ES2583082T3

ES2583082T3 - Variantes de plasminógeno y plasmina

Info

Publication number: ES2583082T3
Application number: ES12700154.3T
Authority: ES
Inventors: Richard Reinier Zwaal
Original assignee: ThromboGenics NV
Current assignee: Oxurion NV
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2016-09-19
Anticipated expiration: 2032-01-04
Also published as: JP6085568B2; US9121014B2; JP2014504867A; AU2012204874A1; DK2661493T3; WO2012093132A1; MX337248B; CA2823491A1; EP2661493B1; KR20140015289A; CN103384722B; US20130273028A1; NZ612836A; AU2012204874B2; CN103384722A; AU2012204874B9; ZA201304937B; BR112013017172A2; RU2604807C2; EP2661493A1

Abstract

Una variante de plasminógeno aislada o plasmina obtenida a partir de esta, o una variante de plasmina aislada, o un derivado proteolíticamente activo o inactivo reversible de cualquiera de dichas plasminas caracterizada por que: comprende en su dominio catalítico una mutación del aminoácido glutamato en la posición 138 del dominio catalítico de plasmina humana, o del resto de aminoácido correspondiente de un dominio catalítico de plasmina no humana, en el que dicho dominio catalítico de plasmina humana comienza por el aminoácido valina en la posición 1, que es el mismo aminoácido valina que aparece en la posición 562 de Glu-plasminógeno humano.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

aminoácidos, carga de aminoácidos, polaridad de aminoácidos, y/o índice de hidropatía de aminoácidos (véase la Tabla 1). Además, la disponibilidad de la estructura cristalina de plasminógeno y microplasmina (MMDB ID: 12717; PDB ID: 1DDJ; Wang et al., 2001, J Mol Biol 295, 903-914) es de gran valor en la ayuda a la identificación de los aminoácidos mutantes, de modo tal que la molécula de plasmina o plasminógeno mutante resultante retiene la actividad proteolítica. Además, es de esperar que la mutación de un aminoácido de tipo natural en una posición dada [P+/-n], y opcionalmente además en una o más de una posición dada P, P', P", etc., en uno cualquiera de los aminoácidos de un grupo dado proporcionará resultados similares. En base a la Tabla 1, dichos grupos dados pueden definirse de la siguiente manera:

-aminoácidos alifáticos hidrofóbos: Met, lie, Leu y Val -aminoácidos aromáticos hidrófobos: Phe -aminoácidos ácidos hidrófilos: Asp, Glu, Asn y Gln -aminoácidos básicos hidrófilos: Arg, Lys e His -aminoácidos alifáticos moderadamente hidrófobos: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Pro -aminoácidos aromáticos moderadamente hidrófobos: Tyr y Trp.

De estos, y para el fin de la mutación, Cys y Pro pueden ser aminoácidos sustitutos menos favorables de aminoácidos de plasmina o plasminógeno de tipo natural debido a la creación del posible grupo tiol libre por Cys, o debido a la alteración más extensa de la estructura de la proteína por Pro. Otras sustituciones de aminoácidos incluyen la mutación de un aminoácido de tipo natural en una posición [P+/-n], y opcionalmente además, en una o más de una posición P, P', P", etc., de un dominio catalítico de plasmina(plasminógeno) en un aminoácido no natural

o no canónico, o en análogos de aminoácidos, tales como norleucina, norvalina, ornitina o citrulina (para un listado más extenso véase, p. ej., Hendrickson et al. 2004, Annu Rev Biochem 73, 147-176).

Tabla 1. Características de los aminoácidos.

Aminoácidos: Polaridad de la cadena lateral Carga de la cadena lateral (en pH 7) Índice hidropático

