JP2003514790A - 可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所送達による血栓溶解の方法 - Google Patents
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所送達による血栓溶解の方法Info
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Abstract
Description
/438,331号の一部継続出願である。
不活性化された酸性化プラスミンを用いる血栓溶解の方法および血栓の近傍へま
たは直接その中への酸性化プラスミンの局所送達に関する。この治療方法は、カ
テーテル誘導供給が可能なあらゆる場所の血栓の溶解に特に適用される。
塞および虚血性卒中は、西側世界での死亡および障害の第一および第三の原因で
ある。閉塞性血栓症は、重要な器官への血流の欠失をもたらし、局所酸素不足、
細胞壊死および器官機能の欠損を発生する。早期の再疎通をもたらす迅速な血栓
の破壊には大きい利益がある。これは細胞死を防ぎ、梗塞の大きさを小さくし、
器官機能を保存し、そして早期および後期の死亡を低下させる。血栓溶解治療は
、現在世界中で1年間に750,000人以上の患者に施され、一方その数の何
倍ものがこの治療により利益を受ける可能性がある。
活性化因子である。数種の異なるプラスミノーゲン活性化因子が現在当面の臨床
使用のために利用でき、そして数種の新世代のプラスミノーゲン活性化因子:組
織プラスミノーゲン活性化因子、tPA、およびその第二世代後継剤のTNK−
tPA、RETEPLASETM(tPAの欠失変異体)、一本鎖ウロキナーゼ形
プラスミノーゲン活性化因子(scuPA、またはプロ−ウロキナーゼ)、ウロ
キナーゼ(UK)、ストレプトキナーゼ(SK)、およびアニソイル化(anisoyl ated) プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体(APSAC)が
臨床試験の対象となっている。tPA、scuPA、およびUKが通常ヒト内で
低レベルで見いだされる。ストレプトキナーゼは強力な血栓溶解活性を有する細
菌酵素である。APSACは、アニソール化ストレプトキナーゼ−プラスミノー
ゲン複合体である。すべての場合に、プラスミノーゲン活性化因子は、酵素前駆
体プラスミノーゲンを活性プロテアーゼであるプラスミンに変換できる。tPA
およびscuPA(およびより低い程度で、APSAC)により提供される利点
は、これらのプラスミノーゲンの活性化が繊維素特異性であることである。繊維
素への結合は、実現すべきこれらの完全なタンパク質分解性の前提条件である(H aber et al., 1989)。ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼは、繊維素の不在
下でプラスミノーゲンを活性化できる。繊維素に対するこのような親和性の変化
は、全身出血が動物モデル内で起きるという範囲内では重要な結果を有する。し
かしこれらの差異は、臨床的には認められていない。
ンに活性化することによりそれらの血栓溶解能力を全般的に行使する。哺乳類中
の主要な繊維素溶解酵素であるプラスミンは、血漿内で循環する不活性の酵素前
駆体プラスミノーゲンから誘導されるトリプシン類似の特異性を有するセリンプ
ロテアーゼである。プラスミノーゲン自体は、N−末端グルタミン酸残基を有す
る791個のアミノ酸のポリペプチドである。プラスミン活性化因子、例えば組
織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)またはウロキナーゼは、一本鎖プラス
ミノーゲン分子をArg561 −Val562 ペプチド結合で切断して活性プラスミ
ンを産生する。得られたプラスミンの2個のポリペプチド鎖は、2個の鎖間ジス
ルフィド架橋により一緒に保持される。25kDaの軽鎖は触媒中心を有しそし
てトリプシンおよびその他のセリンプロテアーゼに相同である。重鎖(60kD
a)は、高度に類似したアミノ酸配列を有する5個の三重ループクリングル構造
からなる。これらのクリングルの一部は、繊維素、α2 −アンチプラスミンまた
はその他のタンパク質とのプラスミノーゲンおよびプラスミン相互作用に関係す
るいわゆるリシン−結合部位を含む。
使用に関連する固有の問題は、これらの使用に伴う出血合併症であり、これには
例えば患者の20%以上における胃腸内出血が含まれる。臨床的に最も危険な頭
蓋内出血は、現在の血管溶解治療の頻繁で致死的な副作用であり、そして患者の
約1%に起きる。出血の機序は多元的でありそして保護的な止血性血栓の溶解お
よびその結果、血管本体の欠損による血管損傷の露出によると考えられる。これ
は、繊維素溶解系の全身的活性化とこれに付随するクロット形成因子の欠失と組
み合わされる。さらに最近の研究の焦点は、改善された繊維素特異性を示す変性
プラスミノーゲン活性化因子の生成に置かれている。これは出血合併症の量を低
下すると期待された。ある場合には、これらの新しい活性化因子はこれらのクロ
ット形成因子、例えばフィブリノーゲン、第8および第5因子、プラスミノーゲ
ン、およびα2 −アンチプラスミンの循環レベルを保存することに役立つ。これ
らは血栓内に存在する繊維素分子を特異的に標的としそして結合し、そしてこの
ように結合した場合にプラスミノーゲンに対してのみ作用する。これは、プラス
ミノーゲンが血栓の近傍においてのみ活性プロテアーゼプラスミンに切断されそ
して繊維素の非特異性全身切断のレベルを低下させる結果を有する。しかし、こ
れらの新しいプラスミノーゲン活性化因子を用いる出血性合併症の数は、変化が
ない。
ナーゼおよびウロキナーゼの血管の血栓閉塞の程度の低下における臨床的成功は
、確証されている。従って、プラスミノーゲン活性化因子は、急性心筋梗塞およ
び心臓のその他の血栓性症状の治療技術に選択される処置となった。しかしなが
ら、心筋梗塞、閉塞性卒中、深部静脈血栓症および末梢動脈障害を含む種々の障
害は、重要な臨床的課題として残り、そして現在使用されている既知のプラスミ
ノーゲン活性化因子は血栓の排除におけるこれらの全般的有用性に影響を与える
種々の限定を受ける。心筋梗塞では、血管流量は、患者の約50%で90分以内
に回復し、一方、急性冠動脈再閉塞は、患者の約10%で起きる。冠動脈再疎通
には、平均して45分以上を要する。主として頭蓋内出血による残留死亡率(res idual mortality)は、まだ血栓溶解処置がない場合の死亡率の少なくとも50%
である。
効力および繊維素特異性の改善ならびに新規薬剤の発見に焦点が当てられている
。この努力の多くは、血栓の足場を形成する繊維素へプラスミノーゲン活性化因
子に向けられ、そして血流内に投与された場合に活性化因子の薬剤動態を改善す
ることに集中された。これは、活性薬剤への患者の暴露を長期化しそして同伴す
る望ましくない全身出血の危険を伴う連続投与としてよりも、一括大量投与(bol us dose)としてのこれらの投与を可能とする。
スイコウモリ(Vampire bat) 唾液プラスミノーゲン活性化因子を用いる第2相臨
床試験の結果に基づいて、新しいプラスミノーゲン活性化因子の安全プロフィー
ルにおいて予想された改善は、血栓治療の後に臨床的には実現されなかった。頭
蓋内出血および卒中を含む中程度ないし大規模出血事例の割合は、当初の非変性
tPAと同程度であった。詰まった動脈は早期には開かず、そして再閉塞の速度
は変わらなかった。これらの活性化因子の唯一の長所は、長くなった血漿半減期
および一括大量投与の可能性であると考えられる。
O)で見いだされる長期クロットの処置において効力が限定されることである。
これらの血栓は、典型的には熟成(age) しそして著しい大きさまで成長できる。
本来の動脈および移植組織中の両方に見いだされる末梢血栓の平均の大きさは、
31±11cmである。熟成しそして収縮(retract) した血栓はプラスミノーゲ
ンを欠き、従ってこれらはプラスミノーゲン活性化因子誘導血栓溶解への古い血
栓の可能性を限定する。これは、ウロキナーゼを用いて24時間以上処置される
PAOを有する患者には全く通常のことであり、そしてこの長期間の後でも血管
の完全な開通は得られない。プラスミノーゲン基質のレベルが低下している血栓
の内部までの直接カテーテルを介する現存の血栓溶解剤の送達に関しては、問題
がさらに大きい。
化因子の全身投与に関連する問題を回避するための基本的に異なる方法は、プラ
スミン自体を患者に直接投与することである。これは、プラスミンが最終的には
プラスミノーゲン活性化因子により開始された血栓溶解を媒介する酵素であるか
らである。収縮した血栓内へ直接の活性プラスミンの直接送達は、これらの血栓
の固有のプラスミノーゲン欠失を回避しそしてプラスミノーゲン含有率にかかわ
らず予測可能、迅速で効果的な血栓溶解を与える。
へのプラスミンの非経口投与を含む繊維素溶解処置を開示している。処置の濃度
および時間は、活性プラスミンが血管内血栓の部位で、血栓を溶解するかまたは
循環フィブリノーゲンレベルを低下させるために十分な濃度に達するために十分
であった。しかし、Reich et al.は、身体内に導入する直前にプラスミノーゲン
からのプラスミン生成を要求する。
定化されると主張されているブタプラスミン製剤を開示している。このプラスミ
ン溶液は、血栓溶解治療のためにヒトに全身投与する前に中和される。
有用なプラスミン組成物を開示している。Yago et al. の組成物は、低濃度の中
性pHプラスミンおよび1)少なくとも2個のアミノ酸から成るオリゴペプチド
、または2)少なくとも2個のアミノ酸、または3)1個のアミノ酸および多価
アルコールであってもよい追加の成分からなる。
活性化因子の種類とは明確に異なる。プラスミンは可能な血栓溶解剤として研究
されたけれども、多数の技術的な困難がこの繊維素溶解酵素の有効な臨床使用を
妨げている。これらの困難は、不活性前駆体、プラスミノーゲンからプラスミン
を生成するために使用されるプラスミノーゲン活性化因子のあらゆる機能的痕跡
を含まない純粋のプラスミンを製造するという問題を含む。これらの初期プラス
ミン製剤の血栓溶解活性は、プラスミン自体よりもむしろ結果的に混入したプラ
スミノーゲン活性化因子の存在による。しかし、混入したプラスミノーゲン活性
化因子も、標的血栓とは異なる部位で全身性出血を開始させる。プラスミン製剤
のために使用されるストレプトキナーゼの別の欠点は、プラスミン調剤中のこの
存在が、発熱およびアナフィラキシーショックを含む不利な免疫応答をしばしば
起こすことである。
アーゼとして、これが生理的pHにおいて自己分解および活性の欠損の傾向が高
いことである。これは使用の前の長期間の貯蔵に適する高品質で安定なプラスミ
ン製剤の製造、および閉塞性血栓を患うヒト患者へのプラスミンの安全で有効な
投与に関して厳しい課題をもたらす。
して標的とした血管血栓閉塞に遭遇した際に活性である活性プラスミンの安定な
形を投与する方法である。
活性化した形を直接送達する血栓の溶解方法である。
特には頭蓋内出血を示す血栓溶解の方法が要求される。
から完全に明らかになりあるいは本発明の実施により習得されるであろう。
