KR20140015289A - 플라스미노겐 및 플라스민 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 플라스민의 프로테아제 활성의 자가 촉매적 파괴를 감소 또는 방지하는 점 돌연변이를 촉매 도메인 내에 하나 이상 포함하는 플라스민 및 플라스미노겐의 변이체에 관한 것이다. 또한 이와 같은 플라스미노겐 및 플라스민의 변이체를 사용하는 조성물, 이 변이체의 사용 용도 및 이를 사용하는 방법이 개시되어 있다.
Description
본 발명은 플라스민의 프로테아제 활성의 자가 촉매적 파괴를 감소 또는 방지하는 점 돌연변이를 하나 이상 촉매 도메인 내에 포함하는 플라스민 및 플라스미노겐의 변이체에 관한 것이다. 또한 상기 플라스미노겐 및 플라스민의 변이체를 사용하는 조성물, 이 변이체의 사용 용도 및 이를 사용하는 방법이 개시되어 있다.
자이모겐 플라스미노겐의 활성화는 섬유소 용해/혈전 용해 활성 세린 프로테이나제 플라스민의 형성을 가져온다. 내인성 플라스미노겐의 활성화는 플라스미노겐 활성 인자, 예를 들어 유로키나제, 스트렙토키나제, 스타필로키나제 또는 tPA, 또는 이것들의 임의의 변이체의 투여에 의하여 촉발 또는 증강시킬 수 있다. 이 내인성 플라스미노겐이 활성화되면, 플라스미노겐 단백질은 5개의 크링글 도메인을 포함하는 중쇄와, 촉매 도메인을 포함하는 경쇄로 단백 분해된다. 상기 중쇄 및 경쇄는 2개의 이황화 결합을 통해 결합된다. 활성화 후, 자가 분해 절단은 중쇄로부터 N-말단 분절(사람 플라스민의 경우에는 78개 아미노산, 그리고 소 플라스민의 경우에는 77개 아미노산)을 제거하고, 소 플라스민 중쇄는 또한 3개 내지 4개의 크링글 도메인으로 추가로 자가 촉매 분해될 수 있으며, 그 결과 소의 미디플라스민(midiplasmin)이 생성된다(Christensen et al. 1995, Biochem J 305, 97-102). 사람의 플라스미노겐 내 R561-V562 펩티드 결합의 절단에 의해 촉발되는 플라스미노겐의 플라스민으로의 활성화는, 경쇄 내에서 커다란 형태상의 변화를 유도하는데, 상기 변화는 상기 경쇄 내부의 촉매 3원체를 프라이밍 또는 활성화한다. 박테리아 플라스미노겐 활성 인자, 예를 들어 스트렙토키나제 및 스타필로키나제는 플라스미노겐과 복합체를 형성하며, 이 경우 플라스미노겐의 R561-V562 펩티드 결합의 절단없이 플라스미노겐의 촉매 위치는 활성 인자-플라스미노겐의 복합체 형성시 형태상의 변화로 인하여 활성화된다(플라스미노겐 활성화 기작은 예를 들어 문헌[Terzyan et al. 2004; Proteins 56: 277-284]의 도입부에 요약되어 있음).
플라스미노겐 활성 인자는 간접적으로 혈전 용해제로서 작용을 하는 반면에, 플라스민 자체를 직접적으로 섬유소 용해제/혈전 용해제로서 이용할 것이 대안으로 제시되고 있다. 그러나, 이와 같은 직접적인 이용은 플라스민이 다수의 프로테아제와 같이, 생성물 억제에 영향을 받는 2차 동력학을 따르는 자가 촉매 단백 분해 과정에 영향을 받는다는 사실에 의해 방해가 된다(Jespersen et al. 1986, Thrombosis Research 41, 395-404).
1960년대 초에는, 아미노산, 예를 들어 리신이 존재한다는 조건 하에 플라스민이 산성 pH 또는 대안적으로 중성 pH에서 안정화될 수 있는 것이 수립되어 있었다. 그럼에도 불구하고, 플라스민이 pH 3.8에서 보관될 때 조차도 Lys104, Arg189 및 Lys622(Lys-플라스민을 기준으로 번호를 매김) 뒤의 자가 분해 절단이 보고되어 있다(WO 01/36608호). 플라스민이 pH 2.2라는 훨씬 낮은 pH에서 보관될 때, Asp62, Asp154 및 Asp346 위치의 Asp-Pro(D-P) 사이에서 비 자가 분해 산 절단이 일어난다(WO 01/36608호). 이는 겉으로 확인되는 자가 촉매 분해가 더 이상 일어나지 않지만, 산 가수 분해가 불안정의 요인이 되는 지점까지 pH가 낮아질 수 있음을 설명한다. WO 01/36608호에는 플라스민 내 어느 펩티드 결합이 중성 pH에서 (자가 촉매) 가수 분해에 쉽게 영향을 받는지에 관한 어떠한 정보도 없다. 알려진 플라스민 안정화제로는 Jespersen et al.(1986, Thromb Res 41, 395-404)에 의하여 개시된 바와 같이 이온 세기가 충분히 높은 글리세롤, 피브리노겐 및 ε-아미노카프론산(EACA)을 포함한다. 리신과 리신 유도체(예를 들어, EACA 및 트라넥삼산) 및 p-아미노메틸벤조산(PAMBA)은 일부 더 알려진 안정화제이다(Uehsima et al. 1996, Clin Chim Acta 245, 7-18; Verstraete 1985, Drugs 29, 236-261). US 제4,462,980호는 산성 조건에서의 보관에도 불구하고 플라스민 분해를 초래하는 플라스민 응집체의 형성을 보고하였다. 이러한 문제에 대한 해결책은 폴리히드록시 화합물을 첨가하는 것에 의하여 US 제4,462,980호에 제공되어 있다. 플라스민을 안정화하는 기타 다른 방법으로는 올리고펩티드 화합물을 첨가하는 것을 포함한다(예를 들어, US 제5,879,923호). 대안적으로, 플라스민의 촉매화 위치는 유도체화, 예를 들어 아실화(EP 제0009879호)에 의해 가역적으로 차단될 수 있다. 플라스민의 페그화도 또한 효소를 안정화하는 수단으로서 제안되어 왔다(WO 93/15189호).
플라스민의 절두형(truncated form) 이외에 다수의 플라스민 변이체가 기술되어 있으며, 그 예로서는 키메라 마이크로플라스민(WO 2004/045558호)과, 2개 사슬 절단 위치에서의 점 돌연변이를 가지는 변이체(US 제5,087,572호) 또는 촉매 3원체 아미노산에서의 점 돌연변이를 가지는 변이체(Mhashilkar et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90, 5374-5377; Wang et al., 2001, J Mol Biol 295, 903-914)를 포함한다. Wang et al.(1995, Protein Science 4, 1758-1767 및 1768-1779)은 545번, 548번, 550번, 555번, 556번, 558번, 560번 내지 564번, 585번, 740번 및 788번 아미노산 위치에서 돌연변이가 발생한 광범위한 마이크로플라스미노겐 돌연변이체 시리즈를 보고하였다. 558번 및 566번 아미노산 위치에서 세린이 시스테인으로 치환된 이중 돌연변이체는 Linde et al.(1998, Eur J Biochem 251, 472-479)에 의해 보고되었다. Takeda-Shitaka et al.(1999, Chem Pharm Bull 47, 322-328)은 활성이 감소한 플라스민 변이체를 언급하는데, 이 변이체는 601번 아미노산 위치에서 알라닌이 트레오닌으로 치환되어 있다. 상기 언급된 아미노산 위치는 모두 1번 아미노산 위치에서 Glu로 시작하는 Glu-플라스미노겐을 기준으로 한다. 절단될 수 없는 플라스미노겐 변이체(손상된 중쇄 및 경쇄 사이에서의 절단)가 WO 91/08297호에 기술되어 있다. Dawson et al.(1994, Biochemistry 33, 12042-12047)은 719번 위치에서 Arg 대신 Glu가 있는 Glu-플라스미노겐 변이체(R719E)의 스트렙토키나제에 대한 감소된 친화도를 기술한다. Jespers et al.(1998, Biochemistry 37, 6380-6386)은 Ala-스캔에서 일련의 파지 전시된 마이크로플라스미노겐 단일 위치 돌연변이체인 H569A, R610A, K615A, D660A, Y672A, R712A, R719A, T782A, R789A를 생산하였고, 719번 위치에서 아르기닌이 스타필로키나제와의 상호 작용에 중요한 역할을 함을 알아내었으며; D660A 돌연변이체는 매우 낮은 발현으로 인하여 더 이상 특성화하지 않았고; 단지 R719A 돌연변이체만을 추가적으로 가용성 형태로 생산하였다. 돌연변이체 중 어느 것도 단백 분해 활성에서 총체적인 변화를 나타내지 않았다(기질 S-2403). Jespers et al.(1998)은 또한 분석에서 활성 위치 돌연변이체 S741A를 포함하였고; 이 돌연변이체의 결정 구조는 Wang et al.(2000, J Mol Biol 295, 903-914)에 개시되어 있다. 스트렙토키나제/플라스미노겐 상호 작용 위치를 규명하기 위한 또 다른 시도에서, Terzyan et al.(2004, Proteins 56, 277-284)은 이미 돌연변이된 바탕 돌연변이체(background)(R561A)에서 다수의 마이크로플라스미노겐 돌연변이체(K698M, D740N, S741A)를 보고하였으며, 이미 돌연변이된 바탕 돌연변이체는 플라스미노겐의 단백 분해 활성화를 억제하여, (스트렙토키나제-마이크로플라스미노겐 복합체의 접촉-활성화 기작의 연구를 복잡하게 만들) 활성 마이크로플라스민의 형성을 억제한다. Terzyan et al.(2004)은 또한 이중 돌연변이체 R561A/K698M과 기능상 확연히 차이가 나지 않는 “우발성(inadvertent)” 삼중 돌연변이체인 R561A/H569Y/K698M을 언급한다. 스트렙토키나제/플라스민(플라스미노겐)의 상호 작용의 연구에서 있어서, Wang et al.(2000, Eur J Biochem 267, 3994-4001)은 Cys536Ala 및 Cys541Ser 바탕 돌연변이체에서 한 세트의 마이크로플라스미노겐(Glu-플라스미노겐의 530번 내지 791번 아미노산) 돌연변이체를 생산하였다. 이들 돌연변이체로는 상기 기술한 바와 같은 R561A 돌연변이체(Terzyan et al.(2004))뿐만 아니라, R561A/K698G, R561A/K698A 및 R561A/K698Q 이중 돌연변이체를 포함한다. 동일한 C536A/C541S 바탕 돌연변이체에서, 단일 K698G 및 K698A 돌연변이를 또한 도입하였고, 이 단일 돌연변이 중 K698G는 정제에서의 어려움으로 인하여 더 이상 특성화하지 않았다. 상기 연구는 플라스미노겐/플라스민 분자의 특성의 보다 나은 이해를 획득하는 것을 목표로 하는 것이었고, 플라스미노겐/플라스민 돌연변이체의 임의의 임상학적 유용성이나 유익성, 또는 추정 임상학적 이점은 보고하지 않았다. Peisach et al.(1999, Biochemistry 38, 11180-11188)은 M585Q, V673M 및 M788L 돌연변이를 포함하는 마이크로플라스미노겐의 결정 구조를 결정하는데 성공하였다.
Nguyen & Chrambach(1981, Preparative Biochem 11, 159-172)는 유로키나제 활성화 플라스민(호모리신)의 산업용 미정제 제조물의 환원 SDS-PAGE에 기초하여, 10.0kDa의“부수적이고 미확인된 단백질 성분”의 존재를 보고하였다. pH에 의존적인 사람 플라스민의 자가 분해에서의 차이점은 Shi & Wu(1988, Thrombosis Research 51, 355-364)에 상세히 기술되어 있다. Ohyama et al.(2004, Eur J Biochem 271, 809-820)은 (플라스미노겐 활성화제인 유로키나제의 존재 하에) 안지오스타틴의 형성을 증강시키는 이와 같은 화합물에 의하여 플라스민의 자가 단백 분해가 증강되므로, 암 치료에 리신 이외의(non-lysine) 유사체 플라스미노겐 조정제의 사용을 제안하였다. Ohyama et al.(2004)의 표 3은 자가 단백 분해 증강 화합물에 영향 받기 쉬운 플라스민 내 15개만큼의 절단 위치를 나열한다. 이전의 연구를 고려하여 관찰 결과를 논의 함에 있어서, 자가 단백 분해 증강 화합물은 다소 B/경쇄의 단백 분해를 선택적으로 증강시킬 것으로 보일 것이지만, 반면에 자가 단백 분해 증강 화합물이 존재하지 않을 때에는 A/중쇄 및 B-사슬 둘 다의 최소한의 분해가 발견되었다.
상기 방법/변이체 그 어떤 것도 분자 수준에서 안정화된 플라스민을 제공함에 따르는 문제점을 해결하지 못한다는 것은 분명하다. 자가 촉매화 분해에 대하여 본질적으로 저항성인 촉매 도메인을 가지는 플라스민 변이체(또는 플라스민이 유도될 수 있는 해당 플라스미노겐 변이체)의 제공은 플라스민의 효율적이고 안전한 장기간 보관에 있어서뿐만 아니라, 혈전 용해 치료법 또는 안구 내 후유리체 박리 또는 유리체 액화의 유도에서와 같은 플라스민의 효율적이고 안전한 치료 용도에 대하여 상당한 진보일 것이다.
본 발명은 분리된 플라스미노겐 변이체 또는 이로부터 얻어진 플라스민, 또는 분리된 플라스민 변이체, 또는 상기 플라스민들 중 임의의 것의 단백 분해 활성 또는 가역적 불활성 유도체로서, 다음과 같은 특징들을 가지는 것에 관한 것이다:
(i) 자체의 촉매 도메인 내 P 위치에 리신 또는 아르기닌을, 그리고 [P+/-n](여기서, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임) 위치에 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 포함함(여기서, [P+/-n] 위치의 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아님); 및
(ii) 상기 (i)의 돌연변이는 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 정도에 비하여 상기 플라스민 변이체의 자가 단백 분해 정도를 감소시킴(상기 감소는 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정됨).
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같이 자체의 촉매 도메인 내 다음과 같은 위치에서 2개 이상의 내부 아미노산의 돌연변이를 포함하는 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체에 관한 것으로서,
- [P+/-n] 및 [P+/-n'] 위치(여기서, n 및 n'는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; [P+/-n] 위치 및 [P+/-n'] 위치에서 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아니며; n 및 n'가 둘 다 P에 더하여지거나 P로부터 차감되면, n 및 n'는 서로 상이함); 또는
- [P+/-n] 및 [P'+/-n] 위치(여기서, P'는 P와 P'의 더 큰 값이고; P' 위치에서 아미노산은 리신 또는 아르기닌이며; n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; [P'+/-n] 위치에서 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아니며; [P+n] 및 [P'-n] 간 중첩 위치들이 존재한다면, 이 중첩 위치들은 배제됨);
여기서, 상기 2개 이상의 내부 아미노산 돌연변이는 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 정도에 비하여 상기 플라스민 변이체의 자가 단백 분해 정도를 감소시킨다(상기 감소는 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정될 수 있음).
상기 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것은 촉매 도메인의 리신 또는 아르기닌 아미노산 중 임의의 하나 이상의 돌연변이(P 및 P' 위치 중 임의의 위치에서 리신 또는 아르기닌 아미노산이 리신 이외의 아미노산 또는 아르기닌 이외의 아미노산으로의 돌연변이)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 플라스미노겐, 플라스민 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것에서, P 또는 P' 위치에서 상기 내부 아미노산은 특히 다음과 같은 것들로부터 선택될 수 있으며,
(i) 사람 플라스민 촉매 도메인의 137번 위치에 있는 리신, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 리신 또는 아르기닌;
(ii) 사람 플라스민 촉매 도메인의 147번 위치에 있는 리신, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 리신 또는 아르기닌; 또는
(iii) 사람 플라스민 촉매 도메인의 158번 위치에 있는 아르기닌, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 아르기닌 또는 리신;
여기서, 상기 사람 플라스민 촉매 도메인은 1번 위치에서 발린 아미노산으로 시작하는데, 상기 발린 아미노산은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린 아미노산과 동일하다.
특히, 본 발명에 의한 플라스미노겐, 플라스민 또는 플라스민 유도체에 있어서, 상기 [P+/-n] 위치에 있는 아미노산은 사람 플라스민 촉매 도메인의 138번 위치에 있는 글루타메이트 아미노산이거나, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 아미노산 잔기이다.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것은 자체의 자가 분해 상수(autolysis constant)가 야생형 플라스민의 자가 분해 상수의 95% 이하인 것을 추가의 특징으로 할 수 있다. 이러한 특징은 또한 상응하는 야생형 플라스미노겐 또는 플라스민의 자가 단백 분해에 비하여 상기 기술된 바와 같이 플라스미노겐 변이체 또는 플라스민 변이체의 자가 단백 분해 감소의 정의로서 사용될 수도 있다.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것은 촉매 상수 kcat가 야생형 플라스민 kcat의 10% 내지 200%의 범위인 것을 추가의 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것은 자체의 자가 분해 상수가 야생형 플라스민 자가 분해 상수의 95% 이하이며, 이의 촉매 상수 kcat는 야생형 플라스민 kcat의 10% 내지 200%의 범위인 것을 추가의 특징으로 할 수 있다.
어떠한 제한도 포함하지 않았을 때, 본 발명에 의한 상기 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것은 Glu-플라스미노겐이나 Glu-플라스민, Lys-플라스미노겐이나 Lys-플라스민, 미디플라스미노겐이나 미디플라스민, 미니플라스미노겐이나 미니플라스민, 마이크로플라스미노겐이나 마이크로플라스민, 델타플라스미노겐이나 델타플라스민 중 하나일 수 있다.
본 발명은 또한 의약품으로서 사용할 상기 기술된 바와 같은 분리된 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체, 또는 이것들의 임의의 조합체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 분리된 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체, 또는 플라스민 유도체, 또는 이것들의 임의의 조합체, 그리고 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 애쥬반트 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이와 같은 조성물은 선택적으로 항응집제, 혈전 용해제, 소염제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 항혈관형성제, 항유사분열제, 항히스타민제 또는 마취제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 분리된 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체의 임의의 유리한 용도를 포함한다. 어떠한 제한도 포함하지 않을 때, 상기 용도로서는 개체 내 병리학적 피브린 침착물 분해의 유도 또는 촉진, 안구 내 후유리체 박리 현상 유도 및/또는 안구 내 유리체 액화 유도용, 개체의 안구 내 외과 유리체 절제술 촉진, 개체의 손상된 조직의 효소적 괴사 조직 제거, 개체 내 순환형 피브리노겐 감소, 개체 내 α2-항플라스민 수준 감소 및 병리학적 피브린 침착 위험 감소를 포함한다.