Alanina: Ala A no polar neutral 1,8

Arginina: Arg R polar positiva -4,5

Asparagina: Asn N polar neutral -3,5

Ácido aspártico: Asp D polar negativa -3,5

Cisteína: Cys C no polar neutral 2,5

Ácido glutámico: Glu E polar negativa -3,5

Glutamina: Gln Q polar neutral -3,5

Glicina: Gly G no polar neutral -0,4

Histidina: His H polar positiva -3,2

Isoleucina: Ile I no polar neutral 4,5

Leucina: Leu L no polar neutral 3,8

Lisina: Lys K polar positiva -3,9

Metionina: Met M no polar neutral 1,9

Fenilalanina: Phe F no polar neutral 2,8

Prolina: Pro P no polar neutral -1,6

Serina: Ser S polar neutral -0,8

Treonina: Thr T polar neutral -0,7

Triptófano: Trp W no polar neutral -0,9

Tirosina: Tyr Y polar neutral -1,3

Valina: Val V no polar neutral 4,2

En las condiciones del ensayo (degradación autoproteolítica no forzada en pH neutro) como se describe en la solicitud de patente internacional n.º PCT/EP2010/059902, un número limitado de escisiones autoproteolíticas se produce en el dominio catalítico de la plasmina. Estas escisiones se produjeron en lisina 137 del dominio catalítico de plasmina humana, en lisina 147 del dominio catalítico de plasmina humana y en arginina 158 del dominio catalítico de plasmina humana. Esto, sin embargo, no excluye la posibilidad de la existencia de otros enlaces peptídicos que se escinden autoproteolíticamente.

Por consiguiente, en relación con las variantes de plasminógeno, variantes de plasmina, o derivados de plasmina según la invención, estos pueden comprender adicionalmente en su dominio catalítico la mutación de un aminoácido lisina o arginina seleccionado entre:

(i): lisina en la posición 137 del dominio catalítico de plasmina humana, o lisina o arginina correspondiente de una plasmina no humana;

(ii): lisina en la posición 147 del dominio catalítico de plasmina humana, o lisina o arginina correspondiente de una plasmina no humana; y/o

5

15

25

35

45

55

65

(iii) arginina en la posición 158 del dominio catalítico de plasmina humana, o lisina o arginina correspondiente de una plasmina no humana;

en el que dicho dominio catalítico de plasmina humana comienza por el aminoácido valina en la posición 1, que es el mismo aminoácido valina que aparece en la posición 562 de Glu-plasminógeno humano. Para esclarecer la numeración de los aminoácidos en el plasminógeno humano y el dominio catalítico de plasmina humana, se hace referencia a la Figura 1 en el presente documento.

En particular, en lo anterior, dicho

glutamato en la posición 138 del dominio catalítico de plasmina humana, o el resto de aminoácido correspondiente de una plasmina no humana se muta en otro aminoácido ácido hidrófilo, p. ej., aspartato, asparagina o glutamina.

La identificación de un aminoácido en una secuencia de plasmina(plasminógeno) no humano que "corresponde a" (es decir, la identificación de un aminoácido "correspondiente") un aminoácido en la plasmina(plasminógeno) humano implica primero la alineación de ambas secuencias aminoácidas. Dicha alineación puede requerir alguna optimización, como la introducción de huecos menores en una o ambas de las secuencias alineadas, para dar lugar a la identidad y homología más alta. En segundo lugar, se identifica el aminoácido en la plasmina(plasminógeno) no humano alineándose con el aminoácido en la plasmina(plasminógeno) humano y en el presente documento se refiere como el aminoácido "correspondiente". La Figura 2 en el presente documento representa una alineación de secuencias proteicas de plasminógeno de mamífero disponibles públicamente, y destaca los aminoácidos de particular interés en la actual invención en la secuencia de plasminógeno humano (línea 1) junto con los aminoácidos correspondientes en las secuencias de plasminógeno no humano (líneas 2-18). Los aminoácidos de particular interés son Lys en la posición 698 (posición 137 en el dominio catalítico, véase la Figura 1), Lys en la posición 708 (posición 147 en el dominio catalítico, véase la Figura 1) y Arg en la posición 719 (posición 158 en el dominio catalítico, véase la Figura1).

