JP2014504867A - プラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は、プラスミンのプロテアーゼ活性の自己触媒による崩壊を減少させる、または防ぐ、触媒領域における１つまたは複数の点突然変異を含むプラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体に関する。プラスミノーゲンおよびプラスミンの前記変異体の組成物、用途、および使用方法も開示される。

Description

本発明は、プラスミンのプロテアーゼ活性の自己触媒による崩壊を減少させる、または防ぐ、触媒領域における１つまたは複数の点突然変異を含むプラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体に関する。プラスミノーゲンおよびプラスミンの前記変異体の組成物、用途、および使用方法も開示される。

酵素前駆体であるプラスミノーゲンの活性化により、線維素溶解活性／血栓溶解活性を有するセリンプロテアーゼであるプラスミンが形成される。内因性のプラスミノーゲンの活性化は、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼもしくはｔＰＡ、またはこれらの任意の変異体等のプラスミノーゲン活性化因子の投与によって引き起こされ、また強化される。活性化において、プラスミノーゲンタンパク質は、タンパク質分解酵素で、５つのクリングルドメインを含む重鎖、および触媒領域を含む軽鎖に切断される。両鎖は２つのジスルフィド結合によってつながっている。活性化後、自己分解による切断により、重鎖からＮ末端のセグメント（ヒトプラスミンでは７８個のアミノ酸、ウシプラスミンでは７７個のアミノ酸）が除去される。ウシプラスミンの重鎖はさらに、クリングル３と４の間で自己触媒により切断され得、それゆえウシのミジプラスミンが生じる（非特許文献１）。プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化は、ヒトプラスミノーゲンにおけるＲ５６１−Ｖ５６２のペプチド結合の切断により引き起こされ、軽鎖での大規模なコンホメーション変化を伴い、前記軽鎖内の触媒三残基内のプライミング、または活性化がもたらされる。ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼ等の細菌のプラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンと複合体を形成し、プラスミノーゲンのＲ５６１−Ｖ５６２のペプチド結合を切断せずに、活性化因子とプラスミノーゲンの複合体形成におけるコンホメーション変化により、プラスミノーゲンの触媒部位を活性化する（プラスミノーゲンの活性化メカニズムは、例えば、非特許文献２の序論で概説されている）。

プラスミノーゲン活性化因子は間接的な血栓溶解剤として作用するが、プラスミンそれ自体を線維素溶解／血栓溶解剤として直接使用することも提案されている。しかしながら、プラスミンが多くのプロテアーゼと同様、自己触媒によるタンパク質分解を受けやすいという事実がそのような直接利用の妨げとなっており、この分解は産物阻害を受ける二次カイネティクスに続いて起こる（非特許文献３）。

１９６０年代の前半に、プラスミンの酸性ｐＨでの安定化、または、リジン等のアミノ酸が存在する条件で、中性ｐＨでの安定化が確立された。にもかかわらず、プラスミンがｐＨ３．８で貯蔵されていてもＬｙｓ１０４、Ａｒｇ１８９およびＬｙｓ６２２（リジンプラスミンに対する番号付け）の後で自己分解により切断されることが報告されている特許文献１。プラスミンがｐＨ２．２よりも低いｐＨで貯蔵されている場合、位置Ａｓｐ６２、Ａｓｐ１５４およびＡｓｐ３４６のＡｓｐ−Ｐｒｏ（Ｄ−Ｐ）の間で、自己分解ではなく酸による切断が生じる特許文献１。これは、あきらかな自己触媒による分解がこれ以上生じないところまでｐＨを低減できるが、そこでは酸加水分解が不安定化の１つの要因となることを示している。特許文献１には、プラスミンのペプチド結合が中性ｐＨで（自己触媒的）加水分解を受けやすいことについての情報は記載されていない。プラスミンの既知の安定剤には、グリセロール、十分に高いイオン強度、フィブリノーゲンおよびε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）があり、Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎらにより開示されている（非特許文献３）。リジンおよびリジン誘導体（ＥＡＣＡおよびトラネキサム酸等）、およびｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）も、さらなる既知の安定剤として挙げられる（非特許文献４、非特許文献５）。特許文献２には、酸性条件での貯蔵にもかかわらず、プラスミン分解の一因となるプラスミン凝集体が形成されることが報告されている。この問題を、ポリヒドロキシ化合物の付加により解決する方法が特許文献２に記載されている。プラスミンの安定化方法には他に、オリゴペプチド化合物の付加もある（例えば特許文献３）。あるいは、プラスミンの触媒部位を、誘導体化、例えばアシル化によって可逆的にブロックできる（特許文献４）。酵素を安定化する手段として、プラスミンのペグ化も提案されている（特許文献５）。

プラスミンの切断型以外のプラスミン変異体が多数記載されており、キメラ的なマイクロプラスミン（特許文献６）、および２つの鎖の切断部位に点突然変異を有する変異体（特許文献７）、または触媒三残基アミノ酸に点突然変異を有する変異体（非特許文献６、非特許文献７）がある。Ｗａｎｇら（非特許文献８）は、位置５４５、５４８、５５０、５５５、５５６、５５８、５６０−５６４、５８５、７４０および７８８のアミノ酸が変異している、多数の一連のマイクロプラスミノーゲン突然変異体を報告した。アミノ酸位置５５８および５６６のシステインがセリンに置換されている二重突然変異体はＬｉｎｄｅらにより報告された（非特許文献９）。Ｔａｋｅｄａ−Ｓｈｉｔａｋａら（非特許文献１０）は、活性が減少したプラスミン変異体、位置６０１のアミノ酸のアラニンがスレオニンへ置換した変異に言及している。上記で言及したアミノ酸位置はすべて、位置１のアミノ酸Ｇｌｕから始まるＧｌｕ−‐プラスミノーゲンに対する位置である。非切断性プラスミノーゲン変異体（重鎖および軽鎖の間が切断されない）が特許文献８に記載されている。Ｄａｗｓｏｎら（非特許文献１１）は、位置７１９のＡｒｇ（Ｒ７１９Ｅ）の代わりにＧｌｕを有するＧｌｕ−プラスミノーゲン変異体がストレプトキナーゼへの親和性を減少させていることを記載している。Ｊｅｓｐｅｒｓら（非特許文献１２）はＡｌａスキャンにおいて、一連のファージ提示マイクロプラスミノーゲンの単一サイト突然変異体Ｈ５６９Ａ、Ｒ６１０Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｄ６６０Ａ、Ｙ６７２Ａ、Ｒ７１２Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｔ７８２Ａ、Ｒ７８９Ａを産生し、位置７１９でのアルギニンがスタフィロキナーゼとの相互作用のカギであることを発見した。Ｄ６６０Ａ突然変異体は、発現が非常に低いため、詳細な特徴は不明である。Ｒ７１９Ａ突然変異体のみをさらに可溶型で産生した。どの突然変異体でも、タンパク質分解活性は著しい変化を示さなかった（基質Ｓ−２４０３）。Ｊｅｓｐｅｒｓら（非特許文献１２）は、彼らの分析に活性サイト突然変異体Ｓ７４１Ａも含め、この突然変異体の結晶構造は、非特許文献１３に開示されている。ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン相互作用部位を解明するさらなる試みで、Ｔｅｒｚｙａｎら（非特許文献２）は、既に突然変異している（Ｒ５６１Ａ）変異体のマイクロプラスミノーゲン突然変異体を複数（Ｋ６９８Ｍ、Ｄ７４０Ｎ、Ｓ７４１Ａ）報告した。Ｒ５６１Ａ突然変異体はプラスミノーゲンのタンパク質分解活性を妨げ、したがって活性マイクロプラスミンの形成を妨げる（これはストレプトキナーゼ−マイクロプラスミノーゲン複合体の接触−活性化メカニズムの研究を複雑化するだろう）。Ｔｅｒｚｙａｎら（非特許文献２）はさらに、二重突然変異体Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８Ｍとは明らかに機能的には無関係な、「偶然得られた」三重突然変異体Ｒ５６１Ａ／Ｈ５６９Ｙ／Ｋ６９８Ｍに言及している。Ｗａｎｇら（非特許文献１４）は、ストレプトキナーゼ／プラスミン（プラスミノーゲン）相互作用の研究において、Ｃｙｓ５３６ＡｌａおよびＣｙｓ５４１Ｓｅｒが既に突然変異している一連のマイクロプラスミノーゲン（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸５３０−７９１）変異体セットを産生した。これらの突然変異体は、Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８Ｇ、Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８ＡおよびＲ５６１ａ／Ｋ６９８Ｑ二重突然変異体と同様、上述のＲ５６１Ａ突然変異（非特許文献２）を含む。同じＣ５３６Ａ／Ｃ５４１Ｓ突然変異において、Ｋ６９８ＧおよびＫ６９８Ａ単一突然変異も導入した。Ｋ６９８Ｇは精製が困難だったため、詳細な特徴は不明である。上記の研究では、プラスミノーゲン／プラスミン分子の特徴をよりよく理解することが狙いであったが、プラスミノーゲン／プラスミン突然変異体の臨床上の有益性もしくは利点、または、推定される臨床上の優位性についてはなんら報告されていない。非特許文献１５は、Ｍ５８５Ｑ、Ｖ６７３ＭおよびＭ７８８Ｌ突然変異を含むマイクロプラスミノーゲンの結晶構造の決定に成功した。

非特許文献１６は、１０．０ｋＤａの「微量で未確認のタンパク質構成成分」の存在を報告した。ウロキナーゼに活性化されたプラスミンの未精製の市販製剤（Ｈｏｍｏｌｙｓｉｎ）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、ヒトプラスミンのｐＨによる自己分解の差異はＳｈｉおよびＷｕ（非特許文献１７）によって詳細に記載されている。Ｏｈｙａｍａら（非特許文献１８）は、がんの治療における非リジンアナログプラスミノーゲン修飾物質の使用を提案している。このような化合物は、（プラスミノーゲン活性化因子ウロキナーゼの存在下）プラスミンの自己タンパク質分解を増強させ、アンギオスタチンの形成を強化するからである。Ｏｈｙａｍａら（非特許文献１８）の表３は、自己タンパク質分解を増強する化合物に接触させたプラスミン内の１５箇所もの切断部位を記載している。先行研究の観点から彼らの観察を考察すると、自己タンパク質分解を増強する化合物は、多かれ少なかれ選択的にＢ／軽鎖のタンパク質分解を増強するが、自己タンパク質分解を増強する化合物の非存在下では、Ａ／重鎖、およびＢ鎖の両方の分解はわずかであったように思われる。

国際公開第０１／３６６０８号パンフレット 米国特許第４，４６２，９８０号明細書 米国特許第５，８７９，９２３号明細書 欧州特許第０００９８７９号明細書 国際公開第９３／１５１８９号パンフレット 国際公開第２００４／０４５５５８号パンフレット 米国特許第５，０８７，５７２号明細書 国際公開第９１／０８２９７号パンフレット

Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３０５，９７−１０２ Ｔｅｒｚｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５６：２７７−２８４ Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８６，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１，３９５−４０４ Ｕｅｈｓｉｍａ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２４５，７−１８ Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ １９８５，Ｄｒｕｇｓ ２９，２３６−２６１ Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．１９９３， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，５３７４−５３７７ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９５，９０３−９１４ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，１７５８−１７６７ ａｎｄ １７６８−１７７９ Ｌｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５１，４７２−４７９ Ｔａｋｅｄａ−Ｓｈｉｔａｋａ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ４７，３２２−３２８ Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，１２０４２−１２０４７ Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，６３８０−６３８６ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９５，９０３−９１４ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７，３９９４−４００１ Ｐｅｉｓａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８，１１１８０−１１１８８ Ｎｇｕｙｅｎ ＆ Ｃｈｒａｍｂａｃｈ １９８１，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１，１５９−１７２ Ｓｈｉ ＆ Ｗｕ １９８８，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１，３５５−３６４ Ｏｈｙａｍａ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７１，８０９−８２０

