PL188719B1

PL188719B1 - Sposób hamowania proliferacji komórek śródbłonka in vitro, zastosowanie białka o sekwencji izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu orazkompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL188719B1
Application number: PL96327200A
Authority: PL
Inventors: Yihai Cao; Moses Judah Folkman; Michael S. O'reilly
Original assignee: Childrens Medical Center
Priority date: 1995-12-13
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2005-04-29
Also published as: NO982715L; PL327200A1; HUP9900979A2; WO1997023500A1; CA2240296A1; DK0869970T3; KR100477280B1; EP0869970A1; US20010016644A1; NO321775B1; EP0869970A4; DE69631972D1; CZ298612B6; ATE262537T1; JP2002502359A; NO982715D0; CA2240296C; DE69631972T2; HUP9900979A3; CZ182898A3

Abstract

1. Sposób hamowania proliferacji komórek sródblonka in vitro, znamienny tym, ze obejmuje podawanie do komórki sródblonka skutecznej ilosci bialka posiadajacego se- kwencje aminokwasowa izolowanego peptydu Kringle 5 czasteczki plazminogenu. 7. Zastosowanie bialka o sekwencji izolowanego peptydu Kringle 5 czasteczki pla- zminogenu do wytwarzania leku do leczenia pacjenta z choroba powiazana z angiogeneza. 17. Zastosowanie bialka o sekwencji izolowanego pepetydu Kringle 5 czasteczki plazmi- nogenu do wytwarzania leku do hamowania proliferacji komórek sródblonka u pacjenta. 27. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze obejmuje hamujaca prolifera- cje komórek sródblonka ilosc bialka o sekwencji aminokwasowej izolowanego peptydu Kringle 5 czasteczki plazminogenu i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania proliferacji komórek śródbłonka in vitro, zastosowanie białka o sekwencji izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu oraz kompozycja farmaceutyczna. Wynalazek dotyczy inhibitorów endotelialnych (śródbłonkowych) zdolnych do hamowania angiogenezy (nowotworzenia naczyń) związanej z chorobami i do modulowania procesów angiogenetycznych. Ponadto w niniejszym zgłoszeniu opisane zostały testy diagnostyczne i zestawy do pomiarów ilości inhibitora obecnego w próbkach płynów biologicznych, zestawy histochemiczne do lokalizacji inhibitora, sekwencje DNA kodujące inhibitor i sondy molekularne do monitorowania biosyntezy i rozpadu, przeciwciała swoiste wobec inhibitora, opracowania peptydowych agonistów i antagonistów receptora inhibitora oraz swoiści agoniści i antagoniści przeciwciał przeciwko receptorom inhibitora, oraz związki cytotoksyczne wiążące się z inhibitorem.

Zastosowany tutaj termin „angiogeneza” oznacza powstawanie nowych naczyń krwionośnych w tkance lub narządzie i obejmuje proliferację komórek śródbłonka. W normalnych warunkach fizjologicznych u ludzi i zwierząt zachodzi angiogeneza jedynie w specyficznych ściśle określonych sytuacjach. Na przykład, normalnie angiogeneza jest obserwowana w gojących się ranach, w trakcie rozwoju zarodkowego i embrionalnego, w tworzeniu się ciałka żółtego, w endometrium i w łożysku. Termin „endotelium” (śródbłonek) oznacza cienką warstwę płaskich komórek nabłonkowych, która pokrywa jamy surowicze, naczynia limfatyczne i naczynia krwionośne.

Wydaje się, że zarówno kontrolowana jak i niekontrolowana angiogeneza podlega takim samym zasadom. Komórki endotelium i pericyty otaczane są przez błonę podstawną tworzącą włośniczkowe naczynia krwionośne. Angiogeneza rozpoczyna się erozją błony podstawnej przez enzymy uwalniane przez komórki endotelium i leukocyty. Komórki endotelium, które pokrywają światło naczyń krwionośnych, wystają przez błonę podstawną.

Stymulatory angiogenezy indukują komórki endotelium do migracji przez poddaną erozji błonę podstawną. Migrujące komórki tworzą „zalążek” pierwotnych naczyń krwionośnych, gdzie komórki śródbłonka przechodzą proces mitozy i proliferują. Zalążki endotelialne zlewają się ze sobą tworząc pętle włośniczkowe, tworzące nowe naczynia krwionośne.

Stała niekontrolowana angiogeneza występuje w różnorodnych stanach chorobowych, przerzutach nowotworowych i w nieprawidłowym wzroście komórek endotelialnych i wspomaga patologiczne uszkodzenie obserwowane w tych warunkach. Rozmaite stany patologiczne, w których występuje niekontrolowana angiogeneza można podzielić na choroby zależne od naczyniotworzenia i związane z naczyniotworzeniem.

Hipoteza, że wzrost guzów jest zależny od naczyniotworzenia była po raz pierwszy postawiona w 1971 (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications., N. Engl. Jour. Med. 285:1182 1186, 1971). Przedstawiając w największym uproszczeniu: Wystąpienie „przyjęcia się” guza zachodzi gdy każdy wzrost populacji komórek nowotworowych jest poprzedzany przez wzrost nowych naczyń włośniczkowych zbiegających się w guzie. „Przyjęcie

188 719 się” guza jest obecnie rozumiane jako faza przednaczyniowa wzrostu guza, w której populacja komórek nowotworowych zajmująca parę milimetrów sześciennych objętości i nie przekraczająca kilku milionów komórek, może przetrwać korzystając z naczyń włośniczkowych gospodarza. Ekspansja objętości guza poza tę fazę wymaga powstania nowych komórek włośniczkowych. Na przykład, przerzuty płucne u myszy we wczesnej fazie przednaczyniowej mogą być nie wykrywalne za wyjątkiem wysokiej klasy badań mikroskopowych skrawków histologicznych.

Pośrednie przykłady dowodów, które wspierają tę hipotezę obejmują:

1) stosunek wzrostu guzów implantowanych u myszy do podskórnych przezroczystych komór jest powolny i liniowy przed nowym unaczynieniem, a szybki i bliski wykładniczemu po nowym unaczynieniu (Algire GH, i in., Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6:73-85, 1945),

2) wzrost guzów w izolowanych perfundowanych narządach gdzie nie proliferują naczynia krwionośne jest ograniczony do 1-2 mm³, ale zwiększa się gwałtownie do ponad 1000-krotnego zwiększenia objętości gdy są one przeszczepiane myszom i ulegają unaczynieniu. (Folkman J., i in., Tumor behaviour in isolated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy materiał in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of surgery 164:491-502, 1966),

3) wzrost guzów w nieunaczynionej rogówce przebiega powoli w stosunku liniowym, lecz zmienia się na wzrost w stosunku wykładniczym po unaczynieniu. (Gimbrone M.A., Jr. i in., Tumor growth and neovascularisation: An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Institute 52:41-427, 1974),

4) guzy zawieszone w cieczy wodnistej komory przedniej oka królika pozostają żywe, nieunaczynione i mają ograniczony wzrost do poniżej 1 miZ Natychmiast po implantowaniu do łożyska naczyniowego tęczówki, stają się unaczynione i gwałtownie rosną, osiągając 16000-krotną pierwotną objętość w ciągu dwóch tygodni. (Gimbrone M. A., Jr. i in., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136:261-276),

5) gdy guzy są implantowane do błony kosmówki omoczniowej płodu kurczęcia, rosną wolno w trakcie fazy beznaczyniowej trwającej ponad 72 godz., ale nie przekraczają średniej średnicy 0,93 ± 0,29 mm. Szybki wzrost guza następuje w ciągu 24 godzin po rozpoczęciu unaczynienia i w ciągu 7 dni unaczyniania osiąga średnią średnicę 8,0 ± 2,5 mm. (Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35:347-356,1977),

6) odlewy naczyniowe przerzutów do wątroby królika wykazują dużą różnorodność wielkości przerzutów, lecz wykazują stosunkowo jednakową wielkość, w której pojawia się unaczynienie. Guzy są generalnie nieunaczynione do średnicy około 1 mm, a są unaczynione powyżej tej wielkości. (Lien W., i in., The blood supply of experimental liver metastases. Π. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970),

7) u myszy transgenicznych rozwijających nowotwory wywodzące się z komórek beta wysepek trzustki, przednaczyniowe hiperplastyczne wysepki mają wielkość mniejszą niż 1 mm. W wieku 6-7 tygodni, 4-10% wysepek ulega unaczynieniu i z nich rosną unaczynione guzy o wielkości większej niż 1000-krotna objętość wysepek przednaczyniowych. (Folkman J. I in., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339:58-61, 1989),

8) swoiste przeciwciała przeciwko VEGF (naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu) zmniejszają gęstość naczyń włosowatych i powodują „znaczące i dramatyczne” zahamowanie wzrostu trzech ludzkich guzów, które zależą od VEGF będącego ich jedynym mediatorem angiogenezy (u myszy nagich). Przeciwciała nie hamują wzrostu komórek nowotworowych in vitro. (Kim K. J. i in., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362:841-844,1993),

9) przeciwciała monoklonalne anty-bFGF powodują 70% zahamowanie wzrostu mysiego guza zależnego od sekrecji bFGF jako jedynego mediatora angiogenezy. Przeciwciała nie hamują wzrostu komórek nowotworowych in vitro. (Hori A. i in. Suppression of solid tumor

188 719 growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblaast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991),

10) wewnątrzotrzewnowe wstrzyknięcie bFGF zwiększa wzrost guza pierwotnego i jego przerzutów poprzez stymulowanie wzrostu komórek endotelialnych naczyń włosowatych guza. Same komórki nowotworowe nie posiadają receptorów dla bFGF i bFGF nie jest mitogenem komórek nowotworowych in vitro. (Gross J.L. i in., Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc. Natl. Acad. Sci. USAAmer. Assoc. Canc. Res. 31:79, 1990),

11) swoisty inhibitor angiogenezy (AGM-1470) hamuje wzrost guza i przerzuty in vivo, lecz jest znacznie mniej aktywny w hamowaniu proliferacji komórek nowotworowych in vitro. Hamuje proliferację naczyniowych komórek endotelialnych w stężeniu pół-maksymalnym o 4 rzędy wielkości niższym niż potrzebne do zahamowania proliferacji komórek nowotworowych. (Ingber D. I in., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48:555-557, 1990) Są również nie bezpośrednie kliniczne dowody, że wzrost guza jest zależny od angiogenezy,

12) ludzkie glejaki siatkówki, które mogą dawać przerzuty do ciała szklistego, rozwijają się w beznaczyniowe sferoidy, które są ograniczone do mniej niż 1 mm³, pomimo to pozostają żywotne i włączają ³H-tymidynę (gdy są usuwane z wyłuszczonego oka i analizowane in vitro),

13) nowotwór jajnika daje przerzuty do otrzewnej jako małe, beznaczyniowe, białe nasionka (1-3 mm3). Te implanty rzadko rosną większe dopóki jeden lub więcej z nich nie stanie się unaczynionymi,

14) intensywność unaczyniania w raku piersi (Weider N. i in., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991, i Weider N. i in., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in earlystage breast carcinoma, J Natl. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992) i raku prostaty (Weider N., Carrol P.R., Flax J., Blumenfeld W., Folkman J., Tumon angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2):401-409,1993) koreluje z wysokim ryzykiem przyszłych przerzutów,

15) przerzuty ludzkiego czerniaka skóry są rzadkie przed unaczynieniem. Początek unaczynienia prowadzi do zwiększenia grubości zmiany i zwiększonego ryzyka przerzutów. (Srivastva A., i in.; The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0,76-4,0 mm grubości) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133:419-423, 1988),

16) w raku pęcherza moczowego poziom w moczu białka bFGF odpowiedzialnego za nowotworzenie naczyń jest bardziej czułym wskaźnikiem stanu i zaawansowania choroby niż cytologia. (Nguyen M. i in., Elevated levels of an angiogenic protein, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst. 85:241-242, 1993).