"Plasmina", también conocida como fibrinolisina o lisofibrina, es una proteasa tipo serina que resulta de la activación del plasminógeno zimógeno. La activación es el resultado de una escisión proteolítica entre los aminoácidos 561 y 562 (numeración relativa al Glu-plasminógeno humano). La plasmina lleva una cadena pesada que comprende 5 dominios kringle y una cadena ligera que comprende el dominio catalítico. El plasminógeno puede enriquecerse a partir del plasma sanguíneo, p. ej., mediante cromatografía por afinidad de lisina (Deutsch y Mertz, 1970, Science 170, 1095-1096). El truncamiento de la molécula de la plasmina (fuera y/o en el dominio catalítico de plasmina) es posible siempre y cuando el dominio catalítico siga siendo funcional, dicho truncamiento da lugar por consiguiente a la formación de un "derivado proteolíticamente activo" de plasmina. Como tal, uno o más de los 5 dominios kringle pueden eliminarse total o parcialmente. Las plasminas truncadas que carecen de uno o más dominios kringle y/o partes que carecen de uno o más dominios kringle, se conciben por tanto en la presente invención como ejemplos de derivados proteolíticamente activos de plasmina. Ejemplos de variantes truncadas de plasmina incluyen, entre otros, "midiplasmina", "miniplasmina", "microplasmina", y "deltaplasmina". La midiplasmina carece básicamente de los dominios kringle 1 a 3 (p. ej., Christensen et al., 1995, Biochem J 305, 97-102). La miniplasmina se obtuvo originalmente por digestión limitada de plasmina con elastasa y carece básicamente de los dominios kringle 1 a 4 (p. ej., Christensen et al., 1979, Biochim Biophys Acta 567, 472-481; Powell y Castellino, 1980, J Biol Chem 255, 5329). La miniplasmina se ha producido posteriormente de forma recombinante (documento WO 2002/050290). La microplasmina se obtuvo originalmente mediante incubación de plasmina en un pH elevado y carece básicamente de todos los dominios kringle (p. ej., documento WO 89/01336). Mientras que la microplasmina obtenida a partir de la incubación de plasmina en un pH elevado contiene los aminoácidos carboxi-terminales 30-31 de la cadena pesada, una variante de microplasmina producida de forma recombinante contiene los aminoácidos carboxiterminales 19 de la cadena pesada (WO 2002/050290). Esto ilustra la variabilidad molecular permitida en un género de plasmina dado como el género de microplasmina (p. ej., especies múltiples forman el género de microplasmina). La deltaplasmina es una versión recombinante de plasmina en la que el dominio kringle 1 o dominio kringle 4 se vincula directamente al dominio catalítico (documento WO 2005/105990). Las variantes truncadas descritas previamente de la plasmina se obtienen por activación de "midiplasminógeno", "miniplasminógeno", "microplasminógeno" y "deltaplasminógeno", respectivamente. Con el fin de ser activable, un plasminógeno truncado necesita comprender un número mínimo de aminoácidos del enlazador entre el dominio kringle (como dominio kringle 5 en miniplasmina) y el dominio catalítico, o C-terminal del dominio catalítico en caso de plasmina truncada sin kringle (véase, p. ej., Wang et al., 1995, Protein Science 4, 1758-1767). En el contexto de la presente invención puede desearse que el plasminógeno comprenda un "sitio de activación intacto", que implica que al menos están presentes los aminoácidos 561 y 562 (en relación con Glu-plasminógeno humano, o los aminoácidos correspondientes de plasminógeno no humano) y están presentes en un contexto molecular de modo tal que puede producirse la activación/conversión de plasminógeno a plasmina, aunque posiblemente con diferentes cinéticas, ya que se produce en plasmina de tipo natural. Como alternativa a la plasmina o una variante truncada activa de la misma, un plasminógeno activable o una variante truncada de la misma puede utilizarse en el contexto de la actual invención (véase, p. ej., los documentos EP 0480906, US 5.304.383; EP 0631786, US 5.520.912, US 5.597.800, US 5.776.452). El "plasminógeno" se refiere a cualquier forma de plasminógeno p. ej., Glu-plasminógeno o Lysplasminógeno (comenzando con Arg en la posición 68 o Lys en las posiciones 77 o 78). Al utilizar plasminógeno

