JP4988115B2 - 可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所送達による血栓溶解の方法 - Google Patents
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Description
【関連する出願への言及】
本出願は、1999年11月13日付け出願の米国特許(US)出願番号09/438,331号の一部継続出願である。
【0002】
【発明の分野】
本発明は、一般的にプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを用いる血栓溶解の方法および血栓の近傍へまたは直接その中への酸性化プラスミンの局所送達に関する。この治療方法は、カテーテル誘導供給が可能なあらゆる場所の血栓の溶解に特に適用される。
【0003】
【背景】
血栓症は、現代世界における罹病および死亡の重要な原因である。急性心筋梗塞および虚血性卒中は、西側世界での死亡および障害の第一および第三の原因である。閉塞性血栓症は、重要な器官への血流の欠失をもたらし、局所酸素不足、細胞壊死および器官機能の欠損を発生する。早期の再疎通をもたらす迅速な血栓の破壊には大きい利益がある。これは細胞死を防ぎ、梗塞の大きさを小さくし、器官機能を保存し、そして早期および後期の死亡を低下させる。血栓溶解治療は、現在世界中で1年間に750,000人以上の患者に施され、一方その数の何倍ものがこの治療により利益を受ける可能性がある。
【0004】
閉塞性血液クロットの溶解に現在使用される血栓溶解剤は、プラスミノーゲン活性化因子である。数種の異なるプラスミノーゲン活性化因子が現在当面の臨床使用のために利用でき、そして数種の新世代のプラスミノーゲン活性化因子:組織プラスミノーゲン活性化因子、tPA、およびその第二世代後継剤のTNK−tPA、RETEPLASETM(tPAの欠失変異体)、一本鎖ウロキナーゼ形プラスミノーゲン活性化因子(scuPA、またはプロ−ウロキナーゼ)、ウロキナーゼ(UK)、ストレプトキナーゼ(SK)、およびアニソイル化(anisoylated) プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体(APSAC)が臨床試験の対象となっている。tPA、scuPA、およびUKが通常ヒト内で低レベルで見いだされる。ストレプトキナーゼは強力な血栓溶解活性を有する細菌酵素である。APSACは、アニソール化ストレプトキナーゼ−プラスミノーゲン複合体である。すべての場合に、プラスミノーゲン活性化因子は、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性プロテアーゼであるプラスミンに変換できる。tPAおよびscuPA(およびより低い程度で、APSAC)により提供される利点は、これらのプラスミノーゲンの活性化が繊維素特異性であることである。繊維素への結合は、実現すべきこれらの完全なタンパク質分解性の前提条件である(Haber et al., 1989)。ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼは、繊維素の不在下でプラスミノーゲンを活性化できる。繊維素に対するこのような親和性の変化は、全身出血が動物モデル内で起きるという範囲内では重要な結果を有する。しかしこれらの差異は、臨床的には認められていない。
【0005】
プラスミノーゲン活性化因子は、循環酵素前駆体プラスミノーゲンをプラスミンに活性化することによりそれらの血栓溶解能力を全般的に行使する。哺乳類中の主要な繊維素溶解酵素であるプラスミンは、血漿内で循環する不活性の酵素前駆体プラスミノーゲンから誘導されるトリプシン類似の特異性を有するセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲン自体は、N−末端グルタミン酸残基を有する791個のアミノ酸のポリペプチドである。プラスミン活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)またはウロキナーゼは、一本鎖プラスミノーゲン分子をArg561 −Val562 ペプチド結合で切断して活性プラスミンを産生する。得られたプラスミンの2個のポリペプチド鎖は、2個の鎖間ジスルフィド架橋により一緒に保持される。25kDaの軽鎖は触媒中心を有しそしてトリプシンおよびその他のセリンプロテアーゼに相同である。重鎖(60kDa)は、高度に類似したアミノ酸配列を有する5個の三重ループクリングル構造からなる。これらのクリングルの一部は、繊維素、α2 −アンチプラスミンまたはその他のタンパク質とのプラスミノーゲンおよびプラスミン相互作用に関係するいわゆるリシン−結合部位を含む。
【0006】
tPA、UKおよびSKのような現存のプラスミノーゲン活性化因子の治療的使用に関連する固有の問題は、これらの使用に伴う出血合併症であり、これには例えば患者の20%以上における胃腸内出血が含まれる。臨床的に最も危険な頭蓋内出血は、現在の血管溶解治療の頻繁で致死的な副作用であり、そして患者の約1%に起きる。出血の機序は多元的でありそして保護的な止血性血栓の溶解およびその結果、血管本体の欠損による血管損傷の露出によると考えられる。これは、繊維素溶解系の全身的活性化とこれに付随するクロット形成因子の欠失と組み合わされる。さらに最近の研究の焦点は、改善された繊維素特異性を示す変性プラスミノーゲン活性化因子の生成に置かれている。これは出血合併症の量を低下すると期待された。ある場合には、これらの新しい活性化因子はこれらのクロット形成因子、例えばフィブリノーゲン、第8および第5因子、プラスミノーゲン、およびα2 −アンチプラスミンの循環レベルを保存することに役立つ。これらは血栓内に存在する繊維素分子を特異的に標的としそして結合し、そしてこのように結合した場合にプラスミノーゲンに対してのみ作用する。これは、プラスミノーゲンが血栓の近傍においてのみ活性プロテアーゼプラスミンに切断されそして繊維素の非特異性全身切断のレベルを低下させる結果を有する。しかし、これらの新しいプラスミノーゲン活性化因子を用いる出血性合併症の数は、変化がない。
【0007】
血栓溶解剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼの血管の血栓閉塞の程度の低下における臨床的成功は、確証されている。従って、プラスミノーゲン活性化因子は、急性心筋梗塞および心臓のその他の血栓性症状の治療技術に選択される処置となった。しかしながら、心筋梗塞、閉塞性卒中、深部静脈血栓症および末梢動脈障害を含む種々の障害は、重要な臨床的課題として残り、そして現在使用されている既知のプラスミノーゲン活性化因子は血栓の排除におけるこれらの全般的有用性に影響を与える種々の限定を受ける。心筋梗塞では、血管流量は、患者の約50%で90分以内に回復し、一方、急性冠動脈再閉塞は、患者の約10%で起きる。冠動脈再疎通には、平均して45分以上を要する。主として頭蓋内出血による残留死亡率(residual mortality)は、まだ血栓溶解処置がない場合の死亡率の少なくとも50%である。
【0008】
血栓溶解剤の領域内の大部分の研究は、現存のプラスミノーゲン活性化因子の効力および繊維素特異性の改善ならびに新規薬剤の発見に焦点が当てられている。この努力の多くは、血栓の足場を形成する繊維素へプラスミノーゲン活性化因子に向けられ、そして血流内に投与された場合に活性化因子の薬剤動態を改善することに集中された。これは、活性薬剤への患者の暴露を長期化しそして同伴する望ましくない全身出血の危険を伴う連続投与としてよりも、一括大量投与(bolus dose)としてのこれらの投与を可能とする。
【0009】
しかし、目的とするプラスミノーゲン活性化因子、例えばTNK−tPA、チスイコウモリ(Vampire bat) 唾液プラスミノーゲン活性化因子を用いる第2相臨床試験の結果に基づいて、新しいプラスミノーゲン活性化因子の安全プロフィールにおいて予想された改善は、血栓治療の後に臨床的には実現されなかった。頭蓋内出血および卒中を含む中程度ないし大規模出血事例の割合は、当初の非変性tPAと同程度であった。詰まった動脈は早期には開かず、そして再閉塞の速度は変わらなかった。これらの活性化因子の唯一の長所は、長くなった血漿半減期および一括大量投与の可能性であると考えられる。
【0010】
プラスミノーゲン活性化因子に伴う別の問題は、これらが末梢動脈閉塞(PAO)で見いだされる長期クロットの処置において効力が限定されることである。これらの血栓は、典型的には熟成(age) しそして著しい大きさまで成長できる。本来の動脈および移植組織中の両方に見いだされる末梢血栓の平均の大きさは、31±11cmである。熟成しそして収縮(retract) した血栓はプラスミノーゲンを欠き、従ってこれらはプラスミノーゲン活性化因子誘導血栓溶解への古い血栓の可能性を限定する。これは、ウロキナーゼを用いて24時間以上処置されるPAOを有する患者には全く通常のことであり、そしてこの長期間の後でも血管の完全な開通は得られない。プラスミノーゲン基質のレベルが低下している血栓の内部までの直接カテーテルを介する現存の血栓溶解剤の送達に関しては、問題がさらに大きい。
【0011】
血栓の位置において十分なプラスミンを生成するためのプラスミノーゲン活性化因子の全身投与に関連する問題を回避するための基本的に異なる方法は、プラスミン自体を患者に直接投与することである。これは、プラスミンが最終的にはプラスミノーゲン活性化因子により開始された血栓溶解を媒介する酵素であるからである。収縮した血栓内へ直接の活性プラスミンの直接送達は、これらの血栓の固有のプラスミノーゲン欠失を回避しそしてプラスミノーゲン含有率にかかわらず予測可能、迅速で効果的な血栓溶解を与える。
【0012】
米国特許(US)第5,288,489号中でReich et al.は、患者の身体内へのプラスミンの非経口投与を含む繊維素溶解処置を開示している。処置の濃度および時間は、活性プラスミンが血管内血栓の部位で、血栓を溶解するかまたは循環フィブリノーゲンレベルを低下させるために十分な濃度に達するために十分であった。しかし、Reich et al.は、身体内に導入する直前にプラスミノーゲンからのプラスミン生成を要求する。
【0013】
反対に、米国特許(US)第3,950,513号中でJensonは、低pHで安定化されると主張されているブタプラスミン製剤を開示している。このプラスミン溶液は、血栓溶解治療のためにヒトに全身投与する前に中和される。
【0014】
米国特許(US)第5,879,923号中でYago et al. は、診断薬として有用なプラスミン組成物を開示している。Yago et al. の組成物は、低濃度の中性pHプラスミンおよび1)少なくとも2個のアミノ酸から成るオリゴペプチド、または2)少なくとも2個のアミノ酸、または3)1個のアミノ酸および多価アルコールであってもよい追加の成分からなる。
【0015】
プラスミンは血栓溶解剤の第二の機序的な種類分類に入り、プラスミノーゲン活性化因子の種類とは明確に異なる。プラスミンは可能な血栓溶解剤として研究されたけれども、多数の技術的な困難がこの繊維素溶解酵素の有効な臨床使用を妨げている。これらの困難は、不活性前駆体、プラスミノーゲンからプラスミンを生成するために使用されるプラスミノーゲン活性化因子のあらゆる機能的痕跡を含まない純粋のプラスミンを製造するという問題を含む。これらの初期プラスミン製剤の血栓溶解活性は、プラスミン自体よりもむしろ結果的に混入したプラスミノーゲン活性化因子の存在による。しかし、混入したプラスミノーゲン活性化因子も、標的血栓とは異なる部位で全身性出血を開始させる。プラスミン製剤のために使用されるストレプトキナーゼの別の欠点は、プラスミン調剤中のこの存在が、発熱およびアナフィラキシーショックを含む不利な免疫応答をしばしば起こすことである。
【0016】
プラスミンの臨床使用に最も重要な限界は、広い特異性を有するセリンプロテアーゼとして、これが生理的pHにおいて自己分解および活性の欠損の傾向が高いことである。これは使用の前の長期間の貯蔵に適する高品質で安定なプラスミン製剤の製造、および閉塞性血栓を患うヒト患者へのプラスミンの安全で有効な投与に関して厳しい課題をもたらす。
【0017】
従って、必要とされるのは、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まずそして標的とした血管血栓閉塞に遭遇した際に活性である活性プラスミンの安定な形を投与する方法である。
【0018】
さらに必要とされるのは、血栓の内部にカテーテルを介して活性プラスミンの活性化した形を直接送達する血栓の溶解方法である。
【0019】
