JP2004508006A - アンギオスタチンを生成するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、プラスミノーゲンを、プラスミノーゲンアクチベーターおよびスルフヒドリル供与体と接触させるか、またはプラスミンをスルフヒドリル供与体と接触させることを含んでなる、アンギオスタチンのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法を提供する。本発明はまた、血管新生疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）の動物に、スルフヒドリル供与体、プラスミノーゲンアクチベーター、またはスルフヒドリル供与体とプラスミノーゲンアクチベーターの組合せ物を投与することによる、血管新生疾患の治療方法を提供する。本発明はさらに、スルフヒドリル供与体とプラスミノーゲンアクチベーターを含有するアンギオスタチン生成用の組成物を含む。本発明はまた、スルフヒドリル供与体および／またはプラスミノーゲンアクチベーターを保有する容器を提供し、該容器の上には、血管新生疾患の動物にスルフヒドリル供与体および／またはプラスミノーゲンアクチベーターを投与することを指示するラベルが存在する。本発明はさらに、血管新生を抑制するプラスミノーゲン断片（そのＮ末端アミノ酸がプラスミンのＮ末端アミノ酸と同じであり、そのＣ末端アミノ酸がクリングル５に位置する）、該断片と選択的に結合する抗体、該抗体を使用するための方法およびキット、該断片を組換えＤＮＡ法により生産するための方法および材料、ならびに、該断片の１つを有効な量で投与することを含む血管新生疾患の治療方法を提供する。最後に、本発明は、該断片の１つをコードするトランスジーンを投与することを含む血管新生疾患の治療方法を提供する。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、血管新生の抑制剤であるアンギオスタチンに関するものである。
【０００２】
発明の背景
アンギオスタチンは、クリングル１〜３とクリングル４の全部または一部から構成されるプラスミノーゲンのタンパク質加水分解断片であると考えられており、血管新生および腫瘍細胞増殖転移の強力な抑制剤である（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら， Ｃｅｌｌ， ７９， ３１５−３２８ （１９９４）； ＰＣＴ出願 ＷＯ ９５／２９２４２）。アンギオスタチンは腫瘍があるマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで見出される（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら， Ｃｅｌｌ， ７９， ３１５−３２８ （１９９４）； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２， ６８９−６９２ （１９９６））。アンギオスタチンをｉｎ ｖｉｖｏで生成する酵素的な作用機序は依然不明である。
【０００３】
アンギオスタチン活性は、プラスミノーゲンの制限されたエラスターゼタンパク質加水分解によりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成させることができる。Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ， ３， １９１−２０９ （Ｄａｖｉｄｓｏｎら編， １９７８）を参照されたい。最近では、アンギオスタチンは、原発性の腫瘍に浸潤してエラスターゼ活性を放出するマクロファージにより生成されると提唱されており、その後エラスターゼ活性がプラスミノーゲンを切断して、アンギオスタチン活性のあるタンパク質を生成させる（Ｄｏｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３７， ５８ （１９９６））。しかしながら、プラスミノーゲンの制限されたエラスターゼ切断はアンギオスタチン活性のある断片を１以上生成させるものの、エランターゼはこうした断片を不活性ペプチドへとさらに消化してしまい、それゆえ、ｉｎ ｖｉｖｏでアンギオスタチンを生成させる酵素ではないと考えられる。
【０００４】
上述したように、アンギオスタチンはプラスミノーゲンの制限されたエラスターゼタンパク質加水分解によりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成させることができる。この方法にはいくつかの欠点がある。まず、エラスターゼはプラスミノーゲンを切断してクリングル１〜３を含む断片を生成させるが、この切断が通常の部位（すなわち、アンギオスタチンのｉｎ ｖｉｖｏ生成のために切断が生じる部位）で起こっているのか不明である。したがって、エラスターゼにより誘導されるアンギオスタチンは、ヒトでは活性が変化して、改変されたｉｎ ｖｉｖｏプロセッシングをもつ可能性がある。また、ペプチドの切断部位が通常のアンギオスタチンと異なる場合には、それは免疫原性があるかもしれない。
【０００５】
アンギオスタチンを生成させる第２の手段は、発現ベクター中のプラスミノーゲンｃＤＮＡまたは遺伝子の所望のクリングルドメインを原核または真核細胞において発現させることによるものである。ＰＣＴ出願 ＷＯ ９５／２９２４２を参照されたい。この方法も、発現すべき適切なドメインが知られていないので、制限を受けることとなる。その産物も免疫原性をもつ可能性があり、また、通常のｉｎ ｖｉｖｏ酵素によるプラスミノーゲンの切断によって生成される産物となるようにヒトではプロセッシングされないかもしれない。
【０００６】
最後に、アンギオスタチンはそれを産生する動物の体液から単離することができる。ＰＣＴ出願 ＷＯ ９５／２９２４２を参照されたい。しかし、この方法では、疾患を治療するのに十分な量のアンギオスタチンが得られない。また、そのような供給源から単離する場合、アンギオスタチンは病原菌で汚染されている可能性もある。
【０００７】
明らかに、天然のアンギオスタチンを大量に生産する方法が必要とされている。本明細書中では、「天然のアンギオスタチン」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されるアンギオスタチンであるか、または、どのように生成されようとも、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されるアンギオスタチンと同一のアンギオスタチンである、と定義される。
【０００８】
発明の概要
本発明は上記のような方法を提供する。こうした方法は、癌細胞、一次内皮細胞、平滑筋細胞または繊維芽細胞を培養することにより得られた調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ： ＣＣＭ）が、プラスミノーゲンまたはプラスミンと接触させたとき、アンギオスタチンをもたらすという知見に基づくものである。このＣＣＭ中の活性因子はプラスミノーゲンアクチベーターとスルフヒドリル供与体であると確認された。したがって、プラスミノーゲンアクチベーターとスルフヒドリル供与体の使用により生成されたアンギオスタチンは、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されたアンギオスタチンと同一のもの、すなわち、天然のアンギオスタチンである。
【０００９】
アンギオスタチンをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成させるための本発明の一つの方法では、プラスミンをスルフヒドリル供与体と接触させることによってアンギオスタチンを生成させる。このプラスミンは、プラスミノーゲンをプラスミノーゲンアクチベーターと接触させることにより生成させることができる。最も簡便には、全部の反応物（プラスミノーゲン、プラスミノーゲンアクチベーターおよびスルフヒドリル供与体）を同時に接触させてアンギオスタチンを生成させる。
【００１０】
この方法で得られるアンギオスタチンは、残りの反応物と共に、あるいはこれらの反応物から精製または部分精製して、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与される。アンギオスタチンを必要とする動物は血管新生疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）に罹っている動物である。
【００１１】
本発明はさらに、アンギオスタチンを生成させるための組成物を提供する。この組成物はプラスミノーゲンアクチベーターおよびスルフヒドリル供与体を含有する。この組成物の２つの実施形態は、プラスミノーゲンアクチベーター産生能のある細胞を培養することによって得られる調整培地（ＣＣＭ）と、そのような細胞の溶解物である。
【００１２】
本発明はまた、血管新生疾患の動物に、プラスミンのアンギオスタチンへの変換を起こさせるのに有効な量のスルフヒドリル供与体を投与することを含んでなる、血管新生疾患の治療方法を提供する。プラスミンは内在性プラスミノーゲンから内在性プラスミノーゲンアクチベーターにより生成されたものであってよい。あるいはまた、上記方法が、有効量のプラスミンを投与することをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、プラスミノーゲンアクチベーターを動物に投与して、内在性プラスミノーゲンから、または投与された有効量のプラスミノーゲンからプラスミンを生成させることができる。
【００１３】
本発明はまた、血管新生疾患の動物に、プラスミノーゲン（内在性プラスミノーゲンまたは投与されたプラスミノーゲン）のプラスミンへの変換を起こさせるのに有効な量のプラスミノーゲンアクチベーターを投与することを含んでなる、血管新生疾患の治療方法を提供する。その後、内在性のまたは投与されたスルフヒドリル供与体により、プラスミンのアンギオスタチンへの変換が起こる。
【００１４】
本発明はさらに、プラスミノーゲンアクチベーターを、単独でまたはスルフヒドリル供与体と共に、保有する容器を提供する。この容器は、その上に、血管新生疾患の動物にプラスミノーゲンアクチベーターまたはプラスミノーゲンアクチベーターとスルフヒドリル供与体との組合せ物を投与することを指示するラベルが存在する。本発明はまた、スルフヒドリル供与体を保有する容器であって、該容器の上に、プラスミンのアンギオスタチンへの変換を起こさせるのに有効な量でスルフヒドリル供与体を投与することを指示するラベルがある、該容器を提供する。
【００１５】
本発明はまた、次の特徴：（ａ） プラスミノーゲンの断片であること、（ｂ） そのＮ末端アミノ酸がプラスミンのＮ末端アミノ酸と同じであること、（ｃ） そのＣ末端アミノ酸がクリングル５にあること、（ｄ） 血管新生を抑制すること、を有するタンパク質を提供する。一つの実施形態において、該タンパク質は天然のアンギオスタチンである。本発明はさらに、該タンパク質をコードするＤＮＡ分子、発現制御配列と機能的に連結された該ＤＮＡ分子、発現制御配列と機能的に連結された該ＤＮＡ分子を含む宿主細胞、ならびに、該宿主細胞を培養することを含む該タンパク質の生産方法を提供する。
【００１６】
上記タンパク質は、血管新生疾患の動物に有効量の該タンパク質を投与することにより血管新生疾患を治療するために使用することができる。血管新生疾患の動物はまた、該タンパク質をコードするトランスジーンを該動物に投与することによって治療することもできる。好ましくは、トランスジーンによりコードされる該タンパク質は天然のアンギオスタチンである。
【００１７】
最後に、本発明は、該タンパク質と選択的に結合する抗体を提供する。そのような抗体を用いると、該タンパク質を含む物質から該タンパク質を精製することができる。さらに、天然のアンギオスタチンと選択的に結合するそのような抗体は、天然のアンギオスタチンを検出または定量するための方法およびキットにおいても使用することができる。
【００１８】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、天然のアンギオスタチンを生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。その一方法は、プラスミノーゲンを、プラスミノーゲンアクチベーターおよびスルフヒドリル供与体と接触させることを含んでなる。３つの反応物をすべて、同時に組み合わせることもできる。あるいは、プラスミノーゲンをプラスミノーゲンアクチベーターと接触させてプラスミンを生成した後、プラスミンをスルフヒドリル供与体と接触させることにより、アンギオスタチンを生成することも可能である。スルフヒドリル供与体と接触させる前に、少なくとも部分的にプラスミンを精製することができる。実際、アンギオスタチンは、プラスミンから直接生成することができ、プラスミンをスルフヒドリル供与体と接触させることにより得られる。
【００１９】
プラスミノーゲンは、あらゆる種の動物に由来するものでよい。しかし、好ましくは、アンギオスタチンの投与時の免疫反応を防止するため、アンギオスタチンで治療しようとする動物の種に由来するプラスミノーゲンを用いる。従って、ヒトをアンギオスタチンで治療する場合には、ヒトプラスミノーゲンを用いるのが好ましい。
【００２０】
プラスミノーゲンを調製する方法は当業者には公知である。プラスミノーゲンはまた、市場でも購入することができる。好ましくは、プラスミノーゲン調製物に病原体が混入しないような組換えＤＮＡ法もしくはその他の技法により、プラスミノーゲンを調製する。
【００２１】
あらゆる種類のプラスミノーゲンアクチベーターを用いることができ、例えば、ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーターおよびストレプトキナーゼが挙げられる。プラスミノーゲンアクチベーターは、あらゆる種の動物に由来するものでよい。プラスミノーゲンアクチベーターの調製方法は、当業者には公知であり、多くのプラスミノーゲンアクチベーターが市販されている。好ましくは、プラスミノーゲンアクチベーター調製物に病原体が混入しないような組換えＤＮＡ法もしくはその他の技法により、プラスミノーゲンアクチベーターを調製する。
【００２２】
プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換させるのに有効な量および条件下で、プラスミノーゲンアクチベーターと接触させる。このような量および条件は、当業者には公知であり、経験に基づいて決定することができる。特に、１ｍｌ反応中のプラスミノーゲン１マイクログラムにつき、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌのウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターが、３７℃で約２４時間のインキュベーション後に、プラスミノーゲンをプラスミンに完全に変換させることがわかっている。
【００２３】
あらゆるスルフヒドリル供与体を用いることができる。スルフヒドリル供与体はよく知られており、市販されている。好適なスルフヒドリル供与体として、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ＤＬ−システイン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、還元型グルタチオン、Ｄ−ペニシラミンおよびカプトプリルが挙げられる。スルフヒドリル供与体は、プラスミノーゲン、および／またはプラスミン、および／またはアンギオスタチン、および／または中間産物におけるジスルフィド結合の形成を減少または改変させると考えられる。
【００２４】
スルフヒドリル供与体は、プラスミンをアンギオスタチンに変換させるのに有効な量および条件下で、単独でまたはプラスミノーゲンおよびプラスミノーゲンアクチベーターの存在下で、プラスミンと接触させる。このような量および条件は、当業者には公知であり、経験に基づいて決定することができる。特に、１ｍｌ反応中のプラスミン１マイクログラムにつき、約１０μＭ〜約１ｍＭのスルフヒドリル供与体が、３７℃で約２４時間のインキュベーション後に、プラスミンをアンギオスタチンに完全に変換させることがわかっている。
【００２５】
プラスミンは、前記のように、プラスミノーゲンアクチベーターによりプラスミノーゲンから生成させることができる。プラスミンは、スルフヒドリル供与体と接触させる前に、反応物から精製してもよい。プラスミンの精製方法は、当業者には公知である（例えば、実施例４を参照）。また、購入した、もしくはその他の方法で調製したプラスミンを用いて、前記のように、これをスルフヒドリル供与体と接触させることによってアンギオスタチンを生成させることも可能である。
【００２６】
本発明はさらに、アンギオスタチン生成用の組成物を提供する。この組成物は、前記のようなプラスミノーゲンアクチベーターとスルフヒドリル供与体を含んでなる。プラスミノーゲンアクチベーターとスルフヒドリル供与体は、生理学的に許容されるあらゆる溶液（例えば、塩水、バッファー、培地）に含有させてもよいし、あるいは、結晶形態または凍結乾燥形態をしていてもよい。治療用途に適した組成物について以下に説明する。
【００２７】