血栓内にまたはその近傍に投与することにより改善できるという発見に関する。
精製されたプラスミンは、生理的pHでは自己分解のために不安定であり、従っ
て、プラスミンは治療的投与のために容易には利用できない。本発明は、プラス
ミノーゲン活性化因子を本質的に含まない薬剤的に許容できる可逆的に不活性化
された繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与することを含んでなる、血管血
栓閉塞を有するヒトまたは動物に繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する
方法を提供する。本発明は、薬剤的に許容できるキャリヤーが低緩衝能力を有す
る、プラスミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなる可逆的
に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法をさ
らに提供する。
キャリヤーを含んでなり、薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーが水およびカル
ボン酸、アミノ酸または低緩衝能力を有するその他の化合物の形の酸より選ばれ
る薬剤的に許容できる酸を含んでなりそして酸性化キャリヤーが約4.0未満の
pHを有する、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与
量を投与する方法も提供する。
または多価アルコールをさらに含んでなる、可逆的に不活性化された酸性化プラ
スミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーの治療的投与量を投与する方
法を提供する。
質的に含まない可逆的に不活性化された酸性化セリンプロテアーゼ、低緩衝能力
緩衝液、および場合により安定化剤を含んでなる。このようなセリンプロテアー
ゼは、トリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼII、カテプシンG、前
立腺特異性抗原、白血球エラスターゼ、キマーゼ、トリプターゼ、アクロシン、
ヒト組織カリクレイン、およびプラスミンを含む。プラスミンは、ミディ(midi) −プラスミン、ミニ(mini)−プラスミン、またはミクロ(micro) −プラスミンを
含み、これらに限定はされないGlu−プラスミン、Lys−プラスミン、これ
らの誘導体および変性または末端切断変種を含む。
化剤を含んでなる。本発明に使用されるプラスミンは、プラスミノーゲンを活性
化することにより得られ、そしてプラスミンの安定な製剤を提供するために約4
未満のpHを有する酸性化溶液中で単離および貯蔵される。本発明の繊維素溶解
性組成物は凍結乾燥してもよく、そしてプラスミノーゲン活性化因子を本質的に
含まない。プラスミン組成物の低緩衝能力は、血栓または血清に投与された場合
に生理的pHへの迅速な滴定(titration) を可能とする。血栓溶解治療のために
クロット部位に直接低緩衝能力溶液中で投与された場合に、酸性化プラスミンは
迅速に中和されそして活性化される。
連して考慮して以下に記載の詳細な説明を見れば明確となるであろう。
を、実施例への参照を含めて以下の本明細書中にさらに具体的に記載する。本説
明は、本発明の一般原理を説明することを目的とするものであり、限定的な意味
に解釈すべきではない。
性組成物の使用を可能とする血栓溶解および血管血栓閉塞へのプラスミンの局所
送達の方法に対する要求に対応する。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を
本質的に含まない薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解
性組成物の治療的投与量をヒトまたは動物に非経口的に投与し、投与した繊維素
溶解性組成物を血栓閉塞と相互作用させ、ヒトまたは動物の血のレベルを測定し
、そして血液流量の事前に選定したレベルに到達するまでこれらのステップを反
復することを含んでなる、血栓閉塞を有するヒトまたは動物への繊維素溶解性組
成物の治療的投与量を投与するための方法を提供する。本発明の方法は、さらに
低緩衝能力緩衝液中のプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない可逆的に
不活性化された酸性化プラスミンを含んでなる繊維素溶解性組成物の使用も提供
する。本方法は、血栓の中またはその至近の位置への繊維素溶解性組成物の血管
内カテーテル直接送達を提供し、これにより繊維素の全身的分解を最小化し、一
方では血栓に対する最高プラスミン活性を保持する。
または実際にその中への可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所投与は
、血栓溶解のための魅力的な治療機会を与える。活性セリンプロテアーゼである
プラスミンは、直接血栓溶解剤であって、血栓に近傍における酵素前駆体プラス
ミノーゲンの存在を必要とするプラスミノーゲン活性化因子とは異なる。活性プ
ラスミンを用いる局所カテーテル−誘導血栓溶解治療は、完全な血栓溶解を達成
するように調節ができ、そしてプラスミンはさらに安全な血栓溶解剤である可能
性を有し、それは、局所送達のために必要な低い用量が、プラスミノーゲン活性
化因子により誘導される高い用量血栓治療にしばしば伴う出血合併症を著しく低
下するからであろう。血栓部位の至近部分からのプラスミンのいかなる漏洩も、
循環α2 −アンチプラスミンにより迅速に中和される。
多くの技術的問題があった。プラスミンは活性セリンプロテアーゼであり、そし
て生理的pHにおいて自己消化および不活性化される。不幸なことには、プラス
ミン分解は、生体内血栓溶解のために必要なpH範囲内で最も顕著である。
ラスミンの維持、ならびに薬剤的に許容できる低緩衝能力緩衝液を有する酸性化
キャリヤー中のその製剤を含み、これによりプラスミノーゲン活性化因子を本質
的に含まない可逆的に不活性化された酸性プラスミン含有繊維素溶解性組成物を
提供する。繊維素溶解性組成物が、ヒトまたは動物への組成物の投与を可能とす
る薬剤的に許容できるキャリヤー、例えば限定はされないが水、生理的塩類溶液
、またはその他の溶剤の添加により再構成してもよい凍結乾燥組成物であること
は本発明の範囲内にあると考える。血管開通の回復に関するその効力は、生体外
アッセイおよび生体内ラビット頸静脈血栓溶解モデルで証明された。
合せ下では本質的に活性ではないがしかし条件の別の組合せに転移されると活性
形に変換する酵素活性を呼ぶ。
ントのヒトまたは動物により生理的に許容されるあらゆるキャリヤーを呼び、水
、塩溶液、生理的塩類溶液、または繊維素溶解剤、例えばプラスミンが溶解また
は懸濁されるその他のあらゆる液体またはゲルを含み、これらに限定はされない
。「薬剤的に許容できるキャリヤー」は、約4.0未満のpHを有するプラスミ
ン溶液を与えそして低または皆無の緩衝能力を有するあらゆる薬剤的に許容でき
る化合物を含んでもよい。
まで変化を始める前に緩衝液が中和できる酸または塩基の量を呼ぶ。本明細書中
に使用される場合に、低緩衝能力緩衝液は、低緩衝能力緩衝溶液の量に対して少
量の酸または塩基の添加によりpHが顕著に調節される。この用語は、塩酸、硝
酸および硫酸を含みこれに制限はされない強酸により酸性化され、そして緩衝能
力を有していない溶液を含むと考える。
、さらに典型的には約pH7.1〜約7.5の間のpHを呼ぶ。
えばカテーテル器具またはシャント)内の血栓を呼ぶ。血栓は、繊維素を含んで
なってもよくそして血小板、赤血球、白血球、脂質またはこれらのあらゆる組合
せをさらに含んでなってもよく、これらに限定はされない。「血栓」は、環状血
栓、球状血栓、ヒアリン血栓、壁状血栓、層状血栓または白色血栓であってもよ
くこれらに限定はされない。
管の部分的または完全な遮断を呼び、ここで血栓は少なくとも繊維素を含んでな
る。閉塞した血管は、静脈、動脈、細静脈、細動脈、毛細血管、血管床または心
臓であってもよくこれらに限定はされず、そしてヒトまたは動物身体のあらゆる
血管分布器官または組織内にあってもよい。血栓閉塞は、補綴血管および合成、
ヒトまたは動物由来の移植組織を含みこれらに限定はされないカテーテルまたは
その他の移植物であってもよく、そして繊維素を含んでなる閉塞により効果的に
遮断されている。
らゆるカテーテルまたは管状器具を呼び、そして動脈カテーテル、心臓カテーテ
ル、中心(central) カテーテル、中心静脈カテーテル、静脈内カテーテル、バル
ーンカテーテル装置、末梢挿入中心カテーテル、肺動脈カテーテルまたはトンネ
ル状中心静脈カテーテルおよび動静脈シャントを含み、これらに限定はされない
。
4.0未満のpHまで酸性化されたあらゆる薬剤的に許容できるキャリヤーを呼
ぶ、「薬剤的に許容できる酸性化キャリヤー」は、低または皆無の緩衝能力の緩
衝液、例えば無機酸の添加により約4.0未満のpHまで酸性化されたカルボン
酸、例えばこれらに限定はされないがギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、クエン
酸、コハク酸、乳酸またはリンゴ酸、または少なくとも1種のアミノ酸、例えば
これらに限定はされないがグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、トレオ
ニンまたはグルタミンまたは少なくとも1種の無機酸、例えばこれらに限定はさ
れないが硫酸、塩酸、硝酸またはリン酸またはこれらのあらゆる組合せを含んで
なってもよい。薬剤的キャリヤーの酸部分が、薬剤的に許容できるキャリヤー中
のpHを約4.0の値未満に保持する少なくとも1種の生理的に許容される緩衝
液、オリゴペプチド、無機または有機イオンまたはこれらのあらゆる組合せであ
ることは本発明の範囲内であると考える。
類または二糖類、例えばこれらに限定はされないがグルコース、フルクトース、
マルトースまたはマンノース、ソルビトールおよびマンニトールを含み、これら
に限定はされない糖アルコール、および多糖類、例えばこれらに限定はされない
がデキストリン、デキストラン、グリコーゲン、デンプンおよびセルロース、ま
たはヒトまたは動物に薬剤的に許容できるこれらのあらゆる組合せまたは誘導体
を呼ぶ。
ばこれらに限定はされないが、グリセロール、アスコルビン酸、ナイアシンアミ
ド、グルコサミン、チアミンまたは無機塩、例えばこれらに限定はされないが塩
化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムまたはプ
ラスミンの製剤の安定性を増加するこれらのあらゆる組合せを呼ぶ。
、生理的条件下でタンパク質分解的に繊維素を切断する能力があるが、しかし約
pH2.5〜約4.0のpHに置かれた場合には可逆的に不活性化されるプラス
ミンのあらゆる触媒活性形を呼ぶ。本明細書中に使用される用語「不活性化」は
、生理的pHにおける活性と比較して酵素活性における全面的または本質的な低
下を呼ぶ。本明細書中に使用される用語「活性プラスミン」は、プラスミンがタ
ンパク質分解的に繊維素を切断可能である条件下にあるプラスミンを呼ぶ。用語
