CZ334097A3 - Fragmenty angiostatinu, agregovaný angiostatin a způsoby jeho použití - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Fragmenty a agregovaná forma inhibitoru proliferace endoteliálních buněk a způsoby jejich použití. Inhibitor endoteliální proliferace je protein odvozený od plazminogenu nebo přesněji, je to fragment angiostatinu. Angiostatinové fragmenty obecně odpovídají kruhovým strukturám, které se vyskytují v inhibitoru proliferace endoteliálních buněk. Angiostatin se také připravuje v agregované formě. Endoteliální buněčná inhibiční aktivita angiostatinových fragmentů a agregovaného angiostatinu se využívá pro inhibici angiogeneze a pro léčbu nemocé zprostředkovaných angiogenezí.

__

Fragmenty angiostatinu, agregovaný angiostatin a způsoby jeho použiti

Oblast techniky

Vynález se týká endoteliálnich inhibitorů nazývaných angiostatin, které vratně inhibují množení endoteliálnich buněk. Vynález zvláště popisuje angiostatinové proteiny, které se mohou izolovat z tělních tekutin, jako je krev a moč, nebo se mohou syntetizovat použitím rekombinantních, enzymatických nebo chemických metod. Angiostatin má schopnost inhibovat onemocnění spojené s angiogenezí a utlumit angiogenní procesy. Dále tento vynález popisuje diagnostické testy a soupravy pro měření angiostatinu, histochemické soupravy vhodné pro lokalizaci angiostatinu, sekvence DNK kódující angiostatin a molekulární sondy vhodné pro monitorování biosyntézy angiostatinu, protilátky specifické k angiostatinu, vývoj proteinových agonistů a antagonistů k angiostatinovému receptorů, protilátkové agonisty a antagonisty specifické k anti-angiostatinovému receptorů a cytotoxická činidla spojená s angiostatinovými proteiny.

Dosavadní stav techniky

Termín angiogeneze míní tvoření nových krevních cév v tkáních nebo orgánech. Za normálních fyziologických podmínek angiogeneze u lidí a zvířat probíhá v omezených, velmi specifických situacích. Například angiogeneze se obvykle pozoruje při hojení ran, během fetálního a embryonálního vývoje a při tvoření žlutého tělíska, děložní sliznice a placenty.

Termín endotelium znamená tenkou vrstvu plochých epiteliálních buněk, které tvoří vystýlku serózních dutin, mízních cév a krevních cév.

Řízená a neřízená angiogeneze probíhá podobným způsobem. Endoteliální buňky a pericyty obklopené bazální vrstvou tvoří kapilární krevní cévy. Angiogeneze začíná erozí bazální membrány pomocí enzymů, které uvolňují endoteliální buňky a leukocyty. Endoteliální buňky, které tvoří vystýlku průchodu krevních cév, pak prostupují skrz bazální membrámu. Stimulanti angiogeneze vyvolávají migraci endoteliálních buněk skrz erodovanou bazální membránu. Migrující buňky tvoří pupen mateřské krevní cévy, kde probíhá mitóza endoteliálních buněk a buňky se množí. Pupeny se spolu spojují, tvoří se kapilární smyčka a vzniká nová krevní céva.

Trvalá, neregulovaná angiogeneze se projevuje v rozmanitých stádiích nemocí, v metastázách nádoru, při abnormálním růstu endoteliálních buněk, a podporuje patologické poškození, které je patrné za těchto podmínek. Různá patologická stádia nemocí, při kterých probíhá neregulovaná angiogeneze, se spojila do skupiny tzv. nemocí zprostředkovaných angiogenezí.

Hypotéza, že nádor roste v závislosti na angiogenezí, se poprvé objevila v roce 1971. (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications.,< N. Engl. Jour. Med. 285:11821186, 1971) Její nejjednodušší verze zní: Pokud se objeví nádor, každému nárůstu populace nádorových buněk musí předcházet nárůst nových kapilár vedoucích do nádoru. Je známo, že vznikem nádoru se označuje prevaskulární fáze nádorového růstu, kde populace nádorových buněk zabírá objem několika málo kubických milimetrů a nepřekročí počet několika milionů, pak nádor může využívat existující hostitelské mikrocévy. Rozšíření nádoru za tuto fázi vyžaduje vznik nových kapilárních krevních cév. Například u myší pulmonální mikrometastázy ve včasné prevaskulární fázi lze určit pouze pozorováním histologického vzorku pomocí vysokoenergetického mikroskopu.

Příklady nepřímých důkazů, které podporují tuto hypotézu:

(1) Růstová rychlost nádorů, které se implantují myším pod kůži v průhledných komůrkách, je před neovaskularizací pomalá a lineární, po neovaskularizaci je rychlá a skoro exponenciální. (Algire GH, et al. Vascular reactions of normál and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normál and neoplastic transplants. J. Nati. Cancer Inst. 6:73-85, 1945) (2) Pokud nádor roste v izolovaných promytých orgánech, kde se krevní cévy nemnoží, jeho velikost se omezuje na 1-2 mm³, ale po transplantaci do myší a neovaskularizaci se jeho objem rychle zvětší více jak tisíckrát.

(3) Růst nádoru v rohovce, která neobsahuje vaskulární systém, probíhá pomalu a lineárně, po neovaskularizaci se přemění v růst exponenciální. (Gimbrone, MA., Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: Tin experimental model using the rabbit cornea. J. Nati.Cancer Institute 52:41-427, 1974) (4) Nádory potopené ve vodné tekutině přední komory oční oka králíka zůstávají schopnými růstu, nejsou vaskularizovány a jejich velikost je menší než 1 mm³. Po implantaci na vaskulární lože duhovky se neovaskularizují a rostou rychleji, jejich původní objem se zvětší 16 000 krát během dvou týdnů.

(Gimbrone MA Jr., et al. _r Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J.Exp.Med. 136:261276) (5) Nádory implantované na chorioalantoickou membránu kuřecího zárodku rostou během fáze bez cévního • · · · zásobováni pomalu, déle než 72 hodin nepřekročí průměr 0,93+0.29 mm. Po počátku neovaskularizace se během 24 hodin objeví rychlý růst nádoru. Do sedmého dne tyto vaskularizované nádory dosahují průměru 8,0+2,5 mm. (Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. Britisch J. Cancer, 35:347-356, 1977).

(6) Nejednotnost ve velikosti vykazují vaskulární druhy metastáz v králičích játrech, avšak v bodě probíhající vaskularizace je velikost nádorů relativně jednotná. Nádory, které nedosáhly velikosti 1 mm v průměru, nemají obvykle vaskulární systém, po překročení této velikosti se vaskularizuji. (Lien W., et al., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normál and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970) (7) U transgenních myší, které tvoří karcinomy v beta buňkách pankreatických ostrůvků, prevaskulární hyperplastické ostrůvky jsou menší než 1 mm. V šestém až sedmém týdnu 4-1'0% ostrůvků se neovaskularizuje a z těchto ostrůvků vznikají velké vaskularizované nádory, jejichž objem je více než tisíce násobkem původního objemu prevaskulárních ostrůvků. (Folkman J, et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nátuře 339:58-61, 1989) (8) Specifické protilátky k VEGF (vaskulární endoteliální růstový faktor) snižují hustotu mikrocév a způsobují podstatnou a dramatickou inhibicí růstu tří lidských nádorů závislých na VEGF, který vystupuje jako jejich jediný zprostředkovatel angiogeneze (v holých myších). Protilátky neinhibují • · ·· . ..v ” • · · · · · · · · • ·· · ···· • · ·· · -» · · · · · · • · · · · ··· ········ · · ··· ·» ·· růst nádorových buněk in vitro. (Kim KJ, et al. , Inhibition of vascular endothelial growth factorinduced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nátuře 362:841-844, 1993) (9) Anti-bFGF monoklonálni protilátky způsobuji 70 % inhibici růstu myšího nádoru, který je závislý na vylučování bFGF jako na jediném zprostředkovateli angiogeneze. Protilátky neinhibují růst buněk in vitro. (Hoři A, et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991) (10) Intraperitoneální injekce bFGF zvýší růst primárního nádoru a jeho metastáz tím, že podporuje růst kapilárních endoteliálních buněk v nádoru. Samotné nádorové buňky nemají receptor pro bFGF a bFGF nepůsobí in vitro jako mitogen (Gross JL, et al., Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF.Proč. Amer. Assoc.Canc.Res. 31:79, 1990) (11) Specifický inhibitor angiogeneze (AGM-1470) inhibuje růst nádoru a metastáz in vivo, ale jeho aktivita je mnohem nižší v případě inhibice množení nádorových buněk in vitro. Tato látka inhibuje množení vaskulárních endoteliálních buněk v poloviční maximálně v čtyřnásobně nižší koncentraci ve srovnání s inhibici množení nádorových buněk. (Ingber D, et al., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nátuře, 48:555-557,1990). Existují také nepřímé klinické důkazy, že růst nádoru závisí na angiogenezi.

(12) Lidské retinoblastomy, které metastázují do sklivce, se vyvíjejí do formy sferoidů bez cévního __β-Λ---' ΓΎ

zásobeni. Jejich objem se omezuje na velikost menši než 1 mm³, přesto jsou schopny růstu a inkorporuji ³Htymidin (když se vyjmou z odstraněného oka a zkoumají se in vitro) .

(13) Karcinom vaječníku metastázuje do peritoneální membrány jako malá bílá semínka bez vaskulárního systému (objem je 1-3 mm³) . Tyto implantáty řídce dorostou do větší velikosti dokud alespoň jeden není neovaskularizován.

neovaskularizace u rakoviny prsu (Weidner

N, et al.

Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma.

N. Engl.J.Med.

324:1-8,1991, a Weidner N, et al.,

Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma,

J. Nati. Cancer Inst.

84:1875-1887,1992) a u rakoviny prostaty (Weidner

N,

Carrol PR, Flax J,

Blumenfeld

W,

Folkman J.

tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostatě carcinoma.

Američan

Journal of

Pathology,

143(2):401-409, 1993) vysoce koreluje s budoucím nebezpečím tvorby metastáz.

(15) Metastázy odvozené z lidského kožního melanomu se před neovaskularizací vyskytuj i pouze řídce.

Neovaskularizace vede k prohloubení lézí a ke zvýšení nebezpečí tvorby metastáz. (Srivasta A, et al., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76-4.0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. Pathol.

133:419-423, 1988) .

(16) V případě rakoviny močového měchýře je hladina angiogenního proteinu bFGF citlivějším indikátorem stavu a rozsahu nemoci ve srovnání s cytologií. (Nguyen M, etal., Elevated levels of an angiogenic • · · ·__ protein, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Nati. Cancer Inst. 85:241-242, 1993)

Pak je jasné, že angiogeneze hraje hlavní úlohu v procesu tvoření metastáz. Jestliže se tato angiogenní aktivita může snížit nebo zcela odstranit, pak nádor, ačkoli bude přítomný, nebude růst. V tomto stádiu nemoce předcházení angiogenezi může zabránit poškození způsobeném vznikem nového mikrovaskulárního systému. Léčení směrované k řízení angiogenních procesů může vést k odstranění nebo ke zmírnění těchto nemocí.

Pro tyto účely se požaduje látka a způsob, který inhibuje nechtěný růst krevních cév, zvláště v nádorech. Nutný je také způsob určení, měření a lokalizace této látky. Látka by měla být schopna překonat aktivitu endogenních růstových faktorů u premetastatických nádorů a předejít tvoření kapilár v nádorech, čímž by měla inhibovat růst nádorů. Látka, fragmenty této látky a její specifické protilátky by také měly být schopny omezit tvoření kapilár v jiných angiogenních procesech, jako je hojení ran a reprodukce. Upřednostňuje < se látka a způsob vhodný pro inhibici angiogeneze, které nejsou toxické a mají málo vedlejších účinků. Dále se požaduje způsob určení, měření a lokalizace vazebných míst vhodných pro zmíněnou látku, stejně jako míst její syntézy. Tato látka a její fragmenty by se měly spojovat s jinými molekulami za účelem radioaktivního a neradioaktivního značení.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje látky a způsoby, které účinně tlumí angiogenezi a inhibují nechtěnou angiogenezi, zvláště pak angiogenezi spojenou s růstem nádoru. Vynález zahrnuje protein, který se nazývá angiostatin. Angiostatin se • ·

definuje schopnosti překonat angiogenní aktivitu endogenních růstových faktorů, jako je bFGF, in vitro, homologií aminokyselinových sekvenci a strukturní podobností s vnitřní částí plazminogenu začínající přibližně plazminogenní aminokyselinou číslo 98. Angiostatin obsahuje protein, jehož molekulová hmotnost určená elektroforézou na redukčním polyakrylamidovém gelu je přibližně mezi 38 a 45 kilodaltony a jehož aminokyselinová sekvence je podstatně podobná sekvenci fragmentu myšího plazminogenu začínající aminokyselinou číslo 98 neporušené molekuly myšího plazminogenu (SEQ ID č.:2).

Aminokyselinová sekvence angiostatinu se trochu mění v závislosti na biologickém druhu. Například v lidském angiostatinu je aminokyselinová sekvence podstatně podobná výše popsané sekvenci fragmentu mýšího plazminogenu, ačkoli sekvence aktivního lidského angiostatinu může začínat buď aminokyselinou číslo 97 nebo 99 aminokyselinové sekvence neporušeného lidského plazminogenu. Fragmenty lidského plazminogenu mají podobnou anti-angiogenní aktivitu, jako se vykazuje v modelu myšího nádoru. Rozumí se, že počet aminokyselin v molekule aktivního angiostatinu může kolísat a předpokládá se, že všechny aminokyselinové sekvence, které vykazují endoteliální inhibiční aktivitu jsou zahrnuty v tomto vynálezu.

Vynález poskytuje způsob a látky vhodné pro léčení nemocí a stavů zprostředkovaných nežádoucí a neřízenou angiogenezí. Toto léčení, vhodné pro lidi nebo zvířata, spočívá v podávání látky, která obsahuje podstatně čištěný angiostatin, jeho derivát či fragment nebo jeho agregovanou formu, v dávce, která je dostatečná pro inhibici angiogeneze. Vynález se zvláště používá pro léčení nádorů nebo pro potlačení jejich růstu. Podáváním angistatinu lidem nebo • · · · · · · ·· • · · · · · · · · · · · • v ··· ··· zvířatům s prevaskulárizovanými metastázovanými nádory se zabrání růstu nebo rozšíření těchto nádorů.

Vynález také popisuje sekvence DNK kódující angiostatin, expresivní vektory obsahující sekvence DNK kódující angiostatin a buňky nesoucí jeden nebo více exresivních vektorů, které obsahují sekvence DNK kódující angiostatin. Vynález dále uvádí způsoby genové terapie, přičemž sekvence DNK kódující angiostatin se zavedou do pacienta za účelem modifikace hladiny angiostatinu in vivo.

Vynález také zahrnuje způsoby diagnostiky a soupravy vhodné pro určení a měření angiostatinu v biologických tekutinách a tkáních a pro jeho lokalizaci v tkáních a buňkách. Diagnostické způsoby a soupravy se mohou vyskytovat v libovolných odborníkovi dobře známých formách. Vynález popisuje protilátky specifické k molekule angiostatinu a k jejím částem a protilátky, které inhibují navázání angiostatin specifických protilátek. Tyto protilátky mohou být polyklonální nebo monoklonální. Angiostatin specifické protilátky se mohou používat v diagnostických soupravách za účelem určení přítomnosti a množství angiostatinu, který slouží pro diagnostiku nebo, prognostiku výskytu nebo opětného výskytu rakoviny nebo jiných nemocí zprostředkovaných angiogenezí. Lidem nebo zvířatům se také mohou podávat angiostatin specifické protilátky za účelem pasivní imunizace proti angiostatinu, čímž se snižuje angiogenní inhibice.

Vynález také popisuje způsoby diagnostiky a soupravy pro určení přítomnosti nebo množství protilátek, které vážou angiostatin, v tělních tekutinách. Diagnostické způsoby a soupravy se mohou vyskytovat v libovolných odborníkovi dobře známých formách.

Vynález zahrnuje protilátky specifické k antiangiostatinovému receptorů, které se vážou na angiostatinový receptor a přenáší k buňkám příslušný signál a působí jako agonisty nebo antagonisty.

Vynález obsahuje angiostatinové proteinové fragmenty a analogy, které se mohou značit izotopy, jinými molekulami nebo proteiny za účelem určení a zviditelnění míst, kam se váže angiostatin. Mezi vhodné metody patří pozitronová emisní tomografie, autoradiografie, průtoková cytometrie, radioreceptorový vazebný test a imunohistochemie.

Tyto angiostatinové proteiny a analogy také působí jako agonisty a antagonisty angiostatinového receptorů, čímž zvyšují nebo blokují biologickou aktivitu angiostatinu.

Takové proteiny se používají při izolaci angiostatinového receptorů.

Vynález také zahrnuje angiostatin, jeho fragmenty, angiostatinové antiséra nebo agonisty a antagonisty angiostatinového receptorů navázané na cytotoxické činidlo, což se využívá při léčbě a ve výzkumu. /Angiostatin, jeho fragmenty, angiostatinové antiséra, agonisty a antagonisty angiostatinového receptorů se za účelem vytvoření léčebných kompozic spojují s farmaceuticky přijatelnými excipienty a nepřerušovaně uvolňovanými₍ látkami nebo sloučeninami, jako jsou biologicky rozložitelné polyméry.

Vynález popisuje molekulární sondy pro ribonukleovou a deoxyribonukleovou kyselinu, které se účastní transkripce a translace angiostatinu. Tyto molekulární sondy jsou vhodné pro určení a měření biosyntézy angiostatinu v tkáních a v buňkách.

Vynález poskytuje kompozice obsahující angiostatin.

Vynález poskytuje způsob léčby nemocí a stavů, které jsou zprostředkovány angiogenezí.

Vynález dále poskytuje způsoby diagnostiky a prognózy a soupravu pro určení přítomnosti a množství angiostatinu v tělní tekutině nebo v tkáni.

• ·

Vynález poskytuje léčebné přípravky a způsob léčby nemoci a stavů zprostředkovaných angiogenezi, které zahrnuji hemangiom, pevné nádory, krevní nádory, leukemie, metastázy, teleangiektazie, psoriázasklerodermie, hnisavý granulom, myokardiálni angiogeneze,

Crohnova nemoc, plaková neovaskularizace, koronární kolaterály, cerebrální kolaterály, arteriovenózní malformace, ischemickou angiogenezi končetin, onemocnění rohovky, rubeosis, neovaskulární glaukom, diabetickou retinopatii, retrolentální fibroplázii, artritidu, diabetickou neovaskularizaci, makulární degeneraci, hojení ran, peptický vřed, nemoci spojené s výskytem Helicobacter, zlomeniny, keloidy, vaskulogenezi, hematopoiesis, ovulaci, menstruaci, tvoření placenty a horečku z kočičího škrábnutí.

Vynález poskytuje přípravky pro léčení nebo potlačení rakoviny.

Vynález poskytuje látky, které tlumí nebo napodobují produkci nebo aktivitu enzymů, které produkuje angistatin in vitro nebo in vivo.

Vynález popisuje produkci angiostatinu nebo antiangiostatinových protilátek u lidí nebo zvířat, jenž takový angiostatin nebo anti-angiostatinové protilátky potřebují, přímou aplikací DNK angiostatinu

Vynález poskytuje způsob určení a kvantifikace přítomnosti angiostatinových specifických protilátek v tělní tekutině.

Vynález poskytuje přípravky obsahující angiostatinové protilátky, které jsou selektivní pro určitou oblast molekuly angiostatinu a které nerozeznávají plazminogen.

Vynález poskytuje způsob detekce a prognózy rakoviny.

Vynález poskytuje přípravek vhodný ke zviditelnění a kvantifikaci angiostatinových vazebných míst in vivo a in vitro.

·»—T-w v

Vynález poskytuje kompozici používanou při určení a kvantifikaci biosyntézy angiostatinu.

Vynález poskytuje terapii rakoviny s minimálními vedlejšími účinky.

Vynález poskytuje přípravek obsahující angiostatin nebo angiostatinový protein navázaný na cytotoxické činidlo. Tato kompozice se používá při léčení nebo potlačení růstu rakoviny.

Vynález poskytuje způsob cíleného zavádění kompozic vztahujících se k angiostatinu.

Vynález poskytuje kompozice a způsoby použitelné v genové terapii pro zmírnění angiogenních procesů. ·

Vynález zahrnuje přípravky a způsoby určení a léčení nemocí a procesů, které se zprostředkovávají angiogenezí nebo se s ní spojují. Uvedenou kompozicí je angiostatin, který se může izolovat z tělních tekutin, mezi něž patří sérum, moč ascity, nebo se může syntetizovat chemickými nebo biologickými způsoby (například kultivací buněk, expresí rekombinantního genu, syntézou proteinu a enzymatickou katalýzou plazminogenu nebo plazminu probíhající in vitro, přičemž vzniká aktivní angiostatin). Způsoby rekombinace zahrnují amplifikaci genu, ze zdroje DNK za použití polymerázové řetězové reakce (PCR), nebo ze zdroje RNK za použití PCR s reverzní transkriptázou. Angiostatin inhibuje růst krevních cév v tkáních, takových jako jako jsou vaskularizované nádory nebo nádory bez vaskulárního systému.

Vynález také zahrnuje kompozici obsahující vektor se sekvencí DNK kódující angiostatin, kde vektor, je-li přítomný v buňce, je schopný exprimovat angiostatin, kompozici obsahující buňku s vektorem, kde vektor nese sekvenci DNK kódující angiostatin, jeho fragmenty nebo jeho analogy a kde vektor, je-li přítomný v buňce, je schopný exprimovat

angiostatin, a způsob implantace buněk do lidi a zvířat. Tyto buňky obsahují vektor, který nese sekvence DNK kódující angiostatin a který, je-li přítomný v buňce, je schopný exprimovat angiostatin.

Vynález také zahrnuje angiostatin, jeho fragmenty, angiostatinová antiséra nebo agonisty a antagonisty angiostatinového receptoru, které se za účelem vytvořeni léčebných kompozic spojují s farmaceuticky přijatelnými excipienty a trvale uvolňovanými látkami nebo sloučeninami, jako jsou biologicky rozložitelné polyméry. Vynález zvláště zahrnuje kompozici obsahující protilátky, které se specificky vážou na angiostatin. Tyto protilátky se neváži na plazminogen.

Vynález popisuje protein označený jako angiostatin, jehož molekulová hmotnost se pohybuje přibližně mezi 38 až 45 kilodaltony (kD) a který je schopný in vitro překonat angiogenní aktivitu endogenních růstových faktorů, jako je bFGF. Angiostatin je protein, jehož molekulová hmotnost určená elektroforézou na redukčním polyakrylamidovém gelu je přibližně mezi 38 a 45 kilodaltony a jehož aminokyselinová sekvence je podstatně podobná sekvenci fragmentu myšího plazminogenu začínající aminokyselinou číslo 98 neporušené molekuly myšího plazminogenu.

Termín podstatně podobná v tomto kontextu znamená, že jde o aminokyselinovou sekvenci, která má anti-angiogenní aktivitu, její molekulová hmotnost je přibližně 38 až 45 kD, vykazuje vysoký stupeň homologie s proteinovým fragmentem myšího plazminogenu, který začíná přibližně aminokyselinou číslo 98 v myším plazminogenu a jeho molekulová hmotnost je 38 až 45 kD. Vysoký stupeň homologie znamená nejméně okolo 60 % homologie aminokyselin, lépe nejméně okolo 70 % homologie aminokyselin, nej žádanější je nejméně 80% homologie aminokyselin.

Termín endoteliální inhibični aktivita znamená schopnost molekuly obecně inhibovat angiogenezi a například inhibovat růst hovězích kapilárních endoteliálních buněk kultivovaných v přítomnosti fibroblastového růstového faktoru.

Na obrázku č. 1 se uvádí aminokyselinová sekvence SEQ ID č.:l úplné molekuly myšího plazminogenu. Sekvence angiostatinu začíná přibližně aminokyselinou číslo 98. Aktivní lidský angiostatin může začínat buď aminokyselinou číslo 97 nebo 99 neporušené molekuly lidského plazminogenu. Na obrázku č. 2 je uvedena aminokyselinová sekvence prvních 339 aminokyselin myšího angiostatinu (SEQ ID č.: 2) a její srovnání se sekvencemi odpovídajícími plazminogenním proteinovým fragmentům plazminogenu člověka (SEQ ID č.:3), opice makak rhesus (SEQ ID č.:4), prasete (SEQ ID č.:5) a hovězího dobytka (SEQ ID č.: 6). Je dáno, že 50% aminokyselin těchto sekvencí je identických. Rozumí se, že aminokyselinové sekvence angiostatinu jednotlivých biologických druhů jsou podobné. Celkový počet aminokyselin angiostatinu není přesně znám, ale definuje se pomocí molekulové hmotnosti aktivní molekuly. Aminokyselinová sekvence angiostatinu se může lišit v závislosti na biologickém druhu, ze kterého pochází molekula plazminogenu. Proto, ačkoli angiostatin získaný z lidského plazminogenu má trochu odlišnou sekvenci ve srovnání s angiostatinem získaným z myši, vykazuje angiogenní aktivitu v modelu myšího nádoru.

Ukázalo se, že angiostatin je schopný inhibovat růst endoteliálních buněk in vitro. Angiostatin neinhibuje růst buněčných linií získaných z jiných buněčných typů. Angiostatin nemá žádný účinek v případě buněčné linie Lewisova plicního karcinomu, plicního epitelia norka, fibroblastů 3T3, buněk aortálního hladkého svalstva hovězího dobytka, retinálního pigmentového epitelia hovězího dobytka,

buněk MDCk (renálního epitelia), buněk W138 (plicní fibroblasty lidského plodu), buňky EFN (fibroblasty myšího plodu) a buněk LM (pojivá tkáň u myší). Endogenní angiostatin v myších nádorech účinně inhibuje metastázy v koncentraci 10 mg angiostatinu na kilogram tělesné hmotnosti.

Angiostatin má specifickou trojrozměrnou strukturu, která se definuje kruhovými oblastmi molekuly plazminogenu. (Robbins, K.C., The plasminogen-plasmin enzyme systém Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice, 2^nd Edition, ed. By Colman, R.W. et al. J.B.Lipincott Company, pp. 340-357, 1987) Existuje pět takových kruhových oblastí, které mají podstatnou sekvenční homologii v oblasti N-konce molekuly plazminogenu. Věří se, že trojrozměrná struktura angiostatinu zahrnuje plazminogenní kruhové oblasti 1 až 3 a část kruhové oblasti 4. Každá kruhová oblast molekuly plazminogenu obsahuje přibližně 80 aminokyselin a tři disulfidové vazby. Tento cysteinový motiv existuje i u jiných biologicky aktivních proteinů. Tyto proteiny zahrnují protrombin, hepatocytový růstový faktor, rozptylový faktor a protein stimulující makrofágy. (Yoshimura, T, et al., Cloning, sequencing, anď expression of human macrophage stimulating protein (MPS,MST1) confirms MSP as a member of the family of kringle proteins and locates the MPS gene on Chromosome 3 J. Biol. Chem., Vol. 268, No.21, pp. 1546115468, 1993). Libovolný izolovaný protein nebo protein mající třírozměrnou podobnou kruhovou strukturu nebo cysteinový motiv, jenž má anti-angiogenní aktivitu in vivo, je součástí vynálezu.

Vynález také zahrnuje určování angiostatinu v tělních tekutinách a tkáních za účelem diagnostiky a prognóz nemocí, jako je rakovina.Vynález dále obsahuje detekci vazebných míst angiostatinu a jeho receptorů v buňkách a tkáních. Vynález popisuje způsoby léčení a prevence angiogenních nemocí a • · ·· • *

Λ '“‘Ύ τ

·· ·· λ—·.· rnr • · ···· · · ·· i¹¹¹ • · · · • · stavů, které zahrnuji artritidu a nádory, stimulaci produkce angiostatinu a/nebo podáváním pacientovi podstatně čištěného angiostatinu nebo agonistů nebo antagonistů angiostatinu a/nebo angiostatinového antiséra nebo antiséra určeného proti angiostatinovému antiséru. podáváni angiostatinu, angiostatinového antiséra receptoru angiostatinu vázaných

Další j eho nebo způsoby fragmentů agonistů cytotoxická na léčby zahrnují a analogů, a antagonistů činidla.

Rozumí se, že angiostatin může pocházet ze zvířat nebo lidi.

Angiostatin se může také připravovat synteticky chemickou reakci nebo rekombinantním způsobem ve spojeni s expresivními systémy. Angiostatin se může také připravovat enzymatickým štěpením izolovaného plazminogenu nebo plazminu za vzniku proteinů majících anti-angiogenní aktivitu. Další způsob produkce angiostatinu je pomocí látek, které napodobují působení endogenních enzymů štěpících plazminogen za vzniku angiostatinu. Produkce angiostatinu se může také utlumit látkami, které ovlivňují aktivitu enzymů štěpících plazminogen.

Pasivní protilátková terapie používající protilátky, které specificky vážou angiostatin, může tlumit procesy závislé na angiogenezi, jako jsou reprodukce, vývoj a hojení ran a tkání. Mohou se aplikovat antiséra proti Fab oblastem protilátek angiostatinu za účelem blokování schopnosti endogenního antiséra angiostatinu vázat angiostatin

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek č. 1 ukazuje SEQ ID č.:l, aminokyselinovou sekvenci celého myšího plazminogenu.

Obrázek č. 2 ukazuje začátek sekvence myšího angiostatinu (SEQ ID č.:2) a je zde zobrazeno srovnání myší sekvence s odpovídajícím lidským (SEQ ID č.:3), opičím (Rhesus) (SEQ ID č.:4), prasečím (SEQ ID č. :5) a hovězím (SEQ

·· ·· ·♦ ·	··
• · · ·	•	• ·	··
• · · · ·	•	• ···	• ·
• · · ·	•	•	• ·
	·· ·	• ·	• ·

ID č. :6) fragmentem plazminogenniho proteinu. Sekvence následují v tomto pořadí: myší, lidská, opičí, prasečí a hovězí.

Obrázek č. 3 zobrazuje BrdU index značení nádorových buněk v plicích, v případech, kdy primární nádor je přítomen nebo chybí.

Obrázek č. 4 ukazuje Matrigelovu analýzu vlivu Lewisova primárního nádoru plic na angiogenezi in vivo řízenou bFGF.

Na obrázku č.: 5 je vyobrazena křivka dávkové odezvy séra získaného z myši s Lewisovým plicním karcinomem (LLCLow) proti séru z normální myši. Endoteliální buňky kapilár hovězího dobytka se analyzovaly v 72 hodinovém testu proliferace řízené bFGF.

Obrázek č. 6 ukazuje nádory s malou a vysokou schopností tvorby metastáz. Ascity těchto nádorů vykazují endoteliální mitogenní aktivitu. Pouze linie nádorů s malou schopností tvorby metastáz vykazuje endoteliální inhibiční aktivitu v séru.

Na obrázku č. 7 je znázorněn chromatografický profil částečně čištěného séra nebo moče zvířat majících nádor. Tento profil byl vytvořen 'pomocí chromatografie s obrácenou fází C4.

Obrázek č. 8 ukazuje povrchové plicní metastázy po 13 dnech léčby myši pomocí neporušené molekuly plazminogenu, aktivní frakce z lysinového vazebného místa I získané při izolaci lidského plazminogenu, koncentrované moče získané od myši s nádorem a koncentrované moče získané od normální myši.

Obrázek č. 9 ukazuje hmotnost plic po 13 dnech léčby myši pomocí neporušené molekuly plazminogenu, aktivní frakce z lysinového vazebného místa I získané při izolaci lidského plazminogenu, koncentrované moče získané od myši s nádorem a koncentrované moče získané od normální myši.

Na obrázku č. 10 je znázorněno schéma vektoru pTrcHis.

• ·

- · · . .. ·-*— · *

Obrázek č. 11 zobrazuje imunoblot exprimovaného lidského angiostatinu v E. coli. /Angiostatin se připravoval fermentací v objemu 10 1. Jako sonda se použily monoklonálni protilátky proti kruhové oblasti 1-3 lidského plazminogenu. Šipka naznačuje rekombinantní lidský angiostatin. V dráze A je rekombinantní angiostatin eluován 0,2 M kyselinou aminokapronovou; v dráze B je fáze z posledního promytí lysinové kolony lx ředěným PBS; v dráze C je čirý lyzát z porušených buněk.

Na obrázku č. 12 je graf znázorňující procento inhibice rostoucích kapilárních endoteliálních buněk u hovězího dobytka jako funkci ředění; Al, A2, Bl, B2 a E označují rekombinantní klony exprimující lidský angiostatin s antiangiogenní aktivitou; Cl, C2, Dl a D2 označují negativní kontroly, což jsou klony obsahující vektor bez sekvence lidské DNK kódující angiostatin.

Obrázek č. 13 ukazuje inhibiční účinek množení rekombinantního lidského angiostatinu na hovězí kapilární endoteliální buňky in vitro.

Na obrázku č. 14 je znázorněn růstový proliferační index a apoptotický index po odstranění primárního nádoru a léčení fyziologickým roztokem nebo analogem fumagilinu, který vykazuje anti-angiogenní aktivitu.

Obrázek č. 15 znázorňuje inhibicí růstu primárního nádoru T241 v myši aplikací lidského angiostatinu in vivo ve formě jedné injekce v dávce 40 mg/kg/den.

Obrázek č. 16 znázorňuje inhibicí růstu primárního nádoru LLC-LM v myši aplikací lidského angiostatinu in vivo ve formě dvou injekcí. Jedna dávka je 40 mg/kg/den, celkem tedy 80 mg/kg/den.

Obrázek č. 17 ukazuje účinek odstranění Lewisova plicniho primárního karcinomu na růst jeho plicních metastáz.

Na obrázku č. 18 se uvádí růstový proliferačni a apoptotický index po odstraněni nádoru.

Obrázek č. 19 ukazuje účinek podání angiostatinového proteinu myši, která má implantovány buňky fibrosarkomu T241, na celkový objem nádoru jako funkci času.

Obrázek č. 20 ukazuje účinek podání angiostatinového proteinu myši, která má implantovány buňky Lewisova plicního karcinomu (LM), na celkový objem nádoru jako funkci času.

Obrázek č. 21 vykazuje účinek podání angiostatinového proteinu myši, která má implantovány buňky sarkomu buněčného retikula na celkový objem nádoru jako funkci času.

Obrázek č. 22 vykazuje účinek podání angiostatinového proteinu imunodeficientní SCID myši, která má implantovány buňky karcinomu prostaty PC-3 na celkový objem nádoru jako funkci času po časový úsek 24 dny.

Obrázek č. 23 vykazuje účinek podání angiostatinového proteinu imunodeficientní SCID myši, která má implantovány buňky karcinomu prsu MDA-MB na celkový objem nádoru jako funkci času po časový úsek 24 dny.

Na obrázku č. 24 je znázorněno schéma klonování sekvence myší DNK kódující myší angiostatinový protein získaný z myší plazminogenní cDNK. Myší angiostatin zahrnuje oblasti smyčky 1-4 myšího plazminogenu. Zkratka PCR označuje polymerázovou řetězovou reakci; PÍ označuje oligonukleotidový primer 5'konce používaný pro PCR; P2 označuje oligonukleotidový primer 3'-konce používaný pro PCR; SS označuje signální sekvenci; ATG je iniciační kodón translace; TAA je konečný kodón translace; HA reprezentuje hemaglutinový epitop tag (YPYDVPDYASL) ; Kl, K2, K3 a K4 označují kruhové oblasti 1, 2, 3 a 4 myšího plazminogenu. CMV označuje cytomegalovirový promotor; T7 označuje promotor bakteriového fága; PA označuje preaktivaci proteinů; zkratkou SP6 se označuje promotor Sp 6.