上記組成物は、プラスミノーゲンアクチベーターを生産することができる細胞を培養することにより調製した調整培地（ＣＣＭ）であり得る。プラスミノーゲンアクチベーターを発現する悪性動物細胞（ヒトおよび非ヒト）が、プラスミノーゲンおよびプラスミンをアンギオスタチンに変換する能力のあるＣＣＭを生産することができる。好適な悪性細胞として、ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＬＮ−ＣａＰ、ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７、ヒトグリオーマ細胞系Ｕ−３７３、Ｕ−１１８、Ａ−１７２およびＵ−８７、ならびに、マウス黒色腫（メラノーマ）細胞系Ｂ１６Ｆ１０が挙げられる。多くの非悪性動物細胞がプラスミノーゲンアクチベーターを生産することも知られている。適した非悪性細胞として、一次内皮細胞（例えば、ウシ大動脈内皮細胞）、平滑筋細胞（例えば、ウシ平滑筋細胞）、および繊維芽細胞が挙げられる。加えて、プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、ストレプトキナーゼ）を生産する細菌細胞も知られており、組換えＤＮＡ法であらゆる種類の細菌を形質転換することにより、プラスミノーゲンアクチベーターを生産することができる。好適な細胞および細胞系が当業者にはよく知られており、細胞寄託機関から購入したり、当業者には公知の方法で取得したりすることができる。
【００２８】
これらの細胞に好適な培養条件もまた当業者には公知である。使用される培地は、スルフヒドリル供与体を含んでいなければならないか、またはＣＣＭの調製後に、スルフヒドリル供与体をこれに添加してもよい。ＣＣＭは、プラスミノーゲンまたはプラスミンをアンギオスタチンに変換させることができるＣＣＭを生産するのに十分な時間、通常の培養条件下で細胞を単純に培養することにより、生産することができる。この時間は、経験に基づいて決定することができる。特に、単層が３７℃で形成された後で哺乳動物細胞を２４〜７２時間培養すれば十分であることがわかっている。
【００２９】
これに代わり、あるいは、加えて、プラスミノーゲンアクチベーターの合成を可能にするのに十分な時間培養した後に、細胞を溶解させることもできる。この時間は、経験に基づいて決定することができるが、単層が形成されるまで細胞を培養すれば十分である。この溶解物を用いて、プラスミノーゲンおよびプラスミンをアンギオスタチンに変換させることができる。
【００３０】
これらの方法により生成されるアンギオスタチンは、反応混合物から精製することができる。タンパク質精製方法は当業者にはよく知られている。特に、アンギオスタチンは、リシン−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。残留プラスミン活性は、例えば、ダイズトリプシン阻害剤−セファロース、アプロチニン−セファロース、または、セリンプロテアーゼもしくはプラスミン触媒ドメインを除去するその他のアフィニティークロマトグラフィー法で除去しなければならない。また、アンギオスタチンは、それと選択的に結合する抗体を用いて、反応混合物から精製してもよい（以下を参照）。
【００３１】
これらの方法により生成されるアンギオスタチン（天然アンギオスタチン）は特性決定がなされている。これは、プラスミノーゲンのクリングル１〜３に特異的なモノクローナル抗体と反応し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの各種試験によるアッセイにより、血管新生を抑制することがわかっている。
【００３２】
また、アンギオスタチンは、プラスミンのＮ末端配列を有することもわかっている。ヒトプラスミノーゲンから生成されるアンギオスタチンについて、そのＮ末端配列は、Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ［配列番号１］であることがみいだされた。その他の動物のプラスミンの配列も知られている。従って、特定の動物の天然アンギオスタチンは、その動物のプラスミンと同じＮ末端配列を有すると考えられる。
【００３３】
驚くべきことに、天然アンギオスタチンは、そのＣ末端アミノ酸がクリングル５に位置することがみいだされた。特に、ヒトプラスミノーゲンから生成されるアンギオスタチンは、Ｃ末端配列Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ［配列番号４］またはＣｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ［配列番号５］を有することがわかっている（実施例６参照）。これらのＣ末端配列は、プラスミノーゲンのアミノ酸５２９または５３０の後の切断によって生じると考えられ（図１６参照）、これが既知のプラスミン切断部位である。従って、天然ヒトアンギオスタチンは、クリングル５のほとんどを含み（図１６参照）、これは、非還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が５０〜６０ｋＤであることと一致している。
【００３４】
アンギオスタチンは、クリングル１〜３と、クリングル４の一部または全部を含むと思われていた（背景技術の項を参照）ため、これらの知見は驚くことであった。また、クリングル１〜４からなる分子は、活性時に、クリングル１〜３からなる分子より活性が低いことも明らかにされている（ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３５７７４を参照）。従って、天然アンギオスタチンが、クリングル５のいずれかの部分を含むことは予想されていなかった。ましてや、天然アンギオスタチンが、クリングル５のほとんどを含むことは予想外であった。
【００３５】
いまや、クリングル５の少なくとも一部を含む、天然アンギオスタチン以外のプラスミノーゲン断片が、アンギオスタチン活性を有する（すなわち、血管新生を抑制する）ことが期待されている。好ましくは、プラスミノーゲン断片は、クリングル５の大部分を含む。さらに好ましくは、プラスミノーゲン断片は、クリングル５のほとんどを含む。本明細書で「クリングル５の大部分」とは、クリングル５の少なくとも５０％（例えば、ヒトクリングル５については、少なくとも４０アミノ酸）を意味し、「クリングル５のほとんど」とは、クリングル５の少なくとも７５％（例えば、ヒトクリングル５については、少なくとも６０アミノ酸）を意味する。もちろん、プラスミノーゲン断片は、前述した理由から、天然アンギオスタチンであるのが最も好ましい。
【００３６】
その他の動物に由来するプラスミノーゲンの配列が知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である）。ヒト［配列番号６］、ウシ［配列番号７］、イヌ［配列番号８］、セイヨウハリネズミ［配列番号９］、ウマ［配列番号１０］、アカゲザル［配列番号１１］、マウス［配列番号１２］、およびブタ［配列番号１３］プラスミノーゲンを配列表（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースからダウンロードした）に挙げる。特定動物の天然アンギオスタチンは、その動物のプラスミノーゲンのクリングル５のほとんどを含むと同時に、上に挙げたヒト天然アンギオスタチンのＣ末端配列に対応するＣ末端配列を有する。実際、これら配列を見直すと、天然アンギオスタチン（配列番号２および配列番号３；以下の実施例６を参照）を生成するヒトプラスミノーゲンにおける切断部位直後の配列が、これらプラスミノーゲン配列のすべてに保存されていることがわかる（配列表において、太字で強調したアミノ酸を参照）。
【００３７】
配列表から認められるように、イヌ［配列番号８］およびウマ［配列番号１０］プラスミノーゲンの配列は、単一クリングルドメインだけを含む。この単一クリングルドメインは、他のクリングル５ドメインとの相同性により、クリングル５ドメインであると考えられ、その他のプラスミノーゲンのクリングル５ドメインに認められる保存配列（配列表において、太字で強調したアミノ酸を参照）を含む。従って、本発明は、クリングル５ドメインを含む、イヌおよびウマプラスミノーゲン断片、ならびに、その他のあらゆるプラスミノーゲンを包含する。
【００３８】
本発明のプラスミノーゲン断片（プラスミンのＮ末端配列を有し、かつクリングル５に位置するそのＣ末端アミノ酸を有するもの）は、組換えＤＮＡ法により生産することができる。好ましくは、プラスミノーゲン断片は、天然アンギオスタチンである。最も好ましくは、プラスミノーゲン断片は、天然ヒトアンギオスタチンである。組換えＤＮＡ法および好適な宿主細胞、ベクター、ならびに、そこで使用するその他の試薬は、当業者には公知である。
【００３９】
本発明のプラスミノーゲン断片生産用の特定の宿主細胞の選択は、当業者に理解されている多数の要因に応じて異なる。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、細胞に対するプラスミノーゲン断片の毒性、形質転換の比率、発現特性、バイオセーフティ、および費用がある。これら要因のバランスを考慮すれば、しかも、すべての宿主が特定のプラスミノーゲン断片の発現に同様に有効であるとは限らないという理解に到達するはずである。
【００４０】
本発明のプラスミノーゲン断片を調製するには、真核宿主細胞が好ましい。上記の指針に従う有用な真核宿主細胞として、酵母およびその他の真菌、動物細胞系、インタクトな動物における動物細胞、昆虫細胞、ならびに、当業者には公知のその他の真核宿主細胞が挙げられる。
【００４１】
本発明のプラスミノーゲン断片をコードするＤＮＡを含むベクターで宿主細胞を形質転換することができる。このベクター上で、コード配列は、発現制御配列と機能的に連結されねばならない。
【００４２】
本明細書で用いる「機能的に連結される」とは、プラスミノーゲン断片が発現されるような様式で行われるＤＮＡ配列の連結を意味する。好ましくは、配列の順序、配列の方向、および様々な配列の相対間隔を含む連結を、最適な発現が得られるように実施する。
【００４３】
発現制御配列は、プロモーターを含まなければならない。ベクターに用いられるプロモーターは、宿主細胞で転写活性を示すあらゆる配列でよく、相同的または異種タンパク質、および細胞外または細胞内タンパク質のいずれかをコードする遺伝子に由来するものでよい。しかし、プロモーターは、いずれかの天然に存在するプロモーターと同一である必要はない。プロモーターは、様々なプロモーターの部分から構成されてもよいし、あるいは、部分的に、または全部が合成であってもよい。プロモーターの設計指針は、ＨａｒｌｅｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５， ２３４３−６１（１９８７）にあるように、プロモーター構造の研究によって提供されている。また、転写開始に対するプロモーターの位置を最適化してもよい。Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６， ７６０−４（１９７９）を参照。プロモーターは、誘導性または構成性のいずれでもよく、好ましくは、強力なプロモーターである。「強力な」とは、プロモーターが、宿主細胞に高速転写をもたらすことを意味する。
【００４４】
ベクターでは、コード配列を、転写終結配列に、またプロモーターにも、機能的に連結しなければならない。さらに、このコード配列は、プロモーターおよび転写終結配列以外の発現制御配列にも、機能的に連結しなければならない。これらの別の発現制御配列として、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、５’非翻訳配列、ならびに、転写または翻訳の制御に関与するその他の配列およびシグナルが挙げられる。
【００４５】
真核細胞の翻訳開始配列の共通配列は、Ｋｏｚａｋ（Ｃｅｌｌ， ４４， ２８３−２９２（１９８６））により、Ｃ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧであると定義されている。この配列からの、特に−３位置（ＡまたはＧ）での偏差は、特定のｍＲＮＡの翻訳に大きな影響をもたらす。実質的にすべての高度発現哺乳動物遺伝子がこの配列を用いる。これに対し、高度に発現した酵母ｍＲＮＡは、この配列とは違い、これに代わって、配列（Ａ／Ｙ）Ａ（Ａ／Ｕ）ＡＡＵＧＵＣＵ（ＣｉｇａｎおよびＤｏｎａｈｕｅ， Ｇｅｎｅ， ５９， １−１８（１９８７））を用いる。これらの配列は、経験に基づき、改変して、特定の宿主細胞で使用するための最適配列を決定することができる。
【００４６】
本発明のプラスミノーゲン断片をコードするＤＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（１９８２）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（１９８９）に記載されているような標準的方法を用いて、調製することができる。特に、プラスミノーゲンをコードするクローンが知られている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２９２４２；Ｂｒｏｗｎｅら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ， ５， ２５７−２６０（１９９１）を参照。その他のクローンを当業者には公知の方法で同定することができる。クローンは、既知であろうと新しく同定されたものであろうと、当業者には公知の方法で本発明のプラスミノーゲン断片をコードするように改変することもできる。
【００４７】
あるいは、コード配列は、既知のプラスミノーゲン配列を用いた当業者には公知の標準的技法により合成してもよい。例えば、自動ＤＮＡ合成装置でのホスホルアミダイト化学により合成し、精製し、アニーリングした後、好適なベクターに連結およびクローニングすることができる。以下に挙げるいくつかの理由で、化学的合成が好ましい。
【００４８】
第１に、ＤＮＡ配列を発現させる宿主が好むコドンを用いて発現を最適化することができるため、化学的合成が望ましい。発現を改善するために、コドンのすべてを改変する必要はないが、５０％を超える、最も好ましくは、少なくとも８０％のコドンを宿主優先コドンに改変すべきである。多くの宿主細胞のコドン優先が知られている。Ｍｉｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｐ． ２２５−８５（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｇｏｌｄ編、１９８６）を参照。その他の宿主細胞のコドン優先は、当業者には公知の方法により導き出すことができる。
【００４９】
化学的に合成したＤＮＡの使用により、配列中の好都合な地点にユニークまたはほぼユニークな制限部位を導入することを目的とするコドンの選択が可能になる。これらの部位の使用により、合成コード配列を構築する好都合な手段が得られる。加えて、メッセンジャーＲＮＡ転写物またはその他の不安定化配列により形成された二次構造が転写または翻訳を妨害する場合には、コドン選択を改変することにより、これらを排除することができる。
【００５０】
化学的合成により、プラスミノーゲン断片をコードするＤＮＡ配列を含む最適化発現制御配列の使用が可能になる。このようにして、プラスミノーゲン断片の最適発現を達成することができる。例えば、前述したように、プロモーターを化学的に合成し、転写開始に対するそれらの位置を最適化することができる。
【００５１】
シグナルまたはシグナル−リーダー配列をコードするＤＮＡは、プラスミノーゲン断片をコードするＤＮＡ配列の上流に位置すると考えられる。シグナルまたはシグナル−リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端でのアミノ酸配列であり、これによって、該配列が結合したタンパク質を、それが生産される細胞から分泌させることができる。好適なシグナルおよびシグナル−リーダー配列は公知である。分泌されたタンパク質の方が往々にして精製しやすいが、一般に発現レベルは分泌なしに得られるものより低くなる。
【００５２】
プラスミノーゲン断片を発現させるベクターは、組換えＤＮＡ法に好適に付すことができ、かつ、選択した宿主細胞においてプラスミノーゲン断片を発現させる能力があるものであれば、どのベクターでもよい。宿主細胞を形質転換するのに用いるベクターは、宿主細胞において、該ベクターを複製させることができる１以上の複製系を含んでもよい。特に、宿主が酵母である場合には、ベクターは、少なくとも２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３および複製起点を含んでいなければならない。
【００５３】
あるいは、組込み用ベクターを用いて、宿主細胞の染色体に、本発明のプラスミノーゲン断片をコードする配列を組み込ませることもできる。宿主細胞におけるコード配列のコピー数は、自己複製ベクターを用いた場合より低いが、染色体に組み込まれた配列を有する形質転換体は一般にかなり安定している。
【００５４】
ベクターが自律複製ベクターである場合には、これは、好ましくは、高コピー数プラスミドであり、そのため、高レベルの発現が得られる。本明細書で用いる「高コピー数プラスミド」とは、１細胞当たり約１００コピー以上で存在するものを指す。多くの好適な高コピー数プラスミドが知られている。
【００５５】
ベクターはまた、ＤＮＡ配列の挿入用のユニーク制限部位と、選択可能または同定可能な表現型特性をコードする配列を含み、この表現型特性は、ベクターが宿主細胞中に存在するとき現れる（「選択マーカー」）。ベクターにユニーク制限部位がない場合には、これを改変して、制限部位を導入または排除することにより、後の操作にさらに適したものにする。
【００５６】
本発明のプラスミノーゲン断片をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを調製した後、これを用いて、宿主細胞を形質転換する。宿主細胞を形質転換する方法は、当業者には公知であり、これらの方法のいずれを用いてもよい。
【００５７】
形質転換した宿主細胞は、公知の方法で選択し、次に、プラスミノーゲン断片を生産するのに有効な条件下で培養する。培養方法は、選択した宿主細胞について当業者には公知のものである。
【００５８】
当業者には公知の、組換え細胞培養物からのタンパク質の回収および精製方法を用いて、発現したプラスミノーゲン断片を回収することができる。特に、本発明のプラスミノーゲン断片に選択的に結合する抗体を用いて、断片を精製することができる（以下参照）。
