PT97983A - Processo para a preparacao de um enzima fibrinolitico hibrido, nomeadamente um derivado de plaminogenio - Google Patents

Description

2 0 presente invento relaciona-se com um enzima fibrino-lítico híbrido, sua preparação, composições farmacêuticas que o contêm e sua utilização no tratamento de doenças tromboembõ1icas, em particular do enfarto agudo do miocárdio. A Patente Europeia No. O 009 679 apresenta derivados de enzimas fibrinolíticos jji vivo que são agentes terapêuticos fiteis para o tratamento da trombose venosa. Os derivados são caracteri-zados pelo sítio catalítico activo nos enzimas a serem bloqueados por um grupo que é removível por hidrólise de modo tal que a pseudo constante de velocidade de primeira ordem para a hidrólise _ Q _3 _£ se situe numa gama de 10 a 10 seg 0 pedido de Patente Europeia No. 0 155 387 apresenta uma proteina híbrida fibrinolíticamente activa que compreende uma cadeia de uma protease de 2 cadeias ligada a uma cadeia de uma protease de 2 cadeias diferente, ou â mesma cadeia da mesma protease, sendo pelo menos uma das cadeias na proteina híbrida derivada de uma protease fibrinolíticamente activa, de modo à proteina híbrida ter um sítio catalítico essencial para a activi-dade fibrinolítica que é bloqueada facultativamente por um grupo de bloqueamento removível. 0 pedido de Patente Europeia No. 0 297 682 apresenta ura activador do plasrainogénio híbrido que compreende os cinco domínios kringle de plasrainogénio ligados à cadeia B de t-PA ou u-PA por meio de uma sequência de amino ácidos compreendendo, respectivamente, o sítio de clivagem de t-PA entre os resíduos 275 e 276 e o resíduo da cisteina 264 de t-PA ou o sítio de clivagem de u-PA entre os resíduos 156 e 159 e o resíduo de cisteina 146 de u~PA, sendo o sítio catalítico da cadeia B de t-PA ou u-PA bloqueado facultativamente por ura grupo de bloqueio removível. 3 -

Foi mencionado um grande número de possíveis grupos de bloqueio no pedido de Patente Europeia Sfo, 0 207 ÔÔ2 como apropriados, sendo dada particular ênfase aos grupos haloantroniloi-los, isto é» o grupo 2-aminobenzoilo substituído na posição 3 ou 4 com um átomo de halogénio e facultativamente ainda substituído com um ou mais grupos fracaroente retirando electrdes ou doando electrdes, Grupos de bloqueio particulares indicados pelo pedido de Patente Europeia No, 0 297 882 incluíram 2-aminobenzoilo substituído na posição 4 com fluoro, cloro ou bromo.

Verificou-se actualmente, surpreendentemente, que o bloqueio de um activador de plasminogénio híbrido <FA) do tipo descrito no pedido de Patente Europeia No. O 297 382 cora um grupo acilo particular <o grupo 4-metoxibenzoilo ou p-anisoilo) proporciona um derivado com propríeades particularraente vantajosas em termos de potência.

De acordo com o presente invento proporciona-se 4-meto-xibensoil-plasminogénio 1-541/t-PA 262-527 incluindo variantes de uma e duas cadeias, variantes Lys^g e glu^, e suas misturas,

Tal como são aqui usadas as expressSes t-PA e plasminogénio têm os significados e sistema de numeração de araíno ácidos indicados na Patente Europeia No, A-0 207 882,

Num aspecto preferido o PA híbrido acílico do invento é a variante glu^ * especialmente a sua forma de cadeia única. O PA híbrido acílico compreende de preferência pelo menos 60¾, com maior preferência pelo menos 80¾ do glu^ preferido, variante de cadeia única em relação às outras variantes de cadeia, - 4 -