5

15

25

35

45

55

65

activable o una variante truncada activable del mismo, la activación a plasmina puede retrasarse y producirse generalmente tras ponerse en contacto con un órgano, tejido o fluido corporal, es decir, tras la administración a un sujeto. En otra alternativa, la plasmina o una variante truncada activa de la misma puede sustituirse en el contexto de la actual invención con un plasminógeno activable o una variante truncada activable del mismo conjuntamente con un activador de plasminógeno (tal como activador de plasminógeno tisular (APt), uroquinasa, estreptoquinasa o estafiloquinasa, o cualquier variante de los mismos; véase, p. ej., los documentos US 6.733.750, US 6.585.972, US 6.899.877; WO 03/33019). En una alternativa adicional, una mezcla de cualquiera de (i) plasmina o derivado de la misma, (ii) plasminógeno activable o un derivado activable del mismo, y, opcionalmente (iii) un activador de plasminógeno pueden utilizarse en el contexto de la actual invención (véase, p. ej., el documento US 2004/0081643). Con el fin de asegurar la estabilidad de la plasmina (o plasminógeno), por lo general se almacenará a temperaturas bajas (p. ej., +4 grados Celsius o -20 grados Celsius). La composición de almacenamiento puede ser una composición estabilizante, tal como una composición de bajo pH (pH 4 o inferior; obtenida p. ej., mediante 1 mM a 250 mM de un ácido, tal como ácido cítrico, véase, p. ej., Castellino y Sodetz, 1976, Methods Enzymol 45, 273286; documentos WO 01/36608; WO 01/36609; WO 01/36611) o una composición con alto contenido en glicerol (3050 % v/v, p. ej., Castellino y Sodetz, 1976, Methods Enzymol 45, 273-286), alternativamente o junto con una o más composiciones estabilizantes que comprenden además p. ej., un aminoácido (p. ej. lisina o un análogo de la misma, tal como EACA o ácido tranexámico), un azúcar (p. ej., manitol) o cualquier estabilizador conocido en la materia (p. ej., dipéptidos, documento WO 97/01631). Se incluye además en el género "plasmina" cualquier derivado activo de la misma (o de una variante de plasmina truncada activa), o un derivado similar de plasminógeno activable (o variante truncada activable del mismo). Dichos derivados incluyen p. ej., plasmina o plasminógeno marcado (o variantes truncadas de los mismos) tales como plasmina marcada con Tc99 (Deacon et al., 1980, Br J Radiol 53, 673-677) o plasmina o plasminógeno pegilado o acilado (o variantes truncadas de los mismos; documentos EP 9879, WO 93/15189) Cualquier otro marcador (radiactivo, fluorescente, etc.) puede emplearse igualmente para producir un derivado de plasmina o plasminógeno. Dichos derivados incluyen además moléculas de plasmina o plasminógeno híbridas o quiméricas que comprenden p. ej., una plasmina o plasminógeno truncados según la invención fusionada con, p. ej., una molécula de unión a fibrina (como kringle 2 de APt, un kringle de apolipoproteína, el dominio tipo dedo de APt o fibronectina o el dominio Fab de un anticuerpo de unión a fibrina).

La comparación de la resistencia autoproteolítica (es decir, estabilidad) de plasmina de tipo natural y de las variantes de plasmina o derivados de plasmina según la invención puede realizarse de manera similar a la comparación de la actividad proteolítica, p. ej., en un ensayo de actividad cromogénico o un ensayo de sustrato biológico basado en p. ej., fibrina, fibrinógeno, fibronectina, gelatina, laminina o colágeno.

Con el fin de determinar la resistencia autoproteolítica, puede determinarse la constante de velocidad de la autolisis. Se prevé que las variantes de plasmina según la invención, incluyendo las plasminas obtenidas de las variantes de plasminógeno según la invención, o cualquiera de los derivados de plasmina según la invención pueden caracterizarse mediante una constante de velocidad de autolisis que es al menos 5 %, o al menos 10 %, 15 %, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 99,5% inferior a la constante de velocidad de autolisis de plasmina de tipo natural, o, alternativamente, por una constante de velocidad de autolisis que es como máximo 95 %, o como máximo 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, o 90 % de la constante de velocidad de autolisis de plasmina de tipo natural. Con el fin de determinar el porcentaje indicado, el cálculo puede realizarse en base a los números de las constantes de velocidad absoluta de autolisis. Por ejemplo, una constante de velocidad de autolisis de 123 M-1s-1 se determinó para microplasmina de tipo natural, mientras que para la variante de microplasmina E138Q se determinó una constante de velocidad de autolisis de 4 M-1s-1 (véase el Ejemplo 1/Tabla 2). La constante de velocidad de autolisis de la variante E138Q es por lo tanto 3,25 % de la constante de velocidad de autolisis de microplasmina de tipo natural.