【００５９】
本発明はまた、血管新生疾患を治療する方法を提供する。血管新生疾患は、血管新生によって起こる、あるいは、血管新生に依存する疾患である。血管新生疾患としては、新生物疾患（例えば、腫瘍および腫瘍転移）、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫）、結合組織障害（例えば、慢性関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化）、眼球血管新生疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス）、心血管疾患、脳血管疾患、糖尿病関連疾患および免疫疾患（例えば、慢性炎症および自己免疫）が挙げられる。
【００６０】
血管新生疾患は、有効な量の天然アンギオスタチン、またはプラスミンのＮ末端配列を有しかつクリングル５の少なくとも一部を含む別のプラスミノーゲン断片を投与することにより、治療することができる。前述の理由から、天然アンギオスタチンが好ましい。
【００６１】
血管新生疾患はまた、プラスミンをアンギオスタチンに変換させるのに十分な量のスルフヒドリル供与体を投与することにより、治療することもできる。また、有効な量のプラスミノーゲンアクチベーターを動物に投与して、プラスミノーゲンからプラスミンを生成させることもできる。プラスミノーゲンまたはプラスミンは、動物に内在するものでもよいし、あるいは、有効量のプラスミノーゲンまたはプラスミンを動物に投与してもよい。
【００６２】
さらに、血管新生疾患はまた、プラスミノーゲンをプラスミンに変換させるのに十分な量のプラスミノーゲンアクチベーターを投与することにより治療することもできる。プラスミノーゲンは、内在するものでもよいし、あるいは、有効量のプラスミノーゲンまたはプラスミンを動物に投与してもよい。プラスミンは、スルフヒドリル供与体によってアンギオスタチンに変換される。スルフヒドリル供与体は、動物に内在するものでもよいし、あるいは、有効量のスルフヒドリル供与体を動物に投与してもよい。プラスミンのアンギオスタチンへの変換を促進する内在性遊離スルフヒドリル供与体の一例として、グルタチオンが挙げられる。グルタチオンは、正常および癌組織に存在するよく知られた内在性物質であり、細胞により細胞外環境へと放出される。この細胞外環境では、グルタチオンは、遊離スルフヒドリル供与体として働き、プラスミンのアンギオスタチンへの変換を媒介する。Ｍｅｌｌｏｎｉらは、気管支肺胞洗浄によって得られる上皮内層液（ＥＬＦ）中のグルタチオンのレベルが、癌に罹患していない喫煙者（５４４ ＋／− ９７．６μＭ）および非喫煙者（３３９．３ ＋／− １１２μＭ）と比較して、肺癌患者で有意に高い（１，４８５．５ ＋／− ２０８μＭ）ことを明らかにした（ｐ＜０．０５）（Ｍｅｌｌｏｎｉら、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．， １５４（６ Ｐｔ １）：１７０６−１１， １９９６）。特記すべきは、Ｓｏｆｆらが示すように、１００μＭのグルタチオンは、アンギオスタチン生成の補因子として働くことができ、これは、内在レベルのグルタチオンまたはその他の遊離スルフヒドリル供与体が、内在性プラスミンをアンギオスタチンに変換するのに十分であるとするパラダイムを支持するものである（Ｇａｔｅｌｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４（２０）：１０８６８−７２， １９９７）。
【００６３】
血管新生疾患に罹患したあらゆる動物を治療することができる。本発明に従い治療が可能な適した動物として、イヌ、ネコ、ウマ、その他の家畜、およびヒトなどの哺乳動物が挙げられる。
【００６４】
血管新生疾患を治療するための各種化合物の有効な投与形態、投与様式および投与量は、経験に基づいて決定することができるが、このような決定は、当業者の技術の範囲内である。当業者には、投与量が、使用した特定の化合物の活性、血管新生疾患の重症度、投与経路、化合物の排出速度、治療期間、動物に投与されるその他の薬剤の特性、動物の年齢、大きさおよび種、ならびに、医学および獣医学で公知の同様の要因に応じて変動することは理解されるであろう。一般に、本発明の化合物の適切な日用量は、治療効果を生み出す最低用量の化合物量である。しかし、日用量は、担当の医師または獣医が、健全な医学的判断の範囲内で決定する。所望であれば、有効な日用量は、一日を通し、適当な間隔をあけて、２、３、４、５、６回以上の小用量として投与してもよい。
【００６５】
本発明の化合物は、経口、鼻内、直腸、膣内、非経口（例えば、静脈内、棘間、腹腔内、皮下、または筋肉内）、槽内、経皮、頭蓋内、大脳内、および局所（口腔および舌下など）を含むあらゆる好適な投与経路で、治療対象の動物患者に投与することができる。好ましい投与経路は、皮下、経口および静脈内である。Ｂｒｅｍら、Ｌａｎｃｅｔ， ３４５， １５７１（１９９５）により記載されるものに類似した生分解性ポリマーを使用して、生分解性ポリマーへの組込み後に、薬剤の局所的持続放出を実施するのも好ましい投与方法である。例えば、腫瘍部位に薬剤含浸ポリマーを移植することにより、最小限の全身暴露で、局所暴露を長続きさせることも可能である。
【００６６】
本発明の化合物を単独で投与することもできるが、化合物を医薬製剤（組成物）として投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物は、１種以上の製薬上許容される担体と一緒に、場合によっては、１種以上のその他の化合物、薬剤またはその他の物質と一緒に混合した活性成分として、本発明の化合物を含んでなる。各担体は、組成物の他の成分と適合性であり、かつ患者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。
【００６７】
本発明の医薬製剤は、経口、鼻内、眼内、局所、直腸、膣内および／または非経口投与に適したものを含む。選択した投与経路が何であれ、本発明の化合物は、当業者には公知の通常の方法により製薬上許容される投与形態に製剤化される。
【００６８】
担体材料と組み合わせて単一の投薬剤形を形成する活性成分の量は、治療しようとする宿主、特定の投与様式、ならびに、既述したその他の要因に応じて変動する。担体材料と組み合わせて単一の投薬剤形を形成する活性成分の量は、治療効果を生み出す最低有効量、あるいは、癌などの生命を脅かす疾病の場合には、治療増強をもたらす最大限の許容量となる化合物量とする。
【００６９】
医薬製剤または組成物の調製方法は、本発明の化合物と、担体と、場合によっては１種以上の補助成分と、を混合する段階を含んでなる。一般に、この製剤は、本発明の化合物を、液状担体、微細な固形担体、または両方と均質かつ入念に混合させた後、必要であれば、その混合物を成形することにより調製する。
【００７０】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェ、丸薬、錠剤、粉末、顆粒、もしくは水性または非水性液体中での溶液または懸濁液、水中油型または油中水型エマルジョン、あるいは、エリキシル剤もしくはシロップ剤、またはトローチ剤（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を用いる）の剤形をしていてよく、各々が、活性成分として、予め決定された量の本発明の化合物を含んでいる。本発明の化合物はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【００７１】
経口投与用の本発明の固体投薬剤形（カプセル剤、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など）では、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムのような１種以上の製薬上許容される担体、および／または下記のもののいずれかと、活性成分を混合する：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールのような保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンのような溶解遅延剤；（６）第４アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイトクレーのような吸着剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの滑沢剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、医薬組成物はさらに緩衝剤を含んでもよい。軟質および硬質充填ゼラチンカプセルでは、類似タイプの固体組成物を充填剤として用い、その際、ラクトースまたは乳糖、ならびに、高分子量のポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いることができる。
【００７２】
錠剤は、場合によっては１種以上の補助成分と一緒に、圧縮または成形により製造することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性稀釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムデンプングリコレートまたは架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性剤または分散剤を用いて、製造することができる。成形錠剤は、不活性液体稀釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適当な機械で成形することにより得られる。
【００７３】
本発明の医薬組成物の錠剤、ならびに、糖衣錠、カプセル剤、丸薬および顆粒剤のようなその他の固体投薬剤形は、場合によっては、刻み目をつけたり、腸溶性コーティングやその他の医薬製剤分野で公知のコーティングなど、コーティングおよびシェルを備えて調製してもよい。これらは、所望の放出プロフィールを達成するような様々な割合の例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／または微小球を用いて、そこでの活性成分の遅延または制御された放出を提供するように調製することも可能である。これらは、例えば、細菌保持フィルターを介したろ過により、滅菌することができる。これらの組成物は、場合により不透明化剤を含んでいてもよく、活性成分のみを胃腸管の特定部分に、あるいは、優先的にそこに、必要に応じて遅延させて、放出する組成のものであってもよい。用いることができる包理用組成物の例として、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。また、活性成分は、マイクロカプセル化された形態をしていてもよい。
【００７４】
本発明の化合物の経口投与用の液体投薬剤形として、製薬上許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分以外に、液体投薬剤形は、例えば、水またはその他の溶剤のように当業界で一般に用いられている不活性稀釈剤；エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、アメリカホドイモ（ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ）、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物を含んでもよい。
【００７５】
不活性稀釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味料、着色剤、香料および保存料などの補助剤を含有してもよい。
【００７６】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントなどの懸濁化剤、ならびにこれらの混合物を含んでもよい。
【００７７】
直腸または膣内投与用の本発明の医薬組成物の製剤は、座薬の形態とすることができ、これは、１種以上の本発明の化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬用ロウまたはサリチル酸塩からなる１種以上の適当な非刺激性賦形剤または担体とを混合して調製することができる。この座薬は室温では固体であるが、体温で液体となるため、直腸または膣腔内で融解する。膣内投与に適した本発明の製剤には、当業者に好適であることが知られている担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたは噴霧製剤も含まれる。
【００７８】
本発明の化合物の局所または経皮投与用の投与形態としては、粉末、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。活性化合物は、製薬上許容される担体、および必要であれば、いずれかのバッファーまたは噴射剤と、無菌状態で混合することができる。
【００７９】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物および植物脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛などの賦形剤、もしくはこれらの混合物を含んでもよい。
【００８０】
粉末および噴霧剤は、本発明の活性化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、もしくはこれら物質の混合物を含有することができる。噴霧剤はさらに、クロロフルオロ炭化水素や、ブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素などの通常の噴射剤を含んでもよい。
【００８１】
経皮パッチは、身体に、本発明の化合物の制御された送達をもたらすという別の利点を有する。このような投薬剤形は、エラストマーマトリックス材料などの媒質に、本発明の化合物を溶解、分散または組み込むことにより調製することができる。また、吸収促進剤を用いて、皮膚への化合物の流入を高めることも可能である。このような流入速度は、速度制御膜を設けるか、あるいは、ポリマーマトリックスまたはゲルに化合物を分散させることにより、制御することができる。
【００８２】
非経口投与に適した本発明の医薬製剤は、１種以上の製薬上許容される無菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、もしくは使用の直前に無菌注射溶液または分散液で再構成することができる無菌粉末と組み合わせて、１種以上の本発明の化合物を含み、これらの液体または粉末は、抗酸化剤、バッファー、意図する受容者の血液と調製物を等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含んでいてもよい。
【００８３】
本発明の医薬組成物に用いることができる好適な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、ならびに、これらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、ならびに、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。レシチンのようなコーティング材料の使用により、また、分散液の場合には、必要な粒度の維持により、ならびに、界面活性剤の使用により、適正な流動度を維持することができる。
【００８４】
さらに、これらの組成物は、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでいてもよい。また、組成物に、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含有させるのが望ましい。加えて、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンのように、吸収を遅らせる物質を含有させることにより、注射用医薬形態の吸収を遅らせることもできる。
【００８５】
場合によっては、薬剤の効果を長続きさせるために、皮下または筋肉注射からの薬剤の吸収を遅くさせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶質または非晶質材料の懸濁液の使用により達成することができる。薬剤の吸収速度は、その溶解速度によって異なるが、その速度は、結晶の大きさおよび結晶質形態に応じて違ってくる。これ以外にも、非経口投与された薬剤の遅延吸収は、油ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁させることにより達成される。
【００８６】
注射可能なデポー剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマー中の薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより、調製される。薬剤とポリマーの比、および使用した特定ポリマーの性質に応じて、薬剤放出速度を制御することができる。その他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）とポリ（酸無水物）が挙げられる。注射可能なデポー剤はまた、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を閉じ込めることにより調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターを介したろ過により滅菌することができる。
【００８７】
