CN114686519A - 一种制备丝氨酸蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体以及宿主细胞。本发明还涉及利用所述表达载体或宿主细胞制备丝氨酸蛋白酶的方法。本发明共表达丝氨酸蛋白酶和相应的丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过由丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制过量表达的丝氨酸蛋白酶的部分活性，减少丝氨酸蛋白酶对表达细胞株造成的细胞毒性，提高表达细胞株对同等表达量的丝氨酸蛋白酶的耐受性。

Description

一种制备丝氨酸蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种制备丝氨酸蛋白酶的方法。
背景技术
丝氨酸蛋白酶(或称丝氨酸内肽酶)是一种能在蛋白质中裂解肽键的酶，其中丝氨酸作为酶活性部位的亲核氨基酸。它们普遍存在于真核生物和原核生物中。丝氨酸蛋白酶根据其结构可分为两大类：类胰蛋白酶(类糜蛋白酶)或类枯草杆菌蛋白酶。其中胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在带正电的氨基酸(赖氨酸或精氨酸)后裂解肽键。这种特异性是由位于酶的底物结合口袋底部的残基(通常是带负电的天冬氨酸或谷氨酸)决定的。
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶对维持生物体的内环境稳定起着重要作用，如控制血液凝聚、血纤蛋白溶解、激酶-激肽释放酶和补体系统。正常情况下，人体自身的内源性蛋白酶抑制剂能保护保护蛋白酶所致的潜在的破坏作用，若蛋白酶抑制剂浓度下降，则破坏了蛋白酶和抗蛋白酶之间的平衡。过量蛋白酶的活化会导致各种疾病的发展，如胰腺炎或弥散性血管内凝血疾病等。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶能使各种疾病激活，而其抑制剂通常是治疗或预防血栓形成、炎症疾病、自身免疫及相关疾病的有效药物。
生物工程中常用哺乳动物细胞表达重组蛋白，而某些用于临床治疗的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(如各类凝血因子和溶栓酶等)常存在哺乳动物细胞内表达量低的问题，进而增加药物的生产成本。其原因在于过量表达的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性会引起细胞毒性。即使是表达活性较低或无活性的蛋白酶前体，也可能在表达过程中有部分或少量被提前激活，细胞毒性超过一定限度时，会对表达胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的细胞群体造成一定的筛选压力，导致最终筛选得到的细胞株几乎都是低表达的。即使偶有高表达细胞株，也无法长期稳定存在，难以用于大规模商业化生产。
发明内容
第一方面，本发明提供共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，或可称为类胰蛋白酶。
在一些实施方式中，所述表达载体为组成型表达载体。优选地，所述表达载体的表达无需诱导剂的诱导。本发明采用组成型表达载体共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以无需诱导而实现目标蛋白的组成型表达，从而避免了额外添加诱导剂导致的细胞生长或代谢抑制，进而影响蛋白的翻译后修饰。且本发明提供的表达载体安全性高，更利于目标蛋白后续的纯化继而作为药物使用。
在一些实施方式中，所述表达载体为pXC17.4载体、pXC18.4载体或pXC17.4和pXC18.4的连接载体。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶为组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogen activator,tPA)。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述α-抗胰蛋白酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述牛胰蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述胶质细胞源性连接蛋白具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体采用包括如下步骤的方法制备得到：将插入编码所述丝氨酸蛋白酶(tPA)的核苷酸序列的表达载体和插入编码所述丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的核苷酸序列的表达载体，连接成双表达框表达载体。
在一些实施方式中，所述共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体采用包括如下步骤的方法制备得到：将编码所述tPA的核苷酸序列插入pXC17.4表达载体中，得到pXC17.4-tPA；将编码所述SPI的核苷酸序列插入pXC18.4表达载体，得到pXC18.4-SPI；所述将pXC17.4-tPA和pXC18.4-SPI用NotI和PvuI进行酶切，连接成同时表达tPA和SPI的双表达框表达载体pXC-tPA-SPI。
第二方面，本发明提供外源转入了所述表达载体的宿主细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，如来自于大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、猴、人等哺乳动物的细胞。相对于酵母细胞需要加入醇氧化酶启动子进行诱导表达，以及细菌细胞(如大肠杆菌)需要加入乳糖进行诱导表达，本发明采用哺乳动物细胞作为宿主细胞，可以无需诱导而实现目标蛋白的组成型表达，从而避免了额外添加诱导剂导致的细胞生长或代谢抑制，进而影响蛋白的翻译后修饰。本发明提供的实施方式安全性高，更利于目标蛋白后续的纯化继而作为药物使用。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovarycells，CHO)。
第三方面，本发明提供丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂形成的非共价复合物。本发明提供的所述丝氨酸蛋白酶与所述丝氨酸蛋白酶抑制剂形成的非共价复合物结构松散，且该非共价复合物的形成可逆。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，或可称为类胰蛋白酶。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶为组织型纤溶酶原激活剂。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明通过大量实践发现，如果采用抑制作用过强的抑制剂会与丝氨酸蛋白酶形成共价复合物，抑制作用过弱则不足以减弱蛋白酶所导致的细胞毒性。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述α-抗胰蛋白酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述牛胰蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述胶质细胞源性连接蛋白具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
第四方面，本发明提供所述丝氨酸蛋白酶与所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的非共价复合物的制备方法。
在一些实施方式中，所述制备方法包括：将本发明第一方面提供的表达载体转染至宿主细胞中进行表达。
在一些实施方式中，所述制备方法包括：利用本发明第二方面提供的宿主细胞进行表达。
在一些实施方式中，所述制备方法包括如下具体步骤：先对转入所述表达载体的宿主细胞进行隆筛选，然后对筛选后的细胞进行培养，表达目标蛋白。
