PT662513E - Metodo para prenenir a degradacao da proteina c - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA PREVENIR A DEGRADAÇÃO DA PROTEÍNA C"

Esta invenção relaciona-se com enzimologia, particularmente com métodos para prevenir a degradação de proteína activada C. A proteína C é uma serina-protease anticoagulante de ocorrência natural que tem um papel na regulação da hemostase activando os factores Va e VIIIa na cascata da coagulação. A Proteína Humana C é fabricada in vivo principalmente no fígado como um polipeptídeo simples com 461 aminoácidos. Esta molécula precursora sofre múltiplas modificações pós-tradução incluindo a) clivagem de uma sequência dc sinal de 42 aminoácidos; 2) remoção proteolítica da cadeia de zimogénio do resíduo de lisina na posição 155 e do resíduo arginina na posição 156 para a transformar numa molécula formada por duas cadeias i.e., uma cadeia leve com 155 aminoácidos ligada através de uma ligação dissulfureto à cadeia pesada contendo serina-protease de 262 resíduos de aminoácidos); 3) carboxilação dependente da vitamina K dos nove resíduos de ácido glutâmico agrupados nos primeiros 42 aminoácidos da cadeia leve, resultando em 9 resíduos de ácido gama-carboxiglutâmico; e 4) ligação de carbohidrato em quatro locais (um na cadeia leve e três na cadeia pesada). A cadeia pesada contém a bem estabelecida tríada da serina-protease de Asp 257, His 211 e Ser 360. Finalmente, o zimogénio circulante de duas cadeias é activado in vivo pela trombina numa superfície fosfolipídica em presença do ião cálcio. A activação resulta da remoção de um dodecapeptídeo no terminal N da cadeia pesada, produzindo proteína C activada (aPC) possuindo actividade enzimática. -2- f

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Trabalhando com grandes quantidades e elevadas concentrações de aPC, observou-se um corte proteolítico no resíduo lisina na posição 308 da cadeia pesada. A sequência do novo terminal N gerado por este corte começa com Glu-Ala-Lys e possui um fragmento com 111 aminoácidos, chamado “fragmento EAK” do terminal C do fim da cadeia pesada. O fragmento EAK não está ligado covalentemente à cadeia leve ao à porção do terminal N da cadeia pesada por pontes dissulfureto. O fragmento EAK também possui o local activo serina da protease serina, nas não os resíduos Asp ou His. Assim, verificou-se que as preparações com proteína C com o fragmento EAK possuíam propriedades anticoagulantes alteradas. A presente invenção inclui métodos para evitar ou minimizar a degradação da molécula de Proteína C por manutenção da molécula a um pH mais baixo, num agente desnaturante ou em concentrações extremas de sal.

Para os fins da presente invenção, tal como aqui revelado e reivindicado os termos que se seguem são definidos abaixo. aPC - proteína C humana activada. APTT tempo de tromboplastina parcial activada. AU - unidades amidolíticas. BME - beta-mercaptoetanol. CHES - ácido 2[N-ciclohexilamino]etanossulfónico Fragmento EAK - o fragmento de 111 aminoácidos surgido do corte na posição 308 da cadeia pesada da proteína C. EDTA - ácido etilenodiaminotetraacético. HEPES - ácido Ν-2-hidroxietil piperazina-N'-2-etanossulfónico. HPC - zimogénio da proteína C humana. ME A - 2-aminoetanol. MES - ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfónico.

Proteína nascente — o polipéplido produzido aquando da tradução por uma transcriptase mRNA, antes de quaisquer modificações pós-tradução. Contudo, modificações pós-tradução tais como a gama-carboxilação de resíduos do ácido glutâmico e hidroxilação de resíduos de ácido aspártico podem começar a ocorrer antes da tradução total da proteína a partir de uma transcrição de mRNA.

Actividade da Proteína C - qualquer propriedade da proteína C humana responsável por actividades proteolíticas, amidolíticas, estcrolíticas e biológicas (anticoagulantes ou pró fibrinolíticas). Os métodos para testar as actividades anticoagulantes e amidolíticas da proteína C são bem conhecidas na arte, i.e., ver Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192. rHPC - zimogénio de proteína C produzida recombinantemente.

Zimogénio - um precursor enzimaticamente inactivo de uma enzima proteolítica. O zimogénio de proteína C, tal como aqui utilizado, refere-se à forma secretada, inactiva, de uma ou duas cadeias dc proteína C.