Obrázek č. 25 znázorňuje počet buněk jako funkci času (čas se udává ve dnech) . Jsou zde vyneseny křivky pro buňky bez cizorodé DNK (kontrola); pro buňky obsahující samotný vektor bez sekvence DNK kódující angiostatin (vektor 5), pro dva klony exprimující angiostatin (AST 31 a AST 37). Graf (a) reprezentuje výsledky transfekce buněk T241. Graf (b) ukazuje výsledky transfekce buněk LL2.

Obrázek č. 26 ukazuje výsledky kultivace media získaného z buněk E. coli, které obsahují angiostatinový klon, v závislosti na počtu buněk. Používají se buňky bez cizorodé DNK (kontrola); buňky transfekované samotným vektorem bez sekvence DNK kódující angiostatin (vektor 5), tři klony exprimující angiostatin (AST 25, AST 31 a AST 37) . Graf (a) reprezentuje výsledky inkubace kultivačního media kontrolního vzorku a všech angiostatinových klonů (exprimujících nebo neexprimujících) v závislosti na počtu buněk. Graf (b) ukazuje výsledky inkubace kultivačního media kontroly, samotného vektoru (vektor 6) a klónů exprimujících myší angiostatin v závislosti na počtu buněk. Graf (c) ukazuje výsledky inkubace čištěného kultivačního media kontroly a klónů exprimujících myší angiostatin v závislosti na počtu buněk, kde kultivační medium se čistí lysin-sefarózovou kolonou za účelem získání komponentů, které se váží na lysin.

Na obrázku č. 27 je znázorněn účinek na celkový objem nádoru jako funkce času implantace buněk fibrosarkomu T241 do myši. Do buněk fibrosarkomu se zavedl vektor obsahující sekvenci DNK kódující angiostatinový protein a vektor je schopný exprimovat angiostatinový protein. Jako buňky bez cizorodé DNK se pro implantaci do myši použily nezměněné buňky fibrosarkomu T241. Vektor 6 je reprezentován buňkami fibrosarkomu T241 transfekované pouze vektorem, který neobsahuje sekvenci DNK kódující angiostatinový protein, implantovanými do myši. Klony 25, 31 a 37 reprezentují 3 klony, produkující angiostatin, buněk fibrosarkomu T241 transfekované vektorem, který obsahuje sekvenci DNK kódující angiostatinový protein. Tyto buňky se implantovaly do myši.

Obrázek č. 28 představuje schéma struktury lidského plazminogenu a jeho kruhových fragmentů. Lidský plazminogen je jednořetězový protein, který obsahuje 791 aminokyselin, s jednostranou přes dusík vázanou glykosylací na aminokyselině Asn²⁸⁹ . Oblast lidského plazminogenu, která není štěpitelná proteázou, zahrnuje 561 aminokyselin N-konce a tvoří pět oddělených oblastí, které tvoří kruhové oddělené smyčky (Kl, K2, K3, K4 a K5) . Každá trojnásobně disulfidickou vazbou vázaná smyčka obsahuje 80 aminokyselin. Angiostatin překrývá první čtyři z těchto kruhových oblastí (Kl-4). Smyčku 3 (Kl3) a 4 (K4) je možené získat štěpením lidského plazminogenu elastázou. Zbytek kruhových fragmentů jsou rekombinatní proteiny, které se exprimují v E. coli. SS označuje signální sekvenci; PA označuje preactivaci proteinu.

Obrázek č. 29 znázorňuje analýzu SDS-PAGE čištěných rekombinantních a přirozených kruhových fragmentů v redukčním prostředí. (A) Rekombinantní kruhové fragmenty čištěné z bakteriálního lyzátu E. col’i se nanesly na 15 % SDS gel, pak následovalo barvení Coomassieovou modří. Do každé dráhy se naneslo přibližně 5 μg proteinu, (v dráze 2 je smyčka 1 (Kl); v dráze 3 je smyčka 2 (K2) ; v dráze 4 je smyčka 3 (K3) ; v dráze 5 je smyčka 4 (K4); v dráze 1 je markér molekulové hmotnosti) . (B) Čištěné velké kruhové fragmenty se barví Coomassieovou modří. Smyčky 1-4 (dráha 2) a 1-3 (dráha 3) se získaly štěpením lidského plazminogenu elastázou a čistily se lysin-sefarózovou chromatografií. Rekombinantní fragment smyček 2-3 (dráha 4) se exprimoval v E. coli a složil se in vitro. Markéry molekulové hmotnosti jsou označeny na levé straně (dráha 1).

Obrázek 30 ukazuje inhibicí množeni endoteliálnich buněk rekombinantnimi kruhovými fragmenty angiostatinu. Kruhové fragmenty se testovaly na hovězích kapilárních endoteliálnich buňkách v přítomnosti 1 ng/ml bFGF po dobu 72 hodin. Na grafu (A) je znázorněn účinek na množeni endoteliálnich buněk dvou smyček rKl a rK2, které se vážou na lysin. Smyčka ΚΙ (-o-) , která se vyznačuje vysokou afinitou k lysinu, inhibuje množení buněk BCE v závislosti na dávce. Smyčka K4 (-·-), která se vyznačuje střední afinitou k lysinu, vykazuje pouze malý inhibiční účinek při vysokých koncentracích. Graf (B) znázorňuje inhibicí množení buněk BCE smyčkami K2 a K3, které se navážou na lysin. Oba fragmenty K2 (--) a K3 (-Π-) inhibují množení buněk BCE v závislosti na dávce. Data reprezentují průměr +/- SEM tří měření.

Obrázek 31 ukazuje anti-endoteliální proliferační aktivitu velkých kruhových fragmentů angiostatinu. Proteolytické fragmenty Kl-4 (angiostatin) (-o-) a Kl-3 (-) inhibují množení buněk BCE v závislosti na dávce. Rekombinantní fragmenty K2-3 (-·-) vykazují menší inhibicí než fragmenty Kl-3 a Kl-4. Data reprezentují průměr tří měření (+/- SEM) jako procento inhibice.

Na obrázku 32 je znázorněna aditivní inhibiční aktivita rekombinantních smyček 2 a 3. (A) Neporušený fragment rK2-3 (také na obr. 31) vykazuje slabý inhibiční účinek pouze v koncentraci 320 nM. Při stejné koncentraci se prokázala aditivní inhibice, když mutantní fragmenty rK2 (cystein je v poloze 169 nahrazen serinem) a K3 (cystein je v poloze 297 nehrazen serinem) se testovaly společně na buňkách BCE. Každá hodnota reprezentuje průměr tří měření +/- SEM. (B) Schéma struktury a aminokyselinová sekvence K2 a K3. Vnitřní řetězová smyčka vázaná disulfidovou vazbou je přítomna mezi cysteinem¹⁶⁹ u K2 a cysteinem²⁹⁷ u K3 (Sohndel, S., Hu, C.-K.,

Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. In press).

Obrázek č. 33 ukazuje inhibici endoteliálního množeni kombinovanými kruhovými fragmenty. V testu se použila koncentrace každého fragmentu 320 nM. Hodnoty reprezentuji průměr tři měřeni (+/-SEM) a uvádí se jako procento inhibice. Graf (A) ukazuje inhibiční účinky kombinace fragmentů různých jednotlivých smyček. Graf (B) ukazuje kombinatorickou inhibiční aktivitu kombinovaných kruhových fragmentů.

Na obrázku č. 34 je znázorněna inhibiční aktivita redukovaného a alkylovaného angiostatinu endoteliální buňky. Část (A) ukazuje SDS-PAGE analýzu redukované (dráha 2) a neredukované (dráha 1) formy lidského angiostatinu. Redukce čištěného lidského angiostatinu pomocí DTT je následována alkylaci proteinu s nadbytkem jodoacetamidu. Takto upravené vzorky se dialyzovaly a testovaly na buňkách BCE. Graf (B) znázorňuje inhibici množení buněk BCE redukovanou a neredukovanou formou angiostatinu v koncentraci 320 nM. Data reprezentují průměr tří měření +/- SEM.

Obrázek č. 35 ukazuje uspořádání aminokyselinové sekvence putativních kruhových oblastí lidského angiostatinu. Sekvence čtyř kruhových oblastí jsou seřazeny vzhledem k jejich zachovaným cysteinům. Shodné a zachované aminokyseliny jsou zvýrazněny. Aminokyseliny ohraničené rámečkem ve smyčce 4 vykazují dva pozitivně nabyté lysiny přilehlé k zachovaným cysteinovaným zbytkům v poloze 22 a 80.

Obrázek č. 36 ukazuje vazebnou charakteristiku a reaktivitu exprimovaného angiostatinu k lysinu.

Na obrázku 36A je gel barvený Coomassiovou modří, (na gel se nanaslo 40 μΐ)

Na obrázku 36B je imunoblot podobného gelu (na gel se nanaslo 20 μΐ) . V dráze 1 je půda z kultivačních nádob indukovaných kultur, je zde patrný angiostatinový protein ve • · • · • ·

....________—— · · -·___a----·——·—·-·—----·— · · ·.

......Μ.-,,·,·............. U->l I II ..................~........,·,.»'^ ................. , _t • · ·· · · · · · # · · «a······ vzdálenosti odpovídající přibližně 50 kD a několik jiných proteinů. Půda z indukovaných kultur je zředěna pufrem 1:1 a je přímo nanesena na sefarózu obsahující lysin. Dráha 2 obsahuje nenavázanou frakci, která prošla lysinovou kolonou. Veškerý angiostatinový protein exprimovaný P. pastoris se váže na lysinovou kolonu. V dráze 3 se nachází specifický eluát 0,2 M kyseliny aminokapronové. Je zde ukázáno, že angiostatinový protein exprimovaný P. pastoris se váže na lysin a může se čistit v jednom kroku za účelem dosažení homogenity na sefaróze obsahující lysin. Strukturálně závislé monoklonální protilátky (VAP), které vznikly proti smyčkám 1 až 3, rozeznávají angiostatinový protein exprimovaný P. pastoris.

Na obrázku č. 37 je patrný angiostatinový protein exprimovaný P. pastoris, který se jeví jako dva pruhy migrující na denaturovaných neredukovaných SDS-PAGE gelech barvených podle Coomassie do vzdálenosti odpovídající molekulové hmotnosti 49 kD a 50 kD. Odstranění jednoduchého N-koncem spojeného komplexního řetězce z exprimovaného angiostatinového proteinu pomocí N-glykanázy, která je specifická pro struktury s'vysokým obsahem mannosy, vede ke vzniku jednoho pruhu ve vzdálenosti odpovídající molekulové hmotnosti 49,5 kD. Části obrázku A a B ukazují barvený gel podle Coomassie a imunoblot podobného gelu. V dráze 1 je čištěný angiostatinový protein exprimovaný P. pastoris. V dráze 2 je čištěný angiostatinový protein exprimovaný P.

pastoris inkubovaný za podmínek štěpení bez N-glykanázy. V dráze 3 je čištěný angiostatinový protein exprimovaný P.

pastoris štěpený N-glykanázou.

Obrázek č. 38A ukazuje dva pruhy čištěného angiostatinového proteinu exprimovaného P. pastoris v množství 4 μς na gelu barveného podle Coomassie.

ti ·

Obrázek č. 38B ukazuje, že čištěný rekombinant inhibuje množení buněk BCE. Je zde znázorněn počet testovaných buněk BCE po 72 hodinách inkubace v přítomnosti (·) nebo bez (o) bFGF, v přítomnosti bFGF a PBS (Δ), což slouží jako kontrola, a v přítomnosti bFGF a angiostatinového proteinu exprimovaného P. pastoris (Δ) .

Obrázek č. 38C ukazuje, že inhibice je závislá na dávce.

Z obrázku č. 39 je patrné, že čištěný angiostatinový protein exprimovaný P. pastoris byl systematicky (podkožně) aplikován myši s primárním nádorem.

Obrázky 39A a 39B ukazuji počet metastáz a hmotnosti plic myší, kterým se denně podávál fyziologický roztok nebo angiostatin exprimovaný P. pastoris nebo angiostatinový protein odvozený od plazminogenu. Na rozdíl od plic myši léčených fyziologickým roztokem plíce myší, kterým se podával angiostatinový protein exprimovaný P. pastoris nebo angiostatinový protein odvozený od plazminogenu, nebyly vaskularizovány a metastázy byly potlačeny.

Na obrázku č. 40 je ukázáno, že plíce myší léčených angiostatinem exprimovaným P. pastoris byly růžové s mikrometastázami, zatímco plíce kontrolní skupiny myší léčené fyziologickým roztokem byly zcela pokryty vaskularizovanými metastázami.

Na obrázky č. 41 je vyobrazený redukční polyakrylamidový elektroforézový (SDS-PAGE) gel, kde je nanesen rekombinantní myší angiostatin v různých fázích čištění a agregace. Čištěný se provádělo na niklové afinitní chromatografické koloně (dráha 1 až 3 promytí inkluzního útvaru, dráha 4 nerozpustné frakce v moči, dráha 5 počáteční materiály nanesené na afinitní kolonu, dráha 6 frakce, která prošla kolonou, dráha 7 eluát angiostatinu).

Na obrázku č. 42 je znázorněn účinek podáni agregovaného rekombinantniho myšího angiostatinu na hovězí kapilární endoteliální buňky.

Na obrázku č. 43 je znázorněn účinek podání agregovaného angiostatinu na objem nádoru u myší, které byly inokulovaný Lewisovým plicním karcinomem. Dávka agregovaného angiostatinu byla 2 mg/kg/den.

Na obrázku č. 44 je znázorněn účinek podání agregovaného angiostatinu na objem nádoru u myší, které byly inokulovany Lewisovým plicním karcinomem. Dávka agregovaného angiostatinu byla 10 mg/kg/den.

Vynález také zahrnuje genovou terapii, což spočívá v regulaci pacientova genu kódujícího angiostatin. V publikaci Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 (1992) jsou uvedeny různé způsoby přenosu a zavádění DNK do buněk za účelem exprese genového proteinového produktu, jinak jsou tyto způsoby referované jako genová terapie. Genová terapie zahrnuje zavedení sekvencí DNK do somatických buněk nebo do buněčné linie pocházející ze zárodků za účelem terapie ex vivo nebo in vivo. Funkce genové terapie jsou: záměna genu, zesílení normální nebo abnormální funkce genu a boj s infekčními nemocemi nebo jinými patologiemi.

Strategie léčení těchto problémů způsobem genové terapie zahrnuje terapeutické strategie, což spočívá v určení poškozeného genu a zavedení funkčního genu za účelem buď nahrazení funkce poškozeného genu nebo zesílení slabé exprese genu; nebo profylaktické strategie, jako je zavedení genu kódujícího proteinový produkt, který ovlivní danné podmínky nebo který připravý tkáň nebo orgán, aby byly citlivější k léčebnému režimu. Příkladem profylaktické strategie je, že gen, jako je gen angiostatinu, se může zavést do pacienta a ·

tak se předejde výskytu angiogeneze; nebo že se může do buňky zavést gen, který zvýší citlivost nádorových buněk k radiaci, a pak ozáření nádoru způsobí vyšší počet odumřelých nádorových buněk.

Tento vynález předvídá řadu způsobů přenosu DNK angiostatinu nebo angiostatinových regulačních sekvencí. Za způsoby genové terapie se také považuje transfekce promotorových sekvencí, které nejsou běžně spojovány s angiostatinem, nebo jiných, sekvencí, které zvyšují produkci angiostatinového proteinu. Příklad této technologie se uvádí v publikaci Transkaryotic Therapies, lne., of Cambridge, Massachusetts. Jde o použití rekombinace na základě homologie za účelem vnesení genového spínače, který v buňkách zapne gen pro erytropoietin. Další vhodnou publikací je Genetic Engineering News, Apríl 15,1994. Takové genového spínače se mohou využít pro aktivaci angiostatinu (nebo angiostatinového receptorů) v buňkách, které normálně angiostatin neexprimují (nebo angiostatinový receptorů).

Způsoby přenosu genů v případě genové terapi spadají do třech kategorií: fyzikální (např. elektroporace, přímý přenos genu a bombardování částitemi), chemický (nosiče na bázi lipidů nebo jiné nevirové nosiče) a biologický (vektory odvozené od virů a sorpce receptorů). Jako ne-virové vektory se mohou používat lipozómy obalené DNK. Takové komplexy liposom/DNK se mohou přímo intravenózně vnést do pacienta. Věří se, že komplexy liposom/DNK se koncentrují v játrech, kde zavedou DNK do makrofágů a Kupfférových buněk. Tyto buňky dlouho přežívají, proto umožňují dlouhodobou expresi zavedené DNK. Vektory nebo holá DNK genu se mohou přímo aplikovat injekcí do orgánu, tkáně nebo nádoru za účelem cíleného zavedení terapeutické DNK.

Metodika genové terapie se může také popsat pomocí cílového místa. Základní způsoby zavádění genů zahrnují • ·

přenos genu ex vívo, in vivo a in vitro. V případě způsobu ex vivo jsou buňky vyjmuty z pacienta a kultivuji se v buněčné kultuře. DNK se přenese do buněk, transfekované buňky se pomnoží a pak se reimplantují pacientovi. V případě přenosu genu in vitro se transformované buňky kultivují v kultuře, používají se buňky tkáňových kultur, nikoli určité buňky určitého pacienta. Do těchto laboratorních buněk se vnese cizorodá DNK a izolují se transfekované buňky, které se pomnoží pro implantaci pacientovi nebo pro jiný účel.

Přenos genu způsobem in vivo zahrnuje vneseni DNK do buněk pacienta, kdy buňky zůstávají v těle pacienta. Pro tyto účely se používá způsob přenosu zprostředkovaný neinfekčními viry nebo přímá aplikace holé DNK injekcí do určitého místa pacienta. DNK se posbírá procentem buněk, ve kterých je exprimován proteinový produkt genu. Další způsoby zde popsané jako je genové dělo se mohou použít při zaváděni DNK angiostatinu nebo regulačních sekvencí angiostatinu in vitro.

Chemické způsoby genové terapi používají látky na bázi lipidů, nemusí to být nezbytně liposomy. Tyto látky přenášejí DNK skrz buněčnou membránu. Lipofektiny nebo cytofektiny, pozitivní ionty na bázi lipidů, které se váží na DNK s negativním nábojem, tvoří komplexy, které mohou procházet buněčnou membránou a vnášet DNK do vnitřního prostředí buněk. Další používanou chemickou metodou je endocytóze založená na přítomnosti vhodného receptoru. Tento způsob zahrnuje navázání specifické ligandy na povrchový receptor buňky, zabalení a přenos skrz buněčnou membránu. Liganda se váže na DNK a celý komplex se přenáší do buňky. Komplex ligandy a genu se aplikuje injekcí do krevního řečiště a pak cílové buňky, které mají receptor, specificky váží ligandů a zmíněný komplex se vnese do buňky.

V mnoha způsobech genové terapie se používají virové vektory za účelem zavedení genů do buněk. Například upravené • · · · · · · · · • · »· · · · ···· · • · ··· ··· ········ ·· it· «· ·· retrovirové vektory se používají u způsobů ex vivo za účelem vnesení genů do okrajových a nádorem infiltrujících se lymfocytů, hepatocytů, epidermálních buněk, myocytů nebo jiných somatických buněk. Tyto upravené buňky se zavádějí do pacienta za účelem produkce genového produktu z vnesené DNK.

Virové vektory se mohou používat pro zavedení genů do buněk způsobem in vivo. Dále se mohou použít k řízení exprese cizorodých genů, cis-působících regulačních elementů nebo promotorů, což jsou tkáňově specifické procesy. Jinak se toho dosáhne použitím in šitu zavedení DNK nebo virových vektorů do určitých anatomických míst in vivo. Například zavedení genu do krevních cév in vivo se dosáhne implantací in vitro transdukovaných endoteliálních buněk do vybraných míst arteriální stěny. Virem infikované okolní buňky také exprimují genový produkt. Virový vektor se může zavést přímo do in vivo místa například pomocí katetru, což umožní, že se virem infikuje pouze jistá oblast. Výsledkem je dlouhodobá místně specifická exprese genu. V případě prsní a jaterní tkáně se demonstroval přenos genu in vivo za použití retrovirových vektorů. Upravený virus se aplikoval injekcí do krevních cév, které vedou do zmíněných orgánů.

Mezi virové vektory, které se používají pro genovou terapii, patří zejména retroviry, jiné RNK viry, jako je poliovirus nebo Sindbisův virus, adenovirus, adeno-asociovaný virus, herpesové viry, SV 40, vakcinie a jiné DNK viry. Nejvíce využívanými vektory pro přenos genů jsou myší retrovirové vektory s porušenou replikací. Retrovirus způsobující leukémii u myší se skládá z jednořetězové RNK, která je v komplexu spojená s jaderným proteinem a polymerázovými enzymy (pol). Komplex je obalený jaderným proteinem (gag) a je obklopený glykoproteinovým obalem (env), který určuje oblast hostitele. Genomová struktura retrovirů zahrnuje gag, pol a env geny, které jsou obklopeny 5' a 3' • ·

dlouhými koncovými repeticemi (LTR). Retrovirové vektorové systémy využívají skutečnosti, že minimální vektor obsahující 5' a 3' LTR a signál pro zbalení je dostatečný, aby umožnil zabaleni vektoru, infekci a integraci do cílových buněk za předpokladu, že virové strukturní proteiny poskytuje in trans buněčné linie. Základní výhody retrovirových vektorů pro přenos genů jsou: účinná infekce a exprese genu u většiny typů buněk, přesné včlenění jednokopiového vektoru do chromozomální DNK cílené buňky a jednoduché zacházení s genomem retroviru.

Adenovirus je tvořen lineární dvouřetězovou DNK spojenou v komplexu s jadernými proteiny. Komplex je obklopen kapsidovými proteiny. Pokroky v oblasti molekulární virologie vedou k možnostem využít biologii těchto organizmů pro účely vytvoření vektorů schopných transdukce nových genetických sekvencí do cílových buněk in vivo. Vektory založené na adenovirech silně exprimují proteinové produkty genů. Adenovirové vektory vykazují vysokou účinnost při infekci, dokonce i při použití nízkých titrů virů. Adenoviry jsou plně přenosné a nejsou nutné ani buňky bez virionů ani aplikace injekce do producentů buněčných linií. Další potencionální výhodou adenovirových vektorů je schopnost dosáhnout dlouhodobé exprese heterogenních genů in vivo.

Mechanické způsoby zavádění DNK zahrnují fúze schopné lipidové váčky jako jsou liposomy nebo jiné váčky vhodné pro membránovou fúzi, lipidové částice DNK začleňující kationický lipid jako je lipofektin. Dále sem patří transfer DNK zprostředkovaný polylysinem, přímou aplikaci DNK injekcí jako je mikroinjekce DNK do zárodečných nebo somatických buněk, pneumatické zavádění částic pokrytých DNK, v případě způsobu genového děla se používají částice zlata, a anorganické chemické přístupy jako je transfekce pomocí fosforečnanu vápenatého. Jiným způsobem je genová terapie zprostředkovaná • ·

ligandy. Tento způsob zahrnuje spojeni DNK s určitým ligandem za vzniku konjugátu ligand-DNK za účelem zavedení DNK do určité buňky nebo tkáně.

Zjistilo se, že vysokého procenta transfektovaných buněk a stálé exprese markerových genů lze dosáhnout vstříknutím plazmidové DNK do svalových buněk. Plazmidová DNK se může nebo nemusí začlenit do genomu buněk. Pokud DNK není začleněna, umožňuje to transfekci a expresi proteinového produktu genu v terminálně diferencovaných a proliferačních tkáních po prodlouženou dobu bez nebezpečí vzniku mutované inzerce, delece nebo alterace v buněčném nebo mitochondrálním genomu. Dlouhodobý, ale ne nezbytně permanentní, přenos terapeutických genů do určitých buněk může vést k léčbě genetických nemocí nebo k profylaktickému použití. DNK se může opakovaně vstřikovat za účelem udržení hladiny produktu genu bez nebezpečí vzniku mutací v genomu recipientních buněk. V případě, že se exogenní DNK nezačlení do genomu, může to vést k přítomnosti několika odlišných konstrukcí exogenní DNK v jedné buňce. Všechny uvedené konstrukce exprimuj! různé genové produkty.

Způsoby přenosu genu zprostředkované částicemi se poprvé použily u rostlinných tkání. Zařízení pro bombardování částicemi nebo genové dělo vytváří hnací sílu za účelem urychlit částice s vysokou hustotou. Tyto částice (jako je zlato nebo wolfram) jsou potaženy DNK, což umožňuje jejich vstup do cílových orgánů, tkání nebo buněk. Způsob bombardování částicemi se může použít v systémech in vitro, ex vivo nebo in vivo pro účely vnesení DNK do buněk, tkání nebo orgánů.

Elektroporace používaná pro přenos genu využívá elektrický proud, aby zajistila vyšší citlivost buněk nebo tkání k přenosu genu zprostředkovaného elektroporací. Za účelem zvýšení prostupnosti membrány takovým způsobem, že • · ·· molekuly DNK mohou vstoupit do buněk, se používá krátký elektrický impulz s danou sílou pole. Tento způsob se používá v systémech in vitro, ex vivo nebo in vivo za účelem vnesení DNK do buněk, tkání a orgánů.

Přenos genu in vivo zprostředkovaný nosičem je vhodný pro transfekci cizorodé DNK do buněk. Komplexy nosič-DNK se může bezpečně vnést do tělních tekutin nebo do krevního řečiště a tak jsou řízeny do cílových orgánů nebo tkání v těle. Mohou se použít jak liposomy tak polykationty, jako jsou polylysin, lipofektiny nebo cytofektiny. Dále se mohou vyvinout liposomy specifické pro určité buňky nebo orgán a tak se cizorodá DNK nesená liposomem dostane do cílových buněk. Jako vhodný způsob pro vnesení DNK do buněk nesoucích receptor se používá vstřikování imunoliposomů, které jsou cíleny na určitý receptor jistých buněk. Další používaný nosičový systém vhodný pro in vivo transfer genu do hepatocytů je asialoglykoproteinový/polylysinový konjugační systém.

Přenášená DNK se může také spojovat v komplexy s jinými druhy nosičů, tak, že DNK se dostane do recipientní buňky a pak zůstává v cytoplazmě nebo v nukleoplazmě. DNK se může spojovat s jadernými proteiny do určitým způsobem vytvořených váčkových komplexů a v této formě se vnáší přímo do jádra.

Genová regulace angiostatinu se může uskutečnit podáváním látek, které vážou gen angiostatinu nebo řídí oblasti spojené s genem angiostatinu nebo jejich odpovídající přepis RNK tlumí rychlost transkripce nebo translace. Buňky transfekované sekvencí DNK kódující angiostatin se mohou podávat pacientovi za účelem poskytnutí in vivo zdroje angiostatinu. Například do buněk se může vnést vektor obsahující sekvence nukleové kyseliny kódující angiostatin. Termín vektor znamená nosič, který obsahuje nebo je spojen s určitými sekvencemi nukleové kyseliny. Funkcí tohoto nosiče

je vnést do buňky určité sekvence nukleové kyseliny. Mezi vektory patři plazmidy, infekční mikroorganizmy, jako jsou viry, nebo nevirové vektory, jako jsou konjugáty ligand-DNK, liposomy, komplexy lipid-DNK. Může být vhodné, aby molekula rekombinantní DNK obsahující sekvence DNK angiostatinu byla spojena se sekvencí, která řídí její expresi, za účelem vytvoření vektoru schopného exprimovat angiostatin. Pro transfekci se mohou použít buňky získané z normální nebo nemocné tkáně pacienta nebo buňky, které nepocházejí z pacienta.

Nádorové buňky získané z pacienta se mohou po transfekci vektorem schopným exprimovat angioatatinový protein vrátit opět do pacienta. Takto upravené nádorové buňky mohou v těle pacienta produkovat angiostatin v množství, které inhibuje růst nádoru. Pacientem může být člověk nebo zvíře. Pro transfekci buněk se mohou použít fyzikální nebo chemické způsoby dobře známé v oboru, jako jsou elektroporace, iontoporace nebo se může použít genové dělo. DNK angiostatinu se může aplikovat přímo do pacienta injekcí a nemusí se přidávat nosič. DNK angiostatinu se může aplikovat podkožně, do svalu nebo krve.

Vnesení angiostatinu do pacienta v rámci genové terapie může probíhat prostřednictvím začlenění DNK angiostatinu do genomu buněk, do minichromozomů nebo jako odděleně se replikující nebo se nereplikujicí konstrukce DNK nacházející se v cytoplazmě nebo v nukleoplazmě buňky. Exprese angiostatinu může přetrvávat po dlouhý časový úsek nebo se musí příslušná tkáni, orgánu angiostatinového

DNK opakovaně vstřikovat, nebo v krvi udržela aby se vhodná v buňce, hladina proteinu.

se může

Angiostatin (tabulka 3). Angiostatinový izolavat na koloně

HPLC C4 protein je z až 35% vymýván acetonitrilovým gradientem. Po elektroforéze na SDS • · ·

• ·

(dodecylsulfát sodný) polyakrylovém gelu (PAGE) za redukčních podmínek se vymytý aktivní protein jeví jako jediný pík ve vzdálenosti odpovídající molekulové hmotnosti přibližně 38 kD.

Vynálezce ukázal, že růst primárního nádoru se spojuje s uvolněním určitého inhibitoru(ů) proliferace do krevního řečiště. Mezi ně se zahrnuje angiostatin, který může potlačit angiogenezi v metastázách, čímž inhibuje růst samotných metastáz. Zdroj angiostatinu spojený s primárním nádorem není znám. Látky se mohou produkovat degradací plazminogenu specifickou proteázou. Angiostatin se může produkovat expresí specifického genu pro angiostatin.

Angiogenní fenotyp primárního nádoru závisí na produkci angiogenních proteinů v nadbytku endoteliálních buněčných inhibitorů, které zpracovávají normální buňky. Věří se, že se produkce angiostatinu snižuje při přechodu do stádia neoplazie. Zatímco produkce angiostatinu se v jednotlivé nádorové buňce snižuje přiměřeně k produkci jejich mateřské buňky, celkové množství inhibitoru zpracované celým nádorem je dostatečné pro zahájení cirkulace a potlačení endoteliálního růstu ve Vzdálených místech mikrometastáz. Angiostatin cirkuluje po podstatně delší dobu než se z primárního nádoru uvolňuje angiogenní protein(y). Zdá se, že angiogenní proteiny působí lokálně, zatímco angiostatin působí globálně a cirkuluje v krvi s relativně dlouhou dobou poločasu rozkladu. Doba poločasu rozkladu se přibližně pohybuje mezi 12 hodinami a 5 dny.

Věří se, že když se nádor stává angiogenní, uvolňuje se jeden nebo více angiogenních proteinů (např. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF, atd.). Tyto proteiny působí místně, směřují do endotelia v okolí primárního nádoru z extravaskulárního směru a necirkulují (nebo cirkulují s krátkým poločasem rozkladu). Tyto angiogenní proteiny se musí produkovat v dostatečném • β ·· ·· · ·· ·· ♦ · · - · · · ·· · · · · ___~ 7.- ,ζ · ____: — ...., ι Φ ·ι < ” ············ • · ··· ··· ···· ···· ·· ··· ·· ·' množství, aby překonaly působení endoteliálního buněčného inhibitoru (inhibitory angiogeneze) primárního nádoru a aby pokračovaly v rozšiřování jeho populace. V případě dobrého růstu nádoru pokračuje uvolňování endoteliálních buněčných inhibitorů do oběhu. Podle této hypotézy inhibitory působí v určité vzdálenosti od primárního nádoru a směřují do kapilárního endotelia metastáz z intravaskulárního směru a pokračují v cirkulaci. Pak právě v čase, kdy vzdálené metastázy mohou zahájit angiogenezi, kapilární endotelium v jejich okolí může být inhibováno vstupujícím angiostatinem.

Po té, co primární nádor dosáhne dostatečné velikosti, angiostatin se průběžně uvolňuje do oběhu. Pro druhý implantát (nebo metastázy) nádoru je obtížné zahájit nebo zesílit jeho vlastní angiogenezi. Jestliže se druhý nádorový implantát (např. do podkožního prostoru nebo do rohovky nebo intravenozně do plic) objeví krátce po té, co je implantován primární nádor, primární nádor není schopen potlačit sekundární nádor (protože angiogeneze v sekundárním nádoru již bude probíhat). Jestliže se implantují dva nádory současně (např. do protilehlých slabin), inhibitory mohou mít stejný inhibiční účinek na každý z nich.

Angiostatin podle vynálezu se může:

(i) podávat lidem nebo zvířatům s nádorem jako angiogenní terapie;

(ii) sledovat v lidském nebo zvířecím séru, moči nebo tkáni jako markér vhodný pro určení prognózy; a (iii) použít jako základ pro analýzu podobných angiostatických molekul v séru a moči pacientů s rakovinou.

Podle vynálezu se angiostatin může izolovat z tělních tekutin, jako je krev nebo moč pacientů, nebo se angiostatin může připravovat způsoby využívající rekombinantní DNK nebo chemickými způsoby za vzniku syntetického proteinu. Tyto ·· ·· ·· · ·· ··“ ···· «··· · · · · * > * - · - · · · *♦• · · · · » · ··· · · • · «·· ··· «··· ···· ·· ··· ·· ·· metody jsou dobře známy v oboru. Způsoby čištěni proteinu jsou dobře známy v oboru a určité příklady způsobu čištění angiostatinu a testování jeho inhibiční aktivity se uvádějí dále v příkladech vynálezu. Izolace lidského endogenního angiostatinu se provádí podobnými způsoby.

Jeden příklad způsobu produkce angiostatinu použitím rekombinantní DNK vyžaduje tyto kroky: (1) identifikaci a čištění angiostatinu, jak se uvádí shora a jak se detailně popisuje níže, (2) určení aminokyselinové sekvence N-konce čištěného inhibitoru, (3) vytvoření syntetických oligonukleotidových primerů pro 3'a 5'konce DNK angiostatinu, (4) amplifikace genové sekvence angiostatinu za použití polymerázy, (5) začlenění amplifikované sekvence do příslušného expresivního vektoru, (6) vnesení vektoru obsahujícího gen do mikroorganizmu nebo jiného expresivního systému schopného exprimovat inhibitorový gen a (7) izolace rekombinantě produkovaného inhibitoru. Příslušné vektory mohou zahrnovat virové, bakteriální a eukaryontní (jako jsou kvasinkové) expresívní vektory. Shora uvedené metody jsou úplněji popsány v laboratorním manuálu Molecular Cioning: A Laboratory Manual Second Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989. Sekvence DNK lidského plazminogenu se zveřejnila v publikaci Browne, M.J., et al., Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplasminogen in HeLa cells Fibrinolysis Vol.5(4), 257-260, 1991).