「プラスミン」は、Glu−プラスミン、Lys−プラスミン、これらの誘導体
、変性または末端切断された変種を含み、これらに限定はされない。用語「末端
切断された(truncated) 変種」は、その全体を引用して本明細書中に編入する米
国特許(US)第4,774,087号に開示されているようなミディ−プラス
ミン、ミニ−プラスミンまたはミクロ−プラスミンを含み、これらに限定はされ
ない。
る化合物を呼び、ヒルイジン、ヘパリン、血栓阻害因子、血小板阻害因子、血小
板凝固阻害因子およびこれらのあらゆる誘導体または組合せを含み、これらに限
定はされない。
繊維素を切断できるあらゆるセリンプロテアーゼを呼び、プラスミン、トリプシ
ン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼII、カテプシンG、前立腺特異性抗原
、白血球エラスターゼ、キマーゼ、トリプターゼ、アクロシン、ヒト組織カリク
レインを含み、これらに限定はされない。
栓周囲またはその中でのプラスミノーゲン利用可能性である。血栓への繊維素溶
解剤の局所送達は、ここでプラスミン自体が血栓に直接投与される強力な治療剤
であることを可能とする。現在血栓溶解剤として使用されている種々のプラスミ
ノーゲン活性化因子とは異なり、プラスミンを用いる直接局所血栓溶解治療は、
クロット溶解を達成するために必要なあらゆるレベルまで強化できる。これは、
プラスミンが繊維素ポリマーに直接作用するからである。さらに、プラスミンは
、血栓内またはその近傍に直接送達されると、慣用の血栓溶解治療に典型的には
伴う全身出血の付随的低下を伴って投与されるさらに低い有効用量を可能とする
。過剰のプラスミンは、循環α2−アンチプラスミンにより迅速に不活性化され
ることもできる。
純度は95%を越え、そして比活性は、18〜23CU/mgの範囲内であった
。プラスミン製剤は、ウロキナーゼ、またはプラスミンへのプラスミノーゲンの
変換のために使用されるあらゆるその他のプラスミノーゲン活性化因子を本質的
に含まなかった。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まないプ
ラスミンが、哺乳類血清、組換えプラスミノーゲンまたは末端切断プラスミノー
ゲン、例えばこれらの限定はされないが、その全体を引用して本明細書中に編入
する米国特許(US)第4,774,087号中でWu et al. により開示された
ように、ミニ−プラスミノーゲンおよびミクロ−プラスミノーゲンを含み、これ
らに限定はされないあらゆる原料から調製されてもよいことも包含する。
ラムに結合することによりプラスミノーゲン活性化因子を本質的に除去するまで
精製されそして次いで溶離されるプラスミンを捕集しそして低緩衝能力緩衝液を
含む酸性化した薬剤的に許容できるキャリヤー中に保管された。結果は、約2.
5〜約4.0の範囲内の低いpHが、プラスミン組成物を室温以上に保持しても
大幅に安定化した。いかなる一つの理論もにとらわれないが、この低いpH値に
おいては、プラスミンはさもなければ自己分解に導くであろうセリンプロテアー
ゼ活性をもう有していないと考えられ、これは、約7.0〜7.5の間の生理的
pHでプラスミンが貯蔵された場合に見られることである。
接またはその至近位置に投与された場合に、低または皆無の緩衝能力緩衝液中の
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、約7.4の生理的pHにある血清
緩衝能力と遭遇する。薬剤的に許容できるキャリヤーの低緩衝能力は中和され、
これにより、プラスミンはその活性状態に復帰しそして血栓の繊維素をタンパク
質分解的に消化する。
活性とし、そして同様にあらゆるプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まな
いプラスミン調製の方法を最初に使用することにより、望ましくない全身出血を
誘発する可能性は低下される。過剰に投与されたプラスミンは、循環血清阻害因
子、例えばα2 −アンチプラスミンにより迅速に不活性化され、そしてさもなけ
れば離れた位置で繊維素溶解を誘発するように循環する比較的安定なプラスミノ
ーゲン活性化因子は本質的に存在しない。
きるキャリヤー、例えば、これに限定されるものではないが、5mMグリシン水
溶液中で容易に貯蔵できる。pHが約2.5〜4.0の範囲内である場合には、
あらゆる薬剤的に許容できるイオンを単独または組み合わせて使用してもよい。
典型的には、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、3.1〜3.5のp
Hに維持される。低pHを維持するためにキャリヤー中に混合される薬剤的に許
容できる酸性イオンは、オリゴペプチド、少なくとも1種のアミノ酸、または有
機もしくは無機酸またはこれらの組合せより選ばれてもよい。安定化は、炭水化
物であってもよく、これに限定はされない少なくとも1種の薬剤的に許容できる
化合物の含有によりさらに増強されてもよい。
処置する方法の説明は、本出願と共通して譲渡されそして同時に出願された米国
特許(US)出願番号第 号、名称「可逆的に不活性化された酸性化
プラスミン」(Reversibly Inactivated Acidified Plasmin)に開示され、そして
その全体を引用することにより本明細書中に編入する。
ための方法は、本出願と共通して譲渡されそして同時に出願された米国特許(U
S)出願番号第 号、名称「可逆的に不活性化された酸性化プラスミ
ン組成物の製造のための方法」(Process for the Production of a Reversible Inactivated Plasmin Composition)に開示され、そしてその全体を引用すること
により本明細書中に編入する。
として血栓内へ直接、または血栓から短距離の近傍の部位のみへプラスミンを送
達し、その際にこれが血栓と迅速に遭遇できるあらゆる方法により可能である。
血栓への距離を最短化することによりまたはクロット内への直接投与により、送
達針またはカテーテルと血栓との間に存在する血清内のプラスミン阻害因子への
プラスミンの暴露が低減される。本発明は、可逆的に不活性化された酸性化プラ
スミンがカテーテルにより血栓に送達されてもよいことを意図する。本発明は、
カニューレ挿入針、例えばこれには限定されないが注射器針を血栓内への可逆的
に不活性化された酸性化プラスミンの注入に使用してもよいこともさらに意図す
る。しかし、ヒトまたは動物内の特定の位置へ液体を局所的に投与するための当
該技術分野の熟練者に既知のあらゆる手段が、本発明の範囲内である。血管また
は冠動脈血栓へのカテーテル送達は、特に血栓内でのプラスミンの位置決定にお
ける正確さをさらに可能とする。本発明は、低緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活
性化された酸性化プラスミンの血栓への局所送達の方法を提供するけれども、ヒ
トまたは動物内に移植されたカテーテルの繊維素閉塞へのこれらの可逆的に不活
性化された酸性化プラスミン組成物の送達も本発明の範囲内である。
量依存の様式で血栓を溶解できることが示された。繊維素溶解は、血栓周囲の血
漿内のα2 −アンチプラスミンまたはα2 −ミクログロブリンのいずれかの欠失
により、ならびにすべての阻害因子の欠失(例えばPBS中)により促進された
。これらの結果は、プラスミンによる血栓溶解が内因性プラスミン阻害因子によ
り著しく厳格に調節され、そしてさらに安全な血栓溶解治療の基礎を提供するこ
とを示す。
的に不活性化された酸性化プラスミン(1〜3mg/kg)の生体内効力を、ラ
ビット頸静脈血栓溶解モデルにおけるtPA(0.5および1.0mg/kg)
と比較した。血栓溶解の速度を測定した。さらに、第8因子およびフィブリノー
ゲンの消費、ならびに表皮細胞出血時間(Cuticle bleeding time) (CBT)を
全身溶解状態の指標として測定した。tPAの0.5mg/kgと比較して、プ
ラスミンは、同等または著しく良好な血栓溶解、同等の第8因子およびフィブリ
ノーゲンの消費および類似したCBTを1mg/kg投与量で示した。3mg/
kgのプラスミンでは著しく増加した消費およびCBTであった。tPAの1m
g/kgと比較すると、プラスミンおよびtPAの両方共に、非常に類似した血
栓溶解速度と同時に3mg/kgプラスミンにおいてフィブリノーゲンの著しく
低い消費を示した。
蔵されそして血栓溶解剤として、ヒトまたは動物に投与の前に中和することなく
カテーテル支援局所血栓溶解の間に使用できる。プラスミンは、tPAと比較し
て優れてはいないにしても同等の繊維素溶解活性を有し、そして安全性プロフィ
ールは局所血栓溶解剤送達のこの動物モデルでは少なくとも同等と考えられる。
ミクロ−プラスミンを含みこれらに限定はされないプラスミン、プラスミンの誘
導体、例えばこれらの末端切断形であってもよく、これらに限定はされないこと
は、本発明の範囲内に入ると考えられる。
接その中へのプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない液状繊維素溶解性
組成物製剤の治療的投与量を投与する方法を提供する。本発明は、プラスミンが
約4.0のpHで投与される前に安定化されてもよい、血管血栓閉塞への液状可
逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の治療的投与量を送達する方法を
さらに提供する。本発明は、血管血栓閉塞または血栓内に直接低緩衝能力緩衝液
内の液状可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの治療的投与量を投与する方
法を提供し、その際、プラスミン組成物は、プラスミンにタンパク質分解的に繊
維素を切断することを可能とする生理的pHに復帰する。
を特定し、低緩衝能力緩衝液中の薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された酸
性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量をヒトまたは動物に投与し、投与された
繊維素溶解性組成物に血栓閉塞と相互作用をさせ、ヒトまたは動物の血管流量の
レベルを測定し、そして血管流量の事前選択レベルに達するまで繊維素溶解性組
成物を投与するステップを反復するステップを含んでなる。
、プラスミンおよび低緩衝能力緩衝液を含む薬剤的に許容できる酸性化キャリヤ
ーを含んでなる。
よび薬剤的に許容できる酸を含んでなり、その際、酸は、カルボン酸、オリゴペ
プチド、アミノ酸であってもよく、しかしこれらには限定はされない有機酸、ま
たは無機酸であり、そして低または皆無の緩衝能力を有し、そして酸性化キャリ
ヤーは約4.0未満のpHを有する。
、酢酸、クエン酸、グリシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン
、およびアラニン酸形より選ばれる薬剤的に許容できる酸を含んでなり、その際
、酸性化キャリヤーは約4.0未満のpHを有する。
。