Ainda num outro aspecto o invento proporciona glu^ plasminogénio de cadeia única 1-541/t-PA 262-527, Esta variante encontra-se de preferência presente a um nível de pelo menos (30%, com amior preferência 80% em relação às outras variantes de cadeia. O PA híbrido acílico do invento pode ser preparado tal como é descrito na generalidade na Patente Europeia No, A-0 297 882. O PA híbrido não acilado é preparado primeiro por expressão do ADN que codifica o PA híbrido na célula hospedeiro e a recuperação do produto PA híbrido. 0 ADN é preparado convencionalmente pela condensação das unidades nucleotido mono-, di- ou oligoméricas apropriadas tal como é descrito Na Patente Europeia No. A-0 297 882, A célula hospedeiro é preparada convencionalmente por transformação com um vector de expressão com capacidade de replicação, na célula hospedeiro, da expressão do APN codificadora. A escolha do vector será determinada em parte pela célula hospedeiro, que pode ser procarionte, tal como iL_ 22X1» ou eucarionte, tais como as células C127 de ratinho, de mieloma de ratinho, de ovário de criceto chinês, fungos por exemplo fungos filamentosos ou 'levedura* unicelular ou uma célula de insecto tal como Drosophila, A célula hospedeiro pode também encontrar-se num animal trasgénico. Os vectores apropriados incluem plasmídeos, bacteriofagos, cosmídeos, e vírus recombinantes, derivados de, por exemplo, baculovlrus ou vaccinia. 5 - 0 glu^ preferido, forma de cadeia única do PA híbrido pode ser obtido por escolha apropriada do vector, célula hospedeiro, condições de expressão e condições de purificação, Assim, por exemplo, células do ovário do criceto chinês <DXB11> podem ser armazenadas em meio sem soro a fim de evitar a proteolise. Embora este método produza usualmente material com um elevado conteúdo da forma glu de cadeia única sc, pode ser necessário, especialmente nas colheitas feitas logo a seguir à mudança das condições de cultura de um meio contendo soro para um meio sem soro, adicionar inibidor(es) da protease por exemplo aprotinina, a fim de evitar a abertura de fendas. De um modo semelhante, dependendo da natureza do esquema de purificação utilizado, os inibidores da protease podem ser requeridos em todos ou em alguns dos tampões de purificação. O PA híbrido é feito reagir com um agente de acilação apropriado a fim de preparar o derivado 4-metoxibenzoilo.

Consequentemente o invento proporciona também um processo para a preparação de PA híbrido acílico do invento, processo esse que compreende a reacção do PA híbrido com um agente de bloqueamento JK em que J é um grupo de localização que faz a mediação da ligação do agente ao sítio catalítico do enzima e K é um grupo p-metoxibenzoilo.

Exemplos do grupo J incluem 4-amidinofenoxi e 2-cloro--4-amidinofenoxi.

Um agente de acilação preferido é 4’-metoxibenzoato de 4-amidinofenilo, normalmente usado sob a forma do sal HC1, Este composto é apresentado em Patente Europeia No. 0 00$ 879. 6 -

As reacçSes de bloqueamento são de preferência realizadas em meios aquosos, com um pH variando entre 6,75 e 8,5, mais preferivelmente entre 6,75 e 7,25 e a temperaturas variando entre 0°C e 30°C, mais preferivelmente entre 15 e 3G°C, A variação da concentração preferida para o agente de bloqueamento vai de 0,01 a 2,0 milimolar, e a variação da concentração do enzima preferida vai de 1 a 500 micromolar, é desejável realizar a reacção de bloqueamento na presença de aditivos solubilizadores ou estabilizadores do enzima tais como 1-arginina, 1-lisina ou ácido 6-aminohexanoico, 0 PA híbrido acílico ou o glu^, plasminogénio de cadeia única 1-541/t-PA 262-527 deste invento é de preferência administrado como uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças trorabóticas.

Consequentemente o presente invento proporciona também uma composição farmacêutica compreendendo o PA híbrido acílico ou glUj, plasminogénio de cadeia única 1-541/t-PA 262-527 do invento em incubação com um veículo farmacêuticaraente aceitável. A composição de acordo com o invento pode ser formulada de acordo com processos de rotina sob a forma de composiçdes farmacêuticas adaptadas para administração intravenosa a seres humanos, Típicamente composiçdes para administração intravenosa são soluçães de PA híbrido estéril em tampão aquoso isotõnico estéril» Quando necessário a composição pode também Incluir um agente de solubilização para manter o PA híbrido em solução e um anestésico local tal como lignocaina para diminuir a dor no local 7 - da injecção, Geralmente, o PA híbrido será fornecido sob a forma de unidade de dosagem por exemplo sob a forma de um ρδ seco ou de um concentrado sem água num recipiente selado herméticaaente tal como uma ampola ou saquinho indicando a quantidade de proteína em unidades de actividade, assim como, para o PA híbrido acílico, uma indicação do tempo ao fim do qual a proteina livre irá ser libertada. Quando se pretende administrar o PA híbrido por infusão, ele será fornecido com um frasco de infusão contendo ‘água para Injecção' de grau farmacêutico estéril. Quando o PA híbrido vai ser administrado por injecçáo, ele é fornecido com uma ampola de água estéril para injecção, A composição para injecção ou infusão será formada misturando os ingredientes antes da administração, Â quantidade de material administrado irá depender do grau de fibrinolise requerido e da velocidade à qual é requerida, da gravidade da condição troraboembõlica e da posição e tamanho do coágulo, A dose exaota a ser utilizada e o modo de administração deve per force, tendo em vista a natureza das queixas, ser decidida de acordo com as circunstancias pelo médico que orienta o tratamento. Contudo, em geral, um doente a ser tratado devido a um trombo maduro, recente ou nascente receberá geralmente uma dose diária de desde 0,01 até 10 mg por quilograma de peso corporal por injecção em até cinco doses ou por infusão.