Además, cualquiera de las variantes de plasmina según la invención, incluyendo las plasminas obtenidas a partir de las variantes de plasminógeno según la invención, o derivados de cualquiera de dichas plasminas pueden retener la actividad proteolítica diferente (mayor o menor) de la actividad proteolítica de plasmina de tipo natural, como se determina p. ej., con un ensayo de actividad cromogénico o un ensayo de sustrato biológico basado en p. ej., fibrina, fibrinógeno, fibronectina, gelatina, laminina o colágeno.

Las actividades proteolíticas de las variantes de plasmina según la invención, incluyendo las plasminas obtenidas a partir de las variantes de plasminógeno según la invención, o cualquiera de los derivados de plasmina según la invención pueden compararse con la actividad proteolítica de plasmina de tipo natural por medio de la constante catalítica kcat que es una medida de la cantidad de moléculas del sustrato de cada sitio de la enzima que se convierte al producto por unidad de tiempo. Por consiguiente, cualquiera de las variantes de plasmina según la invención, incluyendo las plasminas obtenidas a partir de las variantes de plasminógeno según la invención, o cualquiera de los derivados de plasmina según la invención pueden caracterizarse mediante un valor kcat que se encuentra en el intervalo de +100 % a -90 %, o +50 % a -50 % del valor kcat de plasmina de tipo natural, es decir, caracterizados por un valor kcat en el intervalo de 10 % a 200 %, o 50 % a 150 % del valor kcat de plasmina de tipo natural. Con el fin de determinar el porcentaje indicado, el cálculo se realiza en los números kcat absolutos. Por ejemplo, la microplasmina de tipo natural tiene un kcat de 46 s-1, mientras que la variante de microplasmina K137M tiene un kcat de 36s-1 (véase

imagen6

5

15

25

35

45

55

65

El uso de la plasmina en la eliminación de elementos necróticos o restos de lesiones, heridas, heridas ulcerantes (tales como heridas ulcerosas suturadas), etc. se ha descrito p. ej., en el documento US 3.208.908. Del mismo modo, la aplicación tópica de las preparaciones terapéuticas que comprenden plasmina para el tratamiento de quemaduras se divulga p. ej. en el documento US 4.122.158. El desbridamiento se refiere a la eliminación de tejido muerto, dañado y/o infectado con el fin de mejorar o aumentar la cicatrización de los tejidos sanos restantes. Dicha eliminación puede obtenerse por medios quirúrgicos, mecánicos o químicos, o por medio de ciertas especies de gusanos vivos que se alimentan de forma selectiva del tejido necrótico (terapia larval). El desbridamiento también puede realizarse utilizando enzimas o puede asistirse por enzimas, un proceso referido como desbridamiento enzimático. El desbridamiento es un aspecto importante en el proceso de cicatrización de quemaduras y otras heridas graves y se utiliza también en el tratamiento de algunos tipos de mordeduras de serpiente. La aplicación de plasmina (o de cualquier variante o derivado de la misma o por lo tanto alternativa como se ha descrito previamente) en el desbridamiento enzimático (solo o en combinación con otros tipos de desbridamiento) es particularmente útil al favorecer o facilitar la cicatrización de heridas y como un adjunto en los procedimientos quirúrgicos, tales como injerto cutáneo.