組成物は、約2.5と約4.0の間のpHを有する。本発明の方法の別の態様で
は、繊維素溶解性組成物は約3.7のpHを有する。
mg/mlまでの間の濃度範囲内にある。本発明の方法の別の態様では、プラス
ミンは、約0.1mg/mlから約10mg/mlまでの間の濃度範囲内にある
。
の間の濃度範囲内にある。本発明の方法の別の態様では、酸性イオンは、約1m
Mと約500mMとの間の濃度範囲内にある。
剤を含んでなり、ここで、炭水化物はグルコース、マルトース、マンニトール、
ソルビトール、スクロース、ラクトースまたはトレハロースから選ばれ、ここで
、糖は約0.2%(重量/体積)から約20%(重量/体積)までの範囲内の濃
度を有する。一つの態様では、糖はグルコースでありそしてその濃度は約20%
である。
mg(プラスミン)/kg(体重)との間の範囲内の可逆的に不活性化された酸
性化プラスミンの治療的投与量をさらに含んでなる。
は、血管内または血栓内に投与される。本発明の方法の一つの態様では、低pH
緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、血管内カテー
テル器具により血栓内に直接またはその近傍に投与される。本発明の方法のさら
に一つの態様では、血管内カテーテルは、血管閉塞に向けられる。
、および変種は、本開示を参考にして当該技術分野の熟練者には明らかであるこ
とは自明である。従って、本発明の精神および範囲内に入るあらゆるこのような
別法、変形、および変種は、記載の請求項に包含されると考えられる。
れるが、しかしこれを限定すると解釈すべきではない。
に本発明者により発見された技術であり、従ってその実施の好ましいモードを構
成すると考えることができることは当該技術分野の熟練者により認められるであ
ろう。しかし、当該技術分野の熟練者は、本開示を参考として、開示された特定
の態様内で多数の変化を行い、この場合にも本発明の精神および範囲から逸脱す
ることなく同様または類似の結果を得ることができることも認めるであろう。
ys−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーによりコーン画分(C ohn Fraction) II+IIIペーストから精製した。すなわち、ペースト200
gを0.15Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH7.8の2リットル中に再懸濁
した。懸濁液を一晩、37℃でインキュベーション、14,000rpmで遠心
分離、ガラス繊維を通して濾過そしてLys−セファロース4B(Pharmacia) 5
00mlと混合した。プラスミノーゲンの結合は、室温で2時間であった。次い
で、Lys−セファロースを2リットルガラスフィルター上に移し、そして数回
、0.3M NaClを含む0.15Mクエン酸ナトリウムを用いて280nm
における吸光率が0.05未満に下がるまで洗浄した。結合プラスミノーゲンを
0.2Mε−アミノカプロン酸の200ml部分を用いて3回溶離した。溶離し
たプラスミノーゲンを0.4g(固体硫酸アンモニウム)/ml(プラスミノー
ゲン溶液)を用いて沈降させた。粗(純度80〜85%)プラスミノーゲンの沈
降物を4℃で保管した。
ィークロマトグラフィーにより精製した。次いでCNBr−活性化セファロース
4Bと、50mM酢酸緩衝液、pH4.5中のLMW−ウロキナーゼ1.3mg
とを混合してウロキナーゼをカプリングし、そしてカプリング緩衝液、0.1M
炭酸水素ナトリウム、pH8.0 5mlを用いて希釈した。
混合し、そして0.1M HCl中で洗浄した。カプリングは氷上での振とう4
時間で起きた。過剰のCNBr活性基を0.1M Tris、pH8.0を用い
てブロックした。ウロキナーゼ−セファロースのそれぞれのバッチを5回使用し
そしてサイクルの間には4℃で水中の50%グリセロール中に保管した。組織プ
ラスミノーゲン活性化因子(ACTIVASE TM )はGenentech から入手した。プラスミ
ノーゲンを含まないフィブリノーゲンおよびα−トロンビン(3793U/ml
)はEnzyme Research, Incから入手した。α2 −アンチプラスミンは、Athens R esearch Technologiesから入手した。商業的に入手できるプラスミンは、Haemot ologic Technologies, Inc. から入手した。色素原性プラスミン基質S2251
はChromogenix から入手した。 125I−標識ヒトフィブリノーゲン(125〜2
50μCi/mg)はAmersham Pharmacia Biotechから入手した。SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動は、調製済8−25%グラジエントゲルおよびSD
S−緩衝ストリップを用いるPharmacia Phast System装置中で行った。実施例2:活性プラスミンの精製 (i)ウロキナーゼ−セファロースを用いるプラスミンへのプラスミノーゲンの
活性化 プラスミノーゲンをプラスミンに切断して、固定化プラスミノーゲン活性化因
子を用いることによる最終製剤の混入がないプラスミンが得られた。ウロキナー
ゼはプラスミノーゲンを直接切断する。ウロキナーゼによるプラスミノーゲン活
性化は、tPAの場合のように繊維素の存在には依存はせず、そしてウロキナー
ゼはヒトタンパク質である。これらの因子、およびその比較的低コストは、ウロ
キナーゼを好ましい活性化因子とするが、しかしこれは、繊維素分解が可能な活
性プラスミンを生成するtPS、ストレプトキナーゼまたはその他の切断手段の
使用を排除するものではない。粗プラスミノーゲンの硫酸アンモニウム沈降物を
14,000rpmで遠心分離しそして10mMリシン、80mM NaCl、
pH9.0を含む40mM Trisを用いる最小体積中に再懸濁し、10〜1
5mg/mlの最終タンパク質濃度に達した。プラスミノーゲン溶液を同じ緩衝
液に対して一晩透析し硫酸アンモニウムを除去した。透析したプラスミノーゲン
溶液(10〜20ml)を等量の100%グリセロールを用いて希釈しそしてウ
ロキナーゼ−セファロース5mlと混合した。50%グリセロールの使用は、活
性化の間に形成されるプラスミンの自己分解を低下する。プラスミンは50%グ
リセロール中で安定でありそして長期間−20℃でこの溶液中に貯蔵できる。
ファロースの新鮮度に依存して起きた。ウロキナーゼ−セファロースの新しいバ
ッチを用いると、活性化は2時間で完了できた。しかし、これは劣化し、そして
数回のサイクルの後に効率が低下し、プラスミノーゲン活性化の進行を測定する
ために還元性条件下でSDS−PAGEの使用を必要とした。活性化が完了する
と、プラスミン溶液をガラスフィルターを用いてウロキナーゼ−セファロースか
ら濾過し、そして直ちにベンズアミジン−セファロースに適用した。 (ii)ベンズアミジン−セファロース上のプラスミンの捕捉 プラスミンはトリプシン類似の特異性を有するセリンプロテアーゼなので、ベ
ンズアミジン−セファロースは活性プラスミンの捕捉が可能なアフィニティー吸
収剤である。50%グリセロール中のプラスミノーゲン溶液を、0.5M Na
Clを含む0.05M Tris、pH8.0を用いて平衡化した50mlのベ
ンズアミジン−セファロースカラムに、流量3ml/分で加えた。3〜7℃で3
ml/分でカラムに流した。非−結合ピークの初期部分は、高分子量不純物を含
んでいた。非−結合ピークの残りの部分は、残留非−活性化プラスミノーゲンお
よびプラスミンの不活性自己分解生成物であった。 (iii)低pH緩衝液を用いる結合プラスミンの溶離 中性pH条件での不活性化からプラスミンを保護するために、酸性溶離条件を
選定した。ベンズアミジン−セファロースに結合したプラスミンを、0.5M NaClを含む0.2Mグリシン緩衝液、pH3.0を用いて溶離した。結合ピ
ークは、典型的には3個のプール、すなわち2個の初期ピークB1およびB2、
およびB3として溶離する物質の本体ピークに別れた。
ンを含むことを明らかにした。しかしゲル分析は、プラスミンの重鎖および軽鎖
に加えて、10〜15kDaの範囲内の一部の低分子量バンドがプラスミンの部
分的内部切断分解の結果であることを明らかにした。
B2およびB3のプールは、分解程度が低かった。結合ピークの初期部分は、プ
ラスミン活性をほとんど有していず、そして通常廃棄された。この物質中の活性
の欠失は、クロマトグラフィーの間の自己分解によるらしく、それは、溶離物質
中にグリセロールが存在せず、そして初期部分のpHが平衡および溶離する緩衝
液のpHの中間、典型的にはpH6〜6.5の範囲内にあるからである。プラス
ミノーゲン活性化因子を本質的に含まない溶離したプラスミンを、2Mグリシン
緩衝液、pH3.0(捕集体積の10%)を含む管中に捕集した。 (iv)酸性化した水(pH3.7)中の溶離物質の配合 溶離したプラスミンを、氷酢酸を用いて約pH3.7に酸性化した水に対して
、または0.15M NaClを含み氷酢酸を用いて約pH3.7に酸性化した
水に対して透析した。
に許容できる酸性化キャリヤーを生成するあらゆる酸が使用できる。例えば、そ
の他の酸およびアミノ酸、例えばこれらに限定するものではないが、ギ酸、酢酸
、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、安息香酸、セリン、トリオニン、バリ
ン、グリシン、グルタミン、イソロイシン、β−アラニンおよびこれらの誘導体
を含み、これらに限定はされない無機酸、カルボン酸、脂肪酸およびアミノ酸を
単独またこれらのあらゆる組み合わせで、約2.5〜約4.0の間の薬剤的に許
容できるキャリヤー中のpHをを維持するものの使用が本発明の範囲内と考えら
れる。
内試験のためにこの形で効果的に使用できる。プラスミン特異性活性は、Robbin s & Summaria(1970)が記載した適応化カゼイン溶解アッセイを用いて測定した。
酸性化した水中の4%カゼイン溶液1mlおよび67mMリン酸ナトリウム緩衝
液、pH7.4の適当な体積をポリカーボネート試験管に加えた。溶液を渦攪拌
しそして37℃で10分間インキュベーションした。プラスミン試料または緩衝
液(ブランク)をそれぞれの管に15秒間隔で加え、十分に攪拌しそして37℃
で30分間インキュベーションした。15%トリクロロ酢酸3mlを加えて反応
を停止し、沈降物を15分間形成させた。管を3200rpmで20分間遠心分
離した。上清を小ビンに移しそしてそれぞれの試料のA280 を測定した。それぞ
れの試料の比カゼイン溶解活性は次式により算出した。
に決定した。実施例3:プラスミンのpH依存安定性 プラスミンは、その触媒活性の鐘形pH依存性を示す。図1に示すように、プ
ラスミンはpH7.5〜8.0で極大酵素活性を有し、そしてその活性は酸性側
およびアルカリ性側のpHの両方で急速に低下する。プラスミンは、最も不活性
であり、そしてpH4.0以下では触媒中心内のヒスチジンのプロトン化により
可逆的に不活性であり、これはRobbins & Summaria(1976)およびCastellino & P owell(1981) により証明されている。
軽鎖の両方は室温および4℃で数時間中で劇的に分解した。プラスミンは、0.
