NO321775B1 - Fremgangsmate for a hemme endotelcelleproliferasjon in vitro, farmasoytisk blanding som omfatter en endotelcelleproliferasjons-inhibitor, samt anvendelse. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse dreier seg om en ny fremgangsmåte for å hemme endotelcelleproliferasjon in vitro som angitt i krav 1, anvendelse av et protein fra et Kringle 5-peptid som angitt i krav 7 og 17, samt en farmasøytisk blanding omfattende et slikt peptid som angitt i krav 27. Det aktuelle protein har evne til å hemme angiogenese-relaterte sykdommer og å modulere angiogene prosesser. Proteinet kan anvendes i diagnostiske analyser og reagenssett for å måle mengde av inhibitor som er til stede i biologiske væskeprøver, videre i histokjemiske reagenssett for å lokalisere inhibitoren, samt antistoff som er spesifikke for proteinet, til utvikling av peptidagonister og antagonister for proteinets reseptor, anti-protein-reseptorspesifikke antistoff agonister og antagonister og cytotoksiske midler som er koblet til proteinet.

Oppfinnelsens bakgrunn

Som benyttet her betyr begrepet "angiogenese" dannelsen av nye blodårer i et vev eller et organ, og inkluderer endotelcelleproliferasjon. Under normale fysiologiske forhold foregår angiogenese i mennesker eller dyr kun i meget spe-sielle begrensede situasjoner. For eksempel blir angiogenese vanligvis observert under sårtilheling, fosterutvikling og dannelse av corpus luteum, endometriet og morkake. Begrepet "endotelium" betyr et tynt lag av flate epitelceller som dekker serøse hulrom, lymfeårer og blodårer.

Både kontrollert og ikke-kontrollert angiogenese antas å foregå på samme måte. Endotelceller og pericytter, omgitt av en basalmembran, danner kapillære blodårer. Angiogenese begynner med oppløsning av basalmembranen ved hjelp av enzymer som blir frigjort av endotelcellene og hvite blodcel-ler. Endotelcellene som omgir hulrommet i blodårer presser seg deretter gjennom basalmembranen. Angiogene stimuli in-duserer endotelcellene slik at de vandrer gjennom den øde-lagte basalmembran. De vandrende celler danner en "spire" ut fra den eksisterende blodåre, der endotelcellene går gjennom celledeling og prolifererer. Endotel-spirene smel-ter sammen med hverandre slik at de danner kapillære sløy-fer, som produserer den nye blodåre. Vedvarende og ikke-regulert angiogenese forekommer i en lang rekke sykdomstilstander, tumorspredning og unormal vekst av endotelceller, og understøtter den patologiske skade som man ser i disse tilstander. De ulike patologiske sykdomstilstander der ure-gulert angiogense er til stede, har blitt slått sammen som angiogent avhengige eller angiogent assosierte sykdommer.

Hypotesen at tumorvekst er angiogenese-avhengig ble først foreslått i 1971 (Folkman, J., Tumor angiogenesis: Thera-peutic implications, N. Engl. Jour. Med. 285:1182-1186, 1971). I dens enkleste form sier den: «med en gang tumor har tatt feste må enhver okning i tumorcellepopulasjonen bli foregått av en økning i nye kapillærer som samler seg på tumoren». Tumorfeste blir for tiden forstått som en pre-vaskulær fase av tumorvekst der en populasjon tumorceller som fyller ut et volum på noen få kubikkmillimeter og som ikke overstiger et par millioner celler, kan overleve på eksisterende mikroblodårer fra verten. Ekspansjonen av tu-morvolumet utenfor denne fasen krever induksjon av nye ka-pillærblodårer. For eksempel ville mikrometastaser i lungen i den tidlige prevaskulære fase hos mus, ikke kunne påvises med unntak av høygrads-resolusjonsmikroskopi på histologis-ke snitt.

Eksempler på det indirekte bevis som støtter denne ide inkluderer: (1) Veksthastigheten hos tumorer som er implantert i sub-kutane gjennomsiktige kammer hos mus er langsom og lineær for neovaskularisering, og rask og nesten eksponensiell etter neovaskularisering (Algire GH, et al., Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Nati. Cancer Inst., 6:73-85, 1945). (2) Tumor som dyrkes i isolerte perfunderte organer der blodårer ikke prolifererer, blir begrenset til 1-2 mm<3>, men øker raskt til mer >1000 ganger dette volum når de blir transplantert til mus og blir neovaskularisert. (Folkman J, et al.. Tumor behavior in isolated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thy-roid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164-491-502, 1966). (3) Tumorvekst i den avaskulære hornhinne foregår langsomt og med en lineær hastighet, men slår over til eksponensiell vekst etter neovaskularisering. (Gimbrone, M.A., Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Nati. Cancer Institute 52:41-427, 1974). (4) Tumorer fordelt i den vandige væske i forkammeret i kaninøye forblir levedyktige, uten blodårer og begrenset i størrelse til <1 mm<3>. Med en gang de blir implantert på regnbuehinnens vaskulære underlag, blir de neovaskularisert og vokser raskt, slik at de innen to uker oppnår 16000 ganger større volum enn originalt. (Gimbrone M.A. Jr. et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136:261-276). {5) Når tumorer blir implantert på kyllingsfosterets cho-rioallantoinmembran, vokser de langsomt i løpet av en avaskulær- fase på >72 timer, uten å overstige en gjennom-snittsdiameter på 0,93 ± 0,29 mm. Rask tumorekspansjon forekommer 24 timer etter at neovaskularisering er påbegynt, og etter dag 7 oppnår disse vaskulariserte tumorer en gjen-nomsnittlig diameter på 8,0 ± 2,5 mm. {Knighton, D., Avas-cular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35:347-356, 1977). (6) Vaskulære avstøpninger av metastaser i kaninlever viser heterogenitet i metastasenes dimensjoner, men viser en relativt enhetlig størrelsesgrense der vaskularisering er til stede. Tumorer er vanligvis avaskulære opptil 1 mm i diameter, men blir vaskularisert på nytt over denne diameter (Lien, W., et al., The Blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused sili-cone rubber. Surgery 68:334-340,1970). (7) I transgene mus som utvikler karsinom i beta-cellene i de pankreatiske øyer, er prevaskulære hyperplastiske små øyer begrenset i størrelse til <1 mm. Ved 6-7 ukers alder blir 4-10 % av øyene vaskularisert på nytt, og fra disse øyene vokser det store vaskulariserte tumorer som er mer enn 1000 ganger volumet av de prevaskulære øyer. (Folkman, J., et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339:58-61, 1989).

{8) At spesifikt antistoff mot VEGF {vaskulær endotel-vekstfaktor) reduserer tetthet av mikroblodårer og fremkaller "signifikant eller dramatisk" hemming av vekst i tre humane tumorer som er avhengig av VEGF som deres eneste angiogenesemediator (i nakne mus). Antistoffet hemmer ikke vekst av tumorcellene in vitro. {Kim>

K.J. et al./ Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362:841-844, 1993). (9) Anti-bFGF monoklonalt antistoff fremkaller 70 % hemming av vekst i en musetumor som er avhengig av sekresjon av bFGF som dens eneste angiogenesemediator. Antistoffet hemmer ikke vekst av tumorcellene in vitro. {Hori, A. et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutraliz-ing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51:6180-618 4, 1991). (10) Intraperitoneal injeksjon av bFGF forsterker vekst i en primærtumor og dens metastaser ved å stimulere vekst av kapillære endotelceller i tumoren. Tumorcellene mangler i seg selv reseptorer for bFGF, og bFGF er ikke et mitogen for tumorcellene in vitro. {Gross, JL., et al., Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF, Proe. Amer. Assoc. Canc. Res. 31:79,1990).