본 발명은 또한 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(i) [P+/-n] 위치에 있는 아미노산을 돌연변이시키는 단계(여기서, P 위치에 있는 아미노산은 아르기닌 또는 리신이고, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임);
(ii) (i)로부터 얻어진 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을 측정하는 단계로서, 예를 들어 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정되는 단계;
(iii) (ii)에서 측정된 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을, 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 안정성과 비교하는 단계; 및
(iv) 자가 단백 분해에 안정적인 변이체로서 (iii)으로부터 야생형 플라스민보다 자가 단백 분해에 더 안정적인 돌연변이체를 선별하는 단계;
를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 바람직하게 [P+/-n] 위치에 있는 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아니다.
자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체를 스크리닝하는 대안적 방법에 있어서, 상기 방법은
(i) 사람 플라스민 촉매 도메인의 138번 위치에 있는 글루타메이트 아미노산, 또는 이에 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 아미노산 잔기를, 천연 아미노산과 상이한 아미노산으로 돌연변이시키는 단계;
(ii) (i)로부터 얻어진 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을 측정하는 단계로서, 예를 들어 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정되는 단계; 및
(iii) 자가 단백 분해에 안정적인 변이체로서 (ii)로부터 자가 단백 분해에 안정적인 돌연변이체를 선별하는 단계;
를 포함하며, 여기서 상기 사람 플라스민 촉매 도메인은 1번 위치에서 발린 아미노산으로 시작하는데, 상기 발린 아미노산은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린 아미노산과 동일하다.
상기 스크리닝 방법 중 임의의 방법은 임의로 자가 단백 분해 안정 플라스민 변이체의 단백 분해 활성을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 플라스민 포함 조성물의 장기간 보관 안정성을 증진시키는 방법을 추가로 포함하는데, 상기 방법은 단백 분해 활성의 상당한 손실없이 장기간에 걸쳐서 보관될 수 있는, 자가 단백 분해 안정 플라스민 변이체를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체를 생산하는 방법을 추가로 포함하는데, 상기 방법은
(i) 본 발명에 의한 플라스미노겐을 발현할 수 있는 적당한 숙주 세포 내에 상기 플라스미노겐을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계;
(ii) 상기 숙주 세포 내에서 상기 플라스미노겐 발현에 충분한 시간 동안 및 이에 충분한 조건 하에 (i)에서 얻어진 숙주 세포를 생육하는 단계; 및
(iii) (ii)에서 발현된 플라스미노겐을 수확하는 단계;
를 포함한다.
이와 같은 방법은 임의로 (iii)에서 수확한 플라스미노겐을 정제하는 단계 (iv)를 추가로 포함할 수 있다.
이처럼 본 발명은 본 발명에 의한 플라스민 변이체를 생산하는 방법을 포함하며, 상기 방법은
(i) 본 발명에 의한 플라스미노겐을 발현할 수 있는 적당한 숙주 세포 내에 상기 플라스미노겐을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계;
(ii) 상기 숙주 세포 내에서 상기 플라스미노겐 발현에 충분한 시간 동안 및 이에 충분한 조건 하에서 (i)에서 얻어진 숙주 세포를 생육하는 단계;
(iii) (ii)에서 발현된 플라스미노겐을 수확하는 단계;
(iv) (iii)의 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화하는 단계;
를 포함한다.
이와 같은 방법은 임의로 (iv)에서 활성화하기 이전에, (iii)에서 수확된 플라스미노겐을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 의한 플라스민 변이체를 생산하는 임의의 방법에 있어서, (iv)에서 얻어진 활성 플라스민은 임의로 정제될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 의해 생산된 활성 플라스민 변이체는 임의로 유도체화되고/유도체화되거나 가역적으로.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것은 우선적으로 (예를 들어, 파지 전시에 있어서) 유리된 형태 또는 가용성 형태(예를 들어, 숙주의 표면에 부착되지 않은 형태)로 얻어진다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체 또는 플라스민 변이체를 암호화하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 이와 같은 핵산을 포함하는 재조합 벡터는 또한, 이와 같은 핵산 또는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포와 같이, 본 발명의 일부이다.
도 1은 야생형 사람 Glu-플라스미노겐의 아미노산 위치(1번 내지 791번)와 플라스민 촉매 도메인의 아미노산 위치(1번 내지 230번, 아미노산 서열과 번호는 굵은 글씨로 표시함)에 이중으로 번호를 매긴 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명을 입증하는데 사용된 마이크로플라스미노겐은 543번(번호는 Glu-플라스미노겐을 기준으로 매김) 아미노산 위치에서 시작한다. 크링글(Kringle) 도메인(GenBank 수탁 번호 AAA36451에 포함된 정보로부터 도출함)은 박스 안에 표시되어 있으며, 이 도메인의 아미노산 서열은 일반적인 문자체와 이탤릭체를 번갈아서 타이핑하여 표시되어 있다. 촉매 3원체 아미노산은 원 안에 표시되어 있다.
도 2는 GenBank로부터 입수된 포유동물 플라스미노겐 단백질의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 서열 배열은 디폴트 값이 세팅된 미국 국립 생물 정보 센터(NCBI) 웹사이트를 통해 입수할 수 있는 코발트(COBALT) 소프트웨어(Constraint-based Multiple Alignment Tool; Papadopoulos & Agarwala, Bioinformatics 23:1073-79, 2007)를 이용하여 실행하였다. ▼는 Glu-플라스미노겐의 시작을 나타낸다. 아미노산의 번호 매김은 사람의 플라스미노겐을 기준으로 한다.
도 3은 예시적인 마이크로플라스민 변이체 E138Q의 환원 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 좌측 레인: 분자량을 표시하는 분자량 사다리(molecular weight ladder). 레인 1: 활성화 이전의 마이크로플라스미노겐 E138Q. 레인 2: 레인 1의 물질과 동일하지만, 활성화 이후의 것인 마이크로플라스민 E138Q. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다.
도 2는 GenBank로부터 입수된 포유동물 플라스미노겐 단백질의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 서열 배열은 디폴트 값이 세팅된 미국 국립 생물 정보 센터(NCBI) 웹사이트를 통해 입수할 수 있는 코발트(COBALT) 소프트웨어(Constraint-based Multiple Alignment Tool; Papadopoulos & Agarwala, Bioinformatics 23:1073-79, 2007)를 이용하여 실행하였다. ▼는 Glu-플라스미노겐의 시작을 나타낸다. 아미노산의 번호 매김은 사람의 플라스미노겐을 기준으로 한다.
도 3은 예시적인 마이크로플라스민 변이체 E138Q의 환원 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 좌측 레인: 분자량을 표시하는 분자량 사다리(molecular weight ladder). 레인 1: 활성화 이전의 마이크로플라스미노겐 E138Q. 레인 2: 레인 1의 물질과 동일하지만, 활성화 이후의 것인 마이크로플라스민 E138Q. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다.
본 발명은 중성 pH에서 플라스민의 단백 분해 활성의 비강제적 자가 불활성화의 기초가 되는 기작의 연구 결과, 즉 본 발명자가 주로 플라스민의 촉매 도메인으로 이루어진 마이크로플라스민에 중점을 두기로 선택한 연구 결과를 바탕으로 한다. 플라스민에 의한 절단에 감수성인 펩티드 결합은 리신이나 아르기닌의 C-말단에 위치한다(Weinstein & Doolittle, 1972, Biochim Biophys Acta 258, 577-590). 플라스민 촉매 도메인(사람의 Glu-플라스미노겐 중 562번 위치의 아미노산인 발린에서 시작함)의 아미노산 중 거의 10%(230개 중 22개)는 리신 또는 아르기닌이다. 이론상으로 하나의 플라스민 분자 중 이들 리신 또는 아르기닌의 아미노산 C 말단의 구조와 상관 없이, 상기 리신 및 아르기닌의 모든 펩티드 결합 C-말단은 다른 플라스민 분자에 의해 단백 분해 절단될 수 있다. 또한 이론상으로, 이러한 리신 또는 아르기닌 중 임의의 것 하나 이상의, 리신 이외의 아미노산 또는 아르기닌 이외의 아미노산으로의 돌연변이는 플라스민 분자를 자가 단백 분해에 대하여 저항성이 되도록 만들 것이다. 이러한 이론은, 국제 특허 출원 PCT/EP2010/059902호(WO 2011/004011호)에 기술된 바와 같이, 맞는 것으로 판명되었다. 본 발명은, 플라스민 촉매 도메인 내 리신 또는 아르기닌을 반드시 돌연변이시키지 않고도 상기 리신 또는 아르기닌에 인접하는 야생형 아미노산을 야생형이 아닌 아미노산으로 돌연변이시키는 것은 자가 단백 분해에 대한 생성되는 돌연변이 플라스민의 저항성을 또한 상당히 증가시킨다는 예상치 못한 관찰 결과를 기초로 한다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면은 플라스민 분자 및 플라스미노겐 분자, 특히 플라스민으로 활성화될 수 있는/잠재적으로 활성화 가능한 플라스미노겐 분자에 관한 것이며, 상기 분자들은 자체의 촉매 도메인 내에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하므로, 야생형 플라스민 또는 플라스미노겐 내에서 일어나는 자가 단백 분해에 영향을 받기 쉬운 펩티드 결합은 본 발명의 플라스민 및 플라스미노겐 분자 개체 내 자가 단백 분해에 거의 영향을 받지 않거나 아예 영향을 받지 않게 된다.
다시 말해서, 본 발명은 분리된 플라스미노겐 변이체 또는 이로부터 얻어진 플라스민, 또는 분리된 플라스민 변이체, 또는 상기 플라스민들 중 임의의 것의 단백 분해 활성 또는 가역적 불활성 유도체로서, 다음과 같은 특징들을 가지는 것에 관한 것이다:
(i) 자체의 촉매 도메인 내 P 위치에 리신 또는 아르기닌을, 그리고 [P+n] 또는 [P-n](추가로 [P+/-n]으로서 주석이 달림) 위치에서 하나 이상의 아미노산의, 야생형이 아닌 아미노산(또는 천연 아미노산 또는 천연 생성 아미노산과 상이한 아미노산)으로의 돌연변이를 포함함(여기서, n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 위치 [P+/-n]에서 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아님); 및
(ii) (i)의 돌연변이(의 존재)는 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 정도에 비하여 상기 플라스민 변이체의 자가 단백 분해 정도(또는 자가 단백 분해에 대한 감수성, 또는 민감성, 또는 취약성)를 감소시킴(상기 감소는, 예를 들어 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정될 수 있음)(이하 참조).
따라서 본 발명의 목적은 분리된 플라스민 변이체(예를 들어, 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 것), 또는 상기 플라스민들 중 임의의 것의 단백 분해 활성 또는 가역적 불활성 유도체를 제공하는 것이며, 이는 상기 플라스민 변이체 또는 이의 유도체가 야생형 플라스민에 비하여 자가 단백 분해에 대해 더 큰 저항성을 가지는/저항성이 더 큰 것을 특징으로 한다. 자가 단백 분해 저항성/민감성의 측정과 관련하여 몇 가지 고려되는 사항들은 이하에 추가로 기술되어 있다.
소정 위치에서 아미노산의 “야생형이 아닌 아미노산” 또는 “천연 아미노산과 상이한 아미노산”으로의 돌연변이는, 야생형 플라스미노겐 또는 플라스민의 상기 소정 위치에서 아미노산이, 상기 소정 위치에서 상기 야생형 플라스미노겐 또는 플라스민이 야생형 또는 천연 아미노산과 상이한 임의의 아미노산으로 바뀌는 것인 것으로 간주된다. 돌연변이의 선택에 관한 몇 가지 고려 사항들은 이하에 추가로 기술되어 있다.
특히, 상기 P 위치에서 내부 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다. (달리 언급되지 않는 한) 본원에 사용된 기준으로서, 플라스민의 촉매 도메인(문헌에서 “경쇄” 또는 “B 사슬”이라 칭하여지기도 함)은 사람의 플라스민을 기준으로 하여 번호가 매겨질 것이며, 상기 촉매 도메인은 P=1인 위치에서 발린으로 시작하는데, 상기 발린은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린과 동일하다(도 1 참조). 본원에서는 플라스민 촉매 도메인 내 2개의 상이한 아미노산 위치도 참조될 수 있으며, 이후 상기 2개의 아미노산 위치는 각각 [P+/-n](P 위치에서 리신 또는 아르기닌 포함) 및 [P'+/-n](P' 위치에서 리신 또는 아르기닌 포함)라 칭하여진다. 명확함을 위하여, P, P', [P+/-n], [P'+/-n] 위치 등은 정수이다. [P+n], [P'+n] 위치 등은 n의 값에 따라서 증가되는(n은 1, 2, 3, 4 또는 5임) P, P' 등의 정수 값을 가지고; [P-n], [P'-n] 위치 등은 n의 값에 따라서 감소되는(n은 1, 2, 3, 4 또는 5임) P, P' 등의 정수 값을 가지며; [P+/-n], [P'+/-n] 위치 등은 n의 값에 따라서 증가하거나(+) 감소하는(-)(n은 1, 2, 3, 4 또는 5임) P, P' 등의 정수 값을 가진다. 따라서, 예를 들어 만일 [P+1]이 20이면, P는 19이고 [P-2]는 17이거나; 또는, 예를 들어 만일 P'가 49이면, [P'-5]는 44이고 [P'+3]은 52이다. 플라스민 촉매 도메인 내 2개의 상이한 아미노산 위치는 또한, 예를 들어 [P+/-n] 및 [P+/-n']로 정의될 수도 있는데, 여기서 n과 n'는 둘 다 1, 2, 3, 4 또는 5의 값을 가지고; n과 n'는, 이 n과 n'가 둘 다 더하여지거나(+) 차감되는(-) 경우 서로 상이하다. n과 n'가 둘 다 더하여지거나 차감되는 경우, 만일 P가, 예를 들어 19이고, n 및 n'가 둘 다 더하여지면(예를 들어, n=1이고, n'=3이면), [P+n]은 20이고, [P+n']는 22이다. 또는, 만일 n이 차감되어야 하고, n'가 더하여져야 한다면(예를 들어, n=n'=1이면), [P-n]은 18이고, [P+n']는 20이다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같이 자체의 촉매 도메인 내 다음과 같은 위치에서 2개 이상의 내부 아미노산의, 야생형이 아닌 아미노산(또는 천연 아미노산과 상이한 아미노산 또는 천연 생성 아미노산과 상이한 아미노산)으로의 돌연변이를 포함하는 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체에 관한 것이며,
- [P+/-n] 및 [P+/-n'] 위치(여기서, n 및 n'는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; [P+/-n] 위치 및 [P+/-n'] 위치에서 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아니며; n 및 n'가 둘 다 P에 더하여지거나 P로부터 차감되면, n 및 n'는 서로 상이함); 또는
- [P+/-n] 및 [P'+/-n] 위치(여기서, P'는 P와 P'의 더 큰 값이고; P' 위치에서 아미노산은 리신 또는 아르기닌이며; n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; [P'+/-n] 위치에서 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아니며; [P+n] 및 [P'-n] 간 중첩 위치들이 존재한다면, 이 중첩 위치들은 배제됨);
여기서, 상기 2개 이상의 내부 아미노산 돌연변이(의 존재)는 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 정도에 비하여 상기 플라스민 변이체의 자가 단백 분해 정도를 감소시킨다(상기 감소는 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정될 수 있음).
대안적으로, 따라서 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체는 자체의 촉매 도메인 내 임의의 위치, 예를 들어 P, P', P" 등의 위치 중 하나 이상에서, 임의의 리신 이외의 아미노산 또는 아르기닌 이외의 아미노산으로의 돌연변이를 포함할 수 있다.
당업자는, 야생형 아미노산이 돌연변이될 수 있는 기타 다른 아미노산을 용이하게 판단할 수 있을 것이다. 이와 같은 판단은 기준, 예를 들어 아미노산 크기, 아미노산 전하, 아미노산 극성 및/또는 아미노산 소수성 지수(hydropathy index)를 함축할 수도 있으나, 반드시 그렇게 할 필요가 있는 것은 아니다(표 1 참조). 뿐만 아니라, 플라스미노겐과 마이크로플라스민의 결정 구조(MMDB ID : 12717; PDB ID: 1DDJ; Wang et al., 2001, J Mol Biol 295, 903-914)의 이용 가능성은 돌연변이 아미노산의 확인을 돕는데 매우 중요한 가치를 가지며, 생성된 돌연변이 플라스민 또는 플라스미노겐 분자는 단백 분해 활성을 보유한다. 뿐만 아니라, 소정 위치 [P+/-n], 그리고 임의로는 P, P', P" 등의 소정 위치 중 하나 이상에서 야생형 아미노산의, 소정 군의 아미노산들 중 하나로의 돌연변이가, 유사한 결과를 가져올 것임을 예측할 수 있다. 표 1을 바탕으로 하였을 때, 상기 소정 군은 다음과 같이 정의될 수 있다:
- 소수성 지방족 아미노산: Met, Ile, Leu 및 Val
- 소수성 방향족 아미노산: Phe
- 친수성인 산성 아미노산: Asp, Glu, Asn 및 Gln
- 친수성인 염기성 아미노산: Arg, Lys 및 His
- 중간 정도로 소수성인 지방족 아미노산: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Pro
- 중간 정도로 소수성인 방향족 아미노산: Tyr 및 Trp.