04Mリン酸ナトリウム、pH7.4中に1mg/mlで配合し、そして22℃
または4℃で6時間インキュベーションした。インキュベーションの間に、プラ
スミンの本体(integrity) を2時間毎に還元性SDS−PAGE分析を用いて分
析した。重鎖および軽鎖の両方共に22℃および4℃で数時間中で急速に分解し
、これを図1に示す。
) 1mg/mlにおけるプラスミンを種々の酸性条件下、37℃で14日間イン
キュベーションした。プラスミン重鎖および軽鎖の変化を還元性SDS−PAG
Eを用いて分析した。プラスミンを0.04Mリン酸ナトリウムpH7.4中に
1mg/mlで配合しそして同様に4℃で6時間インキュベーションした。イン
キュベーションの間に、プラスミン試料の活性を2時間毎に色素原効力(chromog enic potency) アッセイにより測定した。プラスミン効力は、MLA1600C
分析装置(Pleasantville, NY) を用いて定量的に測定した。プラスミンは、色素
原基質S−2403(D−ピログルタミル−L−フェニルアラニル−L−リシン
−p−ニトロアニリン ヒドロクロリドまたはpyro−Glu−Phe−Ly
s−pNAと短縮)を加水分解してペプチドおよび色素原基p−ニトロアニリン
(pNA)を生成する。色素形成の速度は、動力学的に405nmで測定した。
加水分解された基質の量は、試料中のプラスミン活性に比例した。標準曲線は、
色素形成の速度(OD/分)のプラスミン標準の効力に対する線型相関から作製
した。線型式と未知試料について観察された速度とを一緒に未知の効力を算出す
るために使用した。プラスミンの効力は、mg/mlの単位で報告した。
下し、これを表2に示す。
した。
月間低温で、活性低下またはタンパク質分解または酸性性質の分解生成物の出現
がなく保管できた。図2および表3のデータは、4℃および室温におけるプラス
ミンの安定性を示す。
%として正規化した。HAc/NaAc=酢酸/酢酸ナトリウム) 4℃で、プラスミンは少なくとも9カ月間安定である。室温でも、可逆的に不
活性化された酸性化プラスミンは、少なくとも2カ月は安定である。室温におけ
る長期安定性は、これがこの配合物を血栓溶解投与の長期治療計画に適合させる
ので重要である。例えば、血栓溶解剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子
またはウロキナーゼの36時間投与は、末梢動脈閉塞の治療において慣用である
からである。SDSゲルのそれぞれのレーン内での全タンパク質に関する重鎖割
合に対するpHのプロットを図3に示す。この結果は、緩衝液の種類または緩衝
液濃度とは無関係に、約3.1〜3.5のpH安定性極大を実証する。
ラスミンの能力は、カゼイン溶解アッセイおよび 125I−繊維素−標識血栓溶解
アッセイにおけるその活性によっても明らかにされる。これらの両方のアッセイ
はpH7.4で行われ、そしてpHの変化および等電点(pH5〜5.5)を通
る間にプラスミン活性が完全に回復した。プラスミンは低緩衝能力溶剤中に配合
され、そして、緩衝された溶液、例えば血漿に加えられると、これは迅速に中性
または生理的pHを直ちに取り、そし等電点を通る遅い過程に通常は伴う沈降は
起きない。実施例4.プラスミンはプラスミノーゲン/プラスミノーゲン活性化因子混合物 と同じ固有繊維素溶解効力を有する。
固有繊維素溶解効力を有する。プラスミンの繊維素溶解効力をLys−プラスミ
ノーゲンとtPAとの混合物のものと比較した。これらの実験は、PBS中に浸
漬した 125I−放射能標識繊維素血栓から成る規定の系内で行った。図4は、緩
衝された環境内で、プラスミンを用いて達成される血栓溶解が、Lys−プラス
ミノーゲンとtPAとの混合物とほとんど一致することを示す(それぞれ曲線a
およびb)。同時に、tPA単独(曲線c)またはいかなるタンパク質も存在し
ない場合(曲線d)には血栓溶解が観察されなかった。tPA単独を用いて得ら
れたデータは、その活性がその基質、プラスミノーゲンに依存し、効果的な血栓
溶解剤であることを示す。
が存在しない場合に、精製プラスミンと、tPAとtPAを用いて活性化された
Lys−プラスミノーゲンとの組み合わせとの間に繊維素血栓を溶解する能力に
差異がないことを示す。活性プラスミンの血栓溶解効力を評価するために、 125 I−繊維素標識繊維素血栓溶解アッセイを、血漿環境内で血漿血栓を用いて行っ
た。実施例5.プラスミン活性調節におけるプラスミン阻害因子の役割 125I−繊維素標識血栓溶解アッセイ。プラスミンの繊維素溶解性は、Lijnen et al(1986)により記載されたようにヒトクエン酸化血漿内に浸漬した放射能標
識血漿血栓からなる生体外系内で測定された。すべての実験に使用した血漿は、
37℃で解凍し、分割し、再凍結しそして−80℃で貯蔵した単一ドナー血漿で
あった。 125I−標識フィブリノーゲンの原液は、バイアルの内容物(約110
μCi/バイアル)を0.15Mクエン酸ナトリウム1.0mlを用いて再水和
して調製しそして4℃で保管した。
ーボネート試験管に加え、そして短時間攪拌した。10〜20μMの最終濃度ま
で0.1M CaCl2 を用いて希釈したα−トロンビン25μlを血漿に加え
た。放射能標識した血栓を5分間、37℃で熟成させ、次いでPBSを用いて洗
浄した。血漿または緩衝液2.25mlを含む試験管内に管あたりに血栓1個づ
つで血栓を移した。
後にそれぞれの管にプラスミンを加えた。実験の間は血栓を37℃に戻した。遊
離される放射能の測定のために指定の時点で別の試料を取り出した。血栓溶解の
程度は、血漿内へ血栓から遊離された放射能の量と、反応管内の可溶性放射能の
全量との比率から算出した。百分率で表した標識繊維素分解生成物の放出を時間
に対してプロットした。
プラスミンまたはα2 −マクログロブリン活性を欠く血漿を用いて行った。α2 −アンチプラスミン欠失血漿は、Wiman(1980) 記載のようにして、正常の血漿を
クリングル1−3−セファロースカラム(Kringle 1-3-Sepharose column)を通し
て得られた。α2 −マクログロブリン−不活性化血漿は、0.1Mメチルアミン
Barrett et al.(1979)を用いて2時間、37℃で通常の血漿を処理し、引き続い
て4℃でPBSに対して透析して得られた。
を溶解できることが示され、これを図5および6に示す。プラスミンの量を増加
して 125I−繊維素標識血漿血栓に加え、そして血栓溶解の程度を放射能の遊離
を測定して評価した。(a)反応管内のプラスミン0.15mg/ml、(b)
0.30mg/ml、(c)0.45mg/ml、(d)0.60mg/ml、
(e)プラスミンを加えない対照。図6のデータは、プラスミンは血漿雰囲気中
でも活性でありそして血漿血栓を溶解できることを証明する。この現象は、投与
量依存性である。同時に、Lys−プラスミノーゲンとtPAとの混合物とは異
なり、プラスミン単独による血栓溶解は、血漿環境内で完了までは進行しない。
血栓溶解は、2時間後に停止する傾向がある。いかなる一つの理論にとらわれる
ことは望まないけれども、この現象は、血漿環境内の種々のプロテアーゼ阻害因
子の存在により説明でき、そして、特にα2 −アンチプラスミンによる非−血栓
−結合プラスミンの迅速な阻害による。
の血漿およびα2 −アンチプラスミン、α2 −マクログロブリンもしくはすべて
の阻害因子を欠く血漿試料、またはPBSを用いて、一連の血栓溶解実験を行っ
た。
α2 −アンチプラスミンまたはα2 −マクログロブリンのいずれかの欠失により
促進され、そしてすべての阻害因子が存在しないとさらに促進された。これらの
結果は、プラスミンのよる血栓溶解が、内因性血漿プラスミン阻害因子による非
常に厳格な生理的制御下にあり、従ってさらに安全な血栓溶解治療のための基礎
を提供する。
栓溶解は、これらの阻害因子により制御できる。プラスミノーゲン活性化因子−
誘導血栓溶解は、実際的な観点から人体内に限定はされない血漿中に存在するプ
ラスミノーゲンの内部供給を利用する。反対に、プラスミン−誘導血栓溶解は、
プラスミンの外部供給に全面的に依存する。患者に対するプラスミン投与の休止
は、血栓溶解の迅速な休止をもたらすはずでありそしてさらに安全な治療のため
の基礎を提供する。実施例6:末梢動脈閉塞(PAO)の生体外モデル内の可逆的に不活性化された 酸性化プラスミンおよびtPAの比較 熟成し収縮したクロットは、効果的なクロット溶解のためにすべてのプラスミ
ノーゲン活性化因子により要求される基質であるプラスミノーゲンを欠失する(R abbie et al. Thrombosis and Haemostasis 1996、 75(1)、 127-33)。熟成した
クロットはプラスミノーゲン活性化因子による溶解を著しく起こしにくい。
塞または卒中を起こすクロットとは異なる。これらは典型的には末梢動脈内に見
いだされそして著しい大きさに成長できる。本来の動脈内に見いだされる末梢ク
ロットの平均の大きさは、Ouriel et al. の記載のように14.8±11cmで
ある。プラスミノーゲン活性化因子により独占的に代表される現在の血栓溶解剤
は、これらの種類のクロットの溶解にはほとんど無効である。典型的には、PA
Oの患者をウロキナーゼを用いて24時間以上処置しそしてこの長期間の後でも
、血管の完全な開通には達しない。クロットの内部へカテーテルを介して血栓溶
解剤が送達された場合に、この状況は悪化し、さらにこれらの効力について要求
されるプラスミノーゲン基質の近接を妨げるであろう。
する活性プラスミン直接送達である。収縮クロット内への直接の可逆的に不活性
化された酸性化プラスミンの送達は、これらのクロットの固有のプラスミノーゲ
ン欠失を回避しそしてプラスミノーゲン含有量に関係なく予測可能、迅速そして
有効なクロット血栓溶解剤を提供する。さらに、血漿中の本来のプラスミン阻害
因子、α2 −アンチプラスミンの豊富な存在は、クロットの近傍から逃げるあら
ゆるプラスミンの瞬間的不活性化に役立ち、これにより離れた場所の繊維素溶解
およびこれにより起きる出血エピソードを回避する。
するために、我々はPAOを有する患者内に形成されたクロットのパラメーター
を模擬する生体外モデルを開発した。
しそして添加剤を加えないで自発的にクロット化させた。管を20時間、37℃
でインキュベーションして完全に収縮させた。米国標準試験ふるいD16の14
メッシュを用いて収縮したクロットを血清から分離しそしてこれらの重量を測定
した。脚部動脈内の平均クロット大きさ(0.6x12cm)に近いさらに小さ
い直径のグラス管内に血液クロットを移した。複数のサイドポートを有するパル
ススプレイカテーテル(pulse-spray catheter)(11cm噴射先端を有するフラ
ンスサイズ(French size) 5、Cook, Inc.)をクロット内に挿入しそして本発明
に従う血栓溶解性可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物、またはtP