{11) Fn spesifikk angiogeneseinhibitor (AGM-1470) hemmer tumorvekst og metastaser in vivo, men er mye mindre aktiv i å hemme tumorcelleproliferasjon in vitro. Denne inhibitor hemmer vaskulær endotelcelleproliferasjon med halvmaksimal effekt ved en konsentrasjon som er fire logaritmer lavere

enn den hemmer tumorcelleproliferasjonen. (Ingber, D. et al./ Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48:555-557, 1990). Det er også indirekte klinisk evidens for at tumorvekst er avhengig av angiogenese. (12) Humane retinoblastomer som har spredt seg til glassle-gemet, utvikler seg til avaskulære kuler som er begrenset til mindre enn 1 mm3 til tross for det faktum at de er levedyktige og inkorporerer <3>H-thymidin (når de fjernes fra et øye som er operert ut, og analysert in vitro). (13) Kreft i eggstokkene sprer seg til bukhinnen som små avaskulære hvite utspredninger (1-3 mm3) . Disse implantater blir sjeldent større dersom ikke ett eller flere av dem blir neovaskularisert. (14) Intensiteten av neovaskularisering i brystkreft (Weidner, N. et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991, og Weidner, N. et al., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J. Nati. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992) og i prostatacancer (Weidner, N., Carroll, PR Flax, J. Blumenfeld, W. Folkman, J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2):401-409, 1993) korre-lerer godt med risiko for fremtidig spredning. (15) Metastase fra humant melanom fra hud er sjelden for neovaskularisering. Begynnelse av neovaskularisering fører til øket tykkelse av lesjonen og en økende risiko for spredning. (Srivastava, A., et al., The prognostic signifi-cance of tumor vascularity in intermediate thickness (0,76-4,0 mm thick) skin melanoma. Araer J. Pathol. 133:419-423, 1988). (16) I urinblærecancer er urin-nivået av et angiogent peptid, bFGF, en mer følsom indikator på status og utbredelse av sykdommen enn cytologisk undersøkelse. (Nguyen, M., et al., Elevated levels of an angiogenic peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients, J. Nati. Cancer Inst. 85:241-242, 1993).

Det er således klart at angiogenese spiller en viktig rolle i spredning av en cancer. Dersom denne angiogene aktivitet kunne bli eliminert eller undertrykket, eller på annen måte kontrollert og modueeet, ville tumore, selv om den ville være til stede, ikke kunne vokse. Ved aktiv sykdom kunne prevensjon av angiogenese hindre skaden som fremkalles av invasjon av det nye mikrovaskulære system. Behandlinger rettet mot å kontrollere de angiogene prosesser kunne føre til helbredelse eller lindring av disse sykdommer.

Det som derfor trengs er en blanding som kan hemme endotelcelleproliferasjon slik som den uønskede vekst av blodårer, spesielt inn i tumorer. Det er også behov for en fremgangsmåte for å påvise, måle og å lokalisere blandingen. Blandingen skulle ha evne til å overvinne aktiviteten til endo-gene vekstfaktorer i tumorer for spredning, og forhindre dannelsen av kapillærer i tumorene, for derved å hemme vekst av tumorene. Blandingen, fragmenter av blandingen, og antistoffer som er spesifikke for blandingen, skulle også ha evne til å modulere dannelsen av kapillærer i andre angiogene prosesser, slik som sårtilheling og reproduksjon. Blandingen for å hemme angiogenese skulle fortrinnsvis være nontoksisk, og produsere få bivirkninger. Det er også behov for en fremgangsmåte for å påvise, måle og lokalisere bindingssetene for blandingen, samt også setene for biosyntese av blandingen. Blandingen og fragmenter av blandingen skulle ha evne til å bli bundet til andre molekyler både for radioaktive og ikke-radioaktive merkingsformål.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåter for å benytte den isolerte Kringle 5 region i plasminogen for å hemme endotelproliferasjonsaktivitet. Det isolerte Kringle 5 peptidfragment med inhibitorisk aktivitet, omfatter en ca. åtti (80) aminosyresekvens som består av

CM FGNGKGYRGKRATTVT GT PCQDWAAQE PHRH SIFT P

ETN PRAGLEKNYCRN P DG DVGG PWCYTTN PRKLY DYC

DVPQ SEKV. ID. NR: 1

der

Det aktuelle endotelcelleproliferasjonspeptid tilsvarer et peptidfragment produsert fra humant plasminogen som begynner på ca. aminosyre 462 i humant plasminogen og strekker seg ca. 80 aminosyrer.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåter for in vitro å påvise nærvær eller fravær av det hemmende peptid i kroppsvæsker. I tillegg kan det inhibitoriske peptid bli benyttet i forbindelse med in vitro prolifererende endotelcellekulturer for å teste med henblikk på forbindelser som demper de inhibitoriske virkninger av peptidet - dvs. å lete etter vekstfaktorer eller andre forbindelser som har evne til å reversere eller overvinne inhihibisjo-nen av endotelcelleproliferasjon.

Det er således et mål for den foreliggende oppfinnelse å frembringe en blanding som angitt i krav 27 og som omfatter en endotelcelleproliferasjonsinhibitor som omfatter et ca. 80 aminosyre peptidfragment fra humant plasminogen som i hovedsak tilsvarer Kringle 5 regionen som begynner på aminosyre 462 i humant plasminogen.

Det er videre ytterligere et formål for den foreliggende oppfinnelse å frembringe en diagnostisk eller prognostisk in vitro fremgangsmåte og et reagenssett for å påvise nærvær og mengde av inhibitoren i en kroppsvæske eller i et vev.

Det er videre et annet mål for den foreliggende oppfinnelse å frembringe en blanding for å behandle sykdommer og prosesser som er mediert av angiogenese, deriblant, men ikke begrenset til, hemangiom, faste svulster, leukemi, metastase, telangiektasi, psoriasis, selerodermi, pyogent granu-lom, myokard angiogenese, plaque neovaskularisering, kollateralarer i kransarterier, kollateralarer i hjernearterier, arteriovenose misdannelser, angiogenese i ischemisk ekstre-mitet, sykdommer i hornhinnen, rubeose, neovaskulært glaukom, diabetisk netthinnesykdom, retrolental fibroplasi, leddbetennelse, diabetisk neovaskularisering, macula degenerasjon, sårtilheling, mavesår, sykdommer relatert til Helicobacter, brudd, keloider, vaskulogenese, hematopoiese, eggløsning, menstruasjon, morkakedannelse, og katteklorefe-ber.

Det er annet formål for den foreliggende oppfinnelse å frembringe en blanding for å behandle eller å undertrykke vekst hos en cancer.

Proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å påvise og måle nærvær av et antistoff som er spesifikt for proteinet i en kroppsvæske.

Det er et annet mål for den foreliggende oppfinnelse å frembringe en blanding til bruk i å visualisere og kvanti-tere seter der inhibitor binder in vivo og in vitro.

Det er videre et annet mål for den foreliggende oppfinnelse å frembringe en blanding til bruk i å påvise og kvantifisere inhibitor biosyntese.

Ytterligere et annet mål for den foreliggende oppfinnelse er å frembringe en blanding som omfatter endotelcelleproliferasjonsinhibitoren fra den foreliggende oppfinnelse eller inhibitorpeptidfragment koblet til et cytotoksisk middel.

Disse og andre mål, egenskaper og fordeler ved den foreliggende oppfinnelse vil bli tydelige etter en oversikt av den følgende detaljerte beskrivelse av de klarlagte legem-liggjørelser og de vedlagte patentkrav.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 fremviser inhibisjon av endotelcelleproliferasjon som en prosent endring i celletall som funksjon av konsent-rasjonen av isolert Kringle 5 peptidfragment fra humant plasminogen tilsatt cellene. Figur 2 viser gelelektroforetisk analyse av en preparasjon av et Kringle 5 peptidfragment isolert fra humant plasminogen. Spor 1 er isolert Kringle 5, Spor 2 er molekylvekt standard markører. Figur 3 viser en aminosyre-sammenligning mellom Kringle-regionene 1, 2, 3, 4 og 5 fra humant plasminogen (SEKV. ID. NR:2-6). Figur 4 viser den anti-endotelcelleproliferasjonsaktivitet til humant plasminogen Kringle 5, med og uten aminokarbon-syre (AMCHA) som demonstrerer at lysinbindingssetene ikke var ansvarlige for den anti-endotelcelleproliferasjonsaktivitet i Kringle 5. Figur 5 viser den inhibitoriske effekt av rekombinant Kringle 5 på bovin endotelcelleproliferasjon.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse blir blandinger fremvist som er effektive for å hemme endotelcelleproliferasjon, modulasjon av angiogenese og hemming av uønsket angiogense, spesielt angiogenese som er relatert til tumorvekst. Proteinet som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer en protein-endotelcelleproliferasjoninhibitor, som er karakterisert som en ca. 80 aminosyrers sekvens avledet fra humant plasminogen som Kringle 5. Aminosyresekvensen til inhibitoren kan lett variere mellom ulike arter. Det skal forstås at antall aminosyrer i den aktive inhibitor kan variere og at alle tett homologe aminosyresekvenser som har endotelin-hibisjonsaktivitet blir vurdert som inkludert i den foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer blandinger for å behandle sykdommer og prosesser som medieres av uønsket og ukontrollert epitelcelleproliferasjon, slik som angiogenese, hvor blandingen inkluderer tilnærmet Kringle 5 fra humant plasminogen som har evne til å hemme endotelcelleproliferasjon i in vitro analyser. Det er ønskelig at det isolerte protein er minst ca. 80 % rent, mer ønskelig minst ca. 90 %, og enda mer ønskelig minst ca. 95 % rent. Den foreliggende oppfinnelse er spesielt hensiktsmessig for å behandle eller for å undertrykke veksten av svulster. Tilfør-sel av inhibitor til et menneske eller dyr med prevaskula-riserte metastaserte svulster hjelper å hindre vekst eller ekspansjon av disse svulster.

Peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan merkes med isotop eller med andre molekyler eller proteiner til bruk i påvisning og visualisering av inhibitor-bindingssetene med teknikker som inkluderer, men ikke er begrenset til, positron-emisjons tomografi, autoradiografi, strømningscyto-metri, radioreseptor-bindingsanalyser og immunohistokjemi.

Disse inhibitorpeptider fungerer også som agonister og antagonister på inhibitor-reseptoren, og forsterker derved eller blokker den biologiske aktivitet til endotelcelleproliferasjonsinhibitoren. Slike peptider blir benyttet i rensing av reseptormolekylene som har evne til spesifikt å binde til inhibitoren.

Peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli kombinert med farmasøytisk akseptable eksipienter, og eventuelle langsomt-frisettings forbindelser eller blandinger, slik som biodegraderbare polymerer og matriser, for å danne terapeutiske blandinger.

Mer spesifikt inkluderer den foreliggende oppfinnelse blandinger for påvisning og behandling av sykdommer og prosesser som medieres av eller er assosiert med endotelcelleproliferasjon, slik som angiogenese. Det isolerte Kringle 5 peptidfragment med inhibitorisk aktivitet omfatter en ca. åtti (80) aminosyresekvens bestående av:

CMFGNGKGYRGKRATTVTGT PCQDWAAQE PHRHSIFT P

E TN P RAGLEKNYCRN P DG DVGG PWCYT T N PRKLY DYC DVPQ

SEKV. ID. NR:1

der

Inhibitoren kan isoleres fra plasminogener, slik som humant plasminogen, eller bli syntetisert med kjemiske eller biologiske fremgangsmåter {for eksempel cellekultur, rekombinant genekspresjon, peptidsyntese, og in vitro enzymatisk katalyse av plasminogen eller plasmid for å frembringe aktiv inhibitor).

Rekombinante teknikker inkluderer geneamplifikasjon fra DNA-kilder ved bruk av polymerase-kjedereaksjonen (PCR), og geneamplifikasjon fra RNA-kilder ved bruk av revers transkriptase/PCR.

Begrepet "i hovedsak lik" eller "i hovedsak homolog" når benyttet i referanse til inhibitor-aminosyre og nukleinsy-resekvensene, betyr en aminosyresekvens som har endotelcel-leproliferasjonsinhibisjonsaktivitet og med en molekylvekt på ca. 14 kD, som også har en høy grad av sekvenshomologi tit proteinet som har den spesifikke N-terminale aminosyresekvens som blir beskrevet her, eller en nukleinsyresekvens som koder for en endotelcelleproliferasjoninhibitor med en molekylvekt på ca. 14 kD og en høy grad av homologi til aminosyren som har den spesifikke N-terminael aminosyresekvens som blir beskrevet her.

En høy grad av homologi betyr minst ca. 80 % aminosyrehomologi, ønskelig minst 90 % aminosyrehomologi, og mer ønskelig minst ca. 95 % aminosyrehomologi. Begrepet "endotelin-hibisjonsaktivitet" som benyttet her, betyr evnen et molekyl har i å hemme angiogenese generelt, og for eksempel i å hemme vekst av bovine kapillære endotelceller i kultur i nærvær av fibroblast vekstfaktor.

Påvisning av det aktuelle protein i kroppsvæsker og i vev kan også brukes med henblikk på diagnose eller prognose av sykdommer slik som cancer og kan også brukes til påvisning av inhibitorbindingsseter og reseptorer i celler og vev, og kan benyttes til å påvise sykdommer så som leddbetennelse og tumorer.

Generegulering av den aktuelle inhibitor kan oppnås ved å

tilføre forbindelser som binder til inhibitorens gen, eller kontrollere regioner som er assosiert med genet, eller dets tilsvarende RNA-transkript for å modifisere transkripsjons-eller translasjons-hastighet. I tillegg kan celler som er

transfektert med en DNA-sekvens som koder for inhibitoren bli tilført til en pasient for å gi en in vivo inhibitor-kilde. For eksempel celler bli transfektert med en vektor som inneholder en nukleinsyresekvens som koder for inhibitoren.