Com a gama de dosagem descrita anteriormente, não foram indicados efeitos toxicolõgicos prejudiciais com o PA híbrido do invento,

Consequentemente, num outro aspecto do invento proporciona-se ura método para o tratamento das doenças trombõticas, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade não 8 tõxica eficaz de ura PA híbrido acílico ou glu^, plasminogénio de cadeia única 1-541/t-PA 262-527 do invento,

Mura aspecto afira proporciona-se a utilização de ura PA híbrido acílico ou glu^, plasminogénio de cadeia única 1-541/t-PA 262-527 do invento para a produção de um medicamento para o tratamento das doenças trorabõticas. 0 invento também proporciona um PA híbrido acílico ou glu^, plasminogénio de cadeia única 1-541/t-PA 262-627 do invento para utilização como uma substância terapêutica activa e, em particular, para utilização no tratamento de doenças trorabõticas.

Os Métodos e Exemplos que se seguem ilustram o invento Â. Métodos Gerais usados nos Exemplos <i> Clivagem de ADff

Em geral a clivagem de cerca de 1 pg de plasraídeo de AI>M ou de fragmentos de &B8 foi realizada usando cerca de 5 unidades de um enzima <ou enzimas! de restricção em cerca de 20 Ml de uma solução de tampão apropriado, <ii> Froducão de extremidades embotadas

Se forem requeridas extremidades embotadas elas serão produzidas por tratamento da preparação de ADS cora Polimerase 1 do ADSf, fragmento de Klenow tal como é descrito por Maniatis et al. (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory» 1082!, Alternativamente, extremidades viscosas foram © - removidas por digestão usando nuclease de Kung Bean CKaniatis et ai) * <iii) Produção de Extremidades viscosas* usando agentes de 1igacão

Agentes de ligação oligonuoleotidoe com quinase curta codificando sítios de restrição únicos ou múltiplos foram ligados a fragmentos com extremidades embotadas, sendo o<s> agente<s> de ligação diferido<s> com a endonuclease de restricção apropriada produzindo as requeridas 'extremidades viscosas* necessárias para uma posterior manipulação <Maniatis et al).

<iv> Ligação de Fragmentos de ADN

As reacçães de ligação foram realiozadas tal como foi descrito era Maniatis et al» <v> Transformação A transformação do ADF do plasmídeo em fi, ooli HB101 usou HB101 competente fornecido por Gíbco BRL CPaisley, Scotland), * de acordo com as instruçães dos fabricantes»

Cvi) Preparação de plasmídeo A preparação em grande escala de ADN do plasmídeo e de mini-preparações de plasmídeo foram realizadas tal como foi descrito em Maniatis et al, 10

Cvii) Isolamento do fragmentos de APN a partir de geles de aararose com ponto de fusão baixo <LPH>

Os fragmentos de APN foram isolados a partir de geles da agarose LXP tal como foi descrito por Kaniatis et al« Alterna tivamente a banda de gel retirado foi purificada usando GENECLEAIf <Stratech Scientific, London) utilizado de acordo com as instruções do fabricante. <viii> Agentes de liaacão oliaronucleotidos

Os oligonucleotídos ou foram comprados ou foram produzidos em Applied Biosystems 381A D8Â Synthesizer de acordo com as instruções do fabricante e foram submetidos a quinase tal como é descrito em Maniatis et al. <ix> Ensaios com substrato cromoarénico O híbrido foi ensaiado em relação ao substrato cromogé-nico S2288 CKabiVitrum, Sweden) com uma concentração de substrato de 1 raM em trietanolamína.HC1 0,1 K pH 8,0 a 25°C. Um SU é definido como a quantidade de actividade que dá origem a um aumento de O.P. a 405 nm de 0,001/min em 0,5 ml de substrato numa célula com um comprimento de trajectõria de 1 cm.

Numa outra forma de ensaio, específicamente criado para 0 ensaio semi-quantitativo das fracções da coluna de cromatogra-fia, 10 μΐ de cada fracção foram misturados com 100 μΐ de S-2288 1 mH <como anteriormente) era recipientes de uma placa de microti-tulação e a placa foi incubada a 37°C durante um período de tempo suficiente para se tornar visível uma cor amarela. As soluções foram lidas a 410 nm usando um leitor Dynatech KR7QQ Microplate. 11 (x) Ensaio de actividade fibrinolitica A actividade fibrinolitica das soluç5es activadoras do plasminogénio híbrido foi medida em placas de fibrina contendo plaminogénio tal como foi descrito (Dodd, I,, and Carr, K. , Thrombosis Pes, 1989 55 79 - 85), As respostas à dose dos activa-dores do plasminogénio híbrido apresentavam declives ligeiramente diferentes em relação âs do activador do plasminogénio do tipo tissular padrão sendo assim todas as actividades aproximadas. As actividades são expressas em IU com referência ao 22 padrão Internacional para t-PA, Lote 86/670. Tendo como base a actividade sobre as placas de fibrina avalia-se que a proteina híbrida apresenta uma actividade específica de aproximadamente 150,000 - 250,000 IU/mg de proteina, equivalente a uma actividade específi- 13 ca molar, de aproximadamente 1,5 - 2,5 x 10 IU/mole, (xi) A electrofores em gel de poliacrilamida de sulfato dodeoilo de sódio (SDS FAGB) SDS PAGE foi realizada para determinar o<s> peso(s) molecular<es> aparente<s> do activador do plasminogénio híbrido usando essencialmente o método de Laemmli (Sature 1970 227 680-685), Os activadores foram identificados quer por coloração da proteina quer pela técnica zimográgica da fibrina (Dodd, I. et al Throm, Haemostasis 1986, SS 94-97), Usando estes métodos foi possível determinar a natureza da cadeia <sc v tc> e deduzir prováveis términos em Ή (Glu^ v Lys^g), mas anotando comentários sob "término em 2Γ" (Secção B, (ii>>. (xii) Determinações da constante da taxa a> A pseudo constante da taxa de primeira ordem foi determinada hidrolisando o enzima acílico em condições fisiológicas, isto é 12 em meios aquosos isotónicos com pH 7,4 e a 37°C, Com intervalos regulares foram retiradas porçães alíquotas que foram incubadas com um substrato cromogénico e a taxa de conversão do substrato foi medida tal como foi anteriormente indicado. A hidrólise foi seguida até á altura em que a taxa de conversão do substrato atingiu um máximo, A taxa constante k pode então ser calculada fazendo o diagrama;