Tak więc jest jasne, że angiogeneza gra główną rolę w przerzutach nowotworów. Jeśli aktywność nowotworzenia naczyń może być zahamowana lub usunięta lub w inny sposób kontrolowana i modulowana, wtedy guz mimo, że jest obecny nie rośnie. W stanie chorobowym, zapobiegnięcie angiogenezie może odwrócić zniszczenia spowodowane inwazją nowego systemu naczyń włosowatych. Sposoby leczenia skierowane na kontrolę procesów angiogenezy mogą prowadzić do ustąpienia lub zahamowania tych chorób.

Konieczna jest więc kompozycja i metoda hamująca, która może hamować proliferację komórek śródbłonka taką jak niepożądany wzrost naczyń krwionośnych, szczególnie wrastanie do guza. Potrzebna jest również metoda wykrywania, mierzenia i lokalizacji tej kompozycji. Kompozycja powinna być zdolna do odwrócenia aktywności endogennych czynników wzrostu w guzach przedprzerzutowych i zapobiegać powstawaniu naczyń włosowatych w guzach i poprzez to hamować wzrost guzów. Kompozycja, fragmenty kompozycji i przeciwciała swoiste w stosunku do kompozycji powinny być również zdolne do modulowania powstawania naczyń włosowatych w innych procesach angiogenezy, takich jak gojenie ran i rozmnażanie. Kompozycja i metody hamowania tworzenia naczyń korzystnie powinny być nie toksyczne i powinny wywoływać niewiele efektów ubocznych. Potrzebna jest również metoda wykrywania, mierzenia i lokalizacji miejsc wiązania dla kompozycji jak również miejsc biosyntezy kompozycji. Kompozycja i fragmenty kompozycji powinny być zdolne do koniugacji z innymi cząsteczkami w celach zarówno znakowania radioaktywne jak i nie-radioaktywnego.

188 719

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów zastosowania izolowanego regionu Kringle 5 plazminogenu do hamowania aktywności proliferacyjnej śródbłonka. Izolowany fragment peptydowy Kringle 5 posiadający aktywność hamującą obejmuje sekwencję w przybliżeniu 80 (osiemdziesięciu) aminokwasów:

CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRN PDGDVGGPWC YTTNPRKLYDYCDVPQ SEK NR ID: 1 gdzie

C=Cys Y=TyrD=Asp

M=Met R=ArgW=Trp

F=Phe T=TbrH=His

G=Gly V=ValS=Ser

N=Asn P-ProINle

K=Lys Q=GlnA=Ala

E=Glu L=Leu

Peptyd proliferacji komórek śródbłonka odpowiada fragmentowi peptydowemu powstałemu z ludzkiego plazminogenu i rozpoczynającemu się w przybliżeniu aminokwasem 462 i rozciągającemu się w przybliżeniu na 80 aminokwasów.

Opis patentowy U.S. 5149533 dotyczy analogu tkankowego aktywatora plazminogenu (t-PA) otrzymanego z natywnego t-PA. Natywny t-PA zawiera dwa potrójne połączone mostkami disiarczkowymi regiony, znanymi pod nazwą domen Kringle, często określanymi jako „KI” i „K2”. Domeny te są homologiczne do podobnych domen w protrombinie, plazminogenie, urokinazie oraz innych białkach, które uważa się za uczestniczące w procesie wiązania t-PA do fibryny. Jednakże użyteczność analogu t-PA nie została ujawniona ani też w żaden sposób zasugerowana. Ponadto, analog t-PA jest „hybrydą” obejmującą dwie różne domeny Kringle i jest znacząco większy niż peptyd Kringle 5 wykorzystywany w niżej opisanych rozwiązaniach według wynalazku.

Opis patentowy EP 589 181 ujawnia syntetyczne peptydy otrzymane z sekwencji K - A cząsteczki witronektyny. Jednakże witronektyna i Kringle 5 są całkowicie odmiennymi cząsteczkami. Opis patentowy EP 589 181 nie ujawnia ani nie sugeruje zastosowania peptydów Kringle 5 w kompozycjach farmaceutycznych.

Opis patentowy WO 95/29242 ujawnia związek angiostatyny oraz jego zastosowanie w hamowaniu komórek śródbłonka.

Angiostatyna obejmuje regiony Kringle 1-3 oraz część regionu 4. Jednakże opis patentowy WO 95/29242 nie ujawnia ani nie sugeruje zastosowania peptydów Kringle 5 do hamowania wzrostu komórek śródbłonka oraz angiogenezy.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób hamowania proliferacji komórek śródbłonka in vitro, obejmujący podawanie do komórki śródbłonka skutecznej ilości białka posiadającego sekwencję aminokwasową peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu. Korzystnie, białko podawane do komórki w sposobie według wynalazku obejmuje około 80 aminokwasów. Korzystnie ciężar cząsteczkowy białka podawanego do komórki w sposobie według wynalazku wynosi 14000 (14 kDa). Również korzystnie w sposobie według wynalazku plazminogen jest plazminogenem ludzkim. Korzystnie białko podawane do komórki w sposobie według wynalazku ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 1. Ponadto, korzystnie białko podawane do komórki w sposobie według wynalazku ma sekwencję aminokwasową. co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie białka o sekwencji izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu do wytwarzania leku do leczenia pacjenta z chorobą powiązaną z angiogenezą. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku białko obejmuje 80 aminokwasów. Również korzystnie ciężar cząsteczkowy białka w zastosowaniu według wynalazku wynosi 14000 (14 kD). Ponadto, korzystnie w zastosowaniu według wynalazku plazminogen jest plazminogenem ludzkim. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną do SEK NR ID: 1. Również korzystnie w zastosowaniu według wynalazku białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6. Ponadto, białko w zastosowaniu według wynalazku jest zdolne do hamowania proliferacji komórek śródbłonka. Korzystnie, pacjentem

188 719 z chorobą powiązaną z angiogenezą jest człowiek. Korzystnie, chorobą powiązaną z angiogenezą jest rak, a korzystniej guz lity.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka o sekwencji izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu do wytwarzania leku do hamowania proliferacji komórek śródbłonka u pacjenta. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku białko obejmuje 80 aminokwasów. Korzystnie ciężar cząsteczkowy białka w zastosowaniu według wynalazku wynosi 14000 (14 kD). Korzystnie, plazminogen jest plazminogenem ludzkim. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6. Korzystnie białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 1. Korzystnie, pacjentem jest człowiek. Korzystniej, pacjent ma chorobę powiązaną z angiogenezą. Najkorzystniej, chorobą powiązaną z angiogenezą jest rak, a w szczególności guz lity.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna obejmująca hamującą proliferację komórek śródbłonka ilość białka o sekwencji aminokwasowej izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, białko w kompozycji według wynalazku obejmuje 80 aminokwasów. Korzystnie, ciężar cząsteczkowy białka w kompozycji według wynalazku wynosi 14000 (14 kD). Ponadto korzystnie plazminogen jest ludzkim plazminogenem. Korzystnie także białko w kompozycji według wynalazku ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6. Również korzystnie kompozycja według wynalazku obejmuje białko o sekwencji aminokwasowej co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 1.

Opisane powyżej sekwencje SEK NR ID: 1 i SEK NR ID: 6 są sekwencjami aminokwasowymi pochodzącymi z izolatu ludzkiej krwi i zawierają odpowiednio 79 i 80 aminokwasów.

Dzięki zastosowaniu inhibitora, w tym również rozwiązaniom według wynalazku opisanym powyżej, dostępne stały się metody diagnostyczne do wykrywania obecności lub braku peptydu hamującego w płynach ustrojowych i terapeutyczne mające na celu podawanie w razie potrzeby pacjentowi peptydu lub przeciwciał swoiście wiążących się z peptydem w terapeutycznie skutecznej ilości do regulacji proliferacji komórek śródbłonka. Dodatkowo peptyd hamujący może być zastosowany w połączeniu z kulturami komórek śródbłonka proliferującymi in vitro do badania związków osłabiających efekt hamujący peptydu, tj. do poszukiwania czynników wzrostu lub innych związków zdolnych do przezwyciężania lub odwracania zahamowania proliferacji komórek śródbłonka.

Wyżej wymieniony sposób, zastosowania i kompozycja według wynalazku umożliwiają leczenie chorób i procesów, w których pośredniczy proliferacja komórek śródbłonka, a w szczególności angiogeneza. Angiogeneza pośredniczy między innymi w następujących chorobach i procesach: naczyniakach, guzach litych, białaczkach, przerzutach, pajączkach naczyniowych, łuszczycy, twardzinie, ziarniniakach ropnych, nowotworzeniu naczyń miokardium, unaczynieniu blaszek miażdżycowych, obocznym krążeniu wieńcowym, obocznym krążeniu mózgowym, zaburzeniach rozwoju układu tętniczo-żylnego, angiogenezie wywołanej niedokrwieniem kończyn, chorobach rogówki, rubeozie, jaskrze wywołanej przez nowotworzenie naczyń, retynopatii cukrzycowej, zwłóknieniach zasoczewkowych, zapaleniach stawów, cukrzycowym nowotworzeniu naczyń, degeneracji plamkowej, gojeniu ran, wrzodach żołądka, chorobach związanych z infekcją Helicobacter, zaburzeniach owulacji, miesiączkowaniu, powstawaniu łożyska i gorączce kociego pazura.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie lub zahamowanie wzrostu nowotworu. Umożliwiają one również uzyskanie kompozycji, która będzie modulowała lub naśladowała produkcję lub aktywność enzymów, które wytwarzają inhibitor in vivo lub in vitro.

Inhibitor lub przeciwciała przeciwko inhibitorowi mogą być uzyskane przez bezpośrednie wstrzyknięcie DNA inhibitora ludziom i zwierzętom potrzebującym takiej terapii. Istotne są również metody wykrywające i określające ilość obecnych swoistych przeciwciał przeciwko inhibitorowi w płynach ustrojowych.

Inhibitory endotelialne mogą być stosowane w metodach wykrywania i prognozowania rozwoju nowotworu, oraz do wizualizacji i określania in vivo i in vitro ilości miejsc wiązania dla inhibitora.

188 719

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają terapię przeciwnowotworową, która posiada minimalne efekty uboczne.

Inhibitor proliferacji komórek śródbłonka lub fragment peptydu inhibitora może być związany z czynnikiem cytotoksycznym. Może być on również stosowany do ukierunkowanego dostarczania kompozycji uwalniającej inhibitor do swoistych miejsc.

Proliferacja komórek śródbłonka, między innymi procesy nowotworzenia naczyń, może być również modulowana metodami terapii genowej.

Przedmioty wynalazku, ich cechy i wynikające z nich korzyści oraz istotne zagadnienia związane z inhibitorem wykorzystywanym w rozwiązaniach według wynalazku zostały przedstawione poniżej w szczegółowym opisie ujawnionych wykonań i załączonych zastrzeżeń. Krótki opis figur

Figura 1 pokazuje zahamowanie proliferacji komórek śródbłonka jako procentowe zmiany ilości komórek jako funkcję stężenia izolowanego fragmentu peptydu Kringle 5 ludzkiego plazminogenu dodanego do komórek.

Figura 2 pokazuje analizę elektroforetyczną preparatu fragmentu peptydu Kringle 5 izolowanego z ludzkiego plazminogenu. Linia 1 to wyizolowany Kringle 5; linia 2 to markery masy cząsteczkowej.

Figura 3 pokazuje zasięg aminokwasowy regionów Kringle 1, 2, 3, 4 i 5 ludzkiego plazminogenu (SEK NR ID:2-6).

Figura 4 pokazuje aktywność przeciwko proliferacji komórek śródbłonka ludzkiego plazminogenowego fragmentu Kringle 5 z lub bez kwasu aminowęglowego (AMCHA) wskazuje, że miejsca wiążące lizynę nie są odpowiedzialne za aktywność przeciwko proliferacji komórek śródbłonka fragmentu Kringle 5.