さらに、投与した血栓溶解剤が血栓部位に制限されそして低下した全身および特には頭蓋内出血を示す血栓溶解の方法が要求される。
【0020】
本発明のこれらおよびその他の目的および長所は、以下の説明および請求範囲から完全に明らかになりあるいは本発明の実施により習得されるであろう。
【0021】
【発明の要旨】
本発明は、血栓溶解治療が、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを直接血栓内にまたはその近傍に投与することにより改善できるという発見に関する。精製されたプラスミンは、生理的pHでは自己分解のために不安定であり、従って、プラスミンは治療的投与のために容易には利用できない。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与することを含んでなる、血管血栓閉塞を有するヒトまたは動物に繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法を提供する。本発明は、薬剤的に許容できるキャリヤーが低緩衝能力を有する、プラスミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなる可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法をさらに提供する。
【0022】
本発明は、繊維素溶解性組成物がプラスミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなり、薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーが水およびカルボン酸、アミノ酸または低緩衝能力を有するその他の化合物の形の酸より選ばれる薬剤的に許容できる酸を含んでなりそして酸性化キャリヤーが約4.0未満のpHを有する、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法も提供する。
【0023】
本発明は、薬剤的に許容できる安定化剤、例えばこれらの限定はされないが糖または多価アルコールをさらに含んでなる、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーの治療的投与量を投与する方法を提供する。
【0024】
本発明の一つの態様では、繊維素溶解性組成物は、それぞれの活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性化セリンプロテアーゼ、低緩衝能力緩衝液、および場合により安定化剤を含んでなる。このようなセリンプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼII、カテプシンG、前立腺特異性抗原、白血球エラスターゼ、キマーゼ、トリプターゼ、アクロシン、ヒト組織カリクレイン、およびプラスミンを含む。プラスミンは、ミディ(midi)−プラスミン、ミニ(mini)−プラスミン、またはミクロ(micro) −プラスミンを含み、これらに限定はされないGlu−プラスミン、Lys−プラスミン、これらの誘導体および変性または末端切断変種を含む。
【0025】
本発明の方法は、プラスミンを貯蔵のために安定化させる酸性条件および安定化剤を含んでなる。本発明に使用されるプラスミンは、プラスミノーゲンを活性化することにより得られ、そしてプラスミンの安定な製剤を提供するために約4未満のpHを有する酸性化溶液中で単離および貯蔵される。本発明の繊維素溶解性組成物は凍結乾燥してもよく、そしてプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない。プラスミン組成物の低緩衝能力は、血栓または血清に投与された場合に生理的pHへの迅速な滴定(titration) を可能とする。血栓溶解治療のためにクロット部位に直接低緩衝能力溶液中で投与された場合に、酸性化プラスミンは迅速に中和されそして活性化される。
【0026】
本発明の追加の目的、特徴、および長所は、以下に簡単に説明する添付図を関連して考慮して以下に記載の詳細な説明を見れば明確となるであろう。
【0027】
発明者に既知の本発明実施の最適モードを含む本発明の完全で実行可能な開示を、実施例への参照を含めて以下の本明細書中にさらに具体的に記載する。本説明は、本発明の一般原理を説明することを目的とするものであり、限定的な意味に解釈すべきではない。
【0028】
本発明は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを含んでなる繊維素溶解性組成物の使用を可能とする血栓溶解および血管血栓閉塞へのプラスミンの局所送達の方法に対する要求に対応する。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量をヒトまたは動物に非経口的に投与し、投与した繊維素溶解性組成物を血栓閉塞と相互作用させ、ヒトまたは動物の血のレベルを測定し、そして血液流量の事前に選定したレベルに到達するまでこれらのステップを反復することを含んでなる、血栓閉塞を有するヒトまたは動物への繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与するための方法を提供する。本発明の方法は、さらに低緩衝能力緩衝液中のプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを含んでなる繊維素溶解性組成物の使用も提供する。本方法は、血栓の中またはその至近の位置への繊維素溶解性組成物の血管内カテーテル直接送達を提供し、これにより繊維素の全身的分解を最小化し、一方では血栓に対する最高プラスミン活性を保持する。
【0029】
臨床での動脈および静脈カテーテルの増加する使用に伴って、血栓の至近位置または実際にその中への可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所投与は、血栓溶解のための魅力的な治療機会を与える。活性セリンプロテアーゼであるプラスミンは、直接血栓溶解剤であって、血栓に近傍における酵素前駆体プラスミノーゲンの存在を必要とするプラスミノーゲン活性化因子とは異なる。活性プラスミンを用いる局所カテーテル−誘導血栓溶解治療は、完全な血栓溶解を達成するように調節ができ、そしてプラスミンはさらに安全な血栓溶解剤である可能性を有し、それは、局所送達のために必要な低い用量が、プラスミノーゲン活性化因子により誘導される高い用量血栓治療にしばしば伴う出血合併症を著しく低下するからであろう。血栓部位の至近部分からのプラスミンのいかなる漏洩も、循環α2 −アンチプラスミンにより迅速に中和される。
【0030】
プラスミン精製、および貯蔵、ならびにその治療への使用および送達に伴う数多くの技術的問題があった。プラスミンは活性セリンプロテアーゼであり、そして生理的pHにおいて自己消化および不活性化される。不幸なことには、プラスミン分解は、生体内血栓溶解のために必要なpH範囲内で最も顕著である。
【0031】
本発明内に組み込まれる繊維素溶解性組成物は、精製の間の酸性緩衝液内のプラスミンの維持、ならびに薬剤的に許容できる低緩衝能力緩衝液を有する酸性化キャリヤー中のその製剤を含み、これによりプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性プラスミン含有繊維素溶解性組成物を提供する。繊維素溶解性組成物が、ヒトまたは動物への組成物の投与を可能とする薬剤的に許容できるキャリヤー、例えば限定はされないが水、生理的塩類溶液、またはその他の溶剤の添加により再構成してもよい凍結乾燥組成物であることは本発明の範囲内にあると考える。血管開通の回復に関するその効力は、生体外アッセイおよび生体内ラビット頸静脈血栓溶解モデルで証明された。
【0032】
本明細書中に使用される用語「可逆的に不活性化された」は、規定の条件の組合せ下では本質的に活性ではないがしかし条件の別の組合せに転移されると活性形に変換する酵素活性を呼ぶ。
【0033】
本明細書中に使用される用語「薬剤的に許容できるキャリヤー」は、レシピエントのヒトまたは動物により生理的に許容されるあらゆるキャリヤーを呼び、水、塩溶液、生理的塩類溶液、または繊維素溶解剤、例えばプラスミンが溶解または懸濁されるその他のあらゆる液体またはゲルを含み、これらに限定はされない。「薬剤的に許容できるキャリヤー」は、約4.0未満のpHを有するプラスミン溶液を与えそして低または皆無の緩衝能力を有するあらゆる薬剤的に許容できる化合物を含んでもよい。
【0034】
本明細書中に使用される用語「低緩衝能力緩衝液」は、pHが感知できる程度まで変化を始める前に緩衝液が中和できる酸または塩基の量を呼ぶ。本明細書中に使用される場合に、低緩衝能力緩衝液は、低緩衝能力緩衝溶液の量に対して少量の酸または塩基の添加によりpHが顕著に調節される。この用語は、塩酸、硝酸および硫酸を含みこれに制限はされない強酸により酸性化され、そして緩衝能力を有していない溶液を含むと考える。
【0035】
本明細書中に使用される用語「生理的pH」は、約pH6.5〜約7.5の間、さらに典型的には約pH7.1〜約7.5の間のpHを呼ぶ。
【0036】
本明細書中に使用される用語「血栓」は、血管または血液と接触する器具(例えばカテーテル器具またはシャント)内の血栓を呼ぶ。血栓は、繊維素を含んでなってもよくそして血小板、赤血球、白血球、脂質またはこれらのあらゆる組合せをさらに含んでなってもよく、これらに限定はされない。「血栓」は、環状血栓、球状血栓、ヒアリン血栓、壁状血栓、層状血栓または白色血栓であってもよくこれらに限定はされない。
【0037】
本明細書中に使用される用語「血栓閉塞」は、血栓性クロットの形成による血管の部分的または完全な遮断を呼び、ここで血栓は少なくとも繊維素を含んでなる。閉塞した血管は、静脈、動脈、細静脈、細動脈、毛細血管、血管床または心臓であってもよくこれらに限定はされず、そしてヒトまたは動物身体のあらゆる血管分布器官または組織内にあってもよい。血栓閉塞は、補綴血管および合成、ヒトまたは動物由来の移植組織を含みこれらに限定はされないカテーテルまたはその他の移植物であってもよく、そして繊維素を含んでなる閉塞により効果的に遮断されている。
【0038】
本明細書中に使用される用語「カテーテル器具」は、身体内に入ってもよいあらゆるカテーテルまたは管状器具を呼び、そして動脈カテーテル、心臓カテーテル、中心(central) カテーテル、中心静脈カテーテル、静脈内カテーテル、バルーンカテーテル装置、末梢挿入中心カテーテル、肺動脈カテーテルまたはトンネル状中心静脈カテーテルおよび動静脈シャントを含み、これらに限定はされない。
【0039】
本明細書中に使用される用語「薬剤的に許容できる酸性化キャリヤー」は、約4.0未満のpHまで酸性化されたあらゆる薬剤的に許容できるキャリヤーを呼ぶ、「薬剤的に許容できる酸性化キャリヤー」は、低または皆無の緩衝能力の緩衝液、例えば無機酸の添加により約4.0未満のpHまで酸性化されたカルボン酸、例えばこれらに限定はされないがギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、クエン酸、コハク酸、乳酸またはリンゴ酸、または少なくとも1種のアミノ酸、例えばこれらに限定はされないがグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、トレオニンまたはグルタミンまたは少なくとも1種の無機酸、例えばこれらに限定はされないが硫酸、塩酸、硝酸またはリン酸またはこれらのあらゆる組合せを含んでなってもよい。薬剤的キャリヤーの酸部分が、薬剤的に許容できるキャリヤー中のpHを約4.0の値未満に保持する少なくとも1種の生理的に許容される緩衝液、オリゴペプチド、無機または有機イオンまたはこれらのあらゆる組合せであることは本発明の範囲内であると考える。
【0040】
本明細書中に使用される用語「炭水化物」は、あらゆる薬剤的に許容できる糖類または二糖類、例えばこれらに限定はされないがグルコース、フルクトース、マルトースまたはマンノース、ソルビトールおよびマンニトールを含み、これらに限定はされない糖アルコール、および多糖類、例えばこれらに限定はされないがデキストリン、デキストラン、グリコーゲン、デンプンおよびセルロース、またはヒトまたは動物に薬剤的に許容できるこれらのあらゆる組合せまたは誘導体を呼ぶ。
【0041】
本明細書中に使用される用語「安定化剤」は、少なくとも1種の化合物、例えばこれらに限定はされないが、グリセロール、アスコルビン酸、ナイアシンアミド、グルコサミン、チアミンまたは無機塩、例えばこれらに限定はされないが塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムまたはプラスミンの製剤の安定性を増加するこれらのあらゆる組合せを呼ぶ。