Un uso más conocido de plasmina (o de cualquier variante o derivado de la misma o por lo tanto alternativa como se ha descrito previamente) se refiere en términos generales al tratamiento de (a) depósito(s) patológico(s) de fibrina. Los depósitos de fibrina pueden ser resultado de una amplia variedad de situaciones patológicas en el cuerpo. Por ejemplo, los coágulos de sangre que contienen fibrina pueden formarse en los vasos sanguíneos en el tejido resultante de una vena profunda, arteria coronaria, arteria cerebral u oclusión venosa retiniana o trombosis. Las pequeñas acumulaciones de fibrina preceden, y pueden proporcionar, la advertencia de la trombosis catastrófica inminente. Los ejemplos incluyen angina de pecho inestable, que se considera una advertencia de la trombosis coronaria inminente y ataques isquémicos transitorios, que pueden preceder a apoplejías. La fibrina se deposita además, con frecuencia en el tejido en asociación con la inflamación asociada con muchos procesos de enfermedad que incluyen infección, enfermedad autoinmunitaria y cáncer. Otra situación en la que se deposita fibrina es entorno a abscesos causados por la infección con microorganismos. Los depósitos de fibrina, además con frecuencia se encuentran asociados con ciertos tumores sólidos. La deposición de fibrina también puede ocurrir durante la cicatrización de cualquier tipo de herida, incluyendo las resultantes de la intervención quirúrgica, incluyendo, p. ej. trabeculectomía. Otra situación de la deposición de fibrina es la acumulación de fibrina en una vena retiniana, que puede conducir a la degeneración retiniana, alteración de la visión o incluso la pérdida de la visión. El término depósito patológico de fibrina abarca además dichos depósitos formados o presentes o en la punta de un catéter, el dispositivo de catéter u otro implante, tal como los vasos sanguíneos protésicos e injertos de origen sintético, humano o animal y se bloquean efectivamente por una oclusión que comprende fibrina. El término "dispositivo de catéter" se refiere a cualquier catéter o dispositivo que puede entrar en el cuerpo, incluyendo catéteres arteriales, catéteres cardíacos, catéteres venosos centrales, catéteres intravenosos, catéteres centrales de inserción periférica, catéteres arteriales pulmonares, catéteres venosos centrales en forma de túnel, y derivaciones arteriovenosas.

Entre los diversos factores que favorecen el proceso de trombosis, es decir, la formación de un tapón de trombo o hemostático, se encuentran: (1) daños en el revestimiento de las células endoteliales del vaso sanguíneo afectado,

(2): un aumento en las propiedades de coagulación de la sangre, y (3) estasis sanguínea en el vaso sanguíneo afectado. La trombosis puede comenzar como un bulto muy pequeño unido a la parte dañada del revestimiento del vaso sanguíneo. Su presencia estimula además a que se produzca la trombosis, y tiene el efecto de causar una ralentización del flujo sanguíneo mediante la reducción del diámetro interno del vaso sanguíneo. A menudo el crecimiento adicional del trombo pequeño da lugar inicialmente a la obstrucción completa o casi completa del vaso sanguíneo afectado. Si la trombosis ocurre en una de las arterias, los tejidos irrigados por la arteria pueden privarse de oxígeno y nutrientes, causando daño o muerte del tejido (gangrena). La severidad del daño depende de la posición y el tamaño de la trombosis, la velocidad a la que crece y si el área afectada tiene solo una arteria o está irrigada por los vasos sanguíneos colaterales. Si se ve afectado el vaso sanguíneo de un órgano vital, p. ej., corazón

: o cerebro, la persona puede lesionarse gravemente o fallecer. Eventualmente, un trombo puede contener organismos infecciosos, tales como bacterias, y puede producirse trombosis séptica, con la formación de pus e infección de los tejidos circundantes.

Los usos adicionales de la plasmina (o de cualquier variante o derivado de la misma o por lo tanto alternativa como se ha descrito previamente) incluyen la reducción del nivel de fibrinógeno circulante (p. ej., documento WO 93/07893) y su uso como inhibidor de α2-antiplasmina (descrito para reducir el tamaño del infarto cerebral tras la apoplejía isquémica; documento WO 00/18436).

Otro uso de la plasmina (o de cualquier variante o derivado de la misma o por lo tanto alternativa como se ha descrito previamente) se relaciona con la inducción del desprendimiento vítreo posterior (DVP) y/o licuefacción vítrea en el ojo como alternativa o como adjunto a la vitrectomía mecánica (documentos WO 2004/052228, US 6.733.750, US 6.585.972, US 6.899.877; WO 03/33019; WO 2006/122249; WO 2007/047874, US 5.304.118, US 2006/0024349, US 2003/0147877). La vitrectomía y/o licuefacción del vítreo es beneficiosa para una serie de afecciones oculares, tales como flotadores vítreos (residuos móviles/depósitos de vítreo en el humor vítreo normalmente transparente que puede deteriorar la visión), desprendimiento de retina (una afección cegadora que pueden causarse por tracción vítrea), pliegue macular (tejido cicatricial en la mácula; la mácula se requiere para la visión aguda, central; el pliegue macular también se conoce como membrana epi-o prerretiniana, maculopatía celofán, arruga de la retina,

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

5

15

25

35

45

55

65

En cualquiera de los métodos de producción previos, dicho dominio catalítico puede comprender además una mutación de una lisina o arginina de tipo natural en un aminoácido no lisina, no arginina.