Figura 5 pokazuje efekt hamujący rekombinantu Kringle 5 na proliferację bydlęcych komórek śródbłonka.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem dostarczone są sposób i kompozycja skutecznie hamujące proliferację komórek śródbłonka, modulujące angiogenezę i hamujące niepożądaną angiogenezę, szczególnie angiogenezę związaną ze wzrostem guza. Rozwiązania według wynalazku wykorzystują białkowy inhibitor proliferacji komórek śródbłonka charakteryzujący się w przybliżeniu 80 aminokwasową sekwencją możliwą do otrzymania z ludzkiego plazminogenu jako Kringle 5. Sekwencja aminokwasowa inhibitora może w niewielkim stopniu różnić się między gatunkami. Jest zrozumiałe, że liczba aminokwasów w aktywnej cząsteczce inhibitora może być różna i, że wszystkie o zbliżonej homologii sekwencje aminokwasowe posiadające aktywność hamującą śródbłonek mogą znaleźć zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają wykrywanie i leczenie chorób i procesów, w których pośredniczy niepożądana i niekontrolowana proliferacja komórek śródbłonka, taka jak angiogeneza, przez podawanie ludziom i zwierzętom, u których występuje niepożądana proliferacja komórek śródbłonka kompozycji zawierającej przynajmniej Kringle 5 ludzkiego plazminogenu zdolnego do zahamowania proliferacji komórek śródbłonka w testach in vitro. Korzystnie izolowane białko jest czyste w przynajmniej 80%, bardziej korzystnie w przynajmniej 90%, najkorzystniej w przynajmniej 95% czyste. Rozwiązania według wynalazku są szczególnie użyteczne do leczenia, lub do zahamowania wzrostu nowotworów. Podawanie inhibitora ludziom lub zwierzętom z przerzutami nowotworowymi w fazie przednaczyniowej pomaga zapobiegać wzrostowi i ekspansji tych guzów.

Sekwencje DNA kodujące inhibitor proliferacji komórek śródbłonka, wektory ekspresyjne zawierające sekwencje DNA kodujące inhibitor proliferacji komórek śródbłonka i komórki zawierające jeden lub więcej wektorów zawierających sekwencje DNA kodujące inhibitor są również niniejszym opisane. Znajdują one zastosowanie między innymi w metodach terapii genowej, gdzie sekwencje DNA kodujące inhibitor proliferacji komórek śródbłonka są podawane pacjentowi w celu modyfikacji poziomów inhibitora in vivo.

Rozwiązania według wynalazku są również powiązane z metodami diagnostycznymi i zestawami do wykrywania i mierzenia poziomów inhibitora proliferacji komórek śródbłonka w płynach ustrojowych i tkankach. Metoda diagnostyczna i zestaw mogą występować w każdej konfiguracji znanej specjalistom w danej dziedzinie. Szczególnie istotne są przeciwciała

188 719 swoiste dla inhibitora proliferacji komórek śródbłonka i ich fragmenty, i przeciwciała hamujące wiązanie przeciwciał inhibitora proliferacji komórek śródbłonka. Te przeciwciała mogą być przeciwciałami poliklonalnymi lub monoklonalnymi. Przeciwciała swoiste dla inhibitora proliferacji komórek śródbłonka mogą być zastosowane w zestawach diagnostycznych do wykrywania obecności i ilości inhibitora, co jest diagnostyczne lub prognostyczne dla obecności lub nawrotu nowotworu lub innych chorób, w których pośredniczy angiogeneza. Przeciwciała swoiste dla inhibitora proliferacji komórek śródbłonka mogą być również podawane ludziom lub zwierzętom w celach biernej immunizacji ludzi lub zwierząt przeciwko inhibitorowi celem zmniejszenia zahamowania angiogenezy.

Tak więc istotne są również zagadnienia związane z metodami diagnostycznymi i zestawami do wykrywania obecności i ilości przeciwciał wiążących inhibitor proliferacji komórek śródbłonka w płynach ustrojowych. Metoda diagnostyczna i zestaw mogą występować w każdej konfiguracji znanej specjalistom w danej dziedzinie.

Przeciwciała mogą być również swoiste wobec receptorów inhibitora, dzięki czemu są one zdolne do wiązania receptora inhibitora i przenoszenia odpowiedniego sygnału do komórki i odgrywają role agonisty lub antagonisty.

Fragmenty peptydu inhibitorowego i analogi, mogą być znakowane radioaktywnie lub innymi cząsteczkami lub białkami w celu wykrywania i wizualizacji miejsc wiązania inhibitora technikami obejmującymi lecz nie ograniczonymi do pozytronowej tomografii emisyjnej, autoradiografii, cytometrii przepływowej, testów wiązania znakowanych receptorów i immunohistochemii.

Te peptydy inhibitorowe i analogi również odgrywają rolę jako agoniści i antagoniści receptora inhibitora, przez co zwiększają lub blokują aktywność biologiczną inhibitora proliferacji komórek śródbłonka. Takie peptydy są wykorzystywane do izolacji cząsteczek receptora zdolnych do swoistego wiązania się z inhibitorem.

Inhibitor proliferacji komórek śródbłonka, fragmenty inhibitora, surowica odpornościowa swoista wobec inhibitora, agoniści i antagoniści receptora inhibitora mogą być związani ze związkami cytotoksycznymi do podawania w celach leczniczych i naukowych. Inhibitor, fragmenty inhibitora, surowica odpornościowa przeciwko nim, agoniści i antagoniści receptora inhibitora mogą być połączeni z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, i ewentualnie ze związkiem o przedłużonym uwalnianiu lub kompozycjami takimi jak polimery i matryce ulegające biodegradacji w celu wytworzenia kompozycji terapeutycznych.

Ze względu na zastosowania rozwiązań według wynalazku istotne jest również omówienie sond molekularne dla kwasu rybonukleinowego i dezoksyrybonukleinowego, który jest włączony w transkrypcję i translację inhibitora proliferacji komórek śródbłonka, ponieważ mogą być one wykorzystywane do wykrywania i mierzenia biosyntezy inhibitora w tkankach i komórkach.

Rozwiązania według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w metodach wykrywania i leczenia chorób i procesów, w których pośredniczy proliferacja komórek śródbłonka, taka jak angiogeneza. Izolowany fragment peptydowy Kringle 5 posiadający aktywność hamującą obejmuje sekwencję w przybliżeniu 80 (osiemdziesięciu) aminokwasów przedstawioną w SEK NR ID: 1.

Inhibitor może być izolowany z plazminogenów, takich jak ludzki plazminogen, lub syntetyzowany metodami chemicznymi lub biologicznymi (np. hodowle komórkowe, ekspresja genów rekombinowanych, synteza peptydowa i kataliza enzymatyczna in vitro plazminogenu lub plazminy w celu dostarczenia aktywnego inhibitora). Techniki rekombinacji obejmują amplifikacje genu ze źródeł DNA z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR) i ampiifikacja ze źródeł RNA z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy/PCR.

Niniejszym opisano również kompozycję obejmującą wektor zawierający sekwencję DNA kodującą inhibitor proliferacji komórek śródbłonka, który jest zdolny do ekspresji inhibitora, gdy występuje w komórkach, kompozycję obejmującą komórki zawierające taki wektor, oraz metody implantowania ludziom i innym zwierzętom komórki zawierającej wyżej opisany wektor.

Termin „zasadniczo podobny” lub „zasadniczo homologiczny” gdy jest używany w niniejszym opisie w odniesieniu do aminokwasów inhibitora i sekwencji kwasów nukleinowych

188 719 oznacza sekwencję aminokwasową posiadającą aktywność inhibitora proliferacji komórek śródbłonka i posiadającą zbliżoną masę cząsteczkową, która ma również wysoki stopień homologii do sekwencji białka posiadającego przedstawioną powyżej swoistą N-końcową sekwencję aminokwasową, lub sekwencję kwasów nukleinowych, która koduje inhibitor proliferacji komórek śródbłonka posiadający zbliżoną masę cząsteczkową i wysoki stopień biologii do swoistej N-końcowej sekwencji aminokwasowej przedstawionej powyżej.

Wysoki stopień homologii oznacza przynajmniej około 80% homologię aminokwasową, korzystnie przynajmniej 90% homologię aminokwasową i najkorzystniej przynajmniej 95% homologię aminokwasową. Termin „aktywność hamująca śródbłonek” w sposób tu użyty oznacza zazwyczaj zdolność cząsteczki do hamowania angiogenezy i na przykład do hamowania w hodowli wzrostu komórek środ^oma bydlęcych naczyń włosowatych w obecności czynnika wzrostu fibroblastów.

Poniżej opisano również metody wykrywania inhibitora w płynach ustrojowych i tkankach w celu diagnostycznym i prognostycznym w chorobach takich jak nowotwory oraz metody wykrywania miejsc wiążących inhibitor i receptory w komórkach i w tkankach. Opisane zostały również metody leczenia lub zapobiegania chorobom i procesom z nowotworzeniem naczyń, takich jak, między innymi, zapalenie stawów i nowotwoiy, przez stymulację wytwarzania inhibitora i/lub podawanie izolowanego inhibitora lub oczyszczonego w pożądany sposób inhibitora, lub agonistów lub antagonistów inhibitora i/lub swoistej surowicy odpornościowej przeciwko inhibitorowi lub surowicy odpornościowej przeciwko swoistej surowicy odpornościowej pacjenta. Dodatkowe sposoby leczenia obejmują podawanie inhibitora, biologicznie aktywnych fragmentów inhibitora, analogów inhibitora, swoistej surowicy odpornościowej lub agonistów i antagonistów receptora inhibitora połączonych z czynnikiem cytotoksycznym.

Bierne leczenie przeciwciałami przy użyciu przeciwciał, które swoiście wiążą inhibitor można wykorzystać do modulowania procesów zależnych od angiogenezy takich jak rozmnażanie, rozwój, gojenie ran i naprawa tkankowa. Dodatkowo, surowica odpornościowa skierowana przeciwko regionom Fab swoistych przeciwciał przeciwko inhibitorowi może być podawana w celu blokowania zdolności endogennej swoistej surowicy przeciwko inhibitorowi do wiązania inhibitora.

Poniżej opisano również terapię genową, mającą na celu regulowanie u pacjenta genu kodującego. Różne sposoby przekazania lub dostarczenia DNA do komórek w celu ekspresji białka produktu genetycznego, inaczej określane jako terapia genowa ujawniono w Gene Transfer into Mammalian Soamtic Cells in vivo, N. Yang Crit. Rev. Biotechn. 12 (4): 335-356 (1992), który załączono tu przez odniesienie. Terapia genowa obejmuje włączanie sekwencji DNA do komórek somatycznych lub linii komórek rozrodczych w zastosowaniu w terapii zarówno ex vivo jak i in vivo. Terapia genowa służy w wymiany genów, zwiększenia normalnych i nieprawidłowych funkcji genetycznych i do zwalczania chorób infekcyjnych i innych patologii.

Strategie leczenia tych problemów medycznych terapią genową obejmują takie rodzaje postępowanie terapeutycznego jak, identyfikacja defektywnego genu i następnie dodanie funkcjonalnego genu lub zamiana funkcji defektywnego genu lub nieznaczne zwiększenie funkcji genu, lub postępowanie profilaktyczne, takie jak dodawanie genu w celu wytwarzania białka, które będzie leczyć stany chorobowe lub uczyni tkanki lub narządy bardziej wrażliwymi na podawane leczenia. Przykładem takiej strategii profilaktycznej będzie umieszczenie w organizmie pacjenta sekwencji kwasu nukleinowego kodującej inhibitor i przez to zapobieżenie wystąpienia angiogenezy; lub włączenie genu, który uwrażliwi komórki nowotworowe na promieniowanie i napromieniowanie nowotworu mogące zwiększyć niszczenie komórek nowotworowych.