【0042】
本明細書中に使用される用語「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン」は、生理的条件下でタンパク質分解的に繊維素を切断する能力があるが、しかし約pH2.5〜約4.0のpHに置かれた場合には可逆的に不活性化されるプラスミンのあらゆる触媒活性形を呼ぶ。本明細書中に使用される用語「不活性化」は、生理的pHにおける活性と比較して酵素活性における全面的または本質的な低下を呼ぶ。本明細書中に使用される用語「活性プラスミン」は、プラスミンがタンパク質分解的に繊維素を切断可能である条件下にあるプラスミンを呼ぶ。用語「プラスミン」は、Glu−プラスミン、Lys−プラスミン、これらの誘導体、変性または末端切断された変種を含み、これらに限定はされない。用語「末端切断された(truncated) 変種」は、その全体を引用して本明細書中に編入する米国特許(US)第4,774,087号に開示されているようなミディ−プラスミン、ミニ−プラスミンまたはミクロ−プラスミンを含み、これらに限定はされない。
【0043】
本明細書中に使用される用語「抗凝固剤」は、血栓の形成を阻害できるあらゆる化合物を呼び、ヒルイジン、ヘパリン、血栓阻害因子、血小板阻害因子、血小板凝固阻害因子およびこれらのあらゆる誘導体または組合せを含み、これらに限定はされない。
【0044】
本明細書中に使用される用語「セリンプロテアーゼ」は、タンパク質分解的に繊維素を切断できるあらゆるセリンプロテアーゼを呼び、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼII、カテプシンG、前立腺特異性抗原、白血球エラスターゼ、キマーゼ、トリプターゼ、アクロシン、ヒト組織カリクレインを含み、これらに限定はされない。
【0045】
プラスミノーゲン活性化因子を用いる現在の血栓溶解治療の一つの限界は、血栓周囲またはその中でのプラスミノーゲン利用可能性である。血栓への繊維素溶解剤の局所送達は、ここでプラスミン自体が血栓に直接投与される強力な治療剤であることを可能とする。現在血栓溶解剤として使用されている種々のプラスミノーゲン活性化因子とは異なり、プラスミンを用いる直接局所血栓溶解治療は、クロット溶解を達成するために必要なあらゆるレベルまで強化できる。これは、プラスミンが繊維素ポリマーに直接作用するからである。さらに、プラスミンは、血栓内またはその近傍に直接送達されると、慣用の血栓溶解治療に典型的には伴う全身出血の付随的低下を伴って投与されるさらに低い有効用量を可能とする。過剰のプラスミンは、循環α2−アンチプラスミンにより迅速に不活性化されることもできる。
【0046】
従って、本発明の高度に精製されたプラスミンは、コーン画分(Cohn Fraction) II+IIIから精製されたプラスミノーゲンから調製された。プラスミンの純度は95%を越え、そして比活性は、18〜23CU/mgの範囲内であった。プラスミン製剤は、ウロキナーゼ、またはプラスミンへのプラスミノーゲンの変換のために使用されるあらゆるその他のプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まなかった。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まないプラスミンが、哺乳類血清、組換えプラスミノーゲンまたは末端切断プラスミノーゲン、例えばこれらの限定はされないが、その全体を引用して本明細書中に編入する米国特許(US)第4,774,087号中でWu et al. により開示されたように、ミニ−プラスミノーゲンおよびミクロ−プラスミノーゲンを含み、これらに限定はされないあらゆる原料から調製されてもよいことも包含する。
【0047】
本発明のプラスミンは、ベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することによりプラスミノーゲン活性化因子を本質的に除去するまで精製されそして次いで溶離されるプラスミンを捕集しそして低緩衝能力緩衝液を含む酸性化した薬剤的に許容できるキャリヤー中に保管された。結果は、約2.5〜約4.0の範囲内の低いpHが、プラスミン組成物を室温以上に保持しても大幅に安定化した。いかなる一つの理論もにとらわれないが、この低いpH値においては、プラスミンはさもなければ自己分解に導くであろうセリンプロテアーゼ活性をもう有していないと考えられ、これは、約7.0〜7.5の間の生理的pHでプラスミンが貯蔵された場合に見られることである。
【0048】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが本発明の方法に従って血栓内に直接またはその至近位置に投与された場合に、低または皆無の緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、約7.4の生理的pHにある血清緩衝能力と遭遇する。薬剤的に許容できるキャリヤーの低緩衝能力は中和され、これにより、プラスミンはその活性状態に復帰しそして血栓の繊維素をタンパク質分解的に消化する。
【0049】
血栓内またはその至近位置に投与されるまではプラスミンをタンパク質分解不活性とし、そして同様にあらゆるプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まないプラスミン調製の方法を最初に使用することにより、望ましくない全身出血を誘発する可能性は低下される。過剰に投与されたプラスミンは、循環血清阻害因子、例えばα2 −アンチプラスミンにより迅速に不活性化され、そしてさもなければ離れた位置で繊維素溶解を誘発するように循環する比較的安定なプラスミノーゲン活性化因子は本質的に存在しない。
【0050】
酸性化されたプラスミンは、低または皆無の緩衝能力を有する薬剤的に許容できるキャリヤー、例えば、これに限定されるものではないが、5mMグリシン水溶液中で容易に貯蔵できる。pHが約2.5〜4.0の範囲内である場合には、あらゆる薬剤的に許容できるイオンを単独または組み合わせて使用してもよい。典型的には、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、3.1〜3.5のpHに維持される。低pHを維持するためにキャリヤー中に混合される薬剤的に許容できる酸性イオンは、オリゴペプチド、少なくとも1種のアミノ酸、または有機もしくは無機酸またはこれらの組合せより選ばれてもよい。安定化は、炭水化物であってもよく、これに限定はされない少なくとも1種の薬剤的に許容できる化合物の含有によりさらに増強されてもよい。
【0051】
本発明の低pHプラスミン組成物の治療有効用量を用いる患者内の血栓閉塞を処置する方法の説明は、本出願と共通して譲渡されそして同時に出願された米国特許(US)出願番号第 号、名称「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン」(Reversibly Inactivated Acidified Plasmin)に開示され、そしてその全体を引用することにより本明細書中に編入する。
【0052】
さらに、本発明の可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物を製造するための方法は、本出願と共通して譲渡されそして同時に出願された米国特許(US)出願番号第 号、名称「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の製造のための方法」(Process for the Production of a Reversible Inactivated Plasmin Composition)に開示され、そしてその全体を引用することにより本明細書中に編入する。
【0053】
プラスミン組成物の投与は、一括大量投与(bolus) としてまたは長期間の輸液として血栓内へ直接、または血栓から短距離の近傍の部位のみへプラスミンを送達し、その際にこれが血栓と迅速に遭遇できるあらゆる方法により可能である。血栓への距離を最短化することによりまたはクロット内への直接投与により、送達針またはカテーテルと血栓との間に存在する血清内のプラスミン阻害因子へのプラスミンの暴露が低減される。本発明は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンがカテーテルにより血栓に送達されてもよいことを意図する。本発明は、カニューレ挿入針、例えばこれには限定されないが注射器針を血栓内への可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの注入に使用してもよいこともさらに意図する。しかし、ヒトまたは動物内の特定の位置へ液体を局所的に投与するための当該技術分野の熟練者に既知のあらゆる手段が、本発明の範囲内である。血管または冠動脈血栓へのカテーテル送達は、特に血栓内でのプラスミンの位置決定における正確さをさらに可能とする。本発明は、低緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの血栓への局所送達の方法を提供するけれども、ヒトまたは動物内に移植されたカテーテルの繊維素閉塞へのこれらの可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の送達も本発明の範囲内である。
【0054】
生体外での 125I−繊維素標識血栓溶解アッセイを用いて、プラスミンが投与量依存の様式で血栓を溶解できることが示された。繊維素溶解は、血栓周囲の血漿内のα2 −アンチプラスミンまたはα2 −ミクログロブリンのいずれかの欠失により、ならびにすべての阻害因子の欠失(例えばPBS中)により促進された。これらの結果は、プラスミンによる血栓溶解が内因性プラスミン阻害因子により著しく厳格に調節され、そしてさらに安全な血栓溶解治療の基礎を提供することを示す。
【0055】
カテーテルを介して血栓に直接局所的に投与された低緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミン(1〜3mg/kg)の生体内効力を、ラビット頸静脈血栓溶解モデルにおけるtPA(0.5および1.0mg/kg)と比較した。血栓溶解の速度を測定した。さらに、第8因子およびフィブリノーゲンの消費、ならびに表皮細胞出血時間(Cuticle bleeding time) (CBT)を全身溶解状態の指標として測定した。tPAの0.5mg/kgと比較して、プラスミンは、同等または著しく良好な血栓溶解、同等の第8因子およびフィブリノーゲンの消費および類似したCBTを1mg/kg投与量で示した。3mg/kgのプラスミンでは著しく増加した消費およびCBTであった。tPAの1mg/kgと比較すると、プラスミンおよびtPAの両方共に、非常に類似した血栓溶解速度と同時に3mg/kgプラスミンにおいてフィブリノーゲンの著しく低い消費を示した。
【0056】
このように、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、有効かつ安全に貯蔵されそして血栓溶解剤として、ヒトまたは動物に投与の前に中和することなくカテーテル支援局所血栓溶解の間に使用できる。プラスミンは、tPAと比較して優れてはいないにしても同等の繊維素溶解活性を有し、そして安全性プロフィールは局所血栓溶解剤送達のこの動物モデルでは少なくとも同等と考えられる。
【0057】
可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性酵素が、ミニ−プラスミンおよびミクロ−プラスミンを含みこれらに限定はされないプラスミン、プラスミンの誘導体、例えばこれらの末端切断形であってもよく、これらに限定はされないことは、本発明の範囲内に入ると考えられる。
【0058】
本発明は、血管の血栓閉塞または閉塞したカテーテル器具の至近位置または直接その中へのプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない液状繊維素溶解性組成物製剤の治療的投与量を投与する方法を提供する。本発明は、プラスミンが約4.0のpHで投与される前に安定化されてもよい、血管血栓閉塞への液状可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の治療的投与量を送達する方法をさらに提供する。本発明は、血管血栓閉塞または血栓内に直接低緩衝能力緩衝液内の液状可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの治療的投与量を投与する方法を提供し、その際、プラスミン組成物は、プラスミンにタンパク質分解的に繊維素を切断することを可能とする生理的pHに復帰する。