돌연변이를 위해서 상기한 것들 중 Cys 및 Pro는 Cys에 의해 생성될 수 있는 유리 티올기가 형성되거나 Pro에 의해 단백질 구조에 더 광범위한 혼동(disturbance)이 발생함으로 인하여, 야생형 플라스민 또는 플라스미노겐 아미노산의 저 선호(less favorable) 치환 아미노산일 수 있다. 기타 다른 아미노산 치환은, [P+/-n] 위치, 그리고 임의로는 플라스민(플라스미노겐) 촉매 도메인의 P, P', P" 등의 위치 중 하나 이상에서 야생형 아미노산의, 비 천연 또는 비 표준 아미노산, 또는 아미노산 유사체, 예를 들어 노르루신, 노르발린, 오르니틴 또는 시트룰린으로의 돌연변이를 포함한다(더 광범위한 목록에 대해서는, 예를 들어 문헌[Hendrickson et al. 2004, Annu Rev Biochem 73, 147-176] 참조).
| 아미노산 | 측쇄 극성 |
측쇄
전하
( pH 7) |
소수성 지수 | ||
| 알라닌 | Ala | A | 무극성 | 중성 | 1.8 |
| 아르기닌 | Arg | R | 극성 | 양성 | -4.5 |
| 아스파라긴 | Asn | N | 극성 | 중성 | -3.5 |
| 아스파르트산 | Asp | D | 극성 | 음성 | -3.5 |
| 시스테인 | Cys | C | 무극성 | 중성 | 2.5 |
| 글루탐산 | Glu | E | 극성 | 음성 | -3.5 |
| 글루타민 | Gln | Q | 극성 | 중성 | -3.5 |
| 글리신 | Gly | G | 무극성 | 중성 | -0.4 |
| 히스티딘 | His | H | 극성 | 양성 | -3.2 |
| 이소루신 | Ile | I | 무극성 | 중성 | 4.5 |
| 루신 | Leu | L | 무극성 | 중성 | 3.8 |
| 리신 | Lys | K | 극성 | 양성 | -3.9 |
| 메티오닌 | Met | M | 무극성 | 중성 | 1.9 |
| 페닐알라닌 | Phe | F | 무극성 | 중성 | 2.8 |
| 프롤린 | Pro | P | 무극성 | 중성 | -1.6 |
| 세린 | Ser | S | 극성 | 중성 | -0.8 |
| 트레오닌 | Thr | T | 극성 | 중성 | -0.7 |
| 트립토판 | Trp | W | 무극성 | 중성 | -0.9 |
| 티로신 | Tyr | Y | 극성 | 중성 | -1.3 |
| 발린 | Val | V | 무극성 | 중성 | 4.2 |
국제 특허 출원 PCT/EP2010/059902호에 기술된 테스트 조건(중성 pH에서의 비강제적 자가 단백 분해 조건) 하에서, 제한된 횟수의 자가 단백 분해 절단이 플라스민 촉매 도메인 내에서 일어난다. 이러한 절단은 사람 플라스민 촉매 도메인의 137번 리신, 사람 플라스민 촉매 도메인의 147번 리신 및 사람 플라스민 촉매 도메인의 158번 아르기닌에서 일어난다. 그러나, 이는 자가 단백 분해상 절단될 수 있는 기타 다른 펩티드 결합의 존재 가능성을 배제하지 않는다.
따라서, 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체와 관련하였을 때, P 또는 P' 위치에서 상기 내부 아미노산은 다음과 같은 것들로부터 선택될 수 있으며,
(i) 사람 플라스민 촉매 도메인의 137번 위치에 있는 리신, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 리신 또는 아르기닌;
(ii) 사람 플라스민 촉매 도메인의 147번 위치에 있는 리신, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 리신 또는 아르기닌; 및/또는
(iii) 사람 플라스민 촉매 도메인의 158번 위치에 있는 아르기닌, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 아르기닌 또는 리신;
여기서, 상기 사람 플라스민 촉매 도메인은 1번 위치에서 발린 아미노산으로 시작하는데, 상기 발린 아미노산은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린 아미노산과 동일하다. 사람 플라스미노겐 및 사람 플라스민 촉매 도메인 내 아미노산의 번호 매김을 분명히 하기 위해서, 본원의 도 1이 참고된다.
특히, 상기에서 P 위치에서 상기 하나 이상의 내부 아미노산은 사람 플라스민 촉매 도메인의 137번 위치에 있는 리신, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 리신 또는 아르기닌이고, [P+/-n] 위치에서 상기 내부 아미노산은 [P+1] 위치에 있는 아미노산, 즉 사람 플라스민 촉매 도메인의 138번 위치에 있는 글루타메이트, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 아미노산 잔기이다. 뿐만 아니라, 특히 상기 글루타메이트는 또 다른 친수성의 산성 아미노산, 예를 들어 아스파르테이트, 아스파라긴 또는 글루타민으로 돌연변이된다.
사람 이외 개체의 플라스민(플라스미노겐) 서열 내에서, 사람 플라스민(플라스미노겐) 내 아미노산에 “상응하는” 아미노산의 확인은 우선 상기 두 아미노산 서열을 배열하는 것을 의미한다. 이와 같은 배열은 몇 가지 최적화 과정, 예를 들어 배열된 서열 중 어느 하나 또는 둘 다에 최소한의 갭을 도입하여 동일성 및 상동성을 최고로 만드는 과정을 필요로 할 수 있다. 두 번째로, 사람의 플라스민(플라스미노겐) 내의 아미노산과 함께 배열된, 사람 이외 개체의 플라스민(플라스미노겐) 내에 존재하는 아미노산을 확인하는데, 본원에서는 이를 “상응하는” 아미노산이라 지칭한다. 본원의 도 2는 공중이 입수할 수 있는 포유동물의 플라스미노겐 단백질 서열의 배열을 도시한 것으로서, 여기에서는 사람 이외 개체의 플라스미노겐 서열(라인 2 내지 라인 18) 내 상응하는 아미노산과 함께, 본 발명에 대하여 특별한 관심이 있는 사람의 플라스미노겐 서열(라인 1) 내 아미노산을 강조한다. 특별한 관심이 있는 P, P' 등의 아미노산으로는 698번 위치의 Lys(촉매 도메인 내 137번 위치, 도 1 참조), 708번 위치의 Lys(촉매 도메인 내 147번 위치, 도 1 참조) 및 719번 위치의 Arg(촉매 도메인 내 158번 위치, 도 1 참조)이 있다.
피브리노리신 또는 리소피브린이라고도 알려진 “플라스민”은 지모겐 플라스미노겐의 활성화로부터 생성되는 세린류의 프로테아제이다. 활성화는 561번 및 562번(상기 아미노산 번호는 사람의 Glu-플라스미노겐을 기준으로 하여 매김) 아미노산 사이의 단백 분해 절단의 결과이다. 플라스민은 5개의 크링글 도메인을 포함하는 중쇄와, 촉매 도메인을 포함하는 경쇄를 가진다. 플라스미노겐은, 예를 들어 리신 친화성 크로마토그래피를 통하여 혈장으로부터 증폭될 수 있다(Deutsch & Mertz, 1970, Science 170, 1095-1096). 촉매 도메인이 작용성을 유지하는 한 (플라스민 촉매 도메인의 외부 및/또는 내부에 있는) 플라스민 분자를 절두할 수 있는데, 이와 같은 절두 과정을 통하여 플라스민의 “단백 분해 활성 유도체”가 형성된다. 그렇게 하여, 5개의 크링글 도메인 중 하나 이상은 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 그러므로, 하나 이상의 크링글 도메인이 흠결되었으며/흠결되었거나 하나 이상의 크링글 도메인의 일부가 흠결된 절두형 플라스민은 플라스민의 단백 분해 활성 유도체의 일례로서 본 발명에 의해 검토된다. 플라스민의 절두형 변이체의 예로는 “미디플라스민”, “미니플라스민”, “마이크로플라스민” 및 “델타-플라스민”을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 미디플라스민은 기본적으로 1번 내지 3번 크링글 도메인이 흠결되어 있다(예를 들어, 문헌[Christensen et al., 1995, Biochem J 305, 97-102]). 미니플라스민은 원래 엘라스타제를 사용하여 플라스민을 제한적으로 분해함으로써 얻었으며, 이는 기본적으로 1번 내지 4번 크링글 도메인이 흠결되어 있다(예를 들어, 문헌[Christensen et al., 1979, Biochim Biophys Acta 567, 472-481]; [Powell & Castellino, 1980, J Biol Chem 255, 5329]). 결과적으로 미니플라스민은 재조합 방법에 의해 생산되어 왔다(WO 2002/050290호). 마이크로플라스민은 원래 상승된 pH에서 플라스민을 항온 처리함으로써 얻어졌으며, 기본적으로는 모든 크링글 도메인이 흠결되어 있다(예를 들어, WO 89/01336호). 상승된 pH에서 플라스민을 항온 처리하여 얻어진 마이크로플라스민은 중쇄의 카복시 말단 아미노산을 30개 내지 31개 함유하고 있는 반면에, 재조합 생산된 마이크로플라스민 변이체는 중쇄의 카복시 말단 아미노산을 19개 함유하고 있다(WO 2002/050290호). 이는, 소정의 플라스민 속, 예를 들어 마이크로플라스민 속(예를 들어, 마이크로플라스민 속의 다수 종) 내 분자의 허용 가변성을 예시한다. 델타-플라스민은 크링글 도메인 1 또는 크링글 도메인 4가 촉매 도메인과 직접 결합된 플라스민의 재조합 형태이다(WO 2005/105990호). 상기 기술한 플라스민의 절두형 변이체는, “미디플라스미노겐”, “미니플라스미노겐”, “마이크로플라스미노겐” 및 “델타-플라스미노겐” 각각을 활성화함으로써 얻어진다. 활성화 가능하게 될 수 있도록, 절두형 플라스미노겐은 크링글 도메인(예를 들어, 미니플라스민 내 크링글 5 도메인)과, 촉매 도메인 또는 크링글 저 절두형 플라스민(kringle-less truncated plasmin)의 경우에는 촉매 도메인의 C-말단 사이에 최소한 수의 링커 아미노산을 포함할 필요가 있다(예를 들어, 문헌[Wang et al., 1995, Protein Science 4, 1758-1767] 참조). 본 발명의 내용에서, 플라스미노겐은 “비변형 활성화 위치”를 포함하는 것이 요구될 수 있는데, 이는 적어도 561번 및 562번 위치에 아미노산(사람 Glu-플라스미노겐 기준; 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스미노겐 중 아미노산)이 존재하며, 이 아미노산이 분자 환경 내에 존재함으로 인하여, 가능하게는 야생형 플라스민에서 일어나는 것과 상이한 동태로 일어나긴 하지만, 플라스미노겐의 플라스민으로의 활성화/전환이 일어날 수 있음을 암시한다. 플라스민이나 이의 활성 절두형 변이체에 대한 대안으로서, 본 발명의 내용에서 활성화 가능한 플라스미노겐 또는 이의 절두형 변이체가 사용될 수 있다(예를 들어, EP 제0480906호; US 제5,304,383호; EP 제0631786호; US 제5,520,912호; US 제5,597,800호; US 제5,776,452호 참조). “플라스미노겐”은 임의의 형태의 플라스미노겐, 예를 들어 Glu-플라스미노겐 또는 Lys-플라스미노겐(68번 위치의 Arg, 또는 77번이나 78번 위치의 Lys으로 시작함)을 말한다. 활성화 가능한 플라스미노겐 또는 이의 활성화 가능한 절두형 변이체를 사용할 때, 플라스민으로의 활성화는 지연될 수 있으며, 통상적으로 상기 플라스미노겐이 기관, 조직 또는 체액과 접촉한 이후, 즉 개체에 투여된 이후에 진행할 것이다. 또 다른 대안에 있어서, 플라스민 또는 이의 활성 절두형 변이체는 본 발명의 내용 중 플라스미노겐 활성 인자(예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성 인자(tPA), 유로키나제, 스트렙토키나제 또는 스타필로키나제, 또는 이의 임의의 변이체; 예를 들어, US 제6,733,750호; US 제6,585,972호; US 제6,899,877호; WO 03/33019호)와 함께, 활성화 가능한 플라스미노겐 또는 이의 활성화 가능한 절두형 변이체를 대체할 수 있다. 또 다른 대안에 있어서, (i) 플라스민 또는 이의 유도체, (ii) 활성화 가능한 플라스미노겐 또는 이의 활성화 가능한 유도체, 그리고 임의로 (iii) 플라스미노겐 활성 인자 중 임의의 것의 혼합물을 본 발명의 내용에서 사용할 수 있다(예를 들어, US 제2004/0081643호 참조). 플라스민(또는 플라스미노겐)의 안정성을 확보하기 위해서, 일반적으로 낮은 온도(예를 들어, +4℃ 또는 -20℃)에서 이를 보관할 것이다. 보관 조성물은, 대안적으로는, 예를 들어 아미노산(예를 들어, 리신 또는 이의 유사체, 예를 들어 EACA 또는 트라넥삼산), 당(예를 들어, 만니톨) 또는 당업계에 알려진 임의의 안정화제(예를 들어, 디펩티드, WO 97/01631호)를 포함하는 하나 이상의 추가 안정화 조성물 내에서 또는 이와 함께, 안정화 조성물, 예를 들어 저 pH 조성물(pH 4 이하; 예를 들어, 시트르산과 같은 산 1mM 내지 250mM에 의해 얻어짐; 예를 들어, 문헌[Castellino & Sodetz, 1976, Methods Enzymol 45, 273-286]; WO 01/36608호; WO 01/36609호; WO 01/36611호 참조) 또는 고 글리세롤 함량 조성물(30%v/v 내지 50%v/v, 예를 들어 문헌[Castellino & Sodetz, 1976, Methods Enzymol 45, 273-286] 참조)일 수 있다. 뿐만 아니라, “플라스민” 부류에는 이의 임의의 활성 유도체(또는 활성 절두형 플라스민 변이체의 임의의 활성 유도체), 또는 활성화 가능한 플라스미노겐의 유사 유도체(또는 이의 활성화 가능한 절두형 변이체의 유사 유도체)도 포함된다. 이와 같은 유도체로는, 예를 들어 표지화된 플라스민 또는 플라스미노겐(또는 이의 절두형 변이체), 예를 들어 Tc99 표지화된 플라스민(Deacon et al., 1980, Br J Radiol 53, 673-677) 또는 페그화되었거나 아실화된 플라스민 또는 플라스미노겐(또는 이의 절두형 변이체; EP 제9879호, WO 93/15189호)을 포함한다. 또한 플라스민 또는 플라스미노겐 유도체를 생산하기 위하여 임의의 기타 다른 표지(방사능 표지, 형광 표지 등)를 사용할 수도 있다. 상기 유도체로는 예를 들어 피브리노겐 결합 분자(예를 들어, tPA의 크링글 2, 아포지단백 크링글, tPA의 핑거 도메인(finger domain) 또는 피브로넥틴 또는 피브린 결합 항체의 Fab 도메인)와 융합되어 있는, 예를 들어 본 발명에 의한 절두형 플라스민 또는 플라스미노겐을 포함하는 하이브리드 또는 키메라 플라스민 또는 플라스미노겐 분자를 추가로 포함한다.
야생형 플라스민과, 본 발명에 의한 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체의 자가 단백 분해 저항성(즉, 안정성)의 비교는 단백 분해 활성 비교 방법, 예를 들어 발색 활성 분석법 또는, 예를 들어 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌 또는 콜라겐을 바탕으로 하는 생물학적 기질 분석법과 유사한 방법으로 수행할 수 있다.
자가 단백 분해 저항성을 측정하기 위하여, 자가 분해 속도 상수를 측정할 수 있다. 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것을 포함한, 본 발명에 의한 플라스민 변이체는, 야생형 플라스민의 자가 분해 속도 상수보다 5% 이상 또는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9% 이상으로 낮거나, 또는 대안적으로 야생형 플라스민의 자가 분해 속도 상수의 95% 이하, 또는 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이하인 자가 분해 속도 상수를 특징으로 할 수 있다는 것이 예상된다. 나타낸 백분율을 측정하기 위하여, 자가 분해 절대 속도 상수를 바탕으로 계산이 수행될 수 있다. 예를 들어, 야생형 마이크로플라스민의 자가 분해 속도 상수는 123M-1s-1인 것으로 측정되었던 반면에, 마이크로플라스민 변이체 E138Q의 자가 분해 속도 상수는 4M-1s-1인 것으로 측정되었다(실시예 1/표 2 참조). 그러므로 상기 E138Q 변이체의 자가 분해 속도 상수는 야생형 마이크로플라스민의 자가 분해 속도 상수의 3.25%이다.
뿐만 아니라, 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민을 포함한 본 발명에 의한 플라스민 변이체 중 임의의 것, 또는 상기 플라스민 중 임의의 것의 유도체의 단백 분해 활성은, 예를 들어 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌 또는 콜라겐을 바탕으로 한 생물학적 기질 분석법 또는 발색 활성 분석법으로 측정한 바와 같이, 야생형 플라스민의 단백 분해 활성과는 상이하게(더 크거나 더 작게) 유지될 수 있다.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민을 포함한 본 발명에 의한 플라스민 변이체, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것의 단백 분해 활성은 단위 시간 당 각각의 효소 위치에서 생성물로 전환되는 기질 분자의 수의 척도가 되는 촉매 상수 kcat에 의해서 야생형 플라스민의 단백 분해 활성과 비교될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민을 포함한 본 발명에 의한 플라스민 변이체 중 임의의 것, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것은 야생형 플라스민 kcat 값의 +100% 내지 -90% 또는 +50% 내지 -50%의 범위의 kcat 값을 특징으로 할 수 있으며, 즉 야생형 플라스민 kcat 값의 10% 내지 200% 또는 50% 내지 150%의 범위의 kcat 값을 특징으로 할 수 있다. 나타낸 백분율을 측정하기 위하여, 절대 kcat 값의 계산을 수행한다. 예를 들어, 야생형 마이크로플라스민의 kcat는 46s-1인 반면에, 마이크로플라스민 변이체 K137M의 kcat는 36s-1이다(국제 특허 출원 PCT/EP2010/059902호의 실시예 4/표 3 참조). 그러므로, K137M 변이체의 kcat는 야생형 마이크로플라스민 kcat의 78.3%이다.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것을 포함한, 본 발명에 의한 플라스민 변이체의 단백 분해 활성을, 야생형 플라스민의 단백 분해 활성과 비교하는 또 다른 방법은 kcat/Km을 비교하는 것을 포함한다. kcat/Km 값이 더 크거나, 비슷하거나 또는 약간 더 작은 경우가 바람직할 수 있으나, 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것을 포함한, 본 발명에 의한 플라스민 변이체의 kcat/Km은, 야생형 플라스민의 kcat/Km에 비하여 1000배 이하 또는 500배 이하 작은 경우가 여전히 허용될 수 있다(이하 참조). 예를 들어, E138Q 마이크로플라스민 변이체의 kcat/Km은 9.5×105인 것으로 측정되었던 반면에, 야생형 플라스민의 kcat/Km은 6.9×105인 것으로 측정되었는데(실시예 1/표 2 참조), 즉 E138Q 마이크로플라스민의 kcat/Km 값은 야생형 마이크로플라스민의 kcat/Km 값보다 1.38배 더 크다.