Transfekcja sekwencji starterowych, innych niż normalnie swoiście związanych z inhibitorem, lub innych sekwencji mogących zwiększać produkcję białka inhibitora również stanowi metodę terapii genowej. Przykład takiej technologii można znaleźć w Transkaryftip Therapies, Inc., of Cambridge, Massachusetts, stosując homologiczną rekombinację do przeprowadzenia „genetycznej wymiany” włączającej gen erytropoetyny w komórki. Patrz Genetic Egineering News, 15 kwiecień 1994. Takie „wymiany genetyczne” mogą być stosowane w aktywacji inhibitora (lub receptora dla inhibitora) w komórkach normalnie nie wyrażających inhibitora (lub receptora dla inhibitora).

188 719

Metody przenoszenia genów w terapii genowej dzielą się na trzy rozległe kategorie: fizyczne (np. elektroporacja, bezpośrednie przenoszenie genu i bombardowanie cząstkami); chemiczne (nośniki oparte na lipidach i inne nie-wirusowe wektory) i biologiczne (wektory pochodzenia wirusowego i wychwyt receptorowy). Na przykład mogą być stosowane wektory nie-wirusowe, które zawierają liposomy pokryte DNA. Takie kompleksy liposom/DNA mogą być bezpośrednio podane dożylnie pacjentowi. Uważa się, że kompleksy liposom/DNA są zatężane w wątrobie skąd dostarczają DNA makrofagom i komórkom Kupffera. Komórki te wykazują długą żywotność i dlatego zapewniają długoterminową ekspresję dostarczonego DNA. Dodatkowo wektory lub nagi DNA genu mogą być bezpośrednio wstrzyknięte do pożądanego narządu, tkanki lub guza w celu dostarczenia leczniczego DNA.

Metodologia terapii genowej jest również opisana przez miejsce podawania. Podstawowe drogi dostarczania genów obejmują przenoszenie genu ex vivo, przenoszenie genu in vivo, przenoszenie genu in vitro. W przenoszeniu genu ex vivo komórki są pobierane od pacjentów i hodowane w hodowlach komórkowych. DNA jest transfekowane w komórkach, transfekowane komórki są hodowane w celu zwiększenia ich liczby i następnie ponownie implantowane pacjentowi. W transferze genu in vitro transformowane komórki są komórkami hodowanymi w hodowli, takiej jak tkankowe hodowle komórkowe, i nie są konkretnymi komórkami od konkretnego pacjenta. Te „komórki laboratoryjne” są transfekowane, transfekowane komórki są wybierane i hodowane w celu zwiększenia objętości, albo w celu wszczepienia ich pacjentowi, albo do innych zastosowań.

Transfer genu in vivo obejmuje włączenie DNA do komórek pacjenta, gdy te komórki są żywymi komórkami pacjenta. Metody obejmują zastosowanie transferu genu, w którym pośredniczą wirusy, wykorzystując niezakaźne wirusy do przekazania genu do pacjenta lub wstrzyknięcie nagiego DNA do miejsca wewnątrz pacjenta i to DNA jest wychwycone przez pewien procent komórek, w których białko produkowane przez gen jest wyrażane. Dodatkowo, inne metody tu opisane, takie jak zastosowanie „broni genowej” może być użyte do insercj i in vitro DNA inhibitora proliferacji komórek śródbłonka lub sekwencji regulatorowych inhibitora.

Metody chemiczne terapii genowej mogą obejmować związki oparte na lipidach, nie koniecznie liposomy, do przenoszenia DNa przez błonę komórkową. Lipofektyny i cytofektyny, dodatnie jony oparte na lipidach, które wiążą ujemnie naładowany DNA, tworzą kompleks, który może przekraczać błonę komórkową i wprowadzać DNA do wnętrza komórki. Inna metoda chemiczna stosująca endocytozę opartą na receptorze obejmuje swoiste ligandy do receptorów błony komórkowej otwierające i transportujące je przez błonę komórkową. Ten ligand wiąże się z DNA i cały kompleks jest transportowany do komórki. Kompleks ligandu genowego jest wstrzykiwany do obiegu krwi i wtedy komórki docelowe posiadające receptory mogą swoiście wiązać się z ligandem i transportować kompleks ligand-DNA do komórki.

Metodologia wielu terapii genowych wykorzystuje wektory wirusowe do wprowadzenia genów do komórek. Na przykład, zmienione wektory retrowirusowe używano w metodach ex vivo do wprowadzenia genów do obwodu i limfocytów naciekających guza, hepatocytów, komórek nabłonkowych, miocytów i innych komórek somatycznych. Te zmienione komórki są następnie wprowadzane do pacjenta w celu otrzymania produktu genowego z wprowadzonego DNA.

Wektory wirusowe stosowano do wprowadzania genów do komórek stosując protokoły in vivo. W celu skierowania tkankowo swoistą ekspresję obcych genów możliwe jest zastosowanie elementów regulatorowych cis lub starterów, które są tkankowo swoiste. Alternatywnie, można to osiągnąć używając dostarczenie DNA in situ lub wektorów wirusowych do swoistych anatomicznie miejsc in vivo. Na przykład, transfer genu do naczyń krwionośnych in vivo jest osiągany przez implantowanie in vitro transdukowanych komórek śródbłonka w wybrane miejsca ściany naczyń. Wirus infekuje otaczające komórki, które również wyrażają produkt genu. Wektor wirusowy może być dostarczony bezpośrednio w miejsce in vivo, na przykład przy użyciu cewnika, który zapewnia zainfekowanie jedynie konkretnych miejsc i długoterminową ekspresję genu swoistą w stosunku do miejsca. Przez wstrzyknięcie zmienionego wirusa do naczyń krwionośnych prowadzących do narządów wykazano in vivo w tkankach ssaków i tkance wątrobowej transfer genu z zastosowaniem wektorów retrowirusowych.

188 719

Wektory wirusowe stosowane w protokołach terapii genowej obejmują, lecz nie są ograniczone do, retrowirusów, innych wirusów RNA takich jak poliowirusy lub wirus Sindbis, adenowirusów, wirusów adeno-podobnych, wirusów herpes, SV 40, krowianki i innych wirusów DNA. Mysie wektory retrowirusowe z defektem replikacji są szeroko stosowanymi wektorami transferującymi geny. Retrowirusy mysiej białaczki są złożone z pojedynczej nici RNA będącej w kompleksie z jądrowym białkiem rdzeniowym i enzymami(pol) polimerazy, zamkniętym przez białko rdzenia (gag) i otoczone otoczką glikoproteinową (env), która determinuje zakres gospodarza. Struktura genomowa retrowirusów obejmuje geny gag, poi i evn zawierające powtórzenia w kierunku 5' i 3' (LTR). Ukady wektorów retrowirusowych wykorzystują fakt, że minimalny wektor zawierający LTR 3' i 5' i upakowany sygnał jest zdolny do upakowania, zakażenia i integracji z komórkami docelowymi zapewniając, że strukturalne białka wirusowe są dostarczane in trans w upakowanie linii komórkowej.

Podstawowe korzyści wektorów retrowirusowych do transferu genu obejmują skuteczne zakażenie i ekspresję genu w większości typów komórek, integrację pojedynczej kopii wektora do chromosomalnego DNA komórki docelowej i łatwą manipulację genomem retrowirusowym.

Adenowirus jest zbudowany z liniowego, dwu niciowego DNA będącego w kompleksie z białkami rdzeniowymi i otoczony przez białka kapsydowe. Postępy wirusologii molekularnej prowadzą do możliwości wykorzystywania biologii tych organizmów do stworzenia wektorów zdolnych do przekazywania nowych sekwencji genetycznych do komórek docelowych in vivo. Wektory oparte na adenowirusach wyrażają białka produkowane przez gen na wysokim poziomie. Wektory adenowirusowe są wysoce zakaźne, nawet przy niskich mianach wirusa. Dodatkowo, wirus jest w pełni zakaźny jako bezkomórkowy wirion tak, że wstrzyknięcie produktów linii komórkowych nie jest konieczne. Inną potencjalną korzyścią wektorów adenowirusowych jest zdolność do osiągania długotrwałej ekspresji genów heterologiczych in vivo.

Mechaniczne sposoby dostarczania DNA obejmują pęcherzyki lipidowe takie jak liposomy lub inne pęcherzyki powstałe ze zlania błon, lipidowe cząsteczki DNA włączające kationowe lipidy takie jak lipofektyna, transfer DNA, w którym pośredniczy polilizyna, bezpośrednie wstrzyknięcie DNA, takie jak mikroinjekcje DNA do komórek rozrodczych lub somatycznych, pneumatyczne dostarczenie cząsteczek pokrytych DNA, takie jak cząsteczki złota używane w „broni genowej” i nie organiczne chemiczne działania jak transfekcja fosforanem wapnia. Inne metody, terapii genowej za pośrednictwem ligandów obejmują tworzenie kompleksów DNA ze swoistymi Ugandami w celu zbudowania koniugatów ligand-DNA do kierowania DNA do swoistych komórek i tkanek.

Zauważono, że wstrzyknięcie plazmidu DNA do komórek mięśniowych wywołuje powstanie wysokiego procentu komórek, które są transfekowane i utrzymują ekspresję znaczników genowych. DNA plazmidu może lub nie musi integrować się z genomem komórki. Brak integracji transfekowanego DNA prowadzi do transfekcji i ekspresji białek produkowanych przez gen w ostatecznie zróżnicowanych, nie proliferujących od długiego czasu tkankach bez obawy wprowadzenia mutagennych insercji, delecji lub alteracji w genom komórkowy lub mitochondrialny. Długotrwały, lecz nie koniecznie stały transfer genów leczniczych do swoistych komórek może zapewniać leczenie chorób genetycznych lub ich zastosowanie terapeutyczne. DNA można okresowo ponownie wstrzykiwać w celu utrzymania poziomu produktu genu bez występujących mutacji pojawiających się w genomach komórek biorców Nie integrowane egzogenne DNA pozwalają na obecność kilku różnych konstruktów egzogennego DNA wewnątrz jednej komórki z wszystkimi konstruktami wyrażającymi różne produkty genowe.

Metody transferu genowego, w którym pośredniczą cząsteczki zastosowano po raz pierwszy w transformowaniu tkanek roślin. Przy użyciu urządzenia do bombardowania cząsteczkami lub „bronią genową” generowano taką podstawową siłę przyspieszającą cząsteczki o wysokiej gęstości pokryte DNA (takie jak złoto lub wolfram) do dużej prędkości, która pozwalała na penetrację narządów docelowych, tkanek lub komórek. Bombardowanie cząsteczkami może być stosowane w układach in vitro, lub stosując techniki ex vivo lub in vivo do wprowadzenia DNA do komórek, tkanek lub narządów.

Elektroporacja w transferze genowym wykorzystuje prąd elektryczny do uwrażliwiania tkanek lub komórek na transfer genu, w którym pośredniczy elektroporacja. Krótki impuls elektryczny z wyzwalanym silny polem jest stosowany do zwiększenia przepuszczalności bło188 719 ny i w ten sposób cząsteczki DNA mogą penetrować do komórek. Ta technika może być stosowana w układach in vitro, lub z technikami ex vivo i in vivo do wprowadzenia DNA do komórek, tkanek i narządów.

Transfer genu, w którym pośredniczą nośniki in vivo może być stosowany do wprowadzenia obcego DNA do komórek. Kompleks nośnik-DNA może być bez problemu wprowadzony do płynów ustrojowych lub krążenia krwi, a następnie skierowany do swoistego miejsca narządu docelowego lub tkanki w organizmie. Mogą być stosowane zarówno liposomy jak i polikationy takie jak, polilizyna, polifektyna lub cytofektyna. Liposomy mogą być wytworzone w taki sposób, że są swoiste komórkowe lub swoiste narządowe i tak, że obce DNA niesione przez liposomy może zostać włączone do komórek docelowych. Wstrzyknięcie immunoliposomów, które mają za zadanie osiągnięcie docelowych receptorów na konkretnych komórkach, może być wykorzystane jako sposób włączenia DNA do komórek prezentujących receptor. Innym systemem nośnika, który był stosowany w układzie jest koniugat asjaloglikoproteina/polilizyna wykorzystywany do przenoszenia DNA do hepatocytów w transferze genu in vivo.