Todas as abreviaturas de aminoácidos utilizadas nesta revelação são as aceites pelo United States Patent and Trademark Office, como estabelecido no 37 C.F.R §1.822 (b) (2) (1990). A EP-A-519903 revela composições contendo proteína C activada. A presente invenção relaciona-se com métodos para evitar ou minimizar a autodegradação da proteína C activada. A invenção é melhor exemplificada pela realização do processamento, purificação e/ou armazenamento da proteína C activada a um pH baixo, por exemplo de pH 6,3 a pH 7,0. A autodegradação da aPC pode também ser minimizada por incubação da aPC em presença de concentrações extremas de sal. Para os fins da presente revelação, concentrações extremas de sal significa acima de 0,4 molar ou abaixo de 0.05 molar. A presente invenção também inclui formulações de aPC que mantêm a aPC a um pH baixo ou em concentrações de sal extremas. O papel da proteína C na manutenção da hemostase despoletou um grande interesse por este composto como agente terapêutico para uma grande variedade de distúrbios vasculares. A produção de níveis elevados e elevadas concentrações de proteína C humana revelou o facto de a molécula poder sofrer autodegradação levando a um decréscimo da actividade anticoagulante. A degradação da aPC resulta na formação de um fragmento com 111 aminoácidos, chamado “fragmento EAK”, a partir da ponta terminal C da cadeia pesada. O fragmento EAK não se encontra ligado covalentemente à cadeia leva ou á porção do terminal N da cadeia pesada através de pontes dissulfureto. O fragmento EAK também contém o local activo resíduo de serina da protease serina, nas não os resíduos Asp ou His. Assim, as preparações de proteína C com o fragmento EAK possuem propriedades anticoagulantes alteradas devido à presença do corte proteolítico.

Para reduzir ou evitar a autodegradação que leva à formação do fragmento EAK, a molécula intacta de Proteína C activada pode ser mantida a um pH entre 6,3 e 7,0. A molécula pode ser mantida a um pH dentro destes limites através de todo o processo dc purificação e activação, assim como na solução de formulação final. Podem ser utilizados muitos sistemas tampão diferentes para manter o pH da solução. Sistemas tampão representativos incluem Tris-Acetato, Citrato de Sódio, Citrato-Glicina e Fosfato de Sódio. O técnico experiente reconhecerá que muitos outros sistemas tampão disponíveis também podem ser utilizados nos processos da presente invenção.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com a prevenção ou a redução da formação do fragmento EAK por manutenção da molécula de

I I jf* -5- proteína C activada uuma solução com uma concentração salina extrema. Por exemplo, a pH 7,0 num tampão de Fosfato de Sódio, a formação do fragmento EAK é mínima quando não existe sal presente no tampão. Contudo, a pH 7,0 num tampão de Fosfato de Sódio, a formação do fragmento EAK também é mínima quando existe uma concentração de 0,4 M de cloreto de sódio presente no tampão. Entre estas duas concentrações de sal, ocorre a formação de fragmentos EAK em ritmos diferentes; mas o técnico experiente reconhecerá que mantendo as concentrações de sal abaixo de 0,05 M ou as concentrações de sal acima de 0,4 M mais facilmente evitará ou minimizará a formação de fragmentos EAK. São preferidas outras concentrações de sal abaixo de 0,05 M (e.g., 0,01 M ou 0,005 M) apesar de as melhores formulações farmacêuticas ocorrerem quando o pH da solução é mantido a acerca de pH 7,0 sem adição de sal à solução. O técnico experiente reconhecerá que podem ser utilizados muitos sais diferentes no processamento e nas formulações farmacêuticas. Sais representativos que podem ser utilizados na presente invenção incluem cloreto de potássio, cloreto de cálcio e, mais preferencialmente, cloreto de sódio. A autodegradação da proteína C activada pode ser evitada ou reduzida efectuando a purificação e/ou a formulação em presença de um agente desnaturante. Podem ser utilizados muitos agentes desnaturantes, mas o agente mais preferido é a ureia em concentrações de cerca de 3 M.

A presente invenção não é limitada pelos métodos segundo os quais a proteína C activada pode ser produzida. Apesar de ser mais eficiente a utilização de tecnologia do DNA recombinante para produzir moléculas de proteína C activada, avanços recentes na purificação em larga escala de proteínas permitiram o isolamento de quantidades significativas de proteína C activada a partir de soro humano. A obtenção de tais quantidades de proteína C activada permitiu o processamento de uma só vez de elevadas concentrações de proteína C •iVt { «Λ -6- <\ - activada. Como notado acima, os inventores descobriram que concentrações de proteína C activada acima do nível de 50 microgramas por mililitro mostravam autodegradação da molécula de proteína C activada com a concomitante queda de actividade anticoagulante. Mais importante, o ritmo de autodegradação aumenta conforme aumenta a concentração de proteína C activada numa solução. A um nível industrial, não é eficiente efectuar processos de purificação em grande escala com concentrações muito baixas de proteína.