上記の方法／変異体のいずれもが、分子レベルで安定したプラスミンを提供するという問題を解決しないことは明らかである。自己触媒による分解に内因的に耐性のある触媒領域を有するプラスミン変異体（またはプラスミンが由来する、同様のプラスミノーゲン変異体）の提供は、効果的で安全な長期貯蔵に向けた、また、血栓溶解療法、または眼の後部硝子体剥離もしくは硝子体の液化の誘導等におけるプラスミンの効果的で安全な治療用途に向けた、大きな前進となるであろう。

本発明は、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、もしくは可逆的に不活性な誘導体に関し：
（ｉ）これらは触媒領域において、位置Ｐのリジンまたはアルギニン、および位置［Ｐ＋／−ｎ］の少なくとも１つのアミノ酸の突然変異を含み、ここでｎは１、２、３、４または５であり、位置［Ｐ＋／−ｎ］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；および
（ｉｉ）（ｉ）の突然変異により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定される
ことを特徴とする。

本発明はさらに、触媒領域において少なくとも２つの内部アミノ酸の突然変異を含む上述のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体またはプラスミン誘導体に関し、これら突然変異は：
−位置［Ｐ＋／−ｎ］と［Ｐ＋／−ｎ’］においてであり；ｎとｎ’は１、２、３、４または５であり；位置［Ｐ＋／−ｎ］とと［Ｐ＋／−ｎ’］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；ｎとｎ’がＰに加算されるか、またはＰから減算されるかのいずれかの場合、両者は互いに異なっている；または、
−位置［Ｐ＋／−ｎ］と［Ｐ’＋／−ｎ］においてであり；Ｐ’はＰおよびＰ’の大い方の値であり；位置Ｐ’のアミノ酸はリジンまたはアルギニンであり；ｎは１、２、３、４または５であり；位置［Ｐ’＋／−ｎ］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；［Ｐ＋ｎ］および［Ｐ’−ｎ］の間に重複する位置が有る場合、これらは排除され；
前記少なくとも２つの内部アミノ酸の突然変異により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定できる。

上述のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、位置ＰおよびＰ’のうちのいずれかのリジンまたはアルギニンアミノ酸を含む触媒領域のリジンまたはアルギニンアミノ酸のいずれか１つ以上の、非リジン、非アルギニンアミノ酸への突然変異をさらに含んでもよい。

上記のプラスミノーゲン、プラスミンまたはプラスミン誘導体のうちのいずれかにおいて位置ＰまたはＰ’の前記内部アミノ酸は、特に、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するリジンもしくはアルギニン；
（ｉｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するリジンもしくはアルギニン；または、
（ｉｉｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１５８のアルギニン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するアルギニンもしくはリジン；
から選択されてもよく、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。

特に、本発明のプラスミノーゲン、プラスミンまたはプラスミン誘導体において、位置［Ｐ＋／−ｎ］の前記アミノ酸は、ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３８のアミノ酸のグルタミン酸、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するアミノ酸残基である。

本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、さらに、その自己分解定数が野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であるという特徴を有してもよい。この特徴は、上述したようなプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解を、対応する野生型プラスミノーゲンまたはプラスミンの自己タンパク質分解による分解と比較した際の減少の定義としてもよい。

本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、さらに、触媒定数ｋ_ｃａｔが野生型プラスミンのｋ_ｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあるという特徴を有してもよい。

本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、さらに、その自己分解定数が野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であり、その触媒定数ｋ_ｃａｔが野生型プラスミンのｋ_ｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあるという特徴を有してもよい。

いかなる制限も課すことなく、本発明の上記のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミジプラスミノーゲンまたはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンの１つであってもよい。

本発明はさらに、薬剤として使用する上述の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せに関する。

本発明はまた、上述の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物に関する。そのような組成物は、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤のうちの少なくとも１つを任意でさらに含んでもよい。

本発明はまた、上述の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のあらゆる有益な適用をも含む。いかなる制限も課すことなく、このような適用には、対象における病的なフィブリン沈着の溶解の誘導または促進、眼の後部硝子体剥離の誘導、および／または眼の硝子体液化の誘導、対象の眼の硝子体切除手術の容易化、対象の損傷した組織の酵素的壊死組織除去、対象における循環フィブリノーゲンの減少、対象におけるα２−抗プラスミンレベルの減少、または病的なフィブリン沈着のリスクの減少等がある。

本発明はさらに、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法に関し、前記方法が、
（ｉ）位置［Ｐ＋／−ｎ］のアミノ酸を変異させるステップで、ここで位置Ｐのアミノ酸はアルギニンまたはリジンであり、ｎは１、２、３、４または５であり；
（ｉｉ）（ｉ）から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップで、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定され；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において測定された突然変異体の自己タンパク質分解安定性を野生型プラスミンの自己タンパク質分解安定性と比較するステップ；および
（ｉＶ）野生型プラスミンより自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として（ｉｉｉ）から選択するステップ、
を含む。

上記の方法において、位置［Ｐ＋／−ｎ］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもないことが好ましい。

安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための別の方法においては、前記方法が、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３８のグルタミン酸アミノ酸、または、非ヒトプラスミンの対応するアミノ酸残基を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させるステップ、
（ｉｉ）（ｉ）から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップで、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定され、および
（ｉｉｉ）安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として、自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を（ｉｉ）から選択するステップ；
を含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。

上記のスクリーニング法のいずれかは、任意でさらに、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップを含んでもよい。

本発明はさらに、プラスミン含有組成物の長期貯蔵安定性を強化するための方法を含み、前記方法は、タンパク質分解活性の著しい損失がなく長期にわたり貯蔵できる、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体を同定するステップを含む。

本発明はさらに、本発明のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法を含み、
（ｉ）本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて（ｉ）で得られた宿主細胞を生育するステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において発現したプラスミノーゲンを回収するステップとを含む。
そのような方法は任意でさらに、（ｉｉｉ）において回収されたプラスミノーゲンを精製するステップ（ｉｖ）を含んでもよい。

同様に本発明は、本発明のプラスミン変異体を産生するための方法を含み、前記方法は、
（ｉ）本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて（ｉ）で得られた宿主細胞を生育するステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において発現したプラスミノーゲンを回収するステップと；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のプラスミノーゲンをプラスミンへ活性化するステップとを含む。
そのような方法はさらに任意で、（ｉｖ）における活性化に先立って（ｉｉｉ）において回収されたプラスミノーゲンを精製するステップを含んでもよい。さらに、本発明のプラスミン変異体を産生するためのいかなる方法においても、（ｉｖ）において得られた活性プラスミンを任意で精製してもよい。また、さらには、本発明の方法によって産生された活性プラスミン変異体は、任意で、誘導および／または可逆的に不活化されてもよい。

本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、例えば（ファージディスプレイのような）宿主の表面に付着していない、遊離または可溶性の形態で得られるのが好ましい。

本発明はさらに、本発明のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離された核酸配列に関する。また、このような核酸を含む組換えベクターも、このような核酸または組換えベクターで形質転換された宿主細胞も本発明の一部である。

野生型ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲン（１〜７９１）およびプラスミン触媒領域（１〜２３０、アミノ酸配列と番号は太字で示す）のアミノ酸位置に二重に番号を付けたアミノ酸配列。本発明を実証するために使用するマイクロプラスミノーゲンはアミノ酸位置５４３（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンに対する番号）から始まる。クリングルドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３６４５１に含まれる情報に由来）は、四角で囲み、それらのアミノ酸配列は、標準およびイタリック体で交互に示す。触媒三残基アミノ酸を丸囲みで示す。 ＧｅｎＢａｎｋから得た哺乳類プラスミノーゲンタンパク質のアミノ酸配列アラインメント。配列アラインメントを、デフォルト設定で国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイトを通して利用可能なＣＯＢＡＬＴソフトウエア（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ−ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＆ Ａｇａｒｗａｌａ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：１０７３−７９、２００７）で行った。▼：Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの開始の表示。アミノ酸の番号付けはヒトプラスミノーゲンを基準として行われる。 典型的なマイクロプラスミン変異体Ｅ１３８Ｑの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。左レーン：分子量マーカー、分子量も示す。レーン１：活性化前のマイクロプラスミノーゲンＥ１３８Ｑ。レーン２：レーン１と同じ物質だが、活性化後のマイクロプラスミンＥ１３８Ｑ。クーマシーブリリアントブルーでゲルを染色した。

本発明は中性ｐＨにおけるプラスミンのタンパク質分解活性の自発的な自動不活性化の根底にあるメカニズムの研究の結果に基づいており、この研究で発明者は、大部分がプラスミンの触媒領域からなるマイクロプラスミンに焦点を当てた。プラスミンによる切断を受けやすいペプチド結合はリジンまたはアルギニンのＣ末端側に位置する（ＷｅｉｎｓｔｅｉｎおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９７２、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２５８、５７７−５９０）。プラスミン触媒領域（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸位置５６２のバリンから開始）のアミノ酸のほぼ１０％（２３０個のうち２２個）は、リジンまたはアルギニンである。理論上、１つのプラスミン分子にある、これらリジンおよびアルギニンのＣ末端側のすべてのペプチド結合は、前記リジンまたはアルギニンのアミノ酸のＣ末端の構造とは無関係に、別のプラスミン分子によってタンパク質分解により切断可能である。さらに理論上は、これらのリジンまたはアルギニンのいずれか１つ以上の非リジン、非アルギニンアミノ酸への突然変異により、プラスミン分子の自己タンパク質分解による分解に対する抵抗性が増強するであろう。この理論は、国際特許出願ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１０／０５９９０２号明細書（国際公開第２０１１／００４０１１号パンフレット）において記述されているように、正しいことが証明されている。本発明は、プラスミン触媒領域におけるリジンまたはアルギニンに隣接する野生型のアミノ酸の非野生型アミノ酸への突然変異によっても、ただしこれは前記リジンまたはアルギニンの突然変異を必ずしも伴わないが、得られた突然変異プラスミンの自己タンパク質分解による分解に対する抵抗性が著しく増強するという、予期されなかった観察を基盤としている。

したがって、本発明の１つの態様は、プラスミン分子およびプラスミノーゲン分子、特に活性化可能な／潜在的にプラスミンに活性化可能なプラスミノーゲン分子に関し、この分子は触媒領域に１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を含むため、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲンにおいては自己タンパク質分解により分解する傾向にあるペプチド結合が、本発明のプラスミンおよびプラスミノーゲン分子対象においては、自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がなくなっている。

本発明は、言いかえれば、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、もしくは可逆的に不活性な誘導体に関し：
（ｉ）これらは触媒領域において、位置Ｐのリジンまたはアルギニン、および位置［Ｐ＋ｎ］または［Ｐ−ｎ］（さらに［Ｐ＋／−ｎ］として示される）の少なくとも１つのアミノ酸の、非野生型のアミノ酸への（または天然のアミノ酸もしくは天然に生じているアミノ酸とは異なるアミノ酸への）突然変異を含み、ｎは１、２、３、４または５であり、位置［Ｐ＋／−ｎ］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；および
（ｉｉ）（ｉ）の突然変異（の存在）により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度（または感受性、または敏感さ、または脆弱性）が減少し、これは例えば発色性または生物学的基質活性分析で測定できる（後を参照）
ことを特徴とする。