【0059】
本発明の一つの態様では、本発明の方法は、血栓閉塞を有するヒトまたは動物を特定し、低緩衝能力緩衝液中の薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量をヒトまたは動物に投与し、投与された繊維素溶解性組成物に血栓閉塞と相互作用をさせ、ヒトまたは動物の血管流量のレベルを測定し、そして血管流量の事前選択レベルに達するまで繊維素溶解性組成物を投与するステップを反復するステップを含んでなる。
【0060】
本発明の別の態様では、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物は、プラスミンおよび低緩衝能力緩衝液を含む薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなる。
【0061】
本発明のさらに別の態様では、薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーは、水および薬剤的に許容できる酸を含んでなり、その際、酸は、カルボン酸、オリゴペプチド、アミノ酸であってもよく、しかしこれらには限定はされない有機酸、または無機酸であり、そして低または皆無の緩衝能力を有し、そして酸性化キャリヤーは約4.0未満のpHを有する。
【0062】
さらに別の態様では、薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーは、水およびギ酸、酢酸、クエン酸、グリシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、およびアラニン酸形より選ばれる薬剤的に許容できる酸を含んでなり、その際、酸性化キャリヤーは約4.0未満のpHを有する。
【0063】
別の態様では、薬剤的に許容できる酸は、酢酸またはクエン酸由来の酸である。
【0064】
さらに別の態様では、薬剤的に許容できる酸は、酢酸の酸形である。
【0065】
本発明の方法の一つの態様では、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物は、約2.5と約4.0の間のpHを有する。本発明の方法の別の態様では、繊維素溶解性組成物は約3.7のpHを有する。
【0066】
本発明の方法の別の態様では、プラスミンは約0.01mg/mlから約50mg/mlまでの間の濃度範囲内にある。本発明の方法の別の態様では、プラスミンは、約0.1mg/mlから約10mg/mlまでの間の濃度範囲内にある。
【0067】
本発明の方法の別の態様では、酸性イオンは、約1mMから約500mMまでの間の濃度範囲内にある。本発明の方法の別の態様では、酸性イオンは、約1mMと約500mMとの間の濃度範囲内にある。
【0068】
本発明の方法を実施するための態様は、生理的に受容できるプラスミン安定化剤を含んでなり、ここで、炭水化物はグルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、ラクトースまたはトレハロースから選ばれ、ここで、糖は約0.2%(重量/体積)から約20%(重量/体積)までの範囲内の濃度を有する。一つの態様では、糖はグルコースでありそしてその濃度は約20%である。
【0069】
本発明の方法の態様は、約0.01mg(プラスミン)/kg(体重)と10mg(プラスミン)/kg(体重)との間の範囲内の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの治療的投与量をさらに含んでなる。
【0070】
本発明の方法の態様では、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物は、血管内または血栓内に投与される。本発明の方法の一つの態様では、低pH緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、血管内カテーテル器具により血栓内に直接またはその近傍に投与される。本発明の方法のさらに一つの態様では、血管内カテーテルは、血管閉塞に向けられる。
【0071】
本発明は、ある程度の具体性をもって記載されるけれども、多数の別法、変形、および変種は、本開示を参考にして当該技術分野の熟練者には明らかであることは自明である。従って、本発明の精神および範囲内に入るあらゆるこのような別法、変形、および変種は、記載の請求項に包含されると考えられる。
【0072】
下記の実施例は、好ましい態様および本発明の有用性を説明するために提示されるが、しかしこれを限定すると解釈すべきではない。
【0073】
下記の実施例中に開示した技術は、本発明の実施において良好に機能するように本発明者により発見された技術であり、従ってその実施の好ましいモードを構成すると考えることができることは当該技術分野の熟練者により認められるであろう。しかし、当該技術分野の熟練者は、本開示を参考として、開示された特定の態様内で多数の変化を行い、この場合にも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることも認めるであろう。
【0074】
【実施例】
実施例1:試験したタンパク質の供給源
プラスミノーゲンは、Deutsch & Mertz(1970) により記載されたようにしてLys−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーによりコーン画分(Cohn Fraction) II+IIIペーストから精製した。すなわち、ペースト200gを0.15Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH7.8の2リットル中に再懸濁した。懸濁液を一晩、37℃でインキュベーション、14,000rpmで遠心分離、ガラス繊維を通して濾過そしてLys−セファロース4B(Pharmacia) 500mlと混合した。プラスミノーゲンの結合は、室温で2時間であった。次いで、Lys−セファロースを2リットルガラスフィルター上に移し、そして数回、0.3M NaClを含む0.15Mクエン酸ナトリウムを用いて280nmにおける吸光率が0.05未満に下がるまで洗浄した。結合プラスミノーゲンを0.2Mε−アミノカプロン酸の200ml部分を用いて3回溶離した。溶離したプラスミノーゲンを0.4g(固体硫酸アンモニウム)/ml(プラスミノーゲン溶液)を用いて沈降させた。粗(純度80〜85%)プラスミノーゲンの沈降物を4℃で保管した。
【0075】
低分子量ウロキナーゼ(LMW−ウロキナーゼ)(Abbokinase-Abbott Laboratories, Chicago, Ill.) をさらにベンズアミジン−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次いでCNBr−活性化セファロース4Bと、50mM酢酸緩衝液、pH4.5中のLMW−ウロキナーゼ1.3mgとを混合してウロキナーゼをカプリングし、そしてカプリング緩衝液、0.1M炭酸水素ナトリウム、pH8.0 5mlを用いて希釈した。
【0076】
この溶液をあらかじめ膨潤したCNBr−活性化セファロース5mlと直ちに混合し、そして0.1M HCl中で洗浄した。カプリングは氷上での振とう4時間で起きた。過剰のCNBr活性基を0.1M Tris、pH8.0を用いてブロックした。ウロキナーゼ−セファロースのそれぞれのバッチを5回使用しそしてサイクルの間には4℃で水中の50%グリセロール中に保管した。組織プラスミノーゲン活性化因子(ACTIVASE TM )はGenentech から入手した。プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンおよびα−トロンビン(3793U/ml)はEnzyme Research, Incから入手した。α2 −アンチプラスミンは、Athens Research Technologiesから入手した。商業的に入手できるプラスミンは、Haemotologic Technologies, Inc. から入手した。色素原性プラスミン基質S2251はChromogenix から入手した。 125I−標識ヒトフィブリノーゲン(125〜250μCi/mg)はAmersham Pharmacia Biotechから入手した。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、調製済8−25%グラジエントゲルおよびSDS−緩衝ストリップを用いるPharmacia Phast System装置中で行った。
実施例2:活性プラスミンの精製
(i)ウロキナーゼ−セファロースを用いるプラスミンへのプラスミノーゲンの活性化
プラスミノーゲンをプラスミンに切断して、固定化プラスミノーゲン活性化因子を用いることによる最終製剤の混入がないプラスミンが得られた。ウロキナーゼはプラスミノーゲンを直接切断する。ウロキナーゼによるプラスミノーゲン活性化は、tPAの場合のように繊維素の存在には依存はせず、そしてウロキナーゼはヒトタンパク質である。これらの因子、およびその比較的低コストは、ウロキナーゼを好ましい活性化因子とするが、しかしこれは、繊維素分解が可能な活性プラスミンを生成するtPS、ストレプトキナーゼまたはその他の切断手段の使用を排除するものではない。粗プラスミノーゲンの硫酸アンモニウム沈降物を14,000rpmで遠心分離しそして10mMリシン、80mM NaCl、pH9.0を含む40mM Trisを用いる最小体積中に再懸濁し、10〜15mg/mlの最終タンパク質濃度に達した。プラスミノーゲン溶液を同じ緩衝液に対して一晩透析し硫酸アンモニウムを除去した。透析したプラスミノーゲン溶液(10〜20ml)を等量の100%グリセロールを用いて希釈しそしてウロキナーゼ−セファロース5mlと混合した。50%グリセロールの使用は、活性化の間に形成されるプラスミンの自己分解を低下する。プラスミンは50%グリセロール中で安定でありそして長期間−20℃でこの溶液中に貯蔵できる。
【0077】
プラスミノーゲン活性化は、室温で2時間〜24時間の間にウロキナーゼ−セファロースの新鮮度に依存して起きた。ウロキナーゼ−セファロースの新しいバッチを用いると、活性化は2時間で完了できた。しかし、これは劣化し、そして数回のサイクルの後に効率が低下し、プラスミノーゲン活性化の進行を測定するために還元性条件下でSDS−PAGEの使用を必要とした。活性化が完了すると、プラスミン溶液をガラスフィルターを用いてウロキナーゼ−セファロースから濾過し、そして直ちにベンズアミジン−セファロースに適用した。
(ii)ベンズアミジン−セファロース上のプラスミンの捕捉
プラスミンはトリプシン類似の特異性を有するセリンプロテアーゼなので、ベンズアミジン−セファロースは活性プラスミンの捕捉が可能なアフィニティー吸収剤である。50%グリセロール中のプラスミノーゲン溶液を、0.5M NaClを含む0.05M Tris、pH8.0を用いて平衡化した50mlのベンズアミジン−セファロースカラムに、流量3ml/分で加えた。3〜7℃で3ml/分でカラムに流した。非−結合ピークの初期部分は、高分子量不純物を含んでいた。非−結合ピークの残りの部分は、残留非−活性化プラスミノーゲンおよびプラスミンの不活性自己分解生成物であった。
(iii)低pH緩衝液を用いる結合プラスミンの溶離
中性pH条件での不活性化からプラスミンを保護するために、酸性溶離条件を選定した。ベンズアミジン−セファロースに結合したプラスミンを、0.5M
NaClを含む0.2Mグリシン緩衝液、pH3.0を用いて溶離した。結合ピークは、典型的には3個のプール、すなわち2個の初期ピークB1およびB2、およびB3として溶離する物質の本体ピークに別れた。
【0078】
非−還元性ゲル分析は、すべての3個のプールが高純度(>95%)プラスミンを含むことを明らかにした。しかしゲル分析は、プラスミンの重鎖および軽鎖に加えて、10〜15kDaの範囲内の一部の低分子量バンドがプラスミンの部分的内部切断分解の結果であることを明らかにした。
【0079】
ピークB1の初期部分は、典型的には低分子量不純物の大部分を含んでいた。B2およびB3のプールは、分解程度が低かった。結合ピークの初期部分は、プラスミン活性をほとんど有していず、そして通常廃棄された。この物質中の活性の欠失は、クロマトグラフィーの間の自己分解によるらしく、それは、溶離物質中にグリセロールが存在せず、そして初期部分のpHが平衡および溶離する緩衝液のpHの中間、典型的にはpH6〜6.5の範囲内にあるからである。プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない溶離したプラスミンを、2Mグリシン緩衝液、pH3.0(捕集体積の10%)を含む管中に捕集した。
(iv)酸性化した水(pH3.7)中の溶離物質の配合
