BR112016027089B1 - Método para monomerização de agregados de matriz metaloproteinase 7 (mmp-7), composição farmacêutica compreendendo mmp-7 e seu uso para tratamento de deslocamento de disco intervertebral e processo para preparação de mmp-7 - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA MONOMERIZAÇÃO DE AGREGADO DE MATRIZ METALOPROTEINASE 7 (MMP-7). Um método para monomerização de agregados de MMP-7 é provido. Um método para monomerização de agregados de MMP-7 compreendendo o tratamento de agregados de MMP-7 com uma solução tampão compreendendo um cloreto de cátion monovalente (cloreto de sódio, cloreto de potássio, etc.) em uma baixa concentração ou com uma solução tampão não compreendendo um cloreto de cátion monovalente, um método para preparação de MMP-7 que envolve o dito método para monomerização, e uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 na solução tampão mencionada anteriormente. No caso onde uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 em uma baixa concentração é preparada, a solução tampão mencionada anteriormente compreendendo álcoois de açúcares ou açúcares, é usada.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a um método para monomerização de agregados de matriz metaloproteinase 7 (daqui por diante também referida como "MMP-7"). Especificamente, a presente invenção refere-se a um método para monomerização de agregados de MMP-7 que compreende tratamento de agregados de MMP-7 com uma solução compreendendo uma baixa concentração de um composto de cátion monovalente ou com uma solução não compreendendo o dito composto, um método para preparação de MMP-7 que envolve o dito método para monomerização de agregados de MMP-7, e uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 na solução mencionada anteriormente onde álcoois de açúcares ou açúcares ainda são dissolvidos.

Antecedentes da Técnica

[002] MMP-7 é uma de matriz metaloproteinase (daqui por diante também referida como "MMP") pertencendo a uma família de zinco metaloproteinase que possui uma molécula de zinco no sítio ativo (Cf. por exemplo, referência não-patente 1). MMP é produzida como um precursor, sua sequência sinal é processada com secreção extracelular, e então uma pró-sequência é processada para render uma forma ativa. MMP secretada extracelularmente controla metabolismo de matriz extracelular. Por outro lado, é reportado que MMP-7 é principalmente secretada de células de câncer e está envolvida em invasão e metástase (cf. por exemplo, referência não patente 2). MMP-7 carece de região articulada e o domínio semelhante a hemopexina comum em muitas outras MMPs e consiste na unidade molecular mínima como comparada às outras MMPs. Um substrato de MMP-7 são componentes constituindo colágeno ou matriz extracelular (fibronectina, vitronectina, laminina, agrecano).

[003] MMP-7 é presumida estar envolvida em remissão espontânea de nucleus pulposus existente no espaço epidural (espinhal) visto que um substrato de MMP-7 é agrecano que é o principal componente do tecido de cartilagem e que macrófagos do espécime de cirurgia de deslocamento de disco intervetebral expressa MMP-7 (cf. por exemplo, referência não patente 3). A seguir, Haro et al., administraram MMP-7 para o disco intervertebral de cão herniário e observou o aumento em um volume de nucleus pulposus dentro de disco intervertebral para pelo que mostrar a possibilidade de MMP-7 como um medicamento para tratamento de deslocamento de disco intervertebral (cf. por exemplo, referência não patente 4). Desenvolvimento de MMP-7 como um medicamento é desejado. Entretanto, MMP-7 ocorre no corpo vivo somente em uma quantidade em traço e assim é extremamente difícil isolar e purificar MMP-7 a partir do corpo vivo. Além disso, quando são usados componentes do corpo vivo, existe um conceito em vista de segurança tal como potencial infecção viral. Embora MMP-7 possa ser obtida de células de câncer, é preferível não usar células de câncer como uma fonte para produção (cf. por exemplo, referência não patente 5).

[004] Para resolver tais problemas, foi realizada uma tentativa para obter MMP-7 via uma tecnologia de DNA recombinante. Existem relatos de Barnett et al. de que MMP-7 é expressa em células CHO (cf. por exemplo, referência não patente 6), o relato de que, através de uso de um fragmento de ácido nucléico gerado através de ligação de uma sequência de nucleotídeos de uma sequência sinal de fosfatase alcalina a uma sequência gene de pró-matriz metaloproteinase 7(daqui por diante também referida como "proMMP-7") otimizada para utilização de códon de E. coli, proMMP-7 solúvel foi expressa a 34oC e proMMP-7 insolúvel foi expressa a 42oC (cf. por exemplo, referência patente 1) e o relato de que, através de uso de um fragmento de ácido nucléico gerado através de ligação de um peptídeo sinal modificado a um fragmento de gene de proMMP-7, pró-MMP-7 é expressa como um corpo de inclusão em uma grande quantidade (cf. por exemplo, referência patente 2).

[005] Para conversão de pró-MMP-7 em MMP-7 ativa, é reportado que pró-MMP-7 é aquecida a 37oC na presença de acetato (4-amino fenil) mercúrico (APMA) 1 mM ou tripsina 0,2 μM ou uma solução contendo pró-MMP-7 é aquecida a 53oC (cf. por exemplo, referência não patente 7). Eles revelaram que, após uma baixa concentração (menos que 1 mg/mL) de MMP-7 ativada (também conhecida como Matrilisina) ser estocada a -20oC por 6 meses e em temperatura ambiente por 28 dias, não houve mudança em sua atividade e comportamento sobre eletroforese. Embora não exista descrição definida sobre a mudança, eles parecem sugerir que nenhuma decomposição de Matrilisina foi observada a partir dos resultados de eletroforese. Em adição a estes, existem vários relatos sobre purificação de próMMP-7 e MMP-7 tal como Kihira, and Oneda et al. (cf. por exemplo, referência patente 1, referência não patente 8) e assim um método para a purificação de MMP-7 foi estabelecido em alguma extensão em um nível experimental. Em geral, um método para a purificação de MMP-7 em um nível experimental é aumentado para produção em larga escala. Entretanto, um método para a fabricação de MMP-7 em uma larga quantidade nunca foi estabelecido. Existe pouco relato sobre os problemas na fabricação de MMP-7 em uma larga quantidade e soluções para os mesmos.

[006] Uma composição compreendendo MMP-7, que compreende cloridrato de tris (hidróxi metil) amino metano (Tris cloridrato), cloreto de cálcio e cloreto de sódio é reportada (cf., por exemplo, referências patentes 3 a 5, referências não patentes 7, 9). É conhecido que metaloproteinase como MMP-7, em um estado de uma composição em solução, é estabilizada na coexistência de cloreto de cálcio e cloreto de sódio (cf., por exemplo, referência patente 6). Em particular, um medicamento é normalmente requerido ter uma pressão osmótica de ao redor daquela de fluido do corpo em vista de segurança. Cloreto de sódio é comumente usado como um regulador de pressão osmótica de uma composição líquida. Como uma questão prática, maior parte das composições mostradas nestes documentos compreende um composto de cátion monovalente tal como cloreto de sódio na concentração isotônica para ou mais que aquela de fluido de corpo. Além disso, as composições mostradas nestes documentos não compreendem álcoois de açúcares ou açúcares.

Referências de Patentes

[007] Referência patente 1: patente JP 2938352

[008] Referência patente 2: WO 2010/047347a1

[009] Referência patente 3: JP 2000-344672

[0010] Referência patente 4: JP 2000-226329

[0011] Referência patente 5: JP 2002-173424

[0012] Referência patente 6:

Referências não patente JP 2005-6509

[0013] Referência não patente 1: Soler et al., Biochem Biophys Res Commun, 1994, vol.201, p.917-923

[0014] Referência não patente 2: Ii et al., Exp Biol Med (Maywood), 2006, vol.231, p.20-27

[0015] Referência não patente 3: Haro et al., J Spinal Disord, 1999, vol.13, p.245-249

[0016] Referência não patente 4: Haro et al., J Orthop Res, 2005, vol.23, p.412-419

[0017] Referência não patente 5: Miyazaki et al., Cancer Research, 1990, vol.50, p.7758-7764

[0018] Referência não patente 6: Barnett et al., Protein Exp Purif, 1994, vol.5, p.27-36

[0019] Referência não patente 7: Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol.31, p.8500-8507

[0020] Referência não patente 8: Oneda et al., J Biochem, 1999, vol.126, p.905-911

[0021] Referência não patente 9: Browner et al., Biochemistry, 1995, vol.34, p.6602-6610

Descrição da Invenção (Problema Técnico a ser Resolvido pela Invenção)

[0022] No curso do desenvolvimento de um medicamento compre endendo MMP-7, os presentes inventores verificaram que MMP-7 forma agregados sob as circunstâncias onde um composto de cátion monovalente como cloreto de sódio está em 150 mM ou mais o qual é isotônico àquele de fluido do corpo, como no caso dos convencionais produtos medicinais, especialmente uma composição líquida de metaloproteinase como descrita acima e que MMP-7 é adsorvida a gel em uma aparelhagem normalmente usada para a fabricação de proteínas ou suas preparações ou a um recipiente tal como um frasco normalmente usado para estocagem de preparações. Assim, o problema foi prover um método para monomerização de agregados de MMP-7 onde adsorção de MMP-7 para uma aparelhagem de fabricação é suprimida no momento quando MMP-7 é fabricada, um método para preparação de MMP-7 que envolve o dito método para monomerização de agregados de MMP-7, e uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 onde formação de agregado e adsorção de MMP-7 são suprimidas.

