いる方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2938352B2 (ja) 1994-09-30 1999-08-23 オリエンタル酵母工業株式会社 組換え人マトリライシンの製造方法
US6194189B1 (en) * 1994-12-16 2001-02-27 Washington University Catalytically-active gelatinase mutant
JP4507027B2 (ja) 1998-12-04 2010-07-21 明治乳業株式会社 Ｍｍｐ阻害剤
FR2788525B1 (fr) * 1999-01-19 2002-11-29 Commissariat Energie Atomique Pseudo-peptides phosphiniques, utilisables comme inhibiteurs des metalloproteases a zinc matricielles
JP4813652B2 (ja) 2000-12-04 2011-11-09 丸善製薬株式会社 マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤
US7148046B2 (en) 2001-04-02 2006-12-12 Astex Therapeutics Limited Crystal structure of cytochrome P450
ATE400250T1 (de) 2001-09-12 2008-07-15 Virexx Medical Corp Festphasenmittel zur vaskulären okklusion mit immobilisierter thrombozyten-bindungssubstanz
US7935337B2 (en) * 2002-12-25 2011-05-03 Hiromichi Komori Method of therapy for degenerative intervertebral discs

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10276774A (ja) * 1997-04-03 1998-10-20 Toyobo Co Ltd 新規な糖化蛋白質および該物質を用いた分析用試薬
JP2000344672A (ja) * 1999-05-28 2000-12-12 Meiji Milk Prod Co Ltd マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤
JP2005528109A (ja) * 2002-05-30 2005-09-22 アステックス テクノロジー リミテッド シトクロムｐ４５０タンパク質の精製法および結晶化法
JP2005006509A (ja) * 2003-06-16 2005-01-13 Arkray Inc メタロプロテアーゼの保存方法、および前記方法を用いたメタロプロテアーゼ試薬溶液
JP2009517086A (ja) * 2005-12-01 2009-04-30 バイオマトリカ， インコーポレイテッド ライフサイエンスのための試料保存と試料管理との統合
JP2008206491A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Toyobo Co Ltd ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化方法
WO2010047347A1 (ja) * 2008-10-21 2010-04-29 財団法人化学及血清療法研究所 封入体形成タンパク質の製造方法
JP2013518893A (ja) * 2010-02-04 2013-05-23 ビオマリン プハルマセウトイカル インコーポレイテッド 原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ変異体の組成物、及び、その組成物を用いる方法
WO2012167271A1 (en) * 2011-06-02 2012-12-06 Baxter International Inc. Formulations of recombinant furin

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARNETT J ET AL.: "Production, purification, and characterization of human matrilysin (PUMP) from recombinant Chinese hamster ovary cells", PROTEIN EXPR. PURIF., vol. 5, no. 1, 1994, pages 27 - 36, XP024799933, ISSN: 1046-5928 *
BROWNER MF ET AL.: "Matrilysin-inhibitor complexes: common themes among metalloproteases", BIOCHEMISTRY, vol. 34, no. 20, 1995, pages 6602 - 6610, XP000983457 *
CRABBE T ET AL.: "Biochemical characterization of matrilysin. Activation conforms to the stepwise mechanisms proposed for other matrix metalloproteinases", BIOCHEMISTRY, vol. 31, no. 36, 1992, pages 8500 - 8507, XP055238073 *
HARO H: "Translational research of herniated discs: current status of diagnosis and treatment", J. ORTHOP. SCI., vol. 19, no. 4, July 2014 (2014-07-01), pages 515 - 520, XP055238066, ISSN: 0949-2658 *
INOUYE K ET AL.: "States of tryptophyl residues and stability of recombinant human matrix metalloproteinase 7 (matrilysin) as examined by fluorescence", J. BIOCHEM., vol. 128, no. 3, 2000, pages 363 - 369, XP055238071 *
KANNAN R ET AL.: "Purification of active matrix metalloproteinase catalytic domains and its use for screening of specific stromelysin-3 inhibitors", PROTEIN EXPR. PURIF., vol. 16, no. 1, 1999, pages 76 - 83, XP004441684, ISSN: 1046-5928 *
KIHIRA Y ET AL.: "Production of recombinant human matrix metalloproteinase 7 (Matrilysin) with potential role in tumor invasion by refolding from Escherichia coli inclusion bodies and development of sandwich ELISA of MMP-7", UROL. ONCOL., vol. 2, no. 1, 1996, pages 20 - 26, XP055238069 *
LOPEZ DE TURISO J ET AL.: "Expression and purification of human matrilysin produced in baculovirus-infected insect cells", J. BIOTECHNOL., vol. 46, no. 3, 1996, pages 235 - 241, XP004036792, ISSN: 0168-1656 *
ONEDA H ET AL.: "Refolding and recovery of recombinant human matrix metalloproteinase 7 (matrilysin) from inclusion bodies expressed by Escherichia coli", J. BIOCHEM., vol. 126, no. 5, 1999, pages 905 - 911, XP055238074, ISSN: 0021-924x *
OU L ET AL.: "The expression and refolding of isotopically labeled recombinant Matrilysin for NMR studies", PROTEIN EXPR. PURIF., vol. 47, no. 2, 2006, pages 367 - 373, XP024908753, ISSN: 1046-5928 *
SAMUKANGE V ET AL.: "Effects of heparin and cholesterol sulfate on the activity and stability of human matrix metalloproteinase 7", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 78, no. 1, 2014, pages 41 - 48, XP055238072, ISSN: 0916-8451 *
See also references of EP3147358A4 *
ZHOU JH ET AL.: "Autoantibodies against MMP-7 as a novel diagnostic biomarker in esophageal squamous cell carcinoma", WORLD J. GASTROENTEROL., vol. 17, no. 10, 2011, pages 1373 - 1378, XP055238070, ISSN: 1007-9327 *

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