Transfekowane DNA może być łączone w kompleks z innymi rodzajami nośnika tak, że DNA jest przenoszone do komórki odbiorczej i tam pozostaje w cytoplazmie lub nukleoplazmie. DNA może być łączony z nośnikiem białek jądrowych w swoiście skonstruowane kompleksy pęcherzyków i przenoszony bezpośrednio do jądra komórkowego.

Regulacja genu inhibitora może być uzyskana przez podawanie związków, które wiążą gen inhibitora, albo regiony kontrolne związane z genem inhibitora, albo z odpowiednim transkryptem RNA, modyfikując tempo transkrypcji albo translacji. Oprócz tego, komórki transfekowane DNA kodującym inhibitor, mogą być podawane pacjentowi dostarczając źródła inhibitora in vivo.

Przykładowo, komórki mogą być transfekowane wektorem zawierającym sekwencje kwasu nukleinowego kodujące inhibitor.

Określenie „wektor” w znaczeniu tu użytym, oznacza nośnik, który może zawierać albo łączyć konkretne sekwencje kwasu nukleinowego, który służy do transportu konkretnych sekwencji kwasu nukleinowego do komórki. Przykłady wektorów obejmują plazmidy i zakaźne mikroorganizmy takie jak wirusy, albo wektory nie wirusowe takie jak koniugaty ligand-DNA, liposomy, kompleksy lipid-DNA. Może być pożądane, aby cząsteczka rekombinowanego DNA obejmowała sekwencję DNA inhibitora proliferacji komórek śródbłonka połączoną funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi ekspresję, tworząc wektor ekspresyjny zdolny do ekspresj onowania inhibitora. Transfekowane komórki mogą być komórkami pochodzącymi z normalnych tkanek pacjenta, chorych tkanek pacjenta albo mogą nie pochodzić od pacjenta.

Przykładowo, komórki nowotworowe pobrane od pacjenta mogą być transfekowane wektorem zdolnym do ekspresj onowania białka inhibitora i ponownie podane pacjentowi. Transfekowane komórki nowotworowe wytwarzają w organizmie pacjenta poziom inhibitora hamujący wzrost nowotworu. Pacjentem może być człowiek jak również zwierzę nie będące człowiekiem. Oprócz tego, DNA inhibitora może być wstrzykiwany bezpośrednio, bez pomocy nośnika, do organizmu pacjenta. W szczególności, DNA inhibitora może być wstrzykiwany w skórę, mięśnie albo do krwi.

Ekspresja inhibitora może być kontynuowana przez długi czas lub DNA inhibitora może być podawane okresowo w celu utrzymania pożądanego poziomu białka inhibitora w komórkach, tkankach, narządach lub płynach ustrojowych.

Jakkolwiek nie chcąc być związanym poniższą hipotezą uważa się, że gdy nowotwór staje się angiogenny, uwalnia on jedno lub wiele białek angiogennych (np. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF, itp.), które działają miejscowo, docierają do śródbłonka w sąsiedztwie nowotworu z kierunku zewnątrznaczyniowego, i nie krążą (albo krążą z krótkim okresem półtrwania). Te angiogenne białka muszą być wytwarzane w ilościach wystarczających do przezwyciężenia działania inhibitora komórek śródbłonka (inhibitora naczyniotworzenia) na nowotwór pierwotny, w celu podtrzymywania jego namnażania. Gdy taki nowotwór pierwotny rozwija się dobrze, zaczyna wydzielać inhibitory komórek śródbłonka do krążenia. Nawiązując do tej hipotezy, inhibitory te działają na odległość od nowotworu pierwotnego, docierają do komórek śródbłonka przerzutów z kierunku wewnątrznaczyniowego i rozpoczynają krążę14

188 719 nie. Tak więc, w momencie gdy odległe przerzuty mogą rozpocząć naczyniotworzenie, śródbłonek naczyń w ich sąsiedztwie może być zahamowany przez docierający inhibitor.

Wytwarzanie inhibitora proliferacji komórek śródbłonka jest osiągane przy użyciu podobnych technik rekombinacji DNA i może obejmować etapy (1) identyfikacji i oczyszczania inhibitora jak to omówiono powyżej, zaś w szczegółach przytoczono w figurach, (2) określania sekwencji aminokwasowej końca N oczyszczonego inhibitora, (3) syntetycznego wytwarzania starterów oligonukleotydowych końca 5' i 3' dla sekwencji inhibitora, (4) amplifikacji sekwencji genu inhibitora stosując polimerazę, (5) wprowadzania amplifikowanej sekwencji do odpowiedniego wektora takiego jak wektor ekspresyjny, (6) wprowadzania wektora zawierającego sekwencję genu do mikroorganizmu albo innego układu ekspresji zdolnego do wyrażania genu inhibitora i (7) izolowania inhibitora wytworzonego rekombinacyjnie. Odpowiednie wektory obejmują wektory ekspresyjne wirusowe, bakteryjne i eukariotyczne (w tym drożdży). Powyższe techniki opisane są w pełni w podręcznikach laboratoryjnych takich jak „Molecular Cloning: A Laboratory Manual:, wyd. drugie Sambrook i in., Cold Spring Harbor Press 1989. Sekwencję DNA ludzkiego plazminogenu opublikowano (Browne i in., Fibrinolysis 5 (4): 257-260, 1991) załączona tu jako odnośnik.

Jeszcze inny sposób wytwarzania inhibitora, albo jego biologicznie aktywnych fragmentów obejmuje syntezę białka. Sekwencja aminokwasowa inhibitora może być określona na przykład metodami automatycznego sekwencjonowania białek. Alternatywnie, gdy zostanie wyizolowany gen albo sekwencja DNA kodująca inhibitor, przykładowo, sposobem opisanym powyżej, sekwencja DNA może zostać określona przy użyciu manualnych albo automatycznych sposobów sekwencjonowania znanych w stanie techniki. Sekwencja kwasu nukleinowego z kolei dostarcza informacji dotyczącej sekwencji aminokwasowej.

Gdy znana jest sekwencja aminokwasową białka, fragment może być syntetyzowany sposobami znanymi w stanie techniki, takimi jak przykładowo „Solid Phase Protein Synthesis: A Practical Approach” E. Atherton i R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford, Anglia. Mogą być syntetyzowane liczne fragmenty, które następnie łączy się ze sobą tworząc większy fragment. Takie syntetyczne fragmenty białka mogą być wytwarzane z zastąpieniami aminokwasów w celu badania aktywności agonistycznej albo antagonistycznej in vitro i in vivo.

Fragmenty białka, które posiadają wysokie powinowactwo wiązania do tkanek, mogą być zastosowane do izolowania receptora inhibitora na kolumnach powinowactwa.

Inhibitor jest skuteczny w leczeniu chorób albo procesów takich jak naczyniotworzenie, które są wywoływane przez lub, które obejmują proliferację komórek śródbłonka. Możliwe jest zastosowanie skutecznej ilości inhibitora albo jego fragmentu aktywnego biologicznie, albo kombinacji fragmentów inhibitora, które wspólnie posiadają aktywność przeciw-angiogenną, albo agonistów albo antagonistów inhibitora do leczenia chorób wywołanych angiogenezą. Choroby wywołane naczyniotworzeniem obejmują, choć nie są ograniczone do nowotworów litych, nowotworów krwiopochodnych takich jak białaczki, przerzutów nowotworowych, nowotworów łagodnych, przykładowo naczyniaków, nerwiaków nerwu słuchowego, nerwiako-włókniaków, kaszaków i ziarniaków ropotwórczych, reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycy, chorób naczyniowych narządu wzroku, przykładowo, retynopatii cukrzycowej, retynopatii wcześniaków, zwyrodnienia plamkowego, odrzucania przeszczepu rogówki, jaskry, włóknienia zasoczewkowego, rubeozy, zespołu Osler-Weber'a, nowotworzenia naczyń w mięśniu sercowym, naczyniotworzenia w blaszkach, „pajączków” naczyniowych, stawów hemofilitycznych, włókniako-naczyniaków i ziaminowania rany.

Inhibitor jest przydatny w leczeniu chorób związanych z nadmiernym albo zaburzonym pobudzeniem komórek śródbłonka. Choroby te obejmują, choć nie są ograniczone do zrostów jelitowych, choroby Crohn'a, miażdżycy, twardziny i przerostu blizn itp. Inhibitor może być zastosowany jako czynnik kontrolujący narodziny, przez hamowanie unaczynienia koniecznego do zagnieżdżenia zarodka. Inhibitor jest przydatny w leczeniu chorób, w których naczyniotworzenie jest patologicznym następstwem, takich jak choroba kociego pazura (Róchele minalia quintosa) i wrzody (Helicobacter pylori).

Syntetyczne fragmenty białka inhibitora mają liczne zastosowania. Białko, które wiąże receptor inhibitora z dużą swoistością i zachłannością może być znakowane radioaktywnie

188 719 i stosowane do obrazowania i oceny miejsc wiązania przy użyciu technik autoradiografii i wiązania z błoną.

Dodatkowo, znakowanie białek inhibitora lub jego fragmentów peptydowych krótko żyjącymi izotopami umożliwia obrazowanie miejsc wiązania receptora in vivo przy użyciu tomografii emisji pozytronowej, albo innych nowoczesnych technik umiejscawiania nowotworów z miejscami wiązania inhibitora.

Czynniki cytotoksyczne takie jak rycyna wiązane są z inhibitorem i fragmentami białka inhibitora o wysokim powinowactwie, dostarczając w ten sposób narzędzi do niszczenia komórek wiążących inhibitor. Komórki te spotyka się w wielu miejscach, obejmujących, choć nie ograniczonych do mikroprzerzutów i nowotworów pierwotnych. Białka powiązane z czynnikami cytotoksycznymi mogą być dostarczane w sposób maksymalizujący docieranie do pożądanego miejsca. Przykładowo, dostarczanie może być osiągnięte przez dren do naczyń zaopatrujących miejsce docelowe, albo bezpośrednio do miejsca docelowego. Czynniki takie są dostarczane w sposób kontrolowany przez pompę osmotyczną połączoną z drenem. Kombinacja antagonistów inhibitora może być podawana wraz ze stymulatorami naczyniotworzenia, jako skuteczny czynnik niszczenia przerzutów nowotworu. Ten schemat terapeutyczny odzwierciedla skuteczny sposób niszczenia przerzutów nowotworowych.

Inhibitor może być zastosowany w kombinacji z innymi kompozycjami i procedurami leczenia chorób. Przykładowo, nowotwór może być leczony konwencjonalnie przy użyciu chirurgii, naświetlania albo chemioterapii w kombinacji z inhibitorem, po czym inhibitor może być podawany pacjentowi w celu wydłużenia uśpienia mikroprzerzutów oraz w celu stabilizacji i hamowania wzrostu ewentualnego nowotworu resztkowego. Oprócz tego, inhibitor, fragmenty inhibitora, surowice odpornościowe przeciwko inhibitorowi, agoniści receptora dla inhibitora, antagoniści receptora dla inhibitora i ich kombinacje są łączone z zaróbką dopuszczalną farmaceutycznie i ewentualnie matrycą spowalniającą uwalnianie, taką jak biodegradowalne polimery, tworząc kompozycję farmaceutyczną.

Matryca spowalniająca uwalnianie, w znaczeniu tu zastosowanym, jest matrycą zbudowaną z materiałów, zwykle polimerów, które są degradowalne enzymatycznie albo hydrolizą kwaśną/zasadową albo przez rozpuszczanie. Po wprowadzeniu do organizmu, matryca ulega wpływowi enzymów i płynów ustrojowych.

Matryca spowalniająca uwalnianie wybrana jest z grupy materiałów biokompatybilnych takich jak liposomy, polilaktydy (polikwas mlekowy), poliglikolidy (polimer kwasu glikolowego) , polilaktydo koglikolidy (kopolimery kwasu mlekowego i kwasu glikolowego), polianhydrydy, poli(orto)estry. poliproteiny, kwas hialuronowy, kolagen, siarczan chondroityny, kwasy karboksylowe, kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, polisacharydy, kwasy nukleinowe, poliaminokwasy, aminokwasy takie jak fenyloalanina, tyrozyna, izoleucyna, polinukleotydy, poliwinyl propylenowy, poliwinylopirolidon i silikon. Korzystna matryca biodegradowalna jest matrycą zbudowaną jednego z: polilaktydu, poliglikolidu albo polilaktydu koglikolidu (kopolimerów kwasu mlekowego i kwasu glikolowego).