대안적으로, 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민을 포함한 본 발명에 의한 플라스민 변이체 중 임의의 것, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것은 자가 분해 속도 상수 데이터와 kcat/Km 데이터를 합하여 야생형 플라스민과 비교할 수 있다. 예를 들어, 야생형 플라스민에 비하여 자가 분해 속도 상수가 20배 작고, 야생형 플라스민에 비하여 kcat/Km이 10배 작은 플라스민 변이체는 야생형 플라스민보다 2배 더 우수할 것이다. 명백하게는, 최종 용도에 따라서, 예를 들어 플라스민 활성이 작되 오래 지속되는 것을 원하는 경우, 또는 심지어 이 플라스민 활성이 의도로 하는 임상 효과를 얻기 위하여 필요한 것인 경우 단백 분해 활성이 작고 매우 안정적인(즉, 자가 단백 분해가 일어나지 않거나 거의 일어나지 않는) 플라스민이 매우 바람직할 수 있다. 단백 분해 활성이 낮으며 고도로 안정적인 이와 같은 플라스민 변이체는 서방형 담체나 애쥬반트를 실제로 사용하지 않더라도 실질적으로 균등한 서방형 제형으로서 투여될 것이다.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민을 포함한 본 발명에 의한 플라스민 변이체 중 임의의 것, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것을 비교하는 또 다른 대안으로서는 자가 분해 속도 상수 데이터 및 kcat 데이터를 합한 것으로 야생형 플라스민과 비교할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체로부터 얻어진 플라스민, 또는 본 발명에 의한 플라스민 유도체 중 임의의 것을 포함한, 본 발명에 의한 플라스민 변이체들 중 임의의 것은, 상기 정의된 자가 분해 속도 상수, 촉매 상수 kcat 및/또는 kcat/Km의 임의의 조합에 의해 특징지어질 수 있다.
분명한 것은, 상기 기술한 임의의 비교 측정법에 있어서, 야생형 플라스민과 가장 가까운 플라스민 변이체들을 비교하는 것, 예를 들어 마이크로플라스민 변이체와 야생형 마이크로플라스민을 비교하는 것, 또는 미니플라스민 변이체와 야생형 미니플라스민을 비교하는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라, 어떠한 활성 측정법에 있어서도, 본 발명에 의한 플라스민 변이체의 가역적 불활성 유도체는 우선 가역적 불활성화의 원인(예를 들어, 아실화 또는 비 최적 pH)을 없앰으로써 활성화되어야 한다는 것이 분명하다.
본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체 또는 이로부터 얻어진 플라스민 중 임의의 것, 본 발명에 의한 플라스민 변이체 중 임의의 것은 Glu-플라스민의 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐 또는 Lys-플라스민, 미디플라스미노겐 또는 미디플라스민, 미니플라스미노겐 또는 미니플라스민, 마이크로플라스미노겐 또는 마이크로플라스민, 델타플라스미노겐 또는 델타플라스민일 수 있다.
플라스민 종이 단백 분해 활성인지 여부를 확인하는 분석법이 다수 존재한다. 용이하고도 직접적인 분석법은 샘플 중에 존재하는 플라스민에 의해 발색 기질을 분해하는 것을 바탕으로 하는데, 발색 기질로는 단백 분해 절단시 p-니트로아닐린(pNA)을 방출하는 S-2251(Val-Leu-Lys-pNA)과 S-2403(Glu-Phe-Lys-pNA)을 포함한다. 형성된 pNA의 양은 405㎚에서의 흡광도에 의해 측정될 수 있다. 플라스민 활성을 측정하는 대안적인 분석법으로는 전위차 분석법(potentiometric assay)이 있다. 비색 분석법(colorimetric assay)(발색 기질 사용) 및 전위차 분석법은, 예를 들어 문헌[Castellino & Sodetz, 1976, Methods Enzymol 45, 273-286]에 기술되어 있다. 플라스민 활성을 측정하는 추가의 대안적 분석법으로는 카세인 분해 분석법(caseinolytic assay)이 있다(예를 들어, 문헌[Robbins & Summaria, 1970, Methods Enzymol 19, 184-199]; [Ruyssen & Lauwers, 1978, Chapter IX - Plasmin, “Pharmaceutical Enzymes”, Story-Scientia, Gent, Belgium, pp. 123-131]). 플라스민 활성을 측정하는 또 다른 대안적 분석법으로는 피브린 분해 분석법(fibrinolytic assay)이 있다(예를 들어, 문헌[Astrup & Mullertz, 1952, Arch Biochem Biophys 40, 346-351]). 추가의 활성 분석법은 기타 다른 단백질 기질을 사용하여 용이하게 설계될 수 있다. 분명하게, 이와 같은 분석법은 또한 효소의 자가 단백 분해 절단으로 인하여 시간이 경과함에 따라서 플라스민 단백 분해 활성을 없애는데 사용될 수도 있다. 본 발명의 플라스민 변이체 또는 이의 임의의 활성 절두형 변이체 또는 유도체의 안정성을 평가하는 대안으로서, 상기 플라스민 변이체를 야생형 플라스민의 존재 하에 항온 처리할 수 있으며, 야생형 플라스민에 의한 분해에 대한 플라스민 변이체의 저항성을 모니터링할 수 있다.
병변, 상처, 궤양성 상처(예를 들어, 궤양성 봉합된 상처(ulcerating stitched wound) 등으로부터 괴사 요소 또는 세포 조각을 제거하는데 있어서 플라스민의 사용은, 예를 들어 US 제3,208,908호에 기술되어 있다. 이와 유사하게, 화상을 치료기 위한 플라스민 포함 치료 제제의 국소 도포는, 예를 들어 US 제4,122,158호에 개시되어 있다. 괴사 조직 제거(debridement)는 남아있는 건강한 조직의 치료를 개선하거나 높이기 위해서 사멸, 손상 및/또는 감염된 조직을 제거하는 것을 말한다. 이와 같은 제거는 외과적 수단, 기계적 수단 또는 화학적 수단에 의하거나, 또는 괴사 조직을 선택적으로 먹는 살아있는 구더기 종 중 임의의 것에 의해(구더기 치료법) 이루어질 수 있다. 괴사 조직 제거는 또한 효소를 사용하여 수행할 수도 있으며, 또는 효소의 도움을 받을 수도 있는데, 이 과정을 효소적 괴사 조직 제거(enzymatic debridement)라고 지칭한다. 괴사 조직 제거는 화상 및 기타 다른 중상 치료 과정에 있어서 중요한 측면일 뿐만 아니라, 일부 종류의 뱀에게 물린 상처를 치료하는 데에도 사용된다. 효소적 괴사 조직 제거(단독 또는 기타 다른 유형의 괴사 조직 제거와 병행)에서 플라스민(또는 상기 기술한 바와 같은 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적 수단)을 사용하는 것은 상처 치료 과정을 촉진 또는 가속화하고, 피부 이식과 같은 외과적 방법에 대한 보조적인 수단으로서 특히 유용하다.
플라스민(또는 상기 기술한 바와 같은 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)의 보다 일반적으로 알려져 있는 용도로는 피브린의 병리학적 침착물(들)을 일상적으로 처리하는 것에 관한 것이다. 피브린 침착물은 체 내 다양한 병리학적 상태로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 피브린 함유 혈전이 조직 내 혈관에 형성되면, 심정맥, 관상 동맥, 뇌동맥 또는 망막 정맥 폐쇄 또는 혈전증을 유발할 수 있다. 피브린의 소량 축적이 먼저 일어나고, 이는 심각한 혈전증이 임박하다는 경고를 제공할 수 있다. 예로서는, 불안정형 협심증을 포함하며, 이는 뇌졸중으로 진행될 수 있는 일과성 허혈성 발작 및 관상 혈전증이 임박하다는 경고로서 간주된다. 뿐만 아니라, 피브린은 종종 감염, 자가 면역 질병 및 암을 포함한 다수의 질병 과정과 연관된 염증을 동반하면서 조직 내에 침착된다. 피브린이 침착되는 또 다른 위치로는 미생물로 인한 감염에 의해 유발되는 종기의 주위가 있다. 피브린 침착물은 또한, 종종 임의의 고형 종양과 함께 발견된다. 피브린 축적은 또한 외과적 개입, 예를 들어 섬유주절제술로 인하여 생성된 상처를 비롯한, 임의의 유형의 상처를 치료하는 중에 일어날 수도 있다. 피브린 침착의 또 다른 경우로는 망막 정맥 내에 피브린의 축적이 있는데, 이로써 망막 변성증, 시야 왜곡 현상 또는 심지어 시력 상실까지도 유발될 수 있다. 병리학적 피브린 침착물이란 용어로는 카테터, 카테터 장치 또는 기타 임플란트, 예를 들어 인공 혈관 및 합성 이식편, 또는 사람이나 동물로부터 유래하는 이식편의 내부 또는 말단부에 존재하거나 형성되며, 피브린을 포함하는 폐색체에 의해 효과적으로 차단되는 침착물을 추가로 포함한다. “카테터 장치”란 용어는 동맥 카테터, 심장 카테터, 중심 정맥 카테터, 정맥 내 카테터, 말초 삽입 중심 카테터, 폐동맥 카테터, 터널식 중심 정맥 카테터 및 동정맥 단락을 포함하여 체 내에 삽입될 수 있는 임의의 튜브 유사 장치 또는 카테터를 의미한다.
혈전증 진행 즉, 혈전이나 지혈 플러그(hemostatic plug) 형성을 가속화하는 다양한 요인들로서는 (1) 발병 혈관의 내피 세포 라이닝(endothelial cell lining)의 손상, (2) 혈액 응집성의 증가, 그리고 (3) 발병 혈관 내 혈액의 침체가 있다. 혈전증은 혈관 라이닝의 손상된 부분에 아주 작은 혈액 덩어리가 부착되는 것으로부터 시작할 수 있다. 이 덩어리가 존재함으로 인하여 혈전증이 계속해서 진행되고, 혈관의 내부 지름이 감소함으로 인해 혈류가 느려지는 효과가 있다. 초기에는 작았던 혈전이 점차로 커져서 종종 발병 혈관의 전체, 또는 발병 혈관의 거의 전체를 막아버리게 된다. 만일 혈전증이 동맥들 중 어느 하나에서 발생한다면, 그 동맥에 의해 혈액을 공급받는 조직은 산소 및 영양분의 공급이 차단될 것이고, 이로써 조직이 손상되거나 사멸하게 된다(괴저). 손상의 심각성은 혈전의 위치와 크기, 혈전이 커지는 속도, 그리고 발병된 부위가 단지 하나의 동맥인지 여부 또는 부행 혈관에 의해 공급받는지 여부에 따라서 달라진다. 만일 개체의 생명 유지에 필수적인 기관(예를 들어, 심장이나 뇌)의 혈관에서 발병되면, 개체는 심각한 불구가 되거나 사망할 수 있다. 때때로 혈전은 감염 유기체, 예를 들어 박테리아를 포함할 수 있으며, 고름이 형성되고 주변 조직 감염을 동반하는 패혈성 혈전증을 발생시킬 수 있다.
플라스민(또는 상기 기술한 바와 같은 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 대안적인 수단)의 추가 용도로는 순환 피브리노겐 수준 감소용(예를 들어, WO 93/07893호) 및 α2-항플라스민 억제제(허혈성 뇌졸중 이후 뇌경색의 크기를 줄여준다고 보고됨; WO 00/18436호)로서의 용도를 포함한다.
플라스민(또는 상기 기술한 바와 같은 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)의 또 다른 용도로는 기계적 유리체 절제술에 대한 대안 또는 병행 요법으로서 안구 내 후유리체 박리(PVD) 및/또는 유리체 액화의 유도와 관련된다(WO 2004/052228호; US 제6,733,750호; US 제6,585,972호; US 제6,899,877호; WO 03/33019호; WO 2006/122249호; WO 2007/047874호; US 제5,304,118호; US 제2006/0024349호; US 제2003/0147877호). 유리체 절제술 및/또는 유리체 액화는 다수의 안구 관련 병태, 예를 들어 비문증(시력을 손상시킬 수 있는 것으로서, 정상적으로는 투명한 유리체액 중에 유리체 침착물/이동성 부유물이 떠 다니는 병태), 망막 박리(유리체 수축에 의해 유발될 수 있는 시력 상실 병태), 황반 주름(황반에 존재하는 상처 조직; 황반은 예리한 중심 시력을 형성하는데 필수적임; 황반 주름은 또한, 망막 전막(epiretinal membrane) 또는 망막 전막(preretinal membrane), 셀로판 황반 병증, 망막 주름, 표면 주름 형성 망막 병증(surface wrinkling retinopathy), 전황반 섬유증(premacular fibrosis), 또는 내부 제한 막성 질병으로도 알려져 있음), 유리체 출혈 및/또는 망막에 섬유형 상처 조직(이 상처 조직은 망막 박리를 일으킬 수 있음)을 형성할 수 있는 당뇨병성 망막 병증(증식성 또는 비증식성), 황반 천공(황반 내 천공은 맹점을 형성하며, 유리체 수축, 상처 또는 외상에 의해 유발됨), 유리체 출혈(당뇨병성 망막 병증, 상처, 망막 박리 또는 망막 인열, 지주막하 출혈(털슨 증후군(Terson syndrome)) 또는 혈관 폐색에 의해 유발됨), 초자양하 출혈(유리체를 감싸고 있는 유리질막 하에서 발생하는 출혈), 황반 부종(안구 내 황반 상 또는 황반 하 체액 및 단백질의 침착), 그리고 황반 변성증(드루젠(drusen)의 형성으로 시작함; 건조형 및 습윤형으로 일어남; 만일 연령과 상관되어 있다면, 동전형 노인성 황반 변성증(coined age-related macular degeneration)에 유리하다. 기타 다른 플라스민의 안구 내 용도로는 (안구 내 압력을 줄이기 위해 수행되는) 섬유주 절제술 이후 여과포(filtering bleb)의 구조(rescue) 또는 유지(maintenance)를 포함한다(예를 들어, WO 2011/023805호 참조).
플라스민(또는 상기 기술한 바와 같은 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)의 또 다른 용도로는 진단법에 사용하는 것이 있는데, 더 구체적으로는 적당하게 표지화된(예를 들어, 상기한 바와 같이 Tc99-표지화된) 플라스민(또는 상기 기술한 바와 같은 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)을 병리학적 피브린 침착물을 확인하는데 적용할 수 있다. 이와 같은 진단법에서 본 발명에 의한 절두형 플라스민 또는 플라스미노겐 변이체를 적용할 때, 상기 변이체는 여전히 피브린 결합 위치(이 결합 위치가 플라스민 자체로부터 유래하는 것인지 아니면, 예를 들어 하이브리드 분자를 생성함으로써 플라스민 촉매 도메인에 부가된 것인지 여부에 상관 없음)를 포함하므로 이 점에 주의해야 한다.
본 발명에 의한 플라스민 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 애쥬반트 중에 보관될 수 있다. 이와 같은 담체, 희석제 또는 애쥬반트는 산성이 낮은 완충액, 예를 들어 아세테이트 또는 시트레이트 1mM 내지 100mM로 이루어질 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 산성 조건일 때, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 애쥬반트는 pH가 pH 2.5 내지 5.0, 예를 들어 pH 2.5 내지 4.0, 또는, 예를 들어 pH 3.0 내지 3.5, 또는 pH 3.1, pH 3.2, pH 3.3 또는 pH 3.4일 수 있다. 유용한 산성 화합물로는 아세트산, 시트르산, 염산, 락트산, 말산, 타르타르산 또는 벤조산을 포함한다. 포름산도 사용할 수 있지만, 이 포름산은 Asp-잔기의 C-말단에서 단백 분해 절단을 유도하지 않는 화합물이라는 점에 주의해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 애쥬반트(산성, 중성 또는 염기성)는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루타민, 글리신, 이소루신, 발린, 알라닌, 아스파르트산, 리신, 히스티딘 또는 이의 임의의 유도체나 유사체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 애쥬반트는 탄수화물, 예를 들어 단당류, 이당류, 다당류 또는 다가 알코올을 포함할 수 있다. 예로는 설탕, 예를 들어 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 트레할로스, 말토스 및 만노스; 당 알코올, 예를 들어 솔비톨 및 만니톨; 그리고 다당류, 예를 들어 덱스트린, 덱스트란, 글리코겐, 전분 및 셀룰로스를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 애쥬반트는 글리세롤, 니아신아미드, 글루코사민, 티아민, 시트룰린, 무기 염(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘), 벤질 알코올 또는 벤조산과 같은 화합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 애쥬반트로는 ε-아미노카프론산(EACA) 및/또는 트라넥삼산(상기 내용 및 배경 기술 섹션 참조)과 같은 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물들 중 일부는 상기 기술한 바와 같은 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단의 안정화제로서 사용될 수 있다.
상기한 바를 참고로 하였을 때, 본 발명의 다른 측면은 의약품으로 사용되는, 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것들의 조합체에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것들의 조합체와, 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 애쥬반트 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 상기 조성물은 항응집제, 추가의 혈전 용해제, 소염제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 항혈관형성제, 항유사분열제, 항히스타민제 또는 마취제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 기술한 본 발명의 두 가지 측면들에 대한 구체예에 있어서, 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것들의 조합체, 또는 본 발명에 의한 조성물을 임상학적 관련 용도, 예를 들어 개체 내 병리학적 피브린 침착물 처리용, 안구 내 후유리체 박리 현상 유도용, 안구 내 유리체 액화의 유도용, 안구 내 유리체 절제술 촉진용 및 보조 수단, 후유리체 박리 현상의 유도용, 유리체 황반 수축 치유용, 황반 천공 폐쇄용, 효소적 괴사 조직 제거용, 순환형 피브리노겐 감소용, α2-항플라스민 수준 감소용, 또는 섬유주 절제술용으로 사용할 수 있다.
상기 기술한 본 발명의 두 가지 측면들에 대한 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것들의 조합체, 또는 본 발명에 의한 조성물을 예방학적 목적으로 사용할 수 있거나, 또는 예방학적 치료 방법에 사용할 수 있다. 예방학적 용도로서는 병리학적 피브린 침착물이 생성될 위험성이 큰 포유동물(예를 들어, 비만 포유동물, 육체적인 운동을 충분히 하지 않은 포유동물, 또는 주요 외과 처치 또는 대수술을 앞둔 포유동물)의 체 내에 병리학적 피브린 침착물이 형성될 위험성을 감소시키는 것을 포함한다. 기타 다른 예방학적 용도로는 다른쪽 안구가 후유리체 박리 및/또는 유리체 액화를 유도하는데 필요한 것으로 진단된 포유동물의 겉보기에 건강한 안구 내 후유리체 박리 및/또는 유리체 액화의 유도를 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 개체 내 병리학적 피브린 침착물의 처리, 용해, 성김화(loosening), 불림(macerating), 분해, 이 침착물의 용해를 유도 또는 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법들은 상기 피브린 침착물을 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것의 조합체의 유효량만큼과 접촉시키는 단계를 포함하며, 이와 같은 접촉 단계를 통하여, 상기 병리학적 피브린 침착물이 처리, 용해, 성김화, 불림 및 분해되거나, 또는 이 침착물의 분해가 유도 또는 촉진된다.