在一些实施方式中，所述制备方法包括如下具体步骤：对转入所述表达载体的CHOK1细胞用蛋氨酸亚砜酰亚胺进行加压筛选，然后对筛选后的细胞进行培养，表达目标蛋白。
第五方面，本发明提供所述表达载体、所述宿主细胞、所述非共价复合物或所述非共价复合物的制备方法在制备丝氨酸蛋白酶中的应用。
第六方面，本发明提供一种制备丝氨酸蛋白酶的方法。
本发明在通过所述表达载体或宿主细胞进行蛋白质表达、获得所述非共价复合物或者通过所述制备方法制备得到所述非共价复合物的基础上，可以进一步采用纯化工艺获得丝氨酸蛋白酶，所述纯化的主要目的是去除丝氨酸蛋白酶抑制剂。
在一些实施方式中，可以通过本发明所述表达载体或所述宿主细胞进行蛋白质表达，然后去除表达产物中的丝氨酸蛋白酶抑制剂，从而得到丝氨酸蛋白酶。
在一些实施方式中，可以通过所述非共价复合物或所述方法制备得到所述非共价复合物，然后去除其中的丝氨酸蛋白酶抑制剂，从而得到丝氨酸蛋白酶。
本发明所述纯化可以采用分子排阻、离子交换等本领域已知的蛋白纯化方式。
本发明通过共表达丝氨酸蛋白酶和相应的丝氨酸蛋白酶抑制剂，选择合适的丝氨酸蛋白酶抑制剂使之与丝氨酸蛋白酶形成松散的可逆的非共价复合物(抑制作用过强的抑制剂会与丝氨酸蛋白酶形成共价复合物，抑制作用过弱则不足以减弱蛋白酶所导致的细胞毒性)，后续可以考虑通过下游纯化工艺去除丝氨酸蛋白酶抑制剂来提纯丝氨酸蛋白酶。通过由丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制过量表达的丝氨酸蛋白酶的部分活性，减少丝氨酸蛋白酶对表达细胞株造成的细胞毒性，提高表达细胞株对同等表达量的丝氨酸蛋白酶的耐受性，换言之，在细胞毒性耐受度不变的情况下，共表达丝氨酸蛋白酶抑制剂可提高丝氨酸蛋白酶在同一宿主细胞中的表达量。
附图说明
图1为细胞池培养上清SDS-PAGE检测结果示意图；
其中，泳道1：tPA,泳道2：tPA+AAT,泳道3：tPA+BPTI,泳道4：tPA+PAI-1；泳道5：tPA+PAI-2,泳道6：tPA+PAI-3,泳道7：tPA+PI-12,泳道8：tPA+PI-7；M代表marker。
图2为细胞池补料批培养上清SDS-PAGE检测结果示意图；
其中，泳道1：tPA,泳道2：tPA+AAT,泳道3：tPA+BPTI,泳道4：tPA+PAI-2；泳道5：tPA+PAI-3,泳道6：tPA+PI-12,泳道7：0.2μg Actilyse(参考品),泳道8：0.5μg Actilyse(参考品)，泳道9：1.0μg Actilyse(参考品)；M代表marker。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)是最早的用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产的重组蛋白之一，临床上常用于溶解血栓。相对于其高剂量(50mg/支),其表达量一般鲜有超过500mg/L的。
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下表1：
表1
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu；Val
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下表2：
表2
Figure BDA0002873092720000081
实施例1：质粒构建
全基因合成tPA(Uniprot entry:P00750)的DNA序列，所用密码子以CHO细胞的偏好密码子进行优化，5’和3’的限制性酶切位点分别为HindIII和EcoRI，氨基酸如SEQ IDNO:1所示(36-562为成熟肽)。
全基因合成丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,SPI),所用密码子以CHO细胞的偏好密码子进行优化，5’和3’的限制性酶切位点分别为HindIII和EcoRI。具体而言：α-抗胰蛋白酶(AAT,Uniprot entry:P01009)的序列如SEQ ID NO:2所示；牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI,Uniprot entry:P00974)的序列如SEQ ID NO:3所示；纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1,Uniprot entry:P05121)的序列如SEQ ID NO:4所示；纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2,Uniprot entry:P05120)的序列如SEQ ID NO:5所示；纤溶酶原激活剂抑制剂-3(PAI-3,Uniprot entry:P05154)的序列如SEQ ID NO:6所示；神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(PI-12,Uniprot entry:Q99574)的序列如SEQ ID NO:7所示；胶质细胞源性连接蛋白(PI-7，Uniprot entry:P07093)的序列如SEQ ID NO:8所示。
上述氨基酸序列具体如表3所示。
表3：氨基酸序列
Figure BDA0002873092720000091
Figure BDA0002873092720000101
将tPA的序列插入至pXC17.4表达载体中，构建单独表达tPA的表达质粒pXC17.4-tPA，作为对照；将SPI的序列插入pXC18.4表达载体，并pXC18.4-SPI。将pXC17.4-tPA和pXC18.4-SPI用NotI和PvuI酶切连接成一个同时表达tPA和SPI的双表达框质粒pXC-tPA+SPI，SPI为SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:8中的任意一个。
实施例2：细胞池构建
将pXC17.4-tPA和7个pXC-tPA+SPI质粒通过电穿孔转染至经悬浮无血清驯化的CHO K1细胞中。转染后用含25μM MSX的CD CHO培养基对转染后的细胞进行加压筛选，每3-4天更换一次培养基，直至细胞活率恢复至90％以上，撤去MSX。用SDS-PAGE对培养上清中蛋白进行检测，可能存在某些SPI的抑制作用过强而与丝氨酸蛋白酶形成分子量更大的不可逆的共价复合物，导致目标蛋白失去应用价值，应排除此类抑制物。
结果如图1所示，在本实施例中，排除了PAI-1(泳道4)和PI-7(泳道8)。
实施例3：细胞池补料批培养
将筛选后的细胞池以约0.5×106cell/ml接种至含60ml Dynamis培养基的250ml三角摇瓶中，培养条件：37℃，140RPM,5％CO2，85％湿度。从第3天起，每天流加补料培养基3％(v/v)Cell Boost 7a和0.3％(v/v)Cell Boost 7b，并将葡萄糖控制在5-8g/L的浓度，培养第11天。2000rmp离心10min收获上清，再经0.22μm滤膜过滤后保存于2-8℃。
实施例4：表达量检测
取实施例3所得的100uL培养上清，用PBS稀释10倍后，取20uL样品用还原性于SDS-PAGE分析。
由图2结果可知，共表达SPI的细胞池所表达的tPA表达水平要明显高于单独表达tPA的细胞池。
实施例5：活性分析
用底物S-2288对培养上清进行活性检测。丝氨酸蛋白酶广谱发色底物S-2288为化学合成的小肽，其一端为发色基团(pNA)；丝氨酸蛋白酶可将pNA催化解离下来；游离pNA可通过分光光度计或酶标仪检测，从而确定相应物质的活性。
稀释Buffer:0.05M Tris-HCl,0.15M NaCl,1mg/ml BSA,0.01％Tween 80,pH7.4。
反应Buffer:0.05M Tris-HCl,0.15M NaCl,1mg/ml BSA,0.01％Tween 80,pH7.4,0.5mM S-2288。
取1mg/mL的Actilyse(参考品),用稀释Buffer稀释成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg/mL的工作浓度用于制备标准曲线。细胞池补料批培养上清用稀释buffer 1:1稀释后作为待测样品。取5μL参考品工作液或待测样品，与95μL反应buffer在96孔板混合后，迅速用分光光度计检测检测5分钟内406nm处的吸收值，以工作浓度为横坐标，吸光值为纵坐标拟合标准曲线，计算细胞池补料批培养上清中的tPA含量。检测结果如表4所示。