溶離したプラスミンを、氷酢酸を用いて約pH3.7に酸性化した水に対して、または0.15M NaClを含み氷酢酸を用いて約pH3.7に酸性化した水に対して透析した。
【0080】
低緩衝能力緩衝液を含みそして約2.5〜約4.0の間のpHを有する薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを生成するあらゆる酸が使用できる。例えば、その他の酸およびアミノ酸、例えばこれらに限定するものではないが、ギ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、安息香酸、セリン、トリオニン、バリン、グリシン、グルタミン、イソロイシン、β−アラニンおよびこれらの誘導体を含み、これらに限定はされない無機酸、カルボン酸、脂肪酸およびアミノ酸を単独またこれらのあらゆる組み合わせで、約2.5〜約4.0の間の薬剤的に許容できるキャリヤー中のpHをを維持するものの使用が本発明の範囲内と考えられる。
【0081】
プラスミンは酸性化した水中では著しく安定であり、そして生体外および生体内試験のためにこの形で効果的に使用できる。プラスミン特異性活性は、Robbins & Summaria(1970)が記載した適応化カゼイン溶解アッセイを用いて測定した。酸性化した水中の4%カゼイン溶液1mlおよび67mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4の適当な体積をポリカーボネート試験管に加えた。溶液を渦攪拌しそして37℃で10分間インキュベーションした。プラスミン試料または緩衝液(ブランク)をそれぞれの管に15秒間隔で加え、十分に攪拌しそして37℃で30分間インキュベーションした。15%トリクロロ酢酸3mlを加えて反応を停止し、沈降物を15分間形成させた。管を3200rpmで20分間遠心分離した。上清を小ビンに移しそしてそれぞれの試料のA280 を測定した。それぞれの試料の比カゼイン溶解活性は次式により算出した。
【0082】
【数1】
【0083】
プラスミン濃度は、0.1%溶液に対する1.7の吸光係数を用いて分光分析的に決定した。
実施例3:プラスミンのpH依存安定性
プラスミンは、その触媒活性の鐘形pH依存性を示す。図1に示すように、プラスミンはpH7.5〜8.0で極大酵素活性を有し、そしてその活性は酸性側およびアルカリ性側のpHの両方で急速に低下する。プラスミンは、最も不活性であり、そしてpH4.0以下では触媒中心内のヒスチジンのプロトン化により可逆的に不活性であり、これはRobbins & Summaria(1976)およびCastellino & Powell(1981) により証明されている。
【0084】
プラスミンは、生理的pHでは著しく不安定である。プラスミンの重鎖および軽鎖の両方は室温および4℃で数時間中で劇的に分解した。プラスミンは、0.04Mリン酸ナトリウム、pH7.4中に1mg/mlで配合し、そして22℃または4℃で6時間インキュベーションした。インキュベーションの間に、プラスミンの本体(integrity) を2時間毎に還元性SDS−PAGE分析を用いて分析した。重鎖および軽鎖の両方共に22℃および4℃で数時間中で急速に分解し、これを図1に示す。
【0085】
【表1】
【0086】
(初期時点でのプラスミンの不変の重鎖および軽鎖を100%として正規化した)
1mg/mlにおけるプラスミンを種々の酸性条件下、37℃で14日間インキュベーションした。プラスミン重鎖および軽鎖の変化を還元性SDS−PAGEを用いて分析した。プラスミンを0.04Mリン酸ナトリウムpH7.4中に1mg/mlで配合しそして同様に4℃で6時間インキュベーションした。インキュベーションの間に、プラスミン試料の活性を2時間毎に色素原効力(chromogenic potency) アッセイにより測定した。プラスミン効力は、MLA1600C分析装置(Pleasantville, NY) を用いて定量的に測定した。プラスミンは、色素原基質S−2403(D−ピログルタミル−L−フェニルアラニル−L−リシン−p−ニトロアニリン ヒドロクロリドまたはpyro−Glu−Phe−Lys−pNAと短縮)を加水分解してペプチドおよび色素原基p−ニトロアニリン(pNA)を生成する。色素形成の速度は、動力学的に405nmで測定した。加水分解された基質の量は、試料中のプラスミン活性に比例した。標準曲線は、色素形成の速度(OD/分)のプラスミン標準の効力に対する線型相関から作製した。線型式と未知試料について観察された速度とを一緒に未知の効力を算出するために使用した。プラスミンの効力は、mg/mlの単位で報告した。
【0087】
プラスミンの本体は、生理的pHにおけるインキュベーションにより著しく低下し、これを表2に示す。
【0088】
【表2】
【0089】
(初期時点でのプラスミン溶液の活性を100%として正規化した)
この中性pH溶液中で、プラスミン活性は、4℃で6時間後に70%以上低下した。
【0090】
pH3.7の酸性化水中に配合されたプラスミンは安定である。この形で数カ月間低温で、活性低下またはタンパク質分解または酸性性質の分解生成物の出現がなく保管できた。図2および表3のデータは、4℃および室温におけるプラスミンの安定性を示す。
【0091】
【表3】
【0092】
(インキュベーション前のそれぞれの配合物内の不変の重鎖および軽鎖を100%として正規化した。HAc/NaAc=酢酸/酢酸ナトリウム)
4℃で、プラスミンは少なくとも9カ月間安定である。室温でも、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、少なくとも2カ月は安定である。室温における長期安定性は、これがこの配合物を血栓溶解投与の長期治療計画に適合させるので重要である。例えば、血栓溶解剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼの36時間投与は、末梢動脈閉塞の治療において慣用であるからである。SDSゲルのそれぞれのレーン内での全タンパク質に関する重鎖割合に対するpHのプロットを図3に示す。この結果は、緩衝液の種類または緩衝液濃度とは無関係に、約3.1〜3.5のpH安定性極大を実証する。
【0093】
生理的pHへの転移により完全に活性となる可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの能力は、カゼイン溶解アッセイおよび 125I−繊維素−標識血栓溶解アッセイにおけるその活性によっても明らかにされる。これらの両方のアッセイはpH7.4で行われ、そしてpHの変化および等電点(pH5〜5.5)を通る間にプラスミン活性が完全に回復した。プラスミンは低緩衝能力溶剤中に配合され、そして、緩衝された溶液、例えば血漿に加えられると、これは迅速に中性または生理的pHを直ちに取り、そし等電点を通る遅い過程に通常は伴う沈降は起きない。
実施例4.プラスミンはプラスミノーゲン/プラスミノーゲン活性化因子混合物と同じ固有繊維素溶解効力を有する。
【0094】
プラスミンは、プラスミノーゲン/プラスミノーゲン活性化因子混合物と同じ固有繊維素溶解効力を有する。プラスミンの繊維素溶解効力をLys−プラスミノーゲンとtPAとの混合物のものと比較した。これらの実験は、PBS中に浸漬した 125I−放射能標識繊維素血栓から成る規定の系内で行った。図4は、緩衝された環境内で、プラスミンを用いて達成される血栓溶解が、Lys−プラスミノーゲンとtPAとの混合物とほとんど一致することを示す(それぞれ曲線aおよびb)。同時に、tPA単独(曲線c)またはいかなるタンパク質も存在しない場合(曲線d)には血栓溶解が観察されなかった。tPA単独を用いて得られたデータは、その活性がその基質、プラスミノーゲンに依存し、効果的な血栓溶解剤であることを示す。
【0095】
これらのデータは、阻害因子およびその他の血漿中に存在するタンパク質因子が存在しない場合に、精製プラスミンと、tPAとtPAを用いて活性化されたLys−プラスミノーゲンとの組み合わせとの間に繊維素血栓を溶解する能力に差異がないことを示す。活性プラスミンの血栓溶解効力を評価するために、 125I−繊維素標識繊維素血栓溶解アッセイを、血漿環境内で血漿血栓を用いて行った。
実施例5.プラスミン活性調節におけるプラスミン阻害因子の役割
125I−繊維素標識血栓溶解アッセイ。プラスミンの繊維素溶解性は、Lijnen et al(1986)により記載されたようにヒトクエン酸化血漿内に浸漬した放射能標識血漿血栓からなる生体外系内で測定された。すべての実験に使用した血漿は、37℃で解凍し、分割し、再凍結しそして−80℃で貯蔵した単一ドナー血漿であった。 125I−標識フィブリノーゲンの原液は、バイアルの内容物(約110μCi/バイアル)を0.15Mクエン酸ナトリウム1.0mlを用いて再水和して調製しそして4℃で保管した。
【0096】
125I−フィブリノーゲン10μlを、37℃の血漿250μlを含むポリカーボネート試験管に加え、そして短時間攪拌した。10〜20μMの最終濃度まで0.1M CaCl2 を用いて希釈したα−トロンビン25μlを血漿に加えた。放射能標識した血栓を5分間、37℃で熟成させ、次いでPBSを用いて洗浄した。血漿または緩衝液2.25mlを含む試験管内に管あたりに血栓1個づつで血栓を移した。
【0097】
それぞれの血栓について基線放射能試料を測定した。それぞれの血栓を加えた後にそれぞれの管にプラスミンを加えた。実験の間は血栓を37℃に戻した。遊離される放射能の測定のために指定の時点で別の試料を取り出した。血栓溶解の程度は、血漿内へ血栓から遊離された放射能の量と、反応管内の可溶性放射能の全量との比率から算出した。百分率で表した標識繊維素分解生成物の放出を時間に対してプロットした。
【0098】
血漿環境に加えて、一部の血栓溶解実験は、緩衝液環境内またはα2 −アンチプラスミンまたはα2 −マクログロブリン活性を欠く血漿を用いて行った。α2 −アンチプラスミン欠失血漿は、Wiman(1980) 記載のようにして、正常の血漿をクリングル1−3−セファロースカラム(Kringle 1-3-Sepharose column)を通して得られた。α2 −マクログロブリン−不活性化血漿は、0.1MメチルアミンBarrett et al.(1979)を用いて2時間、37℃で通常の血漿を処理し、引き続いて4℃でPBSに対して透析して得られた。
【0099】
上記の血漿溶解アッセイを用いて、プラスミンが投与量依存の様式で血漿血栓を溶解できることが示され、これを図5および6に示す。プラスミンの量を増加して 125I−繊維素標識血漿血栓に加え、そして血栓溶解の程度を放射能の遊離を測定して評価した。(a)反応管内のプラスミン0.15mg/ml、(b)0.30mg/ml、(c)0.45mg/ml、(d)0.60mg/ml、(e)プラスミンを加えない対照。図6のデータは、プラスミンは血漿雰囲気中でも活性でありそして血漿血栓を溶解できることを証明する。この現象は、投与量依存性である。同時に、Lys−プラスミノーゲンとtPAとの混合物とは異なり、プラスミン単独による血栓溶解は、血漿環境内で完了までは進行しない。血栓溶解は、2時間後に停止する傾向がある。いかなる一つの理論にとらわれることは望まないけれども、この現象は、血漿環境内の種々のプロテアーゼ阻害因子の存在により説明でき、そして、特にα2 −アンチプラスミンによる非−血栓−結合プラスミンの迅速な阻害による。
【0100】
プラスミン触媒血栓溶解における血漿阻害因子の役割を評価するために、正常の血漿およびα2 −アンチプラスミン、α2 −マクログロブリンもしくはすべての阻害因子を欠く血漿試料、またはPBSを用いて、一連の血栓溶解実験を行った。
【0101】
図6から分かるように、プラスミン−誘導繊維素溶解は、血栓周囲の血漿中のα2 −アンチプラスミンまたはα2 −マクログロブリンのいずれかの欠失により促進され、そしてすべての阻害因子が存在しないとさらに促進された。これらの結果は、プラスミンのよる血栓溶解が、内因性血漿プラスミン阻害因子による非常に厳格な生理的制御下にあり、従ってさらに安全な血栓溶解治療のための基礎を提供する。
【0102】
プラスミノーゲン活性化因子−誘導血栓溶解の反対に、プラスミンを用いる血栓溶解は、これらの阻害因子により制御できる。プラスミノーゲン活性化因子−誘導血栓溶解は、実際的な観点から人体内に限定はされない血漿中に存在するプラスミノーゲンの内部供給を利用する。反対に、プラスミン−誘導血栓溶解は、プラスミンの外部供給に全面的に依存する。患者に対するプラスミン投与の休止は、血栓溶解の迅速な休止をもたらすはずでありそしてさらに安全な治療のための基礎を提供する。
実施例6:末梢動脈閉塞(PAO)の生体外モデル内の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンおよびtPAの比較