製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルの形態をしていてもよいし、また、凍結乾燥された状態で保存することもでき、その場合は、無菌液体担体、例えば注射用の水を使用の直前に添加するだけでよい。即座の注射溶液および懸濁液は、前記タイプの無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００８８】
血管新生疾患は、遺伝子治療によっても治療することができる。特に、発現制御配列に機能的に連結された、プラスミンのＮ末端配列を有しかつクリングル５の少なくとも一部を含むプラスミノーゲン断片をコードするＤＮＡからなるトランスジーンを、上記疾患に罹患した動物に投与する。好ましくは、上記トランスジーンによりコードされるプラスミノーゲン断片は、天然アンギオスタチンである。発現制御配列に機能的に連結された、天然アンギオスタチンなどの本発明のプラスミノーゲン断片をコードするＤＮＡの作製については、以下に説明する。動物においてトランスジーンを発現させると、プラスミノーゲン断片が生産され、このプラスミノーゲン断片が、動物における血管新生を抑制する。
【００８９】
遺伝子治療のための方法および材料は当業者には公知である。Ｃｕｌｖｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ（改訂第２版、１９９６）、米国特許第５，５２１，２９１号、第５，４６０，８３１号および第５，５５９，０９９号、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２９２４２、ＷＯ９６／１４８７６およびＷＯ９６／３５７７４を参照されたい。なお、これらの文献はすべて、参照として本明細書にその全文を組み込むものとする。また、Ｋｉｒｓｈｎｂａｕｍら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９２， ３８１−３８７（１９９３）およびＤｒａｚｎｅｒら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９９， ２８８−２９６（１９９７）を参照。特に、トランスジーンの送達に好適な方法およびビヒクルは、公知であり、これらを用いて、本発明のトランスジーンを送達することができる。
【００９０】
例えば、トランスジーンをｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の細胞にトランスフェクションし、好ましくは、形質転換した細胞数を増やした後に、形質転換細胞を、血管新生疾患に罹患した動物に注射する。トランスジーンをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞にトランスフェクションする方法は公知であり、電気穿孔、裸ＤＮＡの細胞への直接注入、粒子ボンバードメント、リポソームまたはその他の脂質を基材とする担体による送達、ウイルスベクターによる送達などが挙げられる。
【００９１】
これ以外にも、トランスジーンが動物内で細胞を形質転換するような方法で、トランスジーンを動物に投与することもできる。トランスジーンをｉｎ ｖｉｖｏで送達する方法もよく知られており、所望組織、器官、または腫瘍への裸ＤＮＡの直接注入、リポソームまたはその他の脂質を基材とする担体を用いたトランスジーンの送達、非感染性ウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を用いたトランスジーンの送達、標的ビヒクル（該ビヒクルをトランスジーンに結合させて、このトランスジーンを特定の細胞、組織、器官または腫瘍に送達させるビヒクル、例えば、腫瘍特異的抗体を結合させたリポソームなど）を用いたトランスジーンの送達などが挙げられる。
【００９２】
本発明はまた、本発明のプラスミノーゲン断片と選択的に結合する抗体を提供し、これには、天然アンギオスタチンと選択的に結合する抗体が含まれる。「選択的に結合する」とは、プラスミノーゲンまたはプラスミンよりもむしろ、天然アンギオスタチンのような本発明のプラスミノーゲン断片と結合することを意味する。
【００９３】
本発明の範囲に含まれる抗体としては、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗血清、モノクローナル抗体、抗原と結合する能力がある抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）またはＦ（ａｂ’）_２）、抗体のあらゆる公知のアイソタイプまたはサブクラス、ならびに、作製された抗体（組換えＤＮＡ法で作製された一本鎖抗体など）が挙げられる。唯一の要件は、最終的抗体作製物が、プラスミノーゲン断片に対する特異性を有し、かつ該断片と選択的に結合する能力があることである。
【００９４】
抗体および抗体フラグメントの作製は、当業者には公知である。例えば、本発明の抗体は、好適な宿主動物（ウサギ、ヤギ、ウマまたはその他の哺乳動物）に、アジュバントと混合した本発明のプラスミノーゲン断片を注射することにより、作製することができる。該断片の注射は、適切な力価の抗血清が得られるまで継続する。抗血清を回収し、必要または所望であれば、公知の技法を用いて、さらに精製してもよい。例えば、抗体をアフィニティー精製してもよいし、あるいは、ＤＥ−５２クロマトグラフィーなどにより分画してもよい。
【００９５】
しかし、好ましくは、本発明の抗体は、免疫した動物（ラット、ハムスター、マウスまたはその他の哺乳動物）由来の細胞と、骨髄腫細胞のような不死化細胞との融合による体細胞ハイブリダイゼーションによって作製する。融合細胞をクローニングし、クローン化した融合細胞をスクリーニングすることにより、適した特異性のモノクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体の作製方法は公知である。
【００９６】
本発明のプラスミノーゲン断片と選択的に結合する抗体を用いて、プラスミノーゲン断片を含有する液体から該断片を精製することができる。このような液体としては、天然アンギオスタチンおよび本発明のプラスミノーゲン断片を生産するための本発明の方法（前記参照）の実施によって得られるような培地がある。これ以外に、天然アンギオスタチンは、体液（例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、ならびに、腫瘍が生産する液体）にも存在する。
【００９７】
プラスミノーゲン断片を精製するために、それを含有する液体を、特定の断片に特異的な抗体と接触させる。好ましくは、該抗体を固相表面と結合させた後、上記断片を含む液体と接触させる。好適な固相表面は、当業者には公知であり、市販されている。例として、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、およびナイロンが挙げられる。
【００９８】
抗体は、好ましくは、固相表面に共有結合させる。抗体を固相表面に共有結合させる方法および薬剤は当業者には公知である。好適な薬剤としては、カルボジイミド、シアノボロハイドライド、ジイミドエステル、過ヨウ素酸塩、ハロゲン化アルキル、スクシンイミド、ジメチルピメルイミジエートおよびジマレイミドが挙げられる。Ｂｌａｉｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５９， １２９（１９９３）；Ｂｌａｉｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４１， ２７００（１９８１）；Ｇａｕｔｈｅｉｅｒら、Ｊ． Ｅｘｐｒ． Ｍｅｄ．， １５６， ７６６（１９８２）を参照。
【００９９】
抗体をプラスミノーゲン断片に結合させるための反応物の特定濃度、インキュベーションの温度および時間、ならびに、その他の条件は、液体中のプラスミノーゲン断片の濃度、液体の種類などの要因によって変動する。当業者であれば、通常の実験を実施しながら、操作および最適条件を決定することができるであろう。
【０１００】
抗体をプラスミノーゲン断片に結合させた後、結合したプラスミノーゲン断片から残りの液体を分離する。次に、公知の方法で、プラスミノーゲン断片を抗体から放出させる。
【０１０１】
最も好ましくは、抗体を結合させた固相表面をカラム内に配置する。例えば、抗体と結合させたアガロースビーズで、カラムを充填する。プラスミノーゲン断片を含む液体を単純にカラムを通過させると、液体中のプラスミノーゲン断片はカラム中の抗体と結合して、カラム内に残るのに対し、残りの液体はカラムを通過する。カラムを洗浄した後、プラスミノーゲン断片を抗体から放出させる。
【０１０２】
また、天然アンギオスタチンと選択的に結合する本発明の抗体を用いて、血管新生疾患の診断のために、天然アンギオスタチンを検出または定量したり、あるいは、このような疾患の再発をモニタリングしたりすることができる。また、このような抗体を用いて、身体中のアンギオスタチンの作用機構を調べることもできる。
【０１０３】
天然アンギオスタチンは、体液（前記参照）、細胞および組織（腫瘍組織、胎盤、子宮、脳、肝および腸）などの物質中に検出することができる。天然アンギオスタチンは、公知の抽出法で細胞または組織から放出させることができる。
【０１０４】
液体または抽出物中の天然アンギオスタチンは、通常のイムノアッセイ技法を用いて、検出または定量することができる。このような技法として、凝集、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光アッセイ、比色分析などが挙げられる。イムノアッセイは、競合的結合フォーマットで実施してもよいし、イムノメトリックアッセイでもよい。これは、均一または不均一アッセイのいずれでもよい。好適な均一技法は、蛍光消光および増強、エネルギー転移イムノアッセイ、二重抗体立体障害イムノアッセイ、基質標識イムノアッセイ、補欠分子族標識イムノアッセイおよび酵素モジュレーター標識イムノアッセイである。
【０１０５】
細胞または組織上の天然アンギオスタチンは、当業者には公知の標準的免疫組織化学的技法により検出することができる。例えば、腫瘍を生検または収集し、組織切片をミクロトームで切断し、天然アンギオスタチン生成の部位を調べる。このような情報は、癌の検出および治療において、診断、そして恐らくは治療目的に有用であり、また、アンギオスタチンの作用様式を調べる研究目的にも有用である。
【０１０６】
天然アンギオスタチンは、天然アンギオスタチンと選択的に結合する標識抗体（一次抗体）、または別の抗体（二次抗体）もしくはプロテインＡのように、イムノグロブリンと結合する標識成分を用いて、検出または定量することができる。一次抗体、または一次抗体と結合する成分のいずれかに好適な標識は、当業者には公知である。例として、下記のものが挙げられる：１）酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ）；２）発蛍光団（イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミン）、３）放射性ヌクレオチド（^１２５Ｉなど）；４）生物発光標識（ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリン）；５）化学発光標識（ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステル）；６）粒子標識（金ナノ粒子など）；および７）ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン。これら標識の結合および検出は、当業者には公知の標準的技法を用いて、実施することができる。
【０１０７】
反応物の特定濃度、インキュベーションの温度および時間、ならびに、その他の条件は、いずれのイムノアッセイまたは免疫組織化学的アッセイであっても、サンプル中の天然アンギオスタチンの濃度、サンプルの種類などの要因によって変動する。当業者であれば、通常の実験を実施しながら、操作および最適条件を決定することができるであろう。
【０１０８】
天然アンギオスタチンを検出および定量する試験キットも本発明に含まれる。このキットは、本発明のイムノアッセイまたは免疫組織化学的技法を実施する上で有用な試薬を保有する１以上の容器のパッケージされた組合せ物である。該キットの試薬に適した容器として、瓶、バイアル、試験管、マイクロプレート、ディップスティック、ストリップ、およびその他の固相表面が挙げられる。
【０１０９】
上記キットは、天然アンギオスタチンと選択的に結合する抗体の容器を備える。これらの抗体は、既述した通りである。該抗体は、溶液状でもよいし、凍結乾燥させるか、あるいは、固相表面に結合させることもでき、また、標識もしくは非標識のいずれでもよい。固相表面は、前述したタイプのものであり、抗体を前記のように結合させる。
【０１１０】
上記キットはさらに、一次抗体と結合する前記標識成分を保有する容器を含む。標識は、既述した通りである。
【０１１１】
最後に、キットは、当業者には公知で、商業的およびユーザーの視点から望ましいと思われるその他の材料も含む。このような材料として、天然アンギオスタチンのサンプル（イムノアッセイを標準化するため、あるいは、免疫組織化学的技法において、細胞または組織と結合するための）、バッファー、酵素基質、稀釈剤、およびイムノアッセイまたは免疫組織化学的技法を実施するための装置が挙げられる。
【０１１２】
実施例
実施例１：プラスミノーゲン − アンギオスタチン変換活性 （ＰＡＣＡ） を含む調整培地の調製
この実施例は、様々な細胞が、精製ヒトプラスミノーゲンまたはプラスミンから生物活性アンギオスタチンを生成させることができる酵素活性を発現することを例示する。プラスミノーゲンまたはプラスミンを無血清調整培地（ＳＦＣＭ）とインキュベートすることにより生成されたアフィニティー精製アンギオスタチンは、ヒト内皮細胞の増殖、血管新生因子である塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）により誘導される遊走、内皮細胞管形成、およびｂＦＧＦ誘導角膜血管新生を抑制した。セリンプロテイナーゼ阻害剤（メタロ−、システイン、またはアスパラギン酸プロテイナーゼの阻害剤ではない）は、アンギオスタチン生成を妨げた。エラスターゼの特異的阻害剤であるエラスタチナールは、アンギオスタチン生成を妨げることができず、エラスターゼはプラスミノーゲンからアンギオスタチンへの変換に関与していないことを示す。実際、データは、アンギオスタチン生成にはセリンプロテイナーゼ活性が必要であることを示している。
【０１１３】
Ａ． 　方法
１． 　細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、２０％子牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ ＃Ａ−２１５１−Ｌ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、２５００Ｕヘパリンナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｔａｓｃａ， ＩＬ）、および５０ｍｇ／ｍｌ内皮細胞増殖補助剤（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を添加したＲＰＭＩで増殖させた。表１に記載した他の細胞を、１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０で増殖させた。細胞を、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で維持した。コンフルエント細胞単層をリン酸バッファーにより２回洗浄し、次いで無血清ＲＰＭＩを添加してＳＦＣＭを生成した。翌日に、ＳＦＣＭを回収し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心して、不溶性の細胞破片を除去した。
【０１１４】
２． 　アンギオスタチン生成
ヒトの血漿からリシン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーにより分離した２マイクログラムのヒトプラスミノーゲン（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ ＆ Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ８０， ３６５〜７８ （１９８１））、またはヒトプラスミン（＃５２７６２４， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を、１００μｌのＳＦＣＭアリコートに添加し、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。アンギオスタチン生成についてウェスタンブロット（下記参照）によりアリコートを分析した。ＳＦＣＭによるプラスミノーゲン切断もまた、プロテイナーゼ阻害剤の存在下で評価した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）。
【０１１５】
３． 　ウェスタンブロット
サンプルを、トリス−グリシンランニングバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０〜６８５ （１９７０））中、１２％ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）において非還元条件下で電気泳動し、０．４５μＭポリビニレン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍ．Ａ．）に電気移行させた。次いで膜を３０分間ブロッキングバッファー（１％牛血清アルブミンを含むトリスバッファー）中でブロックし、１：１０００に希釈した、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１〜３（Ｋ１〜３）断片に対するモノクローナル抗体（ＶＡＰ ２３０Ｌ， Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ， ＩＮ）により検出した。洗浄後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＫＰＬ） Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ， ＭＤ）と共に膜を３０分間インキュベートし、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＫＰＬ）を用いて発色させた。