(Meios Solução de Problemas)

[0023] Os presentes inventores investigaram intensamente de modo a resolver os problemas acima e como um resultado verificaram os seguintes (1) a (4) para completar a presente invenção.

[0024] (1) Agregados de MMP-7 são dissociados para formação de monômeros através de tratamento com uma solução tal como um tampão Tris (pH 6 a 8) compreendendo uma baixa concentração de um cloreto de cátion monovalente (cloreto de sódio e cloreto de potássio). Também, agregados de MMP-7 da mesma maneira formam monômeros quando eles são tratados com a solução não compreendendo um cloreto de cátion monovalente.

[0025] (2) Através de incorporação de um método para monomerização de agregados de MMP-7 com o tratamento como mencionado acima (daqui por diante também simplesmente referido como "um método para monomerização") em um método de fabricação de MMP-7, eficiência em produção de MMP-7 pode ser aumentada. Em particular, através de incorporação de método para monomerização em um método de tratamento com membrana de ultrafiltração imediatamente após conversão de próMMP-7 em MMP-7 através de auto ativação, efeitos mais significantes podem ser obtidos.

[0026] (3) Monômeros MMP-7 mantêm uma alta atividade enzimática.

[0027] (4) Através de adição de açúcares ou álcoois de açúcar como manitol e sucrose para o tampão Tris como mencionado acima, não somente formação de agregados MMP-7 é suprimida mas também adsorção de MMP-7 a gel e a parede de um frasco é suprimida. Por exemplo, através de preparação de uma composição compreendendo um cloreto de cátion monovalente em uma concentração ao redor de 150 mM que é isotônica com aquela de fluido de corpo ou menos quando feita para uma solução aquosa e álcoois de açúcar ou açúcares, a resultante solução se torna uma preparação farmacêutica onde formação de agregados de MMP-7 e adsorção de MMP-7 são suprimidas.

[0028] Da mesma maneira, a presente invenção abrange um método para monomerização de agregados de MMP-7 (método para monomerização), um método para preparação de MMP-7 que envolve o dito método para monomerização e uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 preparada através do uso de tampão mencionado anteriormente e refere-se ao seguinte:

[0029] [1] Um método para monomerização de agregados de matriz metaloproteinase 7 (MMP-7) que compreende tratamento de agregados de MMP-7 com uma solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 130 mM ou menos ou com uma solução não compreendendo um composto de cátion monovalente.

[0030] [2] O método para monomerização de acordo com {1] onde os agregados de MMP-7 são tratados com uma solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 130 mM ou menos.

[0031] [3] O método para monomerização de acordo com [1] onde os agregados de MMP-7 são tratados com uma solução não compreendendo um composto de cátion monovalente.

[0032] [4] O método para monomerização de acordo com [1] ou [2] onde o composto de cátion monovalente está em 100 nM ou menos.

[0033] [5] O método para monomerização de acordo com [1], [2] ou [4] onde o composto de cátion monovalente é pelo menos 80 mM ou menos.

[0034] [6] O método para monomerização de acordo com [1], [2], [4], ou [5] onde o composto de cátion monovalente está em 40 mM ou menos.

[0035] [7] O método para monomerização de acordo com [1], [2], [4], [5] ou [6] onde o composto de cátion monovalente é selecionado do grupo consistindo em cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, fosfato de sódio e fosfato de potássio.

[0036] [8] O método para monomerização de acordo com [1], [2], [4]. [5] ou [6] onde o composto de cátion monovalente é de um cloreto de cátion monovalente.

[0037] [9] O método para monomerização de acordo com [8] onde o composto de cátion monovalente é selecionado do grupo consistindo em cloreto de sódio e cloreto de potássio.

[0038] [10] O método para monomerização de acordo com qual quer uma de [1] a [9] onde a solução ainda compreende cloreto de cálcio.

[0039] [11] Método para monomerização de acordo com [10] onde o cloreto de cálcio está em 30 mM ou menos.

[0040] [12] O método para monomerização de acordo com qualquer uma de [1] a [11] onde a solução é uma solução tampão.

[0041] [13] O método para monomerização de acordo com [12] onde a solução tampão é tampão Tris 5 a 25 mM.

[0042] [14] O método para monomerização de acordo com qual quer uma de [1] a [13] onde a MMP-7 é pelo menos 20 mg/mL ou menos.

[0043] [15] Método para monomerização de acordo com [13] ou [14] onde a solução é tampão Tris 5 a 25 mM (pH 6 a 8) compreendendo cloreto de sódio 30 a 40 mM e cloreto de cálcio 5 a 30 mM.

[0044] [16] O método para monomerização de acordo com qualquer uma de [1] a [15] onde a solução ainda compreende álcoois de açúcares e/ou açúcares.

[0045] [17] O método para monomerização de acordo com [16] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares são selecionados do grupo consistindo em sucrose, lactose, maltose, xilose, trealose, manitol, sorbitol, xilitol, maltitol, lactitol, e álcoois oligossacarídeos.

[0046] [18] O método para monomerização de acordo com [16] ou [17] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares estão em 2% ou mais.

[0047] [19] O método para monomerização de acordo com [18] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares estão em 2 a 7%.

[0048] [20] O método para monomerização de acordo com qualquer uma de [17] a [19] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares são manitol ou sucrose.

[0049] [21] O método para monomerização de acordo com [20] onde o manitol está em 2 a 5% e a sucrose está em 2 a 7%.

[0050] [22] Um método para preparação de MMP-7 que compreende uma etapa consistindo no método para monomerização como mostrado em qualquer uma de [1] a [21].

[0051] [23] O método para preparação de acordo com [22] onde a etapa é realizada após uma etapa de tratamento usando uma solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 130 mM ou mais.

[0052] [24] O método para preparação de acordo com [22] ou [23] onde o método compreende as seguintes etapas (1) a (5):

[0053] (1) uma etapa de interrupção de células produzindo corpo de inclusão de próMMP-7;

[0054] (2) uma etapa de tratamento de dissolução / redobra de corpo de inclusão de pró-MMP-7;

[0055] (3) uma etapa de purificação de próMMP-7;

[0056] (4) uma etapa de autoativação de próMMP-7 em MMP-7; e

[0057] (5) uma etapa consistindo no método para monomerização como mostrado em qualquer uma de [1] a [21].

[0058] [25] O método para preparação de acordo com [24] onde a etapa (5) é uma etapa de concentração usando membrana de ultrafiltração.

[0059] [26] Uma composição (farmacêutica) compreendendo matriz metaloproteinase 7 (MMP-7) como um ingrediente ativo em uma solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 130 mM ou menos ou em uma solução não compreendendo um composto de cátion monovalente.

[0060] [27] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [26] onde a composição compreende MMP-7 como um ingrediente ativo em uma solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 130 mM ou menos.

[0061] [28] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [26] onde a composição compreende MMP-7 como um ingrediente ativo em uma solução não compreendendo um composto de cátion monovalente.

[0062] [29] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [26] ou [27] onde o composto de cátion monovalente é selecionado do grupo consistindo em cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, fosfato de sódio e fosfato de potássio.

[0063] [30] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [26] ou [27] onde o composto de cátion monovalente é de um cloreto de cátion monovalente.

[0064] [31] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [30] onde o composto de cátion monovalente é selecionado do grupo consistindo em cloreto de sódio e cloreto de potássio.

[0065] [32] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com qualquer uma de [26] a [31] onde a composição ainda compreende cloreto de cálcio.

[0066] [33] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [32] onde o cloreto de cálcio está em 30 mM ou menos.

[0067] [34] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com qualquer uma de [26] a [33] onde a solução é uma solução tampão.

[0068] [35] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [34] onde a solução tampão é tampão Tris 5 a 25 mM.

[0069] [36] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com qualquer uma de [26] a [35] onde a MMP-7 está em 20 mg/mL ou menos.

[0070] [37] A Composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [36] onde a MMP-7 está em 1 μg/mL a 1 mg/mL.

[0071] [38] A composição farmacêutica compreendendo MMP-7 de acordo com [35], [36] ou [37] onde a solução é tampão Tris 5 a 25 mM (pH 6 a 8) compreendendo cloreto de sódio 30 a 40 mM e cloreto de cálcio 5 a 30 mM.