熟成し収縮したクロットは、効果的なクロット溶解のためにすべてのプラスミノーゲン活性化因子により要求される基質であるプラスミノーゲンを欠失する(Rabbie et al. Thrombosis and Haemostasis 1996、 75(1)、 127-33)。熟成したクロットはプラスミノーゲン活性化因子による溶解を著しく起こしにくい。
【0103】
熟成クロットは、機序的およびこれらのタンパク質組成の両方において心筋梗塞または卒中を起こすクロットとは異なる。これらは典型的には末梢動脈内に見いだされそして著しい大きさに成長できる。本来の動脈内に見いだされる末梢クロットの平均の大きさは、Ouriel et al. の記載のように14.8±11cmである。プラスミノーゲン活性化因子により独占的に代表される現在の血栓溶解剤は、これらの種類のクロットの溶解にはほとんど無効である。典型的には、PAOの患者をウロキナーゼを用いて24時間以上処置しそしてこの長期間の後でも、血管の完全な開通には達しない。クロットの内部へカテーテルを介して血栓溶解剤が送達された場合に、この状況は悪化し、さらにこれらの効力について要求されるプラスミノーゲン基質の近接を妨げるであろう。
【0104】
収縮クロットの溶解のための別の方法は、クロットの内部へのカテーテルを介する活性プラスミン直接送達である。収縮クロット内への直接の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの送達は、これらのクロットの固有のプラスミノーゲン欠失を回避しそしてプラスミノーゲン含有量に関係なく予測可能、迅速そして有効なクロット血栓溶解剤を提供する。さらに、血漿中の本来のプラスミン阻害因子、α2 −アンチプラスミンの豊富な存在は、クロットの近傍から逃げるあらゆるプラスミンの瞬間的不活性化に役立ち、これにより離れた場所の繊維素溶解およびこれにより起きる出血エピソードを回避する。
【0105】
長期間収縮したクロットの溶解に対するプラスミンおよびtPAの効力を比較するために、我々はPAOを有する患者内に形成されたクロットのパラメーターを模擬する生体外モデルを開発した。
【0106】
生体外PAOモデル。新しいヒト全血を30x0.95cmガラス管中に捕集しそして添加剤を加えないで自発的にクロット化させた。管を20時間、37℃でインキュベーションして完全に収縮させた。米国標準試験ふるいD16の14メッシュを用いて収縮したクロットを血清から分離しそしてこれらの重量を測定した。脚部動脈内の平均クロット大きさ(0.6x12cm)に近いさらに小さい直径のグラス管内に血液クロットを移した。複数のサイドポートを有するパルススプレイカテーテル(pulse-spray catheter)(11cm噴射先端を有するフランスサイズ(French size) 5、Cook, Inc.)をクロット内に挿入しそして本発明に従う血栓溶解性可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物、またはtPAを1mg/mlで、1時間の時間間隔で1mlづつ加えた。注入の回数は、血栓溶解剤の投与量に依存する。クロット溶解の程度は、残留クロットの重量により測定しそしてクロット重量減少の百分率として表した。このモデルはPAOモデルと呼ばれる。静脈血液をクロット形成のために使用したけれども、これはPAO患者内の見いだされるクロットの大きさを模擬している。tPAおよび本発明に従う可逆的に不活性化された酸性化プラスミンをこのモデル内で試験し、その結果を以下に記載する。
【0107】
プラスミンは、新しいクロットの溶解のためにtPAと同様に有効であり、そしてtPAおよびプラスミンを20時間熟成した収縮クロットの溶解のために使用して第8因子により完全に架橋させる場合とは異なる。tPAは、このようなクロットを溶解することは不可能である。tPA処理クロットを用いて得られるクリット重量低下は、投与量をクロット当たりに5mgに上昇させても対照と同様である。
【0108】
反対に、プラスミンは、完全に収縮および架橋したクロットの両方に対して有効である。プラスミンの溶解効果に投与量依存性がありそして5回注入(すなわち全体でプラスミン5mg)の後、クロットはほとんど完全に溶解される。同様の一連の実験で、収縮および架橋したヒト血栓を溶解することへの不適性がウロキナーゼを用いて観察された。従って、局所的に送達されたプラスミンは、tPAおよびその他のプラスミノーゲン活性化因子よりもさらに効果が高い血栓溶解剤である。
【0109】
これらの生体外データは、クロット溶解を開始および維持するためにtPAはその基質であるプラスミノーゲンのクロット中での存在を必要とすることを示す。従って、プラスミンは新しいかまたはプラスミノーゲンに富むクロットの溶解に対してはtPAと同様に効果的であるが、長期に収縮してプラスミノーゲンが少ないクロットの溶解に対しては、tPAおよびその他のプラスミノーゲン活性化因子よりもプラスミンはさらに有効である。さらに、本実施例中に示したデータは、クロット内部に直接注入された場合に、プラスミンがその可逆的に不活性化されたされた酸性化形で有効であることを証明する。
【0110】
ガラス管内のクロットは、血栓または繊維素血栓がヒトまたは動物内に置かれたカテーテル内に形成し、そしてカテーテルが閉塞されるモデルでもある。
実施例7:ラビット頸静脈血栓症モデル
局所投与活性プラスミンの生体内での効力および安全性は、Collen et al., (1983) のラビット頸静脈血栓症モデルにより決定した。このモデルを要約すると以下である:ラビット(2〜3kg)をケタミン/キシラジン(xylazine)を用いて鎮静させ、そしてペントバルビタール(5〜10mg/kg/時間)の希釈溶液の投与のために22G静脈カテーテルを耳血管内に入れた。頸を剃りそして血圧測定および血液試料採取のために動脈カテーテルを頸動脈内に入れた。呼吸を容易にするために気管内チューブを入れるために気管切開を行った。鈍的切開を用いて頸静脈を注意して顔面血管までこれを含んで分離した。顔面血管内に24Gカテーテルを入れそして分離した顔面血管の遠くおよび近傍の両方で頸血管をクランプした。分離した血管部分を生理的塩類溶液を用いて数回洗浄しそして血液を完全に落とした。分離した部分をトロンビン溶液(500U/ml)を用いて数回洗浄した。最後の洗浄の後、動脈カテーテルから動脈血試料0.5mlを採取し、 125I標識フィブリノーゲン50μl(約1μCi)と迅速に混合した。顔面血管を介して、血管部分が完全に拡張するまで分離した血管内に混合物を迅速に注入した。鉗子を用いて血管をマッサージして血栓を混合し、乾燥を防ぐために暴露した頸血管の上に一片のサランラップを置いた。血栓上の冷フィブリノーゲンの析出を防ぐためにヘパリン(100IU/kg)を投与した。血栓を30分間熟成させそしてクリップを取り除いた。
【0111】
血栓の安定性は、30分間の平衡期間を通じて監視した。標識した血栓の溶解(溶解率%)を血栓上に直接設置したGILEガンマカウンタープローブを用いて連続的に測定した。
実施例8:静脈血流の回復
血栓溶解を生理的情報を得るために、別の一連の実験での血栓溶解の別の指標として血流回復を使用した。これらの実験において、トランソニック流量計(Transonic Flowmeter) に接続した閉塞血栓(放射能標識なし)から遠くに近似的な大きさとした流れプローブを配置しそして静脈血流測定を1分毎に行った。
【0112】
血栓形成前の基線血流は、12〜18ml/分でありそしてデータは基線の%として表した。静脈血流の回復割合および第8因子およびフィブリノーゲンの消費量は、図7には60分のものを示し、そして図8には90分のものを示した。0.5mg/kgおよび1.0mg/kgの投与量において、tPAは60分後にそれぞれ16±4%および21±10%の基線血流回復を誘導した。1.0mg/kgおよび2.0mg/kgにおけるプラスミンは、それぞれ基線血流の20±1%および33±1%の回復を誘導した。90分では、tPA注入は血流のそれぞれ18±3%および26±11%回復をもたらし、そしてプラスミンはそれぞれ25±5%および34±6%の血流回復をもたらした。
実施例9:表皮細胞出血時間(CBT)
60分における表皮細胞出血時間を図9に示す。生理的塩類溶液処理は、13±1分の出血時間をもたらした。0.5mg/kgおよび1.0mg/kgの投与量におけるtPAは、それぞれ13±2分および25±4分の出血時間をもたらし、一方、プラスミンは1.0mg/kgおよび2.0mg/kgの投与量においてそれぞれ17±3%および19±1%分の出血時間をもたらした。可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを用いた場合と比較して、tPAは長いCBTを示し、プラスミンが投与され血清因子により迅速に阻害される場合よりも、内因性プラスミノーゲンのtPA活性化による全身繊維素溶解がさらに広範であることを証明する。
実施例10:ラビット繊維素溶解出血モデル
プラスミノーゲン活性化因子tPAと比較してさらに大きいプラスミンの安全性は、繊維素溶解性出血の確実な指標を表す繊維素溶解出血の実証されたラビットモデルで証明され、これはMarder et al.,(1992)に記載されている。
【0113】
プラスミンおよびtPAの血栓溶解的に等価の投与量(体積10ml)を、再出血の発生および期間、および選択された血漿凝固および繊維素溶解パラメーターに対するこれらの相対的効果のために耳−穿刺モデルで比較した。プラスミン(2.0または4.0mg/kg)およびtPA(1.0または2.0mg/kg)の2種類の投与量を、外頸静脈内に装入したカテーテルを介してラビット内に60分間注入した。それぞれの繊維素溶解剤の注入の前、その間およびその後でメス刃を用いる耳穿刺(耳あたりに約6個)を、出血時間および再出血の両方について観察した。一次出血時間は、それぞれの注入開始に対して−30、−10、0、10、30、60、70、90、120および180分で行った。クエン酸処理血液試料(5ml)を、それぞれの繊維素溶解剤の注入の前、その間、および2時間後まで採取した。これらの血液試料をフィブリノーゲン、第8因子、およびα2 −アンチプラスミンについてアッセイした。それぞれの実験群は、ラビット5匹から成っていた。
【0114】
一次出血時間は、注入開始のそれぞれの時点後90分時点までのtPA群で、長くなる傾向があった(表4)。
【0115】
【表4】
【0116】
この効果は、30分および70分の実験時間におけるtPAおよびプラスミンの高投与量群の比較において、統計的に有意であった(p<0.05)。
【0117】
表5は、4個の実験群のそれぞれにおいて観察された再出血の発生を示す。
【0118】
【表5】
【0119】
結果は、プラスミノーゲン活性化因子であるtPAの出血活性とプラスミンのそれとを差別した。tPA処置動物10匹中の9匹とは異なって、いずれのプラスミン処理した動物も再出血を示さなかった。
【0120】
表6Aは、1.0mg/kgtPA投与群に対する活性部位および再出血のすべての部位における平均再出血時間を表示する。表6Bは、2.0mg/kg投与量群に対する相当するデータを表示する。
【0121】
【表6】
【0122】
【表7】
【0123】
活性部位における再出血は、tPAの2種類の投与量群の間の差別を示し、tPAの1.0mg/kg投与と比較して2.0mg/kg投与ではさらに長い再出血期間であった。血液化学測定からの結果を表7〜9に示す。
【0124】
表7は、実験期間で測定したフィブリノーゲンのレベルを示す。tPA注入後の平均フィブリノーゲンレベルは、プラスミン注入後よりもさらに迅速にそしてさらに低い最下点まで低下した。
【0125】
【表8】
【0126】
第8因子に対する平均値(表8)は、プラスミン注入動物よりもtPA注入動物の実験時間の大部分でさらに低く、それぞれのプラスミン群に対してそれぞれのtPA群の60分実験時間では統計的有意に達した。
【0127】
【表9】
【0128】
tPAを投与された動物中の第8因子の回復は、プラスミンを投与された動物とほぼ同様の濃度(初期値の50〜60%)であった。tPAの2種類の投与量の比較は、より高い投与量で第8因子のさらに急速な低下を示し、そしてより低い投与量では第8因子のさらに劇的なリバウンド増加を示した。
【0129】
表9に示すα2 −アンチプラスミンに対する平均値は、プラスミン注入動物と比較してtPA注入動物では大部分の実験時間でさらに低かった。
【0130】
【表10】
【0131】
統計的有意性は、tPA群およびいずれのプラスミン投与群のそれぞれの間で10分および60分実験時間で到達し、そして高投与量tPA群および相当する低投与量プラスミン投与群の間で70分および90分実験時間で到達した。