Log Íl-A./A > em relação a t e t max onde A é a taxa máxima á qual uma porção alíquota converte o max substrato e A^ é a taxa à qual uma porção alíquota converte o substrato no tempo t.

De preferência essas constantes de taxa são calculadas por meio de análise de regerssão não linear computadorizada, adaptando os dados A^ e de tempo â equação A. = A + t o <A -A > <1 max o -e‘et> onde A^ representa a actividade da preparação de enzima aoílico antes da desacilação. b> O Enzima acílico (ca, 20 pmol, 10 jul> foi adicionado a uma solução de S-22&& <0,5 ml de 1,0 mH e fosfato de sódio 0,05 M, NaCl 0,1 M, 0,01¾ p/v de Tween 80 pH <37°C> 7,4) numa cuvette de espectrofotómetro com o termostato ligado para 37°C. As leituras da absorvencia a 405 nm foram registadas com intervalos de 1,0 min durante 30 rain e em software on-board <Beckman Inc.) usado para calcular a taxa de variação da absorvencia em relação a cada intervalo sucessivo de 1 min, A desacilação realizou-se na cuvette, tendo a taxa de alteração de A405nra aumentado ao longo - 13 -

do tempo, Os dados da taxa obtidos quando a absorvencia excedeu um valor de 0,8 não foram usados devido ao efeito de deplecção do substrato, O conjunto de determinaçSes da taxa foi adaptado à função monoexponencial que se segue; ~Jrf· f<t> = A + <A -A > x <l-e > o max o onde A_ é a actividade inicial do enzima acílico e A . é a Ο actividade máxima possível apõs desacilação e foi determinada por desacilação de uma porção aliquota do enzima acílico em Tris. HCl 0,1 M, 20% p/v de gllcerol, STaCl 0,14 M, 0,01% p/v de Tween 80 pH 7,4 a 37°C durante 1 hora seguindo-se o ensaio amidolítico com S-2288 sob as condiçSes anteriormente referidas <isto é tampão fosfato pH 7,4, 37°C>. A e K, a constante da taxa de desacilação de primeira ordem, foram tratados como desconhecidos no processo apropriado e foram derivados por análise de regressão não linear num computador VAX 11/750. <xiii) Determinação da meia vida de desacilação do plasma A meia vida da desacilação para alguns compostos foi determinada no plasma humano em vez de na solução salina tampona da com fosfato. A medição da taxa de desacilação do plasma dos enzimas acílicos baseia-se na propriedade de inibição rápida, irreversível de activadores do plasrainogénio híbrido no plasma a seguir & sua desacilação. 0 enzima acílico <5nK> foi incubado em plasma com pH 7,4 e 37°C e foram removidas porçSes alíquotas de 100 μ.1 em vários pontos ao longo do tempo, O enzima acílico não complexado com inibidores foi isolado a partir de porçães alíquotas do plasma por precipitação da euglobulina. Adicionaram-se 18 volumes de ácido acético <0,01% v/v) à porção aliquota que foi então deixada em gelo durante 30 14 - minutos antes da centrifugação a 1.000 g durante 15 minutos a 4°C, Os precipitados foram dissolvidos em 10 vol de PBS-Tween <HaCl 0,1 Mj MaHgPC^ 0,05 X; 0,01% p/v Tvfeen 60 pH 7,4), A aetividade fibrinolítica no precipitado estabilizado foi medida sobre placas de fibrlna tal como foi descrito na secção <X) tendo como referência um conjunto diluido seriadamente de padróes adicionados ao plasma, precipitados imediatamente <como anterior-mente) e processados simultâneamente. O tempo de incubação nas placas de fibrina foi suficientemente longo <17-20 horas) para permitir a desacilação do enzima acílico e a produção de material activo. 0 nível de aetividade fibrinolítica medida nas porçóes alíquotas foi equacionado com a quantidade de material acilado permanecendo no plasma na altura da colheita de amostras. Um registo serailog da percentagem inicial da aetividade fibrinolítica teórica versus tempo foi linear. A meia vida de desacilação ê definida como o tempo ao qual 50 por cento da concentração teórica inicial do enzima acilado se tinha desacilado. B. Identificação de resíduos de amino ácidos, término em N e natureza da cadeia usada nos exemplos <i> ge.qyêa<2lag