表4：细胞池培养上清表达量检测(S-2288法)
细胞池 表达量(g/L) tPA设为100％
tPA 0.624 100％
tPA+AAT 0.638 102％
tPA+BPTI 1.582 253％
tPA+PAI-2 0.969 155％
tPA+PAI-3 0.981 157％
tPA+PI-12 ＞2.000 ＞320.5％
由表4结果可知，除tPA+AAT外，其余细胞池均有50％以上tPA表达量提升。其中，tPA+PI-12细胞池的表达量超出检测上限，可能与其双链tPA的比例高于其他细胞池有关。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山汉腾生物科技有限公司；广州汉腾生物科技有限公司；
佛山普津生物技术有限公司
<120> 一种制备丝氨酸蛋白酶的方法
<130> RYP2011003.7
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 562
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 组织型纤溶酶原激活剂
<400> 1
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg
20 25 30
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met
35 40 45
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn
50 55 60
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser
65 70 75 80
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
85 90 95
Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu
100 105 110
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr
115 120 125
Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser
130 135 140
Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His
165 170 175
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val
180 185 190
Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys
195 200 205
Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg
210 215 220
Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn
225 230 235 240
Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala
245 250 255
Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly
260 265 270
Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp
275 280 285
Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr
290 295 300
Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala
305 310 315 320
Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro
325 330 335
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile
340 345 350
Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu
355 360 365
Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu
370 375 380
Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp
385 390 395 400
Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser
405 410 415
Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly
435 440 445
Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys
450 455 460
Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His
465 470 475 480
Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr
485 490 495
Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
500 505 510
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val
515 520 525
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly
530 535 540
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met
545 550 555 560
Arg Pro
<210> 2
<211> 418
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> α-抗胰蛋白酶
<400> 2
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
50 55 60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65 70 75 80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
85 90 95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
130 135 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145 150 155 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225 230 235 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
275 280 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
290 295 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
405 410 415
Gln Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 牛胰蛋白酶抑制剂
<400> 3
Met Lys Met Ser Arg Leu Cys Leu Ser Val Ala Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Leu Ala Ala Ser Thr Pro Gly Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala
20 25 30