Para que seja industrial e farmaceuticamente vantajoso é necessário o processamento da molécula cm concentrações excedendo largamente os 50 microgramas, a presente invenção permite ao técnico experiente a produção de grandes quantidades do produto sem perda significativa de actividade do produto. As formulações da presente invenção permitem ainda o armazenamento de soluções estáveis de proteína C activada durante um período mais longo de tempo do que era possível no estado anterior da técnica. O técnico experiente reconhecerá que os métodos da presente invenção permitirão aos que praticam a invenção a criação de volumes maiores de proteína C activada em concentrações mais elevadas do que eram anteriormente possíveis sem receio de sofrer perda dc produto devido à autodegradação. Adicionalmente, as formulações farmacêuticas estáveis podem facilmente ser utilizadas para o tratamento de pacientes sofrendo de distúrbios físicos tal como ensinado por Taylor, Jr. et ai, U.S. Patent N°. 5 009 889.

Os exemplos que se seguem são proporcionados como um meio de ilustração da presente invenção e não devem ser interpretados como suas limitações.

Exemplo 1

Produção de Proteína C Humana

Produziu-se proteína C humana recombinante (rHPC) em células 293 de Rim Humano segundo técnicas bem conhecidas dos técnicos experientes tais como as estabelecidas por Yan, U.S.Patent N°. 4 981 952. O gene que codifica a proteína C humana é revelado e reivindicado por Bang et al, U.S.Patent N°. 4 775 642. O plasmídeo utilizado para expressar a proteína C humana nas células 293 foi o plasmídeo pLPC que foi revelado por Bang et al., U.S.Patent N°. 4 992 373.A construção do plasmídeo foi também descrita na European Patent Publication N°. 0 445 939 e em Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192.

Em resumo, o plasmídeo foi transfectado para células 293, depois identificaram-se transformandos estáveis, que foram subcultivados e cresceram em meio sem soro. Após a fermentação obteve-se um meio sem células por microfiltração. A proteína humana C foi separada do fluido de cultura segundo uma adaptação das técnicas de Yan, U.S.Patent N°. 4 981 952. O meio clarificado foi tomado 4 mM em EDTA antes de ser absorvido por uma resina de troca aniónica (Fast-Flow Q, Pharmacia). Após lavagem com 4 volumes de coluna de Tris 20 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4 e 2 volumes de coluna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, o zimogénio de proteína C humana recombinante ligado foi eluído com Tris 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, pH 7,4. A proteína eluída tinha uma pureza superior a 95% após a eluição, segundo a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. -8- -8-

ί A purificação adicional da proteína foi conseguida tomando a proteína 3 M em NaCl seguido por absorção numa resina de interacção hidrofóbica (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) equilibrada em Tris 20 mM, NaCl 3 M e CaCl2 10 mM, pH 7,4. Após lavagem com dois volumes de coluna de tampão de equilíbrio sem CaCl2, a proteína C humana recombinante foi eluída com Tris 20 mM, pH 7,4. A proteína eluída foi preparada para a activação por remoção do ião cálcio. A proteína C humana recombinante foi passada por uma coluna com afinidade metálica (Chelex-100, Bio-Rad) para remover o cálcio e novamente ligada a um trocador de aniões (Fast Flow Q, Pharmacia). Ambas as colunas foram colocadas em série e equilibradas com Tris 20 mM, NaCl 150 mM e EDTA 5 mM, pH 7,4. Após carga da proteína, a coluna Chelex-100 foi lavada com um volume de coluna do mesmo tampão antes de ser desligada da série. A coluna de troca aniónica foi lavada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio antes de se eluir a proteína com NaCl 0,4 M, Tris-Acetato 20 mM, pH 6,5. As concentrações de proteína nas soluções de proteína C humana recombinante e proteína C humana recombinante activada por UV, 280 nm, extinção E°’1:/<,= 1,85 ou 1,95, respectivamcnte.