Aを1mg/mlで、1時間の時間間隔で1mlづつ加えた。注入の回数は、血
栓溶解剤の投与量に依存する。クロット溶解の程度は、残留クロットの重量によ
り測定しそしてクロット重量減少の百分率として表した。このモデルはPAOモ
デルと呼ばれる。静脈血液をクロット形成のために使用したけれども、これはP
AO患者内の見いだされるクロットの大きさを模擬している。tPAおよび本発
明に従う可逆的に不活性化された酸性化プラスミンをこのモデル内で試験し、そ
の結果を以下に記載する。
してtPAおよびプラスミンを20時間熟成した収縮クロットの溶解のために使
用して第8因子により完全に架橋させる場合とは異なる。tPAは、このような
クロットを溶解することは不可能である。tPA処理クロットを用いて得られる
クリット重量低下は、投与量をクロット当たりに5mgに上昇させても対照と同
様である。
効である。プラスミンの溶解効果に投与量依存性がありそして5回注入(すなわ
ち全体でプラスミン5mg)の後、クロットはほとんど完全に溶解される。同様
の一連の実験で、収縮および架橋したヒト血栓を溶解することへの不適性がウロ
キナーゼを用いて観察された。従って、局所的に送達されたプラスミンは、tP
Aおよびその他のプラスミノーゲン活性化因子よりもさらに効果が高い血栓溶解
剤である。
その基質であるプラスミノーゲンのクロット中での存在を必要とすることを示す
。従って、プラスミンは新しいかまたはプラスミノーゲンに富むクロットの溶解
に対してはtPAと同様に効果的であるが、長期に収縮してプラスミノーゲンが
少ないクロットの溶解に対しては、tPAおよびその他のプラスミノーゲン活性
化因子よりもプラスミンはさらに有効である。さらに、本実施例中に示したデー
タは、クロット内部に直接注入された場合に、プラスミンがその可逆的に不活性
化されたされた酸性化形で有効であることを証明する。
たカテーテル内に形成し、そしてカテーテルが閉塞されるモデルでもある。実施例7:ラビット頸静脈血栓症モデル 局所投与活性プラスミンの生体内での効力および安全性は、Collen et al., ( 1983) のラビット頸静脈血栓症モデルにより決定した。このモデルを要約すると
以下である:ラビット(2〜3kg)をケタミン/キシラジン(xylazine)を用い
て鎮静させ、そしてペントバルビタール(5〜10mg/kg/時間)の希釈溶
液の投与のために22G静脈カテーテルを耳血管内に入れた。頸を剃りそして血
圧測定および血液試料採取のために動脈カテーテルを頸動脈内に入れた。呼吸を
容易にするために気管内チューブを入れるために気管切開を行った。鈍的切開を
用いて頸静脈を注意して顔面血管までこれを含んで分離した。顔面血管内に24
Gカテーテルを入れそして分離した顔面血管の遠くおよび近傍の両方で頸血管を
クランプした。分離した血管部分を生理的塩類溶液を用いて数回洗浄しそして血
液を完全に落とした。分離した部分をトロンビン溶液(500U/ml)を用い
て数回洗浄した。最後の洗浄の後、動脈カテーテルから動脈血試料0.5mlを
採取し、 125I標識フィブリノーゲン50μl(約1μCi)と迅速に混合した
。顔面血管を介して、血管部分が完全に拡張するまで分離した血管内に混合物を
迅速に注入した。鉗子を用いて血管をマッサージして血栓を混合し、乾燥を防ぐ
ために暴露した頸血管の上に一片のサランラップを置いた。血栓上の冷フィブリ
ノーゲンの析出を防ぐためにヘパリン(100IU/kg)を投与した。血栓を
30分間熟成させそしてクリップを取り除いた。
(溶解率%)を血栓上に直接設置したGILEガンマカウンタープローブを用い
て連続的に測定した。実施例8:静脈血流の回復 血栓溶解を生理的情報を得るために、別の一連の実験での血栓溶解の別の指標
として血流回復を使用した。これらの実験において、トランソニック流量計(Tra nsonic Flowmeter) に接続した閉塞血栓(放射能標識なし)から遠くに近似的な
大きさとした流れプローブを配置しそして静脈血流測定を1分毎に行った。
として表した。静脈血流の回復割合および第8因子およびフィブリノーゲンの消
費量は、図7には60分のものを示し、そして図8には90分のものを示した。
0.5mg/kgおよび1.0mg/kgの投与量において、tPAは60分後
にそれぞれ16±4%および21±10%の基線血流回復を誘導した。1.0m
g/kgおよび2.0mg/kgにおけるプラスミンは、それぞれ基線血流の2
0±1%および33±1%の回復を誘導した。90分では、tPA注入は血流の
それぞれ18±3%および26±11%回復をもたらし、そしてプラスミンはそ
れぞれ25±5%および34±6%の血流回復をもたらした。実施例9:表皮細胞出血時間(CBT) 60分における表皮細胞出血時間を図9に示す。生理的塩類溶液処理は、13
±1分の出血時間をもたらした。0.5mg/kgおよび1.0mg/kgの投
与量におけるtPAは、それぞれ13±2分および25±4分の出血時間をもた
らし、一方、プラスミンは1.0mg/kgおよび2.0mg/kgの投与量に
おいてそれぞれ17±3%および19±1%分の出血時間をもたらした。可逆的
に不活性化された酸性化プラスミンを用いた場合と比較して、tPAは長いCB
Tを示し、プラスミンが投与され血清因子により迅速に阻害される場合よりも、
内因性プラスミノーゲンのtPA活性化による全身繊維素溶解がさらに広範であ
ることを証明する。実施例10:ラビット繊維素溶解出血モデル プラスミノーゲン活性化因子tPAと比較してさらに大きいプラスミンの安全
性は、繊維素溶解性出血の確実な指標を表す繊維素溶解出血の実証されたラビッ
トモデルで証明され、これはMarder et al.,(1992)に記載されている。
出血の発生および期間、および選択された血漿凝固および繊維素溶解パラメータ
ーに対するこれらの相対的効果のために耳−穿刺モデルで比較した。プラスミン
(2.0または4.0mg/kg)およびtPA(1.0または2.0mg/k
g)の2種類の投与量を、外頸静脈内に装入したカテーテルを介してラビット内
に60分間注入した。それぞれの繊維素溶解剤の注入の前、その間およびその後
でメス刃を用いる耳穿刺(耳あたりに約6個)を、出血時間および再出血の両方
について観察した。一次出血時間は、それぞれの注入開始に対して−30、−1
0、0、10、30、60、70、90、120および180分で行った。クエ
ン酸処理血液試料(5ml)を、それぞれの繊維素溶解剤の注入の前、その間、
および2時間後まで採取した。これらの血液試料をフィブリノーゲン、第8因子
、およびα2 −アンチプラスミンについてアッセイした。それぞれの実験群は、
ラビット5匹から成っていた。
長くなる傾向があった(表4)。
の高投与量群の比較において、統計的に有意であった(p<0.05)。
それとを差別した。tPA処置動物10匹中の9匹とは異なって、いずれのプラ
スミン処理した動物も再出血を示さなかった。
べての部位における平均再出血時間を表示する。表6Bは、2.0mg/kg投
与量群に対する相当するデータを表示する。
PAの1.0mg/kg投与と比較して2.0mg/kg投与ではさらに長い再
出血期間であった。血液化学測定からの結果を表7〜9に示す。
の平均フィブリノーゲンレベルは、プラスミン注入後よりもさらに迅速にそして
さらに低い最下点まで低下した。
物の実験時間の大部分でさらに低く、それぞれのプラスミン群に対してそれぞれ
のtPA群の60分実験時間では統計的有意に達した。
とほぼ同様の濃度(初期値の50〜60%)であった。tPAの2種類の投与量
の比較は、より高い投与量で第8因子のさらに急速な低下を示し、そしてより低
い投与量では第8因子のさらに劇的なリバウンド増加を示した。
比較してtPA注入動物では大部分の実験時間でさらに低かった。
10分および60分実験時間で到達し、そして高投与量tPA群および相当する
低投与量プラスミン投与群の間で70分および90分実験時間で到達した。実施例11:ミニ−プラスミンによる繊維素溶解 ミニ−プラスミンは、最初の4個のクリングルドメインを欠くプラスミンの末
端切断バージョンである。これは、エラスターゼを用いるプラスミノーゲンの限
定されたタンパク質分解により生成するミニ−プラスミノーゲンから調製できる
。ミニ−プラスミンは、完全な大きさのプラスミンよりもクロット溶解にさらに
有効であり、それは、(a)ミニ−プラスミンはプラスミンよりも小さく(38
kDaに対して84kDa)それでクロット内部にさらに容易に拡散でき、そし
て(b)ミニ−プラスミンはクリングル1のα2 −アンチプラスミン結合部位を
欠き、従ってクロットに架橋するα2 −アンチプラスミンによる阻害に抵抗性で
あるからである。α2 −アンチプラスミンは、しばしば血栓溶解治療への熟成ク
ロットの抵抗性の原因となる。ミニ−プラスミノーゲンは、Sottrup-Jensen et
al. (1975)の記載のようにして精製した。ミニ−プラスミノーゲンへのミニ−プ
ラスミンへの変換、その精製および形成は、実施例2のプラスミンに関する記載
と正確に同じプロトコールを用いて行った。
いて等モル濃度でプラスミンのものと比較した。クロットを20時間熟成し、プ
ラスミン(1mg/ml)またはミニ−プラスミン(0.45mg/ml)の1
mlの2回の投与量をカテーテルを介してクロットに送達した。注入の間に、ク
ロットを37℃で1時間インキュベーションした。血栓溶解の程度は、クロット
重量低下により測定した。生理的塩類溶液を注入したクロットを対照として使用
した。クロットの大きさは0.6 x 12cm。
ラスミンよりも高いクロット溶解を起こす。0.45mg/mlでのニミ−プラ
スミンの2回1−ml注入の後のクロット重量低下は、44.3±4.4%であ
り、一方1mg/mlでのプラスミンの2回1−ml注入は、36±1.7%の
クロット重量低下であった。カテーテルを介してクロットに直接またはその内部
に送達された場合に、ミニ−プラスミンはプラスミンよりもさらに効果的な血栓
溶解剤であり得る。実施例12:プラスミンの局所カテーテルプラスミン投与の効力 カテーテルを介して局所投与されたプラスミン(1〜2mg/kg)の生体内
効力を、ラビット頸静脈血栓溶解モデルにおいてtPA(0.5および1.0m
g/kg)のものと比較した。2種類の方法を血栓溶解を評価するために使用し
た。1)放射能標識血栓を用いる溶解百分率の実時間測定、および2)流動プロ
ーブおよび流量計の適用による基線血流の回復。血栓溶解の速度を測定しそして
実施例6の記載と同様にして90分間定量した。同時に、第8因子およびフィブ
リノーゲンの消費ならびに表皮出血時間(CBT)を全身溶解状態の指標として
測定した。これらの局所投与研究のために、カテーテル(PE50)を周辺耳静
脈を介して遮断性血栓の1cm以内まで進めた。tPAの2種の投与量0.5お
よび1.0mg/kgおよびプラスミンの2種の投与量1.0mg/kgおよび
2mg/kgを使用した。これらの投与量が、30分間で注入した全体積10.