Lys Ala Gln Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro
35 40 45
Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu
50 55 60
Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe
65 70 75 80
Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Ile Gly Pro
85 90 95
Trp Glu Asn Leu
100
<210> 4
<211> 402
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 纤溶酶原激活剂抑制剂-1
<400> 4
Met Gln Met Ser Pro Ala Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Phe Gly Glu Gly Ser Ala Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala
20 25 30
His Leu Ala Ser Asp Phe Gly Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln
35 40 45
Ala Ser Lys Asp Arg Asn Val Val Phe Ser Pro Tyr Gly Val Ala Ser
50 55 60
Val Leu Ala Met Leu Gln Leu Thr Thr Gly Gly Glu Thr Gln Gln Gln
65 70 75 80
Ile Gln Ala Ala Met Gly Phe Lys Ile Asp Asp Lys Gly Met Ala Pro
85 90 95
Ala Leu Arg His Leu Tyr Lys Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp
100 105 110
Glu Ile Ser Thr Thr Asp Ala Ile Phe Val Gln Arg Asp Leu Lys Leu
115 120 125
Val Gln Gly Phe Met Pro His Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val
130 135 140
Lys Gln Val Asp Phe Ser Glu Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn
145 150 155 160
Asp Trp Val Lys Thr His Thr Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly
165 170 175
Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu
180 185 190
Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Lys Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His
195 200 205
Arg Arg Leu Phe His Lys Ser Asp Gly Ser Thr Val Ser Val Pro Met
210 215 220
Met Ala Gln Thr Asn Lys Phe Asn Tyr Thr Glu Phe Thr Thr Pro Asp
225 230 235 240
Gly His Tyr Tyr Asp Ile Leu Glu Leu Pro Tyr His Gly Asp Thr Leu
245 250 255
Ser Met Phe Ile Ala Ala Pro Tyr Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala
260 265 270
Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn
275 280 285
Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu
290 295 300
Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp
305 310 315 320
Met Phe Arg Gln Phe Gln Ala Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu
325 330 335
Pro Leu His Val Ala Gln Ala Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu Val Asn
340 345 350
Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser Ser Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala
355 360 365
Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val
370 375 380
Val Arg His Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met
385 390 395 400
Glu Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 纤溶酶原激活剂抑制剂-2
<400> 5
Met Glu Asp Leu Cys Val Ala Asn Thr Leu Phe Ala Leu Asn Leu Phe
1 5 10 15
Lys His Leu Ala Lys Ala Ser Pro Thr Gln Asn Leu Phe Leu Ser Pro
20 25 30
Trp Ser Ile Ser Ser Thr Met Ala Met Val Tyr Met Gly Ser Arg Gly
35 40 45
Ser Thr Glu Asp Gln Met Ala Lys Val Leu Gln Phe Asn Glu Val Gly
50 55 60
Ala Asn Ala Val Thr Pro Met Thr Pro Glu Asn Phe Thr Ser Cys Gly
65 70 75 80
Phe Met Gln Gln Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Pro Asp Ala Ile Leu Gln
85 90 95
Ala Gln Ala Ala Asp Lys Ile His Ser Ser Phe Arg Ser Leu Ser Ser
100 105 110
Ala Ile Asn Ala Ser Thr Gly Asn Tyr Leu Leu Glu Ser Val Asn Lys
115 120 125
Leu Phe Gly Glu Lys Ser Ala Ser Phe Arg Glu Glu Tyr Ile Arg Leu
130 135 140
Cys Gln Lys Tyr Tyr Ser Ser Glu Pro Gln Ala Val Asp Phe Leu Glu
145 150 155 160
Cys Ala Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile Asn Ser Trp Val Lys Thr Gln
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Thr Lys Gly Lys Ile Pro Asn Leu Leu Pro Glu Gly Ser Val Asp Gly
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Asp Thr Arg Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp
195 200 205
Lys Thr Pro Phe Glu Lys Lys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Phe Arg Val
210 215 220
Asn Ser Ala Gln Arg Thr Pro Val Gln Met Met Tyr Leu Arg Glu Lys
225 230 235 240
Leu Asn Ile Gly Tyr Ile Glu Asp Leu Lys Ala Gln Ile Leu Glu Leu
245 250 255
Pro Tyr Ala Gly Asp Val Ser Met Phe Leu Leu Leu Pro Asp Glu Ile
260 265 270
Ala Asp Val Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Glu Ser Glu Ile Thr Tyr
275 280 285
Asp Lys Leu Asn Lys Trp Thr Ser Lys Asp Lys Met Ala Glu Asp Glu
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Val Glu Val Tyr Ile Pro Gln Phe Lys Leu Glu Glu His Tyr Glu Leu
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Arg Ser Ile Leu Arg Ser Met Gly Met Glu Asp Ala Phe Asn Lys Gly
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Arg Ala Asn Phe Ser Gly Met Ser Glu Arg Asn Asp Leu Phe Leu Ser
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Glu Val Phe His Gln Ala Met Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Thr Glu
355 360 365
Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Val Met Thr Gly Arg Thr Gly His Gly
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Gly Pro Gln Phe Val Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Leu Ile Met His
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Lys Ile Thr Asn Cys Ile Leu Phe Phe Gly Arg Phe Ser Ser Pro
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<211> 406
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 纤溶酶原激活剂抑制剂-3
<400> 6
Met Gln Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Pro Gln Gly
1 5 10 15
Ala Ser Leu His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg Val Glu
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Asp Leu His Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg Arg Asp Phe
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Thr Phe Asp Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gln Ser
50 55 60
Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser Leu Ala Met Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gly Ala Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln Ile Leu Glu Gly Leu Gly
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Leu Asn Leu Gln Lys Ser Ser Glu Lys Glu Leu His Arg Gly Phe Gln
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Gln Leu Leu Gln Glu Leu Asn Gln Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser
115 120 125
Leu Gly Asn Ala Leu Phe Thr Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr
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Asn Phe Arg Asp Ser Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val
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Ala Lys Gln Thr Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp
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Ser Asn Ala Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys
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Trp Glu Thr Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr
210 215 220
Val Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp
225 230 235 240
Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Val Gly
245 250 255
Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro Ser Glu
260 265 270
Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys Thr Leu Arg
275 280 285
Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Pro
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Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu Lys Val Leu Pro Ser
305 310 315 320
Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His Ala Asp Leu Ser Gly Ile
325 330 335
Ser Asn His Ser Asn Ile Gln Val Ser Glu Met Val His Lys Ala Val