Gen kódující angiostatin se může také izolovat z buněk nebo tkáně (jako jsou nádorové buňky), jenž exprimují vysokou hladinu angiostatinu, těmito kroky: (1) izolace mediátorové RNK z tkáně, (2) použitím reverzní transkriptázy vytvořit odpovídající sekvenci DNK a pak (3) použitím polymerázové řetězové reakce (PCR) a příslušných primerů amplifikovat sekvenci DNK kódující aminokyselinovou sekvenci aktivního angiostatinu.

způsob přípravy angiostatinu nebo jeho fragmentů je syntéza proteinu. Jestliže aktivní fragment angiostatinu použitím testovacího který sekvenovat

Další aktivních biologicky systému, fragment proteinové sekvenace. nebo sekvence způsobem výše manuálního nebo • · ·· · · • · · 9 ··

9 99 • · 9· ·······9 9 je podrobněji popsán dále, například způsobem V jiném případě, kdy která kóduje angiostatin, se tato sekvence určí

DNK, popsaným, automatizovaného způsobu dobře znám v oboru. Sekvence nukleové • 9999

9__9_____· --··...

99

99

9

999 biologicky se najde může se tento automatizované informace případě, způsobem, fragmentu se může určit týkaj ící že se vytvoří jako je tryptické štěpení, je

Jestliže se izoluje gen například použitím který je poskytuje Pak v sekvenace, kyseliny sekvence.

určitým

N-konec sekvence se aminokyselinové biologicky aktivní fragment nebo jestliže sekvenován, zbývající aminokyselinová ; z odpovídající sekvence DNK.

i aminokyselinová může syntetizovat jak je doloženo v

Practical Approach E.Atherton and R.C. Press, Oxford, England. Podobně se mohou vícenásobné ' fragmenty, účelem vytvoření velkého sekvence způsoby, publikaci tr proteinu je známa, které jsou v oboru Solid Phase Protein které se spojují fragmentu. Tyto určitých místech testovat jejich a in vivo.

fragment se dobře známy,

Synthesis:

Sheppard, IRL syntetizovat dohromady za syntetické proteinové fragmenty mohou mít v aminokyselinovou substituci, aby se mohla agonistická a antagonistická aktivita in vitro

Proteinové fragmenty, které mají vysokou afinitu vázat se na tkáň, se mohou použít k izolaci angiostatinového receptorů na afinitních kolonách.

receptorů je základní angiostatinu. Izolace agonistů zmírnění receptorů působení a určení

Izolace a čištění angiostatinového krok k objasnění mechanizmu angiostatinového receptorů antagonistů angiostatinu ulehčí vývoj aktivity angiostainového receptorů.

umožní konstrukci nukleotidových léků pro

Izolace sond pro • 4 «·

monitorování umístění a syntézy receptorů za použití metod hybridizace in šitu. Izolovaný gen kódující angiostatinový receptor se může začlenit do expresivního vektoru a vnést do buněk, jako jsou nádorové buňky pacienta, za účelem zvýšení schopnosti buněk, tkáně nebo nádoru vázat angiostatin a inhibovat místní angiogenezi.

Angiostatin je účinný u léčení nemocí nebo procesů zprostředkovaných angiogenezi nebo nemocí, které angiogenezi zahrnují. Vynález obsahuje způsob léčby nemocí zprostředkovaných angiogenezi pomocí účiného množství angiostatinu nebo jeho biologicky aktivního fragmentu nebo kombinací angiostatinových fragmentů, které společně vykazují anti-angiogenní aktivitu, nebo agonistů a antagonistů angiostatinu. Nemoci zprostředkované angiogenezi zahrnují pevné nádory; v krvi vzniklé nádory, jako jsou leukémie; metastázy nádorů; benigní nádory, například hemangiom, akustické neuromy, neurofibromy, trachomy a hnisavé granulomy; revmatoidní artritida; psoriasis; oční angiogenní nemoci, například diabetická retinopatie, retrolentální fibroplazie, makulární degenerace, odloučení štěpu rohovky, neovaskulární glaukom, ťubeosis; Osler-Webbrův syndrom; myokardiální angiogeneze; plaková neovaskularizace; telangiectasie; hemofilické klouby; angiofibrom; zrnitost ran. Angiostatin se používá při léčbě nemocí nadměrné a abnormální stimulace endoteliálních buněk. Tyto nemoci zahrnují intestinální adhezi, Crohnovu nemoc, arterosklerózu, sklerodermie a hypertrofní jizvy, t.j. keloidy. Angiostatin se může použít jako antikoncepční činidlo, které slouží k předcházení vaskularizace nutné pro zachycení embrya. Angiostatin se dále používá při léčení nemocí, kde se vyskytuje angiogeneze jako patologický následek jako u nemoci kočičího škrábnutí (Rochele minalia quintosa) a vředů (Helicobacter pylori).

Syntetické proteinové používají pro různé účely, specifitou a aviditou váže fragmenty angiostatinu se Protein, který se s vysokou na receptor angiostatinu, se používá po označení radioaktivní látkou kvantifikaci vazebných míst za použití k vizualizaci a autoradiografické metody a metody, při které se využívá schopnost vázat se na membránu. Tato aplikace je důležitá pro diagnózu a výzkum. Znalosti vazebných vlastností receptorů angiostatinu umožňuje výzkum transdukčních mechanizmů vazby na receptor.

Proteiny angiostatinu značené izotopy s krátkým poločasem rozpadu umožňují vizualizaci vazebných míst in vivo za použití pozitronové emisní tomografie nebo jiných moderních radiografických metod. Což se využívá pro lokalizaci nádorů s angiostatinovými vazebnými místy.

Systematická substituce aminokyselin těmito syntetickými proteiny vede ke vzniku agonistů a antagonistů s vysokou afinitou k angiostatinovému receptorů, které zvyšují nebo naopak snižují možnost navázání angiostatinu na jeho receptor. Takové agonisty se používají za účelem potlačení růstu mikrometastáz, čímž se omezuje rozšíření metastáz. Antagonisty k angiostatinu se aplikují v situacích, které nejsou adekvátní vaskularizaci, za účelem inhibice účinku angiostatinu a podpoření angiogeneze. Tato aplikace může být účinná při podpoře léčení poranění u diabetiků.

Angiostatinové proteiny se používají pro vývoj afinitních kolon, které jsou vhodné pro izolaci angiostatinového receptorů z kultivovaných nádorových buněk. Po izolace a čištění angiostatinového receptorů následuje sekvenování aminokyselin. Za použití těchto informací se může určit a izolovat gen nebo geny kódující angiostatinový receptor. Dále se připravují sekvence klonovaných nukleových kyselin pro jejich začleněni do vektorů schopných exprese receptorů. Tyto metody jsou mezi odborníky v oboru dobře • ·

známy. Transfekce sekvence (i) nukleových kyselin kódujících angiostatinový receptor do nádorových buněk a jeho exprese zvyšuje odezvu těchto buněk na endogenní nebo exogenní angiostatin a tím se snižuje rychlost růstu metastáz.

Cytotoxická činidla jako je ricin vázaná na angiostatin a proteinové fragmenty angiostatinu účelně ničí buňky, které vážou angiostatin. Tyto buňky se mohou nacházet na mnoha místech, jako jsou metastázy a primární nádory. Za účelem dosáhnout efektivního přístupu do požadovaného místa, se proteiny vážou na cytotoxické činidlo podávají se infuzi. Například ricin vázaný na angiostatinové fragmenty s vysokou afinitou se zavádí kanylou do cév, které zásobují cílové místo, nebo se aplikuje rovnou do tohoto místa. Zmíněná činidla se také zavádějí řízeným způsobem pomocí osmotických pump připojených k infúzním kanylám. Kombinace angiostatinových antagonistů se může podávat spolu se stimulátory angiogeneze za účelem zvýšení vaskularizace tkáně. Tento léčebný režim je účinný při potlačení rakoviny s metastázami.

Angiostatin se může použít v kombinaci s dalšími sloučeninami a s běžnými 'způsoby léčení nemocí. Například nádor se může běžným způsobem operovat, léčit radiací nebo chemoterapií ve spojení angiostatinem. Angiostatinu se může následně podávat pacientům za účelem potlačení metastáz, stabilizace a potlačení růstu primárního nádoru. /Angiostatin, agonisty a antagonisty angiostatinového receptorů nebo jejich kombinace, angiostatinové fragmenty a antiséra se kombinují s farmaceuticky přijatelnými excipienty a stále se uvolňujícími látkami, jako jsou biologicky rozložitelné polyméry, za účelem vytvoření léčebných přípravků.

Jako stále se uvolňující látky se v tomto případě používají materiály, obvykle polyméry, které jsou rozpustitelné, odbouratelné enzymaticky nebo kyselou/bazickou • · hydrolýzou. Po té, co se takový materiál zavede do těla, začnou na něj působit enzymy a tělní tekutiny. Stále se uvolňující látky se vybírají z bikompatibilních materiálů, jako jsou liposomy, polylaktidy (kyselina mléčná),

polyglykolidy (polymér kyseliny glykolové), polylaktidy-koglykolidů (kopolyméry kyseliny mléčné a glykolové) , polyanhydridy, póly(orto)estery, polyproteiny, kyselina hyaluronová, kolagen, sulfát chondroitinu, kyseliny karboxylové, tukové kyseliny, fosfolipidy, polysacharidy, nukleové kyseliny, polyaminové kyseliny, aminokyseliny, jako jsou fanylalanin, tyrosin, izoleucin, polynukleotidy, polyvinylpropylén, polyvinylpyrrolidon a silikon.

Preferovanými biologicky rozložitelnými látkami jsou polylaktidy, polyglykolidy nebo polyaktidy-ko-glykolidy (kopolyméry kyseliny mléčné a glykolové).

Léčebné kompozice, které tlumí angiogenezi podle tohoto vynálezu mohu být pevné, kapalné látky nebo aerosoly a mohou se podávat libovolným známým způsobem. Například pevné léčebné kompozice zahrnují tablety, krémy a implantovatelné dávkovači jednotky. Tablety se podávají orálně, krémy se aplikují povrchově. Implantovatelné dávkovači jednotky se aplikují místně, například do místa nádoru. Ty jednotky, které se slouží k systematickému uvolňování léčebné kompozice tlumící angiogenezi, se implantují podkožně. Například kapalné kompozice zahrnují formulace upravené pro podkožní, intravenózní, intraarteriální injekce a formulace podávané povrchově a do oka. Aerosolové formulace zahrnují inhalační formulace pro aplikaci do plic.

Angiostatin podle vynálezu se může také použít pro tvorbu protilátek, které jsou specifické pro inhibitor nebo jeho receptor. Protilátky mohou být buď polyklonální nebo monoklonální. Zmíněné protilátky, které se mohou specificky vázat na angiostatin nebo jeho receptor, se mohou použít pro

diagnostických metodách nebo v soupravách pro detekci a kvantifikaci angiostatinu nebo jeho receptorů v tělních tekutinách nebo tkáních. Tyto soupravy jsou dobře známy v oboru. Výsledky těchto testů se mohou použít pro diagnostiku a pro předpověď výskytu a opětovného výskytu rakoviny nebo jiných nemocí spojených s angiogenezí.

Angiostatin se může také použít v diagnostických metodách a soupravách pro detekci a kvantifikaci protilátek schopných vázat angiostatin. Tyto soupravy umožňují detekci a kvantifikaci cirkulujících angiostatinových protilátek, které poukazují na rozšíření metastáz v přítomnosti angiostatinu, který je vylučován primárnímy nádory in šitu. U pacientů, kteří mají zmíněné cirkulující anti-angiostatinové protilátky, se může pravděpodobněji vyvtvořit více nádorů nebo více druhů rakovin a může se u nich pravděpodobněji objevit opětný výskyt rakoviny po léčbě nebo po uplynutí doby reemise. Fab fragmenty těchto anti-angiostatinových protilátek se mohou použít jako antigeny pro vytvoření séra proti anti-angiostatinovému Fab fragmentu. Zmíněné sérum slouží k neutralizaci anti-angiostatinových protilátek, což sníží odstraňování cirkulujícího angiostatinu pomocí antiangiostatinových protilátek, čímž se účinně zvýší hladina cirkulujícího angiostatinu.

Dále vynález popisuje způsob blokování působení nadměrného množství endogenního angiostatinu. Což se může dít pasivní imunizací lidí nebo zvířat protilátkami, které jsou specifické k angiostatinu, jenž je v systému nežádoucí. Tento zásah je důležitý v případě léčby abnormální ovulace, menstruace, tvoření placenty a vaskularizace. Tento způsob slouží k testování účinků angiostatinu při odstraňování metastatických procesů. Fab fragment angiostatinových protilátek obsahuje vazebné místo pro angiostatin. Tento fragment se izoluje z angiostatinových protilátek za použití · · ·· ·· ___ · _______·.·___ • · · · · ···· • · · · · · · · · · · • · · · · · · ········ ·· ··· ·· ·* metody, která je známa v oboru. Fab fragmenty angiostatinového antiséra se používají jako antigeny za účelem tvorby séra proti Fab fragmentu. Infúze tohoto antiséra proti Fab fragmentům angiostatinu brání angiostatinu vázat se na angiostatinové protilátky. Léčebný účinek se získá neutralizací endogenních anti-angiostatinových protilátek blokováním navázání angiostatinu na Fab fragmenty anti-angiostatinu. Tato léčba usnadňuje schopnost endogenního cirkulujícího angiostatinu dosáhnout cílových buněk, čímž se potlačí rozšíření metastáz.

Rozumí se, angiostatinu, které Vynález popisuje angiostatinového angiostatinového angiostatinovou substituce nebo že vynález se týká libovolných mají endoteliální inhibiční úplný proteinu proteinu.

aktivitou, cukr nebo angiostatinový biologicky Mezi ně protein, aktivní derivátů aktivitu.

deriváty fragmenty patří proteiny s které mají aminokyselinové jiná molekula je připojená k funkčním skupinám. Vynález dále popisuje angiostatin, angiostatinový receptor a aminokyselinovým geny kódující proteiny, které tyto geny exprimují.

Proteiny a proteinové které jsou shora podstatně čištěné ve farmaceuticky známých v oboru. Tyto standardnímy způsoby. Obecně povrchově, transdermálně, intracerebroventrikulárně, intrauterinálně, orálně, aktivitou, izolované fragmenty metod použití podávat podávat intrakraniálně, intravaginálně, fragmenty s popsány, se proteiny přijatelných oboru.

angiostatinovou připravují jako nebo proteinové formulacích za formulace se mohou se mohou kombinace intraperitonálně, intracerebrálně, rektálně nebo parenterálně (např. intravenózně, intraspinálně, podkožně nebo do svalu). Angiostatin se může spojit s biologicky rozložitelnými polyméry, které umožňují soustavné uvolňování látky. Polyméry se implantují do blízkosti místa, kde je žádoucí výskyt léku, například do místa nádoru, nebo se implantují takovým způsobem, že se angiostatin vylučuje pozvolna a systematicky. Mohou se použít také osmotické minipumpy, které umožňují kontrolované zavádění vysokých koncentrací angiostatinu kanylou do místa zájmu, například přímo do místa růstu metastáz nebo do vaskulárního systému, který zásobuje nádor. Biologicky rozložitelné polyméry a jejich použití se detailně popisuje například v piblikaci J. Neurosurg.74:441-446 (1991).

Dávka angiostatinu podle vynálezu závisí na stádiu nemoce nebo podmínkách, které se léčí, a jiných klinických faktorech, jako jsou hmotnost a stav člověka nebo zvířete a způsob podání látky. Při léčbě lidí a zvířat se podává přibližně 0,5 mg/kg až 500 mg/kg angiostatinu. V závislosti na poločase rozpadu angiostatinu u lidí a určitých zvířat se angiostatin podává v časovém rozmezí několikrát za den až po jednou za týden. Rozumí se, že tento vynález zahrnuje aplikaci na zvířatech a lidech. Způsob podle vynálezu popisuje jedinou dávku nebo opakovanou dávku aplikovanou průběžně nebo po uplynutí určitý časový úsek.

Angiostatinové formuláce zahrnují ty, které jsou vhodné pro orální, rektální, oční (intravitreální nebo intrakamerální), nasální, povrchovou (bukální, sublinguální), intrauterinární, vaginální nebo parenterální (podkožní, intraperitoneální, intramuskulární, intravenózní, intradermální, intrakraniální, intratracheální a epidurální) aplikaci. Angiostatinové formulace se mohou vyskytovat ve formě dávkovačích jednotek a mohou se připravovat běžnými farmaceutickými způsoby. Zmíněné způsoby zahrnují spojení s aktivní látkou a farmaceutickým nosičem(či) nebo excipientem(ty). Formulace se připravují jednotným a těsným spojením aktivní látky s kapalnými nosiči nebo jemnými

pevnými nosiči nebo s oběma typy a je-li potřeba, produktu se tvaruj e.

Formulace vhodné pro parenterálni aplikaci zahrnuje vodní a nevodní sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostaty a rozpouštědla, která způsobují, že formulace jsou stejně izotonické jako je krev příjemce; vodní a nevodní sterilní suspenze, která obsahují suspendující a zahušťující činidla. Formulace se mohou vyskytovat v kontejnerech obsahujících pouze jednu nebo více dávek, například v zatavených ampulích a skleničkách a mohou se skladovat v lyofilizovaném stavu, což pro přípravu injekcí vyžaduje pouhé přidání sterilního kapalného nosiče, například vody, těsně před použitím. Provizorní injekční roztoky a suspenze se mohou připravit ze sterilních prášků, granulí a tablet.

Preferované jsou jednodávkové formulace, které obsahují jednotlivou denní dávku nebo denní sub-dávku nebo vhodnou frakci podávaných ingrediencí. Rozumí se, že mimo přísad, které jsou výše zmiňovány, formulace podle vynálezu může zahrnovat další činidla, které se běžně používají v oboru, vzhledem k typu formulace. Cytotoxická činidla se mohou začlenit nebo jinak kombinovat s angiostatinovými proteiny nebo jejich biologicky fungujícími proteinovými fragmenty a tak poskytují dvojí účinek.

Proteiny inhibující angiogenezi podle vynálezu se mohou syntetizovat ve standardním mikrochemickém zařízení a čistota se kontroluje pomocí HPLC a hmotnostní spektrofotometrie. Způsoby syntézy proteinů, čištění pomocí HPLC a hmotnostní spektrofotometrie jsou běžně známy v oboru. Angiostatinové proteiny a proteiny angiostatinových receptorů se také produkují rekombinantními kmeny E.coli nebo v kvasinkových expresivních systémech a čistí se na chromatografických kolonách.

Různé proteinové fragmenty molekuly neporušeného angiostatinu se syntetizuji pro účely použití jako antigenů pro vývoj specifického antiséra, jako agonistů a antagonistů, které jsou aktivní v angiostatinových vazebných místech, jako proteinů, které se navážou nebo se zkombinují s cytotoxickými činidly toxickými pro cílové buňky vázající angiostatin. Sekvence angiostatinu, které obsahují tyto proteiny, se selektují na základě jejich pozice v externí oblasti molekuly a jsou dostupné k vytvoření vazby s antisérem. Amino- a karboxyl-konce stejně jako střední část molekuly jsou mezi fragmnety znázorněny samostatně za účelem jejich syntézy.

Tyto proteinové sekvence se srovnávají se známými sekvencemi za použití proteinové sekvenční databáze, jako je GenBank, Brookhaven Protein, SWII-PROT a PIR, za účelem určit sekvenční homologie. Tyto informace eliminují sekvence, které vykazují vysoký stupeň sekvenční homologie k jiným molekulám, čímž se zvyšuje potenciál pro vysokou specifitu vyvíjeného antiséra, agonistů a antagonistů k angiostatinu.

Angiostatin a od angiostatinu odvozené proteiny se mohou molekulami pomocí standardních metod, konce angiostatinu obsahující tyrosinové značí izotopy nebo jinými ne se používá řada metod použitím běžných metod jodogen, laktoperoxidáza;

Bolton-Hunterovo činidlo). Tyto značící které nemají se k čemuž spojovat s jinými Amino- a karboxylové a lysinové zbytky radioaktivními látkami, například radioaktivní (tyrosinové zbytky- chloramin T, lysinové zbytky metody jsou dobře známy v oboru. K fragmentům, značení zmíněné zbytky usnadňující značení reaktivních amino- a hydroxylových skupin proteinu, se přidává tyrosin a lysin. Způsob spojení se vybírá na základě funkčních skupin dostupných na aminokyselinách, které zahrnují aminoskupinu, merkaptoskupinu, karboxylovou skupinu, amid, fenol a imidazol. Různá činidla používaná k ovlivnění tohoto párování

zahrnuji mezi jinými glutaraldehyd, diazotizovaný benzidin, karbodiimid a p-benzochinon.

Angiostatinové proteiny se chemicky spojují s izotopy, enzymy, s nosičovými proteiny, cytotoxickými činidly, fluorescenčními molekulami, chemiluminiscenčními, bioluminiscenčními a dalšími látkami pro různé účely použití. Účinnost spojovacích reakcí se určuje použitím různých metod vhodných pro určité reakce. Například radioaktivní značení angiostatinového proteinu pomocí ¹²⁵I se uskutečňuje použitím chloraminu T a Na¹²⁵I s vysokou specifickou aktivitou. Reakce se přerušuje použitím disiřičitanu sodného a směs je odsolena na kolonách na jedno použití. Značené proteiny se vymývají z kolony a tyto frakce se sbírají. S každé frakce alikvoty a měří Tímto způsobem angiostatinového specifickou radioaktivitou jako je testování schopnosti antisérum.

se jejich se oddělí proteinu.

se oddělí radioaktivita nezreagovaný

Proteinové na gamma

Na¹²⁵! od počítači.

značeného vysokou použití, angiostatinové frakce s pro se skladují vázat se na další

Jiná aplikace proteinového konjugátu je produkce polyklonálního antiséra. Například angiostatinové proteiny obsahující lysinové zbytky se váží pomocí glutaraldehydu na čištěný albumin hovězího séra. Účinnost reakce se určuje měřením začlenění radioaktivně značeného proteinu. Nezreagovaný glutaraldehyd a protein se oddělí dialýzou. Konjugát se skladuje pro případ dalšího použití.

Může se vytvořit antisérum proti angiostatinu, jeho analogům, proteinovým fragmentům angiostatinu a angiostatinovému receptorů. Po syntéze proteinu a jeho čištění se tvoří monoklonální a polyklonální antiséra za použití metody známé v oboru. Například polyklonální antiséra se tvoří v králících, ovcích, kozách nebo v jiných zvířatech.

Angiostatinové proteiny spojené s molekulou nosiče jako je • · · • · • · • · albumin hovězího séra nebo sám angiostatin se kombinují se směsí adjuvantu, upravují se do formy emulze a aplikují se podkožní injekcí do více míst na zádech, krku, bocích a někdy do polštářků na nohách. Další injekce se aplikuje v pravidelných intervalech, jako každé 2 až 3 týdny. Vzorky krve se odebírají punkcí žil, například z okrajových ušních žil po dilataci, přibližně 7 až 10 dnů po každé injekci. Vzorky krve se nechají srážet přes noc při teplotě 4°C a centrifugují se přibližně při 2400xg, při teplotě 4°C a po dobu 30 minut. Sérum se oddělí, rozdělí se do alikvótů a skladuje se při teplotě 4°C, pokud se bezprostředně použije nebo při teplotě -20°C až -90°C za účelem následné analýzy.

U všech vzorků sér vzniklých při tvoření polyklonálního antiséra nebo vzorků média odebraných při produkci monoklonálního antiséra se určuje titr protilátek. Titr se zjišťuje několika způsoby, například použitím dot blot analýzy a testu hustoty a také srážením radioaktivně značených komplexů protein-protilátka za použití proteinu A, sekundárního antiséra, chlazeného etanolu nebo směsi aktivního uhlí a dextranu, po čemž následuje měření aktivity na gamma počítači. Nejvyššú titr antiséra se také čistí na afinitních kolonách, které jsou běžně dostupné. Angiostatinové proteiny se váží na gel v afinitní koloně. Vzorky antiséra procházejí skrz kolonu a anti-angiostatinové protilátky zůstávají navázány v koloně. Tyto protilátky se z velké části vymyjí, shromáždí se a určí se jejich titr a specifita.

Angiostatinové sérum s nejvyšším titrem se testuje za účelem zjištění: a) optimálního ředění antiséra, při kterém je nejvyšší možnost specifické vazby s antigenem a nejnižší nespecifické vázání, b) schopnosti vázat zvýšené množství angiostatinového proteinu ve standardní vytěsňovací křivce,

c) potencionální křížové reaktivity s příbuznými proteiny a

proteiny, které zahrnují plazminogen a také angiostatin příbuzných biologických druhů, d) schopnosti určit angiostatinové proteiny v extraktu plazmy, moče, tkání a v mediu buněčné kultury.

Soupravy pro měření angiostatinu a jeho receptorů jsou součástí vynálezu. Antiséra s nejvyšším titrem a specifitou a ty, která mohou sloužit pro detekci angiostatinových proteinů v extraktech plazmy, moče, tkáně a v mediu buněčné kultury se dále zkoumají z důvodu možnosti použití v soupravách pro rychlé, spolehlivé, citlivé a specifické měření a určení lokalizace angiostatinu. Tyto testovací soupravy se používají pro konkurenční a nekonkurenční testy, radioimunotesty, bioluminiscenční a chemiluminiscenční testy, fluorometrické testy, sendvičové testy, imunoradiometrické testy, dot bloty, testy využívající navázání enzymů, které zahrnují ELISA, mikrotitrační destičky, papírky a tyčinky potažené protilátkami používané pro rychlé sledování moče nebo krve a imunocytochemie. Pro každou soupravu se stanovuje rozmezí citlivosti, spolehlivosti, přesnosti, specifity a reprodukovatelnosti testu. Kolísání hodnot uvnitř testu a mezi testy se stanovuje v bodech, které značí 20%, 50% a 80% standardní vytěsňovací křivky nebo křivky aktivity.

Jedním příkladem soupravy, která se běžně používá ve výzkumu a v klinické praxi je souprava pro radioimunotest (RIA) . RIA test, kde se používá angiostatin, se popisuje dále. Po provedení úspěšné radiojodizace a čištění angiostatinu nebo angiostatinového proteinu se do zkumavek, které vykazují ve vhodné pufru relativně konstantní množství radioaktivity, jako je 10 000 cpm, přidá antisérum s nejvyšším titrem. Jiné zkumavky obsahují pufr nebo preimunizační sérum z důvodu zjištění nespecifikého vázání. Po inkubaci při teplotě 4°C po dobu 24 hodin se přidá protein A, obsah zkumavek se promýchá na vortexu, inkubujě se

při teplotě místnosti po dobu 90 minut. Během inkubace se sráží komplexy protilátek a značeného antigenu. Zkumavky se centrifugují přibližně při 2 000 až 2 500 x g a při teplotě 4°C. Odsaje se supernatant a na gamma počítači se měří radioaktivita peletu, které má schopnost proteinu po odečtení

Charakterizuje se vázat přibližně 10 nespecifického vázání.

ředění až 40% antiséra, značeného

Rozsah ředění (přibližně 0,1 pg až ng) angiostatinového proteinu užívaného pro vývoj antiséra se hodnotí, tak, že se do zkumavek obsahujících radioaktivně značený protein a antisérum, přidá známé množství proteinu.

Po prodloužené inkubaci například 24 až 48 hodin se přidá protein A a zkumavky se centrifugují, odstraní se supernatant a měří se radioaktivita peletu. Vytěsnění radioaktivně značeného angiostatinového proteinu neznačeným angiostatinovým proteinem (standard) ukazuje standardní křivka. Do testovacích zkumavek se přidá za účelem charakterizace specifity angiostatinového séra několik koncentrací jiných angiostatinových proteinových fragmentů, plazminogenu, angiostatinu z různých biologických druhů a homologní proteiny.

Extrakty z různých tkání, které zahrnují primární a sekundární nádory, Lewisův plicní karcinom, kultury buněk produkujících angiostatin, placentu, dělohu a jiné tkáně, jako je mozek, játra a střeva, se připravují extrakčními metodami, jenž se s úspěchem používají při extrakci angiostatinu. Po lyofilizaci tkáňových extraktů nebo po jejich vysušení na zařízení Speed Vac se přidá testovací pufr a různé alikvóty extraktů se dají do zkumavek vhodných pro RIA test. Extrakty známých buněk, které produkují angiostatin, se použijí pro stanovení vytěsňovacích křivek, které jsou pararelní ke standardním křivkám, zatímco extrakty tkání, které neprodukují angiostatin nevytěsňují radioaktivně ··· ·· ·· .·· • · · · • · · · · • · · · «··· ···· 4· ·· 4· :-9½..

99·

999 99

99

9999 značený angiostatin z angiostatinového antiséra. Do testovacích zkumavek se přidají ve vzrůstajícím množství extrakty moče, plazmy a cerebrospinální tekutiny získané ze zvířat s Lewisovým plicním karcinomem. Pararelní vytěsňovací křivky upozorňují na možnost využití angiostatinového testu pro měření angiostatinu v tkáních a tělních tekutinách.

Tkáňové extrakty obsahující angiostatin se charakterizují použitím HPLC s reverzní fází. Sbírají se vymyté frakce, suší se na zařízení Speed Vac, rozpouští se v RIA pufru a analyzují se RIA testem. Maximální množství angiostatinové imunoreaktivity vykazují frakce, které odpovídají eluci angiostatinu.

Testovací soupravy poskytují instrukce, antiséra, angiostatin nebo angiostatinové proteiny a možná radioaktivně značený angiostatin a/nebo činidla pro srážení komplexů angiostatin-angiostatinové protilátky. Soprava se používá pro měření angiostatinu v biologických tekutinách a v tkáňových extraktech zvířat a lidí s nádory nebo bez nich.

Jiné soupravy se používají pro lokalizaci angiostatinu v tkáních a buňkách. Tato angiostatinové imunochemická souprava poskytuje instrukce, angiostatinové antisérum a možná blokující sérum a sekundární antisérum vázané na fluorescenční molekulu, jako je fluorescein isotiokyanát nebo některé jiné činidlo používané pro zviditelnění primárního antiséra. Imunohistochemické metody jsou dobře známy v oboru. Tato angiostatinové imunochemická souprava dovoluje lokalizaci angiostatinu v tkáňových sekcích a v kulturách buněk za použití světelné nebo elektronové mikroskopie. Používá se pro účely výzkumu a klinické praxe. Z nádorů se odebírají biopsie nebo se uchovávají jako celek a řežou se z nich mikrotomem tkáňové sekce za účelem nalezení míst, kde dochází k produkci angiostatinu. Takové informace se používají pro diagnostické a případné léčebné postupy u

nemocí, jako je rakovina. Jiný způsob zviditelnění míst, kde dochází k biosyntéze angiostatinu, zahrnuje radioaktivní značení nukleových kyselin, které se používají jako sondy při hybridizaci in šitu při hledání angiostatinové mediátorové RNK. Podobně angiostatinový receptor se může lokalizovat, zviditelnit a kvantifikovat imunohistochemickým způsobem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Volba zvířecího nádorového systému, ve kterém se růst metastáz inhibuje primárním nádorem a po jeho odstranění se růst urychluje.

Na základě testováním mnoha myších nádorů schopných inhibovat jejich vlastní metastázy se vybral Lewisův plicní karcinom, kde primární nádor inhibuje růst metastáz s největší účinností. Syngenním šest týdnů starým myším samcům C57BI6/J se aplikovalo injekcí (podkožně v oblasti zad) lxlO⁶ nádorových buněk. Viditelné nádory se poprvé objevily po 3 až 4 dnech. Když nádory dosáhly velikosti přibližně 1 500 mm³, myši se náhodně rozdělily do dvou skupin. U první skupiny se ( primární nádor zcela odstranil ve druhé skupině myší se po| předstírané operaci nechal neporušený. Ačkoli nádory oi velikosti 500 až 3 000 mm³ inhibují růst metastáz, 1 500 mm³[ je největší velikost primárního nádoru, který mohl být!

bezpečně odstraněn s vysokým procentem přeživších myší a bez i í nebezpečí opětného výskytu.

Po 21 dnech se všechny myši usmrtily a provedla se autopsie. U myší s neporušenými primárními nádory se našlo 4+2 viditelné metastázy. U myší s vyjmutým primárním nádorem se našlo 50+5 metastáz (p < 0, 0001) . Tyto data se potvrdily hmotností plic, která je v souladu s hmotností nádoru. U myší ^s s odstraněným primárním nádorem se zaznamenal 400 % nárůst j ί

• · · ···· • ·· •· · • · · ·· • ·· • ·· · vlhké hmotnosti plic ve srovnání s hmotností plic myší jejichž nádor zůstal nedotčen (p < 0,0001).

Tento experimentální model poskytuje reprodukovatelná data a popsaný experiment je reprodukovatelný. Tento nádor se označil jako Lewisův plicní karcinom s nízkým výskytem metastáz (Lewis lung carcinom-low metastatic; LLC-Low). Nádor skoro stejným způsobem také potlačuje metastázy u SCID myší, které mají nedostatek B a T lymfocytů.

Příklad 2: Izolace variant Lewisova plicniho karcinomu, které jsou vysoce metastatické, ačkoli nedošlo k odstranění primárního nádoru.

Z buněčné linie LLC-low příkladu 1 spontálně vznikli u jedné skupiny myší vysoce metastatické varianty Lewisova plicniho karcinomu, které se izolovaly způsobem popsaným v příkladu 1 a opakovaně se transplantovaly. Tento nádor (LLCHigh) tvoří více než 30 viditelných plicních metastáz , ať je primární nádor přítomen nebo ne.

Příklad 3: Velikost metastáz a míra proliferace nádorových buněk v metastázách. Účinek primárního nádoru, který inhibuje matastázy (LLC-Low).

Myši označené C57BI6/J se použily ve všech experimentech. Myši se inokulovaly podkožně buňkami LLC-Low a za 14 dnů se u poloviny z celkového počtu myší odstranil primární nádor. Pátý, desátý a patnáctý den po odstranění nádoru se myši usmrtily. Připravily se histologické sekce plicních metastáz. U myší s nedotčeným primárním nádorem se zjistila přítomnost mikrometastáz v plicích. Metastázy nebyly neovaskularizovány. Tyto metastázy jsou tvořeny v průměru 12 až 15 vrstvami buněk a nevykazují podstatný nárůst dokonce ani 15 dnů po odstranění nádoru u druhé skupiny myší. Naopak • to toto to ·· > · ·· to • · · v «· • · · · · zvířata, u kterých se primární nádor odstranil, vykazují přítomnost velkých vaskularizovaných metastáz již 5 dnů po operaci. Tyto metastázy 15 dnů po odstranění nádoru 4 krát zvětšily svůj objem (čemuž odpovídá hmotnost nádoru a histologie). Přibližně 50% zvířat, kterým se odstranil primární nádor, zemřela v důsledku plicních metastáz ještě před koncem experimentu. Všechna zvířata s nedotčeným primárním nádorem se dožila konce experimentu.

Rychlost replikace nádorových buněk v metastázách se určuje počítáním jader barvených BrdU vstříknutého do myší. Procento nádorových buněk inkorporujících BrdU v malých metastázách bez vaskulárního systému u zvířat s nedotčeným primárním nádorem bylo vysoké a ekvivalentní inkorporaci BrdU nádorových buněk ve velkých vaskularizovaných metastázách myší, u kterých se primární nádor odstranil (Obrázek č. 3) . Toto zjištění naznačuje, že přítomnost primárního nádoru nemá přímý účinek na rychlost replikace nádorových buněk v metastázách.