Kompozycje terapeutyczne modulujące angiogenezę, według niniejszego wynalazku, mogą być w postaci stałej, płynnej albo w postaci aerozolu i mogą być podawane dowolną znaną drogą podawania. Przykłady kompozycji terapeutycznych w postaci stałej obejmują pigułki, kremy i wszczepialne jednostki dawkowania. Pigułki mogą być podawane doustnie, kremy mogą być podawane miejscowo. Wszczepialne jednostki dawkowania mogą być podawane miejscowo, przykładowo w miejsce nowotworu, albo mogą być wszczepiane w celu uwalniania układowego kompozycji terapeutycznej modulującej angiogenezę, przykładowo podskórnie. Przykłady kompozycji płynnej obejmują formulacje zaadaptowane do wstrzyknięć podskórnych, dożylnych, dotętniczych i formulacje do podawania miejscowego i doocznego. Przykłady aerozoli obejmują formulację wziewną do podawania do płuc.

Białko inhibitora może być również zastosowane do wytwarzania przeciwciał swoistych wobec inhibitora i jego receptora. Przeciwciała mogą być poliklonalne i monoklonalne. Przeciwciała, które wiążą się swoiście z inhibitorem albo receptorem dla inhibitora mogą być zastosowane w metodach diagnostycznych i zestawach dobrze znanych specjalistom, do wykrywania albo określania ilościowo inhibitora albo receptorów dla inhibitora w płynach ustrojowych albo tkance. Wyniki tych badań mogą być zastosowane do diagnozowania albo rokowa16

188 719 nia co do występowania albo nawracania nowotworu i innych chorób związanych z naczyniotworzeniem.

Inhibitor może być również zastosowany w zestawie diagnostycznym do wykrywania i oceny ilościowej przeciwciał zdolnych do wiązania inhibitora. Zestawy te powinny umożliwić wykrywanie krążących przeciwciał przeciwko inhibitorowi. Pacjenci, u których stwierdzi się krążące przeciwciała przeciwko inhibitorowi, z większym prawdopodobieństwem rozwiną nowotwór rozsiany, i jest bardziej prawdopodobne, że po leczeniu albo okresach remisji nowotwór wystąpi u nich powtórnie. Fragmenty Fab przeciwciał przeciwko inhibitorowi mogą być zastosowane jako antygeny do wywołania surowic odpornościowych przeciwko fragmentom Fab anty- inhibitorowi, które mogą służyć do zneutralizowania przeciwciał przeciwko inhibitorowi. Sposób taki powinien zmniejszyć usuwanie krążącego inhibitora przez przeciwciała przeciwko inhibitorowi, skutecznie podnosząc w ten sposób poziom krążącego inhibitora.

W zagadnieniach związanych z inhibitorem endotelialnym istotny jest również sposób blokowania działania nadmiaru endogennego inhibitora. Może to być wykonane przez bierną immunizację człowieka albo zwierzęcia przeciwciałami swoistymi wobec inhibitora niepożądanego w krążeniu. Aspekt ten może być szczególnie istotny w leczeniu zaburzonej owulacji, menstruacji albo tworzenia łożyska, albo w naczyniotworzeniu. Dostarcza to przydatnych narzędzi do badania wpływu usuwania inhibitora na procesy tworzenia przerzutów. Fragment Fab przeciwciał przeciwko inhibitorowi zawiera miejsce wiązania inhibitora. Fragment ten jest izolowany z przeciwciał przy użyciu technik znanych specjalistom w dziedzinie. Fragmenty Fab surowic odpornościowych przeciwko inhibitorowi stosowane są jako antygeny w celu wytwarzania surowic przeciwko fragmentom Fab.

Wstrzyknięcie tej surowicy przeciwko fragmentom Fab, zapobiega wiązaniu inhibitora z przeciwciałami przeciwko inhibitorowi. Korzyść terapeutyczną osiąga się przez blokowanie wiązania inhibitora z fragmentami Fab przeciwko inhibitorowi. Skutek netto takiego leczenia ułatwia zdolność endogennego krążącego inhibitora do docierania do komórek docelowych, zmniejszając w ten sposób rozsiew mikroprzerzutów.

Pochodne inhibitora, wykazujące działanie hamujące proliferację komórek śródbłonka stanowią również istotny aspekt rozwiązań według wynalazku. Rozwiązania według wynalazku są możliwe w oparciu o całe białko inhibitora, pochodne białka inhibitora i biologicznie czynne fragmenty białka inhibitora. Należą do nich białka o aktywności inhibitora, z zastąpieniami aminokwasów albo z cukrami albo innymi cząsteczkami przyłączonymi do grup funkcyjnych aminokwasów. Dla zastosowania rozwiązań według wynalazku istotne są również geny kodujące inhibitor albo receptor inhibitora oraz białka wyrażane przez te geny.

Białka i fragmenty białek o opisanej wyżej aktywności inhibitora mogą być dostarczone jako izolowane i zasadniczo oczyszczone białka i fragmenty białek w formulacjach dopuszczalnych farmaceutycznie przy użyciu sposobów znanych specjalistom. Formulacje te mogą być podawane standardowymi drogami. Ogólnie, kombinacje mogą być podawane drogą miejscową, przezskómą, dootrzewnową, doczaszkową, dokomorową, domózgową, dopochwową, domaciczną, doustną, doodbytniczą albo pozajelitową (np. dożylnie, dordzeniowo, podskórnie albo domięśniowo). ·

Oprócz tego, inhibitor może być włączany do biodegradowalnych polimerów umożliwiających spowolnione uwalnianie związku, przy czym polimery wszczepia się w sąsiedztwie miejsca do którego pożądane jest dostarczanie leku, przykładowo, w miejsce nowotworu albo w taki sposób, aby inhibitor powoli uwalniał się do krwiobiegu. Minipompy osmotyczne mogą być również stosowane w celu kontrolowanego dostarczania wysokiego stężenia inhibitora przez dreny do pożądanego miejsca, takiego jak bezpośrednio do przerzutu albo do krążenia zaopatrującego ten nowotwór. Biodegraaowalne polimery i ich zastosowanie opisano, przykładowo, w Brem i in., J. Neurosurg., 74:441-446 (1991).

Dawkowanie inhibitora zależeć będzie od stanu choroby albo stanu leczonego oraz innych czynników klinicznych takich jak ciężar ciała i stan człowieka albo zwierzęcia oraz drogi podawania związku. Do leczenia ludzi albo zwierząt, inhibitor może być podawany w dawce od około 0,5 mg/kg do około 500 mg/kg. Zależnie od okresu półtrwania inhibitora w organizmie człowieka albo zwierzęcia, inhibitor może być podawany od około kilku razy dziennie do raz w tygodniu. Także możliwe są pojedyncze jak również liczne podawania, równocześnie

188 719 albo w odstępach czasu. Rozwiązania według wynalazku mają zastosowanie zarówno u ludzi jak i w weterynarii.

Formulacje inhibitora obejmują postaci odpowiednie do podawania doustnego, doodbytniczego, okulistycznego (w tym podawanie do ciała szklistego i do komory oka), donosowego, miejscowego (w tym podpoliczkowego i podjęzykowego), domacicznego albo pozajelitowego (w tym podskórnego, dootrzewnowego, domięśniowego, dożylnego, śródskórnego, doczaszkowego, dotchawiczego i pfdtwardawkfwygo). Formulacje inhibitora mogą być w konwencjonalnych jednostkowych postaciach dawkowania i mogą być wytworzone konwencjonalnymi technikami farmaceutycznymi. Techniki takie obejmują etap połączenia składnika czynnego z nośnikiem (nośnikami) i zaróbką (zarobkami) farmaceutycznymi. Ogólnie, formulacje są wytwarzane przez równomierne połączenie składnika czynnego z nośnikami płynnymi albo rozdrobnionymi nośnikami stałymi albo jednymi i drugimi, i jeżeli to konieczne nadanie kształtu produktowi.

Formulacje odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i nie wodne sterylne roztwory do wstrzyknięć, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczalne czyniące formulacje izotoniczną wobec krwi biorcy, i wodne albo nie wodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać środek ułatwiający zawieszanie i środek zagęszczający. Formulacje mogą występować w pojemnikach zawierających pojedynczą dawkę albo liczne dawki, przykładowo w zamkniętych ampułkach i fiolkach i mogą być przechowywane w warunkach liofilizowanych, wymagających jedynie dodania sterylnego nośnika płynnego, przykładowo, wody do wstrzyknięć, bezpośrednio przed użyciem. Roztwory do wstrzyknięć albo zawiesiny do wykonania mogą być wytworzone ze sterylnych proszków, granulek albo tabletek opisanego wyżej rodzaju.

Jednostki dawkowania obejmują takie, które zawierają dawkę dzienną albo jednostkową, część dawki dziennej albo jej odpowiednią część, składnika do podawania. Należy rozumieć, że oprócz składnika czynnego, formulacje mogą obejmować inne czynniki stosowane w odniesieniu do danej formulacji. Ewentualnie, środki cytotoksyczne mogą być włączone albo w inny sposób połączone z białkami inhibitora, albo jej aktywnymi biologicznie fragmentami, zapewniając pacjentowi leczenie skojarzone.

Białka hamujące naczyniotworzenie, mogą być syntetyzowane w standardowym laboratorium chemicznym, zaś ich czystość może być określana przez .HPLC albo spektrofotometrię masową. Sposoby syntezy białka, oczyszczania przez HPLC i spektrofotometria masowa są powszechnie znane specjalistom. Białka inhibitora i białka receptorów dla inhibitora są również wytwarzane rekombinacyjnie w układach ekspresyjnych E. coli albo drożdży i oczyszczane na kolumnach chromatograficznych.

Różne fragmenty białek całej cząsteczki inhibitora mogą być syntetyzowane do zastosowania w niektórych zastosowaniach obejmujących, choć nie ograniczonych do opracowania swoistych surowic odpornościowych, jako agonistów albo antagonistów miejsc wiązania inhibitora, jako białek do wiązania z, albo do stosowania w kombinacji z środkami cytotoksycznymi do kierowanego niszczenia komórek wiążących inhibitor. Sekwencje aminokwasowe obejmujące te białka są selekcjonowane na podstawie ich pozycji w zewnętrznych regionach cząsteczki i dostępności wiązania się z surowicami odpornościowymi. Końce aminowe i karboksylowe, jak również region środkowy cząsteczki, są reprezentowane osobno wśród syntetyzowanych fragmentów.

Te sekwencje białka porównywane są ze znanymi sekwencjami przy użyciu baz danych sekwencji takich jak GeneBank, Briikhaven Protein, SWISS-PROT i PER. w celu ustalenia potencjalnej homologii sekwencji. Informacja ta ułatwia eliminację sekwencji wykazujących wysoki stopień homologii sekwencji z innymi cząsteczkami, zwiększając potencjał wysokiej swoistości w opracowaniu surowic odpornościowych, agonistów i antagonistów inhibitora.

Inhibitor i pochodne białkowe inhibitora mogą być sprzęgane z innymi cząsteczkami przy użyciu standardowych metod. Końce aminowe i karboksylowe angiostatyny zawierają reszty tyrozynowe i lizynowe i mogą być znakowane izotopowo i nie izotopowo wieloma technikami, przykładowo metodą znakowania radioaktywnego przy użyciu konwencjonalnych technik (reszty tyrozynowe - chloramina T, jodogen, laktoperoksydaza; reszty lizynowe - odczynnik Bolton-Huntera). Te techniki sprzęgania są dobrze znane specjalistom. Alternatyw18

188 719 nie, tyrozyna albo lizyna dodawana jest do fragmentów nie zawierających tych reszt, w celu ułatwienia znakowania aktywnych grup aminowych albo hydroksylowych białka. Techniki sprzęgania wybrane są na podstawie dostępnych grup funkcyjnych aminokwasów obejmujących, choć nie ograniczonych do grup aminowych, sulfhydrylowych, karboksylowych, amidowych, fenolowych i imidazolowych. Różne odczynniki stosowane w tym celu obejmują między innymi glutaraldehyd, diazotyzowaną benzydynę, karbodiimid i p-benzokwinon.