Begrepet "vektor" som benyttet her betyr en bærer som kan inneholde eller assosierte med spesifikke nukleinsyresekvenser, som funksjonerer i å transportere de spesifikke nukleinsyresekvenser inn i en celle. Eksempler på vektorer inkluderer plasmider og infeksiøse mikroorganismer, slik som virus, eller ikke-virusvektorer slik som ligand-DNA-konjugater, liposomer, lipid-DNA-komplekser. Det kan være ønskelig at et rekombinant DNA-molekyl som omfatter en endotelcelleproliferasjonsinhibitor DNA-sekvens blir opera-tivt koblet til en ekspresjons-kontrollsekvens for å danne en ekspresjonsvektor som har evne til å uttrykke inhibitoren. De transfekterte celler kan være celler avledet fra pasientens normalvev, pasientens syke vev, eller kan være celler som ikke er fra pasienten.

For eksempel kan tumorceller som er fjernet fra en pasient, bli transfektert med en vektor som har evne til å uttrykke det aktuelle inhibitorproteinet, og bli introdusert tilbake inn i pasienten. De transfekterte tumorceller produserer nivåer av inhibitor i pasienten som hemmer veksten av tumor. Pasienter kan være mennesker eller ikke-humane dyr. Ytterligere kan inhibitor-DNA bli direkte injisert, uten hjelp av en bærer inn i en pasient. Spesielt kan inhibitor DNA bli injisert inn i hud, muskel eller blod.

Inhibitorekspresjon kan vedvare i en lang tid, eller inhibitor-DNA kan tilfores periodisk for å vedlikeholde et øns-ket nivå av inhibitorproteinet i cellene, vevet, organet eller biologisk væske.

Selv om vi ikke ønsker å bli begrenset av den følgende hypotese, er det antatt at når en tumor blir angiogen frigjør den ett eller flere angiogene peptider (f.eks. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF, etc), som virker lokalt, som er rettet mot endotel i området rundt en primær tumor fra en ekstra-vaskulær retning, og som ikke sirkulerer i blod (eller sirkulerer med en kort halveringstid). Disse angiogene peptider må produseres i en mengde som er tilstrekkelig til å overvinne endotelcelleinhibitoreffekten (angiogeneseinhibi-torer) for at en primærtumor skal fortsette å ekspandere dens populasjon. Med en gang en slik primærtumor vokser effektivt fortsetter den å frigjøre endotelcelleinhibitorer inn i sirkulasjonen. Ifølge denne hypotese virker disse in-hibitorer over avstand, langt vekk fra primærtumoren, de er rettet mot kapillærendotel til en metastase fra en intra-vaskulær retning, og de fortsetter å sirkulere. Ved det tidspunkt der en fjernmetastase kan påbegynne angiogenese, kan således kapillærendotelet i de omliggende vev bli hemmet av en ankommende inhibitor.

Produksjon av den aktuelle endotelcelleproliferasjonsinhibitoren kan bli oppnådd ved å bruke lignende fremgangsmåter ved bruk av rekombinante DNA fremgangsmåter som inkluderer trinnene (1) identifikasjon og rensing av inhibitoren, (2) bestemmelse av den N-terminale aminosyresekvens av den rensede inhibitor, (3) syntetisk produksjon av 5' og 3' DNA oligonukleotid primere for inhibitorsekvensen, (4) amplifi-kasjon av inhibitor-genesekvensen ved hjelp av polymerase, (5) innføring av den amplifiserte sekvens inn i en passende vektor, slik som en ekspresjonsvektor, (6) innføring av genet som inneholder vektoren inn i en mikroorganisme eller et annet ekspresjonssystem som har evne til å uttrykke in-hibitorgenet, og (7) isolasjon av den rekombinante produ-serte inhibitor. Passende vektorer inkluderer virus, bakte-rielle og eukaryote (slik som gjær) ekspresjonsvektorer. De beskrevne fremgangsmåter er beskrevet i større detalj i la-boratorie-håndbøker slik som "Molecular Cloning: A Labora-tory Manual" 2. utg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989.

Ytterligere en annen fremgangsmåte for å produsere den aktuelle inhibitoren eller biologisk aktive fragmenter av inhibitor, er ved bruk av peptidsyntese. Aminosyresekvensen til inhibitoren kan bli bestemt, for eksempel ved hjelp av automatisert peptid-sekvenseringsmetoder. Alternativt kan med en gang genet eller DNA-sekvensen som koder for inhibitoren er blitt isolert, for eksempel ved hjelp av frem-gangsmåtene som er beskrevet over, DNA-sekvensen bli bestemt ved hjelp av manuelle eller automatiserte sekvenseringsmetoder som er vel kjent i faget. Nukleinsyresekvensen gir videre informasjon vedrørende aminosyresekvensen.

Med en gang aminosyresekvensen til peptidet er kjent kan peptidfragmenter bli syntetisert med teknikker som er vel kjent i faget, eksemplifisert ved "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton and R.C. Shep-pard, IRI Press, Oxford, England. Multiple fragmenter kan syntetiseres som deretter blir koblet sammen for å danne større fragmenter. Disse syntetiske peptidfragmenter kan også bli laget med aminosyre-substitusjoner i spesifikke plasseringer for å analysere med henblikk på agonist- og antagonist-aktivitet in vitro og in vivo. Peptidfragmenter som har høyaffinitetsbinding til vev, kan benyttes for å isolere reseptorer som binder inhibitoren på affinitetssøy-ler.

Inhibitor er effektiv i behandling av sykdom eller prosesser, slik som angiogenese, som er mediert av eller involve-rer endotelcelleproliferasjon. De angiogenesemedierte sykdommer kan være faste tumorer, blodbårne tumorer, slik som leukemier, tumormetastaser, godartede tumorer, for eksempel hemangiomer, akustiske neurinomer, neurofibromer, trakomer og pyogene granulomer, kronisk leddgikt, psoriasis, angiogene øyesykdommer, for eksempel diabetisk retthinnesykdom, prematur nettinnesykdom, macula degenerasjon, avstøtning av hornhinnetransplantat, neovaskulært glaukom, retrolentai fibroplasi, rubeose, Osler-Webber syndrom, myokard angiogenese, plaque neovaskularisering, telangiektasi, leddsykdom hos blødere, angiofibrom og sårgranulering.

Inhibitoren er hensiktsmessig i behandling av sykdommer med eksessiv eller unormal stimulering av endotelceller. Disse sykdommene kan være termadhesjoner, aterosklerose, sklero-dermi og hypertrofiske arr, dvs. keloider. Inhibitoren kan benyttes som et svangerskaps-prevensjonsmiddel ved å hindre vaskularisering som kreves for at embryo skal implanteres i livmoren. Inhibitoren er hensiktsmessig i behandling av sykdommer som har angiogenese som en patologisk konsekvens, slik som kattekloresykdom ( Rochele minalia quintosa) og mavesår ( Helicobacfer pylori).