Na obrázku č. 3 v jeho levé části je znázorněn BrdU značící index nádorových buněk v případech, kdy primární nádor je či není přítomen.. Před imunohistochemickým barvením se u sekcí zvýšila jejich prostupnost pomocí 0,2 M HCI, doba působení je 10 minut, a dále se natrávily proteinázou K o koncentraci 1 gg/ml (Boehringer Mannheim GmbH, Manhein Germany) v pufru 0,2 M Tris-HCl, 2 mM CaCl₂ při teplotě 37°C po dobu 15 minut. Značící index se odhadnul počítáním procenta pozitivních jader při síle 250. Pravá strana obrázku č. 3 ukazuje analýzu celkové hmotnosti plic s primárními nedotčenými nádory nebo bez nádorů pět, deset a patnáct dnů po operaci. Zvířata se usmrtila 6 hodin po aplikaci peritonální injekce BrdU (0,75 mg pro každou myš).

• · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · • · · · · · ·

Přiklad 4: Inhibice angiogeneze v plicnich metastázách v přítomnosti neporušeného primárního nádoru.

Za účelem měření stupně vaskularizace v plicnich metastázách, se tkáně obarvily použitím protilátek proti von Willebrandovu faktoru (endoteliální specifický markér, dostupný u firmy Dako lne., Carpenteria, CA). Metastázy ze zvířat s neporušeným nádorem tvořily tenkou manžetu (8 až 12 vrstev nádorových buněk) okolo existujících pulmonárních cév. S výjimkou endoteliálních buněk obsažených v cévách se nenašly žádné nebo pouze několik málo buněk, které obsahovaly Willebrandův faktor. Naopak plicní metastázy zvířat pět dnů po odstranění primárního nádoru nebyly pouze větší, ale také se do nich infiltrovaly kapiláry obsahující endoteliální buňky, které se silně obarvily, což dokazuje přítomnost Willebrandova faktoru.

Při imunohistochemické analýze, kterou se dokazuje přítomnost endoteliálních buněk v plicnich metastázách, se zjistilo, že plicní metastázy s neporušeným plicním nádorem 19 dnů po inokulaci měly manžetu nádorových buněk kolem existujících plicnich mikrocév. Metastázy netvořily více jak 8 až 12 vrstev buněk. Okolo mikrocév se neprokázala neovaskularizace a metastázy neobsahovaly žádné nové mikrocévy. To byla typická maximální velikost preangiogenních metastáz bez vaskulárního systému.

Při imunohistochemické analýze tkáně získané pět dnů po resekci primárního nádoru (19 dnů po inokulaci primárního nádoru) se prokázalo, že metastázy obklopily existující plicní cévy. Na rozdíl od vzorků, kde se primární nádor neodstranil, nádor byl neovaskularizovaný. Pak primární neporušený nádor inhibuje tvorbu nových krevních cév v metastázách, ale proliferaci nádorových buněk v metastázách neovlivňuj e.

• ·' · ·· ··

Přiklad 5: Primární nádor inhibuje angiogenezi sekundárního nádoru implantovaného do myší rohovky. Růst tohoto sekundárního nádoru se inhibuje.

Lewisův plicní nádor (LLC-Low) o velikosti 0,25 až 0,5 mm² se implantoval do myší rohovky v den 0. (Muthukkaruppan Vr., et al., Angiogenesis in the mouše cornea. Science

205:1416-1418, 1979). Primární nádor se vytvořil podkožní inokulací lxlO⁶ buněk LLC-Low v oblasti hřbetu čtyři nebo sedm dní před zavedením implantátu do rohovky; nebo v den, kdy byl zaveden implantát do rohovky; nebo čtyři až sedm dnů po zavedení implantátu do rohovky. Do rohovek myší, které slouží jako kontroly se zavedl implantát, ale ne podkožní nádor. Dalším kontrolním myším se zavedl do rohovky implantát a čtyři dny po té se do oblasti zad inokulovaly nádorové buňky LLC-High. Růst nádorů v rohovkách (měřeno okulárním mikrometrem) a růst se hodnotily každý stereomicroscopy).

kontrolních nových kapilárních cév z okraje rohovky den pomocí stereomikroskopie (slit-lamp myší, které se u většiny rohovek (6 z až sedmý den po zavedení až do desátého dne.

nenesou primární podkožní vaskularizace

8) rozběhla implantátu Desátý den do rohovky a vaskularizace nádor, šestý pokračovala nádorů rohovky dosáhla přibližně čtvrtinu objemu celého oka. Za přítomnosti primárního podkožního LLC-Low nádoru se nevytvořil v nádorech rohovky vaskulární systém, pokud se primární nádor zavedl nejméně čtyři dny nebo více před implantací sekundárního nádoru do rohovky (tabulka č. 1) . Jestliže nedošlo k neovaskularizaci, nádory rohovek rostly pomalu jako tenké bílé disky bez vaskulárního systému.

se primární nádory neimplantovaly do čtyř implantátu do ze 3 nádorů

V případě, že dnů po zavedení rohovky, rohovka se rohovky rostly stejnou které nenesly primární vaskularizovala a rychlostí jako v případě kontrol, • ·

nádor. U většiny rohovek (2 ze 3) v přítomnosti primárního podkožního nádoru LLC-High začala vaskularizace sedm dnů po zavedení implantátu a pokračovala až do desátého dne. Desátý den vaskularizace nádorů rohovky opět dosáhla přibližně čtvrtiny objemu celého oka.

Tabulka č. 1

Inhibice angiogeneze nádoru v rohovce primárním podkožním nádorem. (Všechny primární nádory jsou LLC-Low mimo těch označených (*) , které jsou LLC-High).

Den zavedení implantátu do oka	0	0	0	0	0	0	0
Den zavedení implantátu primárního nádoru	-7	-4	-4*	0	ne	+ 4	+ 7
Počet myší s novými cévami v rohovce desátý den	2/10	0/9	2/3	2/3	6/8	3/3	2/3

Očekávalo se, že se u žádné neovaskularizace v případě, že LLC-Low implantoval sedm dní implantátu (t.j.-7). Avšak rohovky z deseti neprokáže se primární podkožní nádor před zavedením nádorového dva z nádorů (2/10) znekrotizovaly, protože byly příliš velké (> 3 cm³) .

Příklad 6: Primární neporušený nádor inhibuje angiogenezi vyvolanou sekundárním podkožním implantátem základního fibroblastového růstového faktoru (bFGF) .

Ačkoli experimenty popsané v příkladech 5 a 6 ukazují, že primární nádor inhibuje angiogenezi v sekundárních metastázách , tyto studie neříkají, zda primární nádor: (i) inhibuje endoteliální proliferaci (nebo angiogenezi) přímo, nebo (ii) nepřímo snižováním angiogenní aktivity metastatických nádorových buněk. Pro získání správné odpovědi byla vyvolána podkožní angiogeneze obsahuj e základní fibroblastový (Passaniti

A, et al. , angiogenesis reconstituted assessing basement

zavedením růstový matrigelu, který faktor (bFGF)

A simple and anti-angiogenic agents using membrane, heparin and fibroblast quantitative method for growth factor.

Lab.invest. 67:519, 1992).

Matrigel (extrakt proteinů bazální membrány) obsahující buď 25 nebo 50 ng/ml bFGF v přítomnosti heparinu se aplikoval podkožní injekcí na břišní straně normálních myší a myší s nádorem (LLC-Low). Myši se usmrtily o čtyři dny poději a změřila se koncentrace hemoglobinu v gelu za účelem kvantifikace tvoření krevních cév. Jak už se dříve popisuje, počet nových cév, které vstupují do matrigelu se vztahuje ke koncentraci hemoglobinu (Folkman J., Angiogenesis and its inhibitors in Important Advances in Oncology 1985, VT De

Vita, S. Hellman and S. Rosenberg, editors, J.B.Lippincott,

Philadelphia 1985). Některé gely se upravily pro histologické testování. U normálních myší pelety matrigelu, které obsahovaly 50 ng/ml bFGF, byly zcela rudé. Tyto gely byly hustě prorostlé novými kapilárními cévami a obsahovaly hemoglobin o koncentraci 2;4 g/dl. Matrigel, kde chybí bFGF, byl průhledný a šedivý a obsahoval pouze 0,4 g/dl hemoglobinu (t.j.6x nižší). Matrigel z myší s primárním nádorem obsahoval pouze 0,5 g/dl růstového faktoru bFGF (obrázek č. 4).

Skoro kompletní inhibice, které se dosáhlo v tomto experimentu, naznačuje, že přítomnost Lewisova plicního primárního nádoru může přímo inhibovat angiogenezi vyvolanou růstovým faktorem bFGF.

Příklad 7: Přenos séra ze zvířete nesoucího nádor do zvířete po resekci primárního nádoru, který potlačuje metastázy.

Do myši se implantoval Lewisův plicní karcinom způsobem, který se popisuje dříve. Po 15 dnech, kdy nádory dorostly do velikosti přibližně 1 500 mm³, se myši náhodně rozdělily do čtyř skupin. U tří skupin se provedla úplná chirurgická resekce primárního nádoru; u jedné skupiny se nádor ponechal na místě (po předstíraném chirurgickém zásahu). Myším ve třech resekčních skupinách se denně aplikovala intraperitonální injekce fyziologického roztoku, sérum z normálních myší nebo sérum z myší s Lewisovým plicním karcinomem o velikosti 1 500 mm³. Skupině myší, kde nádor zůstal nedotčen, se aplikovala intraperitonální injekce fyziologického roztoku. Všechny myši se ošetřovaly po dobu 21 dnů, po té se myši usmrtily a spočítaly se plicní metastázy (tabulka č. 2).

Tabulka č. 2

Odstraněný	primární	nádor	Primární nedotčený nádor
Léčba (intraperit onální inj ekce)	Fyziol. roztok	Sérum z normál. myší	Sérum z myší s nádorem	Inj ekce fyziol. roztoku
Počet plicních metastáz	55+/-5	50+/-4	7+/-2	3+/-1

Tyto výsledky se potvrdily stanovením hmotnosti plic. p=/<

0,0001 pro rozdíly mezi dvěmi skupinami [(55 & 50) versus (7 & 3)]. Podobné výsledky se získaly použitím angiostatinu izolovaného z moči zvířat nesoucích nádor.

« · • ·

Přiklad 8: Testování endoteliálních buněk hovězích kapilár (BCE).

Buňky BCE se používají pouze ve fázi mezi devátou a čtrnáctou pasáži. V den 0 se BCE buňky nanesou na plotny se 24 komůrkami pokryté želatinou (1,5 % želatina v roztoku PBS při teplotě 37°C v atmosféře 10 % CO₂ po dobu 24 hodin a pak se promyjí 0,5 ml roztoku PBS). Počet buněk v každé komůrce je 12 500. Počet buněk se určí použitím hemocytometru. Buňky se nanesou na plotny v 500 μΐ roztoku DMEM, který obsahuje 10 % teplem deaktivované (při teplotě 56°C po dobu 20 minut) telecí sérum a 1 % glutamin-pen-strep (GPS).

Buňky BCE se testují následovně: Odstraněné médium se nahradí 250 μΐ roztoku DMEM/5 % BCS/1 % GPS. Testované vzorky se pak dají do komůrek. (Množství kolísá v závislosti na druhu vzorku, který se testuje). Plotny se inkubují při teplotě 37°C v atmosféře 10 % CO₂ po dobu přibližně 10 minut. Do každé komůrky se přidá 250 μΐ roztoku DMEM/5 % BCS/1 % GPS s 1 ng/ml bFGF. Plotny se opět inkubují při teplotě 37°C v atmosféře 10 % CO₂ po dobu 72 hodin.

Čtvrtý den se po odstranění media každá komůrka tráví trypsinem (0,5 ml trypsinu/EDTA) po dobu dvou až tří minut. Suspendované buňky se pak přenesou do scintilačnich zkumavek, které obsahují 9,5 ml Hemetallu a spočítají se použitím Coulterova počítače. Jednotková aktivita je pak množství séra obsahující angiostatin, který je schopný produkovat polovinu maximální inhibice kapilární endoteliální proliferace, v případě, že jsou buňky inkubovány v přítomnosti růstového faktoru bFGF o koncentraci lng/ml po dobu 72 hodin.

Příklad 9: Sérum získané z myší nesoucích nádor LLC-Low inhibuje proliferaci kapilárních endoteliálních buněk in vitro.

• » ·· . ··

Hovězí kapilární endoteliální buňky se v proliferačním testu trvajícím 72 hodin stimulují základním fibroblastovým růstovým faktorem (bFGF o koncentraci 1 ng/ml). Sérum z myší nesoucích nádor přidané k této kultuře inhibuje proliferaci endoteliálních buněk na dávce závislým a vratným způsobem. Normální sérum nemá inhibiční účinek (obrázek č. 5) . Proliferace endoteliálních buněk se inhibuje podobným způsobem pomocí séra získaného z nu/nu myší a SCID myší, které nesou nádor. Po resekci primárního nádoru se během tří až pěti dnů vytratila angiostatinová aktivita.

Sérum z myší nesoucích nádor také inhibuje hovězí aortální endoteliální buňky a endoteliální buňky získané z myší se spontálním hemangioendoteliomem (Obeso, at al., Methods in Laboratory Investigation, A Hemangioendotheliomaderived cell line; Its use as a Model for Study of Endothelial Cell Biology, Lab Invest., 63 (2). Pgs 259-269, 1990) , ale nemá inhibiční účinek na buňky Lewisova plicního nádoru, 3T3 fibroblasty, buňky aortálního hladkého svalstva, plicního epitelu norka nebo plicních fibroblastů lidského zárodku W138.

Příklad 10: Sérum získané z myší nesoucích nádor LLC-High, které neinhibuje metastázy a neinhibuje proliferaci kapilárních endoteliálních buněk in vi tro.

Sérum z myší nesoucích primární nádor podstatným způsobem proliferaci endoteliálních buněk stimulovanou neinhibuj e kapilárních faktorem bFGF. Po prvních dvou krocích čištění séra sefarózová chromatografie a gelová filtrace) se ve neobjevila žádná angiostatinová aktivita.

LLC-High hovězích růstovým (heparinfrakcích

Příklad 11: Ascity získané z Lewisova plicního karcinomu (nízko metastatické) také generují angiostatinové sérum.

Z káždých 10 až 20 myší, kterým se aplikovaly intraperitonální injekce buď LLC-Low nebo LLC-High nádorových buněk (v množství 10⁶) , se po týdnu získaly 1 až 2 ml krvavých ascitů. Vytvořily se mezenterické nádory. Myši se usmrtily. Sérum se získalo punkcí srdce. Získalo se také sérum z normálních myší, které nenesou nádor, slouží jako kontrola. Sérum a ascity se centrifugovaly, čímž se odstranily buňky, a supernatant se testoval na hovězích kapilárních endoteliálních buňkách stimulovaných růstovým faktorem bFGF (v koncentraci 1 ng/ml) (popsáno v příkladu 9).

Ascity pocházející z obou typů nádorů podstatně stimulují proliferaci kapilárních endoteliálních buněk (např. 100 % proliferace) po 72 hodinách (obrázek 6). Sérum z myší nesoucích LLC-Low nádor inhibuje proliferaci endoteliálních buněk (inhibice až do 79% kontroly) . Sérum z vysoce metastatické linie má stimulační účinek 200%.

Tyto data ukazují, že ascity nízko metastatické linie obsahují převahu stimulátorů endoteliálního růstu nad angiostatinem. Tyto podmínky jsou podobné jako u pevných primárních nádorů. Angiostatinová aktivita se v séru objevuje a jak se předpokládalo, není v protikladu se stimulační aktivitou. Tento patern je podobný jako u pevných primárních nádorů (LLC-Low). Ascity z vysoko metastických nádorů (LLCHigh) také obsahují převahu stimulátorů endoteliálních buněk, ale angiostatin se v séru nepodařilo identifikovat.

Příklad 12: Frakcionace angiostatinu ze séra kolonovou chromatografií a analýza růst inhibujícich frakcí pomocí SDS-PAGE.

Za účelem čištění angiostatinu(ů) se shromáždilo sérum z myší nesoucích shora popsaného chromatografické A0,5mm agarózy chromatografie chromatografických inhibiční aktivitu, nádor. Inhibiční aktivita testovaná podle in vitro testu byla postupně analyzována na koloně za použití několika cyklů

C4-reverzní heparin-Sefarózy, Biogel vysokoúčinné kapalinové fází (HPLC). SDS-PAGE frakcí, které obsahují endoteliální vykázaly nespojitý pruh odpovídající M_r

000 Daltonů, který se čistil přibližně na 1 milión-násobek (tabulka č. 3) na specifickou aktivitu přibližně 2xl0⁷. Jednotlivé frakce získané v různých fázích čistícího procesu se testovaly protilátkami za účelem prokázání přítomnosti známých endoteliálních inhibitorů. Jako součást částečně čištěných a čištěných frakcí se identifikovaly tyto látky: destičkový faktor-4, trombospondin nebo transformační růstový faktor beta.

Tabulka č. 3

	Specifická aktivita (j ednotky*/mg)	Násobek čištění
Sérum	1, 69	1
Heparin Sefaróza	14,92	8,8
Biogel A0,5m	69, 96	41,4
HPLC/C4	2xl07	l,2xl06

* Jednotka aktivity je takové množství séra obsahující angiostatin, které je schopno produkovat polovinu maximální inhibice kapilární endoteliální proliferace v případě, že buňky se inkubuji v přítomnosti růstového faktoru bFGF v koncentraci 1 ng/ml po dobu 72 hodin.

Přiklad 13: Frakcionace angiostatinu z moče kolonovou chromatografii a analýza růst inhibujících frakcí pomocí SDS-PAGE.

Čištění inhibitoru(ů) endoteliálních buněk ze séra je omezováno malým objemem séra, které se může získat z každé myši a velkým množstvím proteinu, jenž sérum obsahuje.

Analyzovala se moč z myší nesoucích nádor a zjistilo se, že obsahuje inhibitor proliferace endoteliálních buněk, který není přítomen v moči myší bez nádoru ani v moči získané z myší s LLC-High nádory. K čištění endoteliální buněčné inhibiční aktivity se používá stejná strategie, jako se používá při čištění séra (popsáno shora) (obrázek č. 7).

Obrázek 7 ukazuje chromatografii s C4 reverzní fází částečně čištěného séra nebo moče ze zvířat nesoucích nádor. Všechny frakce se testují na hovězích kapilárních endoteliálních buňkách za přítomnosti růstového faktoru bFGF proliferačním testem, který trvá 72 hodin, jak se popisuje v příkladu 9. V obou případech se objevil ve frakci 23 nespojitý pík inhibice. K vymývání se použil 30 až 35 % acetonitril. SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza inhibiční frakce z třetího cyklu chromatografie s C4 reverzní fází séra ze zvířat majících nádor vykazuje pruh okolo 38 000 Daltonů.

Příklad 14: Charakterizace cirkulujícího angiostatinu.

Endoteliální inhibice se testovala podle postupu popsaného v příkladu 9. Angiostatin se izoloval na HPLC koloně Synchropack (Synchrom, lne. Lafayette, IN). Inhibitor se vymyl 30 až 35 % gradientem acetonitrilu. Na gelu SDS polyakrylamidové gelové elektroforéze (PAGE) za redukčních podmínek (b-merkaptoetanol 5% v/v) se objevil proteinový pruh vykazující aktivitu. Jeho velikost odpovídá přibližně 28 • ·

kilodaltonům. Aktivitu je možné zjistit v podobných bodech, pokud se vzorek izoloval z moče nebo séra. Aktivita se nestanovila u žádného jiného pruhu.

Aktivita spojená s pruhy se ztratila, když se protein obsažený v gelu zahřál (při teplotě 100°C po dobu 10 minut) nebo se natrávil trypsinem. Když se pruh vykazující aktivitu extrahoval směsí voda/chloroform (1:1), aktivitu vykazovala pouze vodní fáze.

Příklad 15: Čištění inhibičních fragmentů z lidského plazminogenu.

Vazebné místo I plazminogenu , na které se váže lysin, se získalo od firmy Sigma Chemical Company. Tento přípravek je čištěný lidský plazminogen po štěpení enzymem elastázou. Lysinové vazebné místo I získané uvedeným způsobem je populace proteinů, která obsahuje v agregátu nejméně první tři troj smyčkové struktury (číslo 1 až 3) v řetězci plazminu A (smyčky 1+2+3) (Sotrrup-Jensen, L., et al. in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, V o 1. 3, 191, Davidson, J.F., et al. eds Raven Press, New York 1978 and Wiman, B., et al., Biochemica et Biophysica Acta, 579, 142 (1979)). Protein tvořící vazebné místo I plazminogenu, které váže lysin, (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) se resuspendoval ve vodě a nanesl se na kolonu s C4 reverzní fází, která se uvedla do rovnohmotnosti roztokem voda/0,1 % TFA o čistotě, která se požaduje pro HPLC. Kolona se vymývala gradientem voda/0,1% TFA až acetonitril/0,1% TFA a frakce se shromažďovaly do polypropylenových zkumavek. Alikvót každé frakce se odpařil na zařízení Speed Vac, resuspendoval se ve vodě a aplikoval se na buňky BCE do proliferačního testu. Tento postup se dvakrát zopakoval, přičemž pro vymytí inhibiční frakce se použil podobný gradient. Inhibiční aktivita se vymyla 30 až 35 % acetonitrilem v posledním cyklu

C4 kolony. SDS-PAGE inhibiční frakce vykazuje 3 nespojité pruhy jasně odpovídající velikosti 40, 42,5 a 45 kD. SDS-PAGE za neredukčních podmínek odhalila 3 pruhy odpovídající velikosti 30, 32,5 a 35 kD.

Příklad 16: Extrakce inhibiční aktivity z SDS-PAGE.

Čištěné inhibiční frakce z lidského plazminogenu se rozložily na SDS-PAGE za neredukčních podmínek. Oblasti gelu odpovídající pruhům, které se ukázaly po obarvení stříbrem v sousedních drahách, do nichž se vnesly stejné vzorky, se vyřízly a inkubovaly se v 1 ml fyziologického roztoku prufrovaném fosforečnanem při teplotě 4°C po dobu 12 hodin v polypropylénových zkumavkách. Odstranil se supernatant a gel se dvakrát dialyzoval proti fyziologickému roztoku po dobu 6 hodin (MWCO=6-8000) a dvakrát proti destilované vodě také po dobu 6 hodin. Dialyzát se odpařil na vakuové centrifuze. Produkt se resuspendoval ve fyziologickém roztoku a aplikoval se na kapilární endoteliální buňky stimulované 1 ng/ml základního fibroblastového růstového faktoru v 72 hodinovém testu. Protein extrahovaný z každého ze tří pruhů inhiboval kapilární endoteliální buňky.

Příklad 17: Studie léčby použitím plazminogenního fragmentu.

Myším po implantaci Lewisova plicního karcinomu se odstranil nádor, když dosáhl velikosti 1 500 až 2 000 mm³. V den operace se myši rozdělily do 6 skupin po 6 myších. Myši dostávaly denně intraperitonální injekce se třemi čištěnými inhibičními fragmenty lidského plazminogenu, celý lidský plazminogen, moč ze zvířat nesoucích nádor, moč z normálních myší nebo fyziologický roztok. Jedna skupina zvířat nesoucí nádor, která podstoupila pouze předstíranou operaci, dostávala injekce s fyziologickým roztokem. Ihned po

odstranění primárního nádoru se myším aplikovala intraperitonální injekce s 24 μg (1,2 mg/kg/den/myš) inhibičních plazmonogenních fragmentů jako vstupní dávka. Pak dostávaly denně po dobu trvání experimentu intraperitonální injekce s 12 μg inhibičního fragmentu (0,6 mg/kg/den/myš). Kontrolní myši dostávaly po odstranění nádoru stejnou dávku celé molekuly plazminogenu. V případě použití moči se musela moč z normálních myší nebo z myší nesoucích nádor upravit. Moč se filtrovala, dialyzovala, lyofilizovala a resuspendovala ve sterilní vodě, přičemž se dosáhlo 250-ti násobku koncentrace. Buď normálním myším nebo myším nesoucích nádor se ve dvouch intraperitonálních inj ekcích, v den odstranění nádoru, aplikovalo 0,8 ml dialyzovaného koncentrátu moče, což je vstupní dávka.

Pak denně po celý průběh experimentu dostávaly intraperitonální injekce s 0,4 ml dialyzované koncentrované moči. Léčba probíhala po dobu 13 dnů, po té se myši usmrtily a provedla se autopsie.

Výsledky experimentu jsou na obrázcích č. 8 a 9. Obrázek č. 8 ukazuje povrchové plicní metastázy po 13 dnech léčby. Povrchové plicní metastázy odpovídají počtu metastáz pozorovaných v plicích myší při autopsii. Metastázy se počítaly pod stereomikroskopem. Obrázek č. 8 ukazuje průměrný počet povrchových plicních metastáz a standardní chybu průměru. Skupina myší, kterým primární nádory zůstaly zachovány, nevykazuje žádné metastázy. Myši, kterým se primární nádor odstranil a aplikoval se jim fyziologický roztok, vykazují tvorbu rozsáhlých metastáz. Myši, kterým se podával lidský plazminogenní fragment, nevykazují žádné metastázy. Myši léčené celým plazminogenem vykazuji rozsáhlé metastázy, které indikují, že celá molekula plazminogenu nemá endoteliélní inhibiční aktivitu. U myší, které se ošetřovaly dialyzovanou a koncetrovanou močí z myší nesoucích nádor, se metastázy neobjevily. Myši ošetřované koncentrovanou močí z

normálních myší vykazují rozsáhlé metastázy. Zjišťováním hmotnosti plic se došlo ke stejným výsledkům (obrázek 9).

Příklad 18: Aminokyselinová sekvence myšího a lidského plazminogenu.

Na proteinovém sekvenátoru Applied Biosystem model 477A se určily aminokyselinové sekvence angiostatinu izolavaného z myší moče a angiostatinu izolavaného z preparátu lidského vazebného místa I pro lysin. Aminokyselinové frakce obsahující fenyltiohydantoin se identifikovaly pomocí HPLC ABI model 120A. Aminokyselinová sekvence určená ze sekvence N-konce a tryptické digesty myšího a lidského angiostatinu ukazují, že sekvence angiostatinu je podobná sekvenci začínající aminokyselinou č. 98 myšího plazminogenu. Aminokyselinová sekvence angiostatinu je molekula obsahující protein, jehož molekulová hmotnost je mezi přibližně 38 a 45 kilodaltony, což se určilo pomocí redukční polyakrylamidové gelové elektroforézy, a jehož aminokyselinová sekvence je podstatně podobná sekvenci fragmentu myšího plazminogenu začínající aminikyselinou číslo 98 nedotčené molekuly myšího plazminogenu. Začátek aminokyselinové sekvence myšího angiostatinu (SEQ ID č. 2) je na obrázku č. 1. Délka aminokyselinové sekvence může být trochu delší nebo kratší než je délka sekvence na obrázku 1.

Aminokyselinová analýza N-konce a tryptické digesty aktivní frakce lidského vazebného místa I pro lysin (příklad 15) ukazují, že sekvence frakce začíná přibližně aminokyselinou č. 97 nebo 99 lidského plazminogenu a že lidský angiostatin je homologní s myším angiostatinem. Začátek aminokyselinové sekvence lidského angiostatinu (začínající aminokyselinou 98) je ukázán na obrázku 2 (SEQ ID č.: 3). Aminokyselinové sekvence myšího a lidského angiostatinu jsou na obrázku 2 srovnávány s odpovídajícími vnitřními aminosekvencemi plazminogenů jiných biologických typů, které zahrnují prasečí, hovězí opičí (makak rhesus) plazminogen, což ukazuje na přítomnost angiostatinu u těchto biologických druhů.

Příklad 19: Exprese lidského angiostatinu v E.coli.

Vektor pTrcHisA (Invitrogen) (obrázek 10) se použil z důvodu získání vysoké hladiny transkripce řízené trc promotorem, což má sloužit ke zvýšení účinnosti translace eukaryontních genů v E.coli. Angiostatin se exprimuje fúzovaný s polyhistidinovým okrajem N-konce, který má schopnost vázat nikl. Tohoto spojení se využívá při jednostupňovém čištění za použití kovových afinitních pryskyřic. Místa štěpení na fúzním proteinu rozeznávané enterokinázou dovolují následné odstranění N-terminálního histidinového fúzního proteinu. Zjistili se, protein váže lysin;

proteinu z čištěného rekombinantního že rekombinantní lidský angiostatinový reaguje zkříženě s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro kruhovou oblast 1,2 a 3, a inhibuje proliferaci in vivo endoteliálních buněk řízenou růstovým faktorem bFGF.

Za účelem konstrukce inzertu se z mRNK lidských jater získal fragment genu kódující lidský angiostatin. Ten se reverzně přepsal a amplifikoval použitím polymerázové řetězové reakce (PCR) a specifických primerů. Produkt PCR je 1131 párů baží velký a kóduje aminokyseliny lidského plazminogenu od čísla 93 do čísla 470. Amplifikovaný fragment se klonoval do restrikčního místa Xhol/KpnI vektoru pTrcHisA. Výsledná konstrukce se přenesla do hostitelských buněk E.coli XL-1B (dostupných u firmy Stratagen). Kontrolní klon obsahující samotný plazmidový vektor pTrcHisA se transformoval do hostitelských buněk E.coli XL-1B. Tento klon

ΊΟ se zde uvádí jako vektorový kontrolní klon. Oba klony se čistily stejným způsobem, jak se popisuje dále.

Expresívní kolonie se izolovaly následujícím způsobem. Kolonie E.coli transformované genem kódujícím angiostatin se kultivují na nitrocelulózovém filtru impregnovaném IPTG, který leží na plotně s LB agarem. Následuje exprese indukovaná pomocí IPTG. Kolonie se lyžují na nitrocelulózových filtrech. Nitrocelulózové filtry se blokují, promyjí se a testují se za použití dvojích oddělených monoklonálních protilátek (mAbs Dcd a Vap; dárek od S.G.McCance a F.J.Castellino, University of Notre Dáme), které rozpoznají specifické konformace angiostatinu. Izolují se silně exprimující kolonie rozeznávané protilátkami mAbs.

Z důvodu určení optimální doby maximální exprese se shromáždily buňky z různých časových úseků kultivace před a po IPTG indukci. Opakovaně se zmrazily a rozmrazily a analyzovaly se SDS-PAGE, imunoblotováním a použitím protilátek mAbs Dcd a Vap.

Izoloval se klon pTrcHisA/HAsH4. Po IPTG indukci, která trvala 4 hodiny, se shromáždil buněčný pelet a resuspendoval se v roztoku 50 mM Tris o pH 8,0, 2 mM EDTA, 5 % glycerol a 200mg/ml lysozymu. Suspenze se za stálého míchání inkubovala při teplotě 4°C a po dobu 30 minut, dále se centrifugovala při 14 000 ot/min. po dobu 25 minut a pelet se resuspendoval v roztoku 50 mM tris o pH 8,0, 2 mM EDTA, 5 % glycerolu a 0,1% DOC. Suspenze se míchala při teplotě 4°C po dobu 60 minut a pak se centrifugovala při 14 000 ot/min. po dobu 25 minut. Supernatant obsahuje exprimovaný angiostatin. Zjistilo se, že lidský angiostatin exprimovaný v E.coli má fyzikální vlastnosti přirozeného angiostatinu, což je schopnost vázat lysin. Angiostatin exprimovaný v E.coli se pak v jednom kroku čistil přes lysin-sefarózovou (Pharmacia nebo Sigma) kolonu.

Angiostatin se z kolony vymyl 0,2 M kyselinou epsilon-aminon-kapronovou o pH 7,5.

Po těchto experimentech proběhla fermentace klonu pTrcHisA/HAsH4 v objemech 10 1. Buňky získané z této indukce se centrifugovaly a pelet se resuspendoval v roztoku 50 mM Tris o pH 7,5. Buňky se narušily působením tlaku 70 MPa ve třech cyklech a ochlazením na teplotu 10°C mezi jednotlivými cykly. Získaný lyzát se vyčeřil centrifugací při 10 000 ot/min. po dobu 30 minut při teplotě 4°C a exprimovaný angiostatin se izoloval přes lysin-sefarózu (obrázek 11).

Čištěný lidský angiostatin exprimovaný E.coli se dialyzoval proti vodě a lyofilizoval se. Dále se resuspendoval v mediu (DMEM, 5 % BCS, 1 % gentamycin/penicilin/streptomycin) v množství, aby jeho koncentrace byla přibližně 3 μg/ml, a použil se při testování hovězích kapilárních endoteliálních (BCE) buněk in vitro. Tento test se popisuje v příkladu 8. Podobně, kontrolní klon obsahující samotný vektor se ošetřil stejným způsobem jako klon pTrcHisA/HAsH4. Indukoval se stejným způsobem pomocí IPTG a bakteriální lyzát se použil k navázání lysinu, eluoval se 0,2 M kyselinou amúnokapronovou, dialyzoval se a lyofilizoval se. Tento kontrolní preparát se resuspendoval v mediu, tak aby jeho koncentrace byla také 3 μg/ml. Vzorky rekombinantního angiostatinu a kontrol získané z různých indukcí a fermentací, stejně jako s oddělených čistících cyklů se všechny kódovaly v EntreMed, Maryland. BCE testy těchto kódovaných vzorků se uskutečnily v Children's Hospital, Boston.

Výsledky BCE testů za použití rekombinantního lidského angiostatinu ukazují, že lidský angiostatin exprimovaný v E.coli inhibuje proliferaci BCE buněk způsobenou růstovým faktorem bFGF (užívaného v koncentraci 1 ng/ml) (obrázek 12). Zásobní roztok rekombinantního angiostatinu v mediu (v

koncentraci okolo 3 μς/πιΐ) se použil v ředěních 1:5, 1:10 a

1:20. Procento inhibice se vypočítalo následovně:

počet buněk s angiostatinem - počet buněk v den 0 _ -----------------------------------------------počet buněk se samotným bFGF - počet buněk v den 0

Procento inhibice proliferace buněk BCE bylo srovnatelné nebo vyšší než hodnota dosažená pro podobné koncentrace angiostatinu odvozeného od plazminogenu. Výsledky z opakovaných BCE testů jsou znázorněny na obrázku č. 13, kde u ředění 1:5 rekombinantní angiostatin vykázal podobné procento inhibice jako angiostatin odvozený od plazminogenu. Obrázek č. 13 ukazuje překvapující výsledek, že lidský rekombinantní angiostatinový protein inhibuje přes 60% až 75% proliferace BCE v kultuře.

Příklad 20: Angiostatin udržuje matastázy v latentní fázi zvýšením rychlosti apoptózy.

myší C57 BL6/J buňkami se vyvinuly primární cm³. Zvířata se

Lewisova nádory o podrobila

Po podkožní inokulaci plicního karcinomu (lxl0⁶)« přibližné velikosti 1,5 chirurgickému odstranění primárního nádoru nebo předstírané operaci. plíce se resekci

5, 10 a 15 připravily primárního mikrometastáz ve dnů po operaci se myši usmrtily a jejich pro histologické pozorování.

nádoru vykazují masivní srovnání s kontrolními

Zvířata po proliferaci zvířaty po změny jsou plic.

předstírané operaci (obrázek č. 14) . Tytc doprohmotnostiny podstatným zvětšením hmotnosti

Analýza proliferace nádorových buněk určená začleněním bromodeoxyuridinu (BrdU) neukazuje na žádné rozdíly mezi zvířaty s nedotčenými primárními nádory a s odstraněnými primárními nádory 5., 9. a 13. den. Toto zjištění indikuje,

• · · · » · · ·· · · · • · . ··· ·*· ···· ···· ·· ··· ·· ·· že nárůst nádorové hmoty nelze vysvětlit zvýšením proliferace buněk. (obrázek 15) . Proto se u těchto zvířat testovalo odumírání buněk. Apoptóza, proces odumírání buněk, který závisí na změnách v expresy genu a zodpovídá za eliminaci buněk během vývoje, se testovala v rychle proliferujících tkáních, jako je tenké střevo, použitím imunohistochemicky značené DNK štěpené na fragmenty terminální deoxynukleotidylovou transferázou (TdT). Apoptotický index se určil v čase usmrcení. Odstranění primárních nádorů způsobilo statisticky podstatný nárůst (přibližně 3 až 4 násobný) apoptotického indexu ve všech testovaných časech, (obrázek č. 15) .