[0072] [39] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com qualquer uma de [26] a [38] onde a solução ainda compreende álcoois de açúcares e/ou açúcares.

[0073] [40] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [39] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares são selecionados do grupo consistindo em sucrose, lactose, maltose, xilose, trealose, manitol, sorbitol, xilitol, maltitol, lactitol, e álcoois de oligossacarídeo.

[0074] [41] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [39] ou [40] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares estão em 2% ou mais.

[0075] [42] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [41] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares estão em 2 a 7%.

[0076] [43] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com qualquer uma de [40] a [42] onde os álcoois de açúcares e/ou açúcares são manitol ou sucrose.

[0077] [44] A composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 de acordo com [43] onde o manitol está em 2 a 5% e a sucrose está em 2 a 7%.

[0078] [45] Uma composição (farmacêutica) sólida compreen dendo MMP-7 onde a composição pode ser dissolvida em um solvente e a composição com dissolução é a composição mostrada em qualquer uma de [26] a [44].

[0079] [46] Um medicamento para tratamento de deslocamento de disco intervertebral que compreende a composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 como mostrada em qualquer uma de [26] a [45].

Efeitos da Invenção

[0080] De acordo com a presente invenção, um método para monomerização de agregados de MMP-7 com facilidade é provido. Assim, através de incorporação de método em um método de fabricação de MMP-7, produtividade e eficiência de recuperação de MMP-7 podem ser aumentadas.

[0081] Além disso, MMP-7 como monomerizada através do método tem uma maior atividade específica de uma enzima como comparada a agregados de MMP-7 e assim pode ser um material apropriado para provimento de uma preparação de MMP-7 de alta qualidade.

[0082] Além disso, como uma realização da presente invenção, através de estocagem de MMP-7 em um tampão compreendendo cloreto de sódio em uma baixa concentração e álcoois de açúcares ou açúcares, MMP-7 não somente mantém sua forma monomérica mas também uma alta atividade enzimática, e também adsorção de MMP-7 para um recipiente de estocagem pode ser suprimida. Por isso, o tampão usado em um método para monomerização da presente invenção é útil como uma solução preservativa de uma preparação de MMP-7. A composição de MMP-7 da presente invenção, que compreende cloreto de sódio em uma baixa concentração quando feita para uma solução aquosa e álcoois de açúcares ou açúcares, é útil como uma composição líquida para uso medicinal e uma composição para preparação da mesma onde a formação de agregados de MMP-7 é suprimida e adsorção de MMP-7 a um recipiente é suprimida.

Breve Descrição dos Desenhos

[0083] A Fig. 1 mostra os efeitos supressivos de cloreto de sódio (NaCl) e cloreto de potássio (KCl) para formação de agregados de MMP-7 baseado nas análises de peso molecular de MMP-7 medido por dispersão dinâmica de luz.

[0084] A Fig. 2 mostra os efeitos de cloreto de cálcio (CaCl2) sobre supressão de formação de agregado de MMP-7 baseado na análise de peso molecular de MMP-7 medido por dispersão dinâmica de luz.

[0085] A Fig. 3 mostra os efeitos de uma concentração de MMP-7 sobre formação de agregado de MMP-7 baseado nas análises de peso molecular de MMP-7 medido por cromatografia de exclusão de tamanho.

[0086] A Fig. 4 mostra os efeitos de cloreto de sódio (NaCl) sobre a atividade enzimática de MMP-7 quando MMP-7 em 0,1 mg/mL, 2 mg/mL ou 20 mg/mL é diluída com um tampão Tris contendo NaCl 150 mM ou NaCl 40 mM.

[0087] A Fig. 5 mostra os efeitos supressivos de manitol para adsorção de MMP-7 para gel. A: tampão Tris 5 mM (pH 7) / CaCl2 10 mM / NaCl 40 mM; B: tampão Tris 5 mM (pH 7) / CaCl2 10 mM / NaCl 40 mM / manitol 3,5%.

[0088] A Fig. 6 mostra os efeitos supressivos de manitol e sucrose para adsorção de MMP-7 à parede de um frasco.

[0089] A Fig. 7 mostra os efeitos supressivos de manitol e sucrose em cada concentração para adsorção de MMP7 para a parede de um frasco.

[0090] A Fig. 8 mostra os efeitos de manitol e sucrose em cada concentração sobre a atividade enzimática de MMP-7.

[0091] A Fig. 9 mostra os efeitos de manitol sobre supressão de formação de agregado de MMP-7.

Melhor Modo Para Realização da Invenção

[0092] A presente invenção provê um método para monomeri- zação de agregados de MMP-7, um método para preparação de MMP- 7 que envolve o dito método de monomerização e uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7. A presente invenção é caracterizada por agregados de MMP-7 serem tratados com uma solução compreendendo uma baixa concentração de um composto cátion monovalente e ainda compreendendo álcoois de açúcares ou açúcares (daqui por diante também referidos como "uma solução para monomerização"), que MMP-7 é estocada na dita solução e que uma composição de MMP-7 compreende uma baixa concentração de um composto cátion monovalente e álcoois de açúcares ou açúcares quando tornada uma solução aquosa.

[0093] Detecção de agregados de MMP-7 é realizada através de medição de peso molecular de MMP-7 através de dispersão dinâmica de luz, cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação e semelhantes e comparação de peso medido com o peso molecular de MMP-7 monomérica (cerca de 19 kDa) calculado a partir da sequência de aminoácidos. Para a presente invenção, MMP-7 foi determinada ser monomérica em caso em que o peso molecular de MMP-7 em uma amostra está entre uma faixa de 19 kDa a 38 kDa enquanto MMP-7 foi determinada formar agregados em caso dela ser de 38 kDa ou mais. Os critérios acima de determinação são feitos levando em consideração de verdade de medição por dispersão dinâmica de luz de modo que MMP-7 evidentemente formou agregados quando o peso molecular é mais que aquele de um dímero enquanto MMP-7 é monomérica quando ele é menos que aquele de um dímero.

[0094] Monomerização de MMP-7 é realizada através de tratamento de agregados de MMP-7 com uma solução para monomerização. Como aqui usado, "tratamento de agregados de MMP-7 com uma solução para monomerização" significa que agregados de MMP-7 são expostos a uma solução para monomerização e inclui dissolução na dita solução e inclui que, quando agregados de MMP-7 são dissolvidos em uma solução contendo um composto de cátion monovalente em uma alta concentração de 130 mM ou mais, troca de tampão é conduzida com membrana de ultrafiltração ou membrana de diálise usando uma solução para monomerização. Para um tampão para manter o pH constante da solução para monomerização, é possível usar tampão Tris, tampão fosfato, tampão glicina, e tampão ácido carbônico, entre os quais um tampão apropriado pode ser selecionado dependendo do pH no tratamento de monomerização. Uma concentração de um tampão pode estar em uma faixa de 5 a 25 mM, preferivelmente 5 a 20 mM. O pH pode estar em uma faixa de 5 a 9, preferivelmente 6 a 8. Mais preferivelmente, um tampão Tris é selecionado que exerce um efeito sobre aperfeiçoamento de estabilidade de metaloproteinase com o tampão Tris tendo uma concentração de 5 a 10 mM e pH de 6 a 8 (cf. JP 2011-521906).

[0095] Como aqui usado, "um composto de cátion monovalente" significa um composto consistindo em um cátion monovalente e um ânion de contraparte, incluindo cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio e semelhantes. Também, como aqui usado, "um cloreto de cátion monovalente" significa um composto consistindo em um cátion monovalente e um íon cloreto. Para um composto de cátion monovalente como aqui usado, qualquer composto de cátion monovalente pode ser usado, mas preferivelmente é usado um cloreto de cátion monovalente. Especificamente, cloreto de sódio e cloreto de potássio, preferivelmente cloreto de sódio é usado.

[0096] Para dissociação de agregados de MMP-7 em MMP-7 monomérica, uma baixa concentração de um composto de cátion monovalente é usada. MMP-7 dissociada em monômeros é mantida como monômeros em uma solução para monomerização compreendendo uma baixa concentração de um composto de cátion monovalente. O mesmo efeito pode ser obtido através do uso de uma solução para monomerização ou água não compreendendo um composto de cátion monovalente. Por isso, a presente invenção abrange um método para monomerização de agregados de MMP-7 usando uma solução para monomerização, cuja solução inclui líquido tal como água de acordo com a presente invenção, não compreendendo um composto de cátion monovalente. Daqui por diante, uma solução compreendendo uma baixa concentração de um composto de cátion monovalente e a solução não compreendendo um composto de cátion monovalente também são coletivamente referidas meramente como "uma solução para monomerização".