본 발명은 또한, 개체의 안구 내 후유리체 박리 현상을 유도하는 방법 및/또는 안구 내 유리체 액화를 유도하는 방법, 또는 안구 내 외과적 유리체 절제술을 가속화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 이와 같은 치료를 필요로 하는 개체의 안구를, 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것들의 조합체의 유효량만큼과 접촉시키는 단계를 포함하며, 이와 같은 접촉 단계를 통하여, 상기 후유리체 박리 및/또는 상기 유리체의 액화가 유도되거나, 또는 상기 외과 유리체 절제술을 가속화한다.
본 발명은 또한 개체의 손상된 조직의 효소적 괴사 조직 제거 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 손상된 조직을 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민 또는, 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것들의 조합체의 유효량만큼과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계를 통하여 상기 손상된 조직의 효소적 괴사 조직 제거가 일어난다.
본 발명의 또 다른 방법으로는 순환형 피브리노겐을 감소시키는 방법, 또는 개체 내 α2-항플라스민 수준을 감소시키는 방법을 포함하여 임상학적으로 관련된 기타 임의의 징후를 치료 또는 예방하는 방법이 있는데, 상기 방법은 이와 같은 치료를 필요로 하는 개체를 본 발명에 의한 분리된 플라스미노겐, 플라스민, 또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단, 또는 이것들 중 임의의 것의 조합체의 유효량만큼과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계를 통하여 순환형 피브리노겐 또는 상기 α2-항플라스민 수준이 감소하게 된다.
일반적으로, 본 발명에 의한 플라스민(또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)을 포함하는 본 발명의 의약품이나 조성물은 궁극적인 용도와 투여 방식에 따라서, 하나 이상의 추가 활성 성분, 예를 들어 항응집제, 추가의 혈전 용해제, 소염제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 항혈관형성제, 항유사분열제, 항히스타민제 또는 마취제를 포함할 수 있다.
“항응집제”로는 히루딘, 헤파린, 쿠마린, 저분자량 헤파린, 트롬빈 억제제, 혈소판 억제제, 혈소판 응집 억제제, 응집 인자 억제제, 항피브린 항체 및 인자 VIII-억제제(WO 01/04269호 및 WO 2005/016455호에 기술된 바와 같음)를 포함한다.
“혈전 용해제”로는 야생형 플라스민, 야생형 플라스미노겐, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직형 플라스미노겐 활성 인자(tPA 또는 알테플라제), 유로키나제형 플라스미노겐 활성 인자(uPA) 및 스타필로키나제 또는 이것들 중 임의의 것의 임의의 변이체 또는 유도체, 예를 들어 APSAC(아니소일화 플라스미노겐 스트렙토키나제 활성 인자 복합체), 레테플라제, 테넥테플라제, scuPA(단일 사슬 uPA), 또는 이것들 중 임의의 것의 조합체를 포함한다.
“소염제”로는 스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 트리암시놀론, 덱사메타손) 및 비 스테로이드성 소염제(NSAID; 예를 들어, 아세타미노프렌, 이부프로펜 및 아스피린)를 포함한다.
“항바이러스제”로는 트리플루리딘, 비다라빈, 아시클로버, 발라시클로버, 팜시클로버 및 독수리딘을 포함한다.
“항박테리아제”또는 항생제로는 암피실린, 페니실린, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 프라미세틴, 가티플록사신, 겐타마이신, 토브라마이신, 바시트라신, 네오마이신 및 폴리믹신을 포함한다.
“항유사분열제/균 발육 제지제/항진균제”로는 플루코나졸, 암포테리신, 클로트리마졸, 에코나졸, 이트라코나졸, 미코나졸, 5-플루오로시토신, 케토코나졸 및 나타마이신을 포함한다.
“항혈관형성제”로는 항체(또는 이의 단편), 예를 들어 항-VEGF(혈관 내피 성장 인자) 또는 항-PlGF(태반 성장 인자) 항체 및 제제, 예를 들어 마쿠겐(페가프타닙 소듐), 트립토파닐-tRNA 합성 효소(TrpRS), 아세트산아네코르타브, 컴브레스타틴 A4 전구 약물, AdPEDF(안료 상피 유래 인자를 발현할 수 있는 아데노벡터), VEGF-트랩, VEGF 수용체-2의 억제제, VEGF의 억제제, PlGF의 억제제, TGF-β의 억제제, 시롤리머스(Sirolimus)(라파마이신) 및 엔도스타틴을 포함한다.
“항유사분열제”로는 미토마이신 C 및 5-플루오로우라실을 포함한다.
“항히스타민제”로는 케티토펜 푸마레이트 및 페니라민 말레이트를 포함한다.
“마취제”로는 벤조카인, 부탐벤, 디부카인, 리도카인, 옥시부프로카인, 프라목신, 프로파라카인, 프록시메타카인, 테트라카인 및 아메토카인을 포함한다.
본원에서 사용된“접촉”이란 용어는 조성물, 예를 들어 의약품 및 이 조성물과 접촉하는 조직, 체액, 기관 또는 유기체 등 사이의 상호 작용을 초래하는 임의의 투여 방식을 의미한다. 상기 조성물과 조직, 체액, 기관 또는 유기체 등 사이의 상호 작용은 이 조성물을 투여한 직후 또는 거의 직후에 시작하여 일어날 수 있거나, (이 조성물을 투여한 직후 또는 거의 직후에 시작하여) 장기간에 걸쳐서 일어날 수 있거나, 또는 이 조성물을 투여한 시간으로부터 일정 기간 경과한 후에 일어날 수 있다.
병리학적 피브린 침착물에 유효량의 플라스민(또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)을 제공하는 이 피브린 침착물을 (조성물 투여 직후, 투여하고 나서 일정 기간 경과후 또는 장기간에 걸쳐서) 접촉시키는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 만일 이와 같은 피브린 침착물이 혈전과 회합하게 되면, 플라스민(또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)은, 주사 및/또는 주입 및/또는 카테터를 통해서 (혈전이 생성된 부위와 가까운 부위 또는 혈전이 생성된 부위로) 동맥 내, 정맥 내 또는 국소 전달될 수 있다.
효소적 괴사 조직 제거에 플라스민(또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)을 사용할 때, 이 플라스민은 국소 투여될 수 있는 겔 유사 조성물 중에 포함될 수 있거나, 또는 액체 형태로 적용될 수 있다.
(조성물 투여 직후, 투여하고 나서 일정 기간 경과후 또는 장기간에 걸쳐서) 유리체액 및/또는 수양액에 유효량의 플라스민(또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)을 제공하는 안구 내 유리체액 및/또는 수양액을 접촉시키는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이 유리체액 및/또는 수양액을 접촉시키는 하나의 방법으로는 유리체액 및/또는 수양액에 직접 1회 이상 안구내 주사하는 방법이 있다. 대안적으로, 상기 접촉 방법으로는 결막 하, 근육 내 또는 정맥 내 주사를 포함할 수 있다. 추가의 대안적 접촉 방법으로는 유리체 내 주입 가능 장치, 예를 들어 오큐서트(OCUSERT)®(Alza Corp., Palo Alto, California) 또는 비트라서트(VITRASERT)®(Bausch & Lomb Inc., Rochester, New York)를 배치하는 것을 포함한다. 유리체액 및/또는 수양액을 유효량만큼의 플라스민(또는 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단)과 접촉시키는 방법으로는 데포(depot)를 이용하여 연속적으로 주입하는 방법, 서방형 제제 또는 적당한 임의의 주입 가능 장치가 있을 수 있다.
“유효량”이라는 용어는 본 발명에 의한 의약품, 특히 본 발명에 의한 의약품의 활성 성분, 즉 플라스민이나 이의 활성 절두형 변이체(또는 상기 기술한 바와 같은 그 결과의 임의의 대안적인 수단)를 투여할 때의 양을 의미한다. 상기 유효량은 일반적으로, 접촉 방식이나 투여 방식, 그리고 치료될 병태에 따라서 달라질 것이며, 또한 상기 요소들에 따라서 조정을 필요로 할 것이다. 의약품, 더욱 구체적으로는 이의 활성 성분의 유효량이란 심각하거나 불필요한 독성 효과를 나타내지 않고 원하는 임상 결과, 또는 치료나 예방 효과를 얻는데 필요한 양이다. 유효량을 얻거나 유지하기 위해서, 의약품은 단일 투여형 또는 복수 투여형으로 투여될 수 있다. 유효량은 또한, 치료될 필요가 있는 병태의 심각성이나 예방될 필요가 있는 병태의 예상되는 심각성에 따라서 달라질 수 있는데; 이는 환자의 전반적인 건강 상태와 신체 조건에 따라서도 달라질 수 있고, 일반적으로 유효량을 확립하는 데에는 치료 담당의 또는 전문의의 평가가 필요할 것이다. 유효량은 또한 상이한 형태의 투여 방식들의 조합으로 얻을 수 있다. 의약품은 용액(액체 또는 반액체, 예를 들어 겔 유사 형태, 또는 분산액이나 현탁액, 콜로이드, 유액, 나노 입자 현탁액) 또는 고체(예를 들어, 정제, 미니정제, 경질 또는 연질 외피 캡슐)로서 투여될 수 있다.
혈전 용해의 목적을 위하여, 플라스민의 투여량과 플라스민 치료법의 지속 기간은 통상적으로 혈전의 크기와 위치, 그리고 환자의 신장, 체중 및 연령에 따라서 달라질 것이다. 만일 혈전이 정맥에 생성되었다면, 플라스민을 이용한 치료 방법은 수일간 지속될 수 있는 반면에, 만일 혈전이 동맥에 생성되었다면, 플라스민 치료법에는 수 시간만이 소요될 수 있다. 심근 경색증은 단기 단일 투여 치료법으로 치료될 수 있는 반면에, 혈전성 정맥염 및 폐 혈전증과 같은 병태는 장 기간의 복수 투여 치료법을 필요로 할 수 있다. 장기 연속 및/또는 간헐 혈전 용해 플라스민 치료법을 관상 폐색증의 치료 또는 혈전이 형성될 위험이 높은 것으로 알려진 개체 내에 혈전이 형성될 위험성을 감소시키기 위한 예방 차원의 치료법의 경우에 적용할 수 있다. 플라스민 투여량에 영향을 미치는 또 다른 인자로는 플라스민 억제제, 예를 들어 α2-항플라스민 및/또는 α2-마크로글로불린의 혈류 내 수준을 포함하여, 플라스민 억제제의 초기 수준은 환자 상태에 따라서 달라진다. 효율적인 혈전 용해 치료법을 수행하기 위해서 플라스민 투여량을 조정하여 총 순환 α2-항플라스민을 15% 이하로 유지시키는 것이 바람직하다. 혈전 용해 유도의 목적을 위하여, 혈청 억제제에의 노출을 감소시키면서 혈전과 가까운 부위에서 플라스민, 이의 임의의 변이체나 유도체, 또는 그 결과의 대안적인 수단을 전달하여 접촉시키는 방법이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 방법으로는 통상적으로 카테터 장치를 통한 전달을 포함한다. 혈전 용해에서의 사용에 있어서, 플라스민의 통상적인 투여량 범위는, 체중 1㎏ 당 500㎍ 내지 10㎎이다(1회 볼루스 주사, 또는 처음에 1회 볼루스 주사 후 1회 이상 볼루스 주사 반복). 대안적으로, 플라스민은 장기간에 걸쳐서, 예를 들어 주입법 또는 약물 전달용 미니펌프를 통해서 투여될 수 있다. 연속 투여에 있어서 플라스민 투여량은 1시간 당 1㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏의 범위일 수 있다.
후유리체 박리, 유리체 액화, 유리체 혈액 정화(clearance) 또는 지혈, 또는 유리체강으로부터 독성 물질이나 외래 물질의 정화를 유도하기 위한 통상의 플라스민 투여량은 1회 투여시 안구 당 약 0.1㎍ 내지 약 250㎍의 범위에 있을 수 있는데, 이 투여량은 1회 투여시 안구 당 약 50㎕ 내지 약 300㎕의 희석제 부피 또는 담체 부피로 전달될 수 있다. 희석제 또는 담체는, 예를 들어 멸균 평형 염 용액(Balanced Salt Solution; BSS 또는 BSS 플러스), 생리학적 염수 용액, 또는 1mM 내지 10mM의 산, 예를 들어 시트르산을 함유하는 용액일 수 있다. 하나의 구체예에서, 플라스민은 희석제 또는 담체 0.1㎖중 125㎍의 용량으로 눈에 전달된다. 계획된 외과적 유리체 절제술의 경우, 상기 플라스민은 유리체 절제술 15분 내지 300분 전 또는 15분 내지 120분 전에 눈에 전달될 수 있다. 대안적으로, 눈에 플라스민을 투여하는 목적은 외과적 유리체 절제술을 행하지 않거나, 플라스민 처리 자체가 후유리체를 완전히 박리시킬 수 없을 경우 추후의 외과적 유리체 절제술을 촉진하기 위해서이다. 플라스미노겐을 플라스민의 대안적인 공급원으로서 사용할 때(“플라스민”정의 참조), 안구 당 플라스미노겐 250㎍ 이하를 투여할 수 있으며, 상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 인자인 유로키나제 또는 스트렙토키나제 2000IU 이하, 또는 tPA 25㎍ 이하와 함께 투여될 수 있다. 안구 내에 사용할 때, 플라스민 또는 플라스미노겐은 또한, 안구에 무독성인 한, 기상 애쥬반트, 예를 들어 공기, 팽창성 기체나 액화성 기체, 또는 이것들의 혼합물과 함께 투여할 수 있다. 기타 다른 적당한 기상 물질로서는 SF6(6불화황) 및 과불화탄소, 예를 들어 C2F6(헥사플루오로에탄), C3F8(옥타플루오로프로판), C4F8(옥타플루오로시클로부탄), 산소, 질소, 이산화탄소, 아르곤 및 기타 다른 비활성 기체를 포함한다. 안구에 투여되는 기상 물질의 부피는 기상 물질, 환자 및 원하는 결과에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들어, 후방 강에 주사되는 공기의 부피는 약 0.5㎖ 내지 약 0.9㎖의 범위일 수 있다. 기타 다른 기상 물질, 예를 들어 SF6 및 과불화탄소 기체의 부피는 약 0.3㎖ 내지 약 0.5㎖의 범위일 수 있다. 바람직하게, 기상 물질은 안구의 후방 강에, 후방 유리질에 대해 유리체를 압축하여 안구를 손상시키지 않고 유리체 내 강을 형성하는데 충분한 양으로 투여된다. 바람직한 구체예에서, 기상 애쥬반트는 유리체에 투여되어, 안구 내 강의 내부 부피의 약 40% 내지 약 60%를 차지하는 또 다른 강을 형성하게 된다.
상기 언급한 투여량은 어떠한 방식으로든 제한하는 의미는 아닌, 참고 수치이다. 상기 투여량은 또한 야생형 플라스민이나 플라스미노겐, 또는 이의 임의의 활성 또는 활성 가능 절두형 변이체에도 적용된다. 본 발명에 의한 안정성이 큰 플라스민(또는 이의 임의의 변이체나 유도체 또는 그 결과의 대안적인 수단)을 사용하고, 투여량이 본 발명에 의한 플라스민의 궁극적인 안정성과 잔류 활성에 좌우될 때, 야생형 플라스민으로 얻어지는 전체 임상 효과와 동일하거나 이보다 더욱 양호한 효과를 얻기 위한 투여량은 유사하거나, 많거나 또는 적을 수 있다. 본 발명에 의한 플라스민의 투여량은 또한 내인성 억제제, 예를 들어 α2-항플라스민에 의한 억제율에 따라서 달라질 수 있다.
본원에 개시된 기술과 관련하여, 본 발명은 또한 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(i) [P+/-n] 위치에 있는 아미노산을, [P+/-n] 위치에 있는 천연 아미노산과 상이한 아미노산으로 돌연변이시키는 단계(여기서, P 위치에 있는 아미노산은 아르기닌 또는 리신이고, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임);
(ii) (i)로부터 얻어진 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을 측정하는 단계로서, 상기 기술된 바와 같이, 예를 들어 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정되는 단계;
(iii) (ii)에서 측정된 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을, 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 안정성과 비교하는 단계; 및
(iv) 자가 단백 분해에 안정적인 변이체로서 (iii)으로부터 야생형 플라스민보다 자가 단백 분해에 더 안정적인 돌연변이체를 선별하는 단계;
를 포함하며, 여기서 상기 사람 플라스민 촉매 도메인은 1번 위치에서 발린 아미노산으로 시작하는데, 상기 발린 아미노산은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린 아미노산과 동일하다.
상기 방법에 있어서, [P+/-n] 위치에 있는 아미노산은 바람직하게 리신도 아니고 아르기닌도 아니다.
이와 유사하게, 본 발명은 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(i) 사람 플라스민 촉매 도메인의 138번 위치에 있는 글루타메이트 아미노산, 또는 이에 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 글루타메이트를, 상기 138번 위치에 있는 천연 아미노산과 상이한 아미노산으로 돌연변이시키는 단계;
(ii) (i)로부터 얻어진 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을 측정하는 단계로서, 상기 기술된 바와 같이, 예를 들어 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정 또는 분석되는 단계; 및
(iii) 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체로서 (ii)로부터 자가 단백 분해에 안정적인 돌연변이체를 선별하는 단계;
를 포함하며, 여기서 상기 사람 플라스민 촉매 도메인은 1번 위치에서 발린 아미노산으로 시작하는데, 상기 발린 아미노산은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린 아미노산과 동일하다.
상기 스크리닝 방법들 중 임의의 방법에 있어서, 상기 촉매 도메인은 P, P', P" 등의 위치 중 하나 이상에서 야생형 리신 또는 아르기닌의, 리신 이외의 아미노산 또는 아르기닌 이외의 아미노산으로의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 또한 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체의 단백 분해 활성을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
의약품(본원에 있어서는 특히, 투여받을 개체에 곧 투여될 활성 성분 즉, 환자에게 투여될 최종 제형으로 이해) 및 의약품의 대량 보관 활성 성분을 포함하는 다수의 제품들은 일반적으로, 사용전 오랜 기간 동안 보관된다. 가능한한 제품의 유통 기간을 연장시키는 것에 관심이 있다. 제품이 의약품 및/또는 이의 활성 성분인 경우, 유통 기간은 제품이 안전하게 사용될 수 있고, 강력한 이용 가능성, 즉 활성을 유지하는 시간을 의미한다. 통상적으로, 유통 기간은 제품 또는 포장에 표시되어 있다. 일단 유통 기간이 만료되면, 제품의 안전하고 강력한 이용 가능성은 더 이상 보장되지 않는다. 제품을 보관함에 있어서 추가의 중요한 측면으로는 유통 기간을 원하는 만큼 보장할 수 있는 보관 온도가 있다. 예를 들어, +4℃ 또는 평균 냉장고 온도에 보관된 제품의 유통 기간은 12개월일 수 있는 반면에, -20℃ 또는 평균 냉동고 온도에 보관된 동일한 제품의 유통 기간은 36개월일 수 있다. 그러나 유통상, 저온 유통 체계의 온도를 냉동 온도, 예를 들어 -20℃로 유지시키는 것은 저온 유통 체계의 온도를 +4℃로 유지시키는 것보다 더욱 복잡하고, 어려우며 비용이 많이 든다. 그러므로, 제품을 +4℃에 보관할 수 있을 뿐만 아니라, 더 짧지만 충분히 긴 유통 기간을 가지는 것이 매력적일 수 있다. 본 발명은 플라스민이나 이의 임의의 활성 단편 또는 유도체, 또는 플라스민이나 이의 임의의 활성 유도체를 포함하는 조성물의 유통 기간 또는 장기간 보관 안정성을 연장, 증진 또는 증가시킬 수 있는 해결책을 제공한다. 이와 같은 해결책은 본원에 기술된 바와 같이 이용 가능한 플라스민 변이체를 제조하는 것을 기초로 하는데, 상기 변이체는 안정성이 증진되었으며, 본질적으로는 유통 기간이 증가, 증진 또는 연장하였다.