Białka inhibitora sprzęgane są chemicznie z izotopami, enzymami, białkami nośnikowymi, środkami cytotoksycznymi, chemiluminescencyjnymi, bioluminescencyjnymi i innymi składnikami w zależności od zastosowania. Skuteczność reakcji sprzęgania oceniana jest przy użyciu różnych technik odpowiednich do danej reakcji. Przykładowo, znakowanie radioaktywne białka inhibitora ¹²⁵I uzyskuje się przy użyciu chloraminy T i Na¹²⁵I o wysokiej aktywności właściwej. Reakcja jest przerywana metabisulfmem sodu, zaś mieszaninę wysala się na kolumnie jednorazowego użytku. Znakowane białko eluuje się z kolumny i zbiera frakcje. Z każdej frakcji pobiera się porcje i mierzy ich radioaktywność w liczniku gamma. W ten sposób oddziela się nie przereagowany Ńa¹²⁵I od znakowanego białka inhibitora. Frakcje białka 0 najwyższej aktywności właściwej przechowuje się do zastosowania w analizie, tj. zdolności wiązania z surowicą odpornościową przeciwko angiostatynie.

Inne zastosowanie koniugatu białka obejmuje wytwarzanie odpornościowych surowic poliklonalnych. Przykładowo, białka inhibitora zawierające reszty lizyny są wiązane z oczyszczoną albuminą surowicy bydlęcej przy użyciu glutaraldehydu. Skuteczność reakcji określana jest przez pomiar wbudowywania białka znakowanego radioaktywnie. Nie przereagowany glutaraldehyd jest oddzielany przez dializę. Koniugat przechowuje się do użycia.

Możliwe jest również wytworzenie surowicy odpornościowej przeciwko inhibitorowi, analogom inhibitora, fragmentom białkowym inhibitora i receptorowi inhibitora. Po syntezie i oczyszczeniu białka, surowice monoklonalne albo poliklonalne mogą być wytworzone przy użyciu ustalonych technik, znanych specjalistom. Przykładowo, surowice poliklonalne mogą być wywołane u królików, owiec, kóz albo innych zwierząt. Białka inhibitora sprzęgnięte z cząsteczką nośnika takiego jak albumina surowicy bydlęcej albo samego inhibitora łączy się z mieszaniną adiuwantu, emulguje się i wstrzykuje podskórnie w wiele miejsc na grzbiecie, karku, bokach a czasem w poduszkę łapy. W regularnych odstępach czasu, takich jak co 2 do 4 tygodni, podaje się dawkę przypominającą. Próbki krwi uzyskuje się przez nakłucie żyły, przykładowo stosując żyły brzeżne ucha po ich rozszerzeniu, w około 7-10 dni po immunizacji. Próbki krwi pozostawia się do skrzepnięcia, przez noc w 4°C i odwirowuje się przy około 2400 x g w 4°C przez około 30 minut.

Surowicę się pobiera, porcjuje i przechowuje w 4°C do zastosowania bezpośredniego albo w -20 do -90°C do dalszych analiz.

Wszystkie próbki surowicy z wytwarzania surowic poliklonalnych albo próbki pożywki z wytwarzania przeciwciał monoklonalnych bada się w celu określenia miana przeciwciała. Miana ustala się kilkoma sposobami, przykładowo, stosując analizy dot biot albo analizę gęstości, jak również precypitacją kompleksów znakowanego radioaktywnie białka z przeciwciałem, przy użyciu białka A, przeciwciał wtórnych, zimnego etanolu albo węgla-dekstranu, a następnie przez pomiar radioaktywności w liczniku gamma. Najwyższe miana surowicy są również oczyszczane na kolumnach powinowactwa, które są dostępne w handlu. Białka angiostatyny sprzęga się z żelem kolumny powinowactwa. Próbki surowic są przepuszczane przez kolumnę i przeciwciała przeciwko inhibitorowi pozostają związane z kolumną. Przeciwciała te eluuje się następnie, zbiera i bada w celu stwierdzenia miana i swoistości.

Najwyższe miana surowic odpornościowych przeciwko inhibitorowi bada się w celu ustalenia a) optymalnego rozcieńczenia surowicy dla najwyższej swoistości wiązania antygenu i najniższego wiązanie nieswoistego, b) zdolności do wiązania rosnących ilości białka inhibitora w standardowej krzywej wypierania, c) potencjalnej aktywności krzyżowej wobec peptydów pokrewnych i białek pokrewnych gatunków, d) zdolności do wykrywania białek inhibitora w ekstraktach osocza, moczu, tkanek i pożywek hodowli komórkowej.

Surowice odpornościowe, które posiadają najwyższe miana i swoistość i potrafią wykrywać białka inhibitora w ekstraktach osocza, moczu, tkanek i pożywek hodowli komórkowej są dalej badane w celu ustalenia łatwych do zastosowania zestawów do szybkiego, wiary188 719 godnego, czułego i swoistego pomiaru i umiejscawiania inhibitora. Zestawy te obejmują, choć nie są ograniczone do technik testów kompetycyjnych i nie kompetycyjnych, testów radioimmunologicznych, biolumine-scencyjnych i chemoluminescencyjnych, fluorometrycznych, kanapkowych, immunoradiometrycznych, dot błot, testów enzymatycznych obejmujących ELISA, płytki do mikromiareczkowania, opłaszczone przeciwciałami paski albo patyczki do błyskawicznego określania zawartości w moczu i krwi oraz immunohistochemię. Dla każdego testu ustala się zakres, czułość, celność, wierność, swoistość i powtarzalność testu. Różnice wewnątrz testu i między testami określa się na poziomie 20%, 50% i 80% punktów na krzywej standardowej wypierania albo aktywności.

Jednym z przykładów testu powszechnie stosowanego w badaniach oraz w klinice jest zestaw do testu radioimmunologicznego (RIA). RIA dla inhibitora przedstawiony jest poniżej. Po pomyślnym radiojodowaniu i oczyszczaniu inhibitora albo białka inhibitora, surowica odpornościowa o najwyższym mianie dodawana jest w kilku rozcieńczeniach do probówek zawierających względnie stałą ilość radioaktywności, taką jako 10000 cpm, w odpowiednim buforze. Inne probówki zawierają bufor albo surowicę sprzed immunizacji, w celu określenia wiązanie nieswoistego. Po inkubacji w 4°C przez 24 godziny, dodawane jest białko A po czym probówki są wytrząsane, inkubowane w temperaturze pokojowej przez 90 minut i odwirowywane przy około 2000-2500 x g w 4°C, w celu precypitacji kompleksów przeciwciała związanego ze znakowanym radioaktywnie antygenem. Nadsącz jest usuwany przez odessanie, zaś radioaktywność osadu mierzy się w liczniku gamma. Rozcieńczenie surowicy, które wiąże około 10-40% znakowanego białka po odjęciu wiązania nieswoistego, jest dalej charakteryzowane.

Następnie, zakres rozcieńczenia (od około 0,1 pg do około 10 ng) białka inhibitora stosuje się do badania surowicy przez dodanie znanych ilości białka do probówek zawierających znakowane radioaktywnie białko i surowicę odpornościową. Po dodatkowym okresie inkubacji, przykładowo, 24-48 godzin, dodaje się białka A i odwirowuje probówki, nadsącz usuwa i mierzy radioaktywność osadu. Wypieranie wiązania białka znakowanego radioaktywnie inhibitora przez nie znakowane białko inhibitora (standard) daje krzywą standardową. Kilka stężeń innych fragmentów białka inhibitora, inhibitora od innych gatunków i białek homologicznych dodaje się do probówek testowych w celu scharakteryzowania swoistości surowicy odpornościowej wobec inhibitora.

Wytwarzane są następnie ekstrakty z różnych tkanek, w tym obejmujących, choć nie ograniczonych do nowotworów pierwotnych i wtórnych, raka płuc Lewisa, hodowli komórek wytwarzających inhibitor, łożyska, macicy, innych tkanek takich jak mózg, wątroba i jelita. Po liofilizacji albo odwirowaniu w próżni (Speed Vac) ekstraktów tkankowych, dodawany jest bufor testowy i różne porcje umieszczane są w probówkach RIA. Ekstrakty znanych komórek wytwarzających inhibitor tworzą krzywą wypierania, które są równoległe z krzywymi standardowymi, podczas gdy ekstrakty tkanek, które nie wytwarzają inhibitora nie wypierają inhibitora znakowanej z surowicy odpornościowej przeciwko inhibitora. Oprócz tego, do probówek testowych dodawane są w rosnących ilościach ekstrakty moczu, osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego zwierząt z rakiem płuc Lewisa. Równoległe krzywe wypierania wskazują na użyteczność testu na inhibitor w mierzeniu ilości inhibitora w tkankach i płynach ustrojowych.

Ekstrakty tkankowe, które zawierają inhibitor są dodatkowo charakteryzowane przez poddanie próbek HPLC z odwróconą fazą. Wypłukiwane frakcje są zbierane, osuszane w Speed Vac'u, rozpuszczane w buforze testowym i analizowane przez RIA na inhibitor. Maksymalna ilość immunoreaktywności z inhibitorem umiejscowiona jest we frakcjach odpowiadających pozycji elucji inhibitora.

Opisane niniejszym zostały zestawy testowe zawierające instrukcję, surowicę odpornościową, inhibitor albo białko inhibitora i, o ile to możliwe, znakowany inhibitor i/lub odczynniki do precypitacji kompleksów inhibitora związanego z przeciwciałem przeciwko inhibitorowi. Zestaw jest przydatny do pomiaru inhibitora w płynach ustrojowych i ekstraktach tkankowych zwierząt i ludzi z nowotworem lub bez.

Inny zestaw stosowany może być do lokalizacji inhibitora w tkankach i komórkach. Ten zestaw immunohistochemiczny dostarcza instrukcji, surowicy odpornościowej przeciwko inhibitorowi i o ile to możliwe, surowicy blokującej i surowicy wtórnej sprzęgniętej z cząsteczką fluorescencyjną, taką jak izotiocyjanian fluoresceiny albo innymi cząsteczkami stosowa20

188 719 nymi do obrazowania surowicy pierwotnej. Techniki immunohistochemiczne są dobrze znane specjalistom. Zestaw immunohistochemiczny na inhibitor umożliwia umiejscowienie inhibitora w skrawkach tkanki i komórkach hodowanych przy użyciu mikroskopii świetlnej i elektronowej. Jest on stosowany zarówno do celów badawczych jak i klinicznych. Przykładowo, pobierane są bioptaty nowotworów, po czym tkanki są skrawane na mikrotomie w celu badania miejsc wytwarzania inhibitora. Taka informacja jest przydatna w diagnostyce, jak również prawdopodobnie do celów terapeutycznych w wykrywaniu i leczeniu nowotworów. Innym sposobem obrazowania miejsc biosyntezy inhibitora jest znakowanie radioaktywne kwasu nukleinowego do zastosowania w hybrydyzacji in situ w celu sondowania posłańcowego RNA inhibitora. Podobnie, receptor angiostatyny może być lokalizowany, obrazowany i mierzony ilościowo technikami immunohistochemicznymi.

Wynalazek niniejszy jest dalej ilustrowany poniższymi przykładami, które w żaden sposób nie są ograniczeniami zakresu wynalazku. Przeciwnie, należy rozumieć, że możliwe są różne inne wykonania, modyfikacje i zamienniki, które po przeczytaniu poniższych zastrzeżeń przez specjalistę nasuną się same.