Todas as numeraçóes de t-PA tal como em Fennica et al <1963> Mature 301. 214-321; numeração de amino ácidos do plasmi nogénio tendo como base «Sottrup-Jeneen et al <1976) Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, SuppI. 3, ρθΐ, Sational Bíomedical Research Foundation, Si1ver Spring. MD., mas adaptado a fim de incluir o residuo extra de amino ácidos identificado por Forsgren, M. et al (1967) FEBS Letters, 212 254-260, Sequências 15 - de nucleõtido do plasminogénio tal como in Forsgren et al (op. cit,), <ii> Término em N de actlvadores de plasminogénio híbrido

Glu.^ indica a proteina que se pensa compreender o término em 5 do plasminogénio nativo (nascente) isto é resíduos de amino ácidos 1 para a frente,

Lys^g indica que se pensa que a proteina compreende o término em N lys^^ processado, Término em N processado alternativo por exemplo met^ e vai ^ são conhecidos na natureza (Míyashíta et al 1985, Haemostasis 2_£ supp, 1, pp 7-13), Fensa-se que referências a formas terminais em N lys^g aqui indicadas incluam formas lys, vai e met, (iii) Natureza da cadeia sc, indica que a proteina se apresenta sob a forma de cadeia dnica, tc. indica que a proteina se apresenta sob a forma de duas cadeias C, Flasmídeo usado nos Exemplos pTRH37 (Patente Europeia No, O 297 882) - vector expressão para proteina H37 (plasminogénio 1-541/t-PA 262-257),

pTRE24 (Patente Europeia No, 0 207 589) ~ vector expressão para des(cysg^-aspg^) t-PA D, p*Anisato de p-amidofenilo HC1 foi preparado tal como foi descrito na Patente Europeia No, 0 009 879, 16

Exemplo 1

Expressão de plasminogrénio 1-541/t-FA 262-257 <H37) em células de Ovário de Cricetos Chineses O plasmídeo pSVgdhfr foi obtido a partir de American Type Gulture Colleotion <ATCC 37146; Molec, Cell Biol, 1; 854-864 1981>4 O plasmídeo BPV-KT-Xho foi obtido a partir de D, Hamer <Sational Institutes of Health, Bethesda, Karyland) e contem uma versão do gene metalotionein-l do ratinho <Hamer and Valling (1982? J, Mol. Appl, Genet, 2. 273-288) em que o sítio BglII justamente 5* em relação ao ponto de partida da translação foi convertido no sítio Xhol por ligação, A linha celular do ovário de criceto Chinês dhfr <CHO-DBX11> foi descrita préviamente (Urlaub, G, and L,A. Chasin, Proc. Hatl, Acad, Sei, £7 4216-4220), 1,1 Construção de um vector de expressão amplificâvel a► Construção de pTRH69 O plasmídeo pTEH69 foi construido a partir de dois fragmentos A e B isolados a partir do plasmídeo FSVgdhfr e do plasmídeo BPV-KT-Xho1 respectivamente.

Fragmento A - O plasmídeo PSV^dhfr <Fig, 1) foi linearizado com EcoRZ, sendo as extremidades tornadas embotadas por preenchimento e ligação com agentes de ligação Xhol, O plasmídeo linearizado foi então digerido com fragmento A libertando Xhol e BglII <um fragmento 3,4kb codificando a reductase dihidrofolato cADIT e sequências de promoção recente de