実施例11:ミニ−プラスミンによる繊維素溶解
ミニ−プラスミンは、最初の4個のクリングルドメインを欠くプラスミンの末端切断バージョンである。これは、エラスターゼを用いるプラスミノーゲンの限定されたタンパク質分解により生成するミニ−プラスミノーゲンから調製できる。ミニ−プラスミンは、完全な大きさのプラスミンよりもクロット溶解にさらに有効であり、それは、(a)ミニ−プラスミンはプラスミンよりも小さく(38kDaに対して84kDa)それでクロット内部にさらに容易に拡散でき、そして(b)ミニ−プラスミンはクリングル1のα2 −アンチプラスミン結合部位を欠き、従ってクロットに架橋するα2 −アンチプラスミンによる阻害に抵抗性であるからである。α2 −アンチプラスミンは、しばしば血栓溶解治療への熟成クロットの抵抗性の原因となる。ミニ−プラスミノーゲンは、Sottrup-Jensen etal. (1975)の記載のようにして精製した。ミニ−プラスミノーゲンへのミニ−プラスミンへの変換、その精製および形成は、実施例2のプラスミンに関する記載と正確に同じプロトコールを用いて行った。
【0132】
ミニ−プラスミンの血栓溶解能力を、実施例6記載の生体外PAOモデルを用いて等モル濃度でプラスミンのものと比較した。クロットを20時間熟成し、プラスミン(1mg/ml)またはミニ−プラスミン(0.45mg/ml)の1mlの2回の投与量をカテーテルを介してクロットに送達した。注入の間に、クロットを37℃で1時間インキュベーションした。血栓溶解の程度は、クロット重量低下により測定した。生理的塩類溶液を注入したクロットを対照として使用した。クロットの大きさは0.6 x 12cm。
【0133】
図10に示すように、等モル量で使用された場合に、ミニ−プラスミンは、プラスミンよりも高いクロット溶解を起こす。0.45mg/mlでのニミ−プラスミンの2回1−ml注入の後のクロット重量低下は、44.3±4.4%であり、一方1mg/mlでのプラスミンの2回1−ml注入は、36±1.7%のクロット重量低下であった。カテーテルを介してクロットに直接またはその内部に送達された場合に、ミニ−プラスミンはプラスミンよりもさらに効果的な血栓溶解剤であり得る。
実施例12:プラスミンの局所カテーテルプラスミン投与の効力
カテーテルを介して局所投与されたプラスミン(1〜2mg/kg)の生体内効力を、ラビット頸静脈血栓溶解モデルにおいてtPA(0.5および1.0mg/kg)のものと比較した。2種類の方法を血栓溶解を評価するために使用した。1)放射能標識血栓を用いる溶解百分率の実時間測定、および2)流動プローブおよび流量計の適用による基線血流の回復。血栓溶解の速度を測定しそして実施例6の記載と同様にして90分間定量した。同時に、第8因子およびフィブリノーゲンの消費ならびに表皮出血時間(CBT)を全身溶解状態の指標として測定した。これらの局所投与研究のために、カテーテル(PE50)を周辺耳静脈を介して遮断性血栓の1cm以内まで進めた。tPAの2種の投与量0.5および1.0mg/kgおよびプラスミンの2種の投与量1.0mg/kgおよび2mg/kgを使用した。これらの投与量が、30分間で注入した全体積10.0ml中に含まれていた。放射能標識した血栓を用いて60および90分における溶解百分率を測定し、そして、非標識血栓を用いる別の一連の実験で、同じ時点での血流の回復百分率を測定した。0分および60分で得た動脈血液試料(4ml)をフィブリノーゲンおよび第8因子レベルの測定のために使用した。第8因子レベルレベルおよびフィブリノーゲン濃度は、MLA Electra 800 凝固タイマーおよびフィブリノーゲン・アッセイセットを用いて測定した。第8因子レベルは、標準曲線を作製するためにヒト第7因子を用いてCOATEST VIII C4 アッセイにより測定した。0分および60分における表皮出血試験は、ラビットの爪をその先端でイヌ尾トリマーを用いて切除して測定した。血栓が形成されるまで2分毎に爪に接触しないようにして濾紙を用いて血液を軽く叩き、そして濾紙は血液を落とさない(wick)ようにした。結果は、平均±SEMで表し、そして群間の有意の差異を評価するために多重比較試験のためのBoniferori法に従う一方向ANOVAを使用した。P<0.05を有意と考えた。
【0134】
プラスミンまたはtPA(全体積10ml)を、血栓の近く1cmに入れたカテーテルを介して30分間注入した。等量の生理的塩類溶液を対照として用いた。1.0〜2.0mg/kgのプラスミン投与をtPAの0.5mg/kg投与と比較した。多重比較検定のためのDunn法による1方向ANOVAを統計的評価のために使用した( *は0.5mg/kgにおけるtPAと比較したp<0.05、または#は1.0mg/kgのtPAと比較したもの)。
【0135】
tPA(0.5〜1.0mg/kg)と比較して、局所的に注入されたプラスミン(1.0〜2.0mg/kg)は、同等または著しく良好な血栓溶解を誘導し、同時により少ない第8因子およびフィブリノーゲン消費ならびにCBTであった。プラスミン処置のリスク/利益評価は、プラスミンの2倍の投与量(重量基準)がtPAと同等の出血副作用を誘導した。従って、プラスミンは、カテーテル支援局所血栓溶解の間の血栓溶解剤として効果的にそして安全に使用できる。プラスミンは、tPAと比較して同等または優れた溶解活性を有し、そして安全プロフィールは局所血栓溶解送達のこの動物モデルで同等と考えられる。
【0136】
血栓溶解の程度は、血漿内へ血栓から遊離された放射能の量と、反応管内の放射能の全量との比から算出した。標識した繊維素分解生成物の遊離を百分率で表して時間に対してプロットした。
【0137】
標識血栓の溶解割合および第8因子およびフィブリノーゲンの消費は、インキュベーション時間60分(図11)および90分(図12)で示す。0.5mg/kgおよび1.0mg/kgにおいて、tPAはそれぞれ16±2%および21±2%溶解を誘導し、1.0mg/kgおよび2.0mg/kgにおけるプラスミンはそれぞれ26±3%および33±4%溶解を誘導した。90分において、tPA注入はそれぞれ21±2%および26±2%溶解をもたらし、これはそれぞれ31±4%および36±2%の溶解を誘導するプラスミンと比較される。
実施例13:プラスミン処置対tPA処置のリスク/利益評価
血栓溶解のラビットモデルにおけるプラスミンの広範な比較薬理学評価(リスク/利益)を決定した。プラスミンの効力をtPAのものと比較した。効力の指標として溶解および血流の回復の百分率を使用した。これらの分析は、別々の実験で行った。これらの血栓溶解剤により誘導されるそれぞれの副作用は、第8因子およびフィブリノーゲンの消費を測定しそして出血時間を評価して比較した。これは、近似的なリスク/利益プロフィールの決定を可能とした。
【0138】
リスクプロフィールを決定するために、溶解状態および出血の誘導のための代理マーカーとして第8因子の消費を用いて、tPAに対するED50を算出した。第8因子の消費は、第8因子(Kogenatee) の再補充による出血副作用および正常止血状態への復帰に直接関係した。少なくとも10匹(動物)/投与量のNを用いる0.1mg/kg〜3.0mg/kgの範囲のtPA投与量を試験した。1.0mg/kgがtPAに関する臨床投与量と考えられる。tPAに関して算出したED50は1.8mg/kgであった。局所投与プラスミンに関する同様の計算は、3.6mg/kgのED50を与えた。従って、プラスミンの二倍の投与(重量基準)がtPAと同様の出血副作用を示した。同等のリスクプロフィール、すまわち凝固タンパク質消費および出血におけるtPAとプラスミンとの投与量を用いる効力(溶解および血流の百分率)は、図13に示すように算出された。試験したすべての当量リスク投与量、tPA(0.5〜3.0mg/kg)およびプラスミン(1.0〜3.0mg/kg)において、プラスミンは、tPAと比較して、少なくとも同等またはさらに良好な溶解速度および血流回復を誘導した。従って、薬理学データは、カテーテル送入により接近できる血栓の溶解処理のためにプラスミンを考慮するように推奨するために十分である。
実施例14:N−末端配列決定により特性検討されたプラスミン試料の分解ペプチド
プラスミン試料の分解ペプチドを以下のようにN−末端配列決定により特性決定した。プラスミン組成物を2mM酢酸を含む低pH値、すなわち2.5未満のpHおよび3.5および3.8のpHで配合した。プラスミン試料を、4〜12%Bis−Tris NuPageゲルを用いるSDS−PAGEを用いて分析し、これを図14に示す。タンパク質バンドをPVDF膜に転移させ、クーマシー・ブルーR−250(Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA) を用いて染色し、そしてバンドをメスで切り取った。
【0139】
N−末端配列分析は、Hewlett Packard 241 タンパク質配列決定装置(Hewlett Packard, Inc., Glen Allen, VA) を用いて膜から直接行った。プラスミンの相当する断片が同定できるように、それぞれのバンドについて10回のサイクルを行った。それぞれのバンドの分子量をInvitrogen, Inc(San Diego, CA)から入手できるMark 12 マーカーを用いるデンシトメトリー分析を用いて決定した。
【0140】
pH3.8におけるプラスミンのインキュベーションにより生成した3種のポリペプチドは、位置(Lys−プラスミンに対する数値)トレオニン(T105)、グリシン(G190)およびグルタミン酸(E623)で始まった。プラスミンの既知のアミノ酸配列から、最初の2種のポリペプチドは重鎖由来であり、そして第三は軽鎖由来であると決定された。図15に示すように、N−末端アミノ酸の前のアミノ酸は、アルギニンまたはリシン(K104、R189、およびK622)のいずれかであった。プラスミンがリシンおよびアルギニンのカルボキシル側でタンパク質を切断することが一般に知られている。これらの結果は、pH3.8におけるプラスミンの組成物が、自己分解を受けやすいことを証明した。
【0141】
pH2.2におけるプラスミンのインキュベーションにより生成した3種のポリペプチドは、N−末端のプロリンから始まっていた。プラスミンの既知のアミノ酸配列から、これらの3種のポリペプチドは、位置P63、P155、およびP347から始まる重鎖由来であることが決定され、これを図15に示す。それぞれのプロリンの前のアミノ酸は、アスパラギン酸であった(D62、D154、およびD346)。アスパラギン酸−プロリン(D−P)ペプチド結合が酸で切れやすいことは一般に知られている。これらの結果は、pH2.2におけるプラスミンの組成物では、ペプチド結合の酸加水分解を受けやすいことを証明した。
実施例15:低pH配合安定化プラスミン中の糖類
プラスミンをpH2.5〜4.0で下記の糖類の少なくとも1種類を用いて下記の酸の1種類中に配合した。酸の群は、酢酸、クエン酸、セリン、トレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン、β−アラニン、またはその他の酸の1mM〜500mM、好ましくは1mM〜50mMの範囲内のものを含む。糖類の群は、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、ラクトース、グルコースおよびトレハロースの0.2%〜20%を含む。いかなる賦形剤も含まないプラスミン配合物を対照として含ませた。すべての試料を37℃で7日間インキュベーションした。プラスミン本体の変化を還元性SDS−PAGEを用いて分析した。
【0142】
図16に示した結果は、糖類がpH3.5でプラスミンに安定化作用を有しそして低pHでの可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの貯蔵からの利益を改善することを実証する。
実施例16:非−炭水化物安定化剤を用いる可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の安定化
可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物を本発明に従い、非−炭水化物安定化剤として加えたグルコサミン、ナイアシンアミド、シトルリンまたはチアミンの0.1Mを含むpH3.7の5mM酢酸中、1mg/mlで配合した。いかなる賦形安定化剤も含まない可逆的に不活性化された酸性化プラスミン配合物を対照として含ませた。すべての試料を37℃で7日間インキュベーションし、プラスミン本体の変化を非還元性条件下でSDS−PAGEを用いて分析した。図17を参照すると、試験したすべての非−糖類安定化剤が37℃で7日間の試験期間で、可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の安定性を改善した。