【０１１６】
４． 　ザイモグラフ解析
マトリクスメタロプロテイナーゼ活性を検出するために、以前に記載された方法でザイモグラムを行った。Ｈｅｕｓｓｅｎ ＆ Ｄｏｗｄｌｅ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０２， １９６〜２０２ （１９８０）。
【０１１７】
５． 　色原性ペプチド基質
エラスターゼが存在するか否かを調べるために、５０μｌのＳＦＣＭに０．３ｍＭのエラスターゼ特異的色原性ペプチド基質（基質Ｉ：ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ 配列番号１５； 基質ＩＩ：Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ｐＮＡ 配列番号１６； 基質ＩＩＩ：ｐＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ； 基質ＩＶ：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｂｕ−ｐＮＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）を添加し、３７℃で２〜１８時間インキュベートした。基質の切断を、４０５ｎｍでの吸光度をモニターすることにより確認した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）。
【０１１８】
６． 　アンギオスタチンのリシン − セファロース精製
生物活性分析用の精製アンギオスタチンを生成させるために、ヒトプラスミノーゲンを２０μｇ／ｍｌのＰＣ−３ ＳＦＣＭにおいて３７℃で一晩インキュベートした。反応産物をＴＢＳ（５０ｍＭトリス、ｐＨ ７．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）により予め平衡化したリシン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にかけた。ＴＢＳによる洗浄で非特異的に結合したタンパク質を除去した後、アンギオスタチンを０．２Ｍ εアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を含むＴＢＳ溶液で溶出した。溶出画分をリン酸バッファーに対して透析した（カットオフ分子量１２，０００〜１４，０００）。残りのプラスミンを除去するために、アンギオスタチンをダイズトリプシン阻害剤アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）カラムにかけ、通り抜け画分を回収し、濾過滅菌して、使用するまで−８０℃で保存した。８．０のＡ^１％／_１ｃｍを用いて、２８０ｎｍで吸光度を測定することによりアンギオスタチンを定量した。Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ、ｖｏｌ．３、ｐｐ．１９１〜２０９ （Ｄａｖｉｄｓｏｎら編、１９７８）。さらに、精製アンギオスタチンを、ポリアクリルアミドゲルのクーマシーブリリアントブルー染色およびウェスタンブロットによる免疫検出によって調べた。Ｏ’ＲｅｉｌｌｙらのＮａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ２， ６８９〜６９２ （１９９６）に記載されるようにヒト血漿から精製された、エラスターゼにより生成されるアンギオスタチンは、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡのＭ．Ｓ． Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙの好意により贈呈された。
【０１１９】
７． 　アンギオスタチンのミクロシーケンス解析
アンギオスタチンバンドのＮＨ_２末端を決定するために、プラスミノーゲンとＰＣ−３ ＳＦＣＭをインキュベートすることにより調製された１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製アンギオスタチンを、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に電気ブロットして、クーマシーブルーにより染色した。バンドを切り出し、Ｐｏｒｔｏｎサンプル支持ディスク上に配置し、フェニルチオヒダントイン解析によるパルス液相シーケンサーを用いて配列決定した。
【０１２０】
８． 　内皮細胞増殖アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６^ＴＭ ＡＱ非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を利用して細胞増殖を測定した。ヒト内皮細胞を、濃度５．０×１０^３細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ， ＮＪ）に配置した。翌日、新鮮培地中の１、５、８または１０μｇ／ｍｌのアンギオスタチンを３回反復でウェルに添加した。アンギオスタチンを含まないウェルを対照とした。細胞を７２時間培養し、増殖細胞の数を表す４９０ｎｍでの吸光度を、自動マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。結果は、未処理の対照細胞数に対するパーセントとして表す。
【０１２１】
９． 　内皮細胞遊走アッセイ
プラスミノーゲンをＰＣ−３ ＳＦＣＭとインキュベートすることにより調製されたアンギオスタチンが、内皮細胞が血管新生因子であるｂＦＧＦに向かって遊走するのを防ぐ能力を調べるために、改変されたＢｏｙｄｅｎチャンバにおいて、牛毛管内皮細胞（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡのＦｏｌｋｍａｎ博士の好意により贈呈）を用いて以前に記載されたように遊走アッセイを行った。Ｄａｍｅｒｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５， １５８２〜８４ （１９９４）。細胞を、１０％ドナー牛血清および１００ｍｇ／ｍｌ 内皮細胞分裂促進剤を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）において増殖させ、継代して１５代目を使用した。遊走を評価するために、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）補充ＤＭＥＭにおいて細胞を一晩血清飢餓状態にして回収し、ＤＭＥＭ／ＢＳＡに懸濁し、反転Ｂｏｙｄｅｎチャンバ内のゼラチン化膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ）の下方表面に１０^６／ｍｌでプレートし、１．５〜２時間培養して細胞付着を可能にした。チャンバを再反転し、試験物質を上部ウェルに添加して、チャンバをさらに３〜４時間培養した。次いで膜を固定して染色し、１０倍の高倍率視野においてフィルターの頂部に遊走した細胞の数を測定した。０．１％のＢＳＡを添加したＤＭＥＭを陰性対照として使用し、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｎｏｅｌ Ｂｏｕｃｋ博士により提供されたものを、ＤａｍｅｒｏｎらのＳｃｉｅｎｃｅ， ２６５， １５８２〜１５８４ （１９９４）に記載のように調製した）を陽性対照として使用した。
【０１２２】
１０． 　内皮細胞管形成
ＨＵＶＥＣを、以前に記載されたように２４ウェル組織培養プレートにおいてＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｅｎｔａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈのＨｙｎｄａ Ｋｌｅｉｎｍａｎの好意により提供された）のゲル上に配置した。Ｓｃｈｎａｐｅｒら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ， １５６， ２３５〜２４６ （１９９３）。非調整ＲＰＭＩにおいてＰＣ−３ ＳＦＣＭとのインキュベートにより調製したアンギオスタチンをウェルに添加し、次いで５０％ＨＵＶＥＣ培養培地、５０％ＲＰＭＩ １ｍＬ中４．０×１０^４個の最終濃度で細胞を添加した。それぞれのアンギオスタチンまたは対照条件は、３回反復でアッセイを行った。培養物を５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中１６〜１８時間３７℃で培養し、次いでＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ溶液ＩＩ（Ｂａｘｔｅｒ， ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ， ＩＬ）で固定した。管の網状構造を表す領域を、Ｐｏｌａｒｏｉｄ ＭｉｃｒｏＣａｍカメラを用いて、最終倍率３５Ｘで撮影した。次にこの写真を、管の不完全な部分を修正しながら、それぞれの管の長さを測定する盲検オブザーバーが数量化した。それぞれの写真について管の全長を測定し、管の平均長さを決定した。結果は、平均±平均の標準誤差として表した。
【０１２３】
１１． 　角膜血管新生アッセイ
以前に記載されたとおりに角膜アッセイを実施した。Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９８， ４４０〜４５０ （１９９１）。要約すると、１０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦまたはｂＦＧＦと１または１０μｇ／ｍｌのアンギオスタチンを含む５μｌのハイドロンペレット（Ｈｙｄｒｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， ＮＪ）を、麻酔をかけたラットの角膜に注入した。７日後にラットを屠殺し、角膜の血管をコロイド状炭素で染色し、角膜の血管新生活性について調べた。
【０１２４】
Ｂ． 結果
１． 調整培地によるアンギオスタチン生成
ヒトプラスミノーゲンをＰＣ−３細胞が産生したＳＦＣＭとともにインキュベートした結果、約５０ｋＤにおいて複数の免疫反応性のバンドが発生した。それらは、Ｏ’ＲｅｉｌｌｙらＣｅｌｌ， ７９， ３１５−３２８ （１９９４）により観察されたものと類似していた。別の細胞系統に由来するＳＦＣＭの試験からも、ＰＣ−３ ＳＦＣＭと同様に複数のバンドの発生が明らかとなった（データは示していない）。これらの細胞系統は下記の表１に列記する。
【０１２５】
生成物がアンギオスタチンであることの最初の指標は、プラスミノーゲンのクリングル１〜３（Ｋ１〜３）に特異的なモノクロナール抗体との免疫反応性、および開裂産物の大きさに基づくものであった。その後の、プラスミノーゲンの開裂産物が生物学的に活性なアンギオスタチンであったことの裏付を以下に記載する。
【０１２６】
ＰＣ−３ ＳＦＣＭによるアンギオスタチン生成は時間依存的であった。プラスミノーゲン基質の有意な減少および、それに対応する、３時間後に始まったアンギオスタチンの増加があった。２４時間でアンギオスタチンへの変換は完結した（図１Ｂ）。ＰＣ−３ ＳＦＣＭを希釈した結果、アンギオスタチン生成は比例的に減少した（図１Ｃおよび１Ｄ）。
【０１２７】
プラスミン（酵素前駆体であるプラスミノーゲンの活性化形態）もまたアンギオスタチンに変換され得るかどうかを決定するために、プラスミンを候補基質として評価した。プラスミンをＰＣ−３ ＳＦＣＭとインキュベートして、プラスミノーゲン由来アンギオスタチンと区別できない生成物を得た（図１Ａ）。反応速度論的研究では、プラスミンは、プラスミノーゲンに匹敵する速度で、アンギオスタチンに変換された。８時間で５０％変換され、２４時間で完全に変換された（データは示していない）。これらのデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、プラスミノーゲンとプラスミンの両者が、そこからアンギオスタチンを生成することができる基質であることを示唆している。
【０１２８】
【表１】

【０１２９】
２． プラスミノゲン − アンギオスタチン変換活性の酵素分類
アンギオスタチン生成活性のタンパク質分解酵素分類を決定するために、ＰＣ−３ ＳＦＣＭをプラスミノーゲンと共に種々のプロテイナーゼ阻害剤の存在下でインキュベートした。プロテイナーゼ阻害剤を、終夜のインキュベーションの前に、ＳＦＣＭ／プラスミノーゲン混合物に添加した。試料を、アンギオスタチン生成の阻害の立証のためウエスタンブロットで分析した。
【０１３０】
セリンプロテアーゼ阻害剤だけがアンギオスタチン生成を阻止した（表２参照）。対照的に、他の分類のプロテイナーゼ阻害剤はいずれも効果がなかった。
【０１３１】
アンギオスタチンは、エラスターゼによるプラスミノーゲンの限定されたタンパク質分解（ｌｉｍｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）によってｉｎ ｖｉｔｒｏ生成できる。Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ， ３， １９１−２０９ （Ｄａｖｉｄｓｏｎ ら編１９７８年）中のＳｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ２， ６８９−６９２ （１９９６）；Ｄｏｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３７， ５８ （１９９６）。本研究においては、アンギオスタチンの生成は、エラスターゼの特異的阻害剤であるエラスタチナールによって阻害されなかった（以下の表２参照）。加えて、ＳＦＣＭの４種類のエラスターゼ感受性色原性基質と共に行った２４時間のインキュベーションに基づいて、ＰＣ−３ ＳＦＣＭにはエラスターゼ活性が検出されなかった（データは示していない）。このデータは、ヒトプラスミノーゲン−アンギオスタチン変換活性がエラスターゼの作用に依存している可能性は無いことを示している。そのうえ、ゼラチンザイモグラムは、ＰＣ−３ ＳＦＣＭ中には、活性のまたは潜在的な金属プロテイナーゼの形跡が無いことを明らかにした（データは示していない）。
【０１３２】
【表２】

【０１３３】
３． アンギオスタチンの精製
ＰＣ−３ ＳＦＣＭにより生成されたアンギオスタチンをリシン−セファロース（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ２， ６８９−６９２ （１９９６））上でアフィニティー精製し、得られた生成物をウエスタンブロットおよびクーマシーブルー染色により調べた（図２）。３つの全てのバンドのアミノ末端配列は、プラスミノーゲン分子の残基７８〜８７に対応するＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧ（配列番号１）であり、該生成物はプラスミノーゲンの内部断片であることが確認された。
【０１３４】
４． ＰＣ−３ ＳＦＣＭ により生成されたアンギオスタチンは血管新生を阻害する
血管新生は、内皮細胞の増殖、遊走、および管形成を含む細胞内過程のカスケードの現われであることから（ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７， １０９３１−１０９３４ （１９９２））、血管新生に関する複数のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを利用して、プラスミノーゲンをＰＣ−３ ＳＦＣＭと共にインキュベートして生成した産物が生物学的に活性なアンギオスタチンであることを確認した。
【０１３５】
アフィニティー精製した、ＰＣ−３ ＳＦＣＭにより生成されたアンギオスタチンは、ヒト内皮細胞の増殖を濃度依存的に阻害した。未処理対照の細胞増殖と比較して有意な阻害が１０μｇ／ｍｌ （ｐ＜０．０５）で観察された（図３Ａ）。
【０１３６】
ＰＣ−３ ＳＦＣＭにより生成されたアンギオスタチンはまた、ウシ毛細血管内皮細胞（図３Ｂ）のｂＦＧＦに誘導された遊走を、ＥＤ_５００．３５μｇ／ｍｌで阻害した。ＰＣ−３ ＳＦＣＭにより生成されたアンギオスタチンの用量／応答曲線は、エラスターゼにより生成されたアンギオスタチンのそれと見分けがつかなかった。遊走の阻害は、増殖の阻害に必要な濃度より１０倍低い濃度で起こった。この知見は、他の血管新生阻害物質についても報告されている。Ｔａｋａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４， ２６５４−２６６０ （１９９４）。このことは、増殖アッセイは、遊走アッセイとは対照的に、２０％子ウシ血清および内皮細胞増殖補助剤を添加したＲＰＭＩ中で行ったために、多数の刺激性の因子を含有していたという事実によるものである可能性がある。
【０１３７】
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上での内皮細胞の管形成は、１５μｇ／ｍｌで有意に阻害された（図４Ａおよび４Ｂ）；未処理対照での管の平均長は、ＰＣ−３ ＳＦＣＭにより生成されたアンギオスタチンについては２８７．７±４７ｍｍであったのに対して、６７４．５±５４ｍｍであった（Ｐ＜０．００５）。