本発明の目的はしたがって、（プラスミノーゲン変異体から得られるものなどの）単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、もしくは可逆的に不活性な誘導体を提供することであって、前記プラスミン変異体またはそれらの誘導体は、野生型プラスミンと比較して、自己タンパク質分解に対してより高い抵抗性を有する／自己タンパク質分解により強い、という特徴を有する。自己タンパク質分解に対する抵抗性／感受性の測定に関する考察は後に記載する。

所与の位置のアミノ酸の、「非野生型アミノ酸」または「天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸」への突然変異は、野生型プラスミノーゲンまたはプラスミンの前記所与の位置のアミノ酸の、その前記野生型プラスミノーゲンまたはプラスミンのその前記所与の位置の野生型または天然のアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸への変化と考えられる。突然変異の選択に関する考察は後に記載する。

特に、位置Ｐの前記内部アミノ酸はリジンまたはアルギニンである。本明細書で使用される場合（別段に記述しない限り）、プラスミンの触媒領域（本明細書において「軽鎖」または「Ｂ鎖」とも呼ばれる）はヒトプラスミンを基準として番号がつけられ、位置Ｐ＝１のバリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２のバリンと同じである（図１を参照）。本明細書では、プラスミンの触媒領域における２つの異なるアミノ酸位置への参照もでき、それぞれ［Ｐ＋／−ｎ］（位置Ｐはリジンまたはアルギニン）および［Ｐ’＋／−ｎ］（位置Ｐ’はリジンまたはアルギニン）と命名される。明確にするために、位置Ｐ、Ｐ’、［Ｐ＋／−ｎ］、［Ｐ’＋／−ｎ］等は、整数とする。位置［Ｐ＋ｎ］、［Ｐ’＋ｎ］等では、Ｐ、Ｐ’等は整数値であり、ｎ（ｎは１、２、３、４、または５である）の値で増加し；位置［Ｐ−ｎ］、［Ｐ’−ｎ］等では、Ｐ、Ｐ’等は整数値であり、ｎ（ｎは１、２、３、４、または５である）の値で減少し；位置［Ｐ＋／−ｎ］、［Ｐ’＋／−ｎ］等では、Ｐ、Ｐ’等は整数値であり、ｎ（ｎは１、２、３、４、または５である）の値で増加（＋）または減少（−）する。したがって、もし、例えば［Ｐ＋１］＝２０ならば、Ｐ＝１９で［Ｐ−２］＝１７であり；または、もし、例えばＰ’＝４９ならば、［Ｐ’−５］＝４４で［Ｐ’＋３］＝５２である。プラスミン触媒領域の２つの異なるアミノ酸位置を、例えば［Ｐ＋／−ｎ］および［Ｐ＋／−ｎ’］としても定義でき、ｎおよびｎ’の両方が１、２、３、４、または５の値を有しており；ｎとｎ’の両方が加算されるか、または減算されるかのいずれかの場合、両者は互いに異なる；後者の場合、もしＰが、例えば１９で；ｎとｎ’が例えばｎ＝１およびｎ’＝３で両方とも加算されるならば；［Ｐ＋ｎ］＝２０および［Ｐ＋ｎ’］＝２２となる。または、例えばｎ＝ｎ’＝１で、ｎが減算されｎ’が加算されるならば、［Ｐ−ｎ］＝１８および［Ｐ＋ｎ’］＝２０となる。

本発明はさらに、少なくとも２つの内部アミノ酸の非野生型アミノ酸への（または天然のアミノ酸もしくは天然に生じているアミノ酸とは異なるアミノ酸への）突然変異を触媒領域に含む上述のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体またはプラスミン誘導体に関し、これは：
−位置［Ｐ＋／−ｎ］と［Ｐ＋／−ｎ’］においてであり；ｎとｎ’は１、２、３、４または５であり；位置［Ｐ＋／−ｎ］とと［Ｐ＋／−ｎ’］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；ｎとｎ’がＰに加算されるか、またはＰから減算されるかのいずれかの場合、両者は互いに異なっている；または
−位置［Ｐ＋／−ｎ］と［Ｐ’＋／−ｎ］においてであり；Ｐ’はＰおよびＰ’の大きい方の値であり；位置Ｐ’のアミノ酸はリジンまたはアルギニンであり；ｎは１、２、３、４または５であり；位置［Ｐ’＋／−ｎ］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；および、［Ｐ＋ｎ］および［Ｐ’−ｎ］の間に重複する位置が有る場合、これらは排除され；
前記少なくとも２つの内部アミノ酸の突然変異（の存在）により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定できる。

あるいは、本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体はしたがって、その触媒領域で任意の位置、位置Ｐ、Ｐ’、Ｐ’’等の１つまたは複数の位置の任意のリジンまたはアルギニンの、非リジン、非アルギニンアミノ酸への突然変異を含んでもよい。

当業者は、野生型のアミノ酸を別のどのアミノ酸へ突然変異させられるか容易に決定できるであろう。そのような決定は、アミノ酸の大きさ、アミノ酸電荷、アミノ酸極性、および／またはアミノ酸疎水性親水性指標等の基準（表１を参照）を用いてもよいが、必ずしも必要ではない。さらに、プラスミノーゲンおよびマイクロプラスミンの結晶構造（ＭＭＤＢ ＩＤ：１２７１７；ＰＤＢ ＩＤ：１ＤＤＪ；Ｗａｎｇら、２００１、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９５、９０３−９１４）の入手しやすさは、得られる突然変異プラスミンまたはプラスミノーゲン分子がタンパク質分解活性を保持するよう突然変異させるアミノ酸を同定するのに大いに価値がある。さらに、所与の位置［Ｐ＋／−ｎ］の、および任意でさらに所与の位置Ｐ、Ｐ’、Ｐ”等の１つまたは複数の野生型アミノ酸が、所与の群のいずれか１つのアミノ酸へ突然変異することにより類似の結果がもたらされるであろうことが予想できる。表１に基づき、前記所与の群を以下のように定義できる：
− 疎水性の脂肪族アミノ酸：Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ
− 疎水性の芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ
− 親水性の酸性アミノ酸：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎ
− 親水性の塩基性アミノ酸：Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓ
− 中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ
− 中程度に疎水性の芳香族アミノ酸：ＴｙｒおよびＴｒｐ
この中で突然変異の目的では、ＣｙｓおよびＰｒｏは、Ｃｙｓが遊離できるチオール基を生成すること、または、Ｐｒｏがタンパク質構造を大きく乱すため、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲンアミノ酸の置換アミノ酸としては好ましくない可能性がある。他のアミノ酸置換には、プラスミン（プラスミノーゲン）触媒領域の位置［Ｐ＋／−ｎ］の、および任意でさらに位置Ｐ、Ｐ’、Ｐ”等の１つまたは複数の野生型アミノ酸の、非天然もしくは非標準アミノ酸への、またはノルロイシン、ノルバリン、オルニチンもしくはシトルリン等のアミノ酸類似体への突然変異がある（より詳細な一覧については、例えば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、２００４、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７３、１４７−１７６を参照）。

国際特許出願ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１０／０５９９０２号明細書で記述されたような試験条件（中性ｐＨでの自発的な自己タンパク質分解による分解）の下では、プラスミン触媒領域内での自己タンパク質分解による切断は、限られた数でしか生じない。これらの切断は、ヒトプラスミンの触媒領域のリジン１３７、ヒトプラスミンの触媒領域のリジン１４７、およびヒトプラスミンの触媒領域のアルギニン１５８で生じていた。しかしながら、これは、自己タンパク質分解により切断されやすいペプチド結合が他にも存在する可能性を排除するものではない。

したがって、本発明のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体に関して、位置ＰまたはＰ’の前記内部アミノ酸は、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３７のリジン、または非ヒトプラスミンの対応するリジンもしくはアルギニン；
（ｉｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの対応するリジンもしくはアルギニン；および／または
（ｉｉｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１５８のアルギニン、または非ヒトプラスミンの対応するリジンもしくはアルギニン；
から選択されてもよく、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。ヒトプラスミノーゲンおよびヒトプラスミンの触媒領域でのアミノ酸の番号付けを明確にするために、本明細書では図１を参照する。

特に、上記において、位置Ｐの前記少なくとも１つの内部アミノ酸は、ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３７のリジンであるか、または非ヒトプラスミンの対応するリジンまたはアルギニンであり、位置［Ｐ＋／−ｎ］の前記内部アミノ酸は位置［Ｐ＋１］のアミノ酸、すなわちヒトプラスミンの触媒領域の位置１３８のグルタミン酸か、または非ヒトプラスミンの対応するアミノ酸残基である。さらに特定すれば、前記グルタミン酸は、別の親水性の酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸、アスパラギン、またはグルタミンへ突然変異している。

ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）のアミノ酸に「対応する」非ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）配列のアミノ酸の同定（つまり「対応する」アミノ酸の同定）はまず、両方のアミノ酸配列のアラインメントを実施することを意味する。このようなアラインメントでは、高い同一性および相同性を得るために、アラインメントした配列の片方または両方に、ギャップをわずかに導入するなどの最適化が必要な場合がある。次に、ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）のアミノ酸とアラインする非ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）のアミノ酸が同定されるが、本明細書ではこれを「対応する」アミノ酸と称する。本明細書の図７には、公に利用可能な哺乳類のプラスミノーゲンタンパク質配列の、上記のようなアラインメントを示し、ヒトプラスミノーゲン配列（ライン１）に存在する本発明にとって特に興味のあるアミノ酸を、非ヒトプラスミノーゲン配列（ライン２〜１８）の対応するアミノ酸と一緒に強調して示す。特に興味のあるアミノ酸Ｐ、Ｐ’等は、位置６９８（触媒領域の位置１３７、図１を参照）のＬｙｓ、位置７０８（触媒領域の位置１４７、図１を参照）のＬｙｓ、および位置７１９（触媒領域の位置１５８、図１を参照）のＡｒｇである。