Exemplo 2

Activação de Proteína C humana recombinante

Ligou-se trombina bovina a Activated CH-Sepharose 4B (Pharmacia) em presença de HEPES 50 mM, pH 7,5 a 4°C. A reacção de ligação foi efectuada em resina de enchimento de uma coluna utilizando aproximadamente 5000 unidades de trombina/mL de resina. A solução de trombina foi circulada através da coluna durante aproximadamente 3 horas antes da adição de MEA até uma concentração dc 0,6 mL/L de solução circulante. A solução contendo o MEA foi circulada durante 10-12 horas adicionais para assegurar o bloqueio completo das aminas da resina que não tinham reagido. Após o bloqueio, a resina ligada à trombina foi lavada com 10 volumes da coluna de NaCl 1 M, Tris 20 mM, pH 6,5 para remover toda a proteína não especificamente ligada e foi utilizada em reacções de activação após equilíbrio em tampão de activação. A rHPC purificada foi tomada 5 mM em EDTA (para quelar qualquer cálcio residual) e diluída até uma concentração de 2 mg/mL com Tris 20 mM, pH 7,4 ou Tris-acetato 20 mM, pH 6,5. Este material foi passado através de uma coluna com trombina equilibrada a 37°C com NaCl 50 mM e ou tris 20 mM, pH 7,4 ou Tris-acetato 20 mM, pH 6,5. O fluxo foi ajustado para permitir aproximadamente 20 min. de tempo de contacto entre a rHPC e a resina com trombina. O efluente foi recolhido e ensaiado imediatamente quanto à actividade amidolítica. Se o material não tinha actividade específica (amidolitica) comparável a um padrão estabelecido de aPC. era reciclado na coluna com trombina para activar a rHPC até esgotamento. Isto era seguido por diluição 1:1 do material com tampão 20 mM como acima, com um pH de 7.4 ou de 6,5 para manter a aPC em concentrações baixas enquanto aguardava o passo seguinte do processamento. A remoção da trombina lixiviada do material aPC foi conseguida por ligação do aPC a uma resina de troca aniónica (Fast Flow Q, Pharmacia) equilibrada em tampão de activação (em Tris 20 mM, pH 7,4 ou em Tris-Acetato 20 mM, pH 6,5) com 150 mL de NaCl. A trombina não interage com a resina de troca aniónica nestas condições, mas passa través da coluna para o efluente de aplicação da amostra. Uma vez carregada a aPC na coluna, é efectuada uma lavagem com 2-6 volumes da coluna com tampão de equilíbrio 20 inM antes de eluir a aPC ligada num passo de eluição utilizando NaCl 0,4 M em Tris-Acetato 5 mM, pH 6,5 ou em Tris 20 mM, pH 7,4. Lavagens da coluna com volumes mais elevados facilitaram a remoção mais completa do dodecapeptídeo. O material eluído desta coluna foi armazenado ou numa solução gelada (-20°C) ou como pó liofilizado. A actividade amidolítica (AU) da aPC foi determinada por libertação de p-nitroanilina a partir do substracto sintético H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilida (S-2238) adquirido a Kabi Vitrum utilizando um espectrofotómetro constituído por um conjunto de díodos Beckman DU-7400. Uma unidade de proteína C activada foi definida como a quantidade de enzima necessária para a libertação de 1 pmol de p-nitroanilina em 1 min. a 25°C, pH 7,4, utilizando um coeficiente de extinção para a p-nitroanilina a 405 nm de 9620 M^cnT1. A actividade anticoagulante da proteína C activada foi determinada por medida do prolongamento do tempo de coagulação no ensaio de coagulação de tempo de tromboplastina parcial activada. Foi preparada uma curva padrão em tampão de diluição (1 mg/mL de BSA, grau de pureza de radioimunoensaio, Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,02% de NaNj) variando em concentração de proteína C de 125-1000 ng/mL, enquanto as amostras eram preparadas em várias diluições neste intervalo de concentrações. Adicionaram-se a cada “cuvette” com amostra 50 pL de plasma frio de cavalo e 50 pL de reagente de tempo de tromboplastina parcial activado (APTT Reagent, Sigma) e incubou-se a 37°C durante 5 min. Após incubação, adicionaram-se a cada “cuvette” as amostras apropriadas ou padrões. Foi utilizado tampão de diluição em substituição da amostra ou padrão para determinar o tempo de coagulação basal. O cronómetro do fibrómctro (CoA Scrccncr Hcmostasis Analyzcr, American Labor) foi -11 - accionado imediatamente após a adição de 50 pL de CaCl2 30 mM a 37°C a cada amostra ou padrão. A concentração de proteína C activada nas amostras foi calculada a partir da equação de regressão linear da curva padrão. Os tempos de coagulação aqui registados são a média de pelo menos três replicados, incluindo as amostras da curva padrão.