De syntetiske peptidfragmentene fra inhibitoren har en rekke ulike bruksområder. Peptidet som binder til reseptor som har evne til å binde inhibitoren med høy spesifisitet og affinitet, kan radioaktivt merkes og bli benyttet for visualisering og kvantitering av bindingsseter ved hjelp av autoradiografiske og membran-bindingsmetoder.

I tillegg tillater radioaktiv merking av inhibitor eller peptidfragmenter fra inhibitoren med isotoper med kort le-vetid at visualisering av reseptor-bindingsseter in vivo oppnås ved hjelp av positron emisjons-tomografi eller andre moderne radiografiske teknikker for å kunne lokalisere tumorer med inhibitor-bindingsseter.

Cytotoksiske midler, slik som ricin, kan kobles til inhibitoren, og høyaffinitets-peptidfragmenter av inhibitoren, noe som derved gir et redskap for ødeleggelse av celler som binder inhibitoren. Disse cellene kan finnes i mange områder, deriblant, men ikke begrenset til, mikrometastaser og primærtumorer. Peptider som kobles til cytotoksiske midler blir infundert på en måte planlagt for å maksimalisere levering til det ønskede område. For eksempel kan levering oppnås ved hjelp av en kanyle inn i blodårer som leverer blod til målområdet eller direkte inn i målet. Slike midler kan også bli levert på en kontrollert måte ved hjelp av osmotiske pumper koblet til infusjonskanyler. En kombinasjon av inhibitorantagonister kan appliseres sammen med stimula-torer av angiogenese for å øke vaskulering av vev. Dette terapeutiske opplegg gir en effektiv måte for ødelegge me-tastatisk kreft.

Inhibitoren kan benyttes i kombinasjon med andre blandinger og prosedyrer for behandling av sykdommer. For eksempel kan en tumor bli konvensjonelt behandlet med kirurgi, stråling eller kjemoterapi kombinert med inhibitoren, og inhibitoren kan deretter bli tilført pasienten for å forlenge mikrome-tastasenes hvilefase og for å stabilisere og hemme veksten av enhver rest av primærtumor. Ytterligere kan inhibitoren, fragmenter av inhibitoren, inhibitor-spesifikke antisera, inhibitor-reseptoragonister og antagonister eller kombina-sjoner av disse, bli

kombinert med farmasøytisk akseptable eksipienter, og eventuelt langsomtfrisettende matriser, slik som biodegraderbare polymerer, for å danne terapeutiske blandinger.

En langsomt-frisettende matriks, som benyttet her, er en matriks som er laget av materialer, vanligvis polymerer, som er degraderbare ved enzymatisk eller syre/base-hydrolyse eller ved å løses opp. Når den føres inn i krop-pen blir matrisen utsatt for reaksjoner av enzymer og kroppsvæsker. Den langsomt-frisettende matrise er fortrinnsvis valgt fra biokompatible materialer slik som liposomer, polylaktider (polymelkesyre), polyglykolid (polymer av glykolsyre), polylaktid koglykolid (kopolymerer av melkesyre og glykolsyre), polyanhydrider, poly(orto)estere, polypeptider, hyaluronsyre, kollagen, kondroitin-sulfat, karboksylsyrer, fettsyrer, fosfolipider, polysakkarider, nukleinsyrer, polyaminosyrer, aminosyrer, så som fenylala-nin, tyrosin, isoleucin, polynukleotider, polyvinylpropy-len, polyvinylpyrrolidon og silikon. En foretrukket bio-degraderbar matrise er en matrise laget enten av polylaktid, polyglykolid eller polylaktid ko-glykolid (kopolymerer av melkesyre og glykolsyre).

Den angiogenese-modulerende farmasøytiske blanding fra den foreliggende oppfinnelse som angitt i krav 27, kan være et faststoff, en væske eller en aerosol, og kan tilføres ved hjelp av enhver kjent tilføringsvei. Eksempler på faste terapeutiske blandinger inkluderer piller, kremer og implanterbare doseenheter. Pillene kan tilføres oralt, de terapeutiske kremer kan bli tilført lokalt. De implanterbare doseenheter kan tilføres lokalt, for eksempel i et tumorom-råde, eller kan implanteres for systemisk frisetting av den terapeutiske angiogenese-modulerende blanding, for eksempel subkutant. Eksempler på væskeblandinger inkluderer formuleringer som er tilpasset til subkutant injeksjon, intrave-nøs, intraarteriell injeksjon, og formuleringer for lokal og intraokulær tilførsel. Eksempler på aerosolformulering inkluderer inhalasjonsformulering for tilførsel til lunge-ne.

Det aktuelle inhibitorprotein kan også benyttes for å produsere antistoff som er spesifikke for inhibitoren og dens reseptor. Antistoffene kan være enten polyklonale eller monoklonale antistoff. Disse antistoff som spesifikt binder til inhibitoren eller inhibitor-reseptorene, kan benyttes i diagnostiske metoder og reagenssett som er velkjent for de med vanlig kompetanse i faget, for å påvise eller kvantifisere inhibitornivåer eller inhibitor-reseptornivåer i en kroppsvæske eller et vev. Resultater fra disse analyser kan benyttes for å diagnostisere eller forutsi forekomst eller tilbakefall av en cancer eller av andre angiogent medierte sykdommer.

Inhibitoren kan også benyttes for å utvikle en diagnostisk fremgangsmåte og reagenssett for å påvise og kvantifisere antistoff som har evne til å binde inhibitoren. Disse reagenssett ville tillate påvisning av sirkulerende inhibitor-spesifikke antistoff. Pasienter som har slike sirkulerende anti-inhibitor-antistoff kan ha større tendens til å utvikle multiple tumorer og cancere, og kan ha større tendens til å ha tilbakefall av cancer etter behandling eller peri-oder med remisjon. Fab-fragmenter fra disse antistoff kan benyttes som antigen for å produsere anti-inhibitor-spesifikke Fab-fragment antisera som kan benyttes for å nøytralisere anti-inhibitor-antistoff. En slik fremgangsmåte ville hemme fjerningen av sirkulerende inhibitor ved hjelp av anti-inhibitor-antistoff, noe som effektivt ville øke nivåer av sirkulerende inhibitor.

Proteinene og proteinfragmentene med inhibitoraktivitet som er beskrevet over, kan frembringes som isolerte og i hovedsak rensede proteiner og proteinfragmenter i farmasøytisk akseptable formuleringer ved hjelp av formuleringsmetoder som er kjent av de med normal kunnskap i faget. Disse formuleringer kan tilføres via standardveier. Generelt kan kombinasjonene bli tilført ved topisk, transdermal, intraperitoneal, intrakranial, intracerebroventrikulær, intrace-rebral, intravaginal, intrauterin, oral, rektal eller parenteral (f.eks, intravenøs, intraspinal, subkutan eller intramuskulær) vei. I tillegg kan inhibitoren bli inkorporert i biodegraderbare polymerer, noe som tillater vedvarende frisetting av forbindelsen, der polymerene blir implantert i nærheten av der levering av medikament er øns-ket, for eksempel på tumorsetet eller implantert slik at inhibitoren blir langsomt frigitt systemisk. Osmotiske mi-nipumper kan også bli benyttet for å gi kontrollert frisetting av høye konsentrasjoner av inhibitor via kanyler rett i de relevante områder, slik som direkte inn i en metasta-tisk vekst eller inn i blodåre-tilførsel til denne tumor. De biodegraderbare polymerer og deres bruk er for eksempel beskrevet i detalj i Brem et al., J. Neurosurg, 74:441-446

(1991), som herved blir inkorporert som referanse i sin helhet. Dosenivå av den aktuelle inhibitor vil avhenge av sykdoms-tilstanden eller situasjonen som blir behandlet og andre kliniske faktorer slik som kroppsvekt og tilstand til men-nesket eller dyret og tilførselsveien av

forbindelsen. For å behandle mennesker eller dyr kan mellom ca. 0,5 mg/kg til 500 mg/kg av inhibitoren bli tilført. Avhengig av halveringstiden på inhibitoren i det spesifikke dyr eller menneske, kan inhibitoren tilføres mellom flere ganger om dagen og ned til en gang i uken. Det skal forstås at den foreliggende oppfinnelse har applikasjoner til både human og veterinær bruk.