「プラスミン」は、フィブリノリジンまたはｌｙｓｏｆｉｂｒｉｎとしても知られ、セリン型のプロテアーゼであり、酵素前駆体であるプラスミノーゲンの活性化によりもたらされる。活性化は、アミノ酸５６１および５６２（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした番号付け）の間のタンパク質分解切断により起こる。プラスミンは、５つのクリングルドメインを含む重鎖、および触媒領域を含む軽鎖を保有する。プラスミノーゲンは、例えば、リジンアフィニティークロマトグラフィー（ＤｅｕｔｓｃｈおよびＭｅｒｔｚ、１９７０、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７０、１０９５−１０９６）によって血漿から濃縮できる。触媒領域が機能を有する限り、プラスミン分子を切断（プラスミン触媒領域の外部および／または内部で）ができ、したがってこのような切断によりプラスミンの「タンパク質分解活性誘導体」が形成される。そのため、５つのクリングルドメインの１つまたは複数を、全体的にまたは部分的に欠失させることができる。１つまたは複数のクリングルドメインを欠く、および／または、１つまたは複数のクリングルドメインの一部を欠く切断プラスミンは、したがって、本発明においてプラスミンのタンパク質分解活性誘導体の例として想定される。プラスミンの切断変異体の例には、「ミジプラスミン」、「ミニプラスミン」、「マイクロプラスミン」、「デルタプラスミン」があるが、これらに限定されない。ミジプラスミンは基本的にクリングルドメイン１〜３を欠いている（例えばＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３０５、９７−１０２）。ミニプラスミンは、元は、エラスターゼでプラスミンを限定的に分解して得られたもので、基本的にクリングルドメイン１〜４を欠いている（例えばＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５６７、４７２−４８１；ＰｏｗｅｌｌおよびＣａｓｔｅｌｌｉｎｏ、１９８０、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５、５３２９）。ミニプラスミンはその後、組換えで産生されている（国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレット）。これは、マイクロプラスミン類等の所与のプラスミン類の中で許容された分子的多様性を示す（例えば、複数の種がマイクロプラスミン類を形成する）。デルタプラスミンは、クリングルドメイン１またはクリングルドメイン４が触媒領域に直接に結合されているプラスミンの組み換え型である（国際公開第２００５／１０５９９０号パンフレット）。上記のプラスミンの切断変異体は、「ミジプラスミノーゲン」、「ミニプラスミノーゲン」、「マイクロプラスミノーゲン」および「デルタプラスミノーゲン」のそれぞれの活性化により得られる。活性化が可能であるためには、切断プラスミノーゲンは、（ミニプラスミンのクリングル５ドメイン等の）クリングルドメインと触媒領域との間にリンカーとなる最小数のアミノ酸を、またはクリングルが無い切断プラスミンの場合、Ｃ末端に触媒領域を含む必要がある（例えば、Ｗａｎｇら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４、１７５８−１７６７を参照）。本発明の文脈において、プラスミノーゲンは「無傷の活性化部位」を含むことが望ましい場合があり、「無傷の活性化部位」とは、少なくともアミノ酸５６１および５６２（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンに対する；または非ヒトプラスミノーゲンの対応するアミノ酸）が存在し、またこれらが異なったカイネティクスを有する可能性があるにもかかわらず、プラスミンへのプラスミノーゲンの活性化／転化を、野生型のプラスミンと同様生じるように、分子の構成中に存在することを意味する。プラスミンまたはその活性切断変異体の代わりに、活性化可能なプラスミノーゲンまたはその切断変異体を本発明の文脈において使用できる（例えば欧州特許第０４８０９０６号明細書；米国特許第５，３０４，３８３号明細書；欧州特許第０６３１７８６号明細書；米国特許第５，５２０，９１２号明細書；米国特許第５，５９７，８００号明細書；米国特許第５，７７６，４５２号明細書を参照）。「プラスミノーゲン」は、例えばＧｌｕ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲン（位置６８でのＡｒｇ、もしくは位置７７または７８のＬｙｓから開始）などのプラスミノーゲンの任意の形態を指す。活性化可能なプラスミノーゲンまたはその活性化可能な切断変異体を使用する場合、プラスミンへの活性化は遅れ、器官、組織または体液との接触後に、つまり対象への投与後に生じるのが一般的であろう。また別の形態では、本発明の文脈において、プラスミンまたはその活性切断変異体の代わりに、活性化可能なプラスミノーゲンまたはその活性化可能な切断変異体を、プラスミノーゲン活性化因子（組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼまたはスタフィロキナーゼ、またはその任意の変異体等）と併用して使用してもよい。（例えば米国特許第６，７３３，７５０号明細書；米国特許第６，５８５，９７２号明細書；米国特許第６，８９９，８７７号明細書；国際公開第０３／３３０１９号パンフレットを参照）。さらにまた別の形態では、（ｉ）プラスミンまたはその誘導体、（ｉｉ）活性化可能なプラスミノーゲン、またはその活性化可能な誘導体、および、任意で、（ｉｉｉ）プラスミノーゲン活性化因子のいずれかの混合物を、本発明の文脈において、使用できる（例えば米国特許出願公開第２００４／００８１６４３号明細書を参照）。プラスミン（またはプラスミノーゲン）の安定性を確実なものとするために、プラスミン（またはプラスミノーゲン）は、一般的に低温で貯蔵される（例えば摂氏＋４度または摂氏−２０度）。貯蔵組成物は安定化組成物、例えば低ｐＨ組成物（ｐＨ４以下のｐＨ、例えば、酸１ｍＭ〜２５０ｍＭのクエン酸等の酸で得られる、例えば、ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏおよびＳｏｄｅｔｚ、１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４５、２７３−２８６；国際公開第０１／３６６０８号パンフレット；国際公開第０１／３６６０９号パンフレット；国際公開第０１／３６６１１号パンフレットを参照）、もしくは高グリセロール含有組成物（３０〜５０％ｖ／ｖ、例えば、ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏおよびＳｏｄｅｔｚ、１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４５、２７３−２８６）であってもよく、または、例えばアミノ酸（例えば、リジンまたはＥＡＣＡまたはトラネキサム酸等のリジン類似体）、糖（例えばマンニトール）、または当技術分野において知られている任意の安定剤（例えばジペプチド、国際公開第９７／０１６３１号パンフレット）などを含む１つまたは複数のさらなる安定剤組成物内に、もしくはその安定剤組成物と一緒に貯蔵してもよい。「プラスミン」種にはさらに、その任意の活性誘導体（もしくはその活性切断プラスミン変異体）、または活性化可能なプラスミノーゲンの同様の誘導体（もしくはその活性可能な切断変異体）が含まれる。そのような誘導体には、例えば、Ｔｃ^９９−標識プラスミン（Ｄｅａｃｏｎら、１９８０、Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ ５３、６７３−６７７）等の標識プラスミンまたはプラスミノーゲン（もしくはその切断変異体）、またはペグ化された、もしくはアシル化されたプラスミンまたはプラスミノーゲン（もしくはその切断変異体；欧州特許第９８７９号明細書、国際公開第９３／１５１８９号パンフレット）が含まれる。他の任意の標識（放射性、蛍光性等）も、プラスミンまたはプラスミノーゲンの誘導体を産生するために使用してよい。前記誘導体にはさらに、ハイブリッドまたはキメラのプラスミンまたはプラスミノーゲン分子があり、この分子は例えば、フィブリン結合分子（ｔＰＡのクリングル２、アポリポタンパク質のクリングル、ｔＰＡもしくはフィブロネクチンのフィンガードメイン、またはフィブリン結合抗体のＦａｂドメイン等）に融合された、例えば、本発明の切断されたプラスミンまたはプラスミノーゲンを含む。

野生型プラスミン、および本発明のプラスミン変異体またはプラスミン誘導体の自己タンパク質分解に対する耐性（つまり安定性）は、タンパク質分解活性を比較するための方法と類似の方法で比較でき、例えば、発色性の活性分析、または例えばフィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはコラーゲンに基づく生物学的基質分析等がある。

自己タンパク質分解に対する耐性の測定のために、自己分解速度定数が測定し得る。本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明の任意のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体の自己分解速度定数は、野生型プラスミンの自己分解速度定数より少なくとも５％、もしくは少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくは９９．５％低く、または、自己分解速度定数は、野生型プラスミンの自己分解速度定数の最大で９５％、または最大で０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、もしくは９０％であるという特徴を有してもよい。例えば、野生型マイクロプラスミンの自己分解速度定数は１２３Ｍ^−１ｓ^−１と測定され、一方、マイクロプラスミン変異体Ｅ１３８Ｑの自己分解速度定数は４Ｍ^−１ｓ^−１と測定された（実施例１／表２を参照）。したがってＥ１３８Ｑ変異体の自己分解速度定数は、野生型マイクロプラスミンの自己分解速度定数の３．２５％である。

さらに、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または前記プラスミンのいずれかの誘導体を含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかは、野生型プラスミンのタンパク質分解活性とは異なるタンパク質分解活性（高いまたは低い）を有してもよく、この活性は、例えば発色性の活性分析、または、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニンまたはコラーゲン等に基づいた生物学的基質分析等で測定される。

本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明の任意のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のタンパク質分解活性を、野生型プラスミンのタンパク質分解活性と、触媒定数ｋ_ｃａｔにより、比較してもよい。触媒定数ｋ_ｃａｔは単位時間当たりに各酵素部位が生成物に変換する基質分子の数の尺度である。したがって、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかは、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔ値の＋１００％〜−９０％、または＋５０％〜−５０％の範囲にあるｋ_ｃａｔ値、つまり、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔ値の１０％〜２００％、または５０％〜１５０％の範囲のｋ_ｃａｔ値を有することを特徴としてもよい。示された百分率を測定するため、算出は絶対ｋ_ｃａｔ値に基づいて行われる。例えば、野生型マイクロプラスミンのｋ_ｃａｔは４６ｓ^−１であるが、マイクロプラスミン変異体Ｋ１３７Ｍのｋ_ｃａｔは３６ｓ^−１である（国際特許出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１０／０５９９０２号明細書の実施例４／表３を参照）。したがってＫ１３７Ｍ変異体のｋ_ｃａｔは野生型マイクロプラスミンのｋ_ｃａｔの７８．３％である。

本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン含む本発明のプラスミン変異体、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかのタンパク質分解活性を、野生型プラスミンのタンパク質分解活性と比較する別の方法には、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍの比較が含まれる。ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値は高い、同じぐらいまたはわずかに低いのが好ましい場合があるが、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミンを含む本発明のプラスミン変異体、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍは、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍと比較して１０００まで、または１／５００まで低くても許容できる（後を参照）。例として、Ｅ１３８Ｑマイクロプラスミン変異体のｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍが９．５ｘ１０^５と測定され、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍが６．９ｘ１０^５と測定された場合（実施例１および表２を参照）、すなわち、Ｅ１３８Ｑマイクロプラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値は、野生型マイクロプラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値より１．３８倍高い。

あるいは、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかを、自己分解速度定数データとｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍデータとを組み合わせることにより、野生型プラスミンと比較してもよい。例えば、自己分解速度定数が野生型プラスミンと比較して１／２０でありｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍが野生型プラスミンと比較して１／１０であるプラスミン変異体は、野生型プラスミンより２倍優れているであろう。明らかに最終的な使用方法次第ではあるが、タンパク質分解活性が低い非常に安定したプラスミン（すなわち自己タンパク質分解により分解されない、またはほとんど分解されない）は、例えば、プラスミン活性が低レベルであるが持続することが望ましい場合、または目的とする臨床的効果を達成するために必要とされる場合に、強く求められる可能性が高い。したがって、このようなタンパク質分解活性が低い高度に安定したプラスミン変異体は、除放性の担体または補助剤を実際に使用する必要のない、除放性の製剤と事実上等しいものとなるであろう。

本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミン、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかを含む、本発明のプラスミン変異体のいずれかを比較するためのまた別の方法では、自己分解速度定数データとｋ_ｃａｔデータを組み合わせることにより、野生型プラスミンと比較してもよい。

さらに、本発明のプラスミノーゲン変異体から得られたプラスミンを含む本発明のプラスミン変異体のいずれか、または本発明のプラスミン誘導体のいずれかは、上で定義された自己分解速度定数および触媒定数ｋ_ｃａｔおよび／またはｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍを任意で組合せた特徴を有してもよい。

上述のような任意の比較測定では、明らかにプラスミン変異体をその最も近い野生型プラスミンと比較することが望ましい。例えば、マイクロプラスミン変異体を野生型マイクロプラスミンと、またはミニプラスミン変異体を野生型ミニプラスミンと比較することが望ましい。さらに、任意の活性測定では明らかに、本発明のプラスミン変異体の可逆的に不活化された誘導体を、まず可逆的な不活性化の原因（例えばアシル化または非最適ｐＨ）を除くことにより活性化するべきである。

本発明のプラスミノーゲン変異体またはそれから得られたプラスミン、本発明のプラスミン変異体のいずれかは、Ｇｌｕ−プラスミンのＧｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミジプラスミノーゲン、またはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたは、ミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンであってもよい。