【0143】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物も本発明に従い、安定化剤として150mM塩化ナトリウムを用いて、2mM酢酸、pH3.4中、1mg/mlで配合した。同じ配合であるがしかし塩化ナトリウムを含まないものも調製しそして対照として含めた。試料を4℃で28日間インキュベーションした。プラスミン本体の変化は、上記の実施例3記載のようにして非還元性条件下でSDS−PAGEを用いて分析した。値は、100%の値を与えた0日目の対照に対して正規化された。表5で、結果は4℃で貯蔵したプラスミンが、塩化ナトリウムを含む低pH配合よりもさらに安定であったことを証明した。
【0144】
【表11】
【0145】
実施例17:プラスミンは酸性化した生理的塩類溶液の比例する大量を中和できる
生理的pHにおいて血清1mlにより中和できる本発明の可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の体積を推定するために、一連の滴定実験を行った。血清の体積1mlは、PAO患者の動脈内に見いだされる平均的に収縮したクロットの液相体積を表すと推定される。本発明に従う可逆的に不活性化された酸性化プラスミンがその中で配合されるものに典型的な酸性化(pH3.7)低緩衝能力緩衝液を用いて血清(1ml)を滴定した。図18に示すように、血清1mlは、酸性化生理的塩類溶液約150mlを中和できる。後者の体積は、末梢動脈閉塞の処置のために必要な可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの考えられる体積を越える。
【0146】
従って、低緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの配合物は、有効で安定な薬剤組成物のための基礎を提供する。このような組成物は、患者への製剤の送達の間に著しい効力の低下を伴うプラスミンを用いない処置のために必要な時間で、室温で可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの投与を可能とする。
実施例18:低pHで安定化されたトリプシンはさらに高いpH環境への転移により再活性化できる
トリプシン(16.4mg、Sigma Chemical Co. カタログ番号T-1426)を50mM Tris/0.5M NaCl(pH8.0)2.28ml中に溶かした。50mM Tris/0.5M NaCl(pH8.0)を用いて事前に平衡化させたベンズアミジン−セファロース(Pharmaciaコード番号17-0568-01)の1ml−カラムにトリプシン溶液を加えた。このカラムをこの後者の緩衝液4mlを用いて洗浄すると、溶離物吸光度(280nm)の0.03未満への低下をもたらした。200mMグリシン/0.5M NaCl(pH3.0)の体積0.5mlを用いて不活性化された状態にあるこのカラムからトリプシンが溶離した。このカラムから溶離した第3〜第5の0.5ml画分は、吸光度(280nm)のピーク値を含み、そしてプールした。このプールしたトリプシン溶離物の吸光度(280nm)は、9.22と決定された。トリプシンの吸光係数(1%溶液に対するE280 =17.09)およびトリプシンの分子量(24,000)に基づいて、このプールしたカラム溶離物内の全トリプシンタンパク質の濃度は、225μMと算出された。
【0147】
このプールしたカラム溶離物内のトリプシン活性部位の濃度は、Case & Shaw, Biochem. Biophys. Res. Commun. 29, 508(1967) に記載され、その全体を引用して本明細書中に編入する方法によりp−ニトロフェニルグアニジノベンゾアートを活性部位滴定剤として使用して決定された。このアッセイは、pH8.3において、50mMホウ酸ナトリウム(pH8.3)700μl、10mMリン酸ナトリウム/1%グリシン(pH7.0)200μlおよびp−ニトロフェニルグアニジノベンゾアート(ジメチルホルムアミド内に溶解)10μlも含むアッセイ混合物内にプールしたトリプシンカラム溶離物の少量(100μl)を希釈して行った。この混合組成物の最終pHは8.3と測定された。このアッセイ中で形成されたp−ニトロフェノールのトリプシン−依存性量は、410nmで測定した。410nmおよびpH8.3におけるp−ニトロフェノールに対する吸光係数(16,595M-1)に基づいて、1.01mlアッセイ中に存在したこのプールしたトリプシンカラム溶離物100μlは、キュベット中に存在した22.95μMトリプシン活性部位の濃度に一致した。従って、プールしたトリプシンカラム溶離物の初期原溶液は、231μMトリプシン活性部位を含んでいた。後者の値は、存在する全トリプシンタンパク質の濃度(225μM)に、実験誤差の範囲内で一致する。これらの結果は、トリプシンが低pHに調整できそして次いでその活性部位の再活性化を伴って高pH環境に転移できることを示している。
【表12】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、色素原性基質S2251を用いて測定したプラスミン活性のpH依存性を示す。
【図2】 図2は、カゼイン溶解アッセイにより測定した酸性化水(pH3.7)中のプラスミン安定性を示す。
【図3】 図3は、PBS中のプラスミンによる繊維素血栓溶解を示す。
【図4】 図4は、血栓溶解におけるプラスミンまたはtPAとプラスミノーゲンとの有効性を示す。
【図5】 図5は、活性プラスミンの血栓溶解効力を示す。
【図6】 図6は、プラスミン−誘導血栓溶解に対する血漿阻害因子の効果を示す。
【図7】 図7は、60分における血流回復、ならびに第8因子およびフィブリノーゲン消費に対するtPAまたはLys−プラスミンの局所投与を比較する。
【図8】 図8は、90分における血流回復、ならびに60分における第8因子およびフィブリノーゲン消費に対するtPAまたはLys−プラスミンの局所投与を比較する。
【図9】 図9は、表皮出血時間に対するtPAとプラスミンとの局所投与の効果を示す。
【図10】 図10は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンまたはミニ−プラスミンの等モルを用いる収縮血液クロットの溶解を示す。
【図11】 図11は、60分における血栓溶解、ならびに第8因子およびフィブリノーゲン消費に対するtPAおよびプラスミンの局所投与を比較する。
【図12】 図12は、90分における血栓溶解、ならびに60分における第8因子およびフィブリノーゲン消費に対するtPAおよびプラスミンの局所投与を比較する。
【図13】 図13は、tPAに対するプラスミンのリスク/利益評価を示す。
【図14】 図14は、2.2、3.5または3.7のpHにおけるプラスミン組成の進行性分解を示す。
【図15】 図15は、pH2.2および3.8においてプラスミン中に生成した切断部位を示す。
【図16】 図16は、炭化水素安定化剤を用いた3.7のpHにおける可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの37℃での安定性を示す。
【図17】 図17は、安定化剤としてグルコサミン、ナイアシンアミド、チアミンまたはシトルリンを用いたpH3.7における可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの37℃における安定性を示す。
【図18】 図18は、ヒト血清を用いる、種々の低緩衝能力緩衝液を含むプラスミン溶液の滴定を示す。
Claims (31)
- 可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの治療的投与量を含んでなる、ヒトまたは動物における血栓閉塞を治療するための医薬組成物であって、該組成物が、ヒトまたは動物に非経口投与され、投与前に中和されることなく血栓閉塞内または近傍に送達される、上記組成物。
- プラスミノーゲン活性化因子のあらゆる機能的痕跡を含まない、請求項1記載の医薬組成物。
- 血栓閉塞が、冠動脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢血栓症、塞栓性血栓症、肝臓静脈血栓症、衰弱性血栓症、静脈洞血栓症、静脈血栓症、動脈血栓症、閉塞した動静脈シャント、または閉塞したカテーテル器具より選ばれる血管閉塞である、請求項1記載の医薬組成物。
- 薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなり、該薬剤的に許容できるキャリヤーが緩衝液である、請求項1記載の医薬組成物。
- 組成物が凍結乾燥されており、ヒトまたは動物への投与の前に該凍結乾燥された組成物に薬剤的に許容できるキャリヤーが加えられる、請求項1記載の医薬組成物。
- 可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが、Glu−プラスミン、Lys−プラスミン、ミニ−プラスミン、ミクロ−プラスミン、またはこれらの末端切断変種である、請求項4記載の医薬組成物。
- 抗血栓剤をさらに含んでなる、請求項4記載の医薬組成物。
- 薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーが、水および少なくとも1種の薬剤的に許容できる酸を含んでなる緩衝液であって、酸がカルボン酸、オリゴペプチド、アミノ酸より選ばれた有機酸、または無機酸であり、そして酸性化キャリヤーが4.0未満のpHを有する、請求項4記載の医薬組成物。
- 薬剤的に許容できる酸が、ギ酸、酢酸、クエン酸、グリシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパルギン酸、バリンおよびアラニンより選ばれ、そして酸性化キャリヤーが4.0未満のpHを有する、請求項8記載の医薬組成物。
- 薬剤的に許容できる酸が酢酸またはクエン酸である、請求項8記載の医薬組成物。
- 薬剤的に許容できる酸が酢酸である、請求項8記載の医薬組成物。
- 2.5と4.0との間のpHを有する、請求項1記載の医薬組成物。
- 3.0と4.0との間のpHを有する、請求項1記載の医薬組成物。
- 3.1と3.5との間のpHを有する、請求項1記載の医薬組成物。
- 可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが0.01mg/mlから50mg/mlまでの間の濃度範囲内にある、請求項4記載の医薬組成物。
- 可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが0.1mg/mlから10mg/mlまでの間の濃度範囲内にある、請求項4記載の医薬組成物。
- 酸が1mMから500mMまでの濃度範囲内にある、請求項8記載の医薬組成物。
- 酸が1mMと50mMとの間の濃度範囲内にある、請求項8記載の医薬組成物。
- 安定化剤をさらに含んでなる、請求項4記載の医薬組成物。
- 安定化剤が、グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、ラクトースまたはトレハロースより選ばれた薬剤的に許容できる炭水化物である、請求項19記載の医薬組成物。
- 炭水化物が0.2%(重量/体積)から20%(重量/体積)までの範囲内の濃度を有する、請求項20記載の医薬組成物。
- 炭水化物がグルコースでありそしてその濃度が20%である、請求項20記載の医薬組成物。
- 安定化剤が、グルコサミン、ナイアシンアミドおよびチアミンより選ばれる、請求項20記載の医薬組成物。
- 安定化剤が、0.01Mから0.1Mまでの範囲内の濃度を有する、請求項20記載の医薬組成物。
- 組成物の治療的投与量が、0.1mgプラスミン/kg(体重)と10.0mgプラスミン/kg(体重)との間の範囲内にある、請求項1記載の医薬組成物。
- 組成物の治療的投与量が、0.2mgプラスミン/kg(体重)と4.0mgプラスミン/kg(体重)との間の範囲内にある、請求項1記載の医薬組成物。
- 組成物の治療的投与量が、1.0mgプラスミン/kg(体重)と2.0mgプラスミン/kg(体重)との間の範囲内にある、請求項1記載の医薬組成物。
- 組成物がカテーテル器具により投与される、請求項1記載の医薬組成物。
- 血管内カテーテルが血管閉塞に向けられる、請求項28記載の医薬組成物。
- 血管内カテーテルが、組成物を血栓閉塞の近傍またはその中に送達する、請求項29記載の医薬組成物。
- 血管内カテーテルが、血栓閉塞に入りそしてカテーテルが、組成物を血栓閉塞の中に直接送達する、請求項29記載の医薬組成物。
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