Inhibitorformuleringene inkluderer de som er passende for oral, rektal, oftalmologisk (deriblant intravitreal eller intracameral), nasal, lokal (deriblant buccal og subling-val), intrauterin, vaginal eller parenteral (deriblant subkutan, intraperitoneal, intramuskulær, intravenøs, intra-dermal, intrakranial, intratrakeal og epidural) tilførsel. Inhibitorformuleringene kan med fordel bli presentert i en-hetsdoseform og kan prepareres ved hjelp av konvensjonelle farmasøytiske teknikker. Slike teknikker inkluderer trinnet der den aktive ingrediens og den farmasøytiske bærer eller eksipient bringes i kontakt med hverandre. Generelt blir formuleringene preparert ved at den aktive ingrediens bringes i nær og intim assosiasjon med flytende bærere eller finfordelte faste bærere, eller begge, og deretter om det er nødvendig, forming av produktet.

Formuleringer som er passende for parenteral tilførsel inkluderer vandige og ikke-vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksydanter, buffere, bakteriostater og løsningsmidler som fører til at formuleringen er isotont med mottagerens blod, og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderende midler og for-tykkende midler. Formuleringene kan bli presentert i en-hetsdose eller multidose pakninger, for eksempel lukkede ampuller og glass, og kan lagres i en frysetørket (lyofili-sert) tilstand som kun krever tilførsel av steril væskebæ-rer, for eksempel vann til injeksjoner, like før bruk. Im-proviserte injeksjonsløsninger og suspensjoner kan prepareres fra sterile pulvere, korn og tabletter av den type som er beskrevet tidligere.

Foretrukne enhetsdoseformuleringer av den tilførte ingrediens er de som inneholder en daglig dose eller enhet, en daglig deldose, eller en passende fraksjon av dette. Det må forstås at i tillegg til ingrediensené som spesielt er beskrevet over, kan formuleringene i den foreliggende oppfinnelse også inkludere andre midler som er vanlige i faget, med referanse til den relevante type formulering. Eventuelt kan cytotoksiske midler bli inkorporert eller på annen måte kombinert med inhibitorproteiner, eller biologisk funksjonelle peptidfragmenter fra inhibitoren, for å gi dobbel terapi til pasienten.

Angiogenese-inhibitoriske peptider kan syntetiseres i en standard mikrokjemisk fasilitet og renhet bli analysert med HPLC og massespektrofotometri. Peptidsyntese-fremgangsmåter, HPLC-rensing og massespektrofotometri er vanligvis kjent for de som er øvet i disse fagene. Inhibitorpeptider og inhibitor-reseptorpeptider kan også produseres rekombinant i E. coli eller gjær-ekspresjonssystemer, og renses med søylekromatografi.

Ulike peptidfragmenter fra det intakte inhibitormolekyl kan syntetiseres til bruk i en rekke applikasjoner som inkluderer, men ikke er begrenset til de følgende: som antigener for utvikling av spesifikke antisera, som agonister. og antagonister som er aktive ved inhibitor-bindingsseter, som peptider som skal kobles til eller benyttes i kombinasjon med cytotoksiske midler for målrettet avlivning av celler som binder inhibitor. Aminosyresekvensene som omfatter disse peptidene blir utvalgt på basis av deres posisjon på de ytre regioner av molekylet og er tilgjengelige for binding av antisera. Inhibitorens amino- og karboksyl-terminaler, samt midtregionen av molekylet, blir representert separat blant fragmentene som skal syntetiseres.

Disse peptidsekvensene blir sammenlignet med kjente sekvenser ved hjelp av proteinsekvens databaser slik som GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT, og PIR for å bestemme po-tensielle sekvenshomologier. Denne informasjon muliggjør eliminasjon av sekvenser som fremviser en høy grad av sekvenshomologi til andre molekyler, noe som øker potensialet for høy spesifisitet når man utvikler antisera, agonister og antagonister til inhibitoren.

Inhibitor og inhibitor-deriverte peptider kan kobles til andre molekyler ved hjelp av standard fremgangsmåter. Amino- og karboksyl-terminalene til inhibitoren inneholder begge tyrosin- og lysin-rester, og kan merkes med isotoper og på annen måte med mange teknikker, for eksempel radioaktiv merking ved hjelp av vanlige teknikker {tyrosinrester-chloramin T, jodogen, laktoperoksydase, lysinrester-Bolton-Hunter reagens). Disse koblingsteknikker er godt kjent for de som er øvet i faget. Alternativt kan tyrosin eller lysin bli lagt til fragmentene som ikke har disse rester, for å gjøre det lettere å merke reaktive amino- og hydroksyl-grupper på peptidet. Koblingsteknikken blir utvalgt på basis av de funksjonelle grupper som er tilgjengelige på ami-nosyrene, deriblant, men ikke begrenset til, amino, sulf-hydryl, karboksyl, amid, fenol og imidazol. Ulike reagenser benyttet for å fremkalle disse koblinger inkluderer bl.a. glutaraldehyd, diazotisert benzidin, karbodiimid og p-benzoquinon.

Inhibitorpeptider blir kjemisk koblet til isotoper, enzymer, bærerproteiner, cytotoksiske midler, fluorescerende molekyler, kjemiluminescente, bioluminescente og andre forbindelser med henblikk på en rekke applikasjoner. Koblings-reaksjonens effektivitet blir bestemt ved hjelp av ulike teknikker som passer for de ulike reaksjoner. For eksempel blir radioaktiv merking av et inhibitorpeptid med <125>l oppnådd ved hjelp av chloramin T og Na125l med høy spesifikk aktivitet. Reaksjonen blir avsluttet med natriummetabisul-fitt og blandingen blir avsaltet på engengssøyler. Det merkede peptid blir eluert fra søylen og fraksjoner blir samlet. Deler blir fjernet fra hver fraksjon og radioaktivitet blir målt i en gammateller. På denne måte blir det ikke-reagerte Na125l separert fra det merkede inhibitorpeptid. Peptidfraksjonene med den høyest spesifikke radioaktivitet blir lagret for videre bruk, slik som analyse av evnen til å binde til inhibitor-antisera.