プラスミン種がタンパク質分解活性を有するかどうかを判断するための分析が多数ある。簡易で直接的な分析は、試料中のプラスミンによる発色基質の分解に基づいており；発色基質には、タンパク質分解切断でｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を放出するＳ−２４０３（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）およびＳ−２２５１（Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）がある。形成されたｐＮＡの量は吸光度４０５ｎｍで測定できる。プラスミン活性を測定するための他の分析には電位差測定分析がある。比色分析（発色基質を使用する）および電位差測定の分析は、例えば、ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏおよびＳｏｄｅｔｚ（１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４５、２７３−２８６）に記載されている。プラスミン活性を測定するためのさらに他の分析には、カゼイン分解法がある（例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＳｕｍｍａｒｉａ、１９７０、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９、１８４−１９９；ＲｕｙｓｓｅｎおよびＬａｕｗｅｒｓ、１９７８、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ」のＩＸ章−Ｐｌａｓｍｉｎ、Ｓｔｏｒｙ−Ｓｃｉｅｎｔｉａ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ、１２３−１３１ページ）。プラスミン活性を測定するための、さらなる他の分析には線溶検査がある（例えば、ＡｓｔｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒｔｚ、１９５２、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ４０、３４６−３５１）。他のタンパク質基質を使用して、他の活性分析を容易に設計できる。このような分析を、酵素の自己タンパク質分解による分解に起因する、長期にわたるプラスミンのタンパク質分解活性の消失を追跡するためにも使用してもよいことは明らかである。本発明のプラスミン変異体、またはその任意の活性切断変異体もしくは誘導体の安定性を分析するための別の方法として、前記プラスミン変異体を野生型プラスミンの存在下でインキュベートしてもよく、野生型プラスミンによる分解に対するプラスミン変異体の耐性をモニターできる。

病変、創傷、潰瘍化した傷等（縫合創の潰瘍形成等）からの壊死要素または壊死組織片の除去におけるプラスミンの使用は、例えば米国特許第３，２０８，９０８号明細書に記載されている。同様に、熱傷の治療にプラスミンを含む治療用製剤の局所使用が、例えば米国特許第４，１２２，１５８号明細書に開示されている。壊死組織切除は、壊死した、損傷した、および／または感染した組織を除去し、残存している健康な組織の治癒を改善、または強化する。このような除去は、外科的、機械的、化学的な手段により、または選択的に壊死組織を食べる、生きている特定の種の蛆虫（蛆療法）により行ってもよい。壊死組織切除を酵素を使用して、または酵素を併用して行ってもよく、この方法は酵素的壊死組織除去と呼ばれる。壊死組織切除は、熱傷および重度の創傷等の治癒過程の重要な一側面であり、ある種のヘビ咬傷の治療においても同様に使用される。酵素的壊死組織除去（単独で、または他のタイプの壊死組織切除との併用で）におけるプラスミン（または上述の任意のプラスミンの変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の適用は、創傷治癒を促進または容易にするために、および皮膚移植等の外科的処置の補助として特に有益である。

プラスミン（または上述の任意のプラスミンの変異体もしくは誘導体、またはその代替物）のより広く知られた使用方法は、大まかに言えば、病的なフィブリンの沈着の治療に関する。フィブリンの沈着は身体の種々様々な病的状態に起因する。例えばフィブリンを含む血塊が組織内の血管で形成されると、深部静脈、冠状動脈、脳動脈または網膜静脈の閉鎖症、または血栓症を引き起こす。フィブリンのわずかな蓄積は、切迫した重篤な血栓症に先行し、またはその警告となる可能性がある。例として、不安定狭心症が挙げられるが、これは切迫した冠状動脈血栓症および一過性脳虚血発作の警告と考えられ、脳卒中に先行する場合がある。フィブリンはさらに、感染、自己免疫疾患および癌などの多くの疾病プロセスに付随する炎症に関連して、組織内に蓄積することが多い。フィブリンは他にも、微生物による感染によって引き起こされた化膿巣の周囲に沈着する。さらにフィブリン沈着は、特定の固形腫瘍に関連して見られることが多い。フィブリン沈着はまた、あらゆるタイプの創傷、例えばトラベクレクトミー等の外科的処置に起因するものを含む創傷の治癒中に生じる恐れがある。また、フィブリン沈着は、網膜静脈におけるフィブリンの蓄積としても現れ、網膜変性症、視力障害または視力喪失にさえもつながる可能性がある。病的なフィブリン沈着という用語はさらに、カテーテル、カテーテルデバイス内やその先端、または、人工血管、および合成の、ヒトまたは動物由来の移植組織等の、フィブリンを含む閉塞により実質的に閉塞されるインプラント内で形成または存在する沈着を包含する。用語「カテーテルデバイス」は、身体に挿入できる任意のカテーテルまたはチューブ状のデバイスを指し、動脈カテーテル、心臓カテーテル、中心静脈カテーテル、静脈内カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、肺動脈カテーテル、トンネル状中心静脈カテーテル、および動静脈シャント等がある。

血栓症、つまり、血栓または止血血栓の形成、の進行を助長する様々な要因には、（１）罹患血管の血管内皮細胞表層の損傷（２）血中凝固特性の増加、および（３）罹患血管の血液の停滞、がある。血栓症は、血管表層の破損箇所に付着された非常に小さな塊から発症する。小さな塊は、血栓症の発症を助長し、血管の内径を減少させ血流を減速させる作用がある。さらに、最初の小さな血栓が成長すると、罹患血管の完全な、またはほぼ完全な閉鎖に発展する可能性が高い。血栓症が動脈の１つで起こると、その動脈により供給される組織では、酸素および栄養が欠乏し、その結果組織の損傷または死（壊疽）を引き起こす可能性がある。損傷の度合いは、血栓症の位置および大きさ、増殖速度、患部が動脈１本としかつながっていないか、または側副血管により供給を受けるかどうかに依存する。例えば心臓または脳のような重要臓器へつながる血管が影響を受ける場合、人間は重度に障害を負うか、または死亡する可能性がある。時に、血栓は細菌等の伝染性の生物体を含む場合があり敗血症性血栓症が、膿形成および周囲の組織の感染を伴い発症する可能性がある。

さらに、プラスミン（または上述のそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）の使用法には、循環フィブリノーゲンレベルの減少（例えば国際公開第９３／０７８９３号パンフレット）、およびα２−抗プラスミン阻害因子としての使用（虚血性脳卒中後に脳梗塞の大きさを減少させるという報告がされている；国際公開第００／１８４３６号パンフレット）がある。

プラスミン（または上述のそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）のさらなる別の使用法は、眼における後部硝子体剥離（ＰＶＤ）の誘導、および／または硝子体液化に関し、機械的な硝子体切除術の補助手段として、またはその代替法としての使用がある（国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレット；米国特許第６，７３３，７５０号明細書；米国特許第６，５８５，９７２号明細書；米国特許第６，８９９，８７７号明細書；国際公開第０３／３３０１９号パンフレット；国際公開第２００６／１２２２４９号パンフレット；国際公開第２００７／０４７８７４号パンフレット；米国特許第５，３０４，１１８号明細書；米国特許出願公開第第２００６／００２４３４９号明細書；米国特許出願公開第第２００３／０１４７８７７号明細書）。硝子体切除および／または硝子体液化は、多くの眼の疾患にとって利点があり、そのような疾患には、硝子体浮遊物（通常透明な硝子体液内の硝子体液の自動性細片／蓄積で視力を損なう）、網膜剥離（硝子体の牽引により発症する可能性のある盲検化の症状）、黄斑パッカー（網膜黄斑上の瘢痕組織；黄斑は鮮明な中心視覚に必要である；黄斑パッカーはまた、網膜上膜症、または網膜前膜症、セロファン黄斑症、網膜しわ、表面しわ網膜症、黄斑前線維症、または内境界膜疾病としても知られる）、硝子体出血および／または網膜上の線維性瘢痕組織の形成（網膜剥離の原因となる可能性がある）を招く糖尿病網膜症（増殖性または非増殖性）、黄斑円孔（盲点の原因となり、硝子体の牽引、受傷または外傷事故により発症する網膜黄斑の孔）、硝子体出血（糖尿病網膜症、受傷、網膜剥離もしくは網膜裂孔、クモ膜下出血（テルソン症候群）、または閉鎖された血管が原因）、硝子体下出血（硝子体を覆う硝子体膜下の出血）、黄斑浮腫（流動性タンパク質の、眼の網膜黄斑上またはその下での沈着）、および黄斑変性（ドルーゼンの形成で発症；乾燥型および湿潤型；年齢に関連する場合加齢黄斑変性症）がある。プラスミンの他の眼への適用には、トラベクレクトミー手術（眼圧減少のために実施）後のろ過胞の維持または再建がある。例えば、国際公開第２０１０／０２３８０５号パンフレットを参照。

プラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）のさらに別の使用法は、診断にあり、より具体的には、適正に標識された（例えば、Ｔｃ^９９標識された、上記を参照）プラスミン（または上述のそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を、病的なフィブリン沈着の検出に適用してもよい。本発明の切断プラスミンまたはプラスミノーゲン変異体をこのような診断法に適用する場合、前記変異体がフィブリン結合部位を含むことに注意するべきである（プラスミンそれ自体のものであろうが、例えばハイブリッド分子を作ることによりプラスミン触媒領域となって付加されたものであろうが）。

本発明のプラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤において貯蔵してもよい。そのような担体、希釈剤または補助剤は、１〜１００ｍＭの酢酸またはクエン酸等の酸性の低緩衝液から構成されるか、または含んでもよい。酸性の場合、薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤のｐＨは、２．５〜５．０であり、例えば２．５〜４．０、または３．１、３．２、３．３または３．４である。有益な酸性化合物には、酢酸、クエン酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸または安息香酸がある。ギ酸を使用してもよいが、この化合物はＡｓｐ残基のＣ末端でタンパク質分解切断を誘導しないため、注意が必要である。薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤は、酸性、中性または塩基性のいずれかである場合、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジンまたはその任意の誘導体または類似体等の１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよい。薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤は、単糖、二糖、多糖または多価アルコール等の糖を含んでもよい。例えば、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、トレハロース、マルトースおよびマンノース等の糖、ソルビトールおよびマンニトール等の糖アルコール、デキストリン、デキストラン、グリコゲン、デンプンおよびセルロース等の多糖がある。薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤は、グリセロール、ナイアシンアミド、グルコサミン、チアミン、シトルリン、無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等）、ベンジルアルコールまたは安息香酸等の化合物を含んでもよい。薬学的に許容される担体、希釈剤または補助剤には、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）および／またはトラネキサム酸等の化合物を含んでもよい（上記、および背景技術節を参照）。この化合物のいくつかを、上記のプラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物の安定剤として使用してもよい。

上記を考慮すると、本発明の別の態様は、薬剤として使用する、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せに関する。

本発明のまた別の態様は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物に関する。さらなる実施形態において、前記組成物は、抗凝血剤、さらに血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤のうちの少なくとも１つを追加でさらに含んでもよい。

本発明の上述の２つの態様に対する一実施形態において、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せ、または、本発明の組成物は、臨床的に意義のあるあらゆる状況で使用されてもよく、例えばこのような状況には、病的なフィブリン沈着の治療、眼の後部硝子体剥離の誘導、眼の硝子体液化の誘導、眼の硝子体切除の補助および容易化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体黄斑癒着の分離、黄斑円孔の閉鎖、酵素的壊死組織除去、循環フィブリノーゲンの減少、α２−抗プラスミンレベルの減少、またはトラベクレクトミーとの併用がある。