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂
<400> 7
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Thr Gly Ala Thr Phe Pro Glu Glu Ala Ile Ala Asp Leu Ser Val Asn
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Thr Arg Asp Met Ile Asp Asn Leu Leu Ser Pro Asp Leu Ile Asp Gly
165 170 175
Val Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Val Tyr Phe Lys Gly Leu
180 185 190
Trp Lys Ser Arg Phe Gln Pro Glu Asn Thr Lys Lys Arg Thr Phe Val
195 200 205
Ala Ala Asp Gly Lys Ser Tyr Gln Val Pro Met Leu Ala Gln Leu Ser
210 215 220
Val Phe Arg Cys Gly Ser Thr Ser Ala Pro Asn Asp Leu Trp Tyr Asn
225 230 235 240
Phe Ile Glu Leu Pro Tyr His Gly Glu Ser Ile Ser Met Leu Ile Ala
245 250 255
Leu Pro Thr Glu Ser Ser Thr Pro Leu Ser Ala Ile Ile Pro His Ile
260 265 270
Ser Thr Lys Thr Ile Asp Ser Trp Met Ser Ile Met Val Pro Lys Arg
275 280 285
Val Gln Val Ile Leu Pro Lys Phe Thr Ala Val Ala Gln Thr Asp Leu
290 295 300
Lys Glu Pro Leu Lys Val Leu Gly Ile Thr Asp Met Phe Asp Ser Ser
305 310 315 320
Lys Ala Asn Phe Ala Lys Ile Thr Thr Gly Ser Glu Asn Leu His Val
325 330 335
Ser His Ile Leu Gln Lys Ala Lys Ile Glu Val Ser Glu Asp Gly Thr
340 345 350
Lys Ala Ser Ala Ala Thr Thr Ala Ile Leu Ile Ala Arg Ser Ser Pro
355 360 365
Pro Trp Phe Ile Val Asp Arg Pro Phe Leu Phe Phe Ile Arg His Asn
370 375 380
Pro Thr Gly Ala Val Leu Phe Met Gly Gln Ile Asn Lys Pro
385 390 395

Claims (10)

1.共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶；
优选地，所述表达载体为组成型表达载体；
更优选地，所述表达载体的表达无需诱导剂的诱导。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为组织型纤溶酶原激活剂；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
更优选地，所述α-抗胰蛋白酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；和/或，所述牛胰蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和/或，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；和/或，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-2具有如SEQID NO:5所示的氨基酸序列；和/或，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；和/或，所述神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或，所述胶质细胞源性连接蛋白具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的表达载体，其特征在于，所述共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体采用包括如下步骤的方法制备得到：将插入编码所述丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的表达载体和插入编码所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列的表达载体，连接成双表达框表达载体；
优选地，所述共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体采用包括如下步骤的方法制备得到：将编码所述tPA的核苷酸序列插入pXC17.4表达载体中，得到pXC17.4-tPA；将编码所述SPI的核苷酸序列插入pXC18.4表达载体，得到pXC18.4-SPI；所述将pXC17.4-tPA和pXC18.4-SPI用NotI和PvuI进行酶切，连接成同时表达tPA和SPI的双表达框表达载体pXC-tPA-SPI。
5.外源转入了权利要求1～4任意一项所述表达载体的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为来自大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、猴或人的细胞；
更优选地，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞，优选为CHO K1细胞。
6.丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂形成的非共价复合物，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，优选所述非共价复合物的形成可逆；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶为组织型纤溶酶原激活剂。
7.根据权利要求6所述的非共价复合物，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；
优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。
8.制备权利要求6或7所述非共价复合物的方法；
优选地，所述方法包括：将权利要求1～4任意一项所述表达载体转染至宿主细胞中进行表达，或者利用权利要求5所述宿主细胞进行表达；
更优选地，所述方法包括：对转入所述表达载体的宿主细胞进行筛选，然后对筛选后的细胞进行培养，表达目标蛋白；
更优选地，所述方法包括：对转入所述表达载体的CHO K1细胞用蛋氨酸亚砜酰亚胺进行加压筛选，然后对筛选后的细胞进行培养，表达目标蛋白。
9.权利要求1～4任意一项所述表达载体、权利要求5所述宿主细胞、权利要求6或7所述非共价复合物或权利要求8所述方法在制备丝氨酸蛋白酶中的应用。
10.一种制备丝氨酸蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：通过权利要求1～4任意一项所述表达载体或权利要求5所述宿主细胞进行蛋白质表达，然后去除表达产物中的丝氨酸蛋白酶抑制剂；
或者，获得权利要求6或7所述非共价复合物或通过权利要求8所述方法制备得到所述非共价复合物，然后去除其中的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
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