0ml中に含まれていた。放射能標識した血栓を用いて60および90分におけ
る溶解百分率を測定し、そして、非標識血栓を用いる別の一連の実験で、同じ時
点での血流の回復百分率を測定した。0分および60分で得た動脈血液試料(4
ml)をフィブリノーゲンおよび第8因子レベルの測定のために使用した。第8
因子レベルレベルおよびフィブリノーゲン濃度は、MLA Electra 800 凝固タ
イマーおよびフィブリノーゲン・アッセイセットを用いて測定した。第8因子レ
ベルは、標準曲線を作製するためにヒト第7因子を用いてCOATEST VIII C4 アッ
セイにより測定した。0分および60分における表皮出血試験は、ラビットの爪
をその先端でイヌ尾トリマーを用いて切除して測定した。血栓が形成されるまで
2分毎に爪に接触しないようにして濾紙を用いて血液を軽く叩き、そして濾紙は
血液を落とさない(wick)ようにした。結果は、平均±SEMで表し、そして群間
の有意の差異を評価するために多重比較試験のためのBoniferori法に従う一方向
ANOVAを使用した。P<0.05を有意と考えた。
テーテルを介して30分間注入した。等量の生理的塩類溶液を対照として用いた
。1.0〜2.0mg/kgのプラスミン投与をtPAの0.5mg/kg投与
と比較した。多重比較検定のためのDunn法による1方向ANOVAを統計的評価
のために使用した( *は0.5mg/kgにおけるtPAと比較したp<0.0
5、または#は1.0mg/kgのtPAと比較したもの)。
ミン(1.0〜2.0mg/kg)は、同等または著しく良好な血栓溶解を誘導
し、同時により少ない第8因子およびフィブリノーゲン消費ならびにCBTであ
った。プラスミン処置のリスク/利益評価は、プラスミンの2倍の投与量(重量
基準)がtPAと同等の出血副作用を誘導した。従って、プラスミンは、カテー
テル支援局所血栓溶解の間の血栓溶解剤として効果的にそして安全に使用できる
。プラスミンは、tPAと比較して同等または優れた溶解活性を有し、そして安
全プロフィールは局所血栓溶解送達のこの動物モデルで同等と考えられる。
射能の全量との比から算出した。標識した繊維素分解生成物の遊離を百分率で表
して時間に対してプロットした。
ュベーション時間60分(図11)および90分(図12)で示す。0.5mg
/kgおよび1.0mg/kgにおいて、tPAはそれぞれ16±2%および2
1±2%溶解を誘導し、1.0mg/kgおよび2.0mg/kgにおけるプラ
スミンはそれぞれ26±3%および33±4%溶解を誘導した。90分において
、tPA注入はそれぞれ21±2%および26±2%溶解をもたらし、これはそ
れぞれ31±4%および36±2%の溶解を誘導するプラスミンと比較される。
実施例13:プラスミン処置対tPA処置のリスク/利益評価 血栓溶解のラビットモデルにおけるプラスミンの広範な比較薬理学評価(リス
ク/利益)を決定した。プラスミンの効力をtPAのものと比較した。効力の指
標として溶解および血流の回復の百分率を使用した。これらの分析は、別々の実
験で行った。これらの血栓溶解剤により誘導されるそれぞれの副作用は、第8因
子およびフィブリノーゲンの消費を測定しそして出血時間を評価して比較した。
これは、近似的なリスク/利益プロフィールの決定を可能とした。
理マーカーとして第8因子の消費を用いて、tPAに対するED50を算出した。
第8因子の消費は、第8因子(Kogenatee) の再補充による出血副作用および正常
止血状態への復帰に直接関係した。少なくとも10匹(動物)/投与量のNを用
いる0.1mg/kg〜3.0mg/kgの範囲のtPA投与量を試験した。1
.0mg/kgがtPAに関する臨床投与量と考えられる。tPAに関して算出
したED50は1.8mg/kgであった。局所投与プラスミンに関する同様の計
算は、3.6mg/kgのED50を与えた。従って、プラスミンの二倍の投与(
重量基準)がtPAと同様の出血副作用を示した。同等のリスクプロフィール、
すまわち凝固タンパク質消費および出血におけるtPAとプラスミンとの投与量
を用いる効力(溶解および血流の百分率)は、図13に示すように算出された。
試験したすべての当量リスク投与量、tPA(0.5〜3.0mg/kg)およ
びプラスミン(1.0〜3.0mg/kg)において、プラスミンは、tPAと
比較して、少なくとも同等またはさらに良好な溶解速度および血流回復を誘導し
た。従って、薬理学データは、カテーテル送入により接近できる血栓の溶解処理
のためにプラスミンを考慮するように推奨するために十分である。実施例14:N−末端配列決定により特性検討されたプラスミン試料の分解ペプ チド プラスミン試料の分解ペプチドを以下のようにN−末端配列決定により特性決
定した。プラスミン組成物を2mM酢酸を含む低pH値、すなわち2.5未満の
pHおよび3.5および3.8のpHで配合した。プラスミン試料を、4〜12
%Bis−Tris NuPageゲルを用いるSDS−PAGEを用いて分析
し、これを図14に示す。タンパク質バンドをPVDF膜に転移させ、クーマシ
ー・ブルーR−250(Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA) を用いて染色し
、そしてバンドをメスで切り取った。
当する断片が同定できるように、それぞれのバンドについて10回のサイクルを
行った。それぞれのバンドの分子量をInvitrogen, Inc(San Diego, CA)から入手
できるMark 12 マーカーを用いるデンシトメトリー分析を用いて決定した。
リペプチドは、位置(Lys−プラスミンに対する数値)トレオニン(T105
)、グリシン(G190)およびグルタミン酸(E623)で始まった。プラス
ミンの既知のアミノ酸配列から、最初の2種のポリペプチドは重鎖由来であり、
そして第三は軽鎖由来であると決定された。図15に示すように、N−末端アミ
ノ酸の前のアミノ酸は、アルギニンまたはリシン(K104、R189、および
K622)のいずれかであった。プラスミンがリシンおよびアルギニンのカルボ
キシル側でタンパク質を切断することが一般に知られている。これらの結果は、
pH3.8におけるプラスミンの組成物が、自己分解を受けやすいことを証明し
た。
リペプチドは、N−末端のプロリンから始まっていた。プラスミンの既知のアミ
ノ酸配列から、これらの3種のポリペプチドは、位置P63、P155、および
P347から始まる重鎖由来であることが決定され、これを図15に示す。それ
ぞれのプロリンの前のアミノ酸は、アスパラギン酸であった(D62、D154
、およびD346)。アスパラギン酸−プロリン(D−P)ペプチド結合が酸で
切れやすいことは一般に知られている。これらの結果は、pH2.2におけるプ
ラスミンの組成物では、ペプチド結合の酸加水分解を受けやすいことを証明した
。実施例15:低pH配合安定化プラスミン中の糖類 プラスミンをpH2.5〜4.0で下記の糖類の少なくとも1種類を用いて下
記の酸の1種類中に配合した。酸の群は、酢酸、クエン酸、セリン、トレオニン
、イソロイシン、バリン、グルタミン、β−アラニン、またはその他の酸の1m
M〜500mM、好ましくは1mM〜50mMの範囲内のものを含む。糖類の群
は、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、ラクトース、グル
コースおよびトレハロースの0.2%〜20%を含む。いかなる賦形剤も含まな
いプラスミン配合物を対照として含ませた。すべての試料を37℃で7日間イン
キュベーションした。プラスミン本体の変化を還元性SDS−PAGEを用いて
分析した。
して低pHでの可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの貯蔵からの利益を改
善することを実証する。実施例16:非−炭水化物安定化剤を用いる可逆的に不活性化された酸性化プラ スミン組成物の安定化 可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物を本発明に従い、非−炭水化
物安定化剤として加えたグルコサミン、ナイアシンアミド、シトルリンまたはチ
アミンの0.1Mを含むpH3.7の5mM酢酸中、1mg/mlで配合した。
いかなる賦形安定化剤も含まない可逆的に不活性化された酸性化プラスミン配合
物を対照として含ませた。すべての試料を37℃で7日間インキュベーションし
、プラスミン本体の変化を非還元性条件下でSDS−PAGEを用いて分析した
。図17を参照すると、試験したすべての非−糖類安定化剤が37℃で7日間の
試験期間で、可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の安定性を改善し
た。
して150mM塩化ナトリウムを用いて、2mM酢酸、pH3.4中、1mg/
mlで配合した。同じ配合であるがしかし塩化ナトリウムを含まないものも調製
しそして対照として含めた。試料を4℃で28日間インキュベーションした。プ
ラスミン本体の変化は、上記の実施例3記載のようにして非還元性条件下でSD
S−PAGEを用いて分析した。値は、100%の値を与えた0日目の対照に対
して正規化された。表5で、結果は4℃で貯蔵したプラスミンが、塩化ナトリウ
ムを含む低pH配合よりもさらに安定であったことを証明した。
れた酸性化プラスミン組成物の体積を推定するために、一連の滴定実験を行った
。血清の体積1mlは、PAO患者の動脈内に見いだされる平均的に収縮したク
ロットの液相体積を表すと推定される。本発明に従う可逆的に不活性化された酸
性化プラスミンがその中で配合されるものに典型的な酸性化(pH3.7)低緩
衝能力緩衝液を用いて血清(1ml)を滴定した。図18に示すように、血清1
mlは、酸性化生理的塩類溶液約150mlを中和できる。後者の体積は、末梢
動脈閉塞の処置のために必要な可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの考え
られる体積を越える。
合物は、有効で安定な薬剤組成物のための基礎を提供する。このような組成物は
、患者への製剤の送達の間に著しい効力の低下を伴うプラスミンを用いない処置
のために必要な時間で、室温で可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの投与
を可能とする。実施例18:低pHで安定化されたトリプシンはさらに高いpH環境への転移に より再活性化できる トリプシン(16.4mg、Sigma Chemical Co. カタログ番号T-1426)を5
0mM Tris/0.5M NaCl(pH8.0)2.28ml中に溶かし
た。50mM Tris/0.5M NaCl(pH8.0)を用いて事前に平
衡化させたベンズアミジン−セファロース(Pharmaciaコード番号17-0568-01)の