Fragmento B - O plasmídeo BPV MT-Xhol foi linearizado com Sstl, sendo as extremidades tornadas embotadas por digestão com nuclea-se e ligação usando agentes de ligação BglII. O plasmídeo linear 17 - foi então digerido com HindIII, sendo as extremidades embotadas por preenchimento e ligadas com agentes de ligação Hhol. 0 plasmídeo foi então digerido com BglΣ Σ e Xhol, fragmento de libertação B <0,3kb codificando as 3 sequências de poliadenilação de metalotionein) <Fig. 2>. Os Fragmentos A e B foram isolados por electroforese em agarose LMP e ligados entre sí. O ADM ligado foi transformado em B coli HB101 e o plasmídeo PTRH69 foi obtido <Fig, 3), b. Construção de pTSH70 O plasmídeo pTRH69 foi linearizado com Xhol e submetida a fosfatase. 0 fragmento purificado com agarose LMP foi ligado a um fragmento 3,3Kb Xhol derivado do plasmídeo pTEE24, que codifica uma proteina t-PA modificada. E coli HB101 foi então transformado com o ABi? ligado para se obter pTRH70 <Fig. 4>. o. Construção de pTRH13 0 plasmídeo pTKH7G foi digerido com Mlul e BamHl; um fragmento de 4,5Kb (compreendendo as funçbes vector? foi isolado por purificação em gel de agarose LMP e ligado com um fragmento 4,1Kb Mlul/BamHl isolado a partir de pTEH37 (codificando a proteina híbrida H37>. E coli HB101 foi transformado com σ ABM ligado e foi obtido o plasmídeo pTRH13 <Fig, 5?. 1.2 Expressão da proteina híbrida a. Preparação da célula Células CHQ foram tripsinisadas e colocadas em placa a 5 5 x 10 por disco de 60 mm e deixadas em meio de crescimento 18 - (meios nutritivos Hams F12 (041-01765) com 1% de glutamina no calde de cultura (043-05030), 1% de penicilina/estreptomicina no calde de cultura (043-05070) e 10¾ de soro de vitelo fetal bovino (011-6290); Gibco, Paisley, Scotland) a 37°C num incubador humidificado numa atmosfera de 5¾ de 00^/95¾ ar, Após 21 horas as células foram usadas para transfecção de AD2F. b. Processo de Transfecção 0 processo de transfecção, realizado em meio de crescimento usou coprecipitação de cálcio e choque de glicerol tal como é descrito em; DMA Cloning, Ed D.M. Glover (Chap. 15. C. Gorman). A seguir à transfecção cora pTEH13 as células foram mantidas em meio de crescimento durante 46 horas era condiçdes de crescimento (tal como anteriorraente) antes do processo de selecção. c. Seleccão e Co-araplificacão O processo de selecçáo e co-araplificação foi realizado essencialraente tal como foi descrito por K.J. Kaufman (1985) Molecular and Cellular Biology 5, 1750-1759. 46 horas após a transfecção as células foram mudadas de meio para ura meio selec-tivo MEM ALPHA (041-02571), glutamina do caldo a 1% (043-05030), penicilina/estreptomicina do caldo a 1% (043-05070) e soro de vitelo fetal bovino dialisado a 10¾ (220-6300AJ) (Gibco, Paisley, Scotland). As células foram mantidas num meio selectivo durante 8-10 dias até aparecerem colónias de células dhfr4. Quando se estabeleceram as colónias as células mudaram de meio para um meio selectivo contendo metotrexato, (A6770; Sigma, fingland), A concentração de metotrexato foi inicialmente de 0,02 μΚ e aumentou passo a passo até 5 pM. Lotes iniciais da proteina híbrida H37 foram produzidos a partir de um cultura de massa (CH0Z3) amplificada até 3 μΚ de metotrexato. Os õltimos lotes foram 19 - produzidos quer a partir de duas linhagens celulares <CHGZ5-C4 e CH0Z5-C13) que fora® isoladas por clonage® de anel a partir de cultura de nassa a®plifiçada até metotrexato 5 μΚ (CHGZ5), ou CH0Z5-C4E12, que é u® subclone (colocado e® placa co® diluição) de CH0Z5-C4« d> Deteccão de proteina híbrida H37

Durante o processo de amplificação porçães alíquotas do raeio de crescimento a partir de células era crescimento foram ensaiadas quanto â produção de activador do plasminogénio por placa de fibrina e zimografia tal como foi descrito nos ííôtodos, A zimografia revelou uma proteina fibrinolíticamente activa com Kr aparente de aproximadamente 100,000, que é consistente co® o peso molecular esperado da proteina híbrida H37. e, Purificação de proteina híbrida H37 Células CH0 transfectadas com pTKH13 (Exemplo 1.1c) e seleccionadas em relação à sobrevivência em 3 μ.Κ de raetotrexato 2 (Exemplo 1,2c) fora® recolhidas (100 ml por frasco de 175 c® ) durante 3 ou 4 dias em mistura nutritiva Hams F12: meio Eagles modificado de Dulbecco (50:50) e penicilina/estreptomicina a 1% (GIBCO; Paisley, Scotland) (notar, sem soro), 5,31 de meio condicionado a partir de um meio típico de 3* colheita foram recolhidos e purificados sobre Sepharose quelato de zinco (vt 240 ml) e Sepharose lisina (vt 60 ml) usando essencialmente o mesmo método que foi descrito em Dodd, Σ. et al <FEBS Lett,, 1936, 209. 13) exceptuando o facto da coluna de