[0097] Através de adição de um composto de cátion polivalente a uma solução para monomerização, uma faixa de uma concentração de um composto de cátion monovalente a ser tratado pode ser ampliada. Um composto de cátion polivalente é preferivelmente um composto de cátion divalente, mais preferivelmente um composto de íon cálcio divalente, e mais preferivelmente cloreto de cálcio. Como um composto de cátion monovalente, "um composto de cátion polivalente" significa um composto consistindo em um cátion polivalente e um ânion contraparte.

[0098] Especificamente, no caso onde água é usada como uma solução parra monomerização, um composto de cátion monovalente em 40 mM ou menos é usado e, através de adição de cloreto de cálcio a uma solução para monomerização, tratamento com uma solução para monomerização compreendendo um composto de cátion monovalente em mais que 40 mM torna-se possível. Mais especificamente, uma solução para monomerização compreendendo um composto de cátion monovalente em 80 mM ou menos quando ela compreende cloreto de cálcio 5 mM a 10 mM, a solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 100 mM ou menos quando ela compreende cloreto de cálcio 10 mM a 30 mM, e a solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 130 mM ou menos quando ela compreende cloreto de cálcio 30 mM, pode ser usada. Este resultado demonstra que, através de adição de cloreto de cálcio, o efeito de dissociação de agregados de MMP-7 em monômeros e o efeito supressivo para formação de agregado de MMP-7 foram aperfeiçoados. Além disso, pode ser visto a partir dos resultados de Exemplo 2 (Fig. 2) que este efeito é proporcional a uma concentração de cloreto de cálcio. Por exemplo, através de uso de uma maior concentração de cloreto de cálcio, maiores efeitos de monomerização de MMP-7 e manutenção de monômeros de MMP-7 podem ser esperados. A partir de acima, uma concentração de um composto de cátion monovalente é de 130 mM ou menos, preferivelmente 100 mM ou menos, mais preferivelmente 80 mM ou menos, e mais preferivelmente 40 mM ou menos, em caso de uma solução aquosa. Embora uma solução para monomerização possa não compreender um composto de cátion monovalente, a solução compreendendo um composto de cátion monovalente é preferível em vista de qualidade de uma composição farmacêutica.

[0099] De acordo com a presente invenção, uma solução para monomerização consistindo em tampão Tris 5 a 25 mM (pH 6 a 8) compreendendo cloreto de sódio 30 a 40 mM e cloreto de cálcio 5 a 30 mM, ou a solução para monomerização sem cloreto de sódio, pode ser preferivelmente usada.

[00100] Um método para monomerização de agregados de MMP-7 da presente invenção pode ser incorporado em um método de fabricação de MMP-7 de modo a produzir eficientemente monômeros MMP-7 de alta qualidade. Um método genérico para produção de MMP-7 através de uma tecnologia de DNA recombinante é realizado através de etapas de cultura de células, liberação de corpos de inclusão, dissolução e redobra de corpos de inclusão, purificação de próMMP-7, conversão de próMMP-7 em MMP-7 através de auto ativação, purificação e concentração de MMP-7.

[00101] Mais especificamente, um método para monomerização de agregados de MMP-7 da presente invenção é usado em um método de fabricação de MMP-7 como descrito abaixo. Primeiramente, E. coli produzindo próMMP-7 é preparada. Em geral, ela pode ser preparada através de introdução de gene próMMP-7 inserido em um vetor de expressão em E. coli através de procedimento comum. Entretanto, uma vez que próMMP-7 tem uma potente toxidez contra E. coli, produtividade pode ser drasticamente diminuída. De modo a resolver este problema, adição de um peptídeo sinal no terminus-N de próMMP-7 é imaginada. Entretanto, no caso de próMMP-7, são observados fenômenos em que um nível de expressão de próMMP-7 não é aumentado meramente através de adição de um peptídeo sinal e uma porção de próMMP-7 expressa é decomposta. Tais fenômenos podem ser um obstáculo para estabelecimento de um método para eficiente produção de MMP-7. Por isso, como um material de partida para produção de MMP-7, é preferível usar E. coli produzindo próMMP-7 que tem um aumentado nível de expressão de próMMP-7 e aumentada supressão de decomposição de próMMP-7 por proteases. Tal E. coli produzindo próMMP-7 pode ser preparada através do método descrito em WO2010/047347 (mais especificamente, cf. preparação ali).

[00102] A E. coli assim obtida produzindo próMMP-7, após purificação por clonagem de repetição, é preservada como um banco de célula de trabalho e usada como uma semente para uma cultura em larga escala para produção de preparação de MMP-7. Um banco de célula de trabalho pode ser preservado sob condições normalmente usadas para preservação de E. coli recombinante, por exemplo, em uma solução contendo sulfóxido de dimetila 7 a 10% ou glicerol 10 a 50% em um congelador a -80oC a -20oC ou em nitrogênio líquido ou liofilizada em uma ampola a ser preservada em um refrigerador a 2 a 10oC.

[00103] Cultura de E. coli produzindo próMMP-7 em uma escala de produção é realizada em dois estágios, isto é, pré-cultura em uma pequena escala e cultura principal em uma larga escala. Para pré- cultura, meio LB comumente usado para E. coli recombinante, opcionalmente suplementado com antibióticos como ampicilina para retenção de plasmídeo, pode ser usado para propagação de E. coli produzindo próMMP-7. Entretanto, para cultura principal, um meio de cultura onde substância causadora de efeitos colaterais é removida tanto quanto possível é preferivelmente usado. Tal meio de cultura inclui, por exemplo, um meio de glicose contendo vários metais em traços tais como magnésio, cálcio, cobre e sódio, meio LB, meio M9 e semelhantes. Condições de cultura podem ser aquelas apropriadas para propagação de E. coli, por exemplo, condições de cultura de pH (pH 6 a 8), temperatura (30o a 45oC) e tempo (4 a 16 horas). Estas condições de cultura podem ser apropriadamente ajustadas dependendo de uma escala de cultura e tratamento para indução de expressão. Um indutor de expressão é usado para eficiente expressão de próMMP-7 e inclui isopropil-β-tio galacto piranosídeo (IPTG), lactose e semelhantes.

[00104] Para recuperação de MMP-7 de E. coli produzindo próMMP-7 cultivada e propagada em uma larga quantidade após cultura principal, os procedimentos descritos abaixo são realizados. Primeiramente, E. coli produzindo próMMP-7 é cultivada e as células propagadas são interrompidas através de uma medida apropriada de modo a liberar os corpos de inclusão consistindo em próMMP-7 fora das células. Para interrupção de células, lise com substância química (por exemplo, EDTA como um agente quelante), tensoativo (por exemplo, Triton X100) e enzima (por exemplo, lisozima) ou tratamento físico com prensa Francesa, sonificação e semelhantes podem ser usados. Através de combinação de vários destes procedimentos, células podem ser rompidas mais eficientemente. Uma solução obtida após rompimento de células incluindo corpos de inclusão é submetida a fracionamento com membrana de ultrafiltração ou centrífuga para repetição de concentração e lavagem para remoção de maioria de componentes de célula. Para lavagem, um tampão comumente usado tal como tampão Tris, tampão fosfato, tampão glicina, tampão ácido carbônico pode ser usado. Para um tamanho de poro de membrana de ultrafiltração e as condições de centrífuga, existem muitos relatórios aos quais pode ser feito referência. Em caso de tratamento em uma larga quantidade, corpos de inclusão são preferivelmente recuperados por fracionamento com membrana de ultrafiltração.

[00105] Os corpos de inclusão recuperados são temporariamente dissolvidos em uma solução contendo um agente redutor e um agente de desnaturação. Para tal agente redutor, cisteína, glutationa, ditiotreitol, 2-mercapto etanol e semelhantes podem ser usados. Vários destes podem ser usados em combinação. Uma concentração de um agente redutor pode depender de uma quantidade de corpos de inclusão a serem dissolvidos e pode estar em uma faixa de 10 a 200 mM. Para um agente de desnaturação, uréia, cloridrato de guanidina e semelhantes podem ser usados. Uréia e cloridrato de guanidina podem ser usados em uma concentração de 4 a 8 M e 2 a 6 M, respectivamente. Para um tampão, um que é usado para recuperação de corpos de inclusão tais como, por exemplo, tampão fosfato e tampão Tris (pH 7,0 a 9) pode ser usado. Temperatura enquanto dissolvendo não é particularmente limitada contanto que ela seja 40oC ou menor. Tempo de dissolução pode ser fixado vendo as condições de dissolução de corpos de inclusão. Normalmente, a solução é agitada por 30 minutos a 1 hora.

[00106] A seguir, redobra de próMMP-7,isto é, construção de estrutura estérea normal, é realizada através de adição de um tampão de redobra contendo um tensoativo e íons de metal à solução de corpos de inclusão. Brij 35 como tensoativo e acetato de zinco ou cloreto de cobalto como íons de metal são usados em uma concentração de 0,5 a 2% e 0,05 mM a 0,2 mM, respectivamente. Um tipo e uma concentração de um tampão usado para redobra podem ser os mesmos como aqueles usados quando corpos de inclusão são dissolvidos. Tratamento de redobra é realizado deixando-se a solução em repouso por um dia ou mais.