Důkaz, který podporuje toto tvrzení, se získal léčbou mýší s odstraněnými primárními nádory pomocí exogenního supresoru angiogeneze.

Tato látka TNP-1470 (0chloroacetylkarbomoylfumagilol, dříve se tato látka nazývala AGM-1470) je analog fumagilinu a má angiogenní aktivitu. Podkožní injekce látky TNP-1470 (v dávce 30 mg/kg každé dva dny) produkovala výsledky, které byly nápadně podobné těm shora popsaným, které se týkaly zvířat s neporušenými primárními nádory. U těchto zvířat se zjistila nižší hmotnost plic, shodný proliferační index a zvýšený apopoptický index ve srovnání s kontrolními zvířaty, kterým se vstříkl fyziologický roztok (obrázek 16) .

Tyto data ukazují, že metastázy zůstávají latentní, pokud proliferace nádorových buněk je v rovnohmotnosti s odumíráním buněk. Odstranění primárního nádoru způsobuje rychlý nárůst růstu metastáz, pravděpodobně způsobený odstraněním inhibitorů angiogeneze (angiostatinu), který řídí metastatický růst zvýšením apoptózy v nádorových buňkách. Tyto účinky jsou podobné jako ty, které následují po odstranění primárních nádorů a po podání exogenního inhibitoru angiogeneze. Tyto data naznačují, že primární ' ··· · ·*·· ·· · nádor uvolňuje angiostatin, který udržuje metastázy v latentní fázi.

Příklad 21: Léčba primárních nádorů angiostatinem in vivo.

Angiostatin se izoloval z lidského plazminogenu neúplným štěpením enzymem elastázou, jak se popisuje shora v příkladu

15. Angiostatin se resuspendoval ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem za účelem aplikace šest týdnů starým myším samcům C57BI6/J.. Zvířatům se podkožně implantovalo lxlO⁶ buněk, buď z Lewisova plicního karcinomu nebo T241 fibrosarkomu. Léčba angiostatinem se započala po čtyřech dnech, kdy nádory dosahují velikosti 80-160 mm³. Myším se aplikoval angiostatin buď ve formě jediné injekce v dávce 40 mg/kg nebo v podobě dvou injekcí, kde je dávka 80 mg/kg a to intraperitoneálně (ip) nebo podkožně (sc) . Zvířata se usmtrila v různém čase po léčbě prodloužené na 19 dnů.

Angiostatin podávaný v denní dávce 40 mg/kg intraperitoneálně velice podstatně inhibuje růst primárních nádorů T241 (obrázek 17) . Tento inhibiční účinek růstu je jasný během dvou dnů a během studie se zvyšuje. Osumnáctý den myši léčené angiostatinem měly nádory, jejichž objem odpovídal přibližně 38 % objemu nádorů kontrolních zvířat, kterým se aplikoval fyziologický roztok. Tento rozdíl je statisticky podstatný (p<0,001).

Léčba angiostatinem (celková dávka je 80 mg/kg/den, podávaná dvakrát denně v dávce 40 mg/kg intraperitoneálně nebo podkožně) také podstatně snižuje rychlost růstu LLC-LM primárních nádorů (obrázek 17). Tento inhibiční účinek byl zřejmý během 4 dnů a roste s časem. Poslední den experimentu (19. den) myši léčené angiostatinem mají nádory, jejichž objem odpovídá 20 % objemu nádoru kontrolních zvířat, kterým

-·— se aplikoval pouze fyziologický roztok. Tento rozdíl je statisticky podstatný (p<0,001).

V jiné série experimentů se angiostatin podával (50 mg/kg za 12 hodin) myším, kterým se implantovaly buňky z T241 fibrosarkomu, Lewisova plicního karcinomu (LM) nebo sarkomu buněčného retikula. U myší aplikovaný angiostatin podstatně redukoval velikost nádorů každého typu buněk. Obrázek 19 ukazuje, že v případě T241 fibrosarkomu odpovídal u myší léčených angiostatinem průměrný objem nádorů póze 15% objemu nádorů neléčených myší k 24. dni. Obrázek č. 20 ukazuje, že v případě Lewisova plicního karcinomu (LM) odpovídal u myší léčených angiostatinem průměrný objem nádorů póze 13% objemu nádorů neléčených myší k 24. dni. Obrázek č. 21 ukazuje, že v případě sarkomu retikula odpovídal u myší léčených angiostatinem průměrný objem nádorů póze 19% objemu nádorů neléčených myší k 24. dni. Data představují průměr čtyř myší pro každý časový bod.

Tyto výsledky vedou k závěru, že angiostatin je extrémně silný inhibitor růstu tří různých primárních nádorů in vivo.

Příklad 22: Léčba myších primárních nádorů odvozených z lidských buněk angiostatinem in vivo.

Studoval se účinek angiostatinu na dvě lidské nádorové buněčné linie, jsou to lidský karcinom prostaty PC-3 a lidský karcinom prsu MDA-MB. Imunodeficientním SCID myším se implantovaly buňky lidského nádoru. Tyto myši se léčily dávkou 50 mg/kg angiostatinu každých 12 hodin, jak se popisuje v příkladu 21. Výsledky ukazují, že angiostatinový protein podle vynálezu je silný inhibitor růstu lidských nádorových buněk. Obrázek 22 ukazuje, že v případě lidského karcinomu prostaty PC-3 odpovídal u myší léčených angiostatinem průměrný objem nádorů póze 2% objemu nádorů κ

. «4—	-- 99 4	44		__
4	4	4	4	4	4 4	44
4	4	4 4	4	4	4 444	4 4
4	4	4	4	4	4	4 4
4· 4 4	4444	44		444	44	44

neléčených myší k 24. dni. Obrázek č. 23 ukazuje, že v případě lidského karcinomu prsu MDA-MB odpovídal u myší léčených angiostatinem průměrný objem nádorů póze 8% objemu nádorů neléčených kontrolních myší k 24. dni.

Příklad 23: Genová terapie-účinek transfekce genu angiostatinu na objem nádoru.

Použitím PCR se vytvořila DNK sekvence kódující angiostatin obsahující 1380 párů baží a je odvozená od cDNK myšího plazminogenu (získáno z Američan Type Culture Collection (ATCC)) , která kóduje jeho aminokyseliny číslo 1 až 460. Tato sekvence se začlenila do expresivního vektoru, který se vnesl do buněk T241 fibrosarkomu a transfektované buňky se implantovaly do myší. Do myší, které sloužily jako kontrola, se implantovaly buňky T241 bez cizorodé DNK nebo buňky T241 transfektované pouze vektorem (t.j.transfektované buňky, které neexprimují angiostatin). V experimentu se použily tři klony transfektovaných buněk exprimujících angiostatin. Průměrný objem nádoru se určoval v průběhu experimentu. Výsledky ukazují překvapující a velkou redukci průměrného objemu nádoru v myších, které obsahují klony buněk exprimujících angiostatin ve srovnání s kontrolními buňkami, které neobsahují cizorodou DNK nebo neexprimují angiostatin.

Myší DNK sekvence kódující myší angiostatinový protein se odvozuje z cDNK myšího plazminogenu. Myší angiostatin zahrnuje kruhové oblasti 1 až 4 myšího plazminogenu. Schéma pro konstrukci těchto klonů je na obrázku č. 24.

Buňky T 241 fibrosarkomu se transfektovaly klonem myšího angiostatinového proteinu za použití transfekčního systému LIPOFECTIN™ (dostupný u firmy Life Technolodies, Gaithersburg, MD) . Funkční činidlo LIPOFECTINU™ tvoří liposomová formulace kationockého lipidu N-[l-(2,377 dioleyloxy) propyl]-n, n, n-trimetylamoniumchlorid (DOTMA) a diolecoylfosfotidyletanolamin (DOPE) ředěná v poměru 1:1 (w/w) vodou filtrovanou přes membránu.

Postup dočasné transfekce buněk je následující:

1. Kultivace T241 buněk v kultivačních nádobách o objemu 60 cm², 2 ml vhodného kultivačního media obohaceného sérem se inokuluje předkultivovanými buňkami v množství přibližně 1-2 x 10⁵ buněk.

2. Inkubace buněk při teplotě 37°C v inkubátoru s atmosférou CO₂ po dobu dokud buňky nejsou ze 40-70% konfluentní, což obvykle trvá 18-24 hodin. Tato doba kolísá v závislosti na typu buněk. Konfluentnost nádorových buněk T241 byla přibližně 70%.

3. Příprava roztoků do sterilních zkumavek o rozměru 12x75 mm:

roztok A: Pro každou transfekci se naředí 5 gg DNK ve

100 μΐ OPTI-MEM I redukovaném sérovém mediu bez séra dostupné u firmy Life Technologies) (používá se deionizované voda vhodná pro kultivaci tkáňových kultur). roztok B: Pro každou transfekci se naředí 30 μg LIPOFECTINU ve 100 μΐ media OPTI-MEM.

4. Oba roztoky se smíchají, jemně se promýchají a kultivují se při teplotě místnosti po dobu 10-15 minut.

5. Buňky se dvakrát promyjí mediem bez séra.

6. Pro každou transfekci se přidá do každé zkumavky, která obsahuje komplexy činidla LIPOFECTINU™-DNK, 0,8 ml media bez séra. Obsah zkumavek se jemně promýchá a přelije se na buňky.

7. Buňky se inkubují přibližně 12 hodin při teplotě 37°C v inkubátoru s atmosférou CO₂.

8. Medium obsahující DNK se vymění za selekční medium se sérem o koncentraci 1 mg/ml a buňky se inkubují při χι • · 4 · · · · · ···· ···· ·· ··· «· ·· teplotě 37°C v inkubátoru s atmosférou CO₂ po dobu 48-72 hodin.

9. Genová aktivita buněčného extraktu se testuje 48-72 hodin po transfekci.

Exprese angiostatinového proteinu u transfektovaných buněk se testuje použitím protilátek, které jsou specifické k angiostatinu. Po 10 až 14 dnech se v buňkách T241 transfektovaných s CMV-angiostatinem objeví G418 rezistentní kolonie. Určitý počet kolonií se objevil u klonů transfektovaných samotným vektorem, ale ne u klonů, které se netransfektovaly. Za použití imunofluorescenční metody se izolovaly G418 rezistentní klony exprimující angiostatin.

Je zajímavé, že in vitro růst buněk T241 a Lewisových plicních buněk, které jsou transfektovány angiostatinem, není inhibován ani jinak ovlivněn, jak ukazují obrázky č. 25 a 26.

Obrázek č. 27 znázorňuje experiment transfekce. Všechny tři transfektované klony T241 exprimující angiostatin produkují u myší nádor, jehož objem se redukuje na objem nádoru kontrolních myší. Průměrný objem nádoru u myší, kterým se implantoval klon 37 byl pouze 13% objemu nádoru u kontrolních myší, zatímco u klonů 31 a 25 objemy nádorů byly pouze 21% a 34% objemů kontrolních nádorů. Tyto výsledky ukazují, že sekvence DNK kódující angiostatin se mohou přenést do buněk a že transfektované DNK sekvence jsou schopny v implantovaných buňkách exprimovat angiostatinový protein a že exprimovaný angiostatin in vivo redukuje růst nádoru.

Příklad 24: Lokalizace míst exprese angiostatinu in vivo.

Za účelem lokalizace míst exprese angiostatinového proteinu in vivo se analyzovala celková RNK z různých typů • · • · · · · ···· ············ • · · · · ··· ········ .·· ··· ·· ·· buněk, ať už z čerstvých nádorů nebo po několikanásobné pasáži. Byly sem zahrnuty myší buňky Lewisova plicního karcinomu, myší buňky T241 fibrosarkomu, lidské buňky Burkittova lymfomu. Zjišťovala se přítomnost angiostatinových transkriptů. Northernova analýza všech vzorků mimo RNK z jater normálních myší vykazuje nepřítomnost hybridizačního signálu s thn sekvencí. U zmíněného vzorku, kde byla hybridizace pozitivní, se objevil signál přibližně ve vzdálenosti 2,4 kb, který odpovídá myšímu plazminogenu. Northernova analýza lidských vzorků ukazuje na nepřítomnost hybridizačního signálu se sekvencí lidského angiostatinu u všech vzorků mimo té RNK, která pochází z normálních lidských jater. Tyto vzorky mají signál ve vzdálenosti přibližně 2,4 kb, který odpovídá lidskému plazminogenu.

Analýza reverzní transkripční polymerázovou řetězevou reakcí (RT-PCR) ukazuje na nepřítomnost produktu u všech vzorků, které se testovaly sekvenční sondou myšího angiostatinu. Výjimkou jsou vzorky z jater normálních myší. RT-PCR analýza ukazuje, že u všech lidských vzorků testovaných sondou sekvencí lidského angiostatinu není exprimován produkt. Výjimkou jsou vzorky z normálních lidských jater (očekávaná velikost u myší je 1050 bp a u lidí to je 1134 bp).

Transkripty myšího angiostatinu (vykazující totožnost s aminokyselinami 97 až 450 myšího plazminogenu) se neprodukují ve všech myších vzorcích a lidské transkripty angiostatinu (vykazující totožnost s aminokyselinami 93 až 470 lidského plazminogenu) se neprodukují ve všech lidských vzorcích. Pozitivní signály získané ve vzorcích z normálních myších nebo lidských jater jsou z hybridizace s plazminogenem.

Příklad 25: Exprese angiostatinu v kvasinkách.

Genový fragment kódující aminokyseliny 93 až 470 lidského plazminogenu se klonoval do Xhol/EcoRI restrikčního místa vektoru pHIL-SI (Invitrogen). Tento vektor umožňuje sekreční expresy proteinů za použití PHO1 sekrečního signálu v kvasinkách Pichia pastoris. Podobně fragment genu kódující aminokyseliny 93 až 470 lidského plazminogenu se klonoval do SnaBI/EcoRI restrikčního místa vektoru pPIC9 (Invitrogen), který umožňuje sekreční expresy proteinů za použití sekrečního signálu a-faktoru v kvasinkách Pichia pastoris. Lidský angiostatinový protein exprimovaný v těchto systémech má řadu výhod ve zpracování, balení a v postranslační modifikaci zahrnující glykosylaci proteinů ve srovnání s proteiny exprimovanými v E.coli.

Exprese genu v P. pastoris se popisuje v publikacích Sreekrishna, K. te al. (1988) High level expression of heterologous proteins in methylotropic yeast Pichia pastoris. J. Basic Microbiol. 29 (4): 265-278, a Clare, J.J. et al (1991) Production of epidermal growth factor in yeast: High level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies, Gene 105:205-212.

Příklad 26: Exprese angiostatinových proteinů v transgenních zvířatech a rostlinách.

Vytvořila se transgenní zvířata, jako jsou hovězí dobytek nebo prasata, která exprimuj! transkript angiostatinového genu. Transgenní zvíře exprimuje angiostatinový protein například v mléce. Dále se vytvořily poživatelné transgenní rostliny, které exprimuj! transkript angiostatinového genu.

Konstrukce trasgenních zvířat, které exprimuj! cizorodou

DNK se popisuje v publikaci Smith H. Phytochrome transgenics:

functional, ecological and biotechnological applications, Semin. Cell. Biol. 1994 5(5):315-325.

Příklad 27: Charakterizace angiostatinových fragmentů inhibujících proliferaci endoteliálních buněk.

Následující příklad charakterizuje aktivitu jednotlivých a kombinovaných angiostatinových fragmentů. Data naznačují, že existují funkční rozdíly mezi jednotlivými kruhovými strukturami a že tyto angiostatinové fragmenty vykazují silnou anti-endoteliální a anti-angiogenní aktivitu.

Termín angiostatinový fragment znamená protein odvozený od angiostatinu nebo plazminogenu, který inhibuje proliferaci endoteliálních buněk. Angiostatinové fragmenty se používají pro léčbu nemocí nebo stávů zprostředkovaných angiogenezí. Například angiostatinové fragmenty se mohou použít pro inhibicí nebo tlumení růstu nádorů. Aminokyselinová sekvence takového angiostatinového fragmentu se může například vybrat z části myšího plazminogenu (SEQ ID č.:l), myšího angiostatinu (SEQ ID č.:2); lidského angiostatinu (SEQ ID č.:3),₍ angiostatinu opice rhesus (SEQ ID č.:4), prasečího angiostatinu (SEQ ID č.:5) a angiostatinu hovězího dobytka (SEQ ID č.:6).

Termín smyčka 1 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální buňky nebo anti-angiogenní aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 1, kterou popisuje myší smyčka 1 (SEQ ID č. : 7) , lidská smyčka 1 (SEQ ID č.: 8), smyčka 1 opice rhesus (SEQ ID č.: 9), prasečí smyčka 1 (SEQ ID č.: 10) a smyčka 1 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 11). Myší smyčka 1 (SEQ ID č.: 7) odpovídá aminokyselinám v poloze 103 až 181 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č.: 1 a dále odpovídá aminokyselinám v pozicích 6 až 84 (včetně) myšího angiostatinu SEQ ID č.: 2.

• ·

Lidská smyčka 1 (SEQ ID č.: 8), smyčka 1 opice rhesus (SEQ ID č.: 9), prasečí smyčka 1 (SEQ ID č.: 10) a smyčka 1 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 11) odpovídají aminokyselinám angiostatinu SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 5, a SEQ ID č.: 6 v pozicích 6 až 84 (včetně).

Termín smyčka 2 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální buňky nebo anti-angiogenní aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 2, kterou popisuje myší smyčka 2 (SEQ ID č. : 12), lidská smyčka 2 (SEQ ID č.: 13), smyčka 2 opice rhesus (SEQ ID č.: 14), prasečí smyčka 2 (SEQ ID č.: 15) a smyčka 2 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 16). Myší smyčka 2 (SEQ ID č.: 12) odpovídá aminokyselinám v poloze 185 až 262 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č.: 1 a dále odpovídá aminokyselinám v pozicích 88 až 165 (včetně) myšího angiostatinu SEQ ID č. : 2. Lidská smyčka 2 (SEQ ID č.: 13), smyčka 2 opice rhesus (SEQ ID č.: 14), prasečí smyčka 2 (SEQ ID č.: 15) a smyčka 2 hovězího dobytka (SEQ ID č. : 16) odpovídají aminokyselinám angiostatinu SEQ ID č. : 3, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 5, a SEQ ID č.: 6 v pozicích 88 až 165 (včetně).

Termín smyčka 3 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální buňky nebo anti-angiogenní aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 3, kterou popisuje myší smyčka 3 (SEQ ID č.: 17), lidská smyčka 3 (SEQ ID č.: 18), smyčka 3 opice rhesus (SEQ ID č.: 19), prasečí smyčka 3 (SEQ ID č.: 20) a smyčka 3 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 21). Myší smyčka 3 (SEQ ID č. : 17) odpovídá aminokyselinám v poloze 275 až 352 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č.: 1 a dále odpovídá aminokyselinám v pozicích 178 až 255 (včetně) myšího

angiostatinu SEQ ID č.: 2. Lidská smyčka 3 (SEQ ID č.: 18), smyčka 3 opice rhesus (SEQ ID č.: 19), prasečí smyčka 3 (SEQ ID č. : 20) a smyčka 3 hovězího dobytka (SEQ ID č. : 21) odpovídají aminokyselinám angiostatinu SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 5, a SEQ ID č.: 6 v pozicích 178 až 255 (včetně).

Termín smyčka 4 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální buňky nebo anti-angiogenní aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 4, kterou popisuje myší smyčka 4 (SEQ ID č. : 22) a lidská smyčka 4 (SEQ ID č.: 23). Myši smyčka 4 (SEQ ID č.: 22) odpovídá aminokyselinám v pozicích 377 až 454 (včetně) myšího plazminogenu se sekvencí SEQ ID č.: 1.

Termín smyčka 2-3 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální buňky nebo anti-angiogenní aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 2-3, kterou popisuje myší smyčka 2-3 (SEQ ID č.: 24), lidská smyčka 2-3 (SEQ ID č.: 25), smyčka 2-3 opice rhesus (SEQ ID č.: 26), prasečí siíiyčka 2-3 (SEQ ID č.: 27) a smyčka 2-3 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 28). Myší smyčka 2-3 (SEQ ID č. : 24) odpovídá aminokyselinám v poloze 185 až 352 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č.: 1 a dále odpovídá aminokyselinám v pozicích 88 až 255 (včetně) myšího angiostatinu SEQ ID č.: 2. Lidská smyčka 2-3 (SEQ ID č.: 25), smyčka 2-3 opice rhesus (SEQ ID č.: 26), prasečí smyčka 2-3 (SEQ ID č.: 28) a smyčka 2-3 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 28) odpovídají aminokyselinám angiostatinu SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 5, a SEQ ID č.: 6 v pozicích 88 až 255 (včetně).

Termín smyčka 1-3 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální

buňky nebo anti-angiogenni aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 1-3, kterou popisuje myší smyčka 1-3 (SEQ ID č.: 29), lidská smyčka 1 (SEQ ID č.: 30), smyčka 1-3 opice rhesus (SEQ ID č.: 31), prasečí smyčka 1-3 (SEQ ID č.: 32) a smyčka 1-3 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 33). Myší smyčka 1-3 (SEQ ID č.: 29) odpovídá aminokyselinám v poloze 103 až 352 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č. : 1 a dále odpovídá aminokyselinám v pozicích 6 až 255 (včetně) myšího angiostatinu SEQ ID č.: 2. Lidská smyčka 1-3 (SEQ ID č.: 30), smyčka 1-3 opice rhesus (SEQ ID č. : 31), prasečí smyčka 1-3 (SEQ ID č.: 32) a smyčka 1-3 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 33) odpovídají aminokyselinám angiostatinu SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 5, a SEQ ID č.: 6 v pozicích 6 až 255 (včetně) .

Termín smyčka 1-2 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibični aktivitu pro endoteliální buňky nebo anti-angiogenni aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 1-2, kterou popisuje myší smyčka 1-2 (SEQ ID č.: 34), lidská smyčka 1-2 (SEQ ID'č.: 35), smyčka 1-2 opice rhesus (SEQ ID č.: 36), prasečí smyčka 1-2 (SEQ ID č.: 37) a smyčka 1-2 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 38). Myší smyčka 1-2 (SEQ ID č.: 34) odpovídá aminokyselinám v poloze 103 až 262 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č.: 1 a dále odpovídá aminokyselinám v pozicích 6 až 165 (včetně) myšího angiostatinu SEQ ID č.: 2. Lidská smyčka 1-2 (SEQ ID č.: 35), smyčka 1-2 opice rhesus (SEQ ID č.: 36), prasečí smyčka 1-2 (SEQ ID č.: 37) a smyčka 1-2 hovězího dobytka (SEQ ID č.: 38) odpovídají aminokyselinám angiostatinu SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 5, a SEQ ID č.: 6 v pozicích 6 až 165 (včetně) .

Termín smyčka 1-4 zde popisuje proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální buňky nebo anti-angiogenní aktivitu. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 1-4, kterou popisuje myší smyčka 1-4 (SEQ ID č.: 39), lidská smyčka 1-4 (SEQ ID č.: 40). Myší smyčka 1-4 (SEQ ID č.: 39) odpovídá aminokyselinám v poloze 103 až 454 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č.: 1.

Aminokyselinové sekvence smyčky 1, 2, 3, 4, 2-3, 1-3, 12, a 1-4 jsou homologní se shora popsanými určitými sekvencemi. Aminokyselinové sekvence jsou nejméně ze 60%, lépe ze 70% homologní, přednost se dává 80 % homologi s doloženými sekvencemi. Rozumí se, že se dochází k různým substitucím, adicím, delecím nebo jiným modifikacím aminokyselin ve shora uvedených fragmentech za účelem zlepšení nebo modifikace jejich inhibiční aktivity proliferace endoteliálních buněk nebo anti-angiogenní aktivity.

Termín funkční homologie znamená, že pozměněné sekvence, které obsahují delece, adice nebo substituce různých zbytků, vedou ke vzniku sekvence, jenž kóduje stejný nebo funkčně ekvivalentní genový produkt. Produkt genu sám může obsahovat delece, adice nebo substituce aminokyselinových zbytků v angiostatinové sekvenci, což nevede ke změnám které se projeví ve funkci ekvivalentu angiostatinového proteinu. Takové aminokyselinové substituce se provádí na základě podobnosti v polaritě, náboji, rozpustnosti, hydrofobicity a/nebo amfipatické povahy zbytků, které obsahují. Například negativně nabité aminokyseliny zahrnují kyselinu aspartovou a glutamovou; pozitivně nabité kyseliny zahrnují lysin, histidin a arginin; aminokyseliny, které nemají nabité polární hlavní skupiny, mají podobné hodnoty hydrofilicity a zahrnují glycin a asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin;

aminokyseliny nepolárními skupinami zahrnují alanin, leucin, fenylalanin, prolin, metionin a modifikace nevedou k rozšíření rozsahu valin, isoleucin tryptofan. Takové nároků. Za účelem zabránit homodimerizaci tvořením vnitřních disulfidových můstků mezi smyčkami se cysteinové zbytky C4 v rekombinantní lidské smyčce 2 (SEQ ID č.:13) a C42 v rekombinantní smyčce 3 (SEQ ID č.: 18) zaměnily za serin. Rozumí se, že různé substituce, adice, delece a jiné modifikace se provádějí u shora popsaných angiostatinových fragmentů, čímž se podstatně nemění jejich inhibiční aktivita proliferace endoteliálních buněk a nerozšiřuje se ani rozsah nároků.

Termín nepodstatně změněné znamená, že angiostatinový fragment má nejméně 60%, lépe 70%, přednost se dává 80% inhibiční aktivity proliferace endoteliálních buněk ve srovnání s inhibiční aktivitou nejbližšího zde doloženého homologního fragmentu.

Konstrukce genu a exprese.

Způsob založený na PCR se použil z důvodu vytvoření fragmentů cDNK kódujícího smyčku 1 (Kl), smyčku 2 (K2), smyčku 3 (K3) , smyčku 4 (K4) a smyčku 2-3 (K2-3) lidského plazminogenu (HPg). V E.coli se exprimovala rekombinantní smyčka 1 (rKl), smyčka 2 (rK2), smyčka 3 (rK3), smyčka 4 (rK4) a smyčka 2-3 (rK2-3), jak se popisuje v publikacích

Menhart, N., Shel, L.C., Kelly, R.F. a Castellino, F.J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957; Marti,D., Schaller, J.,

Ochensberger, B., a Rickli, E.E. (1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti,D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., a Rickli, E.E. (1996) Biochem. In press; Rejante, M.R., Byeon, I.-J.L., and Llinas, M (1991) Biochem. 30, 11081-11092). Za účelem zabránit homodimerizaci • · · « · tvořením vnitřních disulfidových můstků mezi smyčkami, jak ukazuje obrázek č. 32B, se cysteinové zbytky C169 u rK2 a C29 v rK3 zaměnily za šeřiny, jak je možné vidět v SEQ ID č.: 13 a 18 v pozicích 4 a 42. (Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti,D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., a Rickli, E.E. (1996) Biochem. In press; Smyčky rK3 a rK2-3 obsahují hexahistidinový tag N-konce, který se použil pro čištění proteinu (není ukázáno).

Proteolytické štěpení.

Fragmenty Kl-3, Kl-4 a K4 se připravují štěpením Lys-HPg (Abbot Labs) vepřovou elastázou (Sigma), jak shora popisuje Powell, J.R., a Castellino, F.J. (1983) Biochem. 22, 923-927. Stručný popis: 1,5 mg enzymu elastázy se inkubuje při teplotě místnosti s 200 mg lidského plazminogenu v roztoku 50 mM Tris-HCl pH 8,0 přes noc za stálého míchání. Reakce se ukončila přidáním diizopropylfluorofosforečnanu (DFP) (Sigma) o konečné koncentraci 1 mM. Směs míchala kolébáním dalších 30 minut při teplotě místnosti a dialyzovala se přes noc proti roztoku 50 mM Tris-HCl, pH <8,0.

Čištění proteinu.

Rekombinantní protein K1 se exprimoval v E. coli v buňkách DH5a za použití plazmidového vektoru pSTII. Tento protein se čistí chromatograficky za použití kolon lysinsefaróza 4B (Pharmacia) a Mono Q (BioRad). Bakteriální buňky E. coli (kmen HB101) exprimující rK2 rK3 se kultivují do dosažení OD₆₀₀ přibližně 0,8 při teplotě 3°C v mediu 2x YT, které obsahuje ampicilin o koncentraci 100 mg/ml a kanamycin o koncentraci 25 mg/ml. Přidal se IPTG (isopropyl-b-Dtiogalaktopyranosid) , jehož konečná koncentrace byla 1 mM, a buňky se kultivovaly po dalších 4,5 hodiny při teplotě 37°C z

důvodu vyvoláni produkce rekombinantního proteinu. Buňky se shromáždily centrifugací a pelet se uchovával při teplotě 80°C. Rozmražené buněčné lyzáty se resuspendovaly v extrakčním pufru (6M hydrochlorid guanidinu v 0,1 M fosforečnanu sodným, pH 8,0). Suspenze se centrifugovala při 15 OOOxg po dobu 30 minut a do supernatantu se přidal bmerkaptoetanol, jehož konečná koncentrace byla 10 mM. Supernatan se pak nanesl na Ni⁺_ NTA agarózovou kolonu (1,5 cm x 5 cm) preekvilibrovanou extrakčním pufrem. Kolona se promyla extrakčním pufrem při pH 8,0 a pH 6,3. Rekombinantní proteiny K2 a K3 se vymyly extrakčním pufrem při pH 5,0.

Proteolyticky štěpené fragmenty Kl-3, Kl-4 a K4 se čistily za použití kolony lysin-sefarózy 4B (2,5 cm x 15 cm) ekvilibrované 50 mM Tris.HCl, pH 8,0 až do dosažení absorbance 0,005 při vlnové délce 180 nm. Absorbované kruhové fragmenty se vymyly pufrem Tris, který obsahuje 200 mM εaminokapronovou kyselinu pH 8. Vzorky se dialyzovaly přes noc proti 20 mM Tris-HCl, pH 5,0 a nanesly se do BioRad Mono-S kolony ekvilibrované stejným pufrem. Fragmenty K4, Kl-3 a Kl4 se vymyly s 0-20 %, 20-50 % 50-70 % skokovým gradientem 20 mM fosforečnanu/ΙΜ KC1, pH'5,0, Většina fragmentů Kl-3 a Kl-4 se z koloy vymyla 0,5 M KC1 určila se pomocí SDS-PAGE. Všechny frakce se dialyzovaly přes noc proti 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Po dialýze fragmenty Kl-3 a Kl-4 se dále čistily použitím heparin-sefarózové kolony (5 cm x 10 cm) (Sigma) preekvilibrované pufrem 20 mM Tris-HCl pH 8,0. Fragment Kl-3 se vymyl s 350 mM KC1 a Kl-4 se izoloval z frakce, která kolonou prošla. Čištěné kruhové fragmenty se analyzovaly na SDS gelu, který byl barvený stříbrem, westernovým imunopřenosem a anti-lidskými K4 a Kl-3 polyklonálními protilátkami a sekvenční analýzou N-konce.

Zabalení proteinu in vitro.

Zabalení rK2, rK3 a rK2-3 proběhlo podle standardního protokolu (Cleary, S., Mulkerrin, M:G., and Kelley, R.R. (1989) Biochem. 28, 1884-1891). pH čištěných proteinů se upravilo na hodnotu 8,0 a přidal se ditiotreitol (DTT) na konečnou koncentraci 5 mM. Po celonoční inkubaci se roztok naředil se čtyřmi objemy roztoku 50 mM Tris-HCl pH 8,0, který obsahoval 1,25 mM redukovaného glutationu. Po jedné hodině inkubace se přidal oxidovaný glutation o konečné koncentraci 1,25 mM a směs se inkubovala po dobu 6 hodin při teplotě 4°C. Renaturovaný protein se dialyzoval proti vodě po dobu dvou dnů a další dva dny proti 50 mM fyziologickému roztoku pufrovaným fosforečnanem pH 8,0. Roztok se pak nanesl na lysin-Bio-Gel kolonu (2 cm x 13 cm) ekvilibrivanou stejným fyziologickému roztoku pufrovaným fosforečnanem. Kolona se promývala fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem a protein se vymýval fosforečnanovým pufrem, který obsahoval 50 mM 6-AHA (β-aminohexanovou kyselinu). HPLC z reverzní fází proběhla na Aquapore butylové koloně (2,1 x 100 mm, velikost pórů 30 nm, 7 mm, Applised Biosystems) a použila se kapalinová chromatografie Hewlett Packard s acetonitrilovým gradientem.

Redukce a alkylace.

Redukce a alkylace kruhových fragmentů proběhla podle standardního protokolu (Cao, Y., and Pettersson, R.F., (1990)

Growth Factors 3, 1013). Přibližně 20-80 mg čištěných proteinů v 300-500 ml mediu DME bez séra se inkubovalo při teplotě místnosti s 15 ml 0,5M DTT po dobu 15 minut. Po inkubaci se k reakční směsi přidalo 30 ml 0,5 M jodoacetamidu. Roztok proteinu se dialyzoval přes noc při teplotě 4°C proti 20 objemům DMEM. Roztok se dále dialyzoval po dobu 4 hodin při teplotě 4°C proti 20 objemům čerstvého ·· · ·

DMEM. Po dialýze se vzorky analyzovaly na SDS · gelu a testovala se jejich inhibiční aktivita proliferace endoteliálních buněk.

Čištění a charakterizace kruhového fragmentu lidského plazminogenu.

Fragmenty cDNK kódující jednotlivé smyčky (Kl, K2, K3 a K4) a smyčky 2-3 (K2-3) lidského plazminogenu se amplifikovaly pomocí způsobu založeném na PCR (obrázek 28) . Tyto amplifikované fragmenty se klonovaly do bakteriálního expresivního vektoru. Rekombinantní proteiny exprimované v Escherichia coli se in vitro zabalily a čistily se do dosažení víc jak 98 % homogenity použitím HPLC chromatografie (obrázek č.29). Za redukčních podmínek rekombinantní K2, K3 a K4 migrovaly do vzdálenosti, která odpovídá molekulové hmotnosti 12 až 13 kDa (obrázek 29A, dráhy 2-4), což odpovídá předpovídané molekulové hmotnosti každého kruhového fragmentu. Pomocí SDS gelové elektroforézy se určil rekombinantní fragment Kl s vysokou molekulovou vahou 17 kDa. Fragmenty Kl-4 a Kl-3 se získaly proteolytickým štěpením lidského lys-plazminogenu (Lys-HPg) enzymem elastázou, jak se popisuje v publikaci Powell, J.R. and Casstellino, F.J. (1983) Biochem. 22, 923-927; Brockway, W.J. and Casstellino, F.J. (1972) Arch. Biochem. Biophys). Tyto dva fragmenty (obrázek 29B, dráhy 1 a 2) s předpokládanou molekulovou hmotností 43 kDa a 35 kDa se také čistily.V případě fragmentů Kl-3 a Kl-4 analýza aminokyselinové sekvence N-konce čištěných fragmentů odhalila identickou sekvenci -YLSE-, po níž následuje SEQ ID č.: 30 a SEQ ID č.: 40. Sekvence N-konce fragmentu K4 produkovala sekvenci -WQD- s přibližně 20% VQD-, po které následuje SEQ ID č.: 23. Každá z nich je předpovídána z očekávané sekvence začínající valinem¹⁷⁶ a valinem¹⁷⁷ lidského angioastatinu (SEQ ID č.:3).