Sepharose lisina ser eluida com dois tampSes contendo arginina em vez de sõraente um, 0 primeiro foi Tris 0,02M/SaCl 0,5M/L-arginina 0,25M/Tween 30 0,01¾ pH 7,4 e o segundo foi Tris 0,02»/ffaCl 0,5JÍ/ - 20 - L-arginina 0,5M/Tween SG 0,01% pH 7,4, Foram aplicados sequencial-mente na ordejn aqui indicada, 0 produto da eluição durante estas eluições foi fraccionado. As fracções contendo híbrido foram identificadas com um ensaio baseado em placa de microtitulação rápida usando S2288, (Nesta e em muitas outras experiências o híbrido foi eluido em produto de lavagem com arginina 0,5M, Contudo, noutras experimentações o híbrido é eluido em produto de lavagem de arginina G,25M; a razão não é conhecida mas parece relacionar-se com o nível de carga isto é mg de híbrido ligado por ml de gel da Sepharose lisina,) Foram reunidos e ultrafiltra-dos a 4°C usando uma membrana com um grau de admissão de peso molecular de 10,000 <Amicon, ‘ YK 10*), O ultrafiltrado retido <10,7 ml) continha aproximadamente 220,000 lU/ml e 23,000 SU/ral. Estes valores dão origem a uma relação IUíSU de 9,6 <mas ver comentários em Métodos,· ensaio>; outras purificações proporcionaram tipicamente H37 sc de boa qualidade com relações mais baixas, A análise por SDS PAGB sob condições redutoras seguida por coloração para a proteina usando Page Blue 83 <BDH> indicou que o produto retido continha pelo menos 80 por cento de proteina híbrida sc glu^. O produto retido foi armazenado a -40°C.

Bxemplo 2

Preparação de plasminogénlo de duas cadeias 1-541/t-FA 262-527 <tcH37> H37 de cadeia Gnica <10 mg ml ^ em Tris 0,02M/5aCl 0,5K/L-arginina 0,SK/Tween 80 0,01¾ pH 7,4; 0,5 ml) isolado a partir de linhagens celulares CHQZ5-C4 e -C13 foi misturado com -1 plasrainogénio lys humano <0,5 mg ml de tampão barbitona/solução salina; 3 pl) e incubado durante 2 horas a 37°C sendo então 21 armazenado a -40°C. A análise por SDS PAGE seguida por coloração da proteína e zimografia da proteína revelou que a maior parte do produto incubado se apresentava sob a forma glu^ de duas cadeias.

Exemplo 3

Preparação de plasminogénio de duas cadias 78-541/t-PA 262-527 <H37 _lys7ô._tç), A preparação de H37 lys^ to foi igual â descrita anteriorraente {Exemplo 2) exceptuando o facto do plasminogénio —1 lys do estoque ter um valor de 5 mg ml , de modo tal que a concentração final de plasminogénio foi 10 vezes mais elevada. As análises subsequentes confirmaram que o material era representado principalmente pela forma lyde duas cadeias.

Exemplo 4

Sintese de plasminogénio de cadeia finica p-anisoilo 1-541/t-PA 262-527 H37 sc purificado isolado a partir de principalmente a cultura de massa CH023 <60 nraoles em 1,95 ml de Tris 0,02Jí/NaCl 0,2M/L-arginina 0,2M/ Tween 60 0,01% pH 7,4) foi misturado a 25°C cora ρ’-anisato de p-amidinofenilo. HC1 <100 raM em DKSO, 40 jul) e incubado a 25°C durante 1 hora. 0 ensaio do incubado usando o substrato cromogénico S-2288 revelou 99% de inibição da activida-de presente em t = o. A fira de remover o agente de acilação em excesso, os 2,0 ml foram permutados cora tarapão para Tris 0,02M/$aCl 0,2M/L-arginina 0,2M/Tween 60 0,02% pH 7,4 usando Sephadex G25 <FDI0> e o produto foi armazenado a -40°G. - 22 - A solução foi descongelada e uma porção aliquota foi díluida em fosfato de sódio G,05K /MaCl 0,1M/Tween 80 0,01% pH 7,4 a 37 °C, A desacilação foi medida usando S-2288. Nas condições anteriormente referidas a meia vida da desacilação neste tampão foi de 32±2 minutos, equivalente a uma taxa de desacilação -4 -i constante de 3,5 x 10 sec «

Exemplo 5 Síntese de plasminoscénio de duas cadeias p-anisoilo 1-541/t-FA 262-527 H37 de duas cadeias foi preparado tal como foi descrito no Exemplo 2, 23 nmoles em 1,5 ml de Tris 0,02M/HaCl 0,5M/L-argi nina 0,5M/Tween 80 0,01% pH 7,4 foram misturados a 25°C com p'-anisato de p-amidinofenilo. HC1 <100 mM em BMSO, 30 pl> e incubado a 25°C durante 30 minutos. 0 ensaio do produto incubado usando S-2288 revelou 99% de inibição da actividade presente em t - 0. A mistura foi permutada com tampão para Tris 0,02M/MaCl 0,SJÍ/L-atginina 0,2M/Tween 80 0,01% pH 7,4 usando uma coluna de Sephadex G25 PD10. 0 produto permutado com tampão foi armazenado a -40°C, A meia vida de desacilação no plasma humano a 37°C foi de 35 minutos.