[00107] Para purificação de próMMP-7 a partir da solução de redobra, procedimentos de purificação comumente usados em química de proteína tal como centrífuga, precipitação de sal, ultrafiltração, precipitação isoelétrica, eletroforese, cromatografia de troca de íons, cromatografia de filtração com gel, cromatografia de afinidade, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de hidróxi apatita e semelhantes podem ser usadas em combinação. próMMP-7 na presente invenção pode ser purificada através das etapas consistindo em cromatografia de troca de íons, cromatografia hidrofóbica e tratamento com membrana de ultrafiltração. Ambas cromatografias podem ser feitas em uma maneira comum. Uma quantidade das proteínas e polipeptídeos obtidos pode ser medida com um reagente para medição de proteína tal como BCA Protein Assay Reagente Kit (Pierce Biotechnology, Inc.) e Protein Assay Kit (BIO-RAD, Inc).

[00108] A seguir, conversão de próMMP-7 em MMP-7 é realizada. Um método para conversão inclui aquecimento de uma solução contendo próMMP-7 a 37oC na presença de 1 mM de acetato de (4- amino fenil) mercúrico (APMA) ou tripsina 0,2 μM ou aquecimento de uma solução contendo próMMP-7 a 53oC (Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507), qualquer um de cujos métodos pode ser usado. Neste momento, cloreto de sódio 30 a 200 mM pode ser opcionalmente adicionado (Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507, WO 2010/047347 A1). Tempo de aquecimento está em uma faixa de 1 a 5 horas e é apropriadamente ajustado dependendo de uma concentração e uma quantidade a ser tratada de um reagente e próMMP-7. Para tripsina, uma tratada com N-tosil-L-fenil alanina cloro metil cetona (TPCK) pode ser usada.

[00109] Para medição de uma atividade enzimática de MMP-7, clivagem de um substrato fluorescente (Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala- D-Arg-NH2; SEQ ID NO: 7) por MMP-7 pode ser medida com uma aparelhagem de medição de fluorescência (Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507). Praticamente, Kit para medição de atividade de MMP-7 (ANASPEC) baseado no princípio acima é comercialmente disponível. Assim, a atividade pode ser medida usando este kit de acordo com o protocolo ligado ao mesmo. Para isolamento e purificação de MMP-7 convertida de próMMP-7, os procedimentos de purificação de proteína como descritos acima podem ser usados.

[00110] MMP-7 quando convertida forma agregados em uma solução contendo uma alta concentração de um sal. Isto mais provavelmente ocorre em caso de uma concentração de MMP-7 em uma solução ser 1 mg/mL ou mais. A presença de agregados de MMP-7 conduz à diminuição em produtividade e qualidade quando MMP-7 é fabricada e é feita para preparação de MMP-7. Como descrito acima, agregados de MMP-7 são monomerizados e monômeros de MMP-7 são mantidos em uma solução para monomerização contendo um composto de cátion monovalente em 130 mM ou menos na presença de cloreto de cálcio. Entretanto, na solução contendo um composto de cátion monovalente em uma concentração de mais que 130 mM, é sugerido que a possibilidade para formar agregados de MMP-7 é alta. Por isso, um método para monomerização da presente invenção é incorporado após tratamento com um composto de cátion monovalente em130 mM ou mais. Mais especificamente, ele é incorporado imediatamente após conversão de próMMP-7 em MMP-7 através de auto ativação.

[00111] O tratamento através de um método para monomerização da presente invenção é preferivelmente feito para MMP-7 em 20 mg/mL ou menos. Quando MMP-7 em20 mg/mL ou mais é tratada, entretanto, como descrito acima, o mesmo efeito supressivo para formação de agregado de MMP-7 pode ser esperado através de ajuste de uma concentração de cloreto de cálcio.

[00112] Uma solução contendo os monômeros de MMP-7 assim preparados, após as etapas de purificação e concentração de MMP-7 por membrana de ultrafiltração quando necessário, é usada como um material de partida para produção de preparação de MMP-7. Também nas etapas, uma solução para monomerização da presente invenção pode ser usada. Uma vez MMP-7 seja monomerizada, monômeros de MMP-7 são mantidos tanto quanto eles estejam presentes em uma solução para monomerização e a diminuição da atividade enzimática não seja observada por um longo período de tempo. Assim, uma solução para monomerização da presente invenção pode ser usada para preservação de MMP-7 antes de produção de preparação de MMP-7 e para a fabricação de uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 como um ingrediente ativo para pelo que permitir manutenção de MMP-7 de alta qualidade.

[00113] Em um método para monomerização de agregados de MMP-7 e um método para preparação de MMP-7 que envolve o dito método para monomerização da presente invenção, álcoois de açúcares e açúcares exercem o efeito supressivo para adsorção de MMP-7 para gel amplamente usado na fabricação de MMP-7 e o efeito supressivo para adsorção de MMP-7 para a parede de um frasco usado para a produção de preparação de MMP-7. Tais álcoois de açúcares e açúcares incluem sucrose, lactose, maltose, xilose, trealose, manitol, sorbitol, xilitol, maltitol, lactitol, álcoois de oligossacarídeos, e semelhantes, preferivelmente manitol e sucrose, e mais preferivelmente manitol.

[00114] No caso onde uma baixa concentração (por exemplo, 1 micrograma / mililitro a 1 miligrama / mililitro) de MMP-7 é feita para preparação de MMP-7, a perda de MMP-7 devido sua adsorção à parede de um frasco é imaginada e assim é particularmente efetivo que uma solução para monomerização contenha álcoois de açúcares e açúcares como descrito acima. No caso de MMP-7, álcoois de açúcares ou açúcares são adicionados em 2% ou mais onde o efeito supressivo para adsorção às paredes de um frasco é exercido ou em 2 a 7% onde uma pressão osmótica no corpo pode ser ajustada. De acordo com a presente invenção, uma solução para monomerização é usada que contém 2 a 5% de manitol ou 2 a 7% de sucrose onde a atividade de MMP-7 pode ser mantida. Mais preferivelmente, uma solução para monomerização é usada que consiste em tampão Tris 5 a 25 mM (pH 6 a 8) contendo manitol 2 a 5%, cloreto de sódio 30 a 40 mM e cloreto de cálcio 5 a 30 mM.

[00115] MMP-7 dissolvida na dita solução para monomerização pode ser usada como ela está como uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 da presente invenção. Uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 preferivelmente compreende 2% ou mais álcoois de açúcares e/ou açúcares e um composto de cátion monovalente (cloreto de sódio ou cloreto de cálcio) em 30 a 40 mM em vista de supressão para formação de agregado de MMP-7, manutenção da atividade de MMP-7, supressão de adsorção de MMP- 7 para um recipiente, e assegurando qualidade como uma composição farmacêutica aquosa. Mais especificamente, em caso de uma concentração de MMP-7 ser de 20 miligramas / mililitro ou menos, uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 da presente invenção preferivelmente compreende 2 a 5% de manitol ou 2 a 7% de sucrose, cloreto de sódio 30 a 40 mM e cloreto de cálcio 5 a 30 mM. Uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 da presente invenção pode ser estocada em forma líquida, liofilizada ou congelada. Assim fazendo, de modo a manter segurança e isotonicidade como um medicamento, uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP- 7 é ainda adicionada com um composto que é admitido para administração a humanos e outros animais tais como um agente estabilizante, agente de isotonicidade e um preservativo. Uma composição (farmacêutica) compreendendo MMP-7 da presente invenção pode abranger uma composição sólida que pode ser dissolvida em um solvente e a composição com dissolução é a composição (farmacêutica) líquida compreendendo MMP-7 da presente invenção como descrita acima. Uma composição sólida é obtida através de remoção de um solvente a partir de uma composição (farmacêutica) líquida compreendendo MMP-7 da presente invenção através de liofilização. Um solvente é um definido como um solvente em Dictionary of Pharmaceutical Excipients e inclui água, etanol e semelhantes.

[00116] A composição (farmacêutica) assim obtida compreendendo MMP-7 da presente invenção tem uma atividade enzimática específica de MMP-7 com supressão de formação de agregado de MMP-7 e supressão de adsorção e pode ser usada como um medicamento para tratamento ou diagnóstico de deslocamento de disco intervertebral.

[00117] A presente invenção ainda é explicada em mais detalhes por meio dos seguintes exemplos, mas não é construída para ser limitada aos mesmos.