本発明の上述の２つの態様に対する別の実施形態において、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せ、または、本発明の組成物は、予防の目的で、または予防療法のための方法で使用されてもよい。予防的な使用法には、病的なフィブリン沈着の発症リスクが高い哺乳動物（肥満の、運動不足の、または大きな外科的イベントまたは手術を受ける予定のある哺乳動物等）における発症リスクの減少がある。予防的な使用法には、他にも、片眼が後部硝子体剥離および／または硝子体液化の誘導が必要であると診断される／された哺乳動物の、健康な方の眼における後部硝子体剥離および／または硝子体液化の誘導がある。

あるいは、本発明は、対象における病的なフィブリン沈着を治療する、分解する、軟化する、浸解する、溶解するための、フィブリン沈着の溶解を誘導するまたは促進するための方法に関し、前記方法は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量を接触させることを含み、前記接触により、前記病的なフィブリン沈着の治療、分解、軟化、浸解、溶解、または前記病的なフィブリン沈着の溶解の誘導もしくは促進が得られる。

本発明はまたさらに、眼における後部硝子体剥離を誘導する、および／または眼における硝子体の液化を誘導する、または眼における外科的な硝子体切除の容易化のための方法に関し、前記方法は、このような治療が必要な前記対象の眼に、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量を接触させることを含み、前記接触により、前記後部硝子体剥離および／または硝子体の前記液化の誘導、または前記外科的な硝子体切除の容易化が得られる。

本発明はまた、対象の損傷した組織の酵素的壊死組織除去のための方法に関し、前記方法は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量を前記損傷した組織に接触させることを含み、前記接触により、前記損傷した組織の前記酵素的壊死組織除去が得られる。

本発明の他の方法は、臨床的に関連のある、他のあらゆる適応症を治療するか予防し、対象の循環フィブリノーゲンを減少させるための、またはα２−抗プラスミンレベルを減少させるための方法を含み、前記方法は、本発明の単離されたプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはこれらのいずれかの組合せの有効量をそのような治療を必要とする対象に接触させることを含み、前記接触により、前記循環フィブリノーゲン、または前記α２−抗プラスミンレベルを減少させる。

一般的に、本発明のプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を含む本発明の薬剤または組成物は、最終的な使用方法および投与法によるが、抗凝血剤、さらなる血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤、または麻酔剤等の１つまたは複数のさらなる活性成分を含んでもよい。

「抗凝血剤」には、ヒルジン、ヘパリン、クマリン、低分子ヘパリン、トロンビン阻害物質、血小板抑制剤、血小板凝集阻害剤、凝固因子抑制因子、抗フィブリン抗体、および第ＶＩＩＩ因子阻害物質（国際公開第０１／０４２６９号パンフレットおよび国際公開第２００５／０１６４５５号パンフレットに記載されたもの等）がある。

「血栓溶解剤」には、野生型プラスミン、野生型プラスミノーゲン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡまたはアルテプラーゼ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびスタフィロキナーゼ、またはこれらのあらゆる変異体もしくは誘導体、例えばＡＰＳＡＣ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体）、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ｓｃｕＰＡ（単鎖ｕＰＡ）、またはこれらのいずれかの組合せがある。

「抗炎症剤」には、ステロイド剤（例えばプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ハイドロコルチゾン、プレドニゾン、トリアムシノロン、デキサメサゾン）および非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ；例えばアセトアミノフェン、イブプロフェン、アスピリン）がある。

「抗ウイルス剤」には、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、およびイドクスウリジンがある。

「抗菌剤」または抗生剤には、アンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、フラミセチン、ガチフロキサシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バシトラシン、ネオマイシンおよびポリミキシンがある。

「抗糸状菌／静真菌／抗真菌剤」には、フルコナゾール、アムホテリシン、クロトリマゾール、エコナゾール、イトラコナゾール、ミコナゾール、５−フルオロシトシン、ケトコナゾールおよびナタマイシンがある。

「血管新生阻害剤」には、抗−ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、または抗−ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）抗体等の抗体（またはそのフラグメント）、およびマクゲン（ペガプタニブナトリウム）、トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）、酢酸アネコルタブ、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ、ＡｄＰＥＤＦ（色素上皮由来因子を発現できるアデノベクター）、ＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦレセプター２の阻害剤、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦまたはＴＧＦ−βの阻害剤、シロリムス（ラパマイシン）およびエンドスタチン等の剤がある。

「抗有糸分裂剤」には、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルがある。

「抗ヒスタミン剤」には、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸フェニラミンがある。

「麻酔剤」には、ベンゾカイン、ブタムベン、ジブカイン、リドカイン、オキシブプロカイン、プラモキシン、プロパラカイン、プロキシメタカイン、テトラカインおよびアメトカインがある。

「接触する」は、本明細書で使用される場合、薬剤等の組成物と、前記組成物が接触する組織、体液、器官、生物体等との間の相互作用をもたらす、あらゆる投与の方法を指す。組成物と、組織、体液、器官、生物体等との間の相互作用は、組成物を投与して直ちに、またはほぼ直ちに生じさせることができ、長期間（期間は組成物を投与して直ちに、またはほぼ直ちに開始する）生じさせることができ、または、組成物を投与した時間に対して遅らせることができる。

病的なフィブリン沈着に接触するあらゆる方法が利用できるが、その方法は、フィブリン沈着にプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の有効量を（直ちに、遅延して、または長期間にわたって）提供する。そのようなフィブリン沈着が血塊を伴う場合、注射および／または点滴および／またはカテーテルによって、プラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を動脈内、静脈内または局所的に（血塊の近くに、または血塊中にさえも）送達できる。

酵素的壊死組織除去においてプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を使用する場合、局所に塗布できるゲル様の組成物、または液状の形態での適用も含んでよい。

眼の硝子体液および／または房水に接触するあらゆる方法が利用できるが、その方法では、硝子体液および／または房水にプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の有効量を（直ちに、遅延して、または長期間にわたって）提供する。硝子体液および／または房水に接触する方法の１つには、硝子体液および／または房水に直接注射する、１つまたは複数の眼球内注射がある。あるいは、前記接触方法には、結膜下、筋肉内、または静脈注射がある。さらに別の接触方法には、ＯＣＵＳＥＲＴ（登録商標）（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）または、ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）等の硝子体へ埋め込み型のデバイスを設置する方法がある。硝子体液および／または房水にプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の有効量を接触させる方法は、持効性製剤、徐放性製剤、または任意の適切な埋め込み型のデバイスを使用した、持続的な方法でもよい。

用語「有効量」は、本発明の薬剤、特に本発明の薬剤の活性成分、すなわち、プラスミンまたは活性切断変異体（または上述のそのあらゆる代替物）の投与措置を指す。有効量は、一般に、接触または投与の方法および治療される症状に対する調節により異なり、またそのような調節を必要とする。薬剤、特にその活性成分の有効量は、深刻なまたは不必要な毒性作用を引き起こさず、望ましい臨床結果または治療的効果もしくは予防的効果を得るために必要とされる量である。有効量を得るまたは維持するために、薬剤を単回投与または複数回投与してもよい。有効量はさらに、治療が必要な症状の重症度、または予防が必要な症状の予想される重症度により異なる場合があり、また有効量は、対象の全体的な健康状態および身体状況に依存し、通常、有効量を決定するには、治療を行う医師または内科医の判断が必要となるであろう。有効量はさらに、異なったタイプの投与の組合せによって決定してもよい。薬剤は、溶液（液体、またはゲル状等の半液体、または分散液もしくは懸濁液内、コロイド、エマルジョン内、ナノ粒子懸濁液）として、または固形物（例えば錠剤、小型錠剤、ハードまたはソフトカプセル）として投与してもよい。

血栓溶解の目的では、プラスミン治療におけるプラスミンの用量および治療期間は、典型的には血塊の大きさと場所、また対象の身体の大きさ、体重および年齢に依存する。血塊が静脈性の場合、プラスミンでの治療は数日継続する可能性があるが、血塊が動脈性の場合、プラスミン治療は数時間しか必要とされない可能性がある。心筋梗塞症では、短い単回投与で治療してもよいが、血栓静脈炎および肺塞栓症等の症状には、長期間の複数回投与の治療を必要とする可能性がある。長期間の持続的および／または間欠的な血栓溶解剤プラスミンでの治療を、冠状動脈閉塞症の治療に、または血栓形成を発症するリスクが高いとされる対象において、血栓形成のリスクを減らすための予防的治療に適用してもよい。プラスミンの用量に影響するさらなる因子には、α２−抗プラスミンおよび／またはα２−マクログロブリン等のプラスミン阻害因子の循環レベルがあり、その初期レベルは対象に依存する。全循環α２−抗プラスミンの多くとも１５％が残存し、効果的な血栓溶解療法を達成するように、プラスミン用量を調節することが望ましいであろう。血栓溶解を誘導する目的で、血栓の近位部のそばにプラスミン、またはそのあらゆる変異体または誘導体、またはその代替物を送達する接触方法は、血清抑制因子への曝露が減少するため有利となる可能性がある。そのような接触方法には、一般的にカテーテルデバイスによる運搬がある。血栓溶解に対する使用でのプラスミン用量は、一般的に５００マイクログラム／体重約１０ミリグラム／ｋｇ体重の範囲にあり、単回ボーラス投与、または１回の初回ボーラス投与とその後の１回または反復ボーラス投与に分けて投与する。プラスミンを、あるいは点滴、またはドラッグデリバリー用のマイクロポンプによって長期間にわたり投与してもよい。持続的投与のためのプラスミン用量は１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間までの範囲にあってもよい。

後部硝子体剥離、硝子体液化、硝子体の血液または出血のクリアランス、または硝子体腔からの有毒物質もしくは異物のクリアランスを誘導するためのプラスミン用量は一般的に、片眼１用量あたり、約０．１マイクログラム〜約２５０マイクログラムまでの範囲にあってもよく、片眼１用量あたり約５０マイクロリットル〜約３００マイクロリットルまでの希釈剤または担体容積内で送達できる。希釈剤または担体は、例えば、無菌の平衡塩類溶液（ＢＳＳまたはＢＳＳ Ｐｌｕｓ）、生理的食塩溶液、または１〜１０ｍＭのクエン酸等の酸を含む溶液であってもよい。一実施形態においては、プラスミンを、０．１ｍＬ希釈剤または担体に含まれる１２５マイクログラムの用量で眼に送達する。外科的な硝子体切除が予定されている場合、前記プラスミンを硝子体切除の１５〜３００分前、または１５〜１２０分前に眼に送達してもよい。あるいはプラスミンを、外科用硝子体切除を回避するために、または、プラスミン治療それ自体では後部硝子体剥離を完全に達成できない場合、後の外科的な硝子体切除を容易にするために眼に投与する。プラスミンの代替源としてプラスミノーゲンを使用する場合（「プラスミン」の定義を参照）、片眼当たり２５０マイクログラムまでのプラスミノーゲンを使用でき、前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性化因子としてウロキナーゼまたはストレプトキナーゼを２０００ＩＵまで、またはｔＰＡを２５マイクログラムまで併用してもよい。眼に使用される場合、プラスミンまたはプラスミノーゲンの投与ではさらに、空気、膨張気体または液化可能な気体、またはそれらの混合物等の気体状の補助剤を、眼に無毒である限り、併用して投与してもよい。他の適切な気体には、ＳＦ６（六フッ化硫黄）およびＣ２Ｆ６（ヘキサフルオロエタン）、Ｃ３Ｆ８（オクタフルオロプロパン）、Ｃ４Ｆ８（オクタフルオロシクロブタン）等のパーフルオロカーボン、酸素、窒素、二酸化炭素、アルゴン、および他の不活性ガスがある。眼に使用される気体材料の容積は、気体材料、対象、および望ましい結果に依存する。例えば、後眼房に注入される空気の容積は約０．５ｍＬ〜約０．９ｍＬの範囲にあり得る。ＳＦ６およびパーフルオロカーボンの気体等の他の気体材料では、約０．３ｍＬ〜０．５ｍＬの範囲にあり得る。気体材料は、後部硝子体膜に硝子体液を圧迫し、眼を損傷させずに硝子体液内に空間を形成するのに十分な量で、眼の後眼房へ注入することが好ましい。好ましい実施形態では、気体状補助剤を硝子体液に注入し、眼球内腔の内部体積の約４０％〜約６０％を占める空間を形成する。