En annen applikasjon av peptidkonjugering er for å produsere polyklonale antisera. For eksempel blir inhibitorpeptider som har lysinrester, koblet til renset bovint serumal-bumin ved hjelp av glutaraldehyd. Reaksjonens effektivitet blir bestemt ved å måle inkorporering av radioaktivt merket peptid. Ikke-reagert glutaraldehyd og peptid blir separert ved hjelp av dialyse. Konjugatet blir lagret for etterføl-gende bruk.

Antiserum spesifikt for inhibitor, inhibitoranaloger, peptidfragmenter av inhibitoren og inhibitor-reseptoren kan produseres. Etter peptidsyntese og rensing blir både monoklonale og polyklonale antisera produsert ved hjelp av vel etablerte teknikker som er kjent for de som er øvet i faget. For eksempel kan polyklonale antisera bli produsert i kaniner, sauer, geiter eller andre dyr. Inhibitorpeptider konjugert til et bærermolekyl, slik som bovint serumalbu-min, eller inhibitorproteinet selv, blir kombinert med en adjuvansblanding, emulsifisert og injisert subkutant i multiple steder på nakke, rygg, flanker og noen ganger i fot-potene. Forsterkerinjeksjoner blir gjort med jevne mellom-rom, slik som hver annen til fjerde uke. Blodprøver blir foretatt ved hjelp av venepunksjon, for eksempel ved å bruke den marginale vene i kaninører etter dilatasjon, ca. 7-10 dager etter hver injeksjon. Blodprøvene biir tillatt å koagulere over natt ved 4°C og blir deretter sentrifugert på ca. 2400 x g ved 4e,C i ca. 0,5 timer. Serum blir fjernet, delt i småprøver og lagret ved 4°C for umiddelbar bruk eller ved -20 til -90°C for etterfølgende analyse.

Alle serumprøver fra dannelsen av polyklonale antisera eller mediaprøver fra produksjonen av monoklonale antisera, blir analysert for å bestemme antistoff-titer. Titer blir etablert på en rekke måter, for eksempel ved såkalte dot blots og tetthetsanalyser, og også med presipitasjon av radioaktivt merket peptid antistoffkomplekser ved hjelp av protein A, sekundære antisera, kald etanol eller aktivt kulldekstran etterfulgt av aktivitetsmåling med en gammateller. Antisera med den høyeste titer blir også renset på affinitetssøyler som er kommersielt tilgjengelige. Inhibitorpeptider blir koblet til gelen i affinitetssøylen. Anti-serumprøver blir sendt gjennom søylen og anti-inhibitor-antistoff forblir bundet til søylen. Disse antistoff blir deretter eluert, samlet og evaluert med henblikk på bestemmelse av titer og spesifisitet.

De høyeste titer inhibitor-spesifikke antisera blir testet for å etablere følgende: a) optimal antiserum-fortynning for høyest spesifikk binding av antigen og lavest ikke-spesifikk binding, b) evnen til å binde økende mengde av inhibitorpeptid i en standard konkurrerende kurve, c) po-tensiell kryssreaktivitet med relaterte peptider og proteiner fra relaterte dyrearter, d) evne til å påvise inhibitorpeptider i ekstrakter fra plasma, urin, vev og i cellekulturmedia.

Reagenssett for å måle inhibitor og inhibitor-reseptoren kan også utføres. Antisera som har den høyeste titer og spesifisitet og som kan påvise inhibitorpeptider i ekstrakter av plasma, urin, vev og i cellekulturmedia blir videre studert for å produsere reagenssett som er lett å bruke for rask, pålitelig, følsomme og spesifikke målinger og lokalisasjon av inhibitor. Disse reagenssett kan benytte de føl-gende teknikker: konkurrererende og ikke-konkurrerende analyser, radioimmunoanalyser, bioluminescens og kjemilumine-scens analyser, fluorometriske analyser, skiveanalyser, im-munoradiometriske analyser, dot blot analyser, enzym-koblede analyser deriblant ELISA, mikrotiterplater, anti stoff-dekkede striper eller dyppestrimler for raskt å kunne analysere urin eller blod, og immunocytokjemi. Området, sensitivitet, presisjon, pålitelighet, spesifisitet og re-produsibilitet av analysene blir etablert for hvert reagenssett. Intraanalyse og interanalysevariasjon blir etablert ved 20%, 50% og 80% punktene på standardkurvene av aktivitet eller fortrengning.

Et eksempel på et reagenssett som vanligvis brukes i forsk-ning og klinikk er et radioimmunoanalyse (RIA) reagenssett. Et inhibitor RIA blir beskrevet under. Etter vellykket radioaktiv jodinering og rensing av inhibitor eller inhibitorpeptid, blir antiserum som har det høyeste titer tilsatt i en rekke fortynninger til reagensrør som inneholder en relativt konstant mengde radioaktivitet, slik som 10.000 cpm., i et passende buffersystem. Andre rør inneholder buffer eller pre-immunserum for å bestemme den ikke-spesifikke binding. Etter inkubering ved 4<>C i 24 timer blir protein A tilsatt og tubene blir blandet, inkubert ved romtemperatur i 90 minutter og sentrifugert ved ca. 2000-2500 x g ved 4°C for å presipitere kompleksene av antistoff som er bundet til merket antigen. Supernatanten blir fjernet ved aspira-sjon og radioaktivitet i bunnfallet blir tellet i en gammateller. Antiseriumfortynning som binder ca. 10 til 40 % av det merkede peptid etter at den ikke-spesifikke binding trekkes fra, blir videre karakterisert.

Deretter blir en fortynningsrekke (ca. 0,1 pg ti 1 10 ng) av inhibitorpeptidet som ble benyttet for å produsere antiserum, evaluert ved å tilsette kjente mengder av peptidet til regensrør som inneholder radioaktivt merket peptid og antiserum. Etter en ytterligere inkubasjonsperiode, for eksempel 24 timer til 48 timer, blir protein A tilsatt og rø-rene blir sentrifugert, supernatanten blir fjernet og ra-dioaktiviteten i bunnfallet blir tellet. Graden av konkur-ranse mellom bindning av radioaktivt merket inhibitorpeptid og ikke-merket inhibitorpeptid (standard) gir en standard-kurve. En rekke konsentrasjoner av andre inhibitorpeptid-fragmenter, inhibitor fra ulike dyrearter, og homologe peptider, blir tilsatt til prøverørene for å karakterisere spesifisiteten av inhibitor-antiserum.

Ekstrakter av ulike vev, deriblant, men ikke begrenset til, primære og sekundære tumorer, Lewis lungekarsinom, kulturer av inhibitor-produserende teller, morkake, livmor og andre vev, slik som hjerne, lever og tarm, blir preparert. Etter fyrsetørking eller vakuumsentrifugering av vevsekstraktene, blir analysebuffer tilsatt og ulike prøvevolumer blir plas-sert i RIA reagensrørene. Ekstrakter av inhibitor-produserende celler produserer konkurransekurver som er pa-rallelle til standardkurven, mens ekstrakter av vev som ikke produserer inhibitor ikke konkurrerer vekk radioaktivt merket inhibitor fra antiserum. I tillegg blir ekstrakter av urin, plasma og cerebrospinalvæske fra dyr med Lewis lungekarsinom, tilsatt til prøverørene i økende mengde. Pa-rallelle konkurransekurver indikerer at inhibitoranalysen kan benyttes for å måle inhibitor i vev og kroppsvæsker.