Anti-endoteliálni buněčná proliferační aktivita jednotlivých smyček.

Inhibiční aktivita jednotlivých rekombinantních kruhových fragmentů angiostatinu se testovala na růstu hovězích kapilárních endoteliálnich buněk (BCE) stimulovaném bFGF. Jak ukazuje obrázek č.: 30A fragment rKl inhiboval proliferaci BCE buněk v závislosti na koncentraci. Koncentrace rKl nutná pro dosažení 50 % inhibice (ED₅₀) byla okolo 320 nM (tabulka č. 4) . Naproti tomu fragment rK4 nevykazuje žádný nebo pouze malý inhibiční účinek na proliferaci endoteliálnich buněk. Rekombinantní kruhové fragmenty K2 a K3, které neváží lysin také vykazují inhibicí proliferace endoteliálnich buněk v závislosti na koncentraci (obrázek 30B). Avšak inhibiční síla fragmentu rK2 byla podstatně menší než fragmentů rKl a rK3 (ED_5o=460) (obrázek č. 30 a tabulka č. 4). Nepozorovala se ani cytotoxicita ani odlišná morfologie spojená s apoptotickými endoteliálními buňkami, jako je zakulacování, odtrhávání a fragmentace buněk, dokonce ani po inkubaci za přítomnosti vysoké koncentrace těchto fragmentů. Tyto data naznačují, že fragmenty Kl, K2 K3 méně pak K4 sdílejí anti-endoteliálni růstovou aktivitu angiostatinu.

Tabulka č. 4.

Inhibiční aktivita proliferace kapilárních endoteliálnich buněk.

Fragmenty	ED5o (nM)
Smyčka 1	320

Smyčka 2	-
Smyčka 3	460
Smyčka 4	—
Smyčka 2-3	—
Smyčka 1-3	70
Smyčka 1-4 (angiostatin)	135

Anti-endoteliální buněčná proliferační aktivita fragmentů Kl3 a Kl-4.

Za účelem zhodnoceni anti-endoteliálního buněčného proliferačniho účinku kombinovaných kruhových fragmentů se testovaly čištěné proteolytické lidské fragmenty Kl-4, Kl-3 a rK2-3 na BCE buňkách. V souladu spředchozím zjištěním (O'Reilly, M.S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R.A., Moses, J., Lané, W.S., Cao, Y., Sage, E.H. and Folkman, J. (1994) Cell 79, 315-328) proliferace BCE buněk byla podstatně inhibována, jak ukazuje obrázek č.:31, fragmentem Kl-4, který odpovídá angiostatinu (ED₅₀ =135 nM) (tabulka 4) . Vzrůst anti-endoteliální růstové aktivity vykázal fragment Kl-3 (ED50 =70 nM) (tabulka 4) . Inhibice proliferace endoteliálních buněk je závislá na dávce. Tyto výsledky ukazují, že odstranění fragmentu K4 z angiostatinu zesilují anti-endoteliální růstovou aktivitu.

Aditivní inhibice pomocí fragmentů rK2 a rK3.

Fragment rK2-3 vykazuje pouze slabou inhibiční aktivitu, která je podobná inhibiční aktivitě samotného fragmentu rK2 (obrázek č. 31) . Fragmenty rK2 a rK3 inhibovaly proliferaci endoteliálních buněk (obrázek č.. 30B) . Toto zjištění naznačuje, že inhibiční účinek fragmentu K3 se skrývá ve struktuře fragmentu K2-3. Předchozí studie struktury ukázaly,

že disulfidová vazba mezi smyčkami se nachází mezi K2 (cystein¹⁶⁹) a K3 (cystein²⁹⁷) lidského plazminogenu, což odpovídá cysteinu⁹¹ a cysteinu²¹⁹ SEQ ID č. : 3 (Sohndel, S.,

Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. In press) (obrázek č.:32B). Testoval se inhibiční účinek kombinace fragmentů rK2 a rK3. Je zajímavé, že aditivní inhibice se pozorovala na BCE buňkách, když se kombinovaly jednotlivé fragmenty rK2 a rK3 (obrázek 32A) . Tyto výsledky naznačují, že když se otevře vnitřní disulfidový můstek mezi K2 a K3, dosáhne se maximálního inhibičního účinku fragmentu K2-3.

Pro anti-endoteliální aktivitu angiostatinu se vyžaduje vhodné zabalení kruhových struktur.

Za účelem studia, zda zabalení kruhových struktur je nutné pro anti-endoteliální proliferační aktivitu, se redukoval přírodní angiostatin pomocí DTT a testoval se na hovězích kapilárních endoteliálních buňkách. Po redukci se angiostatin dále alkyloval jodoacetamidem a analyzoval se na SDS gelové elektroforéze. Jak ukazuje obrázek č.: 34A, protein ošetřený DTT migruje do vyšší pozice s molekulovou hmotností okolo 42 kDa (dráha 2) ve srovnání s přírodním angiostatinem s molekulovou hmotností 33 kDa (dráha 1), což naznačuje, že angiostatin se zcela redukoval. Antiproliferační aktivita angiostatinu po redukci z velké části zmizela (obrázek č.: 34B) . Z těchto výsledků vyplývá, že správné zabalení angiostatinu pomocí disulfidových vazeb mezi smyčkami je nutné pro udržení jeho silného inhibičního účinku proliferace endoteliálních buněk.

Uspořádání aminokyselinové sekvence kruhových oblastí lidského plazminogenu ukazuje, že smyčky Kl, K2, K3 a K4 vykazují stejnou hrubou stavbu a překvapující sekvenční homologií (56-82% se shoduje), jak je patrné z obrázku č.:

·«

35. Mezi těmito strukturami smyčka Kl, která má schopnost vázat vysokou afinitou lysin, je segment s nejsilnější inhibiční aktivitou proliferace endoteliálních buněk. Fragment K4, který prostřednictvím své afinity váže lysin, nevykazuje inhibiční aktivitu. Tyto data naznačují, že vazebné místo lysinu na kruhových strukturách nemusí být přímo spojené s inhibiční aktivitou. Konzervativnost aminokyselinové sekvence a funkční rozdílnost těchto kruhových struktur poskytuje ideální systém ke studiu úlohy mutací způsobených replikací DNK během vývoje. Stejně odlišné aktivity týkající se regulace angiogeneze, které vykazuje skupina strukturálně příbuzných proteinů, se také nacházejí u chemokinu -C-X-C- a skupiny růstových hormonů založených na prolaktinu (Maione, T.E., Gray, G.S., Petro, A.J., Hunt, A.L. and Donner, S.I. (1990) Science 247, 77-79.; Koch, A.E., Polverini, P.J., Kunkel, S.L., Harlow, L.A., DiPietro, L.A., Elner, V.M., Elner, S.J., and Strieter, R.M. (1992) Science 258, 1798-1801; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995) J.Exp. Med. 182, 2069-2077; Strieter, R.M., Polverini, P.J., Arenberg, D.A. and Kunkel,

S.L. (1995) Shock 4, 155-160; Jackson, D., Volpert, O.V., Bouck, N., and Linzer, D.I.H. (1994) Science 266, 1581-1584).

Dále sekvenční analýza ukazuje, že smyčka K4 obsahuje dva pozitivně nabyté lysinové zbytky přilehlé k cysteinům 22 a 78 (obrázek č.: 35). Analýza použitím nukleární magnetické rezonance (NMR) ukazuje, že tyto čtyři lysiny dohromady s lysinem 57 tvoří jádro pozitivně nabyté oblasti ve smyčce K4 (Llinas M, nepublikovaná data), zatímco jiné kruhové struktury nemají takovou pozitivně nabitou oblast. Předmětem dalšího studia je problém, zda oblast bohatá na lysin se podílí na ztrátě inhibiční aktivity smyčky 4 lidského plazminogenu. Dříve se fragment K4 spojoval se stimulací proliferace jiných buněčných typů a se zvýšením

uvolňováni vnitrobuněčného vápníku (Donate, L.E., Gherardi, E., Srinivasan, N., Sowdhamini, R., Aporicio, S., and Blundell, T.L. (1994) Prot. Sci. 3, 2378-2394). Skutečnost, že odstranění fragmentu K4 z angiostatinu zvyšuje jeho inhibiční aktivitu endoteliálních buněk naznačuje, že tato struktura může bránit některým inhibičním účinkům fragmentu Kl-3.

Mechanizmus specifické inhibice růstu endoteliálních buněk angiostatinem a jeho příbuznými fragmenty zůstává nevysvětlený. Není ještě jasné, zda inhibice je zprostředkovaná receptorem, který je specificky exprimován v proliferujících endoteliálních buňkách, nebo jestli angiostatin po vstupu do endoteliálních buněk podstatně inhibuje proliferaci buněk. Angiostatin se může spojovat s adhezním receptorem endoteliálních buněk jako je integrin a_vb₃ blokující angiogenezi zprostředkovanou integrinem (Brooks, P.C., Montgomery, A.M., Rosenfeld, M., Reisfeld R.A., Hu, T. Klier., G., and Cheresh, D.A. (1994) Cell 79, 1157-1164). Friedlander et. al. v publikaci Friedlander e, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 270, 1502 popisuje, že angiogeneze v in vivo modelech rohovky nebo chorioallantoické membrány (angiogeneze indukovaná bFGF a nádorovýn nekrotickým faktorem) je závislá na integrinu a_vb₃. Avšak angiogeneze stimulovaná VEGF, transformačním růstovým faktorem a nebo estery forbolu je závislá na a_vb₅. Protilátky proti jednotlivým integrinům specificky blokují jednu z těchto cest a kruhový proteinový antagonista obou integrinů blokuje angiogenezi indukovanou každým cytokinem (Freidlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 270,1502). V případě angiogeneze indukované bFGF a VEGF se angiostatin uplatňuje jako __ ___·

.....· ··..........

• · · • · · · · • · · *« ♦·· inhibitor. Může blokovat běžný způsob angiogeneze sprostředkované integriny.

V posledních několika desítkách zvyšující počet endogenních inhibitorů let se identifikoval angiogeneze (Folkman, (1995) N.Engl.

charakterizovaných endoteliálních buněčných supresorů jsou některými inhibitory proteolytické fragmenty. Například 16 kDa velký fragment N-konce lidského prolaktinu inhibuje proliferaci endoteliálních buněk a blokuje angiogenezi in

J.

J. Med. 333, 1757-1763). Z devíti vivo (Clapp, C.,

Martial, J.A., Guzman,

R.C., Rentierdelrue,

F., and Weiner,

R.I. (1993) Endorinology

D'Angelo et. al. udává, velikosti 16

133, 1292-1299).V jisté publikaci fragment N-konce o proteinové kinázy (MAPK), aktivované bFGF v kapilárních endoteliálních že antiangiogenní inhibuje aktivaci mitogenem, pomocí VEGF a buňkách (D'Angelo, G., kDa

Struman, I.

Martial, J., and Weiner, R. (1995)

Proč. Nati.

Acad. Sci.

neporušená proliferaci angiogeneze.

inhibuje angiogenezi (Maione,

92, 6374-6378). Stejně jako u rodičovská molekula prolaktinu endoteliálních buněk a není ani angiostatinu neinhibuj e inhibitorem

Vysoká koncentrace destičkového faktoru 4 (PF—4)

T.E., Gray, G.S.,

Petro, A.J.,

Hunt, A.L. and Donner, S.I.

77-79; Cao,

Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and (1995) J.Exp. Med. 182, 2069-2077). PF-4 fragment

N-konci proteolytickým štěpením vykazuje 30-ti násobné zvýšení anti-proliferační aktivity ve srovnání s neporušenou molekulou PF-4 (Gupta, S.K., Hassel, T., and

Folkman, J.

zkrácený na až 50-ti

Singh, J.P. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. 92, 7799-7803).

Zjistilo se, že menší proteinové fragmenty fibronektinu, myšího epidermálního růstového faktoru a trombospondinu také vykazují specifickou inhibici růstu endoteliálních buněk (Homandberg, G.A., Williams, J.E., Grant, D., Schumacher, B., and Eisenstein, R. (1985) Am. J. pathol. 120, 327-332;

TTŮJtcm:. JMt .....----,-JUL- - -—·—· -		..
• · · ·	•	i ·	··
• · · · ·	• ·	·· ·	• ·
• · · ·	•	•	• ·
	···	• ·	··

Nelson, J., Allen, W.E., Scott, W.N., bailie, J.R., Walker, B., McFerran, N.V., and Wilson, D.J. (1995) Cancer Res. 55, 3772-3776; Tolsma, S.S., Volpert, O.V., Good, D.J., Frazer, W.A., Polverini, P.J., and brouck, N. (1993) J. Cell Biol. 122, 497-511). Proteolytický štěpeni velkých proteinů může změnit uspořádání původní molekuly nebo zpřístupnit nové epitopy, které jsou antiangiogenní. Pak proteáza(y) může hrát rozhodující úlohu při regulaci angiogeneze. 0 regulaci zmíněných proteázových aktivit in vivo je známo pouze málo.

Data také ukazují, že zabalení kruhových struktur u angiostatinu, které je zprostředkované disulfidovou vazbou je nutné pro udržení inhibiční aktivity růstu endoteliálních buněk. Analogy kruhových struktur plazminogenu se nacházejí i u jiných proteinů. Například apolipoprotein (a) má 37 repeticí plazminogenní smyčky 4 (McLean, J.W., Tomlinson, J.E., Kuang, W.J., Eato, D.L., Chen, E.Y., Fless, G.M., Scanu, A.M., and Lawn, R.M. (1987) Nátuře 330,132-137). Oblast N-konce protrombinu také obsahuje dvě smyčky, které vykazují homologii se smyčkami plazminogenu (Walz, D.A., Hewett-Emmett, D., and Seegers, W.H. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. 14, 1969-1973). Urokináza má kruhovou strukturu, která vykazuje rozsáhlou homologii s plazminogenem (Gunzler, W.A., J., S.G., Otting, F., Kim, S. M. A., frankus, E., and Flohe, L. (1982) Hoppe-Seyler 's A. Physiol. Chem. 363, 1155-1165). Povrchově aktivní protein B a hepatocytový růstový faktor (HGF) také nesou kruhové struktury (Johansson, J., Curstedt, T., and Jornvall., H. (1991) Biochem. 30, 6917-6921; Lukker , N.A., Presta, L.G., and Godowski, P.J. (1994) Prot. Engin. 7, 895-903) .

Příklad 28: Potlačení metastáz a proliferace endoteliálních buněk fragmenty angiostatinu.

. ··

.. ..a·....	......	··
	• ......	• ·
•	•	• ·
•	• ·	• ·
•	•	• ·
····	····	··

··

Následující příklad charakterizuje aktivitu dalších fragmentů angiostatinu. Data naznačují, že takové proteinové fragmenty angiostatinu vykazují silnou anti-endoteliální aktivitu a mají schopnost potlačovat nádory.

Termín smyčka 1-4BKLS znamená proteinový derivát plazminogenu vykazující inhibiční aktivitu pro endoteliální buňky. Tento proteinový derivát má aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci homologní se smyčkou 1-4BKLS, kterou popisuje myší smyčka 1-4BKLS (SEQ ID č. : 41), lidská smyčka 1-4BKLS (SEQ ID č.: 42). Myší smyčka 1-4BKLS (SEQ ID č.: 41) odpovídá aminokyselinám v poloze 93 až 470 (včetně) myšího plazminogenu SEQ ID č.: 1. Tento příklad ukazuje, že fragment angiostatinu může být fragment plazminogenu a zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která je větší než angiostatin popsaný například SEQ ID č.: 3. Tento fragment stále vykazuje inhibiční aktivitu proliferace endoteliálních buněk a anti-angiogenní aktivitu.

Aminokyselinová sekvence smyčky 1-4BLKS je homologní se sekvencemi specifické smyčky 1-4BLKS. Stupeň homologie aminokyselinových sekvencí s doloženými sekvencemi je nejméně 60%, přednostně nejméně 70% a nejvíce se upřednostňuje 80%. Rozumí se, že substituce, delece a jiné modifikace aminikyselin shora uvedených fragmentů se provádí za účelem vylepšení a modifikace inhibiční aktivity endoteliálních buněk. Tyto modifikace však nezvětšují rozsah nároků. Rozumí se, že tiché substituce, delece a jiné modifikace aminokyselin shora uvedených fragmentů podstatně nezmění endoteliální buněčnou inhibiční aktivitu a proto neovlivní ani rozsah patentových nároků.

Klonování angiostatinu do kvasinek Pichia pastoris.

Sekvence kódující angiostatin se amplifikovaly pomocí

PCR za použití Vent polymerázy (New England Biolabs) a primerů číslo 154 (5'-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAGAAAGTG-3') (SEQ ID č.: 43) a číslo 151 ( 5 '-ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGAGG-3 ' ) (SEQ IDČ.: 44).

Tyto primery obsahují spojovníky Xhol a EcoRI. Jako templát se použil plazmid pTrcHis/Has. Tento plazmid obsahoval sekvence kódující aminokyseliny 93 až 470 lidského plazminogenu (SEQ ID č.: 42), které se klonovaly do restrikčního místa Xhol/EcoRI místa expresivního vektoru pHIL-Sl za použití přirozeného sekrečního signálu PHO 1 z P. pastoris. Stejná sekvence se amplifikovala stejným způsobem. Použité primery číslo 156 ( 5 '-ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG-3 ' ) (SEQ ID č.:45) a číslo 151 obsahovaly spojovníky SnaBl a EcoRI. Tato sekvence se klonovala do restrikčního místa SnaBl/EcoRI expresivního vektoru pPlC9 se sekrečním signálem alfafaktoru. Amplifikované produkty se čistily na gelu, spojovníky se odstranily štěpením vhodnými enzymy a produkty se přečistily soupravou gene-clean (Bio 101). Tyto genové fragmenty se ligovaly do vhodných vektorů. Izolovaly se výsledné klony a jejich plazmidy. Linearizovanými plazmidy se transformoval hostitelský kmen GS115 P. pastoris a tak se vytvořily rekombinantní His⁺ Mut³ a His⁺ Muť kmeny. Integrace se potvrdila PCR.

• · • · ·· · · · ···· · ·····'··· ···· ···· ·· ··· ·· ··

100

Oba rekombinantní His⁺ Muť a His⁺ Mut⁺ kmeny se indukovaly metanolem a testovala se jejich vysoká exprese angiostatinu použitím SDS-PAGE gelů barvených Coomasieovou metodou a imunopřenosem za použití myších monoklonálních protilátek proti smyčkám 1 až 3 (Castellino, Enzyme Research Laboratories, Inc. South Bend, IN). Vybraly se transformované klony GS115 P. pastoris pHIL-Sl/Hasl8 a jejich fenotyp se charakterizoval jako His⁺ Muť .

Exprese pHIL-Sl/HAsl8.

Exprese angiostatinu z pHIL-Sl/HAsl8 byla typická pro klon His⁺ Muť . Při indukci v míchaných j ednolitrových nádobách se buňky kultivovaly ve 150 ml pufrovaného komplexního média s metanolem, které obsahuje 1 % kvasinkový extrakt, 2% peptonu, 100 mM fosforečnan draselný pH 6,0, 1,34 % kvasinkové dusíkaté báze se síranem amoným, 0,00004 % biotinu a 0,5 % metanolu. Buňky se stále míchaly rychlostí 250 ot./min. a při teplotě 30°C. Ve 24-ti hodinových intervalech se přidával absolutní metanol v množství, aby konečná koncentrace byla 0,5%. Po 120 hodinách se buňky centrifugovaly při 5 000 ot./min. a supernatanty se uložily při teplotě -70°C do okamžiku dalšího použití.

Izolace angiostatinu z fermantační půdy pro P. pastoris pomocí lysin-sefarózové chromatografie.

Všechny kroky probíhají při teplotě 4°C. Fermentační půda, většinou o objemu 200 ml, obsahující angiostatin se vyčeřila centrifugací při 14 000 x g a koncentrovala se na membráně Centripep 30(Amicon), která zachycuje proteiny o molekulové hmotnosti 30 kDa, na přibližně jednu čtvrtinu původního objemu. Ke koncentrovanému vzorku se přidal jeden objem 50 mM fosforečnanového pufru pH 7,5 a znovu se

101 koncentroval na membráně Centriprep na jednu čtvrtinu původního objemu. Vzorek byl opět ředěn stejným objemem pufru, který tvoři 50 mM fosforečnan sodný pH 7,5. 60 g lysin-sefarózy 4B (Pharmacia) se resuspendovala v 500 ml ledem chlazeného 50 mM fosforečnanového pufru pH 7,5 a použila se k naplnění kolony o rozměrech 48 x 100 mm (objem přibližně 180 ml). Kolona se přes noc promývala 50mM fosforečnanem sodným pH 7,5, množstvím, které odpovídá 7,5 násobku objemu kolony (CV), při průtokové rychlosti 1,5 ml/min. Vzorek se na kolonu nanášel pumpou o průtokové rychlosti 1,5 ml/min a kolona se promývala 1,5 CV 50 mM fosforečnanem sodným pH 7,5, při průtokové rychlosti 3 ml/min.: angiostatin se pak vymyl 0,2 M kyselinou ε-amino-nkapronovou pH 7,4 při průtokové rychlosti 3 ml/min. Shromáždily se frakce obsahující odpovídající absorbanci. Tyto frakce se dialyzovaly po dobu 24-48 hodin proti deionizované vodě a lyofilizovaly se. Ze 100 mg celkového proteinu se obvykle získá 10 mg angiostatinu. Kolona se regenerovala 5 CV 50 mM fosforečnanu sodného/1 M NaCl, pH 7,5.

Test proliferace hovězích kapilárních endoteliálních buněk.

Hovězí kapilární endoteliální buňky se získaly shora popsaným způsobem. Buňky se udržují v DMEM médiu, které obsahuje 3 mg/ml rekombinantního lidského bFGF (Scios Nova,

Mountainview, CA), 10% telecího séra inaktivovaného teplem,

100 U/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu a 0,25 mg/ml fungizonu (BioWhittaker) , v kultivačních lahvích o objemu 72 cm². Test se provedl shora popsaným způsobem.

Studie provedené na zvířatech.

• ·

102

Šest až osm týdnů staří samci myši C57BI/6J (Jackson Laboratories) se podkožně inokulovaly linií buněk nízko metastatického myšího Lewisového plicního karcinomu (LLC-LM) (1 x 10⁶ buněk v jedné injekci) . Přibližně 14 dnů po implantaci, když primární nádor dosáhl objemu 1,5 cm³, se zvířatům v anestezi metoxyfluranem chirurgicky odstranil primární nádor. Místo operace se uzavřelo jednoduchými přerušovanými stehy. Polovina zvířat v této skupině dostala podkožně vstupní dávku (3 mg/kg) rekombinantního angiostatinu nebo angiostatinu odvozeného od plazminogenu bezprostředně po operaci. Dalších 14 dnů dostávaly denně uvedený angiostatin v dávce 1,5 mg/kg. Kontrolní skupině myší se každý den aplikoval stejný objem PBS po dobu 14 dnů po chirurgickém zákroku. 14 dnů po odstranění primárního nádoru se všechny myši usmrtily (což je 28 dnů po implantaci nádoru), vyjmuly se plíce, ty se zvážily a pomocí stereomikroskopu se spočítaly metastázy na jejich povrchu.

Charakteristika rekombinantních lidských angiostatinových fragmentů.

Fragment genu kódující lidský angiostatin zahrnující smyčky 1 až 4 lidského plazminogenu, který obsahuje celkem 26 cysteinů, se exprimoval v metylotrofních kvasinkách Pichia pastoris. Angiostatin exprimovaný kvasinkami Pichia pastoris se váže na lysin-sefarózu a může být specificky vymyt kyselinou ε-aminokapronovou. To ukazuje, že zcela funkční smyčka(y) vázající ε-aminokapronovou kyselinu a mající fyzikální vlastnosti plazminogenních smyček 1 až 4 (SottrupJensen, L. et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3 (1978) Ravens Press, N.Y. p. 191), se může exprimovat a vylučovat se kvasinkami Pichia pastoris a čistí se způsobem, který nevyžaduje zabalení (obrázek č.: 36A

103 uspořádání molekuly až 3 (Castellino,

Bend, IN) (obrázek redukované formy a B). Angiostatin exprimovaný kvasinkami Pichia pastoris stejně jako angiostatin čištěný štěpením plazminogenu enzymem elastázou je rozeznáván v závislosti na monoklonálními protilátkami proti smyčkám Enzyme Research Laboratories, lne. South 36B) . Tyto protilátky rozeznávají plazminogenu nebo angiostatinu.

Angiostatin exprimovaný kvasinkami jeví jako dvojice pruhů migrující neredukovaných SDS-PAGE gelech barvených vzdáleností odpovídající molekulové hmotnosti 49 kDa a 51,5

Pichia pastoris se na denaturovaných podle Coomassie do kDa. U proteinů exprimovaných kvasinkami Pichia pastoris dochází k post-translačním úpravám, z velké části jde o glykosylaci N-konce s vysokým obsahem manózy, nepodstatná je O-terminální glykosylace. Za účelem zhodnocení možností glykosylace angiostatinu exprimovaného kvasinkami Pichia pastoris se rekombinantní angiostatin štěpil enzymem endoglykozidázou H, který je specifický pro struktury obsahující vysoké procento manózy. Po štěpení vznikl pruh o velikosti 51,5 kDa, který migroval stejně jako 49 kDa velký pruh (obrázek 37A a B) . Štěpení O-glykanázou po předchozím působení neuraminidázy, která odstranila zbytky kyseliny sialové, nezměnilo migrační patern dvojice pruhů (data nejsou ukázána). Tyto výsledky ukazují, že angiostatin exprimovaný kvasinkami Pichia pastoris se vyskytuje ve dvou formách: (1) s řetězcem připojeným k N-konci s pravděpodobnou strukturou (Man) 2-150—Man

M a n—G1cNAc---G1cNAc-Asn(Man) i-2-Man a (2) bez glykosylace.

• · • · ·· · · · ···· · • · ··· ··· ········ ·· ··· ·· ··

104

Inhibice hovězích kapilárních endoteliálních buněk in vitro.

Dalším úkolem bylo zjistit jestli rekombinantně exprimovaný angiostatin vykazuje antiangiogenní aktivitu. Buňky BCE se kultivovaly v přítomnosti bFGF za účelem stanovení, zda přidaný čištěný rekombinantní angiostatin bude inhibovat jejich proliferaci. Čištěný angiostatin exprimovaný kvasinkami Pichia pastoris inhiboval v závislosti na koncentraci proliferaci hovězích endoteliálních buněk in vitro zprostředkovanou bFGF (obrázek 38B a 38C) . Při koncentraci 1 ng/ml rekombinantniho angiostatinu byla inhibice 80 %. 50 % inhibice odpovídala té, které se dosáhne angiostatinem získaným štěpením lidského plazminogenu enzymem elastázou.

Potlačení metastáz in vivo.

Použila se transplantovatelná linie buněk LLC (LM), u které byl angiostatin poprvé určen. Tyto buňky byly podkožně implantovány syngenním myším C57B1/6J. Nádory rychle rostly. Během 14 dnů vznikly nádory o velikosti větší jak 1,5 cm³. Následovala resekce primárního nádoru. Metastázy v plicích rostou exponenciálně až zcela pokryjí povrch plic. 14. den po odstranění primárního nádoru jsou tyto metastázy vysoce vaskularizovány. V případech, kde se primární nádor neodstranil, mikrometastázy zůstávají v latentní fázi a nejsou makroskopicky viditelné. Po odstranění primárního nádoru se myším systematicky podával rekombinantní angiostatin za účelem testování potlačení růstu metastáz. Angiostatin exprimovaný kvasinkami Pichia pastoris podávaný systematicky v dávce 30 ng/myš/den inhiboval růst metastáz, o čemž svědčí počet povrchových metastáz (obrázek č.:39A) a celková hmotnost plic (obrázek č.:39B). Údaje o hmotnosti • · ·

105 plic myši, kterým se odstranil primární nádor a aplikovala se denní dávka rekombinantního angiostatinu nebo angiostatinu získaného štěpením plazminogenu elastázou byly srovnatelné s údaji získanými z normálních myší (190 až 200 mg) . Plíce myší, kterým se odstranil primární nádor a následně se jim aplikovala denní dávka rekombinantního angiostatinu byly růžové s minimálním počtem mikrometastáz bez vaskulárního systému (obrázek č. : 40) . Naproti tomu u myší, kterým se po odstranění primárního nádoru podával fyziologický roztok, byly plíce pokryty vaskularizovanými metastázami (obrázek č.: 41) . Je nutné také poznamenat, že nebyl pozorován systematický nebo lokální toxický účinek způsobený dávkou a režimem aplikace angiostatinu exprimovaného kvasinkami Pichia pastoris. U žádné s testovaných myší se nenašel důkaz zánětu nebo krvácení.

Angiostatinový protein exprimovaný kvasinkami Pichia pastoris vykazuje dvě důležité fyzikální vlastnosti přirozeného proteinu: (1) je rozeznáván monoklonálními protilátkami proti smyčkám 1 až 3 lidského plazminogenu v závislosti na uspořádání molekuly (obrázek č.: 36B) a (2) váže lysin (obrázek č.: 36A a B). Tyto vlastnosti ukazují na to, že rekombinantní angiostatinový protein má strukturu, která napodobuje přirozenou molekulu. Angiostatinový protein exprimovaný kvasinkami Pichia pastoris inhibuje proliferaci hovězích kapilárních endoteliálnich buněk in vitro, která je stimulovaná bFGF (obrázek 38) . Systematicky aplikovaný rekombinantní angiostatin udržoval jinak letální Lewisův plicní karcinom tvořící metastázy v latentní fázi (obrázek 39A a B, obrázek č.: 40).

Předchozí data naznačují, že v Lewisových plicních nádorech vyjmutých z myší nebo v LLC buňkách po čtvrté pasáži in vitro chybí detekovatelný transkript angiostatinu.

Plazminogen produkovaný v játrech cirkuluje v plazmě. Jeho

106 koncentrace je 1,6 +/- 0,2 μΜ. Je možné, že nádory produkují enzymy, které štěpí vázaný nebo cirkulující plazminogen za vzniku angiostatinu. Zánětlivé buňky přitahované do místa nádoru mohou také produkovat takový enzym.

Je zajímavé, že plazminogen kvasinek P. pastoris stejně jako lidský plazminogen se produkuje v glykozylované a neglykozylované formě. V případě lidského plazminogenu jeden transkript jednoho genu může produkovat obě zmíněné formy. Molekulární mechanizmus rozlišovacích post-translačních úprav lidského plazminogenu, který je také možné spatřit u TPA, není znám.

Kvasinky P. pastoris silně exprimují angiostatin. Supernatanty obsahují 100 mg/1 proteinu. Pro izolaci a čištění množství angiostatinu, které je nutné pro klinické testy, se používá způsob dobře známý v oboru. Vývoj tohoto expresivního systému a demonstrace in vitro a in vivo aktivity čištěného rekombinantního angiostatinu proti metastázám poskytuje základ pro stanovení kapacity zmíněných fragmentů inhibice růstu nádorů a možnosti prodloužení života pacientů s rakovinou a jinými nemocemi, které jsou zprostředkovány angiogenezí.

Příklad 29: Produkce a podávání agregovaného angiostatinu.

Tento příklad ukazuje produkci a aplikaci agregovaného angiostatinu za účelem inhibice proliferace endoteliálních buněk a růstu nádorů. Za normálních podmínek se předpokládá, že rekombinantní proteiny produkované bakteriemi E.coli musí být z důvodu dosažení požadované aktivity in vivo rozpustné a zabalené (renaturované, redukované a alkylované). Během tohoto zpracování se často ztrácí podstatné množství proteinu. Tento příklad popisuje přímou produkci a použití agregovaného rekombinatního angiostatinu bez další

107 renaturace, redukce nebo alkylace. Takový angiostatin se používá pro inhibici angiogeneze a růstu nádorů. Tento příklad poskytuje překvapivě účinný způsob produkce a použití angiostatinu. Tento agregovaný angiostatin a způsob jeho zavedení také umožňuje kontinuální uvolňování angiostatinu, čímž se optimalizuje jeho účinnost.

Termín agregovaný angiostatin znamená angiostatin, který je podstatně čištěný, ale není manuálně zbalený, jak se popisuje detailně dále.

Exprese angiostatinu.

Expresívní systém E.coli, produktivní a laciný, se angiostatinu. Pro strategie pro angiostatin založeném oligoprimery lemovací sekvence plazminogenu (cDNK plazminogenu (například Menhart, N., Shel, který má použil konstrukce výhodu, že je pro expresi expresivního byly vytvořené smyček zísakal na

PCR cDNK se

L.C., rychlý, myšího systému dva až 4 od ATCC)

R.F.,

Kelly,

Castellino, F.J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957); Marti, and

D.,

Schaller, J., Ochensberger,. B., and Rickli, E.E (1994).

Eur.

J. Biochem. 219, 455-462; Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti,D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., a Rickli, E.E. (1996) Biochem. In press; Rejante, M.R., Byeon, I.-J.L., and Llinas, M (1991) Biochem. 30, 11081-11092). Produkt PCR se začlenil do restrikčních míst Ncol a Xhol vektoru pET22 (Novegen), který obsahuje T7 lac promotor a oligohistidinovou sekvenci.

cDNK se pak transformovala do buněk E.coli (kmen BL21(DE3)), které obsahují chromozomální kopii genu T7 RNA polymerázy, který řídí lacUV5. Exprese rekombinantího angiostatinu se indukovala přidáním IPTG. Exprimovaný angiostatin se akumuluje v hostitelských buňkách jako inkluzivní útvar a • ·

108 obvykle tvoři přes 40% celkového buněčného proteinu, jak se odhaduje barvením Coomasieovou modří.

Vynález předpokládá, že rekombinantí angiostatin nebo jeho fragmenty odvozené z vhodných biologických druhů se mohou exprimovat v různých vektorech a hostitelských systémech, které jsou dobře známy v oboru.

Čištěni a agregace angiostatinu.

Nerozpustná frakce sonikovaných hostitelských buněk, která obsahuje inkluzivní útvar, se čistila centrifugací při 9 000 ot./min. po dobu 25 minut a opakovaně se promývala. Výsledný produkt obsahoval okolo 80 % angiostatinu, jak se odhaduje z barvení Coomassieovou modří. Oligohistidinová oblast N-konce fúzního proteinu umožňuje jednoduché a ekonomické čištění rekombinantního angiostatinu pomocí chelátové afinitní chromatografie na Ni²⁺_NTA agarózové koloně (o rozměrech 1,5 cm x 5 cm) za denaturačních podmínek. Uzavřený útvar se rozpouští v 6M močovině. Jak je možné vidět na obrázku č.: 41 v dráze 7 čištěný angiostatin vykazuje jediný pruh na SDS-PAGE g.elu barveném Coomasieovou modří. Migrační rychlost je mezi 45 kD až 65 kD, upřednostňuje se hodnota okolo 55 kD. Použitím této jednokrokové chromatografie se může dosáhnout podstatné homogenity proteinu, avšak vynález předpokládá, že se pro tyto účely mohou použít různé způsoby čištění, které jsou dobře známy v oboru.