이와 유사하게, 본 발명은 플라스민 포함 조성물의 장기간 보관 안정성을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 단백 분해 활성의 상당한 손실없이 장기간에 걸쳐서 보관될 수 있는, 자가 단백 분해 안정 플라스민 변이체를 확인하는 단계를 포함한다. 장기간 안정성을 측정하기 위하여, 본 발명에 의한 플라스민 제제를 분취하고 예상되는 보관 기간 동안 활성 측정을 반복하여 수행한다. 만일 예상 보관 기간이, 예를 들어 24개월이면, 활성 측정은 예를 들어 매달 수행할 수 있다. 예상되는 보관 기간 말에 단백 분해 활성의 허용 가능한 손실율은 주로 예상되는 임상학적 적용에 따라서 달라질 것이지만, 통상적으로는 예를 들어 10% 내지 15% 이하일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체를 생산하는 방법 즉, 자체의 촉매 도메인 내에, P 위치의 내부 아미노산과의 펩티드 결합이, P 위치의 내부 아미노산과의 펩티드 결합이 자가 단백 분해될 가능성이 적거나 아예 없는 아미노산으로, 자가 단백 분해될 가능성이 있는 P 위치에 존재하는, 하나 이상의 내부 아미노산의 돌연변이를 포함하는 플라스미노겐을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 방법은
(i) 본 발명에 의한 플라스미노겐을 발현할 수 있는 적당한 숙주 세포 내에 상기 플라스미노겐을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계;
(ii) 상기 숙주 세포 내에서 상기 플라스미노겐 발현에 충분한 시간 동안 및 이에 충분한 조건 하에 (i)에서 얻어진 숙주 세포를 생육하는 단계; 및
(iii) (ii)에서 발현된 플라스미노겐을 수확하는 단계
를 포함한다.
마지막으로, (iii)에서 수확한 플라스미노겐을 정제하는 단계를 포함하는 단계 (iv)를 이와 같은 방법에 추가할 수 있다.
적당한 숙주 세포와, 발현 및 생산 방법은 예를 들어 WO 90/13640호(곤충 세포), WO 2002/050290호 및 WO 03/066842호(효모 세포), WO 2008/054592호(박테리아 세포/리폴딩 과정) 및 WO 2005/078109호(좀 개구리밥 유전자 이식 식물 또는 유전자 이식 식물 세포)에 개시되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라서 플라스민 변이체를 제조하는 방법, 즉 자체의 촉매 도메인 내 [P+/-n](여기서, n은 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수임) 위치에서 하나 이상의 내부 아미노산의 돌연변이를 포함하는 플라스민을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 P 위치에서 내부 아미노산과 상기 [P+/-n] 위치의 내부 아미노산 간 펩티드 결합은 P 위치에서 내부 아미노산과의 펩티드 결합이 자가 단백 분해되는 경향이 작거나 자가 단백 분해되는 경향이 아예 없는 아미노산으로 자가 단백 분해되는 경향이 있다. 이와 같은 방법은 일반적으로 상기 기술한 바와 같이 본 발명에 의한 플라스미노겐을 생산하는 단계를 포함하며, 또한 적당한 플라스미노겐 활성 인자(예를 들어, tPA, uPA, 유로키나제, 스트렙토키나제, 스타필로키나제 또는 이의 임의의 변이체)를 사용하여 본 발명에 의한 플라스미노겐을 본 발명에 의한 플라스민으로 활성화하는 단계도 추가로 포함한다. 결론적으로, 활성화 단계를 수행하기 전에 플라스미노겐을 정제하고, 활성화된 플라스민을 정제하며/정제하거나, 활성 플라스민을 상기 기술한 바와 같이 유도체화하고/유도체화하거나 가역적으로 불활성화하며/불활성화하거나, 선택적으로 적당한 보관 조건(예를 들어, 안정화 용액, 동결 건조 온도 및/또는 저온)을 조성하는 하나 이상의 단계들을 추가할 수 있다.
상기 제조 방법들 중 임의의 방법에 있어서, 상기 촉매 도메인은 P, P', P" 등의 위치 중 하나 이상에서 야생형 리신 또는 아르기닌의 리신 이외의 아미노산 또는 아르기닌 이외의 아미노산으로의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기술한 바와 같은 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체 중 임의의 것은 우선적으로 (예를 들어, 파지 전시의 경우에 있어서) 유리된 형태 또는 가용성 형태(예를 들어, 발현 숙주의 표면에 부착되거나 또는 결합되지 않은 형태)로 얻어진다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 플라스미노겐 변이체 또는 플라스민 변이체를 암호화하는 (하나의) 분리된 핵산 서열(들)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이와 같은 핵산을 포함하는 (하나의) 재조합 벡터(들)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이와 같은 핵산이나 이와 같은 재조합 벡터로 형질 전환된 (하나의) 숙주 세포(들)에 관한 것이다.
실시예
실시예
1.
플라스미노겐
변이체의
구성, 발현 및 정제와,
플라스민으로의
활성화
발현 벡터
인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation; 미국 캘리포니아 칼스배드 소재)으로부터 구입한 pPICZαA 분비 벡터를 사용하여 피치아 파스토리스(Pichia Pastoris) 내에서 재조합 사람 마이크로플라스미노겐을 발현 및 분비시켰다.
상기 벡터는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) α-인자 프리프로펩티드의 분비 시그널을 포함한다. XhoI 인지 서열은, 성숙한 단백질로부터 분비 시그널을 제거하는 Kex2에 의해 절단되는 Lys-Arg 위치의 바로 상류인, α-인자 분비 시그널의 COOH-말단에 존재한다. XhoI 제한 위치는, 5' 말단에 XhoI 및 Kex2 인지 위치를 가지는 유전자를 합성함으로써, 관심 있는 유전자(Kex2 절단 위치 포함)를 클로닝하는데 사용될 수 있다. 이후, 관심있는 재조합 유전자를, 천연 NH2-말단을 가지도록 발현시킬 것이다. 유전자 조작된 pPICZαA 벡터 내 α-인자 분비 시그널의 바로 하류는, 이종 유전자의 클로닝을 촉진하는 제한 효소 EcoRI, SfiI, KpnI, SacII 및 XbaI에 대한 인지 위치를 포함하는 다중 클로닝 위치이다.
유전자 합성
피치아 파스토리스 내에서 사람 마이크로플라스미노겐의 발현을 개선하기 위하여, 피치아 파스토리스가 선호하는 코돈 사용을 고려하여 사람 마이크로플라스민미노겐 및 이의 변이체를 암호화하는 유전자를 신생 합성하였다.
코돈 최적화 유전자 서열을 설계하기 위하여, 사람 마이크로플라스미노겐 아미노산 서열(서열 번호 19)을 진 디자이너(Gene Designer) 프로그램(DNA2.0(캘리포니아 멘로 파크 소재)에 의해 개발된 프로그램으로서, 인터넷 상에서 자유롭게 이용 가능함)에 입력하였다. 상기 프로그램에 제공된, 피치아 파스토리스 코돈 용례표를 이용하여 이 서열을 DNA로 역번역하였다. 이후, 뉴클레오티드 서열을 수동으로 체크한 다음, 에스케리치아 콜라이 코돈 용례에 더욱 적합하도록 맞추었다. 뿐만 아니라, 가능할 때 앞뒤 역순으로 동일한 서열인 6-염기쌍 서열(6-base pair palindromic sequence) 및 뉴클레오티드 반복부를 제거하였다. 5' 말단에는 XhoI 제한 위치와 Kex2 절단 위치가 부가되었고, 3' 말단에는 XbaI 제한 위치가 부가되었다. 생성된 서열은 국제 특허 출원 PCT/EP2010/059902호에 개시되어 있다.
아미노산 잔기를 바꾸기 위해서, 퀵체인지(QuickChange) II 위치 배향 돌연변이 유발 키트(미국 캘리포니아 라졸라 소재, 애질런트(Agilent))를 사용하는 위치 배향 돌연변이 유발법에 의해, 돌연변이가 야생형 마이크로플라스미노겐 서열 또는 변이체 마이크로플라스미노겐 서열에 도입되었다(이 경우, 특이적 자가 촉매 절단 위치는 이미 변이됨(국제 특허 출원 PCT/EP2010/059902호 참조)). 이.콜라이(E. coli) 균주 TOP10(인비트로겐(Invitrogen))은 위치 배향 돌연변이 유발 혼합물로 형질 전환되었으며, 이후, 암피실린 저항성 클론이 선별되었다. 생성된 플라스미드 클론 서열의 분석 결과, 표적화된 마이크로플라스미노겐 암호화 영역이 정확히 돌연변이되어서, 암호화 영역에는 원치 않는 돌연변이가 존재하지 않음이 확인되었다.
이하 프라이머들이 위치 배향 돌연변이 유발법에 사용되었다:
Glu138Gln
돌연변이
GTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAA CAG GCACAATTACCTGTGATTG (센스; 서열 번호 20) 및
CAATCACAGGTAATTGTGC CTG TTTCAACAGACCAGCACCGAAC) (안티센스; 서열 번호 21).
제1 변이체에서, 138번 위치의 글루타메이트는 글루타민으로 치환된다. Glu138은 481번 내지 483번 위치의 코돈 GAA에 의해 암호화된다. 뉴클레오티드 GAA(481번 내지 483번 위치)는 CAG로 변이되었으며, 그 결과, 마이크로플라스미노겐 단백질 중 Glu138은 Gln으로 바뀌었다(이 경우, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 22 내에 있으며, 서열 번호 23의 서열은 이의 추론 아미노산 서열임).
제2 변이체에서, 138번 위치의 글루타메이트는 상기와 바와 같이 147번 위치의 리신이 이미 글루타메이트에 의해 치환된 변이체 마이크로플라스미노겐 중 글루타민으로 치환된다(이 경우, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 24 내에 있으며, 서열 번호 25의 서열은 이의 추론 아미노산 서열임).
제3 변이체에서, 138번 위치의 글루타메이트는 상기와 바와 같이 147번 위치의 리신이 이미 히스티딘에 의해 치환되었고, 158번 위치의 아르기닌이 이미 히스티딘에 의해 치환된 변이체 마이크로플라스미노겐 중 글루타민으로 치환된다(이 경우, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 26 내에 있으며, 서열 번호 27의 서열은 이의 추론 아미노산 서열임).
마이크로플라스미노겐
변이체의
발현 및
플라스민으로의
활성화
피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 상청액으로부터 직접 유래되는 마이크로플라스미노겐 돌연변이체를 활성화하기에 앞서, 이 돌연변이체는 면역 친화성에 의해 정제되었다. 쥐과 동물 항 사람 마이크로플라스민 항체(항원으로서 마이크로플라스민을 이용하여 Balb/c 마우스 내에서 생성 촉진되었으며; 트롬보제닉스 엔.브이.(ThromboGenics N.V.)로부터 입수 가능한 하이브리도마 세포주 5D10A4에 의해 생산됨)는 GE 헬스케어(GE Healthcare)의 No 71500015AD 프로토콜에 따라 세파로스 비드에 결합되었다. 이 프로토콜에 따라서, 면역 친화성 수지 7.5㎖는 항체 45㎎으로 제조되었으며, 이후 이는 XK 16/20 컬럼에 팩킹되었다. 미정제 상청액 200㎖ 내지 400㎖(피치아 배양액으로부터 여과, 0.2μ, pH6.0)는 5D10A4 친화성 컬럼 상에 직접 로딩되었다. 세정 단계(100mM KH2PO4, 0.5M NaCl, pH 6.2, 10컬럼 부피) 후, 마이크로플라스미노겐 변이체는 0.2M 글리신-HCl(pH 3.0 완충액)과 함께 용리되었으며, 이후, 이 용리액은 중화된 다음, 25mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)에 대해 투석되었다.
본질적으로 WO 02/50290호의 실시예 2에 개략적으로 기술된 방법에 따라서 마이크로플라스민 변이체를 활성화하였다.
예를 들어 전술된 돌연변이체 마이크로플라스미노겐 E138Q 및 이와 상응하는 활성화 마이크로플라스민을 도 3에 보였다.
전술한 야생형 및 변이체 마이크로플라스미노겐 종의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은 이하 나열되어 있다.
서열 번호 19 - 야생형 사람
마이크로플라스미노겐
아미노산 서열
apsfdcgkpqvepkkcpgrvvggcvahphswpwqvslrtrfgmhfcggtlispewvltaahcleksprpssykvilgahqevnlephvqeievsrlfleptrkdiallklsspavitdkvipaclpspnyvvadrtecfitgwgetqgtfgagllkeaqlpvienkvcnryeflngrvqstelcaghlaggtdscqgdsggplvcfekdkyilqgvtswglgcarpnkpgvyvrvsrfvtwiegvmrnn
서열 번호 22 -
Glu138Gln
치환이 일어난
마이크로플라스미노겐
변이체(
돌연변이된
코돈은 굵은 이탤릭체에 밑줄을 쳐서 표시되었으며,
XhoI
및
XbaI
위치는 밑줄만 쳐서 표시됨)
CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAA CAG GCACAATTACCTGTGATTGAGAACAAGGTTTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTGTTCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA
서열 번호 23 - 서열 번호 22의 추론 아미노산 서열(밑줄 친 N-말단 아미노산 “L
E
KR”은 삽입된
XhoI
+
Kex2
절단 위치에 의해 암호화되고; 도입된 아미노산 돌연변이는 굵은 이탤릭체에 밑줄을 쳐서 표시됨)
LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLK Q AQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN
서열 번호 24 -
Glu138Gln
및
Lys147Glu
치환이 일어난
마이크로플라스미노겐
변이체(
돌연변이된
코돈은 굵은 이탤릭체에 밑줄을 쳐서 표시되었으며,
XhoI
및 XbaI은 밑줄을 쳐서 표시됨)
CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAA CAG GCACAATTACCTGTGATTGAGAAC GAA GTGTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTGTTCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA
서열 번호 25 - 서열 번호 24의 추론된 아미노산 서열(
밑줄 쳐서
표시된 N-말단 아미노산“
LEKR
”은 삽입된
XhoI
+
Kex2
절단 위치에 의해 암호화되며; 도입된 아미노산 돌연변이는 굵은 이탤릭체에 밑줄을 쳐서 표시됨)
LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLK Q AQLPVIEN E VCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN
서열 번호 26 -
Glu138Gln
,
Lys147His
및
Arg158His
치환이 일어난
마이크로플라스미노겐
변이체(
돌연변이된
코돈은 굵은 이탤릭체에 밑줄을 쳐서 표시되었으며, XhoI 및
XbaI
은 밑줄을 쳐서 표시됨)
CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAA CAG GCACAATTACCTGTGATTGAGAAC CAC GTGTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGA CAC GTGCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA
서열 번호 27 - 서열 번호 26의 추론된 아미노산 서열(
밑줄 쳐서
표시된 N-말단 아미노산“
LEKR
”은 삽입된
XhoI
+
Kex2
절단 위치에 의해 암호화되고; 도입된 아미노산 돌연변이는 굵은 이탤릭체에 밑줄을 쳐서 표시됨)
LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLK Q AQLPVIEN H VCNRYEFLNG H VQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN
마이크로플라스민
변이체의
자가 분해 속도 상수 및 동력학적 매개 변수
다양한 마이크로플라스민 돌연변이체에 대해 구하여진 kcat/Km 및 자가 분해 속도 상수 수치가 이하 표 2에 나열되어 있다. 이하 수치들은 본질적으로 국제 특허 출원 PCT/EP2010/059902호의 실시예 3 및 4에 개시된 방법에 따라서 구하여졌다.
| 마이크로플라스민 변이체 |
동력학적 매개 변수
K cat / Km (M -1 s -1 ) |
자가 분해 속도 상수
k(M -1 s -1 ) |
| 야생형 | 6.9×105 | 123 |
| K147E | 8.5×105 | 24 |
| E138Q | 9.5×105 | 4 |
| E138Q K147E | 10.9×105 | 2 |
| E138Q K147H R158H | 5.5×105 | 6 |
실시예
2. 시험관 내 또는 생체 내 모델에 있어서,
플라스민
변이체의
치료 효능
2.1 뇌경색 크기에 미치는
플라스민
변이체의
효과
쥣과동물 뇌경색 모델 내에서 뇌경색 크기를 감소시키는데 있어서 본 발명의 플라스민 변이체의 효능을, 예를 들어 WO 00/18436호의 실시예 2의 기술, 또는 문헌[Welsh et al., 1987, J Neurochem 49, 846-851]에 따라서 수행할 수 있다. 야생형 플라스민이 뇌경색 크기에 미치는 유리한 효과에 관하여는 WO 00/18436호의 실시예 5에 설명되어 있다. 본 발명의 플라스민 변이체 중 임의의 것을 이용하여 유사한 실험을 수행하였으며, 이와 같은 플라스민 변이체의 유리한 효과를 측정한 다음, 이를 야생형 플라스민의 유리한 효과와 비교하였다.
2.2
플라스민
변이체의
생체 내 혈전 용해 활성
토끼 체외 루프 혈전 용해 모델(WO 02/50290호의 실시예 6; Hotchkiss et al., 1987, Thromb Haemost 58, 107 - Abstract 377), 개의 회선 관상 동맥 구리 코일-유도성 혈전증 모델(WO 02/50290호의 실시예 8; Bergmann et al., 1983, Science 220, 1181-1183) 또는 토끼의 경정맥 혈전증 모델(Collen et al., 1983, J Clin Invest 71, 368-376)을 사용하여 본 발명의 플라스민 변이체의 생체 내 혈전 용해 활성을 입증할 수 있었다. 문헌[WO 00/18436호의 실시예 7 및 9; Collen et al. (1983)]에 기술된 바와 같이, 상기 모델들을 사용하여 혈전 용해에 대한 야생형 플라스민의 유리한 효과를 입증하였다. 본 발명의 플라스민 변이체 중 임의의 것을 사용하여 유사한 실험을 수행하였으며, 상기 플라스민 변이체의 유리한 효과를 측정하여, 이를 야생형 플라스민의 유리한 효과와 비교하였다.