上に詳述された用量は、いかなる場合にも制限を意味する数値ではない。前記用量はさらに、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲン、またはその任意の活性または活性可能な切断変異体を指す。本発明の安定性が増加したプラスミン（またはそのあらゆる変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を使用する場合の用量は、本発明のプラスミンの最終的な安定度および残存活性に依るが、野生型プラスミンで得られるのと同じ、または全体的により優れた臨床的効果を得るため、同程度の用量、より高い用量、またはより低い用量であってもよい。本発明のプラスミンの用量は、α２−抗プラスミン等の内因性阻害因子による阻害速度にも依存する。

本明細書で開示された研究に沿って、本発明はさらに、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法に関し、前記方法が、
（ｉ）位置［Ｐ＋／−ｎ］のアミノ酸を位置［Ｐ＋／−ｎ］の天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ変異させるステップで、位置Ｐのアミノ酸はアルギニンまたはリジンであり、ｎは１、２、３、４または５であり；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップで、これは上述のように、例えば、発色性または生物学的基質活性分析によって測定され；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において測定された突然変異体の自己タンパク質分解安定性を野生型プラスミンの自己タンパク質分解安定性と比較するステップ；および
（ｉｖ）野生型プラスミンより自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として（ｉｉｉ）から選択するステップ；
を含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。上記の方法において、位置［Ｐ＋／−ｎ］のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもないことが好ましい。

本発明は、同様に、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法に関し、前記方法が、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３８のグルタミンアミノ酸、または非ヒトプラスミンの対応するグルタミン酸を、前記位置１３８の天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させること、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定すること、これは上述のように、例えば、発色性または生物学的基質活性分析を用いて測定または分析され；および
（ｉｉｉ）自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として（ｉｉ）から選択すること；を含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である。

上記のスクリーニング法のうちのいずれかにおいて、前記触媒領域はさらに、位置Ｐ、Ｐ’、Ｐ’’等の１つまたは複数の野生型リジンまたはアルギニンの、非リジン、非アルギニンアミノ酸への突然変異を含んでいてもよい。

上記のスクリーニング法は、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップをさらに含んでもよい。

薬物を含む多数の製品（ここでは特に、使用者が利用できる状態にある活性成分、すなわち、対象に投与できる最終的な製剤として理解される）、およびバルク貯蔵された薬物の活性成分は、通常利用に先立ってかなりの時間貯蔵される。可能な限り製品の有効期限を延ばすことが目的である。有効期限とは、製品が安全に使用され得、その有用性が効力を維持する、つまり薬剤の場合はその活性が、および／またはその活性成分が効力を維持する期間を意味する。典型的には、有効期限は製品またはその包装に表示される。一旦有効期限が切れると、製品の安全性と有用性の効力は保証されない。製品の貯蔵においてさらに重要な側面は、望ましい有効期限を達成できる貯蔵温度である。例えば、＋４℃または平均的な冷蔵庫の温度で貯蔵された製品の有効期限は、１２ヶ月になる可能性があるが、−２０℃または平均的な冷凍庫の温度で貯蔵された同じ製品の有効期限は、３６ヶ月になる可能性がある。しかしながら、物流的に、例えば−２０℃の凍結温度でコールドチェーンを維持するのは、＋４℃でコールドチェーンを維持するより、著しく複雑で困難で費用がかかる。したがって、製品が＋４℃で貯蔵されながら、短くはあるが十分な長さの有効期限を有することは、依然として大変魅力的である可能性がある。本発明は、プラスミン、もしくはその任意の活性断片もしくは誘導体、またはプラスミンもしくはその任意の活性誘導体を含む組成物の有効期限または長期貯蔵安定性を延長、強化、増加させるための解決策を提供する。解決策では、本明細書に記載した、安定性を増強したプラスミン変異体を提供し、これにより、内因的に有効期限を増加、強化、延長する。

本発明は、同様にプラスミンを含む組成物の長期貯蔵安定性を強化する方法に関し、前記方法は、タンパク質分解活性の著しい損失がなく長期にわたり貯蔵できる、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体を同定するステップを含む。長期安定性の測定には、本発明のプラスミン製剤を等分し、活性測定を想定した貯蔵期間中に反復して行う。想定した貯蔵期間が、例えば２４か月である場合、活性測定を例えば毎月行い得る。想定した貯蔵期間終了時点でのタンパク質分解活性の許容可能な減少量は、大部分は想定した臨床適用によるが、例えば１０％〜１５％を上回らないのが一般的であり得る。

本発明はさらに、本発明のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法、つまりプラスミノーゲンを産生するための方法に関し、この方法は、その触媒領域において、位置Ｐの内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置［Ｐ＋／−ｎ］（１、２、３、４および５から成る群から選択される整数である）の少なくとも１つの内部アミノ酸が、位置Ｐの内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異していることを含む。このような方法は、
（ｉ）本発明のプラスミノーゲン変異体をコードする核酸を前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて（ｉ）で得られた宿主細胞を生育するステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現したプラスミノーゲンを回収するステップとを含む。
この方法には、最後に（ｉｉｉ）で回収されたプラスミノーゲンの精製を含むステップ（ｉｖ）を付加できる。

発現および産生に適した宿主細胞および方法は、例えば国際公開第９０／１３６４０号パンフレット（昆虫細胞）、国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレットおよび国際公開第０３／０６６８４２号パンフレット（酵母細胞）、国際公開第２００８／０５４５９２号パンフレット（細菌細胞／リフォールディングプロセス）および国際公開第２００５／０７８１０９号パンフレット（ウキクサ科形質転換植物または形質転換植物細胞）に開示されている。

本発明はさらに、本発明のプラスミン変異体を産生するための方法、つまりプラスミンを産生するための方法を包含し、この方法は、触媒領域において位置Ｐの内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置［Ｐ＋／−ｎ］（１、２、３、４および５から成る群から選択される整数である）の少なくとも１つの内部アミノ酸が、位置Ｐの内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解しにくいかまたは全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異していることを含む。そのような方法は一般的に、上述のように本発明のプラスミノーゲンを産生するステップを含み、さらに、適切なプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、ｕＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、またはその任意の変異体等）を使用して、本発明のプラスミノーゲンを本発明のプラスミンへ活性化するステップを含む。最終的には、活性化に先立ってプラスミノーゲンを精製する、活性化したプラスミンを精製する、ならびに／または活性プラスミンを上述のように誘導する、および／もしくは可逆的に不活化する、および／もしくは、任意で適切な貯蔵条件（溶液の安定化、凍結乾燥および／または低温）下に置く、１つまたは複数のステップを付加できる。

上記の産生方法のいずれかにおいて、前記触媒領域はさらに、位置Ｐ、Ｐ’、Ｐ’’等の１つまたは複数の野生型リジンまたはアルギニンの、非リジンおよび非アルギニンアミノ酸への突然変異を含んでいてもよい。

上述のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体のいずれかは、例えば（ファージディスプレイの場合のような）発現している宿主の表面に付着または結合していない、遊離または可溶性の形態で得られるのが好ましい。

本発明はまた、本発明のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする、単数または複数の単離された核酸配列に関する。本発明は、またそのような核酸を含む単数または複数の組換えベクターに関する。本発明はまた、そのような核酸、またはそのような組換えベクターで形質転換された単数または複数の宿主細胞に関する。

実施例１ プラスミノーゲン変異体の作成、発現、および精製、ならびにプラスミンへの活性化。
発現ベクター
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入したｐＰＩＣＺαＡ分泌ベクターを、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組み換えヒトマイクロプラスミノーゲンの発現および分泌のために使用した。

このベクターは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子プレプロペプチドの分泌シグナルを含む。ＸｈｏＩ認識配列は、Ｌｙｓ−Ａｒｇ部位のすぐ上流の、α−因子分泌シグナルのカルボキシ末端に存在し、Ｌｙｓ−Ａｒｇ部位は、成熟タンパク質から分泌シグナルを除去するためにＫｅｘ２により切断される。このＸｈｏＩ制限酵素部位を、５’末端でＸｈｏＩおよびＫｅｘ２認識部位を有する遺伝子を合成して、目的の遺伝子をＫｅｘ２切断部位に隣接させてクローニングするために使用してもよい。次いで、目的の組み換えの遺伝子は、天然のＮＨ_２終端を有して発現する。異種遺伝子のクローンニングを容易にするために、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩのための認識部位を有するマルチプルクローニングサイトが、ｐＰＩＣＺαＡベクターのα−因子分泌シグナルからすぐ下流に作られている。

遺伝子合成
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるヒトマイクロプラスミノーゲンの発現を改善するために、ヒトマイクロプラスミノーゲンおよびその変異体をコードする遺伝子を、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）にとって好ましいコドン利用を考慮に入れて、新しく合成した。

コドン最適化遺伝子配列を設計するため、ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列（配列番号１９）を、プログラムＧｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒにインポートした。Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒは、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により開発され、インターネットで自由に利用できる。この配列を、プログラムで提供されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）コドン利用表を使用して、ＤＮＡ塩基配列へ逆翻訳した。次いで、核酸配列を手動でチェックし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のコドン利用により適するように調整した。さらに、可能な場合、６塩基対パリンドローム配列および核酸反復を除去した。５’末端に、ＸｈｏＩ制限酵素部位およびＫｅｘ２切断部位を、３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を付加した。得られた配列を国際特許出願ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１０／０５９９０２号明細書に開示する。

アミノ酸残基を変化させるため、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して、野生型のマイクロプラスミノーゲン配列に、または特定の自己触媒切断部位が既に変化している変異体のマイクロプラスミノーゲン配列に、突然変異を部位特異的突然変異誘発で導入した（国際特許出願ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１０／０５９９０２号明細書を参照）。大腸菌（Ｅ。ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を部位特異的変異誘発ミックスを使用して形質転換し、アンピシリン抵抗性のクローンを選択した。得られたプラスミドクローンの配列決定により、目的のマイクロプラスミノーゲンのコード領域に正確に突然変異誘発がなされたこと、およびコード領域に不要な突然変異がないことが確認された。

下記のプライマーを部位特異的突然変異誘発に使用した：
Ｇｌｕ１３８Ｇｌｎ突然変異
および

第１の変異体において、位置１３８のグルタミン酸はグルタミンに置換された。Ｇｌｕ１３８は位置４８１〜４８３のコドンＧＡＡによりコードされている。ヌクレオチドＧＡＡ（位置４８１〜４８３）をＣＡＧに変化させ、マイクロプラスミノーゲンタンパク質においてＧｌｕ１３８をＧｌｎに変化させた（核酸配列は配列番号２２に示し、推定されるアミノ酸配列は配列番号２３に示す。）

第２の変異体において、位置１４７のリジンがグルタミン酸に既に置換されている変異マイクロプラスミノーゲンにおいて、位置１３８のグルタミン酸を上記のようにグルタミンに置換した（核酸配列は配列番号２４に示し、推定されるアミノ酸配列は配列番号２５に示す）。