Cualquiera de las variantes de plasminógeno, variantes de plasmina, o derivados de plasmina como se ha descrito previamente se obtienen preferentemente en forma libre, o soluble, p. ej., no unida o unida a la superficie del hospedador de expresión (como es el caso de la expresión en fagos).

La invención también se refiere a (una) secuencia(s) de ácido nucleico aislada(s) codificante(s) de una variante de

plasminógeno o variante de plasmina según la invención. La invención también recombinante(s) que comprende(n) dicho ácido nucleico. La invención también hospedadoras transformada(s) con dicho ácido nucleico o con dicho vector recombinante.: se se refiere refiere a a (un) vector(es) (una) célula(s)

Ejemplos

EJEMPLO 1. Construcción, expresión y purificación de variantes de plasminógeno y activación a plasmina

Vector de expresión

El vector de secreción pPICZαA adquirido en Invitrogen Corporation (Carlsbad, California) se utilizó para dirigir la expresión y la secreción de microplasminógeno humano recombinante en Pichia pastoris.

Este vector contiene la señal de secreción del prepropéptido del factor α de Saccharomyces cerevisiae. Una secuencia de reconocimiento XhoI está presente en el extremo COOH-terminal de la señal de secreción del factor α, inmediatamente corriente arriba del sitio Lys-Arg que se escinde por Kex2 para eliminar la señal de secreción de la proteína madura. Este sitio de restricción XhoI puede utilizarse para clonar el gen de flujo de interés con el sitio de escisión Kex2 sintetizando el gen con los sitios de reconocimiento XhoI y Kex2 en su extremo 5'. El gen recombinante de interés se expresará a continuación con NH2-terminal nativo. Desarrollado por ingeniería genética inmediatamente corriente abajo de la señal de secreción del factor α el vector pPICZαA es un sitio de clonación múltiple con sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción EcoRI, SfiI, KpnI, SacII y XbaI que facilita la clonación de genes heterólogos.

Síntesis génica

Para mejorar la expresión de microplasminógeno humano en Pichia pastoris, los genes codificantes del microplasminógeno humano y variantes de los mismos se sintetizaron de novo teniendo en cuenta el uso del codón preferente por Pichia pastoris.

Para diseñar la secuencia génica optimizada por el codón, la secuencia de aminoácidos de microplasminógeno humano (SEQ ID NO: 19) se importó en el programa Gene Designer desarrollado por DNA2.0 (Menlo Park, California) y está disponible gratuitamente en internet. Esta secuencia se retrotraduce en la secuencia de ADN al emplear el codón estable de Pichia pastoris proporcionado por el programa. A continuación, la secuencia de nucleótidos se verificó manualmente y se ajustó para un mejor ajuste del uso del codón de Escherichia coli. Además, se eliminaron, cuando fue posible, secuencias palindrómicas de 6 pares de bases y repeticiones nucleótidas. En el extremo 5', se añadieron un sitio de restricción XhoI y el sitio de escisión Kex2 y en el extremo 3', se añadió un sitio de restricción XbaI. La secuencia resultante se divulga en la solicitud de patente internacional n.º PCT/EP2010/059902.

Con el fin de cambiar los residuos aminoácidos, las mutaciones se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II de Agilent (La Jolla, California) en la secuencia de microplasminógeno de tipo natural o en las secuencias de variante de microplasminógeno en las que los sitios de escisión autocatalítica específicos ya se modificaron (véase la solicitud de patente internacional n.º PCT/EP2010/059902). La cepa de E. coli TOP10 (Invitrogen) se transformó con la mezcla de mutagénesis dirigida al sitio y se seleccionaron los clones resistentes a ampicilina. La determinación de la secuencia de los clones de plásmido resultantes confirmó la mutagénesis precisa de la región de codificación de microplasminógeno diana, así como la ausencia de mutaciones no deseadas en la región de codificación.