Vevsekstrakter som inneholder inhibitor blir ytterligere karakterisert ved å utsette gelprøver til revers-fase HPLC. Eluatfraksjoner blir samlet, tørket ved vakuumsentrifugering, rekonstituert i RIA-buffer og analysert i inhibitor RIA. Den maksimale mengde av inhibitor immunreaktivitet blir lokalisert i fraksjonene som korresponderer til eiue-ringsposisjonen av inhibitor.

Analyse reagenssettet inkluderer instruksjoner, antiserum, inhibitor eller inhibitorpeptid, og muligens radioaktivt merket inhibitor og/eller reagenser for å presipitere bundet inhibitor-inhibitor antistoffkomplekser. Reagensettet er hensiktsmessig for å måle inhibitor i biologiske væsker og vevsekstrakter fra dyr og mennesker med og uten tumorer.

Et annet reagenssett blir benyttet for lokalisasjon av inhibitor i vev og teller. Dette inhibitor immunohistokjemi reagenssettet gir instruksjoner, inhibitor-antiserum og muligens blokkerende serum og sekundært antiserum koblet til et fluorescerende molekyl, slik som fluorescein isotiocya-nat, eller et annet reagens som benyttes for å visualisere det primære antiserum. Immunohistokjemiteknikker er velkjent for de som er øvet i faget. Dette inhibitor immunohistokjemi reagenssett tillater lokalisasjonen av inhibitor i vevssnitt og i dyrkede celler ved hjelp av både lysmikroskop og elektronmikroskopi. Det benyttes for både forsknings og kliniske formål. For eksempel kan tumorer bli biopsert eller samlet og vevssnitt bli kuttet med en mikrotom for å studere områdene der inhibitor produseres. Slik informasjon er hensiktsmessig både for diagnostiske og muligens terapeutiske formål i å påvise og behandle cancer. En annen metode for å visualisere lokalisasjon av inhibitor biosyntese inkluderer radioaktiv merking av nukleinsyrer til bruk i in situ hybridisering for å probe med henblikk på inhibitor messenger RNA. På samme måte kan inhibitor-reseptoren bli lokalisert, visualisert og kvantitert med immunohistokjemiske teknikker.

Denne oppfinnelse er videre illustrert ved hjelp av det følgende eksempel.

EKSEMPEL 1

DEMONSTRASJON AV ENDOTELCELLEPROLIFERASJONS-INHIBITORAKTIVITET AV KRINGLE 5 FRA HUMANT PLASMINOGEN

Kilde: humant plasminogen blir fordøyet med passende enzymer for å fremskaffe et Kringle 5 fragment. Peptidfragmen-tet blir isolert og renset med standard protein og peptid-rensingsmetoder som er velkjent for de som er øvet i faget. Renhetsgraden til det isolerte Kringle 5 blir demonstrert i Figur 2, som viser resultatene etter å ha separert peptid-preparatet ved hjelp av gelelektroforese.

Analyse: Endotelcelleinhibitorisk aktivitet ble analysert

ved hjelp av inhibisjon av DNA-syntese ([metyl-H3] thymidin-inkorporering) i bovine kapillære endotelceller. Kapillære endotelceller ble preparert fra bovine binyrer og dyrket på gelatin-dekkede 48 brønns mikrotiterplater.

Varierende mengde av isolert Kringle 5 ble tilsatt til de dyrkede celler og endringen i antall celler ble bestemt. Prosentendringen i celletall er plottet som en funksjon av mengde av Kringle 5 som ble tilsatt til kulturene for å frembringe den grafiske kurve i Figur 1.

Figur 3 viser en sammenligning av lignende 80 aminosyresekvenser avledet fra Kringle-regionene 1, 2, 3, 4 og 5 fra humant plasminogen.

Claims (33)

1. Fremgangsmåte for å hemme endotelcelleproliferasjon in vitro, karakterisert ved at den omfatter tilfør-sel til en endotelcelle av en effektiv mengde av et protein som har en aminosyresekvens fra et isolert Kringle 5 peptid fra et plasminogen-molekyl.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet omfatter ca. 80 aminosyrer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet har en molekyl vekt på ca. 14 kD.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at plasminogenet er humant plasminogen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID. NR: 1.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID. NR: 6.

7. Anvendelse av et protein med en aminosyresekvens fra et isolert Kringle 5 paptid fra et plasminogen-molekyl ved fremstilling av et medikament som er egnet til behandling av en angiogenese-mediert sykdom.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor proteinet proteinet omfatter ca. 80 aminosyrer.

9. Anvendelse ifølge krav 7, hvor proteinet har en molekylvekt på ca. 14 kD.

10. Anvendelse ifølge krav 7, hvor plasminogenet er humant plasminogen.

11. Anvendelse ifølge krav 7, hvor proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID. NR: 1.

12. Anvendelse ifølge krav 7, hvor proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID. NR: 6.

13. Anvendelse ifølge krav 7, hvor proteinet har evnen til å hemme endotelcelleproliferasjon.

14. Anvendelse ifølge krav 7, hvor individet er et menneske.

15. Anvendelse ifølge krav 7, hvor den angiogenesemedierte sykdom er cancer.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor canceren er en fast tumor.

17. Anvendelse av et protein med en aminosyresekvense fra et isolert Kringle 5 peptid fra et plasminogen-molekyl ved fremstilling av et medikament som er egnet til å hemme en-dotelcelleprolif erasjon i et individ.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor proteinet omfatter ca.

80 aminosyrer.

19. Anvendelse ifølge krav 17, hvor proteinet har en molekylvekt på ca. 14 kD.

20. Anvendelse ifølge krav 17, hvor plasminogenet er humant plasminogen.

21. Anvendelse ifølge krav 17, hvor proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID. NR: 6.

22. Anvendelse ifølge krav 17, hvor proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID. NR: 1.

23. Anvendelse ifølge krav 17, hvor individet er et menneske .

24. Anvendelse ifølge krav 17, hvor sykdommen er en angiogene se -mediert sykdom.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvor den angiogenesemedierte sykdom er cancer.

26. Anvendelse ifølge krav 25, hvor canceren er en fast tumor.

27. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter en en-dotelcelleproliferasjons-hemmende mengde av et protein som har en aminosyresekvens fra et isolert Kringle 5 peptid fra et plasminogenmolekyl og en farmasøytisk akseptabel bærer.

28. Farmasøytisk blanding ifølge krav 27, karakterisert ved at proteinet omfatter ca. 80 aminosyrer.

29. Farmasøytisk blanding ifølge krav 27, karakterisert ved at proteinet har en molekyl vekt på ca. 14 kD.

30. Farmasøytisk blanding ifølge krav 27, karakterisert ved at plasminogenet er humant plasminogen.^

31. Farmasøytisk blanding ifølge krav 27, karakterisert ved at proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID.

Nr: 6.

33. Farmasøytisk blanding ifølge krav 27, karakterisert ved at proteinet har en aminosyresekvens som i hovedsak er lik SEKV. ID. Nr: 1.