第３の変異体において、位置１４７のリジンが既にヒスチジンに置換され、位置１５８のアルギニンが既にヒスチジンに置換されている変異マイクロプラスミノーゲンにおいて、位置１３８のグルタミン酸を上記のようにグルタミンに置換した（核酸配列は配列番号２６に示し、推定されるアミノ酸配列は配列番号２７に示す）。

マイクロプラスミノーゲン変異体の発現とプラスミンへの活性化
活性化に先立って、マイクロプラスミノーゲン突然変異体を免疫アフィニティによって直接ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）上清から精製した。マウスの抗ヒトマイクロプラスミン抗体（抗原としてマイクロプラスミンを使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスで産生；ハイブリドーマセルライン５Ｄ１０Ａ４により産生、ＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ Ｎ．Ｖ．で入手可能）をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのプロトコル番号７１５０００１５ＡＤのセファロースビーズに結合した。このプロトコルに従い、７．５ｍＬの免疫アフィニティ樹脂を４５ｍｇの抗体から調製し、ＸＫ１６／２０カラムに詰めた。未精製の上清２００〜４００ｍＬ（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）培養物を０．２μでろ過／ｐＨ６．０）を直接５Ｄ１０Ａ４アフィニティーカラムに添加した。洗浄ステップ（１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．２、カラム容量の１０倍量）後、マイクロプラスミノーゲン変異体を０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０の緩衝剤で溶出し、溶出液を中和し、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２に透析した）。

マイクロプラスミノーゲン変異体を、国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例２に概説される手順に基本的に従って活性化した。

例として、上記突然変異体マイクロプラスミノーゲンＥ１３８Ｑおよび対応する活性化マイクロプラスミンを図３に示す。

上述の野生型および変異マイクロプラスミノーゲン種のアミノ酸配列および核酸配列を以下に記載する。

配列番号１９−野生型ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列
配列番号２２−Ｇｌｕ１３８Ｇｌｎ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異させたコドンは太字イタリック体に下線、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に下線）
配列番号２３−配列番号２２の推定アミノ酸配列（下線を引いたＮ末端アミノ酸「ＬＥＫＲ」は導入されたＸｈｏＩ＋Ｋｅｘ２切断部位によりコードされる；導入されたアミノ酸突然変異は太字／イタリック体で示し下線を引く。）
配列番号２４−Ｇｌｕ１３８ＧｌｎとＬｙｓ１４７Ｇｌｕ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異させたコドンは太字イタリック体に下線、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に下線）
配列番号２５−配列番号２４の推定アミノ酸配列（下線を引いたＮ末端アミノ酸「ＬＥＫＲ」は導入されたＸｈｏＩ＋Ｋｅｘ２切断部位によりコードされる；導入されたアミノ酸突然変異は太字イタリック体で示し下線を引く。）
配列番号２６−Ｇｌｕ１３８Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１４７ＨｉｓおよびＡｒｇ１５８Ｈｉｓ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異させたコドンは太字イタリック体に下線、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位に下線）
配列番号２７−配列番号２６の推定アミノ酸配列（下線を引いたＮ末端アミノ酸「ＬＥＫＲ」は導入されたＸｈｏＩ＋Ｋｅｘ２切断部位によりコードされる；導入されたアミノ酸突然変異は太字イタリック体で示し下線を引く。）

マイクロプラスミン変異体の自己分解速度定数およびカイネティクスパラメーター
様々なマイクロプラスミン突然変異体に対して得られたｋ_ｃａｔ／Ｋｍ値および自己分解速度定数を下の表２に記載する。これらの値は、国際特許出願ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１０／０５９９０２号明細書の実施例３および４に記載の方法に基本的に従って得た。

実施例２ インビトロまたはインビボモデルにおけるプラスミン変異体の治療効果。
２．１脳梗塞サイズに対するプラスミン変異体の影響。
国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例２の記載のように、またはＷｅｌｓｈら（１９８７、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ４９、８４６−８５１）によれば、脳梗塞サイズを減少させる本発明のプラスミン変異体の効果を、マウスの脳梗塞モデルにおいて見ることができる。野生型プラスミンの脳梗塞サイズへの有益な効果が、国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例５で実証されている。類似の実験を本発明のいずれかのプラスミン変異体で行い、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。

２．２ プラスミン変異体のインビボの血栓溶解活性
ウサギの体外ループ血栓溶解モデル（国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例６；Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓら、１９８７、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ５８、１０７ 要約書３７７）、イヌの冠動脈回旋枝の銅コイル誘導血栓症モデル（国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例８；Ｂｅｒｇｍａｎｎら、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０、１１８１−１１８３）、またはウサギの頚静脈血栓症モデル（Ｃｏｌｌｅｎら、１９８３、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７１、３６８−３７６）を本発明のプラスミン変異体のインビボの血栓溶解活性を実証するために使用できる。国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例７および９、およびＣｏｌｌｅｎら（１９８３）による記載にあるように、血栓溶解への野生型プラスミンの有益な効果をこれらのモデルで実証した。類似の実験を本発明のプラスミン変異体のいずれかで行い、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。

２．３プラスミン変異体のインビトロの血栓溶解活性
末梢動脈閉鎖（ＰＡＯ）のインビトロモデルは国際公開第０１／３６６０９号パンフレットの実施例６に記載されており、野生型プラスミンの血栓溶解の効果をこのモデルにおいて実証した。類似の実験を本発明のプラスミン変異体のいずれかで行い、これらのプラスミン変異体の末梢動脈閉鎖の血栓溶解への有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。

２．４ プラスミン変異体によって誘導された眼の硝子体の液化および後部硝子体剥離
国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例５は、死後のブタの眼における硝子体の液化におけるマイクロプラスミンの効果と、効果を測定するための分析を開示している。国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例６は、死後のヒトの眼における後部硝子体剥離（ＰＶＤ）の誘導におけるマイクロプラスミンの効果の他に、効果を測定するための分析を開示する。本発明のプラスミン変異体による硝子体液化およびＰＶＤの誘導を、類似の死後モデルにおいて実証する。

２．５ プラスミン変異体によって誘導されたインビボのＰＶＤ
国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例７は、インビボのネコのモデルにおけるＰＶＤの誘導に対するマイクロプラスミンの効果の他に、その効果を測定するための分析を開示している。本発明のプラスミン変異体によるＰＶＤの誘導を、インビボのモデルにおいて実証する。

Claims (26)

1. （ｉ）その触媒領域において、内部位置Ｐのリジンとアルギニン、および位置［Ｐ＋／−ｎ］の少なくとも１つのアミノ酸の突然変異を含み、ｎは１、２、３、４または５であり、位置［Ｐ＋／−ｎ］の前記アミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；および
   （ｉｉ）（ｉ）の前記突然変異の存在により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定される
   ことを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体、もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかの、タンパク質分解性が活性な、もしくは可逆的に不活性な誘導体。
2. その触媒領域において、少なくとも２つの内部アミノ酸の突然変異を含み、これは：
   −位置［Ｐ＋／−ｎ］と［Ｐ＋／−ｎ’］においてであり；ｎとｎ’は１、２、３、４または５であり；位置［Ｐ＋／−ｎ］とと［Ｐ＋／−ｎ’］の前記アミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；ｎとｎ’がともにＰに加算されるか、またはＰから減算されるかのいずれかの場合、両者は互いに異なっている；または
   −位置［Ｐ＋／−ｎ］と［Ｐ’＋／−ｎ］においてであり；Ｐ’はＰおよびＰ’の大きい方の値であり；位置Ｐ’の前記アミノ酸はリジンまたはアルギニンであり；ｎは１、２、３、４または５であり；位置［Ｐ’＋／−ｎ］の前記アミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく；［Ｐ＋ｎ］および［Ｐ’−ｎ］の間に重複する位置が有る場合、これらは排除され；
   前記少なくとも２つの内部アミノ酸の前記突然変異の存在により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定される、請求項１に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
3. 位置Ｐおよび／またはＰ’のうちのいずれかのリジンまたはアルギニンアミノ酸を含む前記触媒領域のリジンまたはアルギニンアミノ酸のいずれか１つ以上の、非リジン非アルギニンアミノ酸への突然変異をさらに含む、請求項１または２に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
4. 位置ＰまたはＰ’の前記内部アミノ酸が、
   （ｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するリジンもしくはアルギニン；
   （ｉｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するリジンもしくはアルギニン；または
   （ｉｉｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１５８のアルギニン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するアルギニンもしくはリジン；
   から選択され、
   前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン、プラスミン、またはプラスミン誘導体。
5. 位置［Ｐ＋／−ｎ］の前記アミノ酸が、前記ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３８のアミノ酸のグルタミン酸、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するアミノ酸残基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン、プラスミンまたはプラスミン誘導体。
6. 自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
7. 触媒定数ｋ_ｃａｔが、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
8. 自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大９５％であり、触媒定数ｋ_ｃａｔが、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
9. 前記プラスミノーゲンまたは前記プラスミンが、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミジプラスミノーゲンまたはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
10. 薬剤として使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ。
11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物。
12. 抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤の少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 対象おける病的なフィブリン沈着の溶解を誘発する、または促進するための；眼における後部硝子体剥離を誘導するための、および／もしくは眼における硝子体の液化を誘導するための、または対象の眼における硝子体切除手術を容易にするための；対象の損傷した組織の酵素的壊死組織除去のための；対象の循環フィブリノーゲンを減少させるための、もしくはα２−抗プラスミンレベルを減少させるための；または病的なフィブリン沈着のリスクを減少させるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
14. 安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）位置［Ｐ＋／−ｎ］のアミノ酸を変異させるステップであって、位置Ｐの前記アミノ酸はアルギニンまたはリジンであり、ｎは１、２、３、４または５であるステップと；
    （ｉｉ）（ｉ）から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップであって、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定される、ステップと；
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）において測定された前記突然変異体の自己タンパク質分解安定性を野生型プラスミンの自己タンパク質分解安定性と比較するステップと；
    （ｉＶ）野生型プラスミンより自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として（ｉｉｉ）から選択するステップと
    含む方法。
15. 安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）ヒトプラスミンの触媒領域の位置１３８のグルタミン酸アミノ酸、または、非ヒトプラスミンの対応するアミノ酸残基を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させるステップと、
    （ｉｉ）（ｉ）から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップと、
    （ｉｉｉ）安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として、自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を（ｉｉ）から選択するステップと
    を含み、
    前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、方法。
16. 前記安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
17. タンパク質分解活性を著しく損なわず長期にわたり貯蔵できる請求項１〜９のいずれか一項の安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体を同定するステップを含む、プラスミン含有組成物の長期貯蔵安定性を強化するための方法。
18. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて前記宿主細胞を生育するステップと；
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと
    を含む方法。
19. （ｉｉｉ）において回収された前記プラスミノーゲンを精製するステップ（ｉｖ）をさらに含む請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞内で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて生育するステップと；
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと；
    （ｉｖ）（ｉｉｉ）の前記プラスミノーゲンをプラスミンへ活性化するステップと
    を含む方法。
21. （ｉｉｉ）において回収された前記プラスミノーゲンを（ｉｖ）における活性化に先立って精製する、請求項２０に記載の方法。
22. （ｉｖ）において得られた前記活性プラスミンを精製する、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記活性プラスミンが誘導される、および／または可逆的に不活化される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離された核酸配列。
25. 請求項２４に記載の核酸を含む組換えベクター。
26. 請求項２４に記載の核酸、または請求項２５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。