Exemplo de Preparação (1) Construção de vetor de expressão de próMMP-7 (pETMMP7) com APSP

[00118] Usando iniciadores P1 (SEQ ID NO: 1) e P2 (SEQ ID NO: 2), gene próMMP-7 em biblioteca de cDNA de rim (HumanMTC Panel I, Catalog#: K1420-1 BD) foi amplificado por PCR. Os DNAs amplificados foram inseridos em um vetor de clonagem (pCRII-TOPO, Invitrogen) e as sequências de nucleotídeos dos DNAs obtidos foram determinadas. A determinação das sequências de nucleotídeos foi realizada comum sequenciador de DNA. Busca de homologia entre as sequências de nucleotídeos determinadas e a sequência de nucleotídeos de próMMP-7 registrada em base de dados (Números de Acesso: NM002423) foi realizada para render um plasmídeo (pCRproMMP-7) onde gene próMMP-7 foi inserido.

[00119] A seguir, usando pCRpróMMP-7 como um molde e iniciador P3 (SEQ ID NO: 3), que consiste em uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição NdeI, uma sequência de nucleotídeos codificando sequência de peptídeo sinal PhoA-alcalina fosfatase (APSP) e a sequência terminal-N de próMMP-7, um iniciador P4 (SEQ ID NO: 4), que consiste em uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição BamHI e a sequência terminal C de próMMP-7, PCR foi realizada. Os DNAs amplificados da mesma maneira como acima foram inseridos em um vetor de clonagem e as sequências de nucleotídeos dos DNAs obtidos foram determinadas. Após confirmação de que nenhuma mudança na sequência de nucleotídeos ocorreu, os plasmídeo obtido foi clivado com enzimas de restrição NdeI e BamHI e o fragmento obtido foi inserido em um vetor de expressão pET22b (Merck, product cord; 69744-3) previamente clivado com as mesmas enzimas de restrição para render um plasmídeo (pETMMP7) onde gene próMMP-7 foi inserido.

(2) Construção de vetor de expressão pETMMP7 (L13P-A21E) com APSP modificada e expressão

[00120] Usando GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen) de acordo com protocolo ligado ao mesmo, mutação foi introduzida em uma sequência de reconhecimento de sinal peptidase de sequência APSP (Met - Lys - Gln - Ser - Thr - Ile - Ala - Leu - Ala - Leu - Leu - Pro - Leu - Leu - Phe - Thr - Pro - Val - Thr - Lys - Ala; SEQ ID NO: 8) em pETMMP7 obtida em (1) acima [leucina (Leu) em posição 13 da sequência de aminoácidos de APSP foi substituída com prolina (Pro) e alanina (Ala) em posição 21 foi substituída com ácido glutâmico (Glu)]. Para modificação de APSP, as sequências de M2 (SEQ ID NO: 5) como um iniciador 5' e P6 (SEQ ID NO: 6) como um iniciador 3' foram usadas. E. coli foi transformada com o pETMMP7 obtido (L13P-A21E) com APSP modificada para render uma E. coli recombinante (MMP7L13P-A21E)expressando próMMP-7.

[00121] Indução de expressão foi realizada com Overnight Express Autoinduction System 1 (Merck; product cord 71300-3) de acordo com protocolo ligado ao mesmo. Em resumo, cada colônia foi suspensa em 50 mL de meio LB contendo 50 microgramas / mililitro de ampicilina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em frasco Erlenmeyer de 125 mL, os reagentes de Kit foram adicionados e o frasco foi incubado a 37oC por 16 horas. OD de 600 nm da suspensão de células foi medida e as células correspondendo a OD de 600 nm = 20, 1 mL foram coletadas em precipitados através de centrifugação. Os precipitados foram interrompidos com 200 microlitros de BugBuster e centrifugados para renderem precipitados. Os precipitados foram solubilizados com tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS (SDS-PAGE), submetidos a SDS-PAGE em gel de acrilamida 15% e manchamento CBB foi feito. Como um resultado, o aumento em um nível de expressão de próMMP-7 e o aperfeiçoamento dos efeitos supressivos para decomposição foram confirmados.

[00122] Neste Exemplo de Preparação, os iniciadores com as seguintes sequências foram usados.

[00123] P1: ccataggtcc aagaacaatt gtctctg (SEQ ID NO: 1)

[00124] P2: caatccaatg aatgaatgaa tggatg (SEQ ID NO: 2)

[00125] P3: catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc aaggccctgc cgctgcctca g (SEQ ID NO: 3)

[00126] P4: ggatccctat ttctttcttg aattac (SEQ ID NO: 4)

[00127] M2: ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc (SEQ ID NO: 5)

[00128] P6: cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag (SEQ ID NO: 6)

Exemplo 1 Efeito supressivo para formação de agregado de MMP-7 através de cloreto de cátion monovalente (1) Fabricação de MMP-7

[00129] E. coli (MMP7L13P-A21E) expressando próMMP-7 obtida através dos procedimentos descritos em Exemplo de Preparação foi cultivada e propagada como uma semente em um meio de glicose e indução de expressão de próMMP-7 foi realizada com isopropil-β- tiogalacto piranosídeo (IPTG). As células foram recuperadas da solução de cultura e rompidas com prensa Francesa. A solução obtida após rompimento de células foi centrifugada e corpos de inclusão foram recuperados em precipitados. A seguir, os corpos de inclusão foram dissolvidos em cloridrato de guanidina 6 M contendo Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) e ditiotreitol 0,1 M e redobrados com tampão HEPES 50 mM (pH 7,5) contendo acetato de zinco 0,1 mM, cloreto de cálcio 10 mM, cloreto de sódio 0,2 M e Brij 35 1,0%. A seguir, próMMP-7 foi purificada através de cromatografia de troca de íons e cromatografia hidrofóbica em uma maneira comum. A próMMP-7 obtida foi aquecida a 47oC a 48oC para auto ativação para render MMP-7. A MMP-7 obtida foi submetida a repetição de diluição e concentração com membrana de ultrafiltração usando tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo NaCl 40 mM, CaCl2 10 mM e manitol 3,5% e estocada a -80oC.

(2) Medição de agregados de MMP-7

[00130] A solução contendo uma alta concentração de MMP-7 obtida em (1) acima foi diluída com uma solução aquosa contendo cloreto de cálcio (CaCl2) 5 mM no qual cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio (KCl) foi dissolvido para preparar Amostra 1 e Amostra 2.

[00131] Amostra 1: 1 mg/mL MMP-7 / 5 mM CaCl2 / cada concentração de NaCl (10 a 160 mM)

[00132] Amostra 2: 1 mg/mL MMP-7 / 5 mM CaCl2 / cada concentração de KCl (10 a 160 mM)

[00133] Usando cada 100 microlitros das amostras acima, o efeito de cloreto de sódio e cloreto de potássio sobre a formação de agregados de MMP-7 foi investigado por dispersão dinâmica de luz (dispositivo: Wyatt Technology DynaPro (Protein Solutions) Titan, cell; Wyatt Technology 12 μL Cell 8,5 mm Centre Height, temperatura: 20oC). Um peso molecular de MMP-7 em cada amostra foi medido e analisado. MMP-7 com um peso molecular de 38 kDa ou menos foi determinada ser monomérica baseado no peso molecular de monômeros de MMP-7 (cerca de 19 kDa). Como um resultado, um peso molecular de MMP-7 em 10 mM a 80 mM de solução de NaCl foi de 20 a 29 kDa para revelar que MMP-7 estava presente como um monômero. Da mesma maneira, quando cloreto de potássio foi usado, os resultados foram obtidos que MMP-7 estava presente como um monômero em solução de KCl 10 mM a 80 mM (Fig. 1). A linha pontilhada na figura mostra um peso molecular de 38 kDa.

Exemplo 2 Efeito de cloreto de cálcio sobre supressão de formação de agregado de MMP-7

[00134] A solução de MMP-7 obtida em Exemplo 1-(1) foi diluída com uma solução aquosa na qual cloreto de cálcio e cloreto de sódio foram dissolvidos para preparação de Amostra 3.

[00135] Amostra 3: 1 mg/mL de MMP-7 / cada concentração de CaCl2 (0 a 30 mM) / cada concentração de NaCl (0 a 160 mM).

[00136] O efeito da presença de cada concentração de cloreto de cálcio sobre supressão para formação de agregado de MMP-7 foi investigado como descrito em Exemplo 1-(2).

[00137] Como um resultado, foi mostrado que monômero de MMP-7 foi formado com 40 mM ou menos de NaCl em caso de 0 mM de CaCl2, com 80 mM ou menos de NaCl em caso de 5 mM de CaCl2, com 100 mM ou menos de NaCl em caso de 10 mM de CaCl2, com 120 mM ou menos de NaCl em caso de 20 mM de CaCl2, e com 130 mM ou menos de NaCl em caso de 30 mM de CaCl2. Além disso, também em caso de diluição com água sozinha, a formação de monômero de MMP-7 foi observada. Assim, foi revelado que agregados de MMP-7 foram formados na presença de 130 mM ou mais de NaCl mas a coexistência de 30 mM ou menos (até 30 mM) de CaCl2 suprimiu a formação de monômeros de MMP- 7. Por exemplo, esta concentração de cloreto de cálcio tem o efeito de manter e estabilizar monômeros de MMP-7 mais efetivamente (Fig. 2).

Exemplo 3 Efeito de concentração de MMP-7 sobre formação de agregado de MMP-7

[00138] A solução de MMP-7 obtida no Exemplo 1-(1) foi diluída com uma solução contendo CaCl2 10 mM e cada concentração de cloreto de sódio para preparar Amostra 4 contendo cada concentração de MMP-7.

[00139] Amostra 4: cada concentração de MMP-7 (10, 15, 20 mg/mL) / 10 mM CaCl2 / cada concentração de NaCl (50 a 250 mM).

[00140] O efeito de uma concentração de MMP-7 sobre o efeito supressivo para formação de agregado de MMP-7 foi investigado por cromatografia de exclusão de tamanho (dispositivo HPLC; HEWLETT PACKED 1100 series, carreador; TOYOPARL HW50S, temperatura: 25oC, taxa de fluxo 0,5 mL / minuto, comprimento de onda de 280 nm). Um tamanho de coluna foi de 5 mm de diâmetro e 150mm de comprimento e equilíbrio de coluna foi conduzido com uma solução contendo Tris-HCl 5 mM (pH 7), CaCl2 10 mM, manitol 3,5% e NaCl 40 a 500 mM.

[00141] Sob estas condições, proteínas com um peso molecular de 60 kDa a 80 kDa aparecem em volume vazio (1,8 minutos após início de cromatografia). Assim, um pico na vizinhança de 2 minutos após início de cromatografia (ou pico líder) foi considerado ser de agregados de MMP-7 e, usando uma área do pico como um índice, uma concentração de cloreto de sódio com a qual agregados de MMP-7 foram formados foi calculada.

[00142] Como um resultado, foi verificado que, embora o efeito supressivo de cloreto de sódio para formação de agregado de MMP- 7 tenha enfraquecido dependendo de uma concentração de MMP-7, MMP-7 estava presente como monômeros com 0 a 80 mM de NaCl em caso de MMP-7 em 20 mg/mL ou menos (Fig. 3). A partir de resultados de Exemplo 2 (Fig. 2), é evidente que uma concentração de cloreto de sódio com a qual monômeros de MMP-7 são mantidos aumenta proporcionalmente com o aumento de uma concentração de cloreto de cálcio. No presente exemplo, se CaCl2 30 mM é usado, é assumido que MMP-7 em 20 mg/mL existe como monômeros mesmo na presença de NaCl 100 mM. Além disso, quando MMP-7 em mais que 20 mg/mL é usada, é assumido que MMP-7 pode ser mantida como monômeros através de aumento de uma concentração de cloreto de cálcio.

[00143] O mesmo experimento como acima foi conduzido após Amostra 4 ser deixada em repouso a 4oC por toda noite para render os mesmos resultados como na Fig. 3.

Exemplo 4 Efeito de formação de agregado de MMP-7 sobre atividade enzimática

[00144] A solução de MMP-7 obtida em Exemplo 1-(1) foi diluída com tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo NaCl 40 mM e CaCl2 10 mM para preparar Amostra 5 contendo cada concentração de MMP-7.

[00145] Amostra 5: cada concentração de MMP-7 (0,1, 2, 20 mg/mL) / CaCl2 10 mM / NaCl 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7)

[00146] As soluções contendo cada concentração de MMP-7 foram diluídas para 0,1 mg/mL com tampão Tris 50 mM (pH 7) contendo NaCl 150 mM e CaCl2 10 mM ou tampão Tris 10 mM (pH 7) contendo NaCl 40 mM e CaCl2 10 mM (diluição primária) e ainda diluída para 5 mg/mL com tampão Tris 50 mM (pH 7) contendo NaCl 150 mM e CaCl2 10 mM (diluição secundária).Para as diluições resultantes, uma atividade de clivagem para um substrato fluorescente (Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2; SEQ ID NO: 7) foram medidas usando Kit para medição de atividade de MMP-7 (ANASPEC) de acordo com o protocolo ligado ao mesmo.

[00147] Como um resultado, a atividade enzimática foi diminuída para MMP-7 em 2 mg/mL ou mais diluída com tampão Tris (pH 7) contendo NaCl 150 mM na diluição primária (Fig. 4). Esta diminuição na atividade enzimática é consistente com formação de agregado de MMP-7. Por outro lado, em uma concentração de 0,1 mg/mL ou menos, a diminuição na atividade enzimática não foi observada, sugerindo que formação de agregado por NaCl 150 mM não ocorre nesta concentração de MMP-7.

Exemplo 5 Efeito de concentração de cloreto de sódio sobre etapa de concentração de MMP-7 por membrana de ultrafiltração

[00148] A solução de MMP-7 obtida em Exemplo 1-(1) foi diluída com tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo CaCl2 10 mM para preparar Amostra 6 contendo cada concentração de cloreto de sódio.

[00149] Amostra 6: 4 mg/mL de MMP-7 / CaCl2 10 mM / cada concentração de NaCl (40 mM, 80 mM, 200 mM, 500 mM)) / tampão Tris 5 mM (pH 7).

[00150] Cada 4 mL de Amostra 6 foram concentrados com centrífuga (2500 g) usando membrana de ultrafiltração (Amicon Ultra-4 10K) e um volume de filtrado e absorbância do concentrado em um intervalo de tempo constante.

[00151] Como um resultado, MMP-7 pode ser concentrada em um menor tempo quando uma menor concentração de cloreto de sódio foi usada enquanto ela levou um maior tempo para concentração quando uma maior concentração de cloreto de sódio foi usada (Tabela 1). Na Tabela 1, o símbolo (-) representa o término de concentração. Tabela 1

Exemplo 6 Efeito supressivo de manitol sobre adsorção de MMP-7 (1) Supressão de adsorção de MMP-7 a gel

[00152] A solução de MMP-7 obtida no Exemplo 1-(1) foi diluída com tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo CaCl2 10 mM e NaCl 40 mM para preparar Amostra 7.

[00153] Amostra 7: 5,5 mg/mL de MMP-7 / CaCl2 10 mM / NaCl 40 mM

[00154] Amostra 7 (1 mL) foi aplicada a uma coluna (HW40F, 26x6 cm, Tosoh Corporation) previamente equilibrada com tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo CaCl2 10 mM, e NaCl 40 mM, e após lavagem com o tampão Tris, eluída com o tampão Tris contendo manitol 3,5% (taxa de fluxo: 5 mL / minuto).

[00155] Como um resultado, MMP-7 adsorvida a gel foi eluida por manitol (Fig. 5). Este resultado sugere que manitol tem um efeito supressivo para adsorção de MMP-7 a gel.

(2) Supressão para adsorção de MMP-7 para parede de recipiente

[00156] A solução de MMP obtida em Exemplo 1-(1) foi diluída com tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo CaCl2 10 mM, NaCl 40 mM e manitol ou sucrose para preparar soluções (1 mL) de Amostras 8 a 10 em frascos. As concentrações foram ajustadas de modo que cada amostra tenha a mesma pressão osmótica. Um controle foi a solução de MMP-7 diluída com o tampão Tris não contendo manitol e sucrose (Amostra 10).

[00157] Amostra 8: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCh 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7) / manitol 3,5%

[00158] Amostra 9: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCh 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7) / sucrose 6,6%

[00159] Amostra 10: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCI2 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7).

[00160] Após deixar em repouso em temperatura ambiente por 3 horas, cada soIução em frascos foi diIuída em duas etapas. Para diIuição primária, tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo CaCI2 10 mM e NaCI 40 mM foi usado. Para diIuição secundária, foi usado BIock Ace 1% (BIock Ace poder: DS Pharma BiomedicaI) / TBS-T (Tween 20 0,05% / Tris 50 mM / NaCI 150 mM). MMP-7 na soIução foi quantificada por ELISA. Para ELISA, anticorpo anti-MMP-7 coeIho obtido através de imunização de coeIho com MMP-7, anticorpo anti- MMP-7 de coeIho rotuIado com biotina onde o anticorpo anti-MMP-7 de coeIho foi rotuIado com reagente de rotuIação biotina (Biotin (Long Arm) NHS-Water SoIubIe: Vector Laboratories), streptavidina rotuIada com peroxidase de raiz forte (HRP) (Horseradish Peroxidase Streptavidin Concentrate: Vector Laboratories) e soIução substrato HRP (Peroxidase Substrate SoIution B: KPL). Como um controIe para reação ELISA, padrão MMP-7 para ELISA com uma concentração fixa de MMP-7 foi usado. Uma concentração de MMP-7 foi caIcuIada através de medição de absorção.

[00161] Como um resuItado, como comparado a nenhuma adição (Amostra 10), uma maior taxa de recuperação de MMP-7 foi mostrada quando manitoI (Amostra 8) ou sucrose (Amostra 9) foi adicionado para confirmar o efeito supressivo dos mesmos (Fig. 6).