Exemplo 6 Síntese de plasminoarénio de duas cadeias p-anisoilo 78-541/t-FA 262-527

H37 lys^g de duas cadeias foi preparado tal como foi descrito no Exemplo 3. 21 nmoles de H37 lys^g tc em 1,5 ml de Tris 0,02M/3STaCl 0,5M/L-arginina G,5M/Tween 80 0,01% pH 7,4 foram misturados a 25°C com p‘-anisato de p-amidinofenilo. HC1 <100 mM 23 - em DMSO; 30 μΐ) e incubados a 25ÔC durante 30 minutos, O ensaio do produto incubado usando S-2288 revelou uma inibição de 99% da actividade presente em t = O, A mistura foi permutada com tampão para Tris 0,02M/KaCl 0,2M/L-arginína 0,2H/Tween 80 0,01% pH 7,4 usando uma coluna de Sephadex G25 PD10, 0 produto permutado com tampão foi armazenado a -40°C. A meia vida da desacilação do produto em plasma humano a 37°C foi de 34 minutos,

Sephadex Q25 é uma Marca de Fábrica,

I 24

Legendas para as Figuras Fig 1

Plasmídeo PSV_dhfr P = Sequência de poliadenilação do vírus do macaco) 3’ >ST40 I = Sequência intron vírus^ do macaco > DH = cAPíí reducatse dihidrofolato sv40e EcoRI = Promotor inicial vírus^ do macaco = Restrição sitio enzima: EcoRI foi ligado com agentes de ligação Xhol após digestão com EcoRI BglII - Sítio enzima restrição: BglII Fig 2

Plasmídeo BPV-MT-Xhol

BVP = Sequências de papilomavirus bovino HT-1 = Sequências de genes metalotionein de ratinho - incluindo a sequência 35 poliadenilação <0»3Kb fragmento B) Sstl = Restrição sítio enzima: Sstl foi ligado com agentes de ligação BglII após digestão com Sstl Hindi II = Restrição sítio enzima: HindiII foi ligado com agentes de ligação Xhol após digestão com HindiII

HindiII 25 -

Fig 3

Plasmídeo t>TEH69 HMT 3* = Sequências poliadenilação metalotionein de ratinho í

Fragmento B retirado do plasmídeo BFV-MT-Xhol

BH = cABH reductase dihidrofolato > Fragmento A SV^E = Fromotor inicial vírus^ do aacaco) retirado do plasmídeo PSV_dhfr 2

Xhol = Restrição sítio enzima Xhol

BglII = Restrição sítio enzima BglII

Fig 4

Plasmídeo PTRH7Q LTE = Terminal longo vírus sarcoma de Rous> 3,3Kb repetir ) <XhoI> SV40 3' = Intron vírusdo macaco e > fragmento sequências poliadenilação > de PTSE24 HUT = cADE Muteina t-PA ) MMT3' BH SV40 Bara Hl, = Sequências poliadenilação metalotionein de ratinho = cABE reductase dihidrofolato = Promotor inicial do vírus do macaco JfluI, Xhol f indicam sítios de restrição 26

Fig 5

Plasmídeo pTPH13 LTE = Terminal longo vírus sarcoma de Kous> 4,1Kb <Bam repetir ) HI-MluI> SV403’ = Intron virus^ de macaco e ) fragmento sequências poliadenilação > de pT!H37 H37 = cADN proteina híbrido H37 ) MMT3' = Poliadenilação metalotionein de ratinho sequências DH = cADN reductase dihidrofolato SV40B BaraHI , = Promotor inicial vírus^ do macaco MluI ,* indicam sítios de restrição.

Claims (1)

1. REIYIMDZCAC3ES lâ. - Processo para a preparação de 4-metoxibenzoi 1 --plasminogénio 1-541/t-FA 262-527 incluindo variantes de uma e de duas cadeias, variantes lys^g e glu^, e suas misturas, caracterizado por compreender a reacção de plasminogénio 1-541/t-PA 262-527 incluindo variantes de urna e de duas cadeias, variantes lys^g e fflUj, e suas Misturas com um agente de bloqueamento JK em que J é um grupo de localização que faz a mediação da ligação do agente ao sítio catalítico do enzima e K é um grupo p-metoxiben-zoilo. ga, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o 4-metoxibenzoil-plasminogénio 1-541/t-PA 262-257 glu^, variante de cadeia única. 3ã. - Processo para a preparação de plasminogénio 1-541/t-PA 262-527, glUj, de cadeia única, caracterizado por compreender a expressão do AD& que codifica o composto numa célula hospedeira e a recuperação do produto. 4*. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a mistura de um composto tal como foi definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, com um veículo farmacêuticamente aceitãvel. 5&. - Método para o tratamento de doenças trombôticas, caracterizado por compreender a administração a um doente de uma quantidade não tóxica eficaz de um composto tal como foi definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo a gama de dosagem 26 de composto activo de desde 0,01 até 10 mg por quilograma de peso corporal por dia. Lisboa, 14 de Junho de 1991

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON. 10-A 3.° 1200 LISBOA