【０１３８】
ＰＣ−３ ＳＦＣＭにより生成されたアンギオスタチンの、ｉｎ ｖｉｖｏでの角膜血管新生に対する効果を決定するために、該アンギオスタチンの、角膜血管新生アッセイにおいてｂＦＧＦで誘導される血管新生を阻害する能力を試験した。ｂＦＧＦペレットは、移植した角膜の１００％に血管新生を誘導した（図５Ａ）。対照的に、アンギオスタチンは１０μｇ／ｍｌにて、３個体のうちの３個体において、ｂＦＧＦで誘導される血管新生の応答を完全に阻害した（図５Ｂ）。１．０μｇ／ｍｌのより低い濃度で、アンギオスタチンは、３個体のうちの２個体において血管新生を完全に阻止し、第３の個体において部分的に阻害した。
【０１３９】
総合すれば、これらのデータは、ＰＣ−３ ＳＦＣＭにより生成されたアンギオスタチンはｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの血管新生の両方の強力な阻害剤であることを示している。
【０１４０】
実施例２：プラスミノーゲンからアンギオスタチンへの変換に関与する因子の同定
実施例１に記載したように、ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ−３を増殖させ、ＰＣ−３ ＳＦＣＭを調製した。実施例１に記載したように、ＰＣ−３ ＳＦＣＭまたは以下で同定されるその他の物質とともにインキュベートすることによって、アンギオスタチンを生成させた。実施例１に記載したようにして、ウエスタンブロットを実施した。
【０１４１】
ＰＣ−３ ＳＦＣＭをＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅカラム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に適用した。ウエスタンブロット分析によって証明されている（図６）ように、通り抜け画分にはプラスミノーゲン−アンギオスタチン生成活性の残留がなかった。製造元のプロトコルにしたがって、結合した物質を１ Ｍ ＫＣｌで溶出させ、次に分子カットオフ値６０００−８０００ダルトンでトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．４、１００ ｍＭ ＮａＣｌ）に対して透析した。透析画分中にＰＡＣＡは検出されなかった（図６）。通り抜け画分にも溶出液にもＰＡＣＡが検出されなかったという結果から、プラスミノーゲンもしくはプラスミンからアンギオスタチンを生成するためには２種以上の因子が必要であること、またそれらの因子はＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって分離され、１種以上の因子が溶出液中に存在し、さらに別の因子が通り抜け画分中に含まれるという仮説が導かれた。
【０１４２】
この仮説を検証するため、透析した溶出液を通り抜け画分と再混合した。再混合した物質はプラスミノーゲンをアンギオスタチンに変換することができた。Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ通り抜け画分と同様に、新鮮なＲＰＭＩ培養液を溶出液に補充すると、溶出液のアンギオスタチンを生成する能力が復活し、必須の因子はＲＰＭＩの１成分であって、ＳＦＣＭに独特であるタンパク質またはその他の因子ではないことが示唆された。
【０１４３】
推定上の補助因子をさらに確定するため、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液を補足する能力について、ＲＰＭＩの個々の成分を評価した。補助因子はＲＰＭＩアミノ酸混合物中に存在した（図６）。
【０１４４】
どのアミノ酸がＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液に対してＰＡＣＡを復活させる能力があるかを決定するため、ＲＰＭＩ中に見られる２０アミノ酸を個別に試験した。Ｌ−システインがＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液に対してＰＡＣＡを復活させる能力がある唯一のアミノ酸だった（データは示されていない）。
【０１４５】
Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液へのＬ−システインの添加によってアンギオスタチン生成活性が復活したので、補助因子はスルフヒドリル供与体であると仮定した。そこで、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液に対してＰＡＣＡを復活させる能力について、薬理学的還元剤、Ｄ−ペニシラミンおよびカプトプリルを試験した。Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液への１００μＭ Ｄ−ペニシラミンの添加はアンギオスタチン生成活性を復活させた。カプトプリルもまたＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液に対してアンギオスタチン生成活性を復活させた。
【０１４６】
ＰＣ−３ ＳＦＣＭを５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ１０．０、２０ ｍＭ ＮａＣｌで希釈し、Ｈｉ−Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換樹脂（Ｂｉｏ Ｒａｄ）に適用した。通り抜け画分中にＰＡＣＡは検出されなかった。
【０１４７】
予備実験で、ＰＡＣＡはＨｉＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから３００ ｍＭ ＮａＣｌによって溶出することが示された。そこで、２０ ｍＭから３００ ｍＭまで直線的に変化するＮａＣｌを使用して、結合した物質を溶出させた。（生理学的ＮａＣｌ濃度を回復するように希釈した後の）該画分中の、ＰＡＣＡおよびウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）活性を測定した。ｕ−ＰＡ活性およびＰＡＣＡは同時に精製された（図７）。Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液の検査から、これもｕ−ＰＡを含有することが明らかになった。
【０１４８】
実施例１に記載したように、アンギオスタチンのＮＨ_２−末端切断はＬｙｓ^７７の位置であり、これはプラスミンによるＧｌｕ−プラスミノーゲンの切断の結果である部位である。このことは、プラスミンの生成が、プラスミノーゲンからのアンギオスタチンの生成において必須の中間ステップであるらしいことを示唆している。
【０１４９】
Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液中の因子がｕ−ＰＡであるかどうかを判定するため、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ溶出液の代替物としてｕ−ＰＡを試験した。図８に示すように、ｕ−ＰＡは、いずれもスルフヒドリル供与体源である煮沸したＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ通り抜け画分もしくはＲＰＭＩの存在中でアンギオスタチン生成能力があった。このことは、プラスミノーゲンをアンギオスタチンに変換するために必要な唯一のタンパク質はｕ−ＰＡであることを意味している。
【０１５０】
次に、ｕ−ＰＡ、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）およびストレプトキナーゼをＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ通り抜け画分と組合せてＰＡＣＡについて試験した。プラスミノーゲンアクチベーターのみではプラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成することができなかったが、通り抜け画分の存在中では、アンギオスタチンが生成した（図９）。これらのデータは、プラスミンの生成はアンギオスタチン生成のための中間段階であること、そしてアンギオスタチンの生成はどのプラスミノーゲンアクチベーターが存在するかに依存しないことを示唆している。
【０１５１】
実施例３：プラスミノーゲンアクチベーターおよびスルフヒドリル供与体を使用するアンギオスタチンの生成
プラスミノーゲンをアンギオスタチンに変換するために必要な唯一のタンパク質はプラスミノーゲンアクチベーターであり、またスルフヒドリル供与体が必須の補助因子であることを証明したので、次にアンギオスタチンの生成のためにはこれらの成分で十分かどうかを判定した。すべてのインキュベーションをＴＢＳ中、３７℃で１８時間実施し、生成したサンプルをウエスタンブロット（実施例１に記載したようにして実施した）によって、アンギオスタチンについて分析した。
【０１５２】
プラスミノーゲンおよび５μＭ以上の還元グルタチオンとともにｕ−ＰＡをインキュベートすると、アンギオスタチンが産生された（図１０）。グルタチオン不在中ではアンギオスタチンが産生されなかった。
【０１５３】
ｕ−ＰＡと組合せた１００μＭもしくは１ ｍＭ Ｄ−ペニシラミンの使用でもアンギオスタチンを生成させることができた（図１１）。
【０１５４】
最後に、１００μＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインとのプラスミノーゲン（０．２μＭ）と、ｕ−ＰＡ（０．２ ｎＭ）、ｔ−ＰＡ（１．０ ｎＭ）もしくはストレプトキナーゼ（８．０ ｎＭ）のインキュベーションの結果、アンギオスタチンが産生された（図１２）。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの不在中では、プラスミノーゲンがアンギオスタチンに変換されなかった。
【０１５５】
これらのデータは、プラスミノーゲンはスルフヒドリル供与体の存在中では古典的プラスミノーゲンアクチベーターのそれぞれによってアンギオスタチンに変換されるが、スルフヒドリル供与体不在中では変換されないことを示している。さらに、これらのデータおよび実施例２のデータは、生理学的還元剤（Ｌ−システイン、還元型グルタチオン）および薬理学的還元剤（カプトプリル、Ｄ−ペニシラミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）の存在中で、アンギオスタチンが産生されることを証明している。
【０１５６】
実施例４：アンギオスタチン生成のためのプラスミンの使用
ＴＢＳ １００μｌ中のヒトプラスミノーゲン ２μｇをｕＰＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）１０μｌとともに３７℃で２時間インキュベートした。このインキュベーション後、サンプルを遠心分離してｕＰＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを沈殿させ、プラスミンを含有する上清を回収した。クーマシー染色した還元ポリアクリルアミドゲル上での上清の分析によって、プラスミノーゲンのプラスミンへの完全変換を確認した。次に精製したプラスミンを１００μＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインとともに３７℃で１８時間インキュベートし、ウエスタンブロット（実施例１に記載したようにして実施した）によって、アンギオスタチンの生成についてサンプルを分析した。
【０１５７】
結果を図１３に示す。これらの結果は、プラスミノーゲンからのアンギオスタチンの生成において、プラスミンが必須の中間体であり、そして精製プラスミンとスルフヒドリル供与体とのインキュベーションによって、アンギオスタチンを産生させることができることを証明している。
【０１５８】
実施例５：プラスミノーゲンアクチベーターを伴うかまたは伴わないスルフヒドリル供与体による腫瘍の ｉｎ ｖｉｖｏ 処置
６〜８週令の雌ベージュヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＮＹ）１１匹の右側腹部に、リン酸緩衝生理食塩水 １００μｌ中のマウス血管内皮腫（ＥＯＭＡ）細胞（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩより寛大な提供を受けた）１．０ｘ１０^６細胞を皮下注射した。ＥＯＭＡ腫瘍細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリンＧおよび１００ ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中で増殖させ、１０％ＣＯ_２雰囲気中の加湿インキュベーター中、３７℃で維持した。腫瘍細胞の注射日を０日目とした。
【０１５９】
１日目から開始して１日に２回、各マウスに以下の皮下注射をした。
【０１６０】
【表３】

【０１６１】
組織カリパスを使用して１週間毎に３回、各マウスの原発腫瘍のサイズを測定し、数式（幅^２ｘ長さｘ０．５２）（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２，６８９−６９２（１９９６））を使用して、腫瘍の体積を決定した。結果を図１４に示す。これからわかるように、対照グループに比較して、ＮＡＣでの処置およびｕＰＡ＋ＮＡＣでの処置の両方によって、効果的かつ有意に平均腫瘍サイズが減少した。対照マウス１匹が１０日目に死亡し、もう１匹の対照マウスが１７日目に死亡したことに注目すべきである。２１日の実験期間中、ＮＡＣもしくはｕＰＡ＋ＮＡＣで処置したどのマウスも死亡しなかった。
【０１６２】
対照マウス２匹およびＮＡＣ処置マウス３匹から絶命させた日に採取した血漿サンプルを、ウエスタンブロット（実施例１に記載したように実施した）によって、アンギオスタチンについてアッセイした。対照として２匹のマウスに、１日目から開始して絶命の２４時間前まで１日に２回、アフィニティー精製した無細胞アンギオスタチン １．００ ｍｇを皮下注射した。アフィニティー精製した無細胞アンギオスタチンは実施例３に記載したようにして作成し、実施例１に記載したようにしてリシン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでアフィニティー精製した。結果を図１５に示す。これからわかるように、マウスへのＮＡＣ投与の結果、アンギオスタチンがｉｎ ｖｉｖｏ産生された（レーン５、６および７）。対照マウスではアンギオスタチンの産生が検出されなかった（レーン１および２）。
【０１６３】
実施例６：天然アンギオスタチンのＣ末端配列の決定
ヒトプラスミノーゲン（０．２μＭ）を組換えヒトｕ−ＰＡ（０．２ ｎＭ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）および１００μＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインとともに３７℃で一晩インキュベートすることによって、天然アンギオスタチンを生成させた。次にこの物質をリシンＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（実施例１参照）に適用し、通り抜け画分を回収して濃縮した。濃縮した通り抜け画分のアリコートを、Ｔｒｉｓ−グリシンランニングバッファー中の１２％ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）上、非還元条件下で電気泳動にかけて、０．４５μｍ ２フッ化ポリビニレン（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）に電気泳動転移させ、タンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した。
【０１６４】
染色した膜は約３０ ｋＤの位置に通り抜け画分からの２つの非常に顕著なバンドを示した。その他のバンドも観察されたが、それらのバンドの染色は２つの３０ ｋＤバンドよりもかなり弱く、２つの３０ ｋＤバンドが通り抜け画分の優勢な成分を含有していることを意味していた。
【０１６５】
実施例１に記載したマイクロシークエンス分析によって、２つの３０ ｋＤバンド内のタンパク質のＮ末端配列を決定した。２つのバンドの最も顕著なもののＮ末端配列はＬｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ ［配列番号２］であり、他方のバンドの配列はＬｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ ［配列番号３］であった。プラスミノーゲンのクリングル５中のこれらの配列の所在地（図１６参照）および２つのバンドの優位性から、これらが天然アンギオスタチンのＣ末端の形成のためにプラスミノーゲンが切断された結果として放出された断片であることの極めて強力な証拠となる。
【０１６６】
２つの３０ ｋＤ断片のＮ末端配列から、天然アンギオスタチンのＣ末端配列が Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ ［配列番号４］または Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ ［配列番号５］であると推論された。これらのＣ末端配列はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸５２９（Ａｒｇ）もしくは５３０（Ｌｙｓ）の後の切断によって形成されるものと見られ、これはクリングル５内にあり（図１６参照）、これらはプラスミン切断部位として知られている。この位置での切断は、非還元条件下でのアクリルアミドゲル電気泳動上で天然アンギオスタチンについて観察される分子量に近いプラスミノーゲン断片をもたらすはずである（５０〜６０ ｋＤ）。