Protein obsažený v elučním pufru se dialyzoval (15 000 MWCO) proti fyziologickému roztoku pufrovaném fosforečnanem (PBS) po dobu 24 hodin při teplotě 4°C. Dialyzát se 3 krát vyměnil. Během dialýzy se tvořila bílá sraženina. Vzorek se vyjmul ze sáčku pro dialýzu a sraženina se odstranila centrifugací. Sraženina se pak resuspendovala za použití vortexu v PBS. Vznikla konečná suspenze, která se použila ve

109 zvířecích modelech. Skladovala se při teplotě -20°C. Ve sraženině je obsažen agregovaný angiostatin. Jako dialyzační pufr se může použít například 20 mM tris-HCl pH 7,9/150 mM NaCl. Vynález předpokládá, že více delší nebo kratší dialýza a různé jiné dialyzační pufry se mohou využívat pro získání odpovídajícího množství agregovaného angiostatinu.

In vitro testy agregovaného angiostatinu.

Hovězí kapilární endoteliální buňky (BCE) se používaly pro testy podle příkladu 8. Buňky se testovaly agregovaným rekombinantním lidským angiostatinem připraveným podle popisu v tomto příkladu. Obrázek č.: 42 ukazuje výsledky tohoto testu. Buňky, které jsou vystavené působení agregovaného angiostatinu, jsou zřetelně inhibovány.

In vivo testy agregovaného angiostatinu.

Veškeré úkony na zvířatech proběhly v zařízení dětské nemocnice podle vnitřních místních instrukcí.

A. Agregovaný rekombinantní myší angiostatin, připravený podle popisu v tomto příkladu, se testoval na kuřatech CAM (O' Reilly, M.S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R.A., Moses, J., Lané, W.S., Cao, Y., Sage, E.H. and Folkman, J. (1994) Cell 79, 315-328) . Při dávce 25 μg byla inhibice tvorby kapilár 100 % (všech pět testovaných kuřat CAM dalo 2 až 3 inhibiční zóny) . Při dávce 100 μg inhibice tvoření kapilár trvala 96 hodin. Je známo, že účinky jiných inhibitorů angiogeneze a angiostatinu odvozeného od plazminogenu přetrvává po dobu okolo 48 hodin. To naznačuje, že agregovaný angiostatin poskytuje výhody nepřerušovaného uvolňování.

110

B. Lewisův plicni karcinom se inokuloval podkožně do střední oblasti zad myší C57B16. Myším se implantovalo 1 x 10⁶ buněk v 0,1 ml PBS. Myši byly uzavřeny ve skupinách po šesti nebo méně. Nádory se měřily dialkaliperem a objem nádorů se určil podle vzorce šířka x šířka x délka x 0,52. Poměr objemu léčených nádorů ku objemu kontrolních nádorů (T/C) se určil v posledním časovém bodě.

Po té, co objem nádoru dosáhl 100 až 200 kubických milimetrů, což bylo během 3 až 5 dnů, myši se rozdělily do dvou oddělených experimentů. V prvním pokusu se myším, podkožní injekcí do místa vzdáleného od nádoru, aplikovala každých 24 hodin dávka 2 až 3 mg/kg suspenze agregovaného myšího rekombinantního angiostatinu v PBS (n=3 myši ve skupině). Kontrolní skupina myší dostala srovnatelné injekce fyziologického roztoku. Ve druhém oděleném pokusu (n=6 myší ve skupině) se testovaným myším, podkožní injekcí do místa vzdáleného od nádoru, aplikovala každých 24 hodin dávka 10 mg/kg suspenze agregovaného myšího rekombinantního angiostatinu v PBS. Kontrolní skupina myší dostala srovnatelné injekce fyziologického roztoku.

U žádné z myší 'léčených suspenzí agregovaného rekombinantního angiostatinu se nepozoroval projev toxicity nebo úbytek hmotnosti. Po aplikaci injekce se agregovaný angiostatin jevil jako podkožní masa, která se vstřebá během několika hodin. Což naznačuje, že tato masa se postupně rozpouštěla a že agregovaný angiostatin se nepřerušovaně uvolňoval. V případě obou dávek se u léčených myší projevila podstatná inhibice růstu primárních nádorů Lewisova plicního karcinomu. (Obrázek č. 43 a 44) . Poměr T/C získaný podáním dávky 10 mg/kg/den ve formě jedné injekce za den po dobu 19 dnů (kdy kontrolní zvířata, kterým se podával fyziologický roztok, začala umírat a byla usmrcena) je 0,06. Vynálezcům ·· »· ·'» t ·· ·· ···· · · ·· ···· • ···· ···· • · ·· · · · ···-· · • · · · · ··· ···· ·♦·· . ·· ··· ·· ··

111 není známo, že by někdy před tím redukce objemu nádoru dosáhla takové hodnoty.

Na základě in vitro a in vivo výsledků v tomto přikladu se dá očekávat úspěšné používáni produktů a postupů popsaných pro inhibici proliferace endoteliálnich buněk, angiogeneze a růst lidských nádorů. Agregovaný rekombinantní angiostatin produkovaný tímto způsobem může mít rozdílnou strukturu a proto i rozdílné fyzikální vlastnosti ve srovnání s angiostatinem vzniklým štěpením elastázou nebo s jinými čištěnými proteiny, které jsou obvykle renaturovány. Čištěný rekombinatní angiostatin se srážel za vzniku agregované suspenze. Roztok proteinu se dialyzoval proti relativně velkému objemu pufru nebo vody. Tento jev se pravděpodobně objevuje, protože špatně zabalený protein se stává nerozpustným a agreguje se. Neočekává se, že denaturovaný agregovaný protein by měl mít in vivo zázračné účinky. Věří se, že demonstrovaná anti-nádorová aktivita je způsobena pomalým, ale konstantním rozpouštěním a uvolňováním agregovaného proteinu s podkožních míst. Vynález dále předpokládá, že buď přirozeně se vyskytující nebo rekombinantí angiostatin a jeho fragmenty se mohou používat v popsaných způsobech čištění, které vedou k agregovanému přirozenému nebo rekombinatnímu angiostatinu nebo jeho agregovaným fragmentům, které se mohou používat pro úspěšnou inhibici proliferace endoteliálnich buněk a růstu nádorů bez nutnosti renaturece.

'· ·

112

SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Fragmenty angiostatinu, agregovaný angiostatin a způsoby jeho použití (iii) POČET SEKVENCÍ: 45 (iv) KORRESPONDENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT:

(B) ULICE:

(C) MĚSTO:

(D) STÁT:

(E) ZEMĚ:

(F) POŠT. KÓD:

(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) MEDIUM: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOSZMS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verse #1.30 (vi) DATA O TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PCT/US96/05856 - WO 96/35774 (B) DATUM PODÁNÍ: 26.04.96 (C) KLASIFIKACE:

(vili) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO:

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO:

(C) ČÍSLO SPISU/ZNAČKA:

(ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON:

(B) TELEFAX:

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 812 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární • · · · • · · ·

-Z <»

113 (ii) TYP MOLEKULY: protein (in) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myš (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: plasminogen (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO;1:

Met Asp His Lys Glu

Val

Ile Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Lys

Pro

1

5

10

15

Gly

Gin

Gly

Asp

Ser

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ile

Ser

Thr

Gin

Gly

Ala

Ser

20

25

30

Leu

Phe

Ser

Leu

Thr

Lys

Lys

Gin

Leu

Ala

Ala

Gly Gly

Val

Ser

Asp

35

40

45

Cys

Leu

Ala

Lys

Cys

Glu

Gly

Glu

Thr

Asp

Phe

Val

Cys

Arg

Ser

Phe

50

55

60

Gin

Tyr

His

Ser

Lys

Glu

Gin

Gin

Cys

Val

Ile

Met

Ala

Glu

Asn

Ser

65

70

75

80

Lys

Thr

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg

Met

Arg

Asp

Val

Ile

Leu

Phe

Glu

Lys

85

90

95

Arg

Val

Tyr

Leu

Ser

Glu

Cys

Lys

Thr

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg

100

105

110

Gly

Thr

Met

Ser

Arg

Thr

Lys

Ser

Gly

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp

Gly

115

120

125

Ala

Thr

Phe

Pro

His

Val

Pro

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Thr

His

Pro

Asn

130

135

140

Glu

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Gin

145

150

155

160

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

165

170

175

Asn

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Glu

Glu

Cys

Met

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys

180

185

190

Tyr Glu Gly

Lys

Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gin Ala

195

200

205

Trp

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala

Lys

Phe

210

215

220

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

His

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

225

230

235

240

Pro

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys

Arg

Trp

Glu

Tyr

245

250

255

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

Ser

Pro

Thr

260

265

270

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

275

280

285

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

290

295

300

His

Arg

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

305

310

315

320

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

325

330

335

Thr

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys

340

345

350

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp

Ser

Ser

Val

Pro

Pro

Glu

355

360

365

Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly

Gin

Ser

370

375

380

•

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys

Lys

Cys

Gin

Ser

385

390

395

400

Trp

Ala

Ala

Met

Phe

Pro

His

Arg

His

Ser

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

405

410

415

Pro

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

420

425

430

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

435

440

445

Cys

Asn

Leu

Lys

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr

Gly

Gly

' Ser

Val

Val

Glu

Leu

Pro Thr Val Ser Gin Glu Pro Ser Gly Pro Ser Asp Ser Glu Thr Asp

465 470 475 480

Tyr

Gly Asn Gly Lys Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ala Val Thr

485

• 490

495

Gly

Thr 500

Pro

Cys

Gin

Gly

Trp 505

Ala

Ala

Gin

Glu

Pro 510

His

Arg

Ile 515

Phe

Thr

Pro

Gin

Thr 520

Asn

Pro

Arg

Ala

Asp 525

Leu

Glu

Lys

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp 535

Gly

Asp

Val

Asn

Gly 540

Pro

Trp

Cys

Tyr

Asn

Pro

Arg

Lys 550

Leu

Tyr

Asp

Tyr

Cys 555

Asp

Ile

Pro

Leu

Cys 560

Ala

Ser

Ser 565

Phe

Glu

Cys

Gly

Lys 570

Pro

Gin

Val

Glu

Pro 575

Lys

Pro

Gly 580'

Arg

Val

Val

Gly

Gly 585

Cys

Val

Ala

Asn

Pro 590

His

Ser

Trp 595

Gin

Ile

Ser

Leu

Arg 600

Thr

Arg

Phe

Thr

Gly 605

Gin

His

Phe

Gly

Thr

Leu

Ile

Ala 615

Pro

Glu

Trp

Val

Leu 620

Thr

Ala

Ala

His

Glu

Lys

Ser<

Ser 630

Arg

Pro

Glu

Phe

Tyr 635

Lys

Val

Ile

Leu

Gly 640

Glu

Glu

Tyr 645

Ile

Arg

Gly

Leu

Asp 650

Val

Gin

Glu

Ile

Ser 655

Val

Leu

Ile 660

Leu

Glu

Pro

Asn

Asn 665

Arg

Asp

Ile

Ala

Leu 670

Leu

Lys

Arg 675

Pro

Ala

Thr

Ile

Thr 680

Asp

Lys

Val

Ile

Pro 685

Ala

Cys

Leu

Pro

Asn

Tyr

Met

Val 695

Ala

Asp

Arg

Thr

Ile 700

Cys

Tyr

Ile

Thr

Gly

Glu

Thr

Gin 710

Gly

Thr

Phe

Gly

Ala 715

Gly

Arg

Leu

Lys

Glu 720

Leu

Pro

Val 725

Ile

Glu

Asn

Lys

Val 730

Cys

Asn

Arg

Val

Glu 735

Tyr

Asn

Arg 740

Val

Lys

Ser

Thr

Glu 745

Leu

Cys

Ala

Gly

Gin 750

Leu

Ala

• · · • · · • · · · · • · * · ·· ··

H.b

Gly

Gly

Val Asp 755

Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val

Cys

760

765

Phe

Glu 770

Lys

Asp

Lys

Tyr

Ile 775

Leu

Gin

Gly

Val

Thr 780

Ser

Trp

Gly Leu

Gly 785

Cys

Ala

Arg

Pro

Asn 790

Lys

Pro

Gly

Val

Tyr 795

Val

Arg

Val

Ser

Arg 800

Phe

Val

Asp

Trp

Ile

Glu

Arg

Glu

Met

Arg

Asn

Asn

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 339 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS': myš (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: fragment angiostatinu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Val 1

Tyr

Leu

Ser

Glu 5

Cys

Lys

Thr

Gly

Ile 10

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg 15

Gly

Thr

Met

Ser

Arg 20

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 25

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Gly

Ala

Thr

Phe

Pro 35

His

Val

Pro

Asn

Tyr 40

Ser

Pro

Ser

Thr

His 45

Pro

Asn

Glu

Gly

Leu 50

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp /

Asn 60

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro 65

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 75

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 80

Wf-

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 339 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myš (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: fragment angiostatinu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Val 1

Tyr Leu Ser

Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly

5

10

15

Thr

Met

Ser

Lys 20

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile 25

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro 35

His

Arg

Pro

Arg

Phe 40

Ser

Pro

Ala

Thr

His 45

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 50

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 60

Asp

Pro

Gin

Gly

Pro 65

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg 75

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 80

Ile

Leu

Glu

Cys

Glu 85

Glu

Glu

Cys

Met

His 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 95

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile 100

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 105

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin 110

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 115

Ser

Pro

His

Ala

His 120

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 125

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 130

Asn

Leu

Lys

Lys

Asn 135

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 140

Asp

Arg

Glu

Leu

· β > · · f

325

330

Gly

Pro

Trp (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO.4:

vvíař• · • · /4?

<·/

Arg 145

Pro Trp Cys Phe

Thr Thr 150

Asp Pro Asn

Lys Arg Trp Glu Leu Cys

155

160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 170

Ser

Ser

Gly

Pro

Thr 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn 185

Tyr

Arg

Gly

Asn

Val 190

Ala

Val

Thr

Val

Ser 195

Gly

His

Thr

Cys

Gin 200

His

Trp

Ser

Ala

Gin 205

Thr

Pro

His

Thr

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Asp

Glu

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Lys

Arg

Ala 235

Pro

Trp

Cys

His

Thr 240

Thr

Asn

Ser

Gin

Val 245

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 250

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys 255

Asp

Ser

Ser

Pro

Val 260

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu 265

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro 270

Pro

Glu

Leu

Thr

Pro 275

Val

Val

Gin

Asp

Cys 280

Tyr

His

Gly Asp Gly 285

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly 290

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr 295

Thr

Thr

Gly

Lys

Lys 300

Cys

Gin

Ser

Trp

Ser 305

Ser

Met

Thr

Pro

His 310

Arg

His

Gin

Lys

Thr 315

Pro

Glu

Asn

Tyr

Pro 320

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp

Lys

335 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 339 aminokyselin (B) ΊΎΡ: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE

Μ) (χί)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

li----------r*”• · · · • · · · · • · · · ······· · · (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: opice rhesus (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: fragment angiostatinu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

• · · • · · · • · · · • · • · · ·

Val Tyr Leu Ser Glu

Cys

Lys Thr

Gly

Asn 10

Gly Lys Asn

Tyr

Arg Gly 15

1

5

Thr

Met

Ser

Lys 20

Thr

Arg

Thr

Gly

Ile 25

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro 35

His

Arg

Pro

Thr

Phe 40

Ser

Pro

Ala

Thr

His 45

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 50

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 60

Asp

Gly

Gin

Gly

Pro 65

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asp

Pro

Glu

Glu

Arg 75

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp 80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 85

Asp

Glu

Cys

Met

His 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 95

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile 100

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 105

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin 110

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 115

Ser

Pro

His

Ala

His 120

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 125

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 130

Asn

Leu

Lys

Lys

Asn 135

Tyr. Cys

Arg

Asn

Pro 140

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 145

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 150

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Leu

Cys 160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 170

Ser

Ser

Gly

Pro

Thr 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn 185

Tyr

Arg

Gly

Asp

Val 190

Ala

Val

Thr

Val

Ser 195

Gly

His

Thr

Cys

His 200

Gly

Trp

Ser

Ala

Gin 205

Thr

Pro

His

Thr

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Asp

Glu

Λ21

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Glu

Lys

Ala 235

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 240

5

Thr

Asn

Ser

Gin

Val 245

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 250

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys 255

Glu

Ser

Ser

Pro

Val 260

Ser

Thr

Glu

Pro

Leu 265

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro 270

Pro

Glu

10

Leu

Thr

Pro 275

Val

Val

Gin

Glu

Cys 280

Tyr

His

Gly

Asp

Gly 285

Gin

Ser

Tyr

15

Arg

Gly 290

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr 295

Thr

Thr

Gly

Lys

Lys 300

Cys

Gin

Ser

Trp

Ser 305

Ser

Met

Thr

Pro

His 310

Trp

His

Glu

Lys

Thr 315

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro 320

20

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr 325

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg 330

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp 335

Lys

Gly

Pro

Trp

²⁵ (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 339 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

₄₀ (A) ORGANIZMUS: prasečí' (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: fragment angiostatinu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

Ile Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr 1 5

Thr Thr Ser Lys Thr Lys Ser Gly

5:

Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly
10	15
Ile Cys Gin	Lys Trp Ser Val
	30

Ser Ser Pro

His

Ile Pro Lys Tyr Ser Pro Glu Lys Phe

Pro

Leu

Ala

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Lys

Gly

50

55

60

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Glu

Thr

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp

65

70

75

80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Asp

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

His

Tyr

85

90

95

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Ile

Glu

Cys

Gin

Ser

Trp

100

105

110

Gly

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Leu

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys

145

150

155

160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Thr

Ser

Gly

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

Val

180

185

190

Thr

Ala

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Ala

Gin

Ser

Pro

His

195

200

205

Lys

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

210

215

220

>

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

Thr

Asp

Ser

Glu

Val

Arg

Trp

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

Gly

245

250

255

Ser

Ser

Thr

Thr

Ser

Thr

Glu

His

Leu

Asp

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

Glu

260

265

270

Gin

Thr

Pro

Val

Ala

Gin

Asp

Cys

Tyr

Arg

Gly

Asn

Gly

Glu

Ser

Tyr

275

280

285

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Ile

Thr

Gly

Arg

,ZLys

Cys

Gin

Ser

Trp

Val Ser Met Thr Pro His Arg His Glu Lys Thr Pro Gly Asn Phe Pro

305 310 315 320

423

Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn

325 330

Ser Pro Trp__ ___ (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:S (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

¹⁰ (A) DÉLKA: 339 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE ²⁰ (vi) PŮVODNÍ ZDROJ: .

(A) ORGANIZMUS: hovězí < a i | (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: fragment angiostatinu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Pro Asp Ala Asp Lys

335

30

Ile 1

Tyr

Leu Leu

Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Gin Thr Tyr Arg Gly

5

10

15

35

Thr

Thr

Ala

Glu 20

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 25

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Ser

Ala

Thr

Ser

Pro 35

His

Val

Pro

Lys

Phe 40

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe 45

Pro

Leu

Ala

40

Gly

Leu 50

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 60

Asp

Glu

Asn

Gly

Pro 65

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 75

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 80

45

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 85

Asp

Lys

Cys

Met

His 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 95

Tyr

50

Glu

Gly

Lys

Ile 100

Ala

Lys

Thr

Met

Ser 105

Gly

Arg

Asp

Cys

Gin 110

Ala

Trp

Asp Ser Gin Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro

US 120 125

Asn Lys 130

Asn

Leu

Lys Met Asn Tyr 135

Cys Arg

Asn

Pro Asp Gly 140

Glu Pro

Arg 145

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 150

Thr

Asp

Pro

Gin

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys 160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 170

Ser

Ser

Gly

Pro

Lys 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly

Thr

Gly

Lys

Asn 185

Tyr

Gly

Gly

Thr

Val 190

Ala

Val

Thr

Glu

Ser 195

Gly

His

Thr

Cys

Gin 200

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin 205

Thr

Pro

His

Lys

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Glu

Lys

Ala 235

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 240

Thr

Asn

Ser

Glu

Val 245

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 250

Thr

Ile

Pro

Ser

Cys 255

Glu

Ser

Ser

Pro

Leu 260

Ser

Thr

Glu

Arg

Met 265

Asp

Val

Pro

Val

Pro 270

Pro

Glu

Gin

Thr

Pro 275

Val

Pro

Gin

Asp

Cys 280

Tyr

His

Gly

Asn

Gly 285

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly 290

Thr

Ser

Seť

Thr

Thr 295

Ile

Thr

Gly

Arg

Lys 300

Cys

Gin

Ser

Trp

Ser 305

Ser

Met

Thr

Pro

His 310

Arg

His

Leu

Lys

Thr 315

Pro

Glu

Asn

Tyr

Pro 320

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr 325

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg 330

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp 335

Lys

Ser Pro Trp (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 79 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE

ΛΛ-----—·• · · • · · · • · · ··· ···· ·· • · ·· •· · · • · · ·· • ·· ·· · · (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD· (B) KLON: K1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7;

15

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO

: 7:

Cys 1

Lys

Thr Gly

Ile Gly Asn Gly Tyr 5

Arg 10

Gly

Thr

Met

Ser

Arg 15

Thr

20

Lys

Ser

Gly Val 20

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Gly

Ala

Thr

Phe

Pro 30

His

Val

Pro

Asn

Tyr Ser 35

Pro

Ser

Thr

His 40

Pro

Asn

Glu

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

25

Tyr

Cys 50

Arg Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

30

Thr 65

Asp

Pro Asp

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 75

Ile

Pro

Glu

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 79 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD: ΓΡΠ ΚΤ ΪΎΝ· VI • · *

₉ • · • · • · • · • · ·· ··

42(, (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:8:

Cys 1

Lys

Thr

Gly

Asn 5

Gly

Lys

Asn

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Met

Ser

Lys 15

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile 20

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro 30

His

Arg

Pro

Arg

Phe 35

Ser

Pro

Ala

Thr

His 40

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Pro

Gin

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg 70.

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Leu

Glu

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 79 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fiagment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: opice rhesus (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:’ $;

Cys Lys Thr 1	Gly Asn 5	Gly Lys	Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr
10	15
Arg Thr Gly	Ile Thr 20	Cys Gin	Lys Trp Ser 25	Ser Thr Ser Pro His Arg 30
Pro Thr Phe 35	Ser Pro	Ala Thr	His Pro Ser 40	Glu Gly Leu Glu Glu Asn 45

ΛΖ?

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Gly Gin Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 50 55 60

Thr Asp Pro Glu Glu Arg Phe Asp Tyr Cys Asp Ile Pro Glu Cys _____ 70___ . 75 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 79 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fiagment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: prasečí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

Cys 1

Lys

Thr

Gly

Asn 5

Gly

Lys

Asn

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Thr

Ser

Lys 15

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 20

Ile

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Ser

Val

Ser

Ser

Pro 30

His

Ile

Pro

Lys

Tyr 35

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe 40

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Lys

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Glu

Thr

Arg 70

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Pro

Glu

Cys

• · /ΖΓ (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (Á) DÉLKA: 79 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ·. NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: hovězí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Cys 1

Lys

Thr

Gly

Asn 5

Gly

Gin

Thr

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Thr

Ala

Glu 15

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 20

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Ser

Ala

Thr

Ser

Pro 30

His

Val

Pro

Lys

Phe 35

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe 40

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Asn

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Ťhr

Thr 65

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Pro

Glu

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE

42.?

(iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

15

Cys 1

Met

Tyr Cys

Ser Gly Glu 5

Lys

Tyr

Glu 10

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys 15

Thr

20

Met

Ser

Gly

Leu 20

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp 25

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

His

Gly

Tyr 35

Ile

Pro

Ala

Lys

Phe 40

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Met

Asn

25

Tyr

Cys 50

His

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Glu

Pro

Arg

Pro

Trp 60

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp 65

Pro

Thr

Lys

Arg

Trp 70

Glu

Tyr

Cys

Asp

Ile 75

Pro

Arg

Cys

^JV (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2

Á3o (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13;

• · · · · · · · · • · · · · · · ···· ·.

Cys 1

Met

His

Ser

Ser 5

Gly

Glu

Asn

Tyr

Asp 10

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys 15

Thr

Met

Ser

Gly

Leu 20

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp 25

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

His

Gly

Tyr 35

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe 40

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Lys

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Arg 55

Glu

Leu

Arg

Pro

Trp 60

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp 65

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp 70

Glu

Leu

Cys

Asp

Ile 75

Pro

Arg

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ni) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: opice rhesus (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

Cys 1

Met

His

Cys

Ser 5

Gly

Glu

Asn

Tyr

Asp 10

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys 15

Thr

Met

Ser

Gly

Leu 20

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp 25

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

His

Gly

Tyr 35

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe 40

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Lys

Asn

434

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr

55 60

Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys

70 75 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: prasečí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

Cys Met His Cys Ser Gly Glu His Tyr Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr ¹ 5 1015

Met Ser Gly Ile Glu Cys Gin Ser Trp Gly Ser Gin Ser Pro HisAla

2530

His Gly Tyr Leu Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Met Asn 4045

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr 5560

4U

I .

....... ' λν_(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: hovězí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

Cys Met 1

His Cys Ser 5

Gly

Glu

Asn Tyr Glu Gly 10

Lys

Ile

Ala

Lys 15

Thr

Met

Ser

Gly Arg

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

20

«

25

30

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

35

40

45

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

50

55

60

Asp

Pro

Gin

Lys

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

65

70

75

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE /3?

(iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

Cys 1

Leu

Lys

Gly

Arg 5

Gly Glu

Asn

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Val

Ser

Val 15

Thr

Val

Ser

Gly

Lys 20

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp 25

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro 30

His

Arg

His

Asn

Arg 35

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 40

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp 60

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp 65

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp 70

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile 75

Pro

Ser

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD (B) KLON: K3

WO 96/35774

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

5

Cys 1

Leu

Lys

Gly

Thr 5

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg 10

Gly

Asn

Val

Ala

Val 15

Thr

Val

Ser

Gly

His 20

Thr

Cys

Gin.

His

Trp 25

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro 30

His

Thr

10

His

Asn

Arg 35

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 40

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu 45

Asp

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Lys

Arg

Ala

Pro

Trp 60

Cys

His

Thr

Thr

15

Asn 65_

Ser

Gin

Val

Arg Trp _ _._J70

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile 75

Pro

Ser

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE .

(v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce ³⁵ (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: opice rhesus (vři) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

45

Cys 1

Leu

Lys

Gly

Thr 5

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg 10

Gly

Asp

Val

Ala

Val 15

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

His

Gly

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

His

Thr

20

25

30

50

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

Asn

35

40

45

• · · · • · · « • · · · ··.· · · • · · «· · · • ·

43Γ

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Lys Ala

55

Tyr • 4

4' ·

Pro

Trp Cys Tyr Thr Thr

Asn Ser Gin Val Arg Trp Glu Tyr Cys 65 70

Lys

Ile Pro Ser Cys (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: prasečí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K3

(xi

i) PO1

PISS

EKVENCE: SEQ ID

NO:2

0:

Cys 1

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

Val

Thr

X

5

10

15

Ala

Ser

Gly

His 20

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp 25

Ser

Ala

Gin

Ser

Pro 30

His

Lys

His

Asn

Arg •y C

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn

3 5

40

45

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp 60

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp 65

Ser

Glu

Val

Arg

Trp 70

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ile 75

Pro

Ser

Cys

/36

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: hovězí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

Cys 1

Leu

Lys

Gly

Thr 5

Gly

Lys

Asn

Tyr

Gly 10

Gly

Thr

Val

Ala

Val 15

Thr

Glu

Ser

Gly

His 20

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp 25

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro 30

His

Lys

His

Asn

Arg 35

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 40

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Glu

Lys

Ala

Pro

Trp 60

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asn 65

Ser

Glu

Val

Arg

Trp 70

Glu

Tyr

Cys

Thr

Ile 75

Pro

Ser

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE

(iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

Cys 1

Tyr

Gin

Ser

Asp 5

Gly

Gin

Ser

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr 15

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys 20

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp 25

Ala

Ala

Met

Phe

Pro 30

His

Arg

His

Ser

Lys 35

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 40

Pro

Asp

Ala

Gly

Leu 45

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Asp

Lys

Gly

Pro

Trp 60

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp 65

Pro

Ser

Val

Arg

Trp 70

Glu

Tyr

Cys

Asn

Leu 75

Lys

Arg

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE ' (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD (B) KLON: K4 :

9, 9

9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

Cys 1

Tyr

His

Gly

Asp 5

Gly

Gin

Ser

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr 15

Thr

Thr

Thr

Gly

Lys 20

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp 25

Ser

Ser

Met

Thr

Pro 30

His

Arg

His

Gin

Lys 35

Thr

Pro

Glu

Asn

Tyr 40

Pro

Asn

Ala

Gly

Leu 45

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala 55

Asp

Lys

Gly

Pro

Trp 60

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp 65

Pro

Ser

Val

Arg

Trp 70

Glu

Tyr

Cys

Asn

Leu 75

Lys

Lys

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 168 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE * (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

Cys 1

Met

Tyr

Cys

Ser .5

Gly

Glu

Lys

Tyr

Glu 10

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys 15

Thr

Met

Ser

Gly

Leu 20

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp 25

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

His

Gly

Tyr 35

Ile

Pro

Ala

Lys

Phe 40

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Met

Asn

43?

WO >6/357/4

Tyr

Cys 50

His

Asn

Pro

Asp

Gly Glu 55

Pro

Arg

Pro

Trp Cys 60

Phe

Thr

• Thr

5

Asp 65

Pro

Thr

Lys

Arg

Trp 70

Glu

Tyr

Cys

Asp

Ile 75

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr 80

10

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro 85

Ser

Pro

Thr

Tyr

Gin 90

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg 95

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg 100

Gly

Thr

Val

Ser

Val 105

Thr

Val

Ser

Gly

Lys 110

Thr

Cys

15

Gin

Arg

Trp 115

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro 120

His

Arg

His

Asn

Arg 125

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 130.

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu 135

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 140

Arg

Asn

Pro

Asp

20

Gly 145

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp 150

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp 155

Ser

Gin

Leu ,

Arg

Trp 160

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys

165 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 168 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein ³⁵ (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

Cys _MTt His Cys Ser Cly Clu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr ⁵ 10 1C

WO

Met

Ser

Gly

Leu 20

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp 25

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

His

Gly

Tyr 35

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe 40

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Lys

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Arg 55

Glu

Leu

Arg

Pro

Trp 60

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp 65

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp 70

Glu

Leu

Cys

Asp

Ile 75

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr 80

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser 85

Gly

Pro

Thr

Tyr

Gin 90

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr 95

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg 100

Gly

Asn

Val

Ala

Val 105

Thr

Val

Ser

Gly

His 110

Thr

Cys

Gin

His

Trp 115

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro 120

His

Thr

His

Asn

Arg 125

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 130

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu 135

Asp

Glu

Asn

Tyr

Cys 140

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 145

Lys

Arg

Ala

Pro

Trp 150

Cys

His

Thr

Thr

Asn 155

Ser

Gin

Val

Arg

Trp 160

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile 165

Pro

Ser

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 168 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: opice rhesus (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2-3

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

5

Cys 1

Met

His

Cys

Ser 5

Gly

Glu

Asn

Tyr

Asp 10

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys 15

Thr

Met

Ser

Gly

Leu 20

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp 25

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

10

His

Gly

Tyr 35

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe 40

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Lys

Asn

15

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Glu

Pro

Arg

Pro

Trp 60

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp 65

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp 70

Glu

Leu

Cys

Asp

Ile 75

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr 80

20

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser 85

Gly

Pro

Thr

Tyr

Gin 90

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr 95

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg 100

Gly

Asp

Val

Ala

Val 105

Thr

Val

Ser

Gly

His 110

Thr

Cys

25

His

Gly

Trp 115

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro 120

His

Thr

His

Asn

Arg 125

Thr

Pro

Glu

30

Asn

Phe 13 0

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu 135

Asp Glu

Asn

Tyr

Cys 140

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 145

Glu

Lys

Ala

Pro

Trp 150

Cys

Tyr Thr

Thr

Asn 155

Ser

Gin

Val

Arg

Trp 160

35

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile 165

Pro

Ser

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:27:

₄₀ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 168 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ni) HYPOTETICKÁ: NE ⁵⁰ (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce /^2.

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: prasečí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:27:

Cys 1

Met

His

Cys

Ser 5

Gly

Glu

His

Tyr

Glu 10

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys 15

Thr

Met

Ser

Gly

Ile 20

Glu

Cys

Gin

Ser

Trp 25

Gly

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

His

Gly

Tyr 35

Leu

Pro

Ser

Lys

Phe. 40

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Glu

Pro

Arg

Pro

Trp 60

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp 65

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp 70

Glu

Phe

Cys

Asp

Ile 75

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr 80

Pro

Pro

Pro

Thr

Ser 85

Gly

Pro

Thr

Tyr

Gin 90

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg 95

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg 100

Gly

Thr «

Val

Ser

Val 105

Thr

Ala

Ser

Gly

His 110

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp 115

Ser

Ala

Gin

Ser

Pro 120

His

Lys

His

Asn

Arg 125

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 13 0

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu 135

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 140

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 145

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp 150

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp 155

Ser

Glu

Val

Arg

Trp 160

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

165 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 168 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein • · · · (iu) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: hovězí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K2-3 ! ₅ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:

Cys 1

Met

His

Cys

Ser 5

Gly

Glu

Asn

Tyr

Glu 10

Gly

Lys

Ile

Ala

Lys 15

Thr

20

Met

Ser

Gly

Arg 20

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp 25

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro 30

His

Ala

25

His

Gly

Tyr 35

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe 40

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu 45

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly 55

Glu

Pro

Arg

Pro

Trp 60

Cys

Phe

Thr

Thr

30

Asp 65

Pro

Gin

Lys

Arg

Trp '70

Glu

Phe

Cys

Asp

Ile 75

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr 80

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser 85

Gly

Pro

Lys

Tyr

Gin 90

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr 95

Gly

35

Lys

Asn

Tyr

Gly 100

Gly

Thr

Val

Ala

Val 105

Thr

Glu

Ser

Gly

His 110

Thr

Cys

40

Gin

Arg

Trp 115

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro 120

His

Lys

His

Asn

Arg 125

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe 130

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu 135

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 140

Arg

Asn

Pro

Asp

45

Gly 145

Glu

Lys

Ala

Pro

Trp 150

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asn 155

Ser

Glu

Val

Arg

Trp 160

Glu Tyr Cys Thr Ile Pro Ser Cys

165 • ·· • ·· • · · ·· • ·· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 250 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

Cys 1

Lys

Thr

Gly

Ile 5

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Met

Ser

Arg 15

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 20

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Gly

Ala

Thr

Phe

Pro 30

.His

Val

Pro

Asn

Tyr 35

Ser

Pro

Ser

Thr

His 40

Pro

Asn

Glu

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 75

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 80

Glu

Glu

Cys

Met

Tyr 85

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys 90

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 95

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin 105

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 110

Ser

Pro

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala 120

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 125

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 130

Tyr

Cys

His

Asn

Pro 135

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 140

Pro

Trp

Cys

Phe

• · · · · · • · · ·«· ♦· ·« pr-r

I *

Thr 145

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys 150

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 155

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 160

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 165

Pro

Pro

Ser

Pro

Thr 170

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 175

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn 180

Tyr

Arg Gly

Thr

Val 185

Ser

Val

Thr

Val

Ser 190

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin 195

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin 200

Thr

Pro

His

Arg

His 205

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 210

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 215

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn 220

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 225

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 230

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 235

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu 240

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 250 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:

Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr 15 10 15

Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gin Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg

25 30

• • ···

» a • • B ···«

• · • •

• • ·

Φ •

• 9 9 9 ··· · ·

··

·♦ '

Př

7'7

.......