Los siguientes cebadores se utilizaron para la mutagénesis dirigida al sitio:

Mutación Glu18Gln

GTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAACAGGCACAATTACCTGTGATTG (sentido; SEQ ID NO: 20) y

CAATCACAGGTAATTGTGCCTGTTTCAACAGACCAGCACCGAAC (antisentido; SEQ ID NO: 21)

En una primera variante, el glutamato en la posición 138 se sustituye con una glutamina. Glu138 se codifica por el codón GAA en las posiciones 481-483. La nucleótidos GAA (posiciones 481-483) se convirtieron en CAG,

cambiando Glu138 a Gln en la proteína de microplasminógeno (la secuencia nucleótida se encuentra en SEQ ID NO: 22 y la secuencia aminoácida deducida en la SEC ID NO: 23).

En la segunda variante, el glutamato en la posición 138 se sustituye con una glutamina indicada en una variante de 5 microplasminógeno en la que la lisina en la posición 147 ya se ha sustituido con glutamato (la secuencia nucleótida se encuentra en SEQ ID NO: 24 y la secuencia aminoácida deducida en la SEQ ID NO: 25).

En la tercera variante, el glutamato en la posición 138 se sustituye con una glutamina indicada en una variante de microplasminógeno en la que la lisina en la posición 147 ya se ha sustituido con histidina y la arginina en la posición 10 158 ya se ha sustituido con histidina (la secuencia nucleótida se encuentra en la SEQ ID NO: 26 y la secuencia aminoácida deducida en la SEC ID NO: 27).

Expresión de variantes de microplasminógeno y activación a plasmina

15 Antes de la activación, los mutantes de microplasminógeno se purificaron por inmunoafinidad directamente de los sobrenadantes de Pichia pastoris. Un anticuerpo de microplasmina anti-humano murino (ratones Balb/c criados utilizando microplasmina como antígeno; producido por la línea celular de hibridoma 5D10A4, disponible en ThromboGenics N.V.) se acopló en microesferas de sefarosa según el protocolo n.º 71500015AD de GE Healthcare. Siguiendo este protocolo, se prepararon 7,5 ml de resina de inmunoafinidad a partir de 45 mg de anticuerpo y se

20 embalaron en una columna XK 16/20. El sobrenadante crudo de 200-400 ml (0,2 μ filtrado a partir del cultivo de Pichia/pH 6,0) se cargó directamente sobre la columna de afinidad 5D10A4. Tras una etapa de lavado (100 mM de KH2P04, 0,5 M de NaCl, pH 6,2, 10 volúmenes de columna), la variante de microplasminógeno se eluyó con glicina-HCl 0,2 M, tampón pH 3,0, se neutralizó el eluato y se dializó contra un tampón fosfato de sodio de 25 mM, pH 7,2).

25 Las variantes de microplasmina se activaron esencialmente siguiendo el procedimiento como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 02/50290.

A modo de ejemplo, el microplasminógeno mutante E138Q descrito previamente y la correspondiente microplasmina activada se muestran en la Figura 3.

30 Las secuencias aminoácidas y secuencias nucleótidas de las especies de la variante de microplasminógeno y tipo natural se enumeran en lo sucesivo.

SEQ ID NO: 19 -secuencia aminoácida de microplasminógeno humano de tipo natural 35

imagen12

40 SEQ ID NO: 22 -variante de microplasminógeno con la sustitución Glu138Gln (codón mutado en negrita y cursiva subrayado, XhoI y XbaI subrayados)

imagen13

imagen14

SEQ ID NO: 25 -secuencia aminoácida deducida de la SEQ ID NO: 24 (los aminoácidos N-terminales subrayados "LEKR" se codifican por los sitios de escisión XhoI + Kex2 introducidos; las mutaciones aminoácidas introducidas se indican en negrita y cursiva subrayadas)

imagen15

SEC ID NO: 26 -variante de microplasminógeno con las sustituciones Glu138Gln, Lys147His y Arg158His (codones 10 mutados en negrita y cursiva subrayados, XhoI y XbaI subrayados)

imagen16

imagen17

Claims

imagen1

imagen2