【０１６７】
ヒト天然アンギオスタチンのＮ末端配列 ［配列番号１］は、上記実施例１に示されている。したがって、ヒト天然アンギオスタチンは以下のＮ末端配列：
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ ［配列番号１］、
およびＣ末端配列：
Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ ［配列番号４］もしくは
Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ ［配列番号５］、
を持つ、クリングル５の大部分を含むプラスミノーゲン断片であると推論された。
【０１６８】
実施例７：天然のアンギオスタチンに対する抗体
天然のヒトアンギオスタチンのＣ末端に対する抗体（実施例６参照）を、Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ ［配列番号：１７］（ＲＰ−ＨＰＬＣによって＞ ９５％の純度に精製；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）の配列を有し、架橋剤としてのグルタルアルデヒドを用いてキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に１：１の重量比で結合されたペプチドで免疫した３匹のニュージーランド白ウサギによって調製した。該ウサギは、リン酸緩衝化食塩水に懸濁し同量の完全フロイントアジュバントと混合することによって乳化したペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを、背面４ヶ所に皮下注射することによって免疫した。続いての免疫は、不完全フロイントアジュバントを用いて実施した。該ウサギの耳の動脈から採血し、該血液を凝固させ、血清を遠心分離によって回収した。
【０１６９】
アフィニティー精製は、アガロースに結合させた合成ペプチド［配列番号：１７］を用いて実施した。未精製の血清を樹脂に流し、洗浄後、吸着したタンパク質を低ｐＨのグリシン−ＨＣｌバッファーで溶出した。抗血清は、還元型及び非還元型のプラスミノーゲン、プラスミン及び実施例６に記載のように生成した天然のアンギオスタチンを認識したが、エラスターゼ由来のアンギオスタチン（クリングル１〜３からなる）は認識しなかった。
【０１７０】
実施例８：ヒト癌患者の治療
４人のヒト癌患者を、スルフヒドリル供与体とプラスミノーゲンアクチベーターとの組合せ物を用いて治療した。カプトプリルをスルフヒドリル供与体として使用した。ウロキナーゼ（ｕＰＡ）又は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）をプラスミノーゲンアクチベーターとして使用した。投与した化合物並びにその用量及び投与計画は以下の表４にまとめる。さらに、患者の一人（症例＃２）には、ｕＰＡのみを用いて（すなわち、カプトプリルなし）単一治療を行った。
【０１７１】
治療開始前及び開始後様々な時間で、クエン酸ナトリウム抗凝固薬中に血液サンプルを採取した。血小板の少ない血漿を血液から単離し、試験するまで凍結保存した。
【０１７２】
実施例１に記載のように、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）中の血漿サンプル（１：２０に希釈）に対して、ウェスタンブロットを実施した。症例＃２から採取した血漿サンプルのいくつかに対して実施したウェスタンブロットの結果を、図１７Ａに示す。上記のように、この患者はｕＰＡのみを投与されたもの及びカプトプリルと組み合わせて投与されたものである。図１７Ａからわかるように、アンギオスタチンレベルの顕著な増加が、それぞれの治療の結果として観察された。これは、プラスミンをアンギオスタチンに変換するためにカプトプリル又はその他のスルフヒドリル供与体は必ずしも必要とされない場合があることを示している。このような症状としては、中皮腫、又は内因性スルフヒドリル供与体を放出しうるか若しくはプラスミンのアンギオスタチンへの変換を何らかの別の方法で媒介するその他の癌の存在を挙げることができる。
【０１７３】
リシン結合蛋白質は、症例＃２にｕＰＡ単独又はｕＰＡとカプトプリルを投与した後に得られた血小板の少ない血漿から精製した。最初に１ｍｌの血小板の少ない血漿を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）で１：４０に希釈し、８ｍｌのリシン−セファロース（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、中で予め平衡化させたもの）とともに１２時間以上、４℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした（予備実験において、樹脂：血漿＝８：１で９９％をこえるアンギオスタチンと血漿が結合した）。血漿上清を穏やかな遠心により（２０００ ｘ ｇ）分離し、樹脂を、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の４０ｍｌで３回洗浄した。洗浄及び遠心の繰り返しの後、結合したタンパク質を２００ ｍＭ ＥＡＣＡ、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の４ｍｌで溶出し、溶出液を４０ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）に対して透析し、スピン濃縮して（ＭＷカットオフ＝ １０，０００）５００μｌにした。ウェスタンブロット及びクーマシー染色ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、リシンに結合した画分はプラスミノーゲン、アンギオスタチン及び複合体化アンギオスタチンのみを含んでいた。
【０１７４】
症例＃２から採取した血漿サンプルのリシン結合画分の抗血管新生活性を評価するため、細胞増殖アッセイを以下のように実施した。ウシ大動脈内皮細胞を、２．５％ 熱不活性化仔ウシ血清、１００ ユニット／ｍｌペニシリンＧ、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭの入った２４ウェル培養皿に１．０ ｘ １０^４細胞／ウェルでプレートし、細胞を加湿インキュベーター中、３７℃にて一晩インキュベートした。その後３日間、毎日３ ｎｇ／ｍｌ ヒト ｂＦＧＦ （Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）を含む新しい培地を単独で添加するか、又は種々の量のリシン結合画分とともに添加した。陽性対照として、１００ ｎＭのアフィニティー精製無細胞アンギオスタチン（実施例６に記載のように調製）を使用した。処置の７２時間後、細胞をリン酸緩衝化食塩水で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて分散させ、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを２回反復でウェルからカウントすることによって細胞数を測定した。結果を図１７Ｂに示す。図に示すように、この内皮細胞増殖アッセイによって測定したところによると、ウロキナーゼの単独投与は、抗血管新生活性を誘導した。カプトプリルとウロキナーゼを組み合わせて投与することにより、抗血管新生活性がよりいっそう誘導されるのに対し、ウロキナーゼ単独でも抗血管新生活性を誘導した。これらのデータは、抗血管新生活性がプラスミノーゲンアクチベーター単独によっても誘導されるが、プラスミノーゲンアクチベーターと遊離スルフヒドリル供与体との組合せ物ほど強力には誘導されないことを示す。
【０１７５】
症例＃１は、左骨盤に再発性のユーウィング肉腫を有する１４歳の女児であった。広範囲にわたる事前治療により、彼女が化学療法又は放射線療法に耐えられなくなった後、彼女にカプトプリル及びウロキナーゼの組合せ物を複数のサイクルで投与した。投与用量及び投与計画を表４にまとめる。最初の数ヶ月間は、彼女に、カプトプリル−ウロキナーゼの組合せ物を２週間毎に連続３日間投与した。続いて、彼女に、合計１年間にわたり、３週間毎に連続２日間この組合せ物を投与した。「サイクル」とは２〜３日間の治療と、２又は３週間後に治療が開始されるまでの治療の休閑日を合わせたものをいう。ウェスタンブロットは、アンギオスタチン関連タンパク質の生成を示した。該タンパク質には、遊離のアンギオスタチン、並びに、アンギオスタチンとその他のタンパク質若しくはタンパク質群との複合体が含まれる。その他のタンパク質は、いまだ同定されていない。ウェスタンブロット上に観察された大きな免疫反応性バンドは、アンギオスタチンを含むと考えられる。なぜなら、（ａ）それらはアンギオスタチンに対するいくつかの抗体、例えば、クリングル依存性抗体及びＣＯＯＨ末端特異的抗体と交叉反応し、（ｂ）リシン−セファロ−スでアフィニティー精製してジスルフィド還元すると、複合体は単量体アンギオスタチンを生成し、（ｃ）該複合体はセファロースに結合させたアンギオスタチンに対するモノクローナル抗体を含む樹脂を用いてアフィニティー精製することができるからである。３ヶ月にわたる治療により、該患者は完全な寛解に達した。この治療を丸一年続けると、患者は、治療期間中並びに治療完了後６ヶ月間は、寛解を維持した。
【０１７６】
すべての症例における、治療及び達成された結果を表４にまとめる。
【０１７７】
【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ：　ＰＣ−３細胞によって調製された無血清調整培地（ＳＦＣＭ）によるプラスミノーゲンとプラスミンのアンギオスタチンへの変換を示すウェスタンブロット。レーン１：分子量標準、レーン２：ヒトプラスミノーゲン、レーン３：非調整ＲＰＭＩ培地中、３７℃で、一晩インキュベートしたヒトプラスミノーゲン、レーン４：ＰＣ−３細胞由来のＳＦＣＭ中、３７℃で、一晩インキュベートしたヒトプラスミノーゲン、レーン５：非調整ＲＰＭＩ培地中でインキュベートしたヒトプラスミン、レーン６：ＰＣ−３細胞由来のＳＦＣＭ中でインキュベートしたヒトプラスミン。
図１Ｂ：　プラスミノーゲンからのアンギオスタチン生成が時間依存的であったことを示すウェスタンブロット。ＰＣ−３ ＳＦＣＭをプラスミノーゲンとインキュベートし、図に示した時点で、アリコートを取り、急速凍結させてからウェスタンブロット分析に付した。微量のアンギオスタチン生成が、最初に３時間の時点で観察された。そして、完全な変換は２４時間の時点で観察された。
図１Ｃ：　ＰＣ−３ ＳＦＣＭによるアンギオスタチン生成が濃度依存的であったことを示すウェスタンブロット。ＳＦＣＭは、図に示したように様々な量の新しいＲＰＭＩで希釈し、プラスミノーゲンと一緒に２４時間インキュベートした。
図１Ｄ：　ＳＦＣＭ量とアンギオスタチン生成との関係を示すグラフ。相対的なアンギオスタチンのシグナルは、走査型デンシトメーターを用いてバックグラウンドを差し引くことにより定量した。インキュベーション開始後１８時間の時点で、生成されるアンギオスタチン量と反応混合物中に存在するＰＣ−３ ＳＦＣＭの量との間には直線相関が存在した。
【図２】
プラスミノーゲンと、ＰＣ−３細胞によって調製されたＳＦＣＭ、とのインキュベーションによって生成される、アンギオスタチンのアフィニティー精製後のウェスタンブロット。レーン１：分子量標準、レーン２：非調整ＲＰＭＩ培地中、３７℃で、一晩インキュベートしたヒトプラスミノーゲン、レーン３：プラスミノーゲンとＰＣ−３ ＳＦＣＭとのインキュベーションに続いて、リシン−セファロースで精製し、クマシーブルーで染色することによりウェスタンブロット上で検出されたアンギオスタチン、レーン４：プラスミノーゲンとＰＣ−３ ＳＦＣＭとのインキュベーションに続いて、リシン−セファロースで精製し、クリングル１〜３に対するモノクローナル抗体Ｋ１〜３を使用してウェスタンブロット上で検出されたアンギオスタチン。
【図３】
図３Ａ−Ｂ：　プラスミノーゲンとＰＣ−３ ＳＦＣＭとをインキュベートすることにより生成されるアンギオスタチンが、血管新生にとって重要なｉｎ ｖｉｔｒｏステップを抑制することを示すグラフ。
図３Ａ：　内皮細胞の増殖を示すグラフである。データは平均±標準偏差で示す。
図３Ｂ：　塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に誘導される細胞遊走を示すグラフである。刺激性ｂＦＧＦの存在下および誘導物質不在下でのバックグラウンド遊走を示す。毒性を、平行して、トリパンブルー排除により測定したところ、毒性はすべての濃度において１０％未満であった。
【図４】
図４Ａ−Ｂ：　プラスミノーゲンとＰＣ−３ ＳＦＣＭとをインキュベートすることにより生成されたアンギオスタチンが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト内皮細胞管形成を阻害することを示す写真。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を２４ウェルディッシュ中のゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上にプレートし、次いで、ＰＣ−３ ＳＦＣＭを含む非調整ＲＰＭＩ培地を使用して生成された１５μｇ／ｍＬのアンギオスタチンで処理した。
図４Ａ：　対照のＨＵＶＥＣは、枝分かれし、相互に連結した網状構造を形成している。
図４Ｂ：　対照的に、ＰＣ−３ ＳＦＣＭを使用して生成されたアンギオスタチンは、管網状構造を著しく分断した。
【図５】
図５Ａ−Ｂ：　ＰＣ−３ ＳＦＣＭを使用して生成されたアンギオスタチンによる、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生の阻害を示す写真。
図５Ａ：　ｂＦＧＦを含有するハイドロンペレット（矢印で示す）は、移植後７日目に、陽性の新血管応答を誘導した。
図５Ｂ：　対照的に、ｂＦＧＦと、ＰＣ−３ ＳＦＣＭを使用して生成された１０μｇ／ｍＬのアンギオスタチンを含有するハイドロンペレット（矢印で示す）に向かう血管は全く観察されなかった。
【図６】
Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅからのバッチ溶出液が、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分、ＲＰＭＩ、またはＲＰＭＩアミノ酸と混合した場合に、アンギオスタチンを生成することを示すウェスタンブロット。レーン１：ＳＦＣＭ＋プラスミノーゲン、レーン２：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分＋プラスミノーゲン、レーン３：ＴＢＳに対して透析した後のＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ バッチ溶出液＋プラスミノーゲン、レーン４：透析したバッチ溶出液＋Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分＋プラスミノーゲン、レーン５：透析したバッチ溶出液＋ＲＰＭＩ＋プラスミノーゲン、レーン６：透析したバッチ溶出液＋ＲＰＭＩビタミンミックス＋プラスミノーゲン、レーン７：透析したバッチ溶出液＋ＲＰＭＩアミノ酸ミックス＋プラスミノーゲン、レーン８：透析したバッチ溶出液＋ＲＰＭＩビタミンミックスとアミノ酸ミックス＋プラスミノーゲン、レーン９：プラスミノーゲン＋無調整ＲＰＭＩ。
【図７】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）活性およびプラスミノーゲン−アンギオスタチン変換活性（ＰＡＣＡ）が、Ｈｉ−Ｑ陰イオン交換カラムからの勾配溶出時に、共溶出することを示したグラフ。２８０ｎｍでの吸光度は、いくつかのタンパク質のピークを示した。ｕ−ＰＡ活性は、４０５ｎｍにおいて、プラスミンに対する色素産生ペプチド基質（Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ ｐ−ＮＡ）の開裂を調べることにより測定した。
【図８】
ｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンを、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ の煮沸した通り抜け画分または新しいＲＰＭＩ培地に添加することによって、アンギオスタチンを生成することを示すウェスタンブロット。レーン１：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分＋プラスミノーゲン、レーン２：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分＋プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ、レーン３： Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ の煮沸した通り抜け画分＋プラスミノーゲン、レーン４： Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ の煮沸した通り抜け画分＋プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ、レーン５：無調整ＲＰＭＩ＋プラスミノーゲン、レーン６：無調整ＲＰＭＩ＋プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ。
【図９】
Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分が、プラスミノーゲンアクチベーターの存在下で、アンギオスタチンを生成することを示すウェスタンブロット。レーン１：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分＋プラスミノーゲン、レーン２：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分＋プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ、レーン３：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ａｇａｒｏｓｅ 通り抜け画分＋プラスミノーゲン＋ｔ−ＰＡ。
【図１０】
ｕ−ＰＡおよびグルタチオンによるアンギオスタチン生成を示すウェスタンブロット。レーン１：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ、レーン２：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋５μＭグルタチオン、レーン３：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋５０μＭグルタチオン、レーン４：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋１００μＭグルタチオン、レーン５：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋煮沸した５μＭグルタチオン、レーン６：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋煮沸した５０μＭグルタチオン、レーン７：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋煮沸した１００μＭグルタチオン。
【図１１】
ｕ−ＰＡおよびＤ−ペニシラミンの組合せによるアンギオスタチン生成を示すウェスタンブロット。レーン１：プラスミノーゲン＋１００μＭ Ｄ−ペニシラミン、レーン２：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋１００μＭ Ｄ−ペニシラミン、レーン３：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ＋１．０ｍＭ Ｄ−ペニシラミン。
【図１２】
ｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡおよびストレプトキナーゼによるアンギオスタチン生成を示すウェスタンブロット。図における略号は以下の意味を有する：
ＰＬＧ＝ヒトプラスミノーゲン、
ｕＰＡ＝ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、
ｔＰＡ＝組織型プラスミノーゲンアクチベーター、
ＳＫ＝ストレプトキナーゼ、
＋＝Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含む、および
−＝Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含まない。
【図１３】
プラスミノーゲンからのプラスミン生成と、前もって生成させて精製したプラスミンからのアンギオスタチン生成を示すウェスタンブロット。レーン１：プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ−セファロース、レーン２：精製プラスミン＋１００μＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン。
【図１４】
０〜２１日目における、対照マウスと、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）またはＮ−アセチル−Ｌ−システイン＋ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）で処理したマウスにおける平均原発腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を示すグラフ。
【図１５】
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）によるアンギオスタチン生成を示すウェスタンブロット。レーン１：対照マウス＃２からの血漿（１：２０に希釈）、レーン２：対照マウス＃３からの血漿（１：２０に希釈）、レーン３：アフィニティー精製した細胞不含のアンギオスタチンを投与した１番目のマウスからの血漿（１：２０に希釈）、レーン４：アフィニティー精製した細胞不含のアンギオスタチンを投与した２番目のマウスからの血漿（１：２０に希釈）、レーン５：ＮＡＣ処理したマウス＃１からの血漿（１：２０に希釈）、レーン６：ＮＡＣ処理したマウス＃２からの血漿（１：２０に希釈）、レーン７：ＮＡＣ処理したマウス＃３からの血漿（１：２０に希釈）、およびレーン８：アフィニティー精製した細胞不含のアンギオスタチン。
【図１６】
シグナルペプチド（図示せず）切断後の完全な分子のアミノ酸配列を示す、ヒトプラスミノーゲンの略図（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ （Ｈｉｇｈ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ編（１９９５））から引用）。クリングル１〜５（Ｋ１〜Ｋ５）を示す。プラスミノーゲンからプラスミンへの活性化に必要である、残基７７と７８の間、および残基５６１と５６２の間、の切断部位を黒矢印で示す。白矢印は、該遺伝子におけるイントロンの位置を表わす。さらに、２８９位にあるＮ結合型オリゴ糖および３４６位にあるＯ結合型グリカンの位置を示す。星印（＊）は、プラスミンの触媒作用を示す３残基（Ｈｉｓ ６０３、Ａｓｐ ６４６およびＳｅｒ ７４１）のメンバーを示す。
【図１７】
図１７Ａ：　ウロキナーゼ単独（サイクル２）で処理した、および続いてカプトプリルとウロキナーゼ（サイクル５）で処理した、右半身胸膜部に中皮腫を有する患者（ケース＃２−下記表４を参照）からの血漿サンプルのウェスタンブロット。レーン１：サイクル２、１日目、前処置、レーン２：サイクル２、３日目、後処置、レーン３：サイクル５、１日目、前処置、レーン４：サイクル５、３日目、後処置。この患者に対する「サイクル」とは、治療の３日間と治療が再開されるまでの治療を行わない日数とを加えたものを意味する（下記表４参照）。
図１７Ｂ：　細胞増殖アッセイにおける、サイクル２、３日目（黒棒）およびサイクル５、３日目（点を描いた棒）でのケース＃２の患者から採取した血小板の少ない血漿サンプルのリシン結合画分の量に対する細胞数のグラフ。

Claims (58)

1. プラスミノーゲンを、プラスミノーゲンアクチベーターおよびスルフヒドリル供与体と接触させることを含んでなる、アンギオスタチンのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法。
2. プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. スルフヒドリル供与体がシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、Ｄ−ペニシラミン、および還元型グルタチオンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. アンギオスタチンを反応混合物から少なくとも部分的に精製する、請求項１に記載の方法。
5. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
7. プラスミノーゲンをプラスミノーゲンアクチベーターと接触させてプラスミンとなし、プラスミンをスルフヒドリル供与体と接触させてアンギオスタチンを生成させることを含んでなる、アンギオスタチンのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法。
8. プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
9. スルフヒドリル供与体がシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、Ｄ−ペニシラミン、および還元型グルタチオンからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
10. プラスミンをスルフヒドリル供与体と接触させる前に、プラスミンを少なくとも部分的に精製する、請求項７に記載の方法。
11. アンギオスタチンを反応混合物から少なくとも部分的に精製する、請求項７に記載の方法。
12. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
13. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
14. プラスミンをスルフヒドリル供与体と接触させることを含んでなる、アンギオスタチンのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法。
15. スルフヒドリル供与体がシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、Ｄ−ペニシラミン、および還元型グルタチオンからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
16. アンギオスタチンを反応混合物から少なくとも部分的に精製する、請求項１４に記載の方法。
17. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
18. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
19. 血管新生疾患の動物に、プラスミンのアンギオスタチンへの変換を起こさせるのに有効な量のスルフヒドリル供与体を投与することを含んでなる、血管新生疾患の治療方法。
20. スルフヒドリル供与体がシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、Ｄ−ペニシラミン、および還元型グルタチオンからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記動物に有効量のプラスミンをさらに投与する、請求項１９に記載の方法。
22. 前記動物にプラスミノーゲンをプラスミンに変換するのに有効な量のプラスミノーゲンアクチベーターを投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
23. プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記動物に有効量のプラスミノーゲンをさらに投与する、請求項２２に記載の方法。
25. スルフヒドリル供与体およびプラスミノーゲンアクチベーターを含有する、アンギオスタチン生成用の組成物。
26. スルフヒドリル供与体がシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、Ｄ−ペニシラミン、および還元型グルタチオンからなる群より選択される、請求項２５に記載の組成物。
27. プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターからなる群より選択される、請求項２５に記載の組成物。
28. プラスミノーゲンアクチベーター産生能のある細胞を培地中で培養することにより得られる調整培地であるか、またはそのような細胞の溶解物である、請求項２５に記載の組成物。
29. プラスミノーゲンアクチベーターを保有する容器であって、その上に、血管新生疾患の動物にプラスミノーゲンアクチベーターを投与することを指示するラベルが存在する、上記容器。
30. スルフヒドリル供与体をさらに保有し、前記容器の上のラベルが、血管新生疾患の動物にスルフヒドリル供与体とプラスミノーゲンアクチベーターの組合せを投与することを指示する、請求項２９に記載の容器。
31. スルフヒドリル供与体を保有する容器であって、その上に、プラスミンをアンギオスタチンに変換させるのに有効な量で血管新生疾患の動物にスルフヒドリル供与体を投与することを指示するラベルが存在する、上記容器。
32. プラスミノーゲンアクチベーター産生能のある細胞を培地中で十分な時間にわたり培養して、プラスミノーゲンをアンギオスタチンに変換することができる調整培地（ＣＣＭ）をつくり、該調整培地にプラスミノーゲンを接触させてアンギオスタチンを生成することを含んでなる、アンギオスタチンの生成方法。
33. 前記細胞が癌細胞、一次内皮細胞、平滑筋細胞および繊維芽細胞からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
34. アンギオスタチンを前記調整培地から少なくとも部分的に精製する、請求項３２に記載の方法。
35. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
36. アンギオスタチンが必要な動物に有効量のアンギオスタチンを投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
37. プラスミノーゲンアクチベーター産生能のある細胞を培養した後で溶解し、該溶解物にプラスミノーゲンを接触させてアンギオスタチンを生成することを含んでなる、アンギオスタチンの生成方法。
38. 以下の特徴：
    （ａ） プラスミノーゲンの断片であること、
    （ｂ） そのＮ末端アミノ酸がプラスミンのＮ末端アミノ酸と同じであること、
    （ｃ） そのＣ末端アミノ酸がクリングル５にあること、
    （ｄ） 血管新生を抑制すること、
    を有するタンパク質。
39. クリングル５の少なくとも５０％を含む、請求項３８に記載のタンパク質。
40. クリングル５の少なくとも７５％を含む、請求項３９に記載のタンパク質。
41. ヒトプラスミノーゲンの断片であり、かつ、以下の追加の特徴：
    （ｅ） 非還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、おおよその分子量が５０〜６０ｋＤであること、
    を有する、請求項３８に記載のタンパク質。
42. 以下の追加の特徴：
    （ｆ） 以下のＮ末端配列をもつこと、
    Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ　［配列番号１］
    （ｇ） 以下のＣ末端配列をもつこと、
    Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ　［配列番号４］ または
    Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ　［配列番号５］
    を有する、請求項４１に記載のタンパク質。
43. 請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子。
44. 前記コード配列が発現制御配列と機能的に連結されている、請求項４３に記載のＤＮＡ分子。
45. 請求項４４に記載のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞。
46. 請求項４５に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、血管新生を抑制するプラスミノーゲン断片の生産方法。
47. 天然のアンギオスタチンと選択的に結合する抗体。
48. 天然のアンギオスタチンを含むと予想される物質中の天然のアンギオスタチンを検出または定量する方法であって、
    該物質に請求項４７に記載の抗体を接触させ、
    該物質中に存在する天然のアンギオスタチンを検出または定量する、
    ことを含んでなる、上記方法。
49. 請求項４７に記載の抗体を保有する容器を含んでなる、天然のアンギオスタチンの検出または定量用キット。
50. 請求項３８に記載のタンパク質と選択的に結合する抗体。
51. 請求項３８に記載のタンパク質を、それを含む物質から精製する方法であって、
    請求項５０に記載の抗体が該タンパク質と結合するように、該物質に該抗体を接触させ、
    該抗体と結合したタンパク質を該物質の残部から分離する、
    ことを含んでなる、上記方法。
52. 血管新生疾患の動物に、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のタンパク質を有効な量で投与することを含んでなる、血管新生疾患の治療方法。
53. 前記タンパク質が天然のアンギオスタチンである、請求項５２に記載の方法。
54. 血管新生疾患の動物に、発現制御配列と機能的に連結された請求項３８に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスジーンを投与することを含んでなる、血管新生疾患の治療方法。
55. 前記トランスジーンによりコードされるタンパク質が天然のアンギオスタチンである、請求項５４に記載の方法。
56. 血管新生疾患の動物に、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を起こさせるのに有効な量のプラスミノーゲンアクチベーターを投与することを含んでなる、血管新生疾患の治療方法。
57. 前記動物に有効量のプラスミノーゲンをさらに投与する、請求項５６に記載の方法。
58. プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。

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