...

176

Pro

Arg

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

35

40

45

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Pro

Gin

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

50

55

60

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp

Ile

Leu

Glu

Cys

Glu

65

70

75

80

Glu

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile

Ser

85

90

95

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

100

105

110

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

115

120

125

Lys

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Arg

Glu

Leu

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

130

135

140

Thr

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

145

150

155

160

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser Gly

Pro

Thr

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

165

170

175

Thr

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn

Val

Ala

Val

Thr

Val

Ser

Gly

His

180

185

190

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

His

Thr

His

Asn

Arg

Thr

195

200

205

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

210

215

220

Pro

Asp

Gly

Lys

Arg

Ala

Pro

Trp

Cys

His

Thr

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

225

230

235

240

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

245 250 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 250 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE • · · · —·,, ϊ• · · · · • · · · ···· ····< ·· i—IK..¹ • · ··· · · • · · · ··· ·· ·· fiv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: opice rhesus (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:

15	Cys 1	Lys	Thr	Gly	Ásn 5	Gly	Lys
20	Arg	Thr	Gly	Ile 20	Thr	Cys	Gin
	Pro	Thr	Phe 35	Ser	Pro	Ala	Thr
25	Tyr	Cys 50	Arg	Asn	Pro	Asp	Asn 55
30	Thr 65	Asp	Pro	Glu	Glu	Arg 7,0	Phe
	Asp	Glu	Cys	Met	His 85	Cys	Ser
35	Lys	Thr	Met	Ser 100	Gly	Leu	Glu
	His	Ala	His 115	Gly	Tyr	Ile	Pro
40	Lys	Asn 130	Tyr	Cys	Arg	Asn	Pro 135
45	Thr 145	Thr	Asp	Pro	Asn	Lys 150	Arg
	Thr	Thr	Pro	Pro	Pro 165	Ser	Ser
50	Thr	Gly	Glu	Asn 180	Tyr	Arg	Gly

Asn	Tyr	Arg 10	Gly	Thr	Met	Ser	Lys 15	Thr
Lys	Trp 25	Ser	Ser	Thr	Ser	Pro 30	His	Arg
His 40	Pro	Ser	Glu	Gly	Leu 45	Glu	Glu	Asn
Asp	Gly	Gin	Gly	Pro 60	Trp	Cys	Tyr	Thr
Asp	Tyr	Cys	Asp 75	Ile	Pro	Glu	Cys	Glu 80
Gly	Glu	Asn 90	Tyr	Asp	Gly	Lys	Ile 95	Ser
Cys	Gin 105	Ala	Trp	Asp	Ser	Gin 110	Ser	Pro
Ser 120	Lys	Phe	Pro	Asn	Lys 125	Asn	Leu	Lys
Asp	Gly	Glu	Pro	Arg 140	Pro	Trp	Cys	Phe
Trp	Glu	Leu	Cys 155	Asp	Ile	Pro	Arg	Cys 160
Gly	Pro	Thr 170	Tyr	Gin	Cys	Leu	Lys 175	Gly
Asp	Val 185	Ala	Val	Thr	Val	Ser 190	Gly	His

Thr Cys His Gly Trp Ser Ala Gin Thr Pro His Thr His Asn Arg Thr

195 200 205 • ·

Pro

Glu Asn Phe Pro Cys 210

Lys 215

Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys Arg Asn 220

Pro

Asp

Gly

Glu

Lys

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asn Ser

Gin

Val

225

230

235

240

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

245

250

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 250 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ni) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: prasečí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:32:

Cys 1

Lys

Thr

Gly

Asn 5

Gly

Lys

Asn

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Thr

Ser

Lys 15

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 20

Ile

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Ser

Val

Ser

Ser

Pro 30

His

Ile

Pro

Lys

Tyr 35

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe 40

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Lys

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Glu

Thr

Arg 70

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 80

Asp

Glu

Cys

Met

His 85

Cys

Ser

Gly

Glu

His 90

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 95

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Ile

Glu

Cys

Gin 105

Ser

Trp

Gly

Ser

Gin 110

Ser

Pro

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Leu

Pro

Ser 120

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 125

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 130

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 135

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 140

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 145

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys 150

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys 155

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 160

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 165

Thr

Ser

Gly

Pro

Thr 170

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 175

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn 180

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val 185

Ser

Val

Thr

Ala

Ser 190

Gly

His

Thr

Cys

Gin 195

Arg

Trp

Ser

Ala

Gin 200

Ser

Pro

His

Lys

His 205

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 210

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 215

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn 220

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 225

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 230

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 235

Thr

Asp

Ser

Glu

Val 240

Arg

Trp

Asp

Tyr

Cys 245

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys 250

(2) Informace pro seq id no:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 250 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: hovězí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-3 • · · · ·λ· • ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ED NO:33:

5

Cys 1

Lys Thr Gly

Asn Gly Gin Thr Tyr Arg Gly Thr Thr Ala Glu

Thr

5

10

15

Lys

Ser

Gly

Val

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Ala

Thr

Ser

Pro

His

Val

10

20

25

30

Pro

Lys

Phe

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

35

40

45

15

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Asn

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

50

55

60

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

65

70

75

80

20

Asp

Lys

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile

Ala

85

90

95

Lys

Thr

Met

Ser

Gly Arg

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

25

100

105

110

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

115

120

125

30

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

130

<

135

140

Thr

Thr

Asp

Pro

Gin

Lys

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

145

150

155

160

35

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

Pro

Lys

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

165

170

175

Thr

Gly

Lys

Asn

Tyr

Gly Gly

Thr

Val

Ala

Val

Thr

Glu

Ser

Gly

His

40

180

185

190

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

Lys

His

Asn

Arg

Thr

195

200

205

45

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

210

215

220

Pro

Asp

Gly

Glu

Lys

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asn

Ser

Glu

Val

225

230

235

240

50

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Thr

Ile

Pro

Ser

Cys

245

250

- ........LJ1- ILIJItL·.............“'i1', -.t: ............. ™	• · · -· ·	• · ·	• · ·	•
*	• · - ·	• ·	• · · · ·	•

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:34: T (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární j o (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:34:

Cys 1

Lys

Thr

Gly

Ile 5

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg 10

Gly Thr

Met

Ser

Arg 15

Thr

30

Lys

Ser

Gly

Val 20

Ala

pýs

Gin

Lys

Trp 25

Gly

Ala

Thr

Phe

Pro 30

His

Val

35

Pro

Asn

Tyr 35

Ser

Pro

Ser

Thr

His 40

Pro

Asn

Glu

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

40

Thr 65

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 75

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 80

Glu

Glu

Cys

Met

Tyr 85

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys 90

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 95

Ser

45

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin 105

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 110

Ser

Pro

50

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala 120

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 125

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 130

Tyr

Cys

His

Asn

Pro 135

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 140

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu 1« ₁₅₀

Tyr Cys Asp Ile Pro Arg Cys ¹⁵⁵ 160 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-2

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:35:

Cys 1

Lys

Thr

Gly

Asn 5

Gly

Lys

Asn

Tyr

Arg 10

Gly

Thr

Met

Ser

Lys 15

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile 20

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro 30

His

Arg

Pro

Arg

Phe 35

Ser

Pro

Ala

Thr

His 40

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Pro

Gin

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Leu

Glu

Cys

Glu 80

Glu

Glu

Cys

Met

His 85

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 90

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile 95

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin 105

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 110

Ser

Pro

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 120

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 125

Asn

Leu

Lys

I <? wy

___» ' -4 » — » »e • ♦ »· · · · · · ···· ···· 99 ··· «· _ee /53

Lys Asn Tyr Cys Arg Asn

130

Pro Asp Arg

135

Glu Leu Arg Pro Trp Cys

140

Phe

Thr Thr Asp Pro Asn Lys

145 150

Arg Trp Glu

Leu Cys

155

Asp Ile Pro Arg Cys

160 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

^d (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: opice rhesus (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:36:

35

Cys Lys 1

Thr Gly

Asn Gly 5

Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys

Thr

10

15

40

Arg

Thr

Gly

Ile 20

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 25

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro 30

His

Arg

Pro

Thr

Phe 35

Ser

Pro

Ala

Thr

His 40

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 45

Glu

Glu

Asn

45

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Gly

Gin

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Glu

Glu

Arg 70

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 80

50

Asp

Glu

Cys

Met

His 85

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 90

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile 95

Ser

• · · ·

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin 105

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 110

Ser

Pro

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 120

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 125

Asn

Leu

Lys

Lys

Asn 130

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 135

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 140

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 145

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys 150

Arg

Trp

Glu

Leu

Cys 155

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 160

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: prasečí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:37:

Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Thr Ser Lys Thr

1

5

10

15

Lys

Ser

Gly

Val

Ile

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Val

Ser

Ser

Pro

His

Ile

20

?5

30

Pro

Lys

Tyr

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

35

40

45

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

50

55

60

Thr

Asp

Pro

Glu

Thr

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

65

70

75

80

'· · · · *KS //ys

Asp

Glu

Cys

Met

His 85

Cys

Ser

cly

Glu

His 90

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 95

Ser

5

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Ile

Glu

Cys

Gin 105

Ser

Trp

Gly

Ser

Gin 110

Ser

Pro

10

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Leu

Pro

Ser 120

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 125

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 13 0

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 135

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 140

Pro

Trp

Cys

Phe

15

Thr 145

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys 150

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys 155

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 160

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:38:

2θ 0) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: hovězí (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-2

(xi)Pi

OPIS

SEKVENCE: SEQ ID NO:

38:

Cys

Lys

Thr

Gly

Asn

Gly

Gin

Thr

Tyr

Arg

Gly

Thr

Thr

Ala

Glu

Thr

1

5

10

15

Lys

Ser

Gly

Val

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Ala

Thr

Ser

Pro

His

Val

20

25

30

Pro

Lys

Phe

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

35

40

45

r ···· ···· /η

Tyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Asn

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 80

Asp Lys

Cys

Met

His 85

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 90

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 95

Ala

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Arg

Asp

Cys

Gin 105

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 110

Ser

Pro

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 120

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 125

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 130

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 135

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 140

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 145

Thr

Asp

Pro

Gin

Lys 150

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys 155

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 160

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 352 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:39:

Cys Lys Thr Gly Ile Gly Asn Gly iy_{r Arg} Gly Thr Met Ser Arg Thr ⁵ 10 15

Lys Ser Gly Val Ala Cys Gin Lys Trp Gly Ala Thr Phe Pro His Val ²⁰ 25 30

• ·

Pro Asn Tyr

Ser Pro

Ser

Thr

His 40

Pro Asn Glu Gly

Leu Glu 45

Glu

Asn

35

Ťyr

Cys 50

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 55

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro 60

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 65

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 75

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 80

Glu

Glu

Cys

Met

Tyr 85

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys 90

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 95

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 100

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin 105

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 110

Ser

Pro

His

Ala

His 115

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala 120

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 125

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 130

Tyr

Cys

His

Asn

Pro 135

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 140

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 145

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys 150

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 155

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 160

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 165

Pro

Pro

Ser

Pro

Thr 170

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 175

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn 180

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val 185

Ser

Val

Thr

Val

Ser 190

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin 195

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin 200

Thr

Pro

His

Arg

His 205

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 210

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 215

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn 220

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 225

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 230

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 235

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu 240

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 245

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys 250

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser 255

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp 260

Ser

Ser

Val

Pro

Pro 265

Glu

Glu

Gin

Thr

Pro 270

Val

Val

Gin

Glu

Cys 275

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly 280

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly 285

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr 290

Ile

Thr

Gly

Lys

Lys 295

Cys

Gin

Ser

Trp

Ala 300

Ala

Met

Phe

Pro

His 305

Arg

His

Ser

Lys

Thr 310

Pro

Glu

Asn Phe

Pro 315

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu 320

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg 325

Asn

Pro

Asp

Gly Asp 330

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys 335

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro 340

Ser

Val

Arg

Trp

Glu Tyr 345

Cys

Asn

Leu

Lys 350

Arg

Cys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 352 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Kl-4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:40:

Cys

Lys

Thr

Gly

Asn

Gly

Lys

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Met

Ser

Lys

Thr

5

10

15

Lys

Asn

Gly

Ile

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro

His

Arg

20

25

30

Pro

Arg

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

35

40

45

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Pro

Gin

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

50

55

60

Thr 65

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg 70

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 75

Ile

Leu

Glu

Cys

Glu 80

Glu

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile

Ser

85

90

95

Λ.

··« ·

4bv (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 378 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: myší (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K1-4BKLS (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:41:

Leu 1

Phe

Glu

Lys

Arg 5

Val

Tyr

Leu

Ser

Glu 10

Cys

Lys

Thr

Gly

Ile 15

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg 20

Gly

Thř

Met

Ser

Arg 25

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 30

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp 35

Gly

Ala

Thr

Phe

Pro 40

His

Val

Pro

Asn

Tyr 45

Ser

Pro

Ser

Thr

His 50

Pro

Asn

Glu

Gly

Leu 55

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 60

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 65

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro 70

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 75

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 80

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 85

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 90

Glu

Glu

Cys

Met

Tyr 95

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys 100

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 105

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 110

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin 115

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 120

Ser

Pro

His

Ala

His 125

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala 130

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 135

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 140

Tyr

Cys

His

Asn

Pro 145

Asp Gly Glu

Pro

Arg Pro 150

Trp Cys

Phe

Thr Thr Asp Pro 155

Thr

Lys 160

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Pro

5

165

170

175

Pro

Ser

Pro

Thr

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

180

185

190

10

Gly

Thr

Val

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

195

200

205

Glu

Gin

Thr

Pro

His

Arg

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

15

210

215

220

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

225

230

235

240

20

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

245

250

255

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp

Ser

Ser

260

265

270

25

Val

Pro

Pro

Glu

Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

Gin

Ser

275

280

285

Asp

Gly

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys

30

290

«

295

300

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp

Ala

Ala

Met

Phe

Pro

His

Arg

His

Ser

Lys

Thr

305

310

315

320

35

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

325

330

335

Pro

Asp

Gly

Asp

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

340

345

350

40

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asn

Leu

Lys

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr

Gly

Gly

Ser

355

360

365

Val

Val

Glu

Leu

Pro

Thr

Val

Ser

Gin

Glu

370

375

45

—

—

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 378 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC:

(D) TOPOLOGIE: lineární ···· · ··· • · · · · /62

- · Ή (ii) TYP MOLEKULY: protein (ni) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (vil) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: K1-4BKLS (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:42:

Leu 1

Phe

Glu Lys Lys 5

Val Tyr Leu Ser

Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly

10

15

Lys

Asn

Tyr

Arg 20

Gly

Thr

Met

Ser

Lys 25

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile 30

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 35

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro 40

His

Arg

Pro

Arg

Phe 45

Ser

Pro

Ala

Thr

His 50

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 55

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 60

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 65

Asp

Pro

Gin

Gly'

Pro 70

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 75

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg 80

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp 85

Ile

Leu

Glu

Cys

Glu 90

Glu

Glu

Cys

Met

His 95

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 100

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile 105

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 110

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin 115

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 120

Ser

Pro

His

Ala

His 125

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 130

Lys

Phe

Pro

Asn

Lys 135

Asn

Leu

Lys

Lys

Asn 140

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 145

Asp

Arg

Glu

Leu

Arg 150

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 155

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys 160

Arg

Trp

Glu

Leu

Cys 165

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 170

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 175

Ser

Ser

Gly

Pro

Thr 180

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 185

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn 190

Tyr

Arg

•-------- · · · · · ··· . · · · · · · ···· · • · · · · · · · '······· ·· '♦·· · · · 4

Gly Asn Val Ala Val 195

Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gin His

Trp

Ser

200

205

5

Ala

Gin 210

Thr

Pro

His

Thr

His 215

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 220

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 225

Asn

Leu

Asp

Glu

Asn 230

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 235

Asp

Gly

Lys

Arg

Ala 240

10

Pro

Trp

Cys

His

Thr 245

Thr

Asn

Ser

Gin

Val 250

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 255

Lys

15

Ile

Pro

Ser

Cys 260

Asp

Ser

Ser

Pro

Val 265

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu 270

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro 275

Pro

Glu

Leu

Thr

Pro 280

Val

Val

Gin

Asp

Cys 285

Tyr

His

Gly

20

Asp

Gly 290

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly 295

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr 300

Thr

Thr

Gly

Lys

Lys 305

Cys

Gin

Ser

Trp

Ser 310

Ser

Met

Thr

Pro

His 315

Arg

His

Gin

Lys

Thr 320

25

Pro

Glu

Asn

Tyr

Pro 325

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr 330

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg 335

Asn

30

Pro

Asp

Ala

Asp 340

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys 345

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro 350

Ser

Val

Arg

Trp

Glu 355

Tyr

Cys

Asn

Leu

Lys 360

Lys

Cys

Ser

Gly

Thr 365

Glu

Ala

Ser

Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu

370 375 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:43:

₄₀ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce

	<
			V · Λ	•	'•Ή-·	“T“'	»**“, ..
s»' - ·			9	•	• ·	•	• · ··

• · · · 9 ···· ···· '· _tU (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens ⁵ (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Primer 154 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:43:

ATCGCTCGAG CGTTATTTGA AAAGAAAGTG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina _ „ (C) ŘETĚZEC: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE ₃₀ (v) DRUH FRAGMENTU: -fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens ³⁵ (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: Primer 151 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:44:

ATCGGAATTC AAGCAGGACA ACAGGCGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednořetězcová ⁵⁰ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE

Claims (80)

1. PATENTOVÉNÁROKY (změněné)

   1. Způsob inhibice proliferace endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že se na endoteliální buňku aplikuje proliferaci inhibující množství přípravku, který obsahuje angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 1.
2. 2 . Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED50 pro angiostatinový fragment menší než přibližně 500 nM.
3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 7; SEQ ID č.: 8; SEQ ID č.: 9; SEQ ID č.: 10; SEQ ID č.: 11 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
5. 5. Způsob inhibice proliferace endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že se na endoteliální buňku aplikuje proliferaci inhibující množství přípravku, který obsahuje angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 2.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED50 pro angiostatinový fragment menší než přibližně 500 nM.
7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.

   i · ·.· • · · · · • · · · ···· ···· *· • · · ·· • · ··· · . · • ,· · · ··· tt «·

   I (iv) POZITIVNÍ: NB

   5 (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

   (Á) ORGANIZMUS: Homo sapiens ⁰ (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

   (B) KLON: Primer 156 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 45·

   5 ' ’ atcgtacgta ttatttgaaa AGAAAGTG • ·
8. 8. Způsob podle nároku l,vyznačujícíse tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 12; SEQ ID č.: 13; SEQ ID č.: 14; SEQ ID č.: 15; SEQ ID č.: 16 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
9. 9. Způsob inhibice proliferace endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že se na endoteliální buňku aplikuje proliferaci inhibující množství přípravku, který obsahuje angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 3.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED₅₀ pro angiostatinový fragment menší než přibližně 500 nM.
11. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
12. 12. Způsob podle nároku 9, vyznačujícíse tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 17; SEQ ID č.: 18; SEQ ID č.: 19; SEQ ID č.: 20; a SEQ ID č.: 21 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
13. 13. Způsob inhibice proliferace endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že se na endoteliální buňku aplikuje proliferaci inhibující množství přípravku, který obsahuje angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 1-2.
14. 14. Způsob podle nároku 13,vyznačující se tím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED50 pro angiostatinový fragment menší než přibližné 500 nM.
15. 15. Způsob podle nároku 13,vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.

    168 ········ ·· ··· ··
16. 16. Způsob podle nároku 13,vyznačujícíse tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 38; SEQ ID č.: 39; SEQ ID č.: 40; SEQ ID č.: 41; a SEQ ID č.: 42 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
17. 17. Způsob inhibice proliferaci endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že se na endoteliální buňku aplikuje proliferaci inhibující množství přípravku, který obsahuje angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 1-3.
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED50 pro angiostatinový fragment menší než přibližně 500 nM.
19. 19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
20. 20. Způsob podle nároku 17, vyznačujícíse tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 32; SEQ ID č.: 33; SEQ ID č.: 34; SEQ ID č.: 35; a SEQ ID č.: 36 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
21. 21. Způsob inhibice proliferaci endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že se na endoteliální buňku aplikuje proliferaci inhibující množství přípravku, který obsahuje angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 2-3.
22. 22. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED50 pro angiostatinový fragment menší než přibližně 500 nM.
23. 23. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.

    —------------— ----L______—------—- -· -9-9-.------------,.·- ---gcea ^-l.iui -- — - f-9^gT » · · · · · * • 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 · · · · · 9

    169 ·..· .:.
24. 24. Způsob podle nároku 21,vyznačujícíse tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 27; SEQ ID č.: 28; SEQ ID č.: 29; SEQ ID č.: 30; a SEQ Π) č.: 31 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
25. 25. Způsob podle nároku l,vyznačujícíse tím, že přípravek obsahuje angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 1 a angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 2.
26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že protein smyčky 1 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 8 nebo její funkční homolog a protein smyčky 2 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 13 nebo její funkční homolog.
27. 27. Způsob podle nároku l,vyznačujícíse tím, že přípravek obsahuje angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 1 a angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 2-3.
28. 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že protein smyčky 1 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 8 nebo její funkční homolog a protein smyčky 2-3 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 25 nebo její funkční homolog.
29. 29. Způsob podle nároku l,vyznačujícíse tím, že přípravek obsahuje angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 1, angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 2 a angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 3.
30. 30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že protein smyčky 1 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. : 8 nebo její funkční homolog, protein smyčky 2 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 13 nebo její funkční homolog a protein smyčky 3 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.:

    18 nebo její funkční homolog.

    • ·

    170'
31. 31. Způsob podle nároku 5, vyznačují cíše tím, že přípravek obsahuje angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 2 a angiostatinový fragment odpovídající přibližně oblasti smyčky 3.
32. 32. Způsob podle nároku 31,vyznačující se tím, že protein smyčky 2 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 13 nebo její funkční homolog a protein smyčky 3 obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 18 nebo její funkční homolog.
33. 33. Způsob léčení savce s nemocí zprostředkovanou angiogenezi, s e vyznačuje tím, že se savci aplikuje pro léčbu účinné množství přípravku obsahujícího angiostatinový fragment, který přibližně odpovídá oblasti smyčky 1, oblasti smyčky 2, oblasti smyčky 3, oblasti smyčky 1-2, oblasti smyčky 1-3 a oblasti smyčky 2-3 nebo jejich kombinaci.
34. 34. Způsob podle nároku 33,vyznačující se tím, že savec je člověk.
35. 35. Způsob podle nároku 33,vyznačující se tím, že nemoc zprostředkovaná angiogenezi je vybrána ze skupiny zahrnující rakovinu, artritidu, makulámí degenerace a diabetickou retinopatii.
36. 36. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 7; SEQ ID č.: 8; SEQ ID č.: 9; SEQ ID č.: 10; SEQ ID č.: 11; SEQ ID č.: 12; SEQ ID č.: 13; SEQ ID č.: 14; SEQ ID č.: 15; SEQ ID č.. 16; SEQ ID č.: 17; SEQ ID č.: 18; SEQ ID č.: 19; SEQ ID č.: 20;

    SEQ ID č.: 21; SEQ ID č.. 27; SEQ ID č.: 28; SEQ ID č.: 29; SEQ ID č.: 30; SEQ ID č.. 31,

    SEQ ID č.: 32; SEQ ID č.: 33; SEQ ID č.: 34; SEQ ID č.: 35; SEQ ID č.: 36; SEQ ID č.: 38;

    SEQ ID č. : 39; SEQ ID č.: 40; SEQ ID č.: 41; SEQ ID č.: 42 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
37. 37. Způsob podle nároku 33,vyznačující se tím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED₅₀ pro angiostatinový fragment menší než přibližně 500 nM.

    171 ........
38. 38. Způsob léčení savce s nemocí zprostředkovanou angiogenezi, s e vyznačuje tím, že se savci aplikuje pro léčbu účinné množství přípravku obsahujícího dva nebo více angiostatinových fragmentů vybraných ze skupiny angiostatinových fragmentů, které přibližně odpovídají oblasti smyčky 1, oblasti smyčky 2, oblasti smyčky 3, oblasti smyčky 1-2, oblasti smyčky 1-3 a oblasti smyčky 2-3 nebo jejich kombinaci.
39. 39. Způsob podle nároku 38, vyznačující setím, že savec je člověk.
40. 40. Farmaceutický přípravek obsahující angiostatinový fragment vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je vybrán ze skupiny angiostatinových fragmentů, které přibližně odpovídají oblasti smyčky 1, oblasti smyčky 2, oblasti smyčky 3, oblasti smyčky 1-2, oblasti smyčky 1-3 a oblasti smyčky 2-3 nebo jejich kombinace.
41. 41. Přípravek podle nároku 40, vyznačující setím, žev případě endoteliálních buněk je hodnota ED50 pro angiostatinový fragment menší než přibližně 500 nM.
42. 42. Přípravek podle nároku 40, vyznačující setím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
43. 43. Přípravek podle nároku 40, vyznačující setím, že kde angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č : 7; SEQ ID č.: 8; SEQ ID č.: 9; SEQ ID č.. 10; SEQ ID č.: 11; SEQ ID č.: 12; SEQ ID č.: 13; SEQ ID č.: 14; SEQ ID č.: 15; SEQ ID č.: 16; SEQ ID č.: 17; SEQ ID č.: 18; SEQ ID č.: 19;

    SEQ ID č.: 20; SEQ ID č.: 21; SEQ ID č.: 27; SEQ ID č.: 28; SEQ ID č.: 29; SEQ ID č.: 30;

    SEQ ID č.: 31; SEQ ID č.: 32; SEQ ID č.. 33; SEQ ID č.: 34; SEQ ID č.: 35; SEQ ID č.: 36;

    SEQ ID č.: 38; SEQ ID č.: 39; SEQ ID č.: 40; SEQ ID č.: 41; SEQ ID č.: 42 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.

    2.
44. 44. Podstatně izolavaný angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky • · · ·

    172
45. 45. Angiostatinový fragment podle nároku 44 je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
46. 46. Angiostatinový fragment podle nároku 44 obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 12; SEQ ID č.: 13; SEQ ID č.: 14; SEQ ID č.: 15; SEQ ID č.: 16 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
47. 47. Podstatně izolovaný angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 3.
48. 48. Angiostatinový fragment podle nároku 47 je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
49. 49. Angiostatinový fragment podle nároku 47 obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 17; SEQ ID č.: 18; SEQ ID č.: 19; SEQ ID č.: 20; SEQ ID č. : 21 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
50. 50. Podstatně izolavaný angiostatinóvý fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky 1-2.
51. 51. Angiostatinový fragment podle nároku 50 je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
52. 52. Angiostatinový fragment podle nároku 50 obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 38; SEQ ID č.: 39; SEQ ID č.: 40; SEQ ID č.: 41; SEQ ID č.: 42 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.

    2-3.
53. 53. Podstatně izolavaný angiostatinový fragment přibližně odpovídající oblasti smyčky

    173
54. 54. Angiostatinový fragment podle nároku 53 je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
55. 55. Angiostatinový fragment podle nároku 53 obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 27; SEQ ID č.: 28; SEQ ID č.: 29; SEQ ID č.: 30; SEQ ID č .: 31 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
56. 56. Přípravek obsahující sekvenci izolované DNK kódující angiostatinový fragment, jenž má inhibuj ící aktivitu proliferace endoteliálních buněk, se vyznačuje tím, že angiostatinový fragment je vybrán ze skupiny angiostatinových fragmentů, které přibližně odpovídají oblasti smyčky 1, oblasti smyčky 2, oblasti smyčky 3, oblasti smyčky 1-2, oblasti smyčky 1-3 a oblasti smyčky 2-3 nebo jeho funkční homolog.
57. 57. Přípravek podle nároku 56, vyznačující se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
58. 58. Přípravek podle nároku 56, vyznačující se tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 7; SEQ ID č : 8; SEQ ID č.: 9; SEQ ID č.: 10; SEQ ID č.: 11; SEQ ID č.: 12; SEQ ID č.: 13; SEQ ID č.: 14; SEQ ID č.: 15; SEQ ID č.: 16; SEQ ID č.: 17; SEQ ID č.: 18; SEQ ID č.: 19;

    SEQ ID č.: 20; SEQ ID č.: 21; SEQ ID č.: 27; SEQ ID č.: 28; SEQ ID č.: 29; SEQ ID č.: 30;

    SEQ ID č.: 31; SEQ ID č.: 32; SEQ ID č.: 33; SEQ ID č.: 34; SEQ ID č.: 35; SEQ ID č.: 36;

    SEQ ID č.: 38; SEQ ID č.: 39; SEQ ID č.: 40; SEQ ID č.: 41; SEQ ID č.: 42 nebo jejich kombinaci nebo její funkční homolog.
59. 59. Přípravek podle nároku 56 dále obsahuje vektor spojený se sekvencí DNK kódující angiostatinový fragment, se vyznačuje tím, že tento vektor, jestliže je přítomný v buňce, je schopen exprimovat angiostatinový fragment.

    • · · · • · ··· ···

    174 ···· ···· ·· ··· ·· ··
60. 60. Přípravek podle nároku 59 se vyznačujetím, že zahrnuje buňku obsahující zmíněný vektor.
61. 61. Způsob exprese angiostatinového fragmentu, vykazujícího inhibiční aktivitu proliferace endoteliálních buněk, zahrnuje transfekci buňky vektorem avyznačuje se tím, že vektor obsahuje sekvenci DNK kódující zmíněný angiostatinový fragment a jestliže je tento vektor přítomný v buňce, je schopen exprimovat angiostatinový fragment, který je vybrán ze skupiny angiostatinových fragmentů přibližně odpovídající oblasti smyčky 1, oblasti smyčky 2, oblasti smyčky 3, oblasti smyčky 1-2, oblasti smyčky 1-3 a oblasti smyčky 23 nebo jejich kombinacím, či jeho funkční homolog.
62. 62. Způsob podle nároku 61,vyznaču jící se tím, že angiostatinový fragment je odvozen od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
63. 63. Přípravek podle nároku 61,vyznačující se tím, že angiostatinový fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID č.: 7; SEQ ID č.: 8; SEQ ID č.: 9; SEQ ID č.: 10; SEQ ID č.: 11; SEQ ID č.: 12; SEQ ID č.: 13; SEQ ID č.: 14; SEQ ID č.: 15; SEQ ID č.: 16; SEQ ID č.: 17; SEQ ID č.: 18; SEQ ID č.: 19;

    SEQ ID č.: 20; SEQ ID č.: 21; SEQ ID č.: 27; SEQ ID č.: 28; SEQ ID č.: 29; SEQ ID č.: 30;

    SEQ ID č.: 31; SEQ ID č.: 32; SEQ ID č.: 33; SEQ ID č.: 34; SEQ ID č.: 35; SEQ ID č.: 36;

    SEQ ID č.: 38; SEQ ID č.: 39; SEQ ID č.: 40; SEQ ID č.: 41; SEQ ID č.: 42 nebo její funkční homolog.
64. 64. Přípravek pro inhibici proliferace endoteliálních buněk obsahující podstatně čištěný agregovaný angiostatin, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin je rekombinantně produkovaný protein přibližně odpovídající oblasti smyčky 1-4 nerenaturované molekuly plazminogenu.
65. 65. Přípravek podle nároku 64, vyznačující setím, že agregovaný angiostatin má molekulovou hmotnost přibližně 45 až 65 kilodaltonů, jak se určilo redukční elektroforézou na polyakrylamidovém gelu.

    175
66. 66. Přípravek podle nároku 64, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin je odvozen z fragmentu plazminogenu začínajícího přibližně aminokyselinou číslo 98 odvozeného od myšího plazminogenu, lidského plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu a plazminogenu hovězího dobytka.
67. 67. Přípravek podle nároku 64, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin je schopný inhibovat nemoc zprostředkovanou angiogenezi.
68. 68. Přípravek podle nároku 67, vyznačující se tím, že tato nemoc je vybrána ze skupiny zahrnující rakovinu, artritidu, makulámí degenerace a diabetickou retinopatii.
69. 69. Způsob inhibice proliferaci endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že se na endoteliální buňku aplikuje proliferaci inhibující množství agregovaného angiostatinu, kterým je rekombinantně produkovaný protein přibližně odpovídající oblasti smyčky 1-4 nerenaturované molekuly plazminogenu.
70. 70. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin má molekulovou hmotnost přibližně 45 až 65 kilodaltonů, jak se určilo redukční elektroforézou na polyakrylamidovém gelu.
71. 71. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin je odvozen od fragmentu plazminogenu začínajícího přibližně aminokyselinou číslo 98 odvozeného od lidského plazminogenu, myšího plazminogenu, plazminogenu opice rhesus, prasečího plazminogenu nebo plazminogenu hovězího dobytka.
72. 72. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin je schopný inhibovat nemoc zprostředkovanou angiogenezi.
73. 73. Způsob podle nároku 72, vyznačující se tím, že nemoc zprostředkovaná angiogenezi je vybrána ze skupiny zahrnující rakovinu, artritidu, makulámí degenerace a diabetickou retinopatii.

    176
74. 7 4 . Způsob léčení savce s nemocí zprostředkovanou angiogenezí, aplikací pro léčbu účinného množství agregovaného angiostatinu, sevyznačuje tím, že angiostatin je rekombinantě produkovaný protein přibližně odpovídající oblasti smyčky 1-4 nerenaturované molekuly plazminogenu.
75. 75.Způsob produkce agregovaného angiostatinu pro inhibici proliferace endoteliálních buněk, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin je rekombinantně produkovaný protein přibližně odpovídající oblasti smyčky 1-4 nerenaturované molekuly plazminogenu a že tento způsob zahrnuje rekombinantní expresi angioastatinu, podstatné čištění angioastatinu a dále agregaci čištěného angiostatinu.
76. 76. Způsob podle nároku 75, vyznačující provádí dialýzou angiostatinu.
77. 77. Způsob podle nároku 76, vyznačující hodin a nejméně tři krát se vymění dialyzát.
78. 78. Způsob podle nároku 76, vyznačující se tím, že agregační krok se se tím, že dialýza trvá přibližně 24 se tím, že dialýza probíhá při teplotě přibližně 4°C.
79. 79. Způsob podle nároku 75, vyznačující se tím, že agregovaný angiostatin má molekulovou hmotnost přibližně 45 až 65 kilodaltonů, jak se určilo redukční elektroforézou na polyakrylamidovém gelu.
80. 80. Produkt, vyznačující se tím, že se připravil způsobem podle nároku 75.