1ml−カラムにトリプシン溶液を加えた。このカラムをこの後者の緩衝液4m
lを用いて洗浄すると、溶離物吸光度(280nm)の0.03未満への低下を
もたらした。200mMグリシン/0.5M NaCl(pH3.0)の体積0
.5mlを用いて不活性化された状態にあるこのカラムからトリプシンが溶離し
た。このカラムから溶離した第3〜第5の0.5ml画分は、吸光度(280n
m)のピーク値を含み、そしてプールした。このプールしたトリプシン溶離物の
吸光度(280nm)は、9.22と決定された。トリプシンの吸光係数(1%
溶液に対するE280 =17.09)およびトリプシンの分子量(24,000)
に基づいて、このプールしたカラム溶離物内の全トリプシンタンパク質の濃度は
、225μMと算出された。
して本明細書中に編入する方法によりp−ニトロフェニルグアニジノベンゾアー
トを活性部位滴定剤として使用して決定された。このアッセイは、pH8.3に
おいて、50mMホウ酸ナトリウム(pH8.3)700μl、10mMリン酸
ナトリウム/1%グリシン(pH7.0)200μlおよびp−ニトロフェニル
グアニジノベンゾアート(ジメチルホルムアミド内に溶解)10μlも含むアッ
セイ混合物内にプールしたトリプシンカラム溶離物の少量(100μl)を希釈
して行った。この混合組成物の最終pHは8.3と測定された。このアッセイ中
で形成されたp−ニトロフェノールのトリプシン−依存性量は、410nmで測
定した。410nmおよびpH8.3におけるp−ニトロフェノールに対する吸
光係数(16,595M-1)に基づいて、1.01mlアッセイ中に存在したこ
のプールしたトリプシンカラム溶離物100μlは、キュベット中に存在した2
2.95μMトリプシン活性部位の濃度に一致した。従って、プールしたトリプ
シンカラム溶離物の初期原溶液は、231μMトリプシン活性部位を含んでいた
。後者の値は、存在する全トリプシンタンパク質の濃度(225μM)に、実験
誤差の範囲内で一致する。これらの結果は、トリプシンが低pHに調整できそし
て次いでその活性部位の再活性化を伴って高pH環境に転移できることを示して
いる。
性を示す。
ラスミン安定性を示す。
効性を示す。
消費に対するtPAまたはLys−プラスミンの局所投与を比較する。
ィブリノーゲン消費に対するtPAまたはLys−プラスミンの局所投与を比較
する。
。
の等モルを用いる収縮血液クロットの溶解を示す。
ン消費に対するtPAおよびプラスミンの局所投与を比較する。
フィブリノーゲン消費に対するtPAおよびプラスミンの局所投与を比較する。
性分解を示す。
を示す。
された酸性化プラスミンの37℃での安定性を示す。
シトルリンを用いたpH3.7における可逆的に不活性化された酸性化プラスミ
ンの37℃における安定性を示す。
の滴定を示す。
Claims (33)
- 【請求項1】 a)血栓閉塞を有するヒトまたは動物を特定し、そして b)本質的にプラスミノーゲン活性化因子を含まない薬剤的に許容できる可逆的
に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量をヒトまたは動物に
非経口投与し、治療的投与量は血栓閉塞内または近傍に送達される、 ステップを含んでなる、血栓閉塞を有するヒトまたは動物に可逆的に不活性化さ
れた酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法。 - 【請求項2】 c)投与された繊維素溶解性組成物を血栓閉塞と相互作用さ
せる ステップをさらに含んでなる、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 d)ヒトまたは動物の血管流量のレベルを測定し、そして e)事前に選択した血管流量のレベルに達するまでステップ(a)〜(d)を反
復する ステップをさらに含んでなる、請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 血栓閉塞が、冠動脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢血栓症、
塞栓性血栓症、肝臓静脈血栓症、衰弱性血栓症、静脈洞血栓症、静脈血栓症、動
脈血栓症、閉塞した動静脈シャント、または閉塞したカテーテル器具より選ばれ
る血管閉塞である、請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物が、可逆
的に不活性化された酸性化繊維素溶解性酵素および薬剤的に許容できる酸性化キ
ャリヤーを含んでなり、薬剤的に許容できるキャリヤーが低緩衝能力緩衝液であ
る、請求項1記載の方法。 - 【請求項6】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物が凍結乾
燥され、そして請求項1記載の方法が、ヒトまたは動物への投与の前に、凍結乾
燥された繊維素溶解性組成物に薬剤的に許容できるキャリヤーを加えるステップ
をさらに含んでなる、請求項1記載の方法。 - 【請求項7】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性酵素が、哺乳類
セリンプロテアーゼである、請求項5記載の方法。 - 【請求項8】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性酵素が、Glu
−プラスミン、Lys−プラスミン、ミニ−プラスミン、ミクロ−プラスミン、
またはこれらの末端切断変種である、請求項5記載の方法。 - 【請求項9】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物が、抗血
栓剤をさらに含んでなる、請求項5記載の方法。 - 【請求項10】 薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーが、水および少なく
とも1種の薬剤的に許容できる酸を含んでなる低緩衝能力緩衝液であって、酸が
カルボン酸、オリゴペプチド、アミノ酸より選ばれた有機酸、または無機酸であ
り、そして酸性化キャリヤーが約4.0未満のpHを有する、請求項5記載の方
法。 - 【請求項11】 薬剤的に許容できる酸が、ギ酸、酢酸、クエン酸、グリシ
ン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパルギン酸、バリン
およびアラニンより選ばれ、そして酸性化キャリヤーが約4.0未満のpHを有
する、請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 薬剤的に許容できる酸が酢酸またはクエン酸である、請求
項10記載の方法。 - 【請求項13】 薬剤的に許容できる酸が酢酸である、請求項10記載の方
法。 - 【請求項14】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物が、約
2.5と約4.0との間のpHを有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項15】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物が、約
3.0と約4.0との間のpHを有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項16】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物が、約
3.1と約3.5との間のpHを有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項17】 哺乳類セリンプロテアーゼが約0.01mg/mlから約
50mg/mlまでの間の濃度範囲内にある、請求項7記載の方法。 - 【請求項18】 哺乳類セリンプロテアーゼが約0.1mg/mlから約1
0mg/mlまでの間の濃度範囲内にある、請求項7記載の方法。 - 【請求項19】 酸が約1mMから約500mMまでの濃度範囲内にある、
請求項10記載の方法。 - 【請求項20】 酸が約1mMと50mMとの間の濃度範囲内にある、請求
項10記載の方法。 - 【請求項21】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物が安定
化剤をさらに含んでなる、請求項5記載の方法。 - 【請求項22】 安定化剤が、グルコース、マルトース、マンニトール、ソ
ルビトール、スクロース、ラクトースまたはトレハロースより選ばれた薬剤的に
許容できる炭水化物である、請求項21記載の方法。 - 【請求項23】 炭水化物が約0.2%(重量/体積)から約20%(重量
/体積)までの範囲内の濃度を有する、請求項22記載の方法。 - 【請求項24】 炭水化物がグルコースでありそしてその濃度が約20%で
ある、請求項22記載の方法。 - 【請求項25】 安定化剤が、グルコサミン、ナイアシンアミドおよびチア
ミンより選ばれる、請求項22記載の方法。 - 【請求項26】 安定化剤が、約0.01Mから約0.1Mまでの範囲内の
濃度を有する、請求項22記載の方法。 - 【請求項27】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療
的投与量が、約0.1mg(プラスミン)/kg(体重)と10.0mg(プラ
スミン)/kg(体重)との間の範囲内にある、請求項1記載の方法。 - 【請求項28】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療
的投与量が、約0.2mg(プラスミン)/kg(体重)と4.0mg(プラス
ミン)/kg(体重)との間の範囲内にある、請求項1記載の方法。 - 【請求項29】 可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療
的投与量が、約1.0mg(プラスミン)/kg(体重)と2.0mg(プラス
ミン)/kg(体重)との間の範囲内にある、請求項1記載の方法。 - 【請求項30】 可逆的に不活性化された酸性化組成物がカテーテル器具に
より投与される、請求項1記載の方法。 - 【請求項31】 血管内カテーテルが血管閉塞に向けられる、請求項31記
載の方法。 - 【請求項32】 血管内カテーテルが、可逆的に不活性化された酸性化繊維
素溶解性組成物を血栓閉塞の近傍またはその中に送達する、請求項31記載の方
法。 - 【請求項33】 血管内カテーテルが、血栓閉塞に入りそしてカテーテルが
、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物を血栓閉塞の中に直接送達
する、請求項31記載の方法。
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