Przykład 1

Pokazanie aktywności inhibitora proliferacji komórek śródbłonka fragmentu Kringel 5 ludzkiego plazminogenu.

Źródło: Ludzki plazminogen jest trawiony odpowiednimi enzymami w celu uzyskania fragmentu Kringle 5. Fragment białkowy jest izolowany i oczyszczany standardowymi metodami izolacji i oczyszczania białek dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie. Czystość izolowanego Kringle 5 jest pokazana na figurze 2, pokazującej wyniki przebiegu preparatu białkowego na żelu elektroforetycznym.

Test: Aktywność hamująca komórki śródbłonka była oceniana przez zahamowanie syntezy DNA (włączanie [metylo-H³] tymidyny) w bydlęcych komórkach śródbłonka naczyń włosowatych. Komórki śródbłonka naczyń włosowatych były uzyskiwane z bydlęcych gruczołów nadnerczowych i hodowane na pokrytych żelatyną 48 studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania.

Różne ilości izolowanego Kringle 5 są dodawane do hodowanych komórek i oceniana jest zmiana liczby komórek. Procentowa zmiana liczby komórek jest nanoszona na wykres jako funkcja ilości kringle 5 dodanego do hodowli w celu uzyskania wykresu przedstawionego na figurze 1.

Figura 3 pokazuje porównanie podobnych sekwencji 80 aminokwasów pochodzących z regionów Kringle 1,2, 3, 4 i 5 ludzkiego plazminogenu.

188 719

Lista sekwencji

(1)	Informacje	ogólne
	(i) Zgłaszający: (A) Nazwa: The Children's Medicwl Center CorpirdtOoπ
	(B)	Ulica: 300 Longwood Avenue
	(C)	Miasto: Boston
	(D)	Stan: MA

(E) Państwo: USA (F) Kod pocztowy: 02115 (G) (ii) Tytuł zgłoszenia: INHIBITOR PROLIFERACJI KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA I SPOSOBY JEGO ZASTOSOWANIA (iii) Liczba sekwencci: 6 (iv) Postać sczyiywalna komputerowo:

(A) Tpp nośnkda: dyskiekka (B) Komputer: oompatybinyy z IMM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/Ms-DOS (D) Oprogramowanie: PatentIn wy>^uszczony #1.0, wersja #1.30 (EPO) (v) Dane dotyczące Zgłoszenia:

Numer zgłoszenia: P-327200 (vi) Dane dotyczące piewszeństww:

(A) nr zgłoszenia międzynarodowego: P<CT/US96/20447 (B) data zgłoszenia: 13 grudnia 1996 (vi) Dane dotyczące pierwszeństwa:

(A) numer piewszeństwa: US 60/008519 (B) data pierwszeństwa: 13 grudnia 1995 (vi) Dane dotyczące pierwszeństwa:

(A) umerr pierwszeństwa: SS 08/763528 (B) dtta pierwszeństwa: 12 ruudnaa 1998 (2) Informacje dla SEK NR ID: 1 (i) Charćdcterystyka sekwencji (A) Długość: 79 aminokwasów (B) Rodzaj : sekwencja aminokwasc^wą (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetyczna: NIE (v) Rodzaj fraęmentu: wewntrzny (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm: homo sapiens (B) Izolat indywidualny: izolwt (F) Rodzaj tkanki: krew (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 1

Cys Met Phe Oly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

188 719

10 ¹⁵

val

Thr

Oly

Thr

Pro

cys

Ola

Asp

Trp

Ala

Gin

Glu

Pro

His

Arg

20

25

30

His

Ser

ile

Phe

Thr

pro

Glu

Thr

Asn

Pro

Arg

Ala

Gly

Leu

Olu

Lys

35

40

45

Asn

Tyr

cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Val

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

50

55

60

Thr

Asn

Pro

Arg

Lya

Leu

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Gin

65

70

75

(2) Informacje dla SEK NR ID: 2 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość: 79 aminokwasów (B) Rodzaj: sekwencja aminokwasowa (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: peptyd (v) Rodzaj fragmentu: wewnętrzny (vi) Oryginalne źródło:

(A) organizm: homo sapiens (F) Rodzaj tkanki: krew

(x:

i) C

ipis

sek

wenc j i:

SEK NR

ID:

: 2

CyB

Lys

Thr

Gly

Asn

Gly

Lys

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Met

Ser

Lys

Thr

1

5

10

15

Lys

Asn

Gly

Ile

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Thr

Ser

Pro

His

Arg

20

25

30

Pro

Arg

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

ser

Glu

Gly

Leu

Glu

Aen

35

40

45

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Pro

Gin

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

50

55

60

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp

ile

Leu

Glu

Cye

65

70

75

(2) Informacje dla SEK NR ID: 3 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość: 78 aminokwasów (B) Rodzaj: sekwencja aminokwasowa (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: peptyd (v) Rodzaj fragmentu: wewnętrzny (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm: homo sapiens

188 719 (F) Rodzaj tkanki: krew (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 3

Cys Met His Cys 1'	Ser Gly Glu 5	Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr
10	15
Met Ser Gly Leu	Glu Cys Gln	Ala Trp Asp	Ser Gln Ser Pro His Ala
20		25	30
Bis Gly Tyr Ile	Pro Ser Lys	Phe Pro Asn	Lys Asn Leu Lys Lys Asn
35		40	45
Tyr Cys Arg Asn	Pro Asp Arg	Glu Leu Arg	Pro Trp Cys Phe Thr Thr
50	55		60
Asp Pro Asn Lys	Arg Trp Glu	Leu Cys Asp	Ile Pro Arg Cys
65	•70		75
(2) Informacje dla SEK NR ID	: 4
(i) Charakterystyka sekwencji
(A)	Długość: 78	1 aminokwasów
(B)	Rodźaa: sekwencja aminokwasowa
(C)	Rodzaj nici: pojedyncza
(D)	Topolcogia:	liniowa
(ii) Rcodzaj	cząsteczki	: peptyd
(v) Rodzaj	\| fragmentu	: wevmętrzny

(vi) Oryginalne źródło:

(A)	Organizm: homo	sapiens
(F)	Rodzaj tkarkci :	łreww

(xi)

Opis i

sekwencc i:

SEK

NR

ID:

4

Cys

Leu

Lys

Gly Thr Gly

Glu

Aen

T^ Arg

Gly

Asn

Val

Ala

val

Thr

1

5

10

15

Val

Ser

Gly

His Thr Cys

Gln

Bis

Trp

Ser

Ala

Gln

Thr

Pro

His

Thr

20

25

30

His

Asn

Arg

Thr Pro Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Abp

Glu

Aen

35

40

45

Tyr

Cys

Arg

Asn Pro Asp

Gly

Lys

Arg

ALa

Pro

Trp

Cys

His

Thr

50

55

60

Asn

Ser

Gln

Val Arg Trp

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Cys

es

70

75

(2) Informacje

dla SEK NR

ID:

5

(i) Charakterystyka

sekwencji

(A)

Długość:

78

aminokwasów

(B)

Rodzaj:

sekwencja aoinitwasiwa

(C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: linóowa

188 719 (ii) Rodzaj cząsteczki: peptyd (v) Rcolzaj fragmentu: weiwintrzny (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organioot: homo sapiens (F) Rodzaj tkanki: krew (xi) O>is sekwencji: SEK NR ID: 5

Cys		His	Gly	Asp	Gly	Gln	Ser
1				5
Thr	Thr	Gly	Lys	Lys	Cys	Gln	Sec
			20
His	Sin	Lys	Thr	Pro	Glu	Asn	Tyr
		35					40
Tyr	Cys	Arg	Asn	Pro	Asp	Ala	Aep
	50					55
Asp	Pro	ser	Vai	Arg	Trp	Glu	Tyr
65					70

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr
	10	15
Trp 25	Ser	Ser	Met	Thr	Pro 30	His	Arg
Pro	Asn	Ala	Gly	Leu 45	Thr	Het	Asn
Lys	Gly	Pro	Trp 60	Cys	Phe	Thr	Thr
Cys	Asn	Leu	Lys	Łye	Cys

(2) Informacje dla SEK NR ID: 6 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość: 80 aminokwasów (B) Rodzaj: sekwencja aminokwasowa (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: linóowa (ii) Rtołzaj cząsteczki: peptyd (v) Rodzaj fragmentu: wełmęęrzny (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organiom : oomo sapenne (F) Rodząj kkanki: keww

(xi)

Op

is s

ekwucc

i: :

SEK

NR

ID:

6

Cys

Met

Phe

Gly

Asn

Gly

Lys

Gly

Tyr

Arg

Gly

Lys

Arg

Ala

Thr

1

5

10

15

Val

Thr

Gly

Thr

Pro

Cys

Gln

Asp

Trp

Ala

Gln

Glu

Pro

His

Arg

30

25

30

His

Ser

Ile

Phe

Tbr

Pro

Glu

Thr

Asn

Pro

Arg

Ala

Gly

Leu

Glu

Lys

35

40

45

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Aep

Gly

Asp

Val

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

50

55

60

Thr

Asn

Pro

Arg

Lys

Leu

Tyr

Asp

Tyr

Cye

Asp

Val

Pro

Gln

Cys

65

70

75

80

188 719

Κ5 kD

-200 “69

-21.5

-14.3

Figura 2

188 719 _ υ υ ο _ a w sc α u ω ω Sć fu Η W W U > Ω Ω X 2 Ω υ υ υ υ υ >· Α >· >« >· ω ω ω w ρ s g ί ί 5 agsfcs fc fe t/> Cu 0u Q O 2 Q Z

EEhp ht) UOb .22 ο

ω

ο ιΠ

Ω Ω Ω a Ω

CU CM Dl* CU CU

22§§§ u u u u u . χ >4 >-< X >4

CU CU Ou Cu >4 Z δ δ 6

CU

Ω

Ο (Ν □ Ó O O 68

Figura 3 w cu <n v*) χ χ χ χ x

188 719

stężenie białka (nM)

FIGURA 4

Figura 5

188 719 % zmiany liczby komórek

stężenie białka (nM) FIGURA 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób hamowania proliferacji komórek śródbłonka in vitro, znamienny tym, że obejmuje podawanie do komórki śródbłonka skutecznej ilości białka posiadającego sekwencję aminokwasową izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko obejmuje 80 aminokwasów.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ciężar cząsteczkowy białka wynosi 14000.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazminogen jest plazminogenem ludzkim.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ED: 1.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6.
7. Zastosowanie białka o sekwencji izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu do wytwarzania leku do leczenia pacjenta z chorobą powiązaną z angiogenezą.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że białko obejmuje 80 aminokwasów
9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że ciężar cząsteczkowy białka wynosi 14000.
10. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że plazminogen jest plazminogenem ludzkim.
11. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną do SEK NR ID: 1.
12. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6.
13. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że białko jest zdolne do hamowania proliferacji komórek śródbłonka.
14. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że pacjentem jest człowiek.
15. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że chorobą powiązaną z angiogenezą jest rak.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że rakiem jest guz lity.
17. Zastosowanie białka o sekwencji izolowanego pepetydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu do wytwarzania leku do hamowania proliferacji komórek śródbłonka u pacjenta.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że białko obejmuje 80 aminokwasów.
19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że ciężar cząsteczkowy białka wynosi 14000. .
20. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że plazminogen jest plazminogenem ludzkim.
21. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6.
22. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 1.
23. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że pacjentem jest człowiek.
24. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że pacjent ma chorobę powiązaną z angiogenezą.
25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że chorobą powiązaną z angiogenezą jest rak.
26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że rakiem jest guz lity.

188 719
27. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje hamującą proliferację komórek śródbłonka ilość białka o sekwencji aminokwasowej izolowanego peptydu Kringle 5 cząsteczki plazminogenu i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
28. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że białko obejmuje 80 aminokwasów.
29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że ciężar cząsteczkowy białka wynosi 14000.
30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że plazminogen jest ludzkim plazminogenem.
31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 6.
32. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że białko ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% homologiczną z SEK NR ID: 1.