Para a preparação de amostras para estudos comparativos, conseguiu-se a completa degradação da aPC (7,3 mg/mL em Tris 20 mM c NaCl 150 mM) após 44 horas de incubação a 25°C ou após concentração em resina de troca aniónica (FFQ, Pharmacia), pH 7,4 a 4°C. Foram efectuados ensaios de actividade amidolitica, FIPLC, sequenciação do terminal N e SDS-PAGE em amostras para confirmar e quantificar a quantidade de autodegradação e os locais de clivagem na sequência de aminoácidos.

Exemplo 3

Ensaios de Estabilização da Proteína C Activada O efeito do pH na actividade da aPC foi examinado por monitorização da AU. Foi utilizado um sistema de três tampões para estabelecer as condições de pH no intervalo 6-9,3 (em incrementos de 0,3 unidades de pH) por utilização de 50 mM de MES (pH 5,5-7), HEPES (pH 6,8-8,2) e CHES (pH 8,6-10). A aPC foi diluída até uma concentração final de 0,4 mg/mL com o tampão apropriado ao pFl e incubada a essa concentração antes da medição de actividade. As amostras foram ensaiadas tanto no tempo inicial como após 30 horas a 4°C utilizando ensaios amidolíticos efectuados ao pH da incubação. Essas medidas mostraram uma dependência ao pH em forma de sino para a actividade amidolitica. Os resultados desses ensaios são mostrados na Tabela I, abaixo.

Tabela I

Ritmos amidolíticos ílU/mg aPC) m 0 horas 30 horas 6,0 1,63 1,58 6,6 4,00 4,63 7,2 9,16 6,68 7,8 11,26 9,26 8,4 7,05 5,16 9,0 3,53 3,53 A actividade máxima para a aPC foi a pH 7,4, enquanto os valores extremos de pH de 6 e 9,3 mostraram actividade muito reduzida. Apesar da a aPC parecer reter alguma actividade amidolitica a pH extremos, estes dados sugerem que a autodegradação é reduzida evitando condições de pH nas quais a aPC tinha uma actividade máxima.

Para determinar se a actividade amidolitica dependente do pH era função da formação de fragmentos EAK, as amostras de aPC foram incubadas a pH 6,0, 7,5 e 9,0, 1,5 mg/mL a 4°C durante 18 horas. A quantidade de EAK formada foi medida por integração da área sob o pico de EAK em HPLC assim como por observação qualitativa da banda EAK em SDS-PAGE. Estes dados não mostraram aumento na formação de EAK durante o decurso da incubação a pH 6,0, enquanto que houve um aumento de aproximadamente 30% a pH 7,5 e um aumento de 50% a pH 9,0. Apesar dos níveis elevados de fragmento EAK nas amostras de pH 7,5 e 9,0, a preparação ainda possuía elevada actividade AU quando ensaiada a pH 7,4. Assim, a geração do fragmento EAK não é necessáriamente associada com uma diminuição da actividade amidolitica. Em vez disso, o fragmento EAK deve ficar suficientemente associado ao resto da i - 13 -

cadeia pesada de aPC para manter a funcionalidade da protease scrina. Um conteúdo mais elevado de fragmentos EAK está associado com actividade amidolitica mais elevada. O fragmento EAK contém o local activo serina (resíduo 360) da tríade catalítica (incluindo His 211 e Asp 257 encontrados na porção do terminal N da cadeia pesada). Consequentemente, se o fragmento EAK não está covalentemente ligado ao resto da cadeia pesada, este corte proteolítico pode resultar em actividade enzimática reduzida. Para se conhecer o impacto de várias quantidades de EAK na actividade anticoagulante, foram preparados vários lotes diferentes de aPC tal como descrito nos Exemplos 1 e 2 supra. Os ensaios amidolíticos foram efectuados com concentrações de substracto #S-2238 variando entre 22-198 uM, concentrações de aPC variando entre 1,6-3,3 nM (75-150 ng/mL), Tris 20 mM, pH 7,4 e NaCl 150 mM. Os resultados deste ensaio são mostrados na Tabela II.