[00162] A seguir, uma concentração efetiva de manitol ou sucrose para supressão de absorção de MMP-7 à parede de um recipiente e efeito de manitol ou sucrose sobre a atividade enzimática de MMP-7 foi investigado. A solução de MMP-7 obtida em Exemplo 1-(1) foi diluída com tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo CaCl2 10 mM, NaCl 40 mM e manitol ou sucrose para preparação de soluções (1 mL) de Amostras 12 a 16 em frascos. Um controle foi a solução de MMP-7 diluída como tampão Tris não contendo manitol e sucrose (Amostra 11).

[00163] Amostra 11: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCh 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7)

[00164] Amostra 12: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCh 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7) / manitol 1%

[00165] Amostra 13: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCI2 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7) / manitoI 2%

[00166] Amostra 14: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCI2 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7) / sucrose 2%

[00167] Amostra 15: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCI2 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7) / manitoI 5%

[00168] Amostra 16: 50 μg/mL de MMP-7 / CaCI2 10 mM / NaCI 40 mM / tampão Tris 5 mM (pH 7) / sucrose 7%

[00169] Após repouso em temperatura ambiente por 3 horas, cada soIução em frascos foi diIuída em duas etapas. Cada soIução em frascos foi diIuída com soIução de diIuição primária de tampão Tris 50 mM (pH 7) contendo Brij 35 0,01%, BSA 0,01%, NaCI 150 mM e CaCI2 10 mM para 5 ng/mI e a atividade de cIivagem para um substrato fIuorescente (a atividade enzimática de MMP-7) foi medida como no ExempIo 4. Neste experimento, um substrato fIuorescente obtido de PEPTIDE INSTITUTE, INC. (MOCAc-Pro-Leu-GIy-Leu-A2pr(Dnp)-AIa- Arg-NH2; (7-Metóxi coumarin-4-iI) acetiI-L-proIiI-L-IeuciI gIiciI-L-IeuciI- [Nβ-(2,4-dinitro fenil)-L-2,3-diamino propionil]-L-alanil-L-arginina amida; SEQ ID NO: 9) foi usada. Para diluição secundária, Block Ace 1% (Block Ace poder: DS Pharma Biomedical) / TBS-T (Tween20 0,05% / Tris 50 mM / NaCl 150 mM) foi usado e uma concentração de MMP-7 na solução foi medida por ELISA como acima.

[00170] Como um resultado, como comparado a nenhuma adição (Amostra 11), uma maior taxa de recuperação de MMP-7 foi mostrada quando manitol 2 a 5% (Amostras 13, 15) ou sucrose 2 a 7% (Amostras 14, 15) foi adicionado para confirmar seu efeito supressivo para adsorção à parede de um recipiente (Fig. 7). Nenhuma diminuição na atividade enzimática de MMP-7 foi observada após adição de manitol ou sucrose (Fig. 8).

Exemplo 7 Efeito de manitol sobre supressão para formação de agregado de MMP-7

[00171] A solução de MMP-7 obtida em Exemplo 1-(1) foi submetida a troca de tampão com tampão Tris 5 mM (pH 7) contendo cada concentração de NaCl, CaCl2 5 mM e manitol 3,5% usando filtro de rotação e então foi diluída com o tampão Tris para preparação de amostras 17 a 22. Um controle foi a solução de MMP-7 tratada com o tampão Tris não contendo manitol (Amostra 17).

[00172] Amostra 17: NaCl 10 mM / MMP-7 1 mg/mL / CaCl2 5 mM

[00173] Amostra 18: NaCl 10 mM / MMP-7 1 mg/mL / CaCl2 5 mM / manitol 3,5%

[00174] Amostra 19: NaCl 40 mM / MMP-7 1 mg/mL / CaCl2 5 mM / manitol 3,5%

[00175] Amostra 20: NaCl 80 mM / MMP-7 1 mg/mL / CaCl2 5 mM / manitol 3,5%

[00176] Amostra 21: NaCl 120 mM / MMP-7 1 mg/mL / CaCl2 5 mM/ manitol 3,5%

[00177] Amostra 22: NaCl 180 mM / MMP-7 1 mg/mL / CaCl2 5 mM/ manitol 3,5%

[00178] Um peso molecular de MMP-7 em cada amostra foi medido através de dispersão dinâmica de luz como descrito em Exemplo 1-(2). Como um resultado, foi mostrado que MMP-7 formou agregados com cloreto de sódio 40 mM ou mais (Fig. 9).

Aplicabilidade Industrial

[00179] Um método para monomerização de agregados de MMP-7 da presente invenção pode ser usado para a fabricação de MMP-7 e a produção de preparação de MMP-7.

Claims (27)

1. Método para monomerização de agregados de matriz metaloproteinase 7 (MMP-7), caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento de agregados de MMP-7 com uma solução compreendendo um composto de cátion monovalente em 80 mM ou menos ou com uma solução isenta de um composto de cátion monovalente, em que o composto de cátion monovalente é selecionado do grupo consistindo em cloreto de sódio e cloreto de potássio.

2. Método para monomerização de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os agregados de MMP- 7 são tratados com uma solução isenta de um composto de cátion monovalente.

3. Método para monomerização de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de cátion monovalente está em 40 mM ou menos.

4. Método para monomerização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a solução compreende ainda cloreto de cálcio.

5. Método para monomerização de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o cloreto de cálcio está em 30 mM ou menos.

6. Método para monomerização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a solução é uma solução tampão.

7. Método para monomerização de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a solução tampão é tampão Tris 5 a 25 mM.

8. Método para monomerização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o MMP-7 está em 20 mg/mL ou menos.

9. Método para monomerização, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a solução é tampão Tris 5 a 25 mM tendo um pH 6 a 8 compreendendo cloreto de sódio 30 a 40 mM e cloreto de cálcio 5 a 30 mM.

10. Método para monomerização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a solução compreende ainda álcoois de açúcares e/ou açúcares.

11. Método para monomerização, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os álcoois de açúcares e/ou açúcares são selecionados do grupo consistindo em sacarose, lactose, maltose, xilose, trealose, manitol, sorbitol, xilitol, maltitol, lactitol, e álcoois de oligossacarídeos.

12. Método para monomerização, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que os álcoois de açúcares e/ou açúcares estão em 2% ou mais.

13. Método para monomerização, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os álcoois e açúcares e/ou açúcares estão em 2 a 7% p/v.

14. Método para monomerização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que os álcoois e açúcares e/ou açúcares são manitol ou sacarose.

15. Método para monomerização, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o manitol está em 2 a 5% e a sacarose está em 2 a 7% p/v.

16. Processo de preparação de metaloproteinase 7 (MMP- 7), caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa consistindo no método para monomerização, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

17. Processo de preparação, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a etapa é realizada após uma etapa de tratamento usando uma solução compreendendo um composto de cátion monovalente a 130 mM ou mais.

18. Processo de preparação, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas (1) a (5): (1) uma etapa de interrupção de células produzindo corpo de inclusão de próMMP-7; (2) uma etapa de tratamento de dissolução/redobra de corpo de inclusão de pró-MMP-7; (3) uma etapa de purificação de próMMP-7; (4) uma etapa de autoativação de próMMP-7 em MMP-7; e (5) uma etapa consistindo no método para monomerização, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

19. Processo de preparação, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa (5) é uma etapa de concentração usando membrana de ultrafiltração.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende matriz metaloproteinase 7 (MMP-7) como um ingrediente ativo em uma solução, em que a solução é 5 a 25 mM de tampão Tris, que apresenta pH 6 a 8, compreendendo 30 a 40 mM de cloreto de sódio e 5 a 30 mM de cloreto de cálcio.

21. Composição farmacêutica compreendendo MMP-7 de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que compreende ainda álcoois de açúcares e/ou açúcares.

22. Composição farmacêutica compreendendo MMP-7 de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que álcoois de açúcares e/ou açúcares são selecionados do grupo consistindo em sucrose, lactose, maltose, xilose, trealose, manitol, sorbitol, xilitol, maltitol, lactitol, e álcoois de oligossacarídeos.

23. Composição farmacêutica compreendendo MMP-7 de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que álcoois de açúcares e/ou açúcares estão em 2% ou mais.

24. Composição farmacêutica compreendendo MMP-7 de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que álcoois de açúcares e/ou açúcares estão em 2 a 7%.

25. Composição farmacêutica compreendendo MMP-7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada pelo fato de que álcoois e açúcares e/ou açúcares são manitol ou sucrose.

26. Composição farmacêutica compreendendo MMP-7 de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que manitol está em 2 a 5% e a sucrose está em 2 a 7%.

27. Uso de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações de 20 a 26, ou de uma composição farmacêutica sólida, como definida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar o deslocamento do disco intervertebral.