2.3
플라스민
변이체의
시험관 내 혈전 용해 활성
말초 동맥 폐색증(PAO)의 시험관 내 모델은 WO 01/36609호의 실시예 6에 기술되어 있으며, 야생형 플라스민의 혈전 용해 효능에 관하여는 이 모델을 사용하여 입증하였다. 본 발명의 플라스민 변이체 중 임의의 것을 이용하여 유사한 실험을 수행하였으며, 말초 동맥 폐색증의 혈전 용해에 대한 이 플라스민 변이체의 유리한 효과를 측정하여, 이를 야생형 플라스민의 유리한 효과와 비교하였다.
2.4
플라스민
변이체에
의해 유도된 안구의 유리체 액화 및
후유리체
박리
WO 2004/052228호의 실시예 5에는 효능을 측정하는 분석법과, 사후 돼지 안구 유리체가 액화되는데 있어서 마이크로플라스민의 효능에 관하여 개시되어 있다. WO 2004/052228호의 실시예 6에는 효능을 측정하는 분석법과, 사후 사람 안구의 후유리체 박리 현상(PVD)을 유도함에 있어서 마이크로플라스민의 효능에 관하여 개시되어 있다. 본 발명의 플라스민 변이체에 의한 유리체 액화 및 PVD의 유도 현상은 유사한 사후 모델을 대상으로 행하여졌다.
2.5
플라스민
변이체에
의해 유도된 생체 내
PVD
WO 2004/052228호의 실시예 7에는 효능을 측정하는 분석법과, 고양이과 동물의 생체 내 모델 내에서 PVD를 유도함에 있어서 마이크로플라스민의 효능에 관하여 개시되어 있다. 본 발명의 플라스민 변이체에 의해 PVD가 유도된다는 사실은 유사한 생체 내 모델을 통하여 입증하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> ThromboGenics N.V.
<120> Plasminogen and plasmin variants
<130> TG-041
<150> EP 11 150 246
<151> 2011-01-05
<150> US 61/429,868
<151> 2011-01-05
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 791
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser
1 5 10 15
Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala
20 25 30
Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His
35 40 45
Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser
50 55 60
Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met
85 90 95
Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser
100 105 110
Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu
115 120 125
Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp
130 135 140
Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu
145 150 155 160
Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly
165 170 175
Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser
180 185 190
Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys
195 200 205
Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro
210 215 220
Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile
225 230 235 240
Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys
245 250 255
Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val
260 265 270
Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His
275 280 285
Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr
290 295 300
Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn
305 310 315 320
Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser
325 330 335
Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr
340 345 350
Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly
355 360 365
Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser
370 375 380
Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala
385 390 395 400
Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro
405 410 415
Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu
420 425 430
Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val
435 440 445
Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe
450 455 460
Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly
465 470 475 480
Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile
485 490 495
Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys
500 505 510
Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn
515 520 525
Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro
530 535 540
Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly
545 550 555 560
Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln
565 570 575
Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu
580 585 590
Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser
595 600 605
Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val
610 615 620
Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu
625 630 635 640
Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala
645 650 655
Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr
660 665 670
Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr
675 680 685
Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val
690 695 700
Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val
705 710 715 720
Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser
725 730 735
Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys
740 745 750
Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro
755 760 765
Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile
770 775 780
Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
785 790
<210> 2
<211> 812
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 2
Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly His Gly Ser Leu Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser
20 25 30
Val Phe Ser Leu Thr Lys Lys Gln Leu Ser Val Gly Ser Ile Glu Glu
35 40 45
Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Glu Thr Gly Phe Ile Cys Arg Ser Phe
50 55 60
Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Pro Glu Asn Ser
65 70 75 80
Lys Ser Ser Ile Val Phe Arg Met Arg Asp Val Phe Leu Phe Glu Lys
85 90 95
Arg Ile Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Thr Tyr Arg
100 105 110
Gly Thr Met Ala Lys Thr Lys Asn Asp Val Ala Cys Gln Lys Trp Ser
115 120 125
Asp Asn Ser Pro His Lys Pro Asn Tyr Thr Pro Glu Lys His Pro Leu
130 135 140
Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Asn
145 150 155 160
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Val Arg Phe Asp Tyr Cys
165 170 175
Asn Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn
180 185 190
Tyr Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Lys Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala
195 200 205
Trp Asn Ser Gln Thr Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe
210 215 220
Pro Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu
225 230 235 240
Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Phe
245 250 255
Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Ser Gly Pro Thr
260 265 270
Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Lys Val Ser
275 280 285
Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Glu Gln Thr Pro
290 295 300
His Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp
305 310 315 320
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr
325 330 335
Thr Thr Asn Ser Glu Val Arg Trp Glu His Cys Gln Ile Pro Ser Cys
340 345 350
Glu Ser Ser Pro Ile Thr Thr Glu Tyr Leu Asp Ala Pro Ala Ser Val
355 360 365
Pro Pro Glu Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly
370 375 380
Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys
385 390 395 400
Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Glu Lys Thr Pro Glu
405 410 415
His Phe Pro Glu Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp
420 425 430
Ala Asp Lys Ser Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp
435 440 445
Glu Phe Cys Asn Leu Arg Lys Cys Leu Asp Pro Glu Ala Ser Ala Thr
450 455 460
Asn Ser Pro Ala Val Pro Gln Val Pro Ser Gly Gln Glu Pro Ser Ala
465 470 475 480
Ser Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys Ala
485 490 495
Thr Thr Val Met Gly Ile Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu Pro
500 505 510
His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Gln Ala Gly Leu
515 520 525
Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Asn Gly Pro Trp
530 535 540
Cys Tyr Thr Met Asn Gln Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asp Val Pro
545 550 555 560
Gln Cys Val Ser Thr Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro
565 570 575
Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala Asn Pro His
580 585 590
Ser Trp Pro Trp Gln Ile Ser Leu Arg Thr Arg Tyr Gly Lys His Phe
595 600 605
Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His
610 615 620
Cys Leu Glu Arg Ser Ser Arg Pro Ala Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly
625 630 635 640
Ala His Lys Glu Val Asn Leu Glu Ser Asp Val Gln Glu Ile Glu Val
645 650 655
Tyr Lys Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Ala Asp Ile Ala Leu Leu Lys
660 665 670
Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Ser Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu
675 680 685
Pro Pro Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Leu Cys Tyr Ile Thr
690 695 700
Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu
705 710 715 720
Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Tyr
725 730 735
Leu Asn Gly Arg Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly Asn Leu Ala
740 745 750
Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
755 760 765
Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu
770 775 780
Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg
785 790 795 800
Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Ile Met Arg Asn Asn
805 810
<210> 3
<211> 810
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<400> 3
Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu
35 40 45
Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Lys Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe
50 55 60
Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg
65 70 75 80
Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys
85 90 95
Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg
100 105 110
Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser
115 120 125
Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser
130 135 140
Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln
145 150 155 160
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys
165 170 175
Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn
180 185 190
Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala
195 200 205
Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe
210 215 220
Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu
225 230 235 240
Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu
245 250 255
Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr
260 265 270
Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala
275 280 285
Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro
290 295 300
His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp
305 310 315 320
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His
325 330 335
Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys
340 345 350
Asp Ser Ser Leu Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro
355 360 365
Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser
370 375 380
Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser
385 390 395 400
Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr
405 410 415
Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp
420 425 430
Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr
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<213> Sus scrofa
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His Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu
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Thr Thr Asp Ser Glu Val Arg Trp Asp Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys
340 345 350
Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Glu Tyr Leu Asp Ala Pro Val Pro Pro
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370 375 380
Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln Ser
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Pro Ala Ile Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Thr Pro
675 680 685
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Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Tyr Leu Gly Gly
725 730 735
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755 760 765
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<211> 812
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<213> Mus musculus
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Cys Leu Glu Lys Ser Ser Arg Pro Glu Phe Tyr Lys Val Ile Leu Gly
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<213> Rattus norvegicus
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450 455 460
Ala Ile Val Pro Gln Val Pro Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Thr Asp
465 470 475 480
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485 490 495
Ala Ala Gly Thr Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Ser
500 505 510
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Ala Ser Leu Ser Ser Phe Glu Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys
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Trp Pro Trp Gln Ile Ser Leu Arg Thr Arg Phe Ser Gly Gln His Phe
595 600 605
Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His
610 615 620
Cys Leu Glu Lys Ser Ser Arg Pro Glu Phe Tyr Lys Val Ile Leu Gly
625 630 635 640
Ala His Glu Glu Arg Ile Leu Gly Ser Asp Val Gln Gln Ile Ala Val
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Thr Lys Leu Val Leu Glu Pro Asn Asp Ala Asp Ile Ala Leu Leu Lys
660 665 670
Leu Ser Arg Pro Ala Thr Ile Thr Asp Asn Val Ile Pro Ala Cys Leu
675 680 685
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690 695 700
Gly Trp Gly Glu Thr Lys Gly Thr Pro Gly Ala Gly Arg Leu Lys Glu
705 710 715 720
Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Ala Glu Tyr
725 730 735
Leu Asn Asn Arg Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala
740 745 750
Gly Gly Ile Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
755 760 765
Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu
770 775 780
Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg
785 790 795 800
Tyr Val Asn Trp Ile Glu Arg Glu Met Arg Asn Asp
805 810
<210> 13
<211> 811
<212> PRT
<213> Erinaceus europaeus
<400> 13
Met Gln Arg Lys Glu Leu Val Leu Leu Phe Leu Leu Phe Leu Gln Pro
1 5 10 15
Gly His Gly Ile Pro Leu Asp Asp Tyr Val Thr Thr Gln Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Ser Ser Ser Thr Lys Lys Gln Leu Ser Val Gly Ser Thr Glu Glu
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130 135 140
Glu Gly Leu Asp Gln Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Lys
145 150 155 160
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Met Asp Pro Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Cys
165 170 175
Glu Ile Ile Gln Cys Glu Asp Glu Cys Met His Cys Ser Gly Gln Asn
180 185 190
Tyr Val Gly Lys Ile Ser Arg Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Pro
195 200 205
Trp Asp Ser Gln Ile Pro His Pro His Gly Phe Ile Pro Ser Lys Phe
210 215 220
Pro Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu
225 230 235 240
Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Arg Asn Lys Arg Trp Glu Tyr
245 250 255
Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Ser Gly Pro Thr
260 265 270
Tyr Gln Cys Leu Met Gly Asn Gly Glu His Tyr Gln Gly Asn Val Ala
275 280 285
Val Thr Val Ser Gly Leu Thr Cys Gln Arg Trp Gly Glu Gln Ser Pro
290 295 300
His Arg His Asp Arg Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Cys Lys Asn Leu Asp
305 310 315 320
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro Ala Pro Trp Cys Phe
325 330 335
Thr Thr Asn Ser Ser Val Arg Trp Glu Phe Cys Lys Ile Pro Asp Cys
340 345 350
Val Ser Ser Ala Ser Glu Thr Glu His Ser Asp Ala Pro Val Ile Val
355 360 365
Pro Pro Glu Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Gly Asn Gly
370 375 380
Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys
385 390 395 400
Gln Pro Trp Thr Ser Met Arg Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu
405 410 415
Asn Tyr Pro Asp Ala Asp Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp
420 425 430
Gly Asp Lys Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp
435 440 445
Glu Phe Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Met Ser Ala Thr
450 455 460
Asn Ser Ser Pro Val Gln Val Ser Ser Ala Ser Glu Ser Ser Glu Gln
465 470 475 480
Asp Cys Ile Ile Asp Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Thr Lys Ala Thr
485 490 495
Thr Gly Ala Gly Thr Pro Cys Gln Ala Trp Ala Ala Gln Glu Pro His
500 505 510
Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Asp Leu Gln
515 520 525
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Asn Gly Pro Trp Cys
530 535 540
Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asp Ile Pro His
545 550 555 560
Cys Val Ser Pro Ser Ser Ala Asp Cys Gly Lys Pro Lys Val Glu Pro
565 570 575
Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala Asn Pro His
580 585 590
Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Arg Phe Gly Gln His Phe Cys
595 600 605
Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys
610 615 620
Leu Glu Lys Phe Ser Asn Pro Ala Ile Tyr Lys Val Val Leu Gly Ala
625 630 635 640
His Gln Glu Thr Arg Leu Glu Arg Asp Val Gln Ile Lys Gly Val Thr
645 650 655
Lys Met Phe Leu Glu Pro Tyr Arg Ala Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu
660 665 670
Ser Ser Pro Ala Ile Ile Thr Asp Lys Ile Ile Pro Ala Cys Leu Pro
675 680 685
Asn Ser Asn Tyr Met Val Ala Asp Arg Ser Leu Cys Tyr Ile Thr Gly
690 695 700
Trp Gly Glu Thr Lys Gly Thr Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala
705 710 715 720
Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Gln Glu Leu Leu
725 730 735
Asn Gly Arg Val Arg Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly
740 745 750
Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe
755 760 765
Glu Lys Asp Arg Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly
770 775 780
Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Tyr
785 790 795 800
Val Ser Trp Leu Gln Asp Val Met Arg Asn Asn
805 810
<210> 14
<211> 780
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 14
Met Glu Gln Arg Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Pro
1 5 10 15
Gly Gln Ala Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Phe Ser Phe Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Ala Ser Ile Ala Glu
35 40 45
Cys Ala Ala Arg Cys Glu Ala Glu Thr Glu Phe Thr Cys Arg Ser Phe
50 55 60
Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Val Met Ala Glu Asn Ser
65 70 75 80
Lys Ser Ser Ala Ile Ile Arg Arg Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys
85 90 95
Arg Met Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Ile Gly Asn Gly Arg Ser Tyr Arg
100 105 110
Gly Thr Lys Ser Lys Thr Lys Thr Gly Phe Thr Cys Gln Lys Trp Ser
115 120 125
Ser Ser Tyr Pro His Lys Pro Asn Phe Thr Pro Lys Lys Tyr Pro Ala
130 135 140
Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gln
145 150 155 160
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Glu Arg Phe Asp Tyr Cys
165 170 175
Asp Ile Pro Glu Cys Glu Asp Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn
180 185 190
Tyr Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Ile Glu Cys Gln Ala
195 200 205
Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe
210 215 220
Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu
225 230 235 240
Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Pro Lys Lys Arg Trp Glu Leu
245 250 255
Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Ser Gly Pro Thr
260 265 270
His Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Lys Val Ala
275 280 285
Arg Thr Lys Ser Gly Leu Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro
290 295 300
His Leu His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asp Leu Asp
305 310 315 320
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Ser Ala Pro Trp Cys Tyr
325 330 335
Thr Thr Asp Ser Lys Val Arg Trp Glu His Cys Asp Ile Pro Ser Cys
340 345 350
Ala Ser Ser Pro Thr Ser Val Glu Pro Leu Asp Ala Pro Ala Pro Pro
355 360 365
Glu Glu Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Gly Asn Gly Gln Ser
370 375 380
Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln Ser
385 390 395 400
Trp Leu Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Arg Thr Pro Gln Asn Tyr
405 410 415
Pro Asn Ala Asp Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp
420 425 430
Ile Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr
435 440 445
Cys Asn Leu Arg Arg Cys Ser Glu Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Thr
450 455 460
Val Pro Thr Ala Gln Leu Pro Arg Pro Glu Ala Thr Phe Glu Pro Asp
465 470 475 480
Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys Ala Thr Thr
485 490 495
Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gln Gly Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg
500 505 510
His Asn Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Arg
515 520 525
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Thr Asn Gly Pro Trp Cys Tyr
530 535 540
Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys
545 550 555 560
Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Asp Cys Gly Lys Pro Lys Val Glu Pro Lys
565 570 575
Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala Asn Pro His Ser
580 585 590
Trp Pro Trp Gln Ile Ser Leu Arg Thr Arg Thr Gly Gln His Phe Cys
595 600 605
Gly Gly Thr Leu Ile Ala Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys
610 615 620
Leu Glu Lys Tyr Pro Arg Pro Ser Ala Tyr Arg Val Ile Leu Gly Ala
625 630 635 640
His Lys Glu Val Asn Leu Glu Leu Asp Val Gln Asp Ile Asp Val Ala
645 650 655
Lys Leu Phe Leu Glu Pro Ser Arg Ala Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu
660 665 670
Ser Ser Leu Glu Trp Ala Trp Thr Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu
675 680 685
Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Phe Glu Tyr
690 695 700
Leu Asn Gly Arg Val Arg Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala
705 710 715 720
Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
725 730 735
Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu
740 745 750
Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg
755 760 765
Phe Val Asp Trp Ile Glu Arg Thr Met Arg Asn Asn
770 775 780
<210> 15
<211> 827
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<400> 15
Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu
35 40 45
Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Lys Glu Phe Thr Cys Arg Tyr Phe
50 55 60
His Cys Arg Cys Thr Tyr Pro Glu Ile Cys Asn Ser Asp Gly Lys Ala
65 70 75 80
Phe Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn
85 90 95
Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu
100 105 110
Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr
115 120 125
Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp
130 135 140
Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro
145 150 155 160
Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro
165 170 175
Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr
180 185 190
Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu
195 200 205
Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln
210 215 220
Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys
225 230 235 240
Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly
245 250 255
Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu
260 265 270
Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro
275 280 285
Thr Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val
290 295 300
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305 310 315 320
Pro His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu
325 330 335
Asp Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys
340 345 350
His Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser
355 360 365
Cys Asp Ser Ser Leu Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro
370 375 380
Pro Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln
385 390 395 400
Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln
405 410 415
Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn
420 425 430
Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala
435 440 445
Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu
450 455 460
Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala
465 470 475 480
Pro Pro Pro Val Val Gln Leu Pro Asn Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu
485 490 495
Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr
500 505 510
Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His
515 520 525
Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu
530 535 540
Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys
545 550 555 560
Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln
565 570 575
Cys Ala Ser Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys
580 585 590
Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser
595 600 605
Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Leu Gly Met His Phe Cys
610 615 620
Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys
625 630 635 640
Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala
645 650 655
His Gln Glu Val Lys Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser
660 665 670
Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Thr Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu
675 680 685
Ser Ser Pro Ala Ile Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro
690 695 700
Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly
705 710 715 720
Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala
725 730 735
Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Asn Glu Phe Leu
740 745 750
Asn Gly Arg Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly
755 760 765
Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe
770 775 780
Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly
785 790 795 800
Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe
805 810 815
Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
820 825
<210> 16
<211> 769
<212> PRT
<213> Ailuropoda melanoleuca
<400> 16
Phe Val Arg Arg Ser Phe Glu Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Ala
1 5 10 15
Ile Met Ala Glu Asn Ser Lys Ser Ser Ala Val Phe Arg Met Arg Asp
20 25 30
Val Ile Leu Phe Gln Lys Arg Ile Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly
35 40 45
Asn Gly Lys Thr Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Val
50 55 60
Ala Cys Gln Lys Trp Ser Asp Thr Phe Pro His Lys Pro Asn Tyr Thr
65 70 75 80
Pro Glu Lys His Pro Leu Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn
85 90 95
Pro Asp Asn Asp Glu Lys Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asn
100 105 110
Gln Arg Phe Asp Tyr Cys Ser Ile Pro Gln Cys Glu Asp Glu Cys Met
115 120 125
His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Glu Gly Lys Val Ser Lys Thr Lys Ser
130 135 140
Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asn Ser Gln Thr Pro His Ala His Gly
145 150 155 160
Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys
165 170 175
Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Pro
180 185 190
Asn Lys Arg Trp Glu Phe Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro
195 200 205
Pro Pro Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Lys Gly Glu Asn
210 215 220
Tyr Arg Gly Lys Val Ser Val Thr Ala Ser Gly His Thr Cys Gln Arg
225 230 235 240
Trp Ser Glu Gln Thr Pro His Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe
245 250 255
Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu
260 265 270
Ser Ala Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Ser Glu Val Arg Trp Glu His
275 280 285
Cys Ser Ile Pro Ser Cys Glu Ser Ser Pro Leu Thr Leu Asp Ser Leu
290 295 300
Asp Thr Pro Ala Ser Ile Pro Pro Glu Gln Thr Pro Val Val Gln Glu
305 310 315 320
Cys Tyr Gln Gly Asn Gly Gln Thr Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr
325 330 335
Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ser Pro His Arg
340 345 350
His Glu Lys Thr Pro Glu Arg Phe Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn
355 360 365
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Lys Ser Pro Trp Cys Tyr Thr Thr
370 375 380
Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Phe Cys Asn Leu Lys Lys Cys Leu Asp
385 390 395 400
Thr Glu Glu Ser Gly Thr Ser Ser Pro Thr Val Pro Gln Val Pro Ser
405 410 415
Gly Glu Glu Pro Ser Glu Thr Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly
420 425 430
Tyr Arg Gly Lys Lys Ala Thr Thr Val Leu Gly Ile Pro Cys Gln Glu
435 440 445
Trp Thr Ala Gln Glu Pro His Lys His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr
450 455 460
Asn Pro Arg Ala Glu His Leu Leu Cys Pro Thr Cys Leu Val Pro Ser
465 470 475 480
Val Pro Thr Val Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Leu Phe Leu Asp
485 490 495
Val Asn Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp
500 505 510
Tyr Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ala Ser Gly Ser Phe Asp Cys Gly Lys
515 520 525
Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys
530 535 540
Val Ala Asn Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Ile Ser Leu Arg Thr Arg
545 550 555 560
Phe Gly Gln His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val
565 570 575
Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Arg Ser Pro Arg Pro Ala Ala Tyr
580 585 590
Lys Val Ile Leu Gly Ala His Arg Glu Phe Asn Leu Glu Ser Asp Val
595 600 605
Gln Glu Ile Glu Val Ser Lys Leu Phe Leu Glu Pro Thr His Ala Asp
610 615 620
Ile Ala Leu Ile Lys Leu Gln Ser Pro Ala Val Leu Thr Ser Lys Val
625 630 635 640
Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr
645 650 655
Leu Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Val
660 665 670
Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys
675 680 685
Asn Arg Tyr Glu Tyr Leu Asn Gly Lys Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys
690 695 700
Ala Gly Asn Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly
705 710 715 720
Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val
725 730 735
Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr
740 745 750
Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Glu Ile Met Arg Asn
755 760 765
Asn
<210> 17
<211> 334
<212> PRT
<213> Papio hamadryas
<400> 17
Ile Arg Leu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Arg Tyr Arg Gly Lys
1 5 10 15
Lys Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Lys
20 25 30
Glu Pro His Ser His Leu Ile Phe Thr Pro Glu Thr Tyr Pro Arg Ala
35 40 45
Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly
50 55 60
Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp
65 70 75 80
Val Pro Gln Cys Ala Ser Ser Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val
85 90 95
Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His
100 105 110
Ala His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met
115 120 125
His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala
130 135 140
Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Phe Tyr Lys Val Ile
145 150 155 160
Leu Gly Ala His Gln Glu Val Arg Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile
165 170 175
Glu Val Ser Lys Met Phe Ser Glu Pro Ala Gly Ala Asp Ile Ala Leu
180 185 190
Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Ile Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala
195 200 205
Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe
210 215 220
Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Tyr Gly Ala Gly Leu Leu
225 230 235 240
Lys Glu Ala Arg Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr
245 250 255
Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His
260 265 270
Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
275 280 285
Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp
290 295 300
Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val
305 310 315 320
Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
325 330
<210> 18
<211> 343
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 18
Ala Pro Gln Ala Pro Ser Val Glu Asn Pro Pro Glu Ala Asp Cys Met
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys Ala Thr Thr Val Ala
20 25 30
Gly Val Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Gly
35 40 45
Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr
50 55 60
Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Asn Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr
65 70 75 80
Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asp Ile Pro Gln Cys Glu Ser
85 90 95
Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Lys Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Ala
100 105 110
Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala Thr Pro His Ser Trp Pro Trp Gln
115 120 125
Val Ser Leu Arg Arg Arg Ser Arg Glu His Phe Cys Gly Gly Thr Leu
130 135 140
Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Asp Ser Ile
145 150 155 160
Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Thr Val Ile Leu Gly Ala His Tyr Glu Met
165 170 175
Ala Arg Glu Ala Ser Val Gln Glu Ile Pro Val Ser Arg Leu Phe Leu
180 185 190
Glu Pro Ser Arg Ala Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala
195 200 205
Val Ile Thr Asp Glu Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr
210 215 220
Val Val Ala Asp Lys Thr Val Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr
225 230 235 240
Gln Gly Thr Phe Gly Val Gly Arg Leu Lys Glu Ala Arg Leu Pro Val
245 250 255
Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Tyr Leu Asn Gly Arg Val
260 265 270
Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly Asp Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser
275 280 285
Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys
290 295 300
Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro
305 310 315 320
Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Thr Tyr Val Pro Trp Ile
325 330 335
Glu Glu Thr Met Arg Arg Tyr
340
<210> 19
<211> 249
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys
1 5 10 15
Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro
20 25 30
Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly
35 40 45
Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu
50 55 60
Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln
65 70 75 80
Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu
85 90 95
Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser
100 105 110
Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro
115 120 125
Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly
130 135 140
Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu
145 150 155 160
Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly
165 170 175
Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr
180 185 190
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys
195 200 205
Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala
210 215 220
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Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
245
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ccaggtcgtg ttgtcggtgg ctgtgtggct catcctcatt cttggccttg gcaagtgtct 120
cttagaacta gatttggtat gcacttctgt ggtggcacct tgatctcacc tgaatgggtc 180
ttaaccgcag ctcattgtct ggagaagtca ccacgtccat cttcatacaa ggtcatcctt 240
ggcgcacatc aggaagtcaa tcttgagcct catgttcagg agatcgaagt ctctcgtttg 300
ttcttggaac caactcgtaa agacattgct cttctgaagc tgtcatctcc tgccgtgatt 360
accgacaagg taattcctgc ctgcttgcct agtcctaatt acgtcgttgc cgaccgtacc 420
gaatgcttca ttactggttg gggtgagact caaggtacgt tcggtgctgg tctgttgaaa 480
caggcacaat tacctgtgat tgagaacaag gtttgtaaca gatacgagtt cctgaatggt 540
cgtgttcagt ccactgagtt gtgtgcaggt caccttgcag gtggtactga tagttgtcaa 600
ggtgattctg gtggaccact ggtgtgcttc gagaaggata agtacatctt acaaggtgtt 660
acgtcttggg gtcttggatg tgctcgtcct aacaagccag gtgtctacgt cagagtctcc 720
agattcgtaa cttggatcga aggtgtcatg cgtaacaact aatctaga 768
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Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro
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His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His
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Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala
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His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu
65 70 75 80
Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu
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Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu
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Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys
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Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile
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Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Gln Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu
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ttaaccgcag ctcattgtct ggagaagtca ccacgtccat cttcatacaa ggtcatcctt 240
ggcgcacatc aggaagtcaa tcttgagcct catgttcagg agatcgaagt ctctcgtttg 300
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caggcacaat tacctgtgat tgagaacgaa gtgtgtaaca gatacgagtt cctgaatggt 540
cgtgttcagt ccactgagtt gtgtgcaggt caccttgcag gtggtactga tagttgtcaa 600
ggtgattctg gtggaccact ggtgtgcttc gagaaggata agtacatctt acaaggtgtt 660
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<222> (763)..(768)
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ctcgagaaaa gagcaccttc attcgactgt ggtaagcctc aggtcgaacc taagaagtgt 60
ccaggtcgtg ttgtcggtgg ctgtgtggct catcctcatt cttggccttg gcaagtgtct 120
cttagaacta gatttggtat gcacttctgt ggtggcacct tgatctcacc tgaatgggtc 180
ttaaccgcag ctcattgtct ggagaagtca ccacgtccat cttcatacaa ggtcatcctt 240
ggcgcacatc aggaagtcaa tcttgagcct catgttcagg agatcgaagt ctctcgtttg 300
ttcttggaac caactcgtaa agacattgct cttctgaagc tgtcatctcc tgccgtgatt 360
accgacaagg taattcctgc ctgcttgcct agtcctaatt acgtcgttgc cgaccgtacc 420
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caggcacaat tacctgtgat tgagaaccac gtgtgtaaca gatacgagtt cctgaatgga 540
cacgtgcagt ccactgagtt gtgtgcaggt caccttgcag gtggtactga tagttgtcaa 600
ggtgattctg gtggaccact ggtgtgcttc gagaaggata agtacatctt acaaggtgtt 660
acgtcttggg gtcttggatg tgctcgtcct aacaagccag gtgtctacgt cagagtctcc 720
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<223> E138Q K147H R158H mutant microplasmin
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<223> encoded by XhoI restriction site nucleotides
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<222> (3)..(4)
<223> KEX2 cleavage site
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Leu Glu Lys Arg Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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195 200 205
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210 215 220
Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser
225 230 235 240
Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
245 250
Claims (26)
- 분리된 플라스미노겐 변이체 또는 이로부터 얻어진 플라스민, 또는 분리된 플라스민 변이체, 또는 상기 플라스민들 중 임의의 것의 단백 분해 활성 또는 가역적 불활성 유도체로서,
(i) 자체의 촉매 도메인 내 P 내부 위치에 리신 또는 아르기닌을, 그리고 [P+/-n](여기서, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임) 위치에 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 포함함(여기서, [P+/-n] 위치의 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아님); 및
(ii) 상기 (i)의 돌연변이의 존재는 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 정도에 비하여 상기 플라스민 변이체의 자가 단백 분해 정도를 감소시킴(상기 감소는 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정됨)
을 특징으로 하는, 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체. - 제1항에 있어서, 자체의 촉매 도메인 내 다음과 같은 위치에 2개 이상의 내부 아미노산의 돌연변이를 포함하는 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체로서,
- [P+/-n] 및 [P+/-n'] 위치(여기서, n 및 n'는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; [P+/-n] 위치 및 [P+/-n'] 위치에서 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아니며; n 및 n'가 둘 다 P에 더하여지거나 P로부터 차감되면, n 및 n'는 서로 상이함); 또는
- [P+/-n] 및 [P'+/-n] 위치(여기서, P'는 P와 P'의 더 큰 값이고; P' 위치에서 아미노산은 리신 또는 아르기닌이며; n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; [P'+/-n] 위치에서 아미노산은 리신도 아니고 아르기닌도 아니며; [P+n] 및 [P'-n] 간 중첩 위치들이 존재한다면, 이 중첩 위치들은 배제됨);
여기서, 상기 2개 이상의 내부 아미노산 돌연변이의 존재는 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 정도에 비하여 상기 플라스민 변이체의 자가 단백 분해 정도를 감소시키는(상기 감소는 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정됨), 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체. - 제1항 또는 제2항에 있어서, P 및/또는 P' 위치 중 임의의 위치에서 리신 또는 아르기닌 아미노산을 포함한, 촉매 도메인의 리신 또는 아르기닌 아미노산 중 임의의 하나 이상의, 리신 이외의 아미노산 또는 아르기닌 이외의 아미노산으로의 돌연변이를 추가로 포함하는, 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, P 또는 P' 위치에서 상기 내부 아미노산은
(i) 사람 플라스민 촉매 도메인의 137번 위치에 있는 리신, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 리신 또는 아르기닌;
(ii) 사람 플라스민 촉매 도메인의 147번 위치에 있는 리신, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 리신 또는 아르기닌; 또는
(iii) 사람 플라스민 촉매 도메인의 158번 위치에 있는 아르기닌, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 아르기닌 또는 리신;
으로부터 선택되며, 여기서 상기 사람 플라스민 촉매 도메인은 1번 위치에서 발린 아미노산으로 시작하는데, 상기 발린 아미노산은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린 아미노산과 동일한, 플라스미노겐, 플라스민 또는 플라스민 유도체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, [P+/-n] 위치에서 상기 아미노산은 사람 플라스민 촉매 도메인의 138번 위치의 글루타메이트 아미노산이거나, 또는 이와 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민 촉매 도메인의 아미노산 잔기인, 플라스미노겐, 플라스민 또는 플라스민 유도체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 자체의 자가 분해 상수는 야생형 플라스민의 자가 분해 상수의 95% 이하인 것을 추가의 특징으로 하는 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 촉매 상수 kcat 는 야생형 플라스민 kcat의 10% 내지 200%의 범위인 것을 추가의 특징으로 하는 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 자체의 자가 분해 상수는 야생형 플라스민 자가 분해 상수의 95% 이하이며, 이의 촉매 상수 kcat는 야생형 플라스민 kcat의 10% 내지 200%의 범위인 것을 추가의 특징으로 하는 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 또는 플라스민은 Glu-플라스미노겐이나 Glu-플라스민, Lys-플라스미노겐이나 Lys-플라스민, 미디플라스미노겐이나 미디플라스민, 미니플라스미노겐이나 미니플라스민, 마이크로플라스미노겐이나 마이크로플라스민, 델타플라스미노겐이나 델타플라스민인 분리된 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체.
- 의약품으로서의 사용을 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 분리된 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체, 또는 이것들 중 임의의 것의 조합체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 분리된 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체, 또는 이것들 중 임의의 것의 조합체와, 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 애쥬반트 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
- 제11항에 있어서, 항응집제, 혈전 용해제, 소염제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 항혈관형성제, 항유사분열제, 항히스타민제 또는 마취제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피험체 내에서 병리학적 피브린 축적의 분해를 유도 또는 촉진하거나; 눈에서 후 유리체 박리를 유도하고/유도하거나 눈에서 유리체의 용해를 유도하거나, 또는 피험체의 눈에서 외과적 유리체 절제술을 촉진하거나; 피험체의 손상된 조직을 효소에 의해 괴사 조직 제거하거나; 순환성 피브리노겐을 감소시키거나, 또는 피험체 내 α2-항플라스민 수준을 감소시키거나; 또는 병리학적 피브린 축적 위험성을 감소시키기 위한, 분리된 플라스미노겐 변이체, 플라스민 변이체 또는 플라스민 유도체.
- 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체를 스크리닝하는 방법으로서,
(i) [P+/-n] 위치에 있는 아미노산을 돌연변이시키는 단계(여기서, P 위치에 있는 아미노산은 아르기닌 또는 리신이고, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임);
(ii) (i)로부터 얻어진 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을 측정하는 단계로서, 예를 들어 발색 또는 생물 기질 활성 분석법으로 측정되는 단계;
(iii) (ii)에서 측정된 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을, 야생형 플라스민의 자가 단백 분해 안정성과 비교하는 단계; 및
(iv) 자가 단백 분해에 안정적인 변이체로서 (iii)으로부터 야생형 플라스민 보다 자가 단백 분해에 더 안정적인 돌연변이체를 선별하는 단계;
를 포함하는 방법. - 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체를 스크리닝하는 방법으로서,
(i) 사람 플라스민 촉매 도메인의 138번 위치에 있는 글루타메이트 아미노산, 또는 이에 상응하는 사람 이외 개체의 플라스민의 아미노산 잔기를, 천연 아미노산과 상이한 아미노산으로 돌연변이시키는 단계;
(ii) (i)로부터 얻어진 돌연변이체의 자가 단백 분해 안정성을 측정하는 단계; 및
(iii) 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민변이체로서 (ii)로부터 자가 단백 분해에 안정적인 돌연변이체를 선별하는 단계;
를 포함하며, 여기서 상기 사람 플라스민 촉매 도메인은 1번 위치에서 발린 아미노산으로 시작하는데, 상기 발린 아미노산은 사람 Glu-플라스미노겐의 562번 위치에 있는 발린 아미노산과 동일한, 방법. - 제14항 또는 제15항에 있어서, 자가 단백 분해에 안정적인 플라스민 변이체의 단백 분해 활성을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 플라스민 포함 조성물의 장기간 보관 안정성을 증강시키는 방법으로서, 상기 방법은 단백 분해 활성의 상당한 손실없이 장기간에 걸쳐서 보관될 수 있는, 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 자가 단백 분해 안정적인 플라스민 변이체를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 플라스미노겐 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 플라스미노겐을 암호화하는 핵산을, 이 플라스미노겐을 발현할 수 있는 적당한 숙주 세포에 도입하는 단계;
(ii) 상기 숙주 세포 내에서 상기 플라스미노겐 발현에 충분한 시간 동안 및 이에 충분한 조건 하에 (i)에서 얻어진 숙주 세포를 생육하는 단계; 및
(iii) (ii)에서 발현된 플라스미노겐을 수확하는 단계
를 포함하는 방법. - 제18항에 있어서, (iii)에서 수확된 플라스미노겐을 정제하는 단계 (iv)를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 플라스민 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 플라스미노겐을 발현할 수 있는 적당한 숙주 세포 내에 이 플라스미노겐을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계;
(ii) 상기 숙주 세포 내에서 상기 플라스미노겐을 발현하는데 충분한 시간 동안 및 이에 충분한 조건 하에 (i)에서 얻어진 숙주 세포를 생육하는 단계;
(iii) (ii)에서 발현된 플라스미노겐을 수확하는 단계; 및
(iv) (iii)의 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화하는 단계
를 포함하는 방법. - 제20항에 있어서, (iv)에서 활성화하기 전에 (iii)에서 수확한 플라스미노겐을 정제하는 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, (iv)에서 얻어진 활성 플라스민을 정제하는 방법.
- 제20항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 활성 플라스민은 유도체화되고/유도체화되거나 가역적으로 불활성화되는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 플라스미노겐 변이체 또는 플라스민 변이체를 암호화하는 분리된 핵산 서열.
- 제24항에 의한 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
- 제24항에 의한 핵산 또는 제25항에 의한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
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