Tabela II

Percentagem em Teor de EAK versus Actividade Específica Medida Pelas Actividades Amidolitica e Anticoagulante

Actividade Específica de EAK AU/mg APTT/mg 3 1,13 2,11 19 1,35 1,7 35 1,52 1,37 51 1,64 1,00 67 1,68 0,78

Amostra N°. 1 2 3 4 5

Foi explorada a dependência da degradação pelo pH para gerar amostras de aPC que continham vários teores de EAK. Esses exemplos foram preparados como descrito nos Exemplos 1 e 2 supra. Compararam-se as amostras com os vários teores de EAK com aPC intacta (<3% de Fragmentos EAK). Os parâmetros cinéticos amidolíticos, incluindo os valores de Km, Kcat e V máx foram medidos para cada um desses lotes com três concentrações diferentes de enzima, e estão resumidos na Tabela III.

Tabela III Dados Cinéticos

Amostra N°. [aPC] Km V máx. Kcat (% de EAK) ng/mL (mM) (umol/mL/min) (1/seg.) 1 (20%) 150 0.12 9102 7 1 113 0,12 8634 6,6 1 75 0,19 8713 6,7 2 (67%) 150 0,18 10672 8,2 2 113 0,18 9729 7,5 2 75 0,18 9930 7,6 3(100%) 150 0,16 13142 10,1 3 113 0,14 2337 1,8 3 75 0,18 316 0,2 os valores de Km para as três amostras de aPC foram semelhantes dentro da variação experimental e mostraram um valor médio de 0,16 mM de substracto. Isto sugere que a afinidade para o substracto S-2238 não é alterado na aPC degradada. Surpreendentemente, o material degradado ainda possuía actividade AU essencialmente semelhante à da aPC intacta. A proteína activada C pode possuir funcionalidade amidolitica intacta versus um substracto tripeptídico (S-2238) mesmo com um elevado conteúdo de fragmentos EAK. A actividade anticoagulante in vitro pode ser medida pelo ensaio APTT. Inesperadamente, a elevada actividade AU não se correlacionava com a actividade anticoagulante. Enquanto que a actividade AU aumentava com um aumento de teor em EAK, a actividade APTT decrescia com o aumento de teor em EAK. O efeito da concentração dc sal na formação de fragmentos EAK e na estabilidade da proteína C activada foi estudada incubando amostras de proteína C activada a vários níveis de pH e de concentração de sal, e medindo depois a percentagem de formação de fragmentos EAK por hora. As concentrações de proteína C no ensaio situavam-se entre 4-5 miligramas por mililitro. Todos os ensaios foram efectuados em tampão fosfato 5 a 20 mM. Foi utilizado cloreto de sódio como sal (quando o sal estava presente) e todos os ensaios foram efectuados a 25°C. A percentagem de formação de fragmentos EAK por hora foi medida por integração por HPLC. Os resultados desses ensaios são mostrados abaixo na Tabela IV. -16-

Tabela IY

Efeito da Concentração de Sal na Formação de Fragmentos EAK PH concentração de sal % de EAK formado/hora 6,4 400 raM 0,094 7,0 400 mM 0,145 6,4 50 mM 0,292 7,0 50 mM 0,365 6,4 0 0,038 7,0 0 0,092

Lisboa, 9 de Maio de 2001 c-

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para minimizar a degradação de proteína C activada, compreendendo o referido processo a manutenção da referida proteína C activada numa solução com um pH entre 6,3 e 7,0.
2. 2. Processo da Reivindicação 1, em que a referida solução tem uma concentração de sal inferior a 0,050 M ou acima de 0,40 M.
3. 3. Processo da Reivindicação 2, em que a referida solução tem uma concentração de sal inferior a 0,050 M.
4. 4. Processo da Reivindicação 2, em que a referida solução tem uma concentração de sal inferior a 0,010 M.
5. 5. Processo da Reivindicação 2, em que o sal na solução é cloreto de sódio.
6. 6. Formulação farmacêutica estável compreendendo proteína C activada numa solução com um pH entre 6,3 e 7,0.
7. 7. Composição farmacêutica da Reivindicação 6 que compreende ainda sal numa concentração inferior a 0,050 M ou superior a 0,4 M.
8. 8. Composição farmacêutica da Reivindicação 7, em que a concentração de sal é inferior a 0,05 M. -2-
9. 9. Composição farmacêutica da Reivindicação 6 em que o tampão é scleccionado do grupo que consiste em Tris-Acetato, Citrato dc Sódio, Citrato-Glicina e Fosfato de Sódio. Lisboa, 9 de Maio de 2001 U lV· ) ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBOA