CN1636594B - 血管生成抑制素和用于抑制血管生成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及内皮细胞生长抑制剂和其使用方法。内皮细胞生长抑制剂是一种从血液或尿中分离的蛋白质，该蛋白质是从C4反相高效液相层析柱上作为单一峰洗脱的。内皮细胞生长抑制剂是一种经还原聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量在大约38千道尔顿和45千道尔顿之间的蛋白质分子，并且具有基本上相似于从鼠纤溶酶原分子的98位氨基酸开始之鼠纤溶酶原片段的氨基酸序列。

Description

血管生成抑制素和用于抑制血管生成的方法
相关申请的交互参考 
本申请是1994年10月20日提交的美国专利申请序号08/326,785的部分继续申请，前者则是1994年4月26提交的美国专利申请的部分继续申请。 
发明的所属领域 
本发明涉及称为血管生成抑制素(angiostatin)的内皮生长抑制剂，该抑制剂可逆地抑制内皮细胞的增殖。更具体地说，本发明涉及可从体液如血液或尿中分离的，或者可用重组、酶促或化学方法合成的血管生成抑制素蛋白质。血管生成抑制素能够抑制血管生成相关的疾病和调制血管生成过程。另外，本发明涉及诊断检测法和血管生成抑制素检测药盒、定位血管生成抑制素的组织化学药盒、编码血管生成抑制素的DNA序列和监测血管生成抑制素生物合成的分子探针、对血管生成抑制素特异的抗体、产生血管生成抑制素受体的肽激动剂和拮抗剂、抗血管生成抑制素受体特异性抗体刺激动和拮抗剂，以及与血管生成抑制剂肽连接的细胞毒性剂。 
发明的背景 
本文所用的术语“血管生成”是指产生伸入到组织或器官中的新的血管。在正常生理条件下，人或动物只在很特异受限制的情况下才发生血管生成。例如，在伤口俞合、胎儿和胚胎发育及黄体、内皮和胎盘形成中可观察到正常血管生成。术语“内皮”是指衬在浆液腔、淋巴管及血管内壁上的扁平内皮细胞的薄层。 
一般认为受控制的和不受控制的血管生成是以相似方式进行的。内皮细胞和外膜细胞由基底膜包绕形成毛细血管。血管生成随 着由内皮细胞和血细胞释放的酶侵蚀基底膜开始。然后衬在血管腔内的内皮细胞通过基底膜伸出。血管生成刺激剂诱导内皮细胞通过受侵蚀的基底膜迁移。迁移细胞从母血管分岔形成“新芽”，内皮细胞在这里进行有丝分裂和增殖。内皮细胞新芽彼此合并形成毛细环，产生新的血管。 
持续的、不受控制的血管生成发生在多种疾病状态、肿瘤转移及内皮细胞的正常生长中，并支持可见于这些状态下的病理性损伤。已将其中存在不受控制的血管生成的各种病理学疾病状态归纳分类为血管生成依赖性的或血管生成相关性的疾病。 
1971年首先提出了肿瘤生长是血管生成依赖性的这一假想(Folkman J.，Tumor angiogenesis：Therapeutic implications.，N，En-gl.Jour.Med.285：1182-1186，1971)。其中以最简单的措词指出：“一旦发生肿瘤“容纳”，肿瘤细胞群体的每次增加之前均有集中于肿瘤上之新毛细血管的增加”。肿瘤“容纳”目前被理解为肿瘤生长之血管前期的指征，其中占据很少几个立方厘米体积并且不超过几百万个细胞的肿瘤细胞群体可以在已有的宿主微血管上存活。在此期之后肿瘤体积的扩大需要诱发新的毛细血管生成。例如，除非对组织学切片进行高倍显微镜检查，否则将不能在早期血管前期检测到小鼠的肺部微量转移。 
支持这一观点的间接证据包括： 
(1)移植在小鼠皮下透明小室中的肿瘤在神经血管生成之前生长速率缓慢而且呈线性生长，而在神经血管生成之后则生长迅速并近于指数生长(Algire GH，et al.vascular reactions of normal andmilignant tumors in vivo.I.Vascular reactions of mice to wounds andto normal and neoplastic transplants.J.Natl.Cancer Inst.6：73-85，1945)； 
(2)在血管没有增殖的分离的灌注器官中，肿瘤生长只限于1-2mm3，但当将其移植到小鼠体内并逐渐有神经血管生成时这一体积便迅速扩大到1000倍以上(Folkman J.et al.，Tumor behavior inisolated perfused organs：In vitro growth and metastasis of biopsy ma- terial in rabbit thyroid and canine intestinal segments.Annals ofSurgery 164：491-502，1966)。 
(3)无血管角膜中的肿瘤生长缓慢而且呈线性生长速率，但在神经血管生成后便变成指数生长(Gimbrone，M.A.，Jr.et al.，Tu-mor growth and neovascularization：An experimental model using therabbit cornea.J.Natl.Cancer Institute 52：41-427，1974)； 
(4)悬浮在兔眼前房之水性液体中的肿瘤仍是活的和无血管的，并且被限制在小于1mm3的体积。一旦将其移植到虹膜血管床上，它们便迅速神经血管化并迅速生长，2周内达到其原有体积的16，000倍(Gimbrone MA Jr.，et al.，Turnor dermancy in vivo by pre-vention of neovascularization.J.Exp.Med.136：261-276)； 
(5)当将肿瘤移植于鸡胚绒膜尿囊膜上时，它们在＞72小时的无血管期内生长缓慢，而且平均直径不超过0.93+0.29mm。在开始神经血管化后的24小时内出现肿瘤迅速扩大，并且到第7天时这些有血管生成的肿瘤达到8.0+2.5mm的平均直径(Knighton D.，Avascular and vascular phase of tumor growth in the chick embryo.British J.Cancer，35：347-356，1977)； 
(6)兔肝中转移瘤的血管管型揭示了转移瘤大小的不均一性，但就这一存在血管化部位来说则显示出相对不均匀的切开点。通常肿瘤在直径达1mm之前是无血管的，但在直径超出1mm时即表现有神经血管生成(Lien W.，et al.，The blood supply of experimental liv-er metastases.II.A microcirculatory study of normal and tumor Ves-sels of the liver with the use of perfused silicone rubber.Suvgery 68：334-340，1970)； 
(7)在胰岛β细胞发生肿瘤的转基因小鼠中，血管生成前增生的胰岛大小限于＜1mm。在6-7周龄时，有4-10％的胰岛逐渐神经血管化，并由这些胰岛产生超过血管生成前胰岛100倍体积的大的血管化肿瘤(Folkman J，et al.，Induction of angiogenesis during thetransition from Hyperplasia to neoplasia，Nature 339：58-61，1989)。 
(8)抗VEGF(血管内皮生长因子)特异性抗体降低微血管密度， 并使三种依赖于VEGF(作为其在裸鼠体内血管生成的唯一介导物)的人肿瘤的生长受到“显著的”抑制。抗体则不能抑制肿瘤细胞在体外的生长(Kim K J，et al.，Inhibition of Vascular endothelial growthfactor-induced angiogenesis Suppresses tumor growth in vivo.Nature362：841-844，1993)； 
(9)抗bFGF单克隆抗体使依赖于作为其血管生成之唯一介导物的bFGF分泌的小鼠肿瘤的生长受到70％的抑制。该抗体却不能在体外抑制肿瘤细胞的生长(Hori A，et al.，Suppression of solidtumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against hu-man basic fibroblast growth factor.Cancer Research，51：6180-6184，1991)； 
(10)腹腔内注射bFGF可通过刺激肿瘤中毛细血管内皮细胞的生长促进原发瘤及其转移瘤的生长。肿瘤细胞本身缺少bFGF的受体，并且bFGF不是肿瘤细胞在体内的有丝分裂原(Gross JL，et al.，Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF，Proc.Hmer.As-soc.Canc.Res.31：79，1990)； 
(11)特异性血管生成抑制剂(AGM-1470)抑制肿瘤生长和体内转移，但在抑制肿瘤细胞体外增殖中其活性则小得多。它抑制血管内皮细胞半最大增殖的浓度比抑制肿瘤细胞增殖低4个对数值(Ingber D，et al.，Angioinhibins：Synthetic analogues of fumagillinwhich inhibit angiogenesis and suppress tumor growth.Nature，48：555-557，1990)。也有间接的临床证据表明肿瘤生长是血管生成依赖性的。 
(12)转移到玻璃体的人成视网膜细胞瘤可发展成不到1mm3直径的无血管球形体，尽管事实上当将其从已摘除的眼球中切除并进行体外分析时可见它们是存活的并且可掺入3H-胸苷； 
(13)卵巢肿瘤作为极小的无血管白色籽瘤(1-3mm3)转移到腹腔上。在其中一个或多个移植物逐渐有神经血管形成之前很少能够长得较大； 
(14)乳腺癌(Weidner N，et al.，Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma.N.Engl.J.Med.324：1-8，1991，and Weidner N，et al.，Tumor angiogenesis：A new sig-nificant and independent prognostic indicator in early-stage breastCarcinoma，J.Natl.Cancer Inst.84：1875-1887，1992)和前列腺癌(Woodner N，Carroll PR，Flax J，Blumenfeld W，Folkman J.Tumorangiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma.American J.of Pathology，143(2)：401-409，1993)中神经血管化的强度与肿瘤进一步转移的危险密切相关； 
(15)在神经血管生成之前人皮肤黑素瘤很少发生转移。在神经血管生成后增加了损伤的厚度并增加了转移的危险(Srivastava A，et al.，The prognostic significance of tumor rascularity in intermediatethiclcness(0.76-4.0mm厚)skin melanoma.Amer.J.Pathol.133：419-423，1988)； 
(16)就膀胱癌来说，血管生成肽即bFGF的尿液水平是指示疾病状态和程度的比细胞学检查更为敏感的指征(Nguyen M，et al.，Elevated levels of an angicgenic peptide，basic fibroblast growth fac-tor，in urine of bladder cancer patients.J.Natl.Cancer Inst.85：241-242，1993)。 
因此可见，血管生成在肿瘤的转移中起着重要作用。如果能够抑制或消除这种血管生成活性，则尽管肿瘤仍存在，也不会生长。在疾病状况下，阻止血管生成可以避免因新的微血管系统侵入所引起的损伤。针对控制血管生成过程的治疗可导致这些疾病的消除或减轻。 
因此需要有一种能抑制不需要的血管生长，特别向肿瘤内生长的组合物及方法。另外还需要一种检测、测定及定位该组合物的方法。该组合物应能够克服转移前肿瘤中内源性生长因子的活性并阻止肿瘤中毛细血管的生成，从而抑制肿瘤的生长。该组合物、组合物的片段和对组合物特异的抗体也应能够调节如伤口愈合及再生等其他血管生成过程中的毛细血管生成。该抑制血管生成的组合物和方法较好是无毒性的并几乎不产生付作用。另外还需要一种检测、测 定和定位组合物之结合位点及组合物之生物合成位点的方法。该组合物和组合物的片段应能够为放射活性和非放射活性标记目的而结合到其他分子上。 
发明的概要 
本发明提供了有效地调节血管生成，及抑制不需要的血管生成，特别是与肿瘤生长有关之血管生成的组合物与方法。本发明包括已根据其在体外克服内源性生长因子如bFGF的血管生成活性的能力，以及根据其与在纤溶酶原的氨基酸98处开始的血纤溶酶原内在部分的氨基酸序列同源性和结构相似性而定义的，称为“血管生成抑制素”的蛋白质。血管生成抑制素包括如经还原性需丙烯酰胺聚胶电泳法测定分子量约为38千道尔顿至45千道尔顿，具有基本上与在完整的鼠纤溶酶原分子的氨基酸序号98处开始的鼠纤溶酶原的片段相似之氨基酸序列的蛋白质。 
血管生成抑制素的氨基酸序列在不同种间稍有变化。例如，人血管生成抑制素的氨基酸序列基本上相似于上述鼠纤溶酶原片段的序列，但活性人血管生成抑制素序列可能开始于完整人纤溶酶原氨基酸序列的氨基酸序号97或99处。此外，人纤溶酶原的片段具有如在小鼠肿瘤模型中所显示的相似的抗血管生成活性。应明确的是，活性血管生成抑制素分子中的氨基酸数目可能有变化，并且具有内皮抑制活性的所有氨基酸序列均应包括在本发明范围内。 
本发明提供用于治疗由不需要的不受控制的血管生成介导的疾病和过程的方法及组合物，所说的方法是以足可抑制血管生成的剂量给人或动物投用包含基本上纯化的血管生成抑制素或血管生成抑制素衍生物的组合物。本发明特别适用于治疗肿瘤或抑制肿瘤生长。给患有血管生成前的转移肿瘤的人或动物投用血管生成抑制素将阻止那些肿瘤的生长或扩展。 
本发明还包括编码血管生成抑制素的DNA序列，含有编码血管生成抑制素之DNA序列的表达载体，以及含有一个或多个所说的表达载体的细胞。本发明进一步包括基因治疗方法，借以将编码 血管生成抑制素的DNA序列导入病人体内以在体内修饰血管生成抑制素水平。 
本发明还包括检测和测定生物体液和组织中血管生成抑制素、以及定位组织和细胞中血管生成抑制素的诊断方法及药盒。诊断方法和药盒可以是本领域技术人员熟知的任何配置的。本发明还包括对血管生成抑制素分子或其部分特异的抗体，以及抑制对血管生成抑制素特异的抗体结合的抗体。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以在诊断药盒中使用对血管生成抑制素特异的抗体以检测血管生成抑制素的存在和量，从而借以诊断或预测由血管生成介导的肿瘤或其他疾病的发生或再发。也可以将对血管生成抑制素特异的抗体投用于人或动物，以使之产生抗血管生成抑制素的主动免疫，从而降低血管生成抑制作用。 
本发明还包括用于检测能与体液中血管生成抑制素结合之抗体的存在及其量的诊断方法和药盒。所说的诊断方法和药盒可以是本领域技术人员熟知的任何配置的。 
本发明还包括与血管生成抑制素受体结合并向细胞传递适当的信号和起到激动剂或拮抗剂作用的抗血管生成抑制素受体特异性抗体。 
本发明还包括能够进行同位素标记或用其他分子或蛋白质标记的，用于检测和观察血管生成抑制素结合位点的血管生成抑制素肽片段及类似物，其中用于检测和观察的技术包括但不只限于正电子发射X线断层照相术、放射自显影、流式细胞计数法、放射受体结合检测法及放射组织化学法。 
这些血管生成抑制素肽和类似物也可用作血管生成抑制素受体的激动剂和拮抗剂，从而提高或阻断血管生成抑制素的生物学活性。这些肽可用于分离血管生成抑制素受体。 
本发明还包括为治疗和研究目的与细胞毒性剂连接的血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素抗血清，或血管生成抑制素受体激动剂及血管生成抑制素受体拮抗剂。另外，可将血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素抗血清、血管生 成抑制素受体激动剂及血管生成抑制素受体拮抗剂与医药上可接受的赋形剂，及选择性缓释化合物或组合物例如生物可降解的聚合物组合在一起，制成治疗组合物。 
本发明还包括参与血管生成抑制素转录和转译之核糖核酸及脱氧核糖核酸的分子探针。这些分子探针提供了用于检测和测定组织和细胞中血管生成抑制素生物合成的工具。 
因此，本发明的一个目的是提供包含血管生成抑制素的组合物。 
本发明的另一个目的是提供治疗由血管生成抑制素介导之疾病和过程的方法。 
本发明的再一个目的是提供用于检测体液或组织中血管生成抑制素的存在或含量的诊断或预测方法及药盒。 
本发明的另一个目的是提供治疗由血管生成介导的疾病和过程的方法和组合物，这些疾病和过程包括但不只限于血管瘤、实体肿瘤、血液系统肿瘤、白血病、转移瘤、毛细管扩张、牛皮癣、硬皮病、脓性肉芽肿、心肌血管生成、克罗恩氏病、斑样神经血管化、冠血管旁系生成、脑血管旁系生成、动静脉畸型、缺血性肢血管生成、角膜病、潮红、神经血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织形成、关节炎、糖尿病性神经血管形成、黄斑退化、伤口愈合、消化性溃疡、螺旋菌相关疾病、骨折、瘢痕瘤、血管生成、血细胞生成、排卵、月经来潮、胎盘形成及猫抓伤热。 
本发明的另一个目的是提供治疗肿瘤或抑制肿瘤生长的组合物。 
本发明的再一个目的是提供调节或模拟在体内或体外产生血管生成抑制素之酶的生成或活性的化合物。 
本发明的再一个目的是通过给需要血管生成抑制素或抗血管生成抑制素抗体的人或动物直接注射血管生成抑制素DNA来提供这样的血管生成抑制素或抗血管生成抑制素抗体。 
本发明的再一个目的是提供检测和定量体液中对血管生成抑制素特异性抗体的存在。 
本发明的再一个目的是提供由对血管生成抑制素分子的不识别纤溶酶原的特异性区域有选择性的抗血管生成抑制素抗体组成的组合物。 
本发明的再一个目的是提供检测或预测癌症的方法。 
本发明的再一个目的是提供用于在体内和体外观察和定量血管生成抑制素结合位点的组合物。 
本发明的再一个目的是提供用于检测和定量血管生成抑制素生物合成的组合物。 
本发明的再一个目的是提供有最小付作用的癌症治疗方法。 
本发明的再一个目的是提供包含与用来治疗癌症或抑制癌生长之细胞毒性剂连接的血管生成抑制素或血管生成抑制素片段的组合物。 
本发明的再一个目的是提供向特定位置定点释放血管生成抑制素相关组合物的方法。 
本发明的再一个目的是提供用于为调节血管生成过程而进行基因治疗的组合物和方法。 
在评阅下列已公开的实施方案和待批权利要求的详细描述后，将会更清楚地了解本发明的这些和其他目的、特征和优点。 
附图的简要说明 
图1显示鼠纤溶酶原的全氨基酸序列，即SEQ ID NO：1。 
图2显示小鼠血管生成抑制素的起始部分序列(SEQ ID NO：2)，并与相应的人(SEQ ID NO：3)、恒河猴(SEQ ID NO：4)、猪(SEQ ID NO：5)和牛(SEQ ID NO：6)纤溶酶原肽片段的序列相比较。首先列出的是小鼠序列，然后是人、恒河猴、猪和牛。 
图3(A和B)显示在有或没有原发瘤的情况下，肺中肿瘤细胞的BrdU标记指数。 
图4显示Lowis原发性肺肿瘤对体内bFGF推动的血管生成之影响的Matrigel分析。 
图5显示得自带Lewis肺癌(LLC-Low)小鼠之血清对得自正常小鼠之血清的剂量反应曲线。在bFGF推动的72小时增殖试验 中检测牛毛细血管内皮细胞。 
图6(A和B)显示低和高转移瘤在其腹水中含有内皮促有丝分裂活性，但只有低转移瘤在血清中具有内皮抑制活性。 
图7(A和B)显示从带瘤动物体中部分纯化的血清或尿的C4反相层析图形。 
图8显示用完整纤溶酶原分子、从人纤溶酶原的赖氨酸结合位点I制剂得到的活性部分、浓缩的带瘤小鼠的尿和浓缩的正常小鼠的尿处理小鼠13天后肿瘤肺表面转移情况。 
图9显示用人纤溶酶原的完整纤溶酶原分子、赖氨酸结合位点I制剂的活性部分、浓缩的带瘤小鼠的尿和浓缩的正常小鼠的尿处理13天后小鼠的肺重量。 
图10图解显示pTrcHis载体。 
图11显示用抗人纤溶酶原Kringle区域1-3的单克隆抗体探查的，来自10L按比例增加的发酵液的大肠杆菌表达之人血管生成抑制素的免疫印迹。箭头显示重组人血管生成抑制素。A)显示用0.2M氨基已酸洗脱的重组血管生成抑制素；B)显示最后用1×PBS洗脱赖氨酸柱的洗脱物；C)显示从破碎的细胞得到的澄清溶胞产物。 
图12图解显示作为储备液稀释度函数的生长的牛毛细血管内皮细胞的百分抑制率；A1、A2、B1、B2和E是表达人血管生成抑制素抗血管生成活性的重组克隆；C1、C2、D1和D2对照是只含有载体而没有编码血管生成抑制素之人DNA序列的阴性对照克隆。 
图13显示重组人血管生成抑制素对牛毛细血管内皮细胞增殖的体外抑制作用。 
图14显示在除去原发肿瘤并用盐水或具有抗血管生成活性的烟曲霉素类似物处理后的生长增殖指数和编程性细胞死亡指数。图15(A、B和C)显示一次体内注射40mg/kg/天量的人血管生成抑制素后，对小鼠T241原发肿瘤生长的抑制率。 
图16(A、B和C)显示以每剂40mg/kg两次体内注射人血管生成抑制素(80mg/kg/天)后，对小鼠体内LLC-LM原发肿瘤生长的抑制率。 
图17显示除去Lewis肺原发肿瘤对其肺转移的影响。 
图18显示肿瘤切除后的生长增殖和编程性细胞死亡指数。 
图19显示给带有移植的T241纤维肉瘤细胞的小鼠投用血管生成抑制素蛋白质对作为时间之函数的总肿瘤体积的影响。 
图20显示给带有移植的Lewis肺癌(LM)细胞的小鼠投用血管生成抑制素蛋白质对作为时间函数之总肿瘤体积的影响。 
图21显示给带有移植的网状细胞肉瘤细胞的小鼠投用血管生成抑制素蛋白质对作为时间之函数的总肿瘤体积的影响。 
图22显示给移植的人前列腺癌PC-3细胞的免疫缺陷性SCID小鼠投用血管生成抑制素蛋白质对作为24天期间之时间函数的总肿瘤体积的影响。 
图23显示给带有移植的人乳腺癌MDA-MB细胞的免疫缺陷性SCID小鼠投用血管生成抑制素蛋白质对作为24天期间之时间函数的总肿瘤体积的影响。 
图24图解显示编码衍生于小鼠纤溶酶原cDNA之小鼠血管生成抑制素蛋白质的小鼠DNA序列克隆程序。小鼠血管生成抑制素包括小鼠纤溶酶原Kringle区域1-4。PCR是指聚合酶链反应；P1是用于PCR的5′末端寡核苷酸引物；P2是用于PCR的3′末端寡核苷酸引物；SS是指单链序列；ATG是转译起始密码子；TAA是转译终止密码子；HA代表血凝素表位尾部(YPYDVPDYASL)；K1、K2、K3和K4分别代表小鼠纤溶酶原Kringle区域1、2、3和4；CMV是巨细胞病毒启动子；T7是细菌噬菌体启动子；PA代表前活化肽；SP6是Sp6启动子。 
图25图解显示非被转染的细胞(模拟的)、单用没有编码血管生成抑制素之DNA序列的载体(载体5)转染的细胞、以及两个表达血管生成抑制素的克隆(AST31和AST37)，作为时间(天数)之函数的细胞数目。(a)图代表转染T241细胞的结果。(b)图显示转染LL2细胞的结果。 
图26显示培养含有血管生成抑制素克隆之大肠杆菌细胞得到的培养基对细胞数目的影响。其中包括未被转染的细胞(模拟的)； 单用没有编码血管生成抑制素的载体(载体5)转染的细胞；和三个表达血管生成抑制素的克隆(AST25、AST31和AST37)。(a)图代表保温对照组(模拟的)和所有血管生成抑制素克隆(表达和非表达的)的培养基对细胞数目的影响。(b)图代表保温对照组(模拟的)和单独载体(载体6)及表达小鼠血管生成抑制素之血管生成抑制素克隆的培养基对细胞数目的影响。(c)图代表保温对照组(模拟的)和表达小鼠血管生成抑制素之血管生成抑制素克隆的纯化的培养基对细胞数目的影响，其中培养基被加于赖氨酸-琼脂糖柱上纯化以产生赖氨酸结合成分。 
图27显示对作为小鼠体内植入T241纤维肉瘤细胞时间的函数的总肿瘤体积的影响，其中纤维肉瘤细胞已被含有编码血管生成抑制素蛋白质之DNA序列的载体转染，并且该载体能够表达血管生成抑制素蛋白质。“未被转染的”是指植入小鼠体内的未改变的T241纤维肉瘤细胞。“载体6”代表只用不含编码血管生成抑制素蛋白质之DNA序列的载体转染的，植入小鼠体内的T241纤维肉瘤细胞。“克隆25，克隆31和克隆37”代表用含有编码血管生成抑制素蛋白质之载体转染的，植入小鼠体内的三个T241纤维肉瘤细胞的血管生成抑制素生产克隆。 
发明的详细描述 
本发明包括用于检测和治疗由血管生成介导的或与血管生成相关的疾病和过程的组合物及方法。所说的组合物是可从包括但不只限于血清、尿和腹水的体液中分离的，或以化学或生物学方法(如细胞培养、重组基因表达、肽合成，以及体外酶促催化纤溶酶原或纤溶酶以产生活性血管生成抑制素)合成的血管生成抑制素。重组技术包括使用聚合酶链反应(PCR)从DNA来源扩增基因，以及使用反转录酶/PCR从RNA来源扩增基因。血管生成抑制素抑制血管向组织如未生成血管的或已有血管生成的肿瘤中生长。 
本发明还涉及包括载体的组合物，其中载体含有编码血管生成抑制素的DNA序列并且当该载体存在于细胞中时能够表达血管生 成抑制素，以及包括含有载体之细胞的组合物，其中所说的载体含有编码血管生成抑制素或其片段或类似物的DNA序列，并且其中当载体存在于细胞中时便能够表达血管生成抑制素，以及包括将含有载体的细胞植入人或非人类动物体内的方法，其中所说的载体含有编码血管生成抑制素的DNA序列，并且其中当载体存在于细胞内时便能够表达血管生成抑制素。 
另外，本发明还包括与医药上可接受的赋形剂以及选择性缓释化合物或组合物如生物可降解的聚合物结合，以形成治疗组合物的血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成素抗血清、血管生成抑制素受体激动剂或血管生成抑制素受体拮抗剂。特别是本发明包括含有与血管生成抑制素特异结合之抗体的组合物，其中所说的抗体不与纤溶酶原结合。 
更具体地说，本发明包括称为血管生成抑制素的蛋白质，其为分子量约为38至45千道尔顿(KD)，能够在体外克服内源性生长因子如bFGF之血管生成活性的蛋白质。如经还原聚丙烯酰胺凝胶电泳所测知的血管生成抑制素具有大约38千道尔顿至45千道尔顿的分子量，并且具有基本上相似于从完整的鼠纤溶酶原分子之氨基酸序号98处开始的鼠纤溶酶原片段的氨基酸序列。术语“基本上相似”当用于血管生成抑制素氨基酸序列时，是指具有抗血管生成活性并且具有大约38KD至45KD之分子量的，而且也与在小鼠纤溶酶原的大约氨基酸序号98处开始的分子量约38KD至45KD的小鼠纤溶酶原的肽片段有高度序列同源性的氨基酸序列。高度同源性是指至少约有60％氨基酸同源性，较好至少有大约70％氨基酸同源性，并且最好至少有大约80％氨基酸同源性。术语“内皮抑制活性”在本文中是指一种分子总地抑制血管生成，例如在有成纤维细胞生长因子的培养物中抑制牛毛细血管内皮细胞生长的能力。 
图1和SEQ ID NO：1中显示了完整鼠纤溶酶原分子的氨基酸序列。血管生成抑制素的序列开始于其大约氨基酸序号98处。活性人血管生成抑制素可开始于完整人纤溶酶原分子的氨基酸97或99处。小鼠血管生成抑制素之前339个氨基酸的氨基酸序列示于 图2(SEQ ID NO：2)中，并与来自人(SEQ ID NO：3)、恒河猴(SEQID NO：4)、猪(SEQ ID NO：5)及牛(SEQ ID NO：6)纤溶酶原的相应纤溶酶原肽片段的序列相比较。假使这些序列的氨基酸有50％以上是完全相同的，可理解到血管生成抑制素的氨基酸序列在种间是基本上相似的。血管生成抑制素中氨基酸总数尚不完全清楚，但可以根据活性分子的分子量限定这一数目。本发明血管生成抑制素的氨基酸序列可依据纤溶酶原分子所来源的种的不同而有所差异。因此，尽管本发明的衍生于人纤溶酶原的血管生成抑制素与衍生于小鼠的血管生成抑制素稍有序列差异，但如在小鼠肿瘤模型中所显示的，其同样有抗血管生成活性。 
已证明血管生成抑制素能够在体外抑制内皮细胞的生长。血管生成抑制素并不抑制衍生于其他类型之细胞系的生长。特别是，血管生成抑制素对Lewis肺癌细胞系、水貂肺表皮细胞、3T3成纤维细胞、牛主动脉平滑肌细胞、牛视网膜色素上皮细胞、MDCK细胞(犬肾上皮细胞)、W138细胞(人胎肺成纤维细胞)、EEN细胞(鼠胎成纤维细胞)和LM细胞(母鼠结缔组织)没有作用。带瘤小鼠体内的内源性血管生成抑制素以大约每公斤体重10mg的全身浓度使用时可有效地抑制肿瘤转移。 
血管生成抑制素具有由纤溶酶原分子的Kringle区域限定的特定三维构象(Robbins，K，C.，“The plasminogen-plasmin enzymesystem”Hemostasis and Thrombosis，Basic Principles and Practice，2nd Edition，ed.by Colman，R.W.et al.，J.B.Lippincott Company，PP.340-357，1987)。在纤溶酶原分子的NH2末端部分有5个这样的Kringle区域，这些区域是构象上相关的基元并且有实质上的序列同源性。认为血管生成抑制素的三维构象包括纤溶酶原Kringle区域1至3和Kringle区域4的一部分。纤溶酶原分子的每个Kringle区域均含有大约80个氨基酸及3个二硫键已知在其他生物学活性蛋白质中存在这一半胱氨酸基元。这些蛋白质包括但不只限于凝血酶原、肝细胞生长因子、分散因子(scatter factor)和巨噬细胞刺激蛋白(Yoshimura，T，et al.，“Cloning，sequencing，and ex- pression of human macrophage stimulating protein(MSP，MSTI)Con-firms MSP as a member of the family of Kringle proteins and Locatesthe MSP gene on Chromosome 3”，J.Biol.Chem.，Vol.268，No.21，pp.15461-15468，1993)。预期具有体内抗血管生成活性的任何具有三维Kringle样构象或半胱氨酸基元的分离的蛋白质或肽均包括在本发明范围内。 
本发明还包括为诊断或预测疾病例如癌症的目的而检测体液和组织中血管生成抑制素的方法。本发明还包括检测细胞与组织中的血管生成抑制素结合位点和受体。本发明还包括通过给病人投用基本上纯化的血管生成抑制素，或血管生成抑制素激动剂或拮抗剂，和/或血管生成抑制素抗血清或抗血管生成抑制素抗血清的抗血清，以治疗或预防关节炎和肿瘤等血管生成疾病及过程的方法。其他治疗方法包括投用与细胞毒性剂连接的血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素类似物、血管生成抑制素抗血清，或血管生成抑制素受体激动剂和拮抗剂。应明确的是，血管生成抑制素可以是动物或人来源的。也可以通过化学反应或与表达系统合用的重组技术合成产生血管生成抑制素。也可以经酶促裂解分离的纤溶酶原或纤溶酶产生具有抗血管生成活性的肽，以生产血管生成抑制素。也可以由模拟将纤溶酶原裂解成血管生成抑制素之内源性酶的作用的化合物产生血管生成抑制素。也可以由影响纤溶酶原裂解酶之活性的化合物来调节血管生成抑制素的产生。 
可以使用与血管生成抑制素特异结合的被动抗体疗法来调节例如生殖、发育和伤口愈合及组织修复等血管生成依赖性过程。另外，可以投用抗血管生成抑制素抗体之Fab区域的抗血清，以阻断内源性血管生成抑制素抗血清与血管生成抑制素结合的能力。 
本发明还包括基因疗法，借以调节病人体内的编码血管生成抑制素的基因。Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo，N.Yang，Crit，Rev.Biotechn.12(4)：335-356(1992)中描述了称为基因治疗的，向细胞内转移或输送DNA以表达基因产物蛋白质的各种方法(该文列为参考文献)。基因治疗包括将DNA序列掺入体 细胞或生殖系细胞中，用于来自体内或体内治疗。基因治疗的作用是替换基因、放大正常或异常基因功能，及对抗感染性疾病及其他病理学改变。 
以基因治疗法处理这些医学问题的策略包括识别有缺陷的基因，然后加入功能性基因以替换有缺陷基因的功能，或放大减弱的功能性基因等治疗策略；或者加入编码某产物蛋白质的基因，借以处理相关的病理条件，或使组织或器官对某疗法更为敏感等预防策略。预防策略的一个例子是可以将血管生成抑制素基因置于病人体内，从而防止血管生成过程的发生；或者可以插一个使肿瘤细胞对放射治疗更敏感的基因，然后再照射肿瘤时将会提高对肿瘤细胞的杀伤。 
本发明中可望使用许多转移血管生成抑制素DNA或血管生成抑制素调节序列的方法。作为基因治疗的方法，也可想到转染除正常发现与血管生成抑制素相联系者以外的启动子序列，或其他可增加血管生成抑制素蛋白质产生的序列。这一技术的一个例子是见于Transkaryotic Therapies，Inc.(Cambridge，Massachusetts)的技术，其中使用同源重组插入一个接通细胞中红细胞生成素基因的“基因开关”。这样的“基因开关”可用于激活正常情况下不表达血管生成抑制素(或血管生成抑制素受体)之细胞中的血管生成抑制素(或血管生成抑制素受体)。 
用于基因治疗的基因转移方法分成物理学(例如电穿孔、直接基因转移和颗粒轰击)、化学(脂质基载体或其他非病毒载体)及生物学(病毒衍生的载体和受体摄入)这三大类方法。例如，可以使用的非病毒载体包括由DNA包被的脂质体。可以将这种脂质体/DNA复合物直接静脉注射到病人体内。一般认为脂质体/DNA复合物集中在肝中，由这里将DNA输送到巨噬细胞和Kupffer细胞中。这些细胞是长期存活的并因而可提供被输送之DNA的长期表达。此外，载体或基因的“裸露的”DNA可直接注射到所需器官，组织或肿瘤中，以有目标的释放治疗用DNA。 
也可以依据输送部位来描述基因治疗方法学。输送基因的基本方式包括来自体内的基因转移，体内基因转移，和体外基因转移。在 来自体内的基因转移中，从病人体内取得细胞并使之在细胞培养物中生长。将DNA转染到细胞中，扩增被转染之细胞数目后重新植入病人体内。在体外基因转移中，被转化的细胞是生长于培养物中的细胞，例如组织培养细胞和来自特定病人体内的非特定细胞。转染这些“实验室细胞”后选择并扩充被转染的细胞，以便植入病人体内或作其他使用。 
体内基因转移包括将DNA导入存在于病人体内的病人细胞中。方法包括使用非感染性病毒介导的基因转移法以在病人体内释放基因，或者将裸露的DNA注射到病人体内的某一部位，由一定比例的细胞摄取该DNA并在其中表达基因产物蛋白质。此外，也可使用本文所述的其他方法，例如可使用“基因枪”在体外插入血管生成抑制素DNA或血管生成抑制素调节序列。 
基因治疗的化学方法可包括不一定是脂质体的脂质基化合物，以越过细胞膜运送DNA。使用脂转染剂或细胞转染剂(即与带负电荷的DNA结合的脂质基阴离子)，制成可越过细胞膜并向细胞内提供DNA的复合物。另一种化学方法是利用受体基胞吞作用，包括使特异性配体结合到细胞表面受体上，并包膜并穿过细胞膜运输之。配体与DNA结合并将整个复合物输送到细胞内。将配体基因复合物注射到血流中，然后具有受体的靶细胞即可特异地结合配体并将配体-DNA复合物输送到细胞内。 
许多基因治疗方法学都是利用病毒载体将基因插入细胞内。例如，已在来自体内的方法中使用经过改变的反转录病毒载体将基因导入外周和肿瘤侵润淋巴细胞、肝细胞、表皮细胞、肌细胞，或其他体细胞中。然后将这些改变的细胞引入病人体内，以在体内提供由被插入的DNA编码的基因产物。 
也已使用病毒载体以体内方法将基因插入细胞中。为了指导外来基因的组织特异性表达，可以使用已知为组织特异性的顺式作用调节元件或启动子。或者，也可经在体内向特定解剖部位原位释放DNA或病毒载体而达到这一目的。例如，在体内基因向血管中的转移是通过将体外转导的内皮细胞植入动脉壁上的选定部位而达到 的。病毒感染的周边细胞也可表达基因产物。例如可以借助一个导管将病毒载体直接送到体内部位，从而只使某些区域被病毒感染，并提供长期的位点特异性基因表达。也已在乳腺组织和肝组织中证明了可将改变的病毒注射到导入器官的血管内，从而利用反转录病毒载体进行体内基因转移。 
已用于基因治疗方法中的病毒载体包括但不只限于反转录病毒、其他DNA病毒例如脊髓灰质炎病毒或新培斯病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、SV40、痘苗病毒及其他DNA病毒。复制缺陷性鼠反转录病毒载体是最广泛使用的基因转移载体。鼠白血病反转录病毒由与核的核心蛋白和多聚酶(pol)复合的单链RNA组成，该RNA被蛋白核心(gag)包装并由决定宿主范围的糖蛋白外膜(env)所环绕。反转录病毒的基因组结构包括gag、pol、及被5′和3′长末端重复区(LTR)所包围的env基因。反转录病毒载体系统揭示了这样一个事实，即含有5′和3′LTRs及包装信号的最小载体足以允许载体包装、感染并整合到靶细胞中，条件是在包装细胞系中以反式结构供应病毒结构蛋白质。用反转录病毒载体进行基因转移的基本优点包括可在大多数细胞类型中进行有效的感染和基因表达，使单拷贝载体准确地整合到靶细胞染色体DNA中，以及易于操作反转录病毒基因组。 
腺病毒由与核心蛋白质复合的线性双股DNA组成，并环绕有衣壳蛋白质。分子病毒学的进展已导致可以开发这些生物体的生物学功能，用以创造能够在体内将新的基因序列转导到靶细胞内的载体。基于腺病毒的载体将以高水平表达基因产物肽。腺病毒即使在低病毒滴度条件下也具有高的感染效率。另外，该病毒作为无细胞病毒颗粒是有全感染性的，所以不必注射病毒生产细胞系。腺病毒载体的另一个潜在优点是能够在体内完成对异源基因的长期表达。 
DNA传输的机械方法可利用包括用于膜融合的融合脂质泡囊如脂质体或其他泡囊、掺入阳离子脂质如脂质转染剂之DNA的脂质颗粒、多聚赖氨酸介导的DNA转移、DNA直接注射如将DNA微量注射到生殖细胞或体细胞中、气动输送的DNA包被的颗粒如用 于“基因枪”中的金颗粒、以及无机化学手段如磷酸钙转染法。另一种配体介导的基因治疗方法包括使DNA与特异性配体复合以形成配体-DNA结合物，从而将DNA导向特定细胞或组织中。 
已发现将质粒DNA注射到肌肉细胞可使高比例的细胞被转染并可持续表达标记基因。质粒的DNA可以被或不被整合到细胞的基因组中。已转染之DNA的非整合将允许基因产物蛋白质在终末分化的、非增殖的组织中的长期转染和表达，而不会使细胞或线粒体基因组发生突变性插入、缺失或改变。治疗基因长期但不一定永久地转移到特定细胞中可用于对遗传性疾病的治疗或预防。可分阶段再注射DNA以维持基因产物水平，而接受体细胞的基因组不会发生突变。外源DNA的非整合可允许在一个细胞中存在几种不同的外源DNA构建体，同时所有的构建体均可表达不同的基因产物。 
颗粒介导的基因转移方法最初被用于转化植物组织。借助颗粒轰击装置或“基因枪”，产生一种加速DNA包被之高密度颗粒(如金或钨)达到高速度的动力，使之穿透靶器官、组织或细胞。颗粒轰击可用于体外系统，借助来自体内的或体内的转移技术将DNA导入细胞、组织或器官中。 
用于基因转移的电穿孔是使用电流制得对电穿孔介导的基因转移敏感的细胞或组织。使用有给定电流强度的简单电脉冲增加膜的通透性，以这种方式DNA分子即可穿透到细胞中。这一技术可用于体外系统，或借助来自体内的或体内的转移技术将DNA导入细胞、组织或器官中。 
可使用载体介导的体内基因转移将外源DNA转染到细胞中。可以将载体-DNA复合物方便地导入体液或血流中，然后位点特异性地引向体内的靶器官或组织。可使用脂质体和例如多聚赖氨基、脂质转染剂或细胞转染剂等多聚阳离子。可发展细胞特异性的或器官特异性的脂质体，这样由脂质体携带的外来DNA便可被靶细胞摄入。可以注射以某些细胞上的特异性受体为目标的免疫脂质体，以此作为将DNA插入带受体之细胞中的方便方法。已使用的另一个载体系统是用于将DNA带向肝细胞以进行体内基因转移的脱唾 液酸糖蛋白/多聚赖氨酸结合物系统。 
也可以将已转染的DNA与其他类型的载体结合，从而将DNA带向接受体细胞，然后定居在胞质或核质中。可以将DNA偶联到特异性工程化泡囊复合物中并直接带入核中。 
可以投用与血管生成抑制素基因结合的化合物，或与血管生成抑制素基因相联系的控制区域，或其相应的RNA转录物以改变转录或转译速率，从而完成血管生成抑制素的基因调节。此外，可以使病人投用被编码血管生成抑制素的DNA序列转染的细胞，以提供一个血管生成抑制素的体内来源。例如，可以用含有编码血管生成抑制素之核酸序列的载体转染细胞。 
本文所用的术语“载体”是指可含有特定核酸序列的或与之相联系的运载体，其功能是将特定核酸序列输送到细胞内。载体的例子包括质粒和传染性微生物如病毒，或非病毒载体如配体-DNA结合物、脂质体、脂质-DNA复合物。可望将含有血管生成抑制素DNA序列的重组DNA分子可操作地连接到表达控制序列上，以形成能够表达血管生成抑制素的表达载体。被转染的细胞可以是衍生于病人之正常组织、病人的患病组织的细胞，或者可以是非病人细胞。 
例如，可用能够表达本发明的血管生成抑制素蛋白质的载体转染从病人中摘除的肿瘤细胞，然后重新导入病人体内。被转染的肿瘤细胞在病人体内以足可抑制肿瘤生长的水平产生血管生成抑制素。病人可以是人或非人动物。细胞也可以是由非载体材料，或本领域已知的物理或化学方法如电穿孔、离子穿孔或通过“基因枪”转染的。另外，可以不借助载体将血管生成抑制素DNA直接注射到病人体内。具体地说，可将血管生成抑制素DNA注射到皮肤、肌肉或血流中。 
将血管生成抑制素转染到病人体内的基因治疗方法可以通过将血管生成抑制素DNA整合到细胞的基因组中或微型染色体中，或作为细胞之胞质或核质中的分离的复制或非复制DNA构建体来完成。血管生成抑制素的表达可长期持续进行，或者定期反复注射以在细胞、组织或器官中维持血管生成抑制素蛋白质的所需水平或预 定的血液内水平。 
可以在HPLC C4柱上分离血管生成抑制素(见表3)。以30-35％乙腈梯度洗脱血管生成抑制素蛋白质。基于在还原条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析，有活性蛋白质带是作为约38千道尔顿的单一峰洗脱的。 
本发明人已证明生长的原发肿瘤与内皮细胞增殖特异性抑制剂(包括能抑制在转移范围以内的血管生成，从而抑制转移瘤本身的生长的血管生成抑制素)向血流中的释放相关。与原发肿瘤相关的血管生成抑制素的来源是未知的，该化合物可通过用特异性蛋白酶降解纤溶酶原来产生，或者血管生成抑制素可能通过编码血管生成抑制素之特定基因的表达来产生。 
原发肿瘤的血管生成表型取决于血管生成肽以超过由正常细胞产生之内皮细胞抑制物的量生成，但据信其在向瘤生成转化期间受到向下调节。虽然血管生成抑制素在个别肿瘤细胞中的产生相对于由其亲代细胞类型产生可能受到下调，但由整个肿瘤合成的抑制物的总量是可进入循环并抑制微量转移之远距离部位的内皮生长。循环中的血管生成抑制素可比由原发肿瘤释放的血管生成肽保持明显更长的时间。因此，血管生成肽似乎是在局部起作用，而血管生成抑制素则在全身起作用并且以相对长的半衰期在血液中循环。血管生成抑制素的半衰期约为12小时至5天。 
虽然并不拘泥于下列推想，但据信当肿瘤逐渐有血管生成时便释放出一种或多种血管生成肽(例如aFGF、bFGF、VEGF、IL-8、GM-CSF等)，其局部作用于来自血管外方向的原发肿瘤附近的靶内皮，并且不进入循环(或者以短的半衰期循环)。为使原发肿瘤继续扩充其群体，这些血管生成肽必须以足可克服内皮细胞抑制物(血管生成的抑制物)之作用的量产生。一旦这些原发肿瘤充分生长，它便继续向循环中释放内皮细胞抑制物。根据这一假设，这些抑制物远距离作用于离开原发肿瘤的，从血管内方向开始的转移部位的靶毛细血管内皮，并继续进入循环。因此，恰是在远距离转移瘤开始生成血管时，其邻近部位的毛细血管内皮即受到新进入的血管生成抑 制素的抑制。 
一旦原发肿瘤达到了足以引起血管生成抑制素连续向循环中释放的大小时，第二次肿瘤移植(微量转移)便难以开始或增加其自身的血管生成。如果在原发肿瘤植入后的短时间内发生第二次肿瘤植入(例如植入皮下，或角膜，或经静脉内转移到肺)，则原发肿瘤将不能抑制次生肿瘤生长(因为次生肿瘤中的血管生成一直在进行中)。如果同时植入两个肿瘤(例如在相反的两侧)，则抑制物可能对彼此有等同的抑制作用。 
本发明的血管生成抑制素可以： 
(i)作为抗血管生成治疗剂投用于带肿瘤的人或动物； 
(ii)作为诊断标记监测人或动物血清、尿或组织；以及 
(iii)用作分析肿瘤病人血清和尿中相似血管生成抑制分子的基础。 
作为本发明的一部分，其包括可从病人的血液或尿等体液中分离的血管生成抑制素或可用本领域已知的重组DNA方法或肽化学合成方法生产的血管生成抑制素。蛋白质纯化方法是本领域已知的，下文实施例中提供了纯化血管生成抑制素，及检测抑制物活性之方法的特定实例。可使用相似的技术完成人内源性血管生成抑制素的分离。 
使用重组DNA技术生产血管生成抑制素之方法的一个实例包括以下步骤：(1)按上文讨论的并在下文中更详细描述的方法鉴定和纯化血管生成抑制素，(2)确定纯化之抑制物的N末端氨基酸序列，(3)合成得到血管生成抑制素序列的5′和3′DNA寡核苷酸引物，(4)使用聚合酶扩增血管生成抑制素基因序列，(5)将扩增的序列插入适当的载体如表达载体中，(6)将含有基因的载体导入微生物或其他能够表达抑制物基因的表达系统中，以及(7)分离重组产生的抑制物。适当的载体包括病毒、细菌或真核生物(如酵母)表达载体。上述这些技术在实验室手册例如Sambrook et al.，“Molecular Cloming：ALaboratory Manual”2th Eeition，Cold Spring Harbor Press，1989中有更详细的描述。已公开了人纤溶酶原的DNA序列(Browne，M.J.et al.，“Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplas-minogen in HeLa cells”，Fibrinolysis Vol.5(4)，257-260，1991)和列入本文作为参考。 
也可以用下述方法从高水平表达血管生成抑制素的细胞或组织(例如肿瘤细胞)中分离血管生成抑制素的基因：(1)从组织中分离信使RNA，(2)使用反转录酶产生相应的DNA序列，然后(3)使用聚合酶链反应(PCR)，以适当的引物扩增编码活性血管生成抑制素氨基酸序列的DNA序列。 
生产血管生成抑制素或其生物学活性片段的另一种方法是使用肽合成技术。一旦按下文详述的检测系统找到了血管生成抑制素的生物学活性片段，即可例如用肽自动测序方法测定其序列。或者，一经使用按上述方法分离了编码血管生成抑制素的基因或DNA序列，即可使用本领域已知的手工或自动测序方法确定DNA序列。反过来核酸序列也可提供有关氨基酸序列的信息。因此，如果用特殊方法例如胰酶消化法产生了生物学活性片段，或者测定了片段的N末端序列，即可根据相应的DNA序列确定其余的氨基酸序列。 
一旦知道了肽的氨基酸序列，即可用本领域已知的技术，例如E.Atherton and R.C.Sheppard，IRL Press，Oxford，England中所介绍的固相肽合成技术(“Solid Phase Peptiole Synthesis：A PracticalApproach”)合成所说的片段。同样，可合成多个片段，然后将其连接在一起形成较大的片段。也可以合成在特定位置有氨基酸取代的这些合成肽片段，以试验体内和体外激动和拮抗活性。可以使用对组织具有高度亲和性的肽片段从亲和柱上分离血管生成抑制素受体。分离和纯化血管生成抑制素受体是阐明血管生成抑制素作用机制的基本步骤。分离血管生成抑制素受体和鉴定血管生成抑制素激动剂及拮抗剂将有利于开发用于调节血管生成抑制素受体(发挥生物学活性的最后途径)的活性。受体的分离得以构建核苷酸探针，从而可使用原位和溶液杂交技术监测受体的定位及合成。此外，可以分离血管生成抑制素受体的基因，掺入表达载体中并转化到细胞例如病人肿瘤细胞内，以提高细胞、组织或肿瘤与血管生成抑制素结合并抑 制局部血管生成的能力。 
血管生成抑制素可有效地治疗由血管生成介导的或涉及血管生成的疾病或过程。本发明包括用有效量的血管生成抑制素或其生物学活性片段，或共同具有抗血管生成活性的组合的血管生成抑制素片段，或血管生成抑制素激动剂和拮抗剂治疗血管生成介导的疾病的方法。血管生成介导的疾病包括但不只限于实体瘤；血源肿瘤如白血病；肿瘤转移；良性肿瘤例如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，及化脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼的血管生成性疾病例如糖尿病性视网膜病、早熟的视网膜病、黄斑退化、角膜移植物排斥、神经血管性青光眼、晶状体后纤维组织形成、潮红；Osler-Web-ber综合症；心肌血管生成；斑块神经血管生成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤及伤口肉芽生成。血管生成抑制素可用于治疗因内皮细胞过多或异常刺激所致的疾病。这些疾病包括但不只限于肠粘连、Crohn氏病、动脉粥样硬化、硬皮病及肥大性瘢痕即瘢痕瘤。血管生成抑制素可因阻止胚胎植入所需的血管生成而用作生育控制剂。血管生成抑制素可用于治疗具有例如因猫抓伤病(Rochele mi-nalia quintosa)或溃疡病(Helicobacter pylori)所致之病理学后果的血管生成的疾病。 
血管生成抑制素的合成肽片段具有多种不同的用途。放射标记以高特异性和亲和力与血管生成抑制素受体结合的肽，并借以使用放射自显影和膜结合技术观察和定量结合位点。这一应用提供了重要的诊断和研究工具。对血管生成抑制素受体之结合性质的了解有助于研究与受体相关联的转导机制。 
另外，用短半衰期同位素标记的血管生成抑制素有可能利用正电子发射X线断层法或其他先进的放射照相技术在体内显现受体结合位点，以定位有血管生成抑制素结合位点的肿瘤。 
系统取代这些合成肽内的氨基酸，可产生血管生成抑制素受体的高亲和力肽激动剂和拮抗剂，以增加或减少与其受体结合的血管生成抑制素。可使用这样的激动剂抑制微量转移的生长，从而限制肿瘤的扩散。在血管生成不足的情况下应用血管生成抑制素的拮抗 剂以阻断血管生成抑制素的抑制作用并促进血管生成。例如，这种处理方法可具有促进糖尿病人伤口愈合的治疗作用。 
利用血管生成抑制素肽展开从培养的肿瘤细胞中分离血管生成抑制素受体的亲和柱。在分离并纯化血管生成抑制素受体后进行氨基酸序列分析。可基于这一信息鉴定并分离编码血管生成抑制素受体的基因。然后将克隆的核酸序列插入到能够表达该受体的载体中。这些技术都是本领域技术人员熟知的。将编码血管生成抑制素受体的核酸序列转染到肿瘤细胞中，并由被转染的肿瘤细胞表达该受体，以提高这些细胞对内源性或外源性血管生成抑制素的反应性并进而降低转移生长的速率。 
将细胞毒性剂如蓖麻蛋白连接到血管生成抑制素及高亲和性血管生成抑制素肽片段上，从而提供用于破坏结合血管生成抑制素之细胞的工具。可以在包括但不只限于微量转移和原发肿瘤在内的许多位置见到这些细胞。以造成最大化释放的方式将与细胞毒性剂连接的肽输注到所需的部位。例如，通过套管将蓖麻蛋白连接的高亲和性血管生成抑制素片段输送到导向靶部位的血管中或直接导向靶部位。也可以通过与输注导管连接的渗透泵以受控制的方式释放这些药剂。也可以将组合的血管生成抑制素拮抗剂与血管生成刺激剂合用，以增加组织的血管生成。这一疗法可有效地破坏转移性癌症。 
血管生成抑制素可与其他用于治疗疾病的组合物和方法合用。例如，可常规使用外科手术、放射治疗或化学疗法连同血管生成抑制素治疗肿瘤，然后给病人投用血管生成抑制素以继续扩展对微量转移灶的控制，并稳定和抑制残存原发肿瘤的生长。此外，可将血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素抗血清、血管生成抑制素受体激动剂、血管生成抑制素受体拮抗剂或其混合物与药学上可接受的赋形剂、适当的缓释基质如生物可降解的聚合物组合，制成治疗组合物。 
所使用的缓释基质通常是由聚合物等材料制得的，可经酶促或酸/碱水解或溶解而降解的基质。一旦引入体内，基质即受到酶和体液的作用。缓释基质可选自生物相容性材料，例如脂质体、聚交酯 (聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、乳交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、多聚氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮及硅氧烷。优选的生物可降解基质是选自聚交酯、聚乙交酯、聚交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)。 
本发明的血管生成调节治疗组合物可以是固体、液体或气雾化形式的，并可按任何已知的给药途径给药。固体治疗组合物的例子包括丸剂、乳膏及可植入的剂量单位。丸剂可经口服给药，治疗性乳膏可表面给药。可植入的剂量单位可在局部例如肿瘤部位给药，或者可以植入皮下以便全身释放治疗用血管生成调节组合物。液体组合物的例子包括适于皮下、静脉内、关节内注射的配制品，及适于表面或眼内给药的配制品。气雾剂的例子包括肺部给药的吸入剂。 
本发明的血管生成抑制素还可用于产生对抑制物和其受体特异的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。可以将这些与血管生成抑制素或血管生成抑制素受体特异结合的抗体用于本领域技术人员熟知的诊断方法及药盒中，借以检测或定量体液或组织中的血管生成抑制素或血管生成抑制素受体。可使用这些试验的结果来诊断或预测肿瘤及其他血管生成所介导的疾病的发生或复发。 
也可将血管生成抑制素用于检测和定量能够结合血管生成抑制素之抗体的方法和药盒中。这些药盒可以检测循环血管生成抑制素抗体，借以指示在由原发瘤于原位分泌的血管生成抑制素存在下出现的微量肿瘤转移传播。有这种循环抗血管生成抑制素抗体的病人很可能发展多发肿瘤和癌症，并且很可能在进行一段时间的治疗后出现肿瘤复发。可使用这些抗血管生成素抗体Fab片段作为抗原以产生可用于中和抗血管生成抑制素抗体的抗血管生成抑制素Fab片段血清。可用这种方法，减少抗血管生成抑制素抗体对循环血管生成抑制素的排除，从而有效地提高循环血管生成抑制素水平。 
本发明的另一个方面是涉及阻断过量内源性血管生成抑制素之作用的方法。为此可使用对系统内不需要的血管生成抑制素特异的 抗体来被动免疫人或动物。这种方法对于治疗异常排卵、月经和胎盘形成，以及血管生成是很重要的，并为检测血管生成抑制素排除对肿瘤转移过程的影响提供了有用的手段。血管生成抑制素抗体的Fab片段含有血管生成抑制素的结合位点。可使用本领域已知的技术从血管生成抑制素抗体中分离该片段。可使用血管生成抑制素抗血清的Fab片段作为抗原以产生抗Fab片段抗血清。输注这种针对抗血管生成抑制素Fab片段的抗血清可阻止血管生成抑制素与血管生成抑制素抗体结合。可经阻断血管生成抑制素与抗血管生成抑制素之Fab片段的结合，中和内源性抗血管生成抑制素抗体而达到治疗目的。这种方法的净效果是有利于提高内源性循环血管生成抑制素达到靶细胞的能力，从而减少转移瘤传播。 
应明确的是，本发明意欲包括具有内皮抑制活性之血管生成抑制素的任何衍生物。本发明包括完整的血管生成抑制素蛋白质、血管生成抑制素蛋白质的衍生物及血管生成抑制素蛋白质的生物学活性片段。其中包括具有氨基酸取代的或带有与氨基酸功能基团连接之糖链或其他分子的有血管生成抑制素活性的蛋白质。本发明还包括编码血管生成抑制素和血管生成抑制素受体的基因及由这些基因表达的蛋白质。 
可以作为按本领域技术人员已知的配制方法得到的药用配制品中的分离的和基本上纯化的蛋白质和蛋白质片段来提供有上述血管生成抑制素活性的蛋白质和蛋白质片段。可按常规途径投用这些配制品。一般说来，可合用表面、透皮、腹腔内、颅内、脑室内、脑内、子宫内、阴道内、口腔、直肠或胃肠道外(如静脉内、脊髓内、皮下或肌肉内)等途径给药。另外，可将血管生成抑制素掺入用于缓慢释放化合物的生物可降解的聚合物内，将聚合物植入希望释放药物的邻近部位例如肿瘤部位，以缓慢地全身释放血管生成抑制素。也可以利用渗透微泵使药物通过插管受控制地以高浓度释放到感兴趣的部位，例如直接导向转移生长部位或导入进入肿瘤的血管内。例如在Brem et al.，J.Neurosurg.74：441-446(1991)(引用其全文作为参考)中详细描述了生物可降解的聚合物及其应用。 
本发明血管生成抑制素的剂量取决于疾病状态、被处理的病理条件及其他临床因素，例如人或动物的体重和一般状况，以及给药途径等。为治疗人或动物，可投用0.5mg/kg至500mg/kg的血管生成抑制素。依据血管生成抑制素在特定动物或人体内的半衰期，可以每天几次或每周一次给药。应明确的是，本发明适用于人和脊椎动物。本发明的方法欲包括单一或多种药物同时或相继给药。 
血管生成抑制素配制品包括适于口服、直肠内、眼内(包括晶体内或眼房内)、鼻内、表面(包括口腔或舌下)、子宫内、阴道内或胃肠道外(包括皮下、腹腔内、肌肉内、静脉内、皮内、颅内、气管内及硬膜腔内)途径给药的配制品。血管生成抑制素配制品可以作为单位剂量形式存在并可用常规制药技术制得。这些技术包括使活性成分与医药上可接受的载体或赋形剂结合的步骤。一般说来，可使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体均匀地和密切的结合制成配制品，然后在必要时制成成形产品。 
适于胃肠道外给药的配制品包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂及可使配方与病人的血液有等渗压之溶质的液体和非液体无菌注射溶液；以及可包括悬浮剂和增稠剂的液体和非液体无菌悬液。配制品可以存在于单剂量或多剂量的容器例如密封的安瓶和小瓶中，并可制成冻干品，使用前只要加入无菌液体载体例如注射用水即可。可以从前述的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时使用的注射溶液和悬液。 
优选的单位剂量配制品是含有每日剂量或单位的、每日亚剂量的或其适当部分之给药成分的配制品。应明确的是，除了上面特别提到的成分外，本发明的配制品还可含有常规用于这种类型配方中的其他药剂。例如可以加入细胞毒性剂，或与血管生成抑制素或其生物学功能肽片段组合，以提供双重治疗效果。 
可以按标准微量化学手段和以HPLC及质谱法检查的纯度来合成本发明的血管生成抑制肽。肽合成、HPLC纯化及质谱法都是本领域技术人员已知的。也可以在重组大肠杆菌或酵母表达系统中生产血管生成抑制素肽和血管生成抑制素受体肽，并用柱层析法纯 化之。 
可以合成完整血管生成抑制素分子的不同的肽片段，这些肽片段的应用包括但不只限于：作为诱导产生特异性抗血清的抗原、作为在血管生成抑制素结合位点上有活性的激动剂和拮抗剂、作为可以与细胞毒性剂连接或合用的肽，用于有针对性的杀伤结合血管生成抑制素的细胞。可以基于其在分子之外部区域上的位置来选择包含这些肽的氨基酸序列，以便于与抗血清结合。在所合成的片段中分别代表血管生成抑制素的氨基和羧基末端，以及分子的中间区域。 
使用蛋白质序列数据库例如GenBank、Brookhaven Protein、SWISS-PROT及PIR，将这些肽序列与已知的序列相比较，以确定可能的序列同源性。这一信息有利于排除与其他分子上表现有高度序列同源性的序列，从而在开发血管生成抑制素的抗血清、激动剂和抑制剂中提高特异性。 
可以使用标准方法将血管生成抑制素和血管生成抑制素衍生的肽偶联到其他分子上。血管生成抑制素的氨基和羧基末端均含有酪氨酸和赖氨酸残基，并可使用多种技术进行同位素和非同位素标记，例如用常规技术(酪氨酸残基-氯胺T、iodegen、乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)进行放射标记。这些偶联技术都是本领域技术人员已知的。或者，可以将酪氨酸或赖氨酸加到没有这些残基的片段上，以便于标记肽分子上的反应性氨基和羟基基团。基于氨基酸上可利用的功能性基团选择偶联技术，这些基团包括但不只限于氨基、巯基、羧基、酰胺、苯酚和咪唑。用于影响这些偶联的各种试剂包括戊二醛、重氮化的联苯胺、碳化二亚胺和对苯醌。 
将血管生成抑制素与同位素、酶、载体蛋白质、细胞毒性剂、荧光分子、化学发光剂、生物发光剂及其他化合物偶联，以提供多种应用。使用适于特定反应的不同技术来确定偶联反应的效率。例如，使用有高比活性的氯胺T和Na125I完成用125I对血管生成抑制素肽的放射标记。用焦亚硫酸钠终止反应并在一次性使用的柱上将混合物脱盐。从柱上洗脱标记的肽并收集各部分。从各部分取等份试样并在γ计数器中测放射活性。以这种方法，从标记的血管生成抑制素肽 中分离未反应的Na125I。储存有最高比放射活性的肽部分，以用于继后的分析，例如用于分析其与血管生成抑制素抗血清结合的能力。 
肽结合物的另一个应用是用于生产多克隆抗血清。例如使用戊二醛将含有赖氨酸残基的血管生成抑制素肽连接到纯化的牛血清白蛋白上。经检测放射性标记之肽的掺入来确定反应的效率。透析分离未反应的戊二醛和肽。将结合物储存备用。 
可以产生抗血管生成抑制素、血管生成抑制素类似物、血管生成抑制素之肽片段及血管生成抑制素受体的抗血清。在肽合成和纯化后，使用本领域技术人员已知的技术引发产生多克隆和单克隆抗血清。例如可以在兔、绵羊、山羊或其他动物体内产生多克隆抗血清。可以将结合于牛血清白蛋白等载体分子上的血管生成抑制素肽，或血管生成抑制素本身与佐剂混合物合用，乳化后，皮下注射于背部、颈部、协腹部的多个部位，有时也可注射于动物的足垫中。以例如2至4周的间隔期进行加强注射。每次注射后约7至10天经静脉穿刺，例如从扩张后的耳缘静脉采取血液样品。使血样于4℃过夜凝固，并于4℃下以大约2400xg离心约30分钟。除去血清，等分后于4℃下保存以备短时内使用，或者于-20至-90℃保存留待以后的分析使用。 
对产生多克隆抗血清的所有血清样品和生产单克隆抗血清的培养基样品进行分析以确定抗体滴度。通过几种手段确定溶度，例如使用点印迹和密度分析法，也可以用蛋白A、第二抗血清、冷乙醇或活性碳-葡聚糖沉淀放射标记的肽-抗体复合物，然后再用γ计数器测定活性。也可以在市购的亲和层析柱上纯化最高滴度抗血清。使血管生成抑制素肽偶联到亲和柱中的凝胶上。使抗血清样品通过柱，而抗血管生成抑制素抗体仍结合于柱上。然后洗脱这些抗体，收集后检测其溶度和特异性。 
试验最高溶度血管生成抑制素抗血清以确定：a)对抗原有最高特异性结合并有最低非特异性结合的最适抗血清稀释度；b)在顶替标准曲线中结合渐增量之血管生成抑制素肽的能力，c)与包括纤溶酶原及相关种动物之血管生成抑制素在内的相关肽和蛋白质的可能 的交叉反应性，d)检测血浆、尿、组织和细胞培养基之提取物中之血管生成抑制素肽的能力。 
检测血管生成抑制素和血管生成抑制素受体的药盒也将包括在本发明范围内。进一步检查具有最高溶度和特异性并可检测血浆、尿和组织，以及细胞培养基之提取物中血管生成抑制素肽的抗血清，将很容易建立用于迅速、可靠、灵敏并特异地检测和定位血管生成抑制素的药盒。这些检测药盒包括但不只限于使用以下技术：竞争和非竞争检测法、放射免疫法、生物发光检测法、化学发光检测法、荧光检测法、夹心检测法、免疫放射检测法、点印迹法、包括用于迅速监测尿或血液的ELISA、微量溶定板、抗体包被条或测杆在内的酶联测定法、以及免疫细胞化学检测法。对每种药盒均要确定其使用范围、灵敏性、精确度、可靠性、特异性及再现性。在顶替或活性标准曲线上于20％、50％和80％点位置确定测定内和测定间的变化。 
常用于研究和临床中检测药盒的一个例子是放射免疫试验(RIA)药盒。以下举例说明血管生成抑制素RIA检测法。在成功地进行放射碘标记并纯化血管生成抑制素或血管生成抑制素肽后，向在适当缓冲系统中含有相对恒定量放射活性(例如10,000cpm)的试管中以几个不同的稀释度加入有最高溶度的抗血清。其他试管则含有缓冲液或预免疫血清，以确定非特异性结合。4℃保温24小时后，加入蛋白A并旋转试管，室温下保温90分钟，并于4℃下以大约2000-2500xg离心，以沉淀出与标记之抗原结合的抗体复合物。抽吸除去上清液并在γ计数器中计数沉淀物中的放射活性。进一步鉴定减去非特异性结合后结合大约10-40％标记肽的抗血清稀释液的特征。 
然后，向含有放射标记肽和抗血清的试管内加入已知量的血管生成抑制素肽，以估计用于产生抗血清的该肽的稀释度范围(约为0.1pg至10ng)。继续保温一段时间，例如24至48小时后，加入蛋白A并离心该试管，除去上清并计数沉淀中的放射活性。由未被标记的血管生成抑制素肽(标准品)取代放射标记的血管生成抑制素肽的结合作用，得到标准曲线。向检测试管中加入几个浓度的其他血 管生成抑制素肽片段、纤溶酶原、和来自不同种动物的血管生成抑制素，以及同源肽，以分析血管生成抑制素抗血清的特异性。 
使用已成功地用于提取血管生成抑制素的提取技术从包括但不只限于原发和继发肿瘤、Lewis肺癌、血管生成抑制素生产细胞的培养物、胎盘、子宫、以及脑、肝和肠等其他组织的各种组织中制备提取物。在冻干或真空离心蒸发浓缩(Speedvac)组织提取物后，加入检测缓冲液并分成不同等份置于RIA试管内。已知血管生成抑制素生产细胞的提取物产生与标准曲线平行的顶替曲线，而不产生血管生成抑制素之组织的提取物则不从血管生成抑制素抗血清中置换放射标记的血管生成抑制素。另外，以渐增的量向检测试管中加入得自带Lewis肺癌之动物的尿、血浆及脑脊液的提取物。平行顶替曲线表明了血管生成抑制素检测法检测组织和体液中之血管生成抑制素的实用性。 
另外还对等分样品进行反相HPLC分析，以进一步鉴定含血管生成抑制素的组织提取物。收集洗脱部分，在真空离心蒸发浓缩器中干燥，加RIA缓冲液重新溶解并用血管生成抑制素RIA检测法分析之。最大量的血管生成抑制素免疫反应性存在于血管生成抑制素洗脱位置所对应的各管中。 
检测药盒中备有使用说明书、抗血清、血管生成抑制素或血管生成抑制素肽、及可能的放射标记的血管生成抑制素和/或用于沉淀未结合之血管生成抑制素-血管生成抑制素抗体复合物的试剂。药盒可用于检测患有或没有肿瘤之动物和人的生物体液和组织提取物中的血管生成抑制素。 
另一种药盒是用于定位组织和细胞中的血管生成抑制素。该血管生成抑制素免疫组织化学药盒提供有使用说明书、血管生成抑制素抗血清，和可能的封闭血清及与用来观察第一抗血清存在的荧光分子例如异硫氰酸荧光素，或某些其他试剂连接的第二抗血清。免疫组织化学技术是本领域技术人员已知的。该血管生成抑制素免疫组织化学药盒允许使用光学和电子显微镜定位组织切片和培养的细胞中的血管生成抑制素。其可用于研究和临床目的。例如，活体解 剖或收集肿瘤并用切片机切制组织切片，以检查血管生成抑制素产生的部位。在检测和治疗癌症中，这些资料可用于诊断及可能的治疗目的。观察血管生成抑制素生物合成之位点的另一种方法包括放射标记用于原位杂交的核酸，以探查血管生成抑制素信使RNA。同样，也可以用免疫组织化学技术定位、观察并定量血管生成抑制素受体。 
借助下列实施例进一步举例描述本发明，但这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。相反，很显然，在阅读本说明书后，可提示本领域技术人员在不背离本发明的精神和/或待批权利要求范围的情况下对本发明作出各种其他修改和改动。 
实施例1
选择一个其中转移瘤的生长受到原发瘤的抑制并在除去原发瘤后加速转移瘤生长的动物-肿瘤系统 
经筛选各种能够抑制其自身转移的小鼠肿瘤，选择出其中原发瘤最有效地抑制肺转移的Lewis肺癌。给同基因C57B16/J六周龄雄性小鼠注射(背部皮下)1×106个肿瘤细胞。3-4天后第一次出现可见的肿瘤。当肿瘤长到大约1500mm3时，将小鼠随机分成两组。第一组完全切除原发病，第二组则在假手术后留下整个肿瘤。虽然500mm3至3000mm3大小的肿瘤抑制转移瘤的生长，但1500mm3原发瘤是以高存活率被安全切除并且不发生局部复发的最大原发瘤。 
21天后杀死所有小鼠并进行尸体解剖。在带有完整原发瘤的小鼠体内有4+2个可见的转移灶，而在已切除了肿瘤的小鼠体内则有50+5个转移灶(p＜0.0001)。如前已证明的，与肿瘤生长密切相关的肺脏重量进一步证实了这些数据。与留有完整原发瘤的小鼠相比，已切除了肿瘤的小鼠净肺脏重量增加了400％(p＜0.0001)。 
该实验模型给出可再现的数据，并且所述的实验是可以重复的。该肿瘤被标记为“Lewis肿瘤-低转移性”(LLC-Low)。在缺乏B和T淋巴细胞的SCID小鼠中，肿瘤也以几乎完全相同的模式抑制 转移。 
实施例2
分离无论是否除去了原发瘤均高度转移的Lewis肺癌的变体 
在一组小鼠中从实施例1的LLC-Lwo细胞系自发产生Lewis肺癌的高转移变体，按照实施例1中所述的方法分离之并重复移植之。无论是否存在原发瘤，该肿瘤LLC-High)均形成30处以上的可见的肺转移。 
实施例3
小鼠体内转移瘤的大小和肿瘤细胞的增殖速率。抑制转移之原发瘤(LLC-Low)的影响。 
所有实验中均使用C57B16/J小鼠。小鼠皮下接种LLC-Low细胞，14天后切除半数小鼠的原发瘤。于切除肿瘤后的第5、10和15天杀死小鼠。得到肺转移的组织学切片。带有完整原发瘤的小鼠的肺中具有未形成神经血管的微量转移灶。这些转移瘤的直径限于12-15层细胞，并且甚至在除去肿瘤后的15天也没有显示明确的增大。相反，切除了原发瘤的动物早在手术后5天即出现大的有血管生成的转移瘤。到切除肿瘤后的第15天这些转移瘤的体积进一步增大4倍(如反映在肺脏重量的增加及组织学改变)。在实验结束前没有50％除去了原发瘤的动物死于肿瘤肺转移。所有带完整原发瘤的动物在实验结束时仍存活。 
计数被以前注入小鼠体内的BrdU着染的细胞核，确定转移灶内肿瘤细胞的复制速率。在带有完整原发瘤之动物的小的无血管的转移瘤中，掺入BrdU之肿瘤细胞的高百分率相当于已除去了原发瘤之小鼠的大的有血管生成的转移瘤中肿瘤细胞的BrdU掺入量(图3)。这一发现提示，原发瘤的存在对转移灶内肿瘤细胞的复制速率没有直接影响。 
图3中，左框显示在有或没有原发肿瘤的情况下肺中肿瘤细胞的BrdU标记指数。在进行免疫组织化学染色前，先将切片用0.2MHCl浸透10分钟，并在0.2M Tris-HCl、2mM CaCl2中用1μg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)于 37℃下消化15分钟。计数阳性核(250倍)的百分数以估计标记指数。图3的右框显示带有完整的原发瘤或手术切除原发瘤后5、10和15天时，对总肺肿瘤重量的分析结果。腹腔注射BrdU(0.75mg/小鼠)后6小时杀死动物。 
实施例4
在完整原发瘤存在下抑制肺转移灶中的血管生成。 
为了检测肺转移灶中肿瘤血管化的程度，用抗yon Willebrand因子的抗体(一种内皮特异性标记，得自Dako inc.，Carpenteria，CA)给组织染色。带有完整肿瘤之动物的转移灶围绕着已有肺血管形成薄的环带(8-12肿瘤细胞层)。除了血管内衬的内皮细胞，没有或很少细胞是yon Willebrand因子阳性的。相反，除去原发瘤后5天之动物的肺转移灶不仅较大，而且其中还充满了含内皮细胞(这些细胞呈现von Willebrand因子强染色)的毛细血管芽。 
在对肺转移灶中存在之内皮细胞的免疫组织化学分析中，接种后19天带完整的原发肺肿瘤之小鼠的肺转移灶中出现围绕已有微血管的肿瘤细胞环带。这些转移限于8-12个细胞层。没有环绕微血管的神经血管化的迹象，并且不含任何新的微血管。这是典型的最大体积无血管的血管生成前转移。 
在对切除原发瘤后5天(接种原发瘤后19天)收集的组织进行的免疫组织化学分析中，可见围绕着肺中已有血管的转移灶。相反，在已切除了原发瘤的样品中，则可见肿瘤有神经血管生成。因此，完整原发瘤抑制转移灶中新的毛细血管的生成，但转移灶中肿瘤细胞的增殖不受原发瘤的影响。 
实施例5
原发瘤抑制移植到小鼠角膜中之第二个肿瘤的血管生成。该第二个肿瘤的生长受到抑制。 
第0天将0.25至0.5mm2Lewis肺肿瘤(LLC-Low)植入小鼠角膜中(Muthukkaruppan Vr.，et al.，Angiogenesis in the mousecornea.Science 205：1416-1418，1979)。于角膜移植肿瘤前4或7天或在角膜移植肿瘤当天，或在角膜移植肿瘤后4或7天，经背部皮 下接种1×106个LLC-Low细胞而形成原发瘤。对照小鼠接受角膜移植物但没有皮下肿瘤。其他对照小鼠接受角膜移植物并于角膜移植前4天于背部接种LLC-High肿瘤细胞。每天用狭缝光源立体显微镜观察角膜肿瘤生长情况(用接目测微器测量)及由角膜边缘生长的新的毛细血管。 
在不带原发皮下肿瘤的对照小鼠中，从角膜植入后第6至7天开始，持续到第10天大部分角膜(6/8)发展了神经血管化。到第10天时，有血管生成的角膜肿瘤达到大约全眼的1/4体积。在原发皮下LLC-Low肿瘤存在下，如果原发瘤在角膜肿瘤植入前至少4天时仍在原位置，则角膜移植物并没血管形成(表1)。在没有神经血管化的情况下，角膜肿瘤生长缓慢，在角膜内呈薄的、白色的，无血管的园盘。 
然而，如果在角膜植入后4天时没有植入原发瘤，则角膜逐渐有血管生成，并且3/3的角膜肿瘤以如不带肿瘤之对照组动物一样的速率生长。在原发皮下LLC-High肿瘤存在下，从角膜植入后第7开始持续至第10天大部分角膜(2/3)出现了神经血管化。第10天时，有血管生成的角膜肿瘤再次达到约占全眼1/4的体积。 
表1 
原发皮下肿瘤对角膜中肿瘤血管生成的抑制作用[除标(＊)者为LLC-High外，所有原发瘤均为LLC-Low肿瘤] 
Figure BYZ000000919709700361
当原发LLC-Low皮下肿瘤在植入眼肿瘤前7天(即-7)被植入时，可望有0/10角膜将显示神经血管化。但其中2个肿瘤(2/10)已因太大(＞3cm3)而逐渐坏死。 
实施例6
完整原发瘤抑制由碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的次级皮下植入物诱导的血管生成。 
虽然实施例V和VI中所述的实验显示原发瘤抑制继发性转移瘤中的血管生成，但这些研究并没有揭示是否原发瘤：(i)直接抑制，或(ii)通过下调转移性肿瘤细胞的血管生成活性而间接抑制内皮增殖(或血管生成)。为了区分这两种可能性，经植入含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的matrigel来诱导皮下血管生成病灶(Passan-iti A.et al.，A simple，quantitative method for assessing angiogenesisand anti-angiogenic agent using recenstituted basement membrance，heparin and fibroblast growth factor，Lab Invest.67：519，1992)。 
在肝素存在下将含有25或50ng/mlbFGF的Matrigel(一种基底膜蛋白质提取物)皮下注射到正常和带瘤小鼠(LLC-Low)的腹部表面。4天后杀死小鼠并检测凝胶中的血红蛋白浓度，以定量血管生成水平。前已显示进入matrigel中之新血管的数目与血红蛋白浓度相关(Folkman J.，Angiogenesis and its inhibitors，“ImportantAdvances in Oncology 1985”，VT Devita，S.Hellman and S.Rosen-berg，ed.J.B.Lippincott，philadelphia，1985)。还制备了一些用于组织学检查的凝胶。在正常小鼠中，含有50ng/ml bFGF的matrigel沉淀物完全是红色的。它们受到新生毛细血管的严重侵入，并含有2.4g/dl血红蛋白。缺乏bFGF的matrigel是半透明的和灰色的，并只含有0.4g/dl血红蛋白(相差6倍)。相反，从带有原发瘤小鼠体内得到的matrigel则只含有0.5g/dl血红蛋白(图4)。 
在本实验中几乎完全抑制血管生成表明，存在Lewis肺原发肿瘤可直接抑制bFGF诱导的血管生成。 
实施例7
将来自带瘤动物的血清转输到已切除了原发瘤的动物体内以抑制肿瘤转移。 
按上述方法给小鼠移植Lewis肺癌。15天后，当肿瘤体积约为1500mm3时将小鼠随机分成4组。3组完全切除了原发瘤；1组保留肿瘤(假外科手术处理)。然后3组切除肿瘤的小鼠每天接受腹腔 内注射的盐水、正常非带瘤小鼠的血清，或带有1500mm3Lewis肺癌之小鼠的血清。留有完整肿瘤的一组小鼠接受腹腔内盐水注射。所有小鼠均处理21天，然后无痛处理动物并计数肿瘤转移灶数目。 
表2
Figure BYZ000000919709700381
这些结果得到肺脏重量的进一步证实。两组间的差异统计为P＝＜0.0001[(55和50)对(7和3)]。使用得自带瘤动物尿中的血管生成抑制素得到了相似的结果。 
实施例8
牛毛细血管内皮(BCE)细胞检测法 
只使用第9至14代的BCE细胞。于第0天，以12，500细胞/孔的浓度将BCE细胞铺敷在刚胶化的(1.5％明胶在PBS中于37℃，10％CO2环境下放置24小时，然后用0.5ml PBS淋洗)24孔平板上。使用血细胞计数器计数细胞。将细胞铺板在加有10％热灭活的(56℃处理20分钟)小牛血清和1％glutamine-pen-strep(GPS)的500μlDMEM中。 
按下述方法攻击BCE细胞：除去培养基并换成250μl DMEM/5％BCS/1％GPS。然后将待试样品加到各孔中(加入量依据待试样品的不同而不同)。将平板放于37℃/10％CO2条件下放置约10分钟。向各孔内加入含2ng/ml bFGF的250μl DMEM/5％BCS/1％GPS。最后的培养基是含1ng/ml bFGF的500μl DMEM/5％BCS/1％GPS。将平板重新放回37℃/10％CO2保温箱中保温72小时。 
第4天，除去培养基以计数细胞，然后用胰蛋白酶将各孔处理2-3分钟(0.5ml胰蛋白酶/EDTA)。将悬浮细胞转移到含有9.5ml Hemetall的闪烁瓶中并使用Coulter计数器计数。一活性单位是含有当将内皮细胞在1ng/ml bFGF中保温72小时，能够对毛细血管内皮增殖产生半最大抑制作用之血管生成抑制素的血清量。 
实施例9
带有低转移性Lewis肺癌(LLC-Low)之小鼠的血清在体外抑制毛细血管内皮细胞增殖。 
在72小时增殖试验中，用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，1ng/ml)刺激牛毛细血管内皮细胞。加到这些培养物中的带瘤小鼠的血清以剂量依赖性和可逆的方式抑制内皮细胞增殖。正常血清不是抑制性的(图5)。内皮细胞增殖以相似方式(相对于对照组)受到得自带瘤nu/nu小鼠和SCID小鼠之血清的抑制。除去原发瘤后，3-5天血管生成抑制素活性从血清中消失。 
带瘤动物的血清也抑制牛主动脉内皮细胞和衍生可自发小鼠血管内皮瘤的内皮细胞(Obeso，et al.，“Methods in Laboratory Investi-gation，A Hemangioendothelioma-derived cell line；Its use as a Medelfor the Study of Endothelial Cell Biology”，Lab Invest.，63(2)，259-269，1990)，但不抑制Lewis肺癌细胞、3T3成纤维细胞、主动脉平滑肌细胞、水貂肺表皮细胞或W138人胎肺成纤维细胞。 
实施例10
不抑制转移的带Lewis肺癌(LLC-High)之小鼠的血清，并不抑制体外毛细血管内皮细胞增殖。 
相对于对照组，带有LLC-High原发瘤之小鼠的血清并没有明显地抑制bFGF刺激的牛毛细血管内皮细胞的增殖。另外，当对该血清进行前两个步骤的纯化(肝素-Sepharose层析和凝胶过滤)时，各洗脱部分中均未见有血管生成抑制素活性。 
实施例11
Lewis肺癌(低转移性)小鼠的腹水也诱导产生血管生成抑制素血清。 
给小鼠腹腔内注射LLC-Low或LLC-High肿瘤细胞(106个)，一周后从10-20只小鼠体内各得到1-2ml血色腹水。可见其 中有转移瘤细胞接种。然后无痛处死小鼠。经心脏穿刺得到血清。也从作为对照的正常不带瘤小鼠体内得到血清。离心血清和腹水以除去细胞，并检测上清液对bFGF(1ng/ml)刺激的牛毛细血管内皮细胞增殖的影响(参见实施例IX)。72小时后来源于带两种类型肿瘤之小鼠的腹水刺激了明显超过对照组的毛细血管内皮细胞增殖(即100％增殖，参见图6)。相反，来源于带低转移瘤小鼠的血清则抑制内皮细胞增殖(其抑剂作用为对照组的79％)。带高转移瘤细胞系之小鼠的血清则有高达200％的刺激性。 
这些数据显示低转移瘤细胞系造成的腹水含有超过血管生成抑制素的内皮生长刺激物的优势。这种情况类似于实体原发瘤。此外，血管生成抑制素活性出现在血清中，似乎未受到刺激活性的对抗。这一模式相似于实体原发瘤(LLC-Low)。来自高转移瘤(LLC-High)的腹水也似乎含有优势内皮细胞刺激物，但在血清中未能鉴定出血管生成抑制素。 
实施例12
用柱层析法从血清中分级分离血管生成抑制素，并经SDS-PAGE分析生长抑制部分。 
为了纯化血管生成抑制素，合并得自带瘤小鼠的血清。然后使用肝素-Sepharose、Biogel A0.5mm琼脂糖和几轮C4反相高效液相层析(HPLC)相继层析分离按上述体外抑制活性试验法检测的抑制活性。对含有内皮抑制活性的HPLC部分进行SDS-PAGE，显示出表观还原分子量为38,000道尔顿的不连续的带，其大约被纯化106倍(见表3)，达到大约2x107的比活性。在纯化的不同阶段，用特异性抗体测试合并的各洗脱部分中是否有已知内皮抑制剂存在。在部分纯化或完全纯化的洗脱物中未发现有血小板因子4、血小板反应蛋白或转化生长因子β。 
表3 
Figure BYZ000000919709700411
＊1活性单位是含有当内皮细胞在bFGF1ng/ml中保温72小时，能够对毛细血管内皮增殖产生半最大抑制作用之血管生成抑制素的血清量。 
实施例13
用柱层析法从尿中分级分离血管生成抑制素并经SDS-PAGE分析生长抑制部分。 
从血清中纯化内皮细胞抑制物受到可从各小鼠体内得到的小体积血清及血清中的大量蛋白质的阻碍。 
分析得自带瘤小鼠的尿并发现其含有不带瘤小鼠和带有LLC-High肿瘤之小鼠的尿中所没有的内皮细胞增殖抑制物。利用纯化血清的相同手段(如上文所述)纯化内皮细胞抑制活性(图7)。 
图7显示对部分纯化之带瘤动物血清或尿进行的C4反相层析的结果。按照实施例IX中所述的72小时增殖试验法在加有bFGF的牛毛细血管内皮细胞上检验所有层析分离的部分。两种情况下，在30-35％乙腈洗脱的第23管中见到一个分立的抑制活性峰。对从第三轮C4反相层析分离带瘤动物的血清得到的抑制活性部分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果显示出一条约为38,000道尔顿的带。 
实施例14
鉴定循环血管生成抑制素的特征。 
按照实施例9中所述的方法检测内皮抑制作用。在Synchropak HPLC柱(Synchrom，Inc.Lafayettle，IN)上分离血管生成抑制素。以30-35％乙腈梯度处洗脱抑制物。在还原条件下(β-巯基乙醇，5％V/V)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，洗脱出38千道尔顿的有活性的蛋白质带。在非还原下洗脱出28千道尔顿的有活性的蛋白质。不管初始样品是从尿中还从血清中分离出来的均在相似点上发现活性。其他带的蛋白质则没有测到活性。 
当进行加热(100℃，10分钟)或用胰蛋白酶处理时，便丢失了与这些带相联系的活性。如用水/氯仿混合物(1∶1)提取有活性的带，发现活性只在水相中。 
实施例15
从人纤溶酶原中纯化抑制性片段。 
纤溶酶原赖氨酸结合位点I得自Sigma Chemical Company。制剂是用弹性蛋白酶消化后纯化的人纤溶酶原。以这种方法得到的赖氨酸结合位点I是含有聚集体形式的，至少有纤溶酶A链(Kringle 1+2+3)中前三个三联环结构(编号1至3)的肽的群体(Sotrrup-Jensen，L.，et al.Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis，Vol.3，191，Davidson，J.F.，et al.eds，Raven Press，New York 1978；Wiman，13，et al.，Biochemica et Biophysica Acta，579，142(1979))。将纤溶酶原赖氨酸结合位点I(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)重新悬浮于水中并加于已用HPLC级水/0.1％TFA平衡过的C4反相柱上。用水/0.1％TFA至乙腈/0.1％TFA的梯度洗，并将洗脱的各管内容物收集到聚丙烯试管中。在真空离心蒸发浓缩器中蒸发每一个等分部分，重新悬浮于水中，加于用来进行增殖试验的BCEs上。使用相似的洗脱梯度将抑制活性部分重新纯化两次。在最后一次过C4柱时使用30-35％乙腈梯度洗脱抑抑制活性部分。对抑制活性部分进行SDS-PAGE显示出3条表观还原分子量为40、42.5和45kd的分立的带。在非还原条件下进行SDS-PAGE则显示出3条分子量分别为30、32.5和35kd的带。 
实施例16
从SDS-PAGE中提取抑制活性。 
在非变性条件下进行SDS-PAGE，以进一步分离从人纤溶酶原中纯化的抑制活性部分。从凝胶上切下相当于用银染色法在加有同样样品的相邻泳道中所看到之带的凝胶区域，并在加有1ml磷酸盐缓冲盐水的聚丙烯管中于4℃保温12小时。除去上清并对盐水透析两次各6小时(MWCO＝6-8000)，再对蒸镏水透析两次各6小时。真空离心以蒸发透析液。将产物重新悬浮于盐水中，并加于用1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子刺激的牛毛细血管内皮细胞中测定72小时。分别从三条带中提取的蛋白质均抑制了毛细血管内皮细胞增殖。 
实施例17
纤溶酶原片段处理研究 
给小鼠移植Lewis肺癌，并在肿瘤为1500-2000mm3时切除之。手术当天将小鼠随机分成6组，每组6只小鼠。小鼠每天接受腹腔注射的三个纯化的人纤溶酶原抑制性片段、完整人纤溶酶原、带瘤动物的尿、正常小鼠的尿或盐水。给一组只经过假处理的带瘤小鼠注射盐水。除去原发瘤后，立即给小鼠腹腔内由注射24μg(1.2mg/kg/天/小鼠)作为上样剂量的抑制性纤溶酶原片段。然后在实验期间每天腹腔内注射12μg抑制性片段(0.6mg/kg/天/小鼠)。切除肿瘤后对照组小鼠接受同样剂量的完整纤溶酶原分子。为了进行尿处理，过滤、广泛透彻并冻干正常或带瘤小鼠的尿，然后重新悬浮在无菌水中得到250倍浓缩的尿液。在除去原发瘤的当天给小鼠两次腹腔内注射作为上样剂量的0.8ml来自带瘤小鼠或正常小鼠的经过透析的尿浓缩液。然后在整个实验过程中每天腹腔内注射0.4ml经过透析并浓缩的尿。继续处理13天，然后杀死动物并进行尸体解剖。 
实验结果示于图8和9中。图8显示经13天处理后的表面肺转移。表面肺转移是指尸体解剖时见于小鼠肺中之转移的数目。使用立体显微镜计数转移数目。图8显示所计数的表面肺转移的平均数和平均数的标准误。如图中所示，带有原发瘤的这组小鼠未见有 转移。已切除了原发瘤并用盐水处理的小鼠则显示有广泛转移。用人的纤溶酶原片段处理的小鼠未显示有肿瘤转移。用完整的纤溶酶原处理的小鼠显示有广泛转移，表明完整的纤溶酶原分子没有内皮抑制活性。用经过透析并浓缩的带瘤小鼠的尿处理的小鼠未出现肿瘤转移。用浓缩的正常小鼠的尿处理的小鼠则显示有广泛转移。测定肺的重要得到了相似的结果(图9)。 
实施例18
鼠和人血管生成抑制素的氨基酸序列 
在Applied Biosystem Model 477A蛋白质序列仪上检测从小鼠尿中分离的和人赖氨酸结合位点I片段制剂中分离的血管生成抑制素的氨基酸序列。用联机ABI Model 120A HPLC鉴定苯基酶硫因酸化氨基酸镏份。从鼠和人血管生成抑制素N末端序列和胰酶消化产物测得的氨基酸序列表明，血管生成抑制素的序列相似于在鼠纤溶酶原之氨基酸序号98处开始的序列。因此，血管生成抑制素的氨基酸序列是包含具有如用还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得分子量约为38千道尔顿至45千道尔顿之蛋白质的分子，并且具有基本上与在完整鼠纤溶酶原分子之氨基酸序号98处开始的鼠纤溶酶原片段相似的氨基酸序列。图1中显示了鼠血管生成抑制素的起始氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。该氨基酸序列的长度可能比图1中所示的序列稍长些或稍短些。 
N末端氨基酸分析和人赖氨酸结合位点I活性部分的胰酶消化产物(见实施例15)显示，该部分的序列开始于人纤溶酶原的大约氨基酸97或99处，并且人血管生成抑制素是与鼠血管生成抑制素同源的。人血管生成抑制素(开始于氨基酸98处)的初始氨基酸序列示于图2(SEQ ID NO：3)中。图2中将鼠和人血管生成抑制素的氨基酸序列与其他种动物如猪、牛和恒河猴纤溶酶原的相应内部氨基酸序列作了比较，表明这些种动物中存在血管生成抑制素。 
实施例19
人血管生成抑制素在大肠杆菌中的表达 
使用pTrcHisA载体(Invitrogen)(图10)得到高水平的。从trc 启动子开始受调节的转录，用以提高真核基因在大肠杆菌中的转译效率。表达与N末端镍结合的聚组氨酸尾部相融合的血管生成抑制素，以便于使用金属亲和树脂进行一步骤纯化。融合肽中的肠激酶切割识别位点允许继后从纯化的重组蛋白质上去掉N末端组氨酸融合肽。发现重组人血管生成抑制素蛋白质可结合赖氨酸，可与对Kringle区域1、2和3特异的单克隆抗体发生交叉反应，并且在体外抑制bFGF促成的内皮细胞增殖。 
为了构建插入片段，经反转录并使用聚合酶链反应(PCR)和特异性引物进行扩增，以从人肝mRNA制得编码人血管生成抑制素的基因片段。1131碱基对的产物编码人纤溶酶原的氨基酸93至470。将经过扩增的片段克隆到pTrcHisA的XhoI/KpnI位点中，并将所得到的构建体转化到XL-1B(得自Stratagene)大肠杆菌宿主细胞内。同时将只含有质粒载体pTrcHisA的对照克隆转化到XL-1B大肠杆菌宿主细胞内。将此克隆定名为载体对照克隆。按下述方法纯化两克隆。 
按以下方法选择表达菌落：使已用编码血管生成抑制素的基因转化的大肠杆菌菌落转移物生长于加有IPTG的硝化纤维素滤膜上并将滤膜叠置在LB琼脂板上。在用IPTG诱导表达后，溶解硝化纤维素滤膜上的菌落。封闭硝化纤维素转移物，淋洗并用两种分立的识别血管生成抑制素之特殊构象的单克隆抗体(单克隆抗体(MAb)Dcd和Vap；由S.G.McCance和F.J.Castellino(Vniversity ofNotre Dame)惠赠)探查之。选择由mAbs识别的强表达菌落。 
为了确定最大表达的适宜时间，在IPTG诱导前后的不同时间收集细胞并进行反复冻融，然后进行SDS-PAGE分析，并用单克隆抗体Dcd和Vap进行免疫印迹和探针杂交分析。 
从中选择出克隆pTrcHisA/HAsH4。用IPTG诱导4小时，然后收集细胞沉淀，将其重新悬浮在50mM Tris pH8.0、2mM EDTA、5％甘油和200mg/ml溶菌酶中并于4℃下搅拌30分钟。将此浆液以14,000rpm离心25分钟并将沉淀物重新悬浮在50mM Tris pH8.0、2mM EDTA、5％甘油和0.1％DOC中。将此悬液于4℃搅拌1小 时，然后以14,000rpm离心25分钟。该步骤得到的上清部分即含有所表达的血管生成抑制素。发现大肠杆菌表达的人血管生成抑制素具有天然血管生成抑制素的能够与赖氨酸结合的物理性质。以一步骤法在赖氨酸-Sepharose(Pharmacia或sigma)柱上纯化大肠杆菌表达的血管生成抑制素。用0.2Mε-氨基-正已酸(pH7.5)从柱上洗脱血管生成抑制素。 
在经过这些实验之后，对克隆pTrcHisA/HAsH4进行放大到10升的批量发酵。离心分离从该放大诱导得到的细胞并重新悬浮在50mM Tris(pH7.5)中，以10,000psi破碎细胞三次，并在每次处理之间于10℃下冷却。在4℃下以10,000rpm离心30分钟以澄清所得到的溶胞产物，并在赖氨酸-Sepharose柱上分离所表达的血管生成抑制素(图11)。 
将经过纯化的大肠杆菌表达的人血管生成抑制素对水彻底透析，然后冻干。将此被表达的人血管生成抑制素重新悬浮在培养基(DMEM，5％BCS，1％庆大霉素/青霉素/链霉素)中，达到估计约为3μg/ml的浓度，并用于如实施例8中所述的体外牛毛细血管内皮(BCE)细胞试验。同样，按处理克隆pTrcHisA/HAsH4的相同方法处理只含载体的对照克隆。同样用IPTG诱导，并将细菌溶胞产物用于结合赖氨酸，用0.2m氨基己酸洗脱，彻底透析并冻干。也以估计的3μg/ml的浓度将该对照制剂重新悬浮在培养基中。从不同的诱导、批量发酵及分离纯化过程得到的重组血管生成抑制素及对照样品均已在Entre Med，Maryland获得编号。在Children′s Hospital，Boston以双盲方式对这些编号的样品进行BCE试验。 
对重组人血管生成抑制素进行的BCE试验结果表明，在大肠杆菌中表达的人血管生成抑制素抑制由bFGF(用量为1ng/ml)引起的BCE细胞增殖(图12)。对培养基中的储备重组血管生成抑制素(约3μg/ml)进行1∶5、1∶10和1∶20倍稀释。 
按下列公式计算百分抑制率： 
Figure BYZ000000919709700461
其对BCE细胞增殖的百分抑制率与相似浓度的纤溶酶原衍生的血管生成抑制素的百分抑制率差不多或较高些。图13中显示了反复进行BCE试验所获得的结果，其中重组血管生成抑制素储备液的1∶5稀释液给出与使用纤溶酶原衍生之血管生成抑制素相似的百分抑制率。图13显示了这一令人惊奇的结果，其中人重组血管生成抑制素蛋白质抑制60％以上，甚至高达75％以上的培养的BCE增殖。 
实施例20
血管生成抑制素通过增加编程性细胞死亡的速率来保持微量转移的休止期。 
在给C57BL6/J小鼠皮下接种Lewis肺癌细胞(1x106)后，生长成大约1.5cm3的原发瘤。对动物进行原发瘤切除或假手术。在手术后第5、10和15天杀死小鼠并对其肺进行组织学检查。切除了原发瘤的动物比经过假手术的对照组动物表现有更大量的微量转移灶增殖(图14)。这些改变还伴有肺脏重量的显著增加。 
用6-氟脱搪尿苷(BrdU)摄入法分析肿瘤细胞增殖情况，于第5、9和13天显示带完整原发瘤的动物和切除了肿瘤的动物间没有差异，表明不能根据增加增殖率来解释肿瘤体积的增加(图15)。因此，检查了这些动物体内的细胞死亡情况。用末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)技术并借助免疫组织化学标记之DNA片段检查编程性细胞死亡——一个依赖于基因表达之改变的，并看作是发育期间细胞清除的以及发生在迅速增殖组织如小肠中的细胞死亡过程。在动物死亡的每个时间测定编程性细胞死亡指数。在所有检查期间，除去原发瘤均引起了编程性细胞死亡指数的统计学上的显著增加(约增加3-4倍)(图15)。 
用血管生成抑制素的外源抑制物处理已切除了原发瘤的小鼠，获得了进一步的支持性证据。所说的外源抑制物，即TNP-1470(0-氯乙酰氨基甲酰基烟曲霉醇，以前称为AGM-1470)是一种具有所报导的血管生成活性之烟曲霉素的类似物。皮下注射TNP-1470(每两天30mg/kg)所得到的结果与上述有完整原发瘤之动物的实验结果十分相似。与注射盐水的对照组动物相比，这些动物表现 有较低的肺重量，相当的增殖指数和增加了的编程性细胞死亡指数(图16)。 
这些数据表明，当肿瘤细胞增殖率与细胞死亡的等价速率相平衡对转移保持在休止状况。除去原发瘤引起转移灶生长的迅速增加，可能是由于除去了血管生成抑制物(血管生成抑制素)，从而因提高了肿瘤细胞编程性死亡速率而失去对转移灶生长的控制。这些效应是与除去原发瘤和投用外源血管生成抑制物后见到的效应相似的。总地说来，这些数据提示原发瘤释放可维持微量转移休止的血管生成抑制素。 
实施例21
用血管生成抑制素体内处理原发瘤。 
用如上文实施例15中所述的有限弹性蛋白酶消化法从人纤溶酶原中纯化血管生成抑制素。给六周龄雄性C57B16/J小鼠投用重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水中的血管生成抑制素，然后皮下接种1x106个Lewis肺癌或T241纤维肉瘤细胞。4天后当肿瘤大小为80-160mm2时开始用血管生成抑制素治疗。通过腹腔内(ip)或皮下(sc)途径给小鼠一次注射40mg/kg或两次注射80mg/kg血管生成抑制素。在治疗后的19天里于不同时间处死动物。 
以每日剂量40mg/kg(ip)投用血管生成抑制素对T241原发瘤的生长产生十分显著的抑制作用(图17)。这种抑制效果在两天内即可看到，并且在整个研究过程中成倍增加。到第18天，血管生成抑制素处理之小鼠肿瘤体积约为盐水处理之小鼠的肿瘤的38％。统计学上这一差异特别显著(p＜0.001，Students t试验)。 
血管生成抑制素处理(每天投用两次，每次40mg/kg，ip或sc，总剂量为80mg/kg/天)也显著地降低了LLC-LM原发瘤的生长速度(图17)。第4天见到这样的抑制效果，并且在以后的时间里可见这种成倍增加。在实验的最后一天(第19天)，血管生成抑制素处理的小鼠平均肿瘤体积仅为盐水处理之小鼠的20％，差异性显著(p＜0.001，Student t试验)。 
在另一个实验系列中，给移植了T241纤维肉瘤、Lewis肺癌 (LM)或网状细胞肉瘤细胞的小鼠投用血管生成抑制素(每12小时50mg/kg)。就每种类型的肿瘤细胞来说，接受血管生成抑制素的小鼠均明显减小了肿瘤体积。图19所示数据证明，在第24天带有T241纤维肉瘤的小鼠经用血管生成抑制素治疗后，其平均肿瘤体积仅为未经治疗之小鼠的15％。图20显示，在第24天带有Lewis肺瘤(LM)的小鼠经用血管生成抑制素治疗后其平均肿瘤体积仅为未经治疗之小鼠的13％。图21所示数据表明，在第24天带有网状细胞肉瘤的小鼠经用血管生成抑制素治疗后其平均肿瘤体积仅为未经治疗之小鼠的19％。所示数据代表在各时间点上4只小鼠的平均值。 
这些结果表明血管生成抑制素是三种不同原发瘤体内生长的极强抑制剂。 
实施例22
用血管生成抑制素体内处理人细胞衍生的原发瘤。 
研究了血管生成抑制素对两个人肿瘤细胞系，即人前列腺癌PC-3和人乳腺癌MDA-MB的作用。给免疫缺陷性SC1D小鼠移植人肿瘤细胞，基本上按实施例21中所述的方法每12小时用50mg/kg血管生成抑制素处理小鼠。结果证明本发明的血管生成抑制素蛋白质是人肿瘤细胞生长的强有力抑制剂。图21显示，在第24天时用血管生成抑制素处理的带人前列腺癌PC-3的小鼠平均肿瘤体积只是未经处理之对照组小鼠的2％。图23显示，在在第24天时用血管生成抑制素处理的带人乳腺癌MDA-MB的小鼠平均肿瘤体积只是未经处理之对照组小鼠的8％。 
实施例23
基因治疗——血管生成抑制素基因转染对肿瘤体积的影响。 
使用PCR技术产生从编码鼠纤溶酶原氨基酸1-460之小鼠纤溶酶原cDNA(得自American Type Culture Collection(ATCC))衍生的1380碱基对血管生成抑制素DNA序列，并插入到表达载体中。将表达载体转染到T241纤维肉瘤细胞中并将被转染的细胞植入小鼠体内。对照组小鼠接受未被转染的T241细胞或只用载体转染的 T241细胞(即不表达血管生成抑制素的转染的细胞)。实验中使用三个表达血管生成抑制素的被转染的细胞克隆。测定整个时间过程中的平均肿瘤体积。结果显示与使用未被转染的和非表达的对照细胞相比，表达血管生成抑制素的细胞克隆在小鼠体内可使其平均肿瘤体积显著降低。 
编码小鼠血管生成抑制素蛋白质的小鼠DNA序列衍生于小鼠纤溶酶原cDNA。小鼠血管生成抑制素包含小鼠纤溶酶原Kringle区域1-4。图24中显示了构建该克隆的程序。 
使用LIPOFECTINTM转染系统(可购自Life Technologies，Gaithersbury，MD)将小鼠血管生成抑制素蛋白质克隆转染到T241纤维肉瘤细胞中。LIPOFECTINTM试剂是加在膜过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-氯化三甲铵(DOTMA)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1(W/W)脂质体制剂。 
瞬时转染细胞的步骤如下： 
1.将T241细胞培养在60cm2组织培养皿中，种子细胞约为1-2x105个，加于添加有血清的适当生长培养基中。 
2.37℃在CO2孵箱中保温细胞，直至细胞达到40-70％汇合，保温时间一般为18-24小时，但具体时间将取决于不同细胞类型。T241肿瘤细胞汇合度约为70％。 
3.在12x75mm无菌试管中制备下列溶液： 
溶液A：各次转染中，将5μgDNA稀释在100μl无血清OPTI-MEM I还原血清培养基(可得自Life Technologies)中，(也可以使用组织培养级去离子水)。 
溶液B：为各次转染，将30μgLIPOEFECTN稀释在100μlOPTI-MEM培养基中。 
4.将两溶液合并，轻轻混合，并于室温下保温10-15分钟。 
5.用无血清培养基洗细胞两次。 
6.对每次转染，均将0.8ml无血清培养基加到每个含有LIPO-FECTINTM试剂一DNA复合物的试管中。轻轻混合并将混合物加 在细胞上。 
7.37℃下在CO2孵箱中将细胞保温大约12小时。 
8.用1mg/ml含有血清的选择培养基取代含DNA的培养基，并于37℃在CO2孵箱中保温48-72小时。 
9.转染后48-72小时检测细胞提取物的基因活性。 
可使用血管生成抑制素特异性抗体检测用于表达血管生成抑制素蛋白质的被转染细胞。或者，在大约10-14天后，G418抗性集落出现于CMV-血管生成抑制素转染的T241细胞中。另外，有许多克隆见于单用载体转染的克隆中，但不见于未被转染的克隆中。使用免疫荧光方法根据其血管生成抑制素的表达来选择G418抗性克隆。 
令人感兴趣的是，如图25和26中所示，用血管生成抑制素转染的T241细胞和Lewis肺细胞的体外细胞生长没有受到抑制或其他不利的影响。 
图27显示转染实验的结果。所有三个表达血管生成抑制素的T241转染的克隆均使小鼠的平均肿瘤体积比对照组小鼠的平均肿瘤体积有明显降低。植入克隆37之小鼠的平均肿瘤体积仅为对照组的13％，而植入克隆31和克隆25的小鼠平均肿瘤体积分别仅为对照组的21％和34％。这些结果证明可以将编码血管生成抑制素的DNA序列转染到细胞中，可由被植入的细胞中转染的DNA序列表达血管生成抑制素蛋白质，并且所表达的血管生成抑制素可在体内发挥抑制肿瘤生长的功能。 
实施例24
定位血管生成抑制素表达的体内部位 
为了定位血管生成抑制素蛋白质表达的体内部位，分析得自各种不同类型的细胞即Lewis肺癌细胞(小鼠)、T241纤维肉瘤(小鼠)和Burkitt′s淋巴瘤细胞(人)，包括新鲜肿瘤或几次传代后的细胞培养物的总RNA，以确定是否存在血管生成抑制素转录物。样品的Northern分析表明，除正常小鼠肝RNA外没有与所有样品中的其他序列杂交的信号，只是正常小鼠肝RNA给出一个相当于小鼠纤 溶酶原的约2.4Kb信号。人样品的Northern分析表明，除正常人肝RNA外没有与所有样品中之人血管生成抑制素序列杂交的信号，只是正常人肝RNA显示一个相当于人纤溶酶原的约2.4Kb信号。 
反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析显示，除了正常小鼠肝以外没有来自用小鼠血管生成抑制素序列探查之所有样品的任何产物。QT-PCR分析表明，没有来自除了正常人肝以外的用人血管生成抑制素序列探查之所有人样品的任何产物(预计小鼠的序列大小为1050bp，人的序列大小为1134bp)。 
因此可以看出，上述所有小鼠样品均没有产生小鼠血管生成抑制素转录物(推测其相当于小鼠纤溶酶原的氨基酸97至450)，并且上述人样品均没有产生人血管生成抑制素转录物(估计其相当于人纤溶酶原的氨基酸93至470)。在正常小鼠/人肝中得到的阳性信号是来自与纤溶酶原杂交的信号。 
实施例25
在酵母中表达血管生成抑制素 
将编码人纤溶酶原之氨基酸93至470的基因片段克隆到pHIL-SI(Invitrogen)的Xho/EcoRI位点中，以允许使用巴斯德毕赤(pichia pastoris)酵母中的PH01分泌信号分泌表达蛋白质。同样，将编码人纤溶酶原之氨基酸93至470的基因片段克隆到pPIC9(In-vitrogen)的SnaBI/EcoRI位点中，以允许使用巴斯德毕赤酵母中的α因子分泌信号分泌表达蛋白质。在这些系统中表达的血管生成抑制素蛋白质将具有许多比在大肠杆菌中表达者更好的优点，例如在蛋白质加工、蛋白质折迭以及包括糖基化在内的转译后修饰等方面。 
文献Sreekrishna，K.et al.(1988)High level expression of het-erologous proteins in methylotropic yeast Pichia pastoris，J.Basic Mi-crobiol.29(4)：265-278和Clare，J.J.et al.(1991)Production of epi-dermal growth factor in yeast：High-Level secretion using Pichia pas-toris strains containg multiple gene copies，Gene 105：205-212(两文献均列为本文参考文献)中描述了在巴斯德毕赤酵母中的基因表达。 
实施例26
血管生成抑制素蛋白质在转基因动物和植物中的表达 
创造表达血管生成抑制素基因转录物的如牛或猪家族的转基因动物。例如这些转基因动物可在其乳汁中表达血管生成抑制素蛋白质。另外也可构建表达血管生成抑制素基因转录物的可食转基因植物。 
Smith H.，Phytochrome transgenics：functional，ecological andbiotechnical applications，Semin.Cell.Biol.(1984)5[5]：315-325中描述了表达外来DNA之转基因动物的构建。 
应明确的是，上述内容只涉及本发明的优选实施方案，可以在不背离待批权利要求中所示本发明之精神和范围的前提下对本发明作出许多改动和改进。 
序列表 
(1)一般信息： 
(i)申请人：THE CHILDREN′S MEDICAL CENTER CORPO-RATION 
(ii)发明名称：血管生成抑制素及使用方法 
(iii)序列数：6 
(iv)通讯地址： 
(A)收件人：Jones&Askew 
(B)街：191Peachtree Street，37th Floor 
(C)城市：Atlanta 
(D)州：Georgia 
(E)国家：U.S. 
(F)邮编：30303-1769 
(v)计算机可读形式： 
(A)介质类型：Floppy盘 
(B)计算机：IBM PC兼容机 
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS 
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30 
(vi)目前申请资料： 
(A)申请号：US 
(B)申请日： 
(C)分类： 
(vii)在先申请资料： 
(A)申请号：US 08/248,629 
(B)申请日：26-APR-1994 
(vii)在先申请资料： 
(A)申请号：US08/326,785 
(B)申请日：20-OCT-1994 
(viii)律师/代理人信息： 
(A)名称：Johnson，James D. 
(B)登记号：31，771 
(C)参考/文档号：05213-0122 
(ix)电讯信息： 
(A)电话：404-818-3700 
(B)传真：404-818-3799 
(2)SEQ ID NO：1的信息： 
(i)序列特征： 
(A)长度：812氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(C)链型： 
(D)拓扑结构：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(iii)假设：无 
(vi)来源： 
(A)生物体：小鼠 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1： 
Met Asp His Lys Glu Val Ile Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Lys Pro 
1               5                   10                  15 
Gly Gln Gly Asp Ser Leu Asp Gly Tyr Ile Ser Thr Gln Gly Ala Ser 
            20                  25                  30 
Leu Phe Ser Leu Thr Lys Lys Gln Leu Ala Ala Gly Gly Val Ser Asp 
        35                  40                  45 
Cys Leu Ala Lys Cys Glu Gly Glu Thr Asp Phe Val Cys Arg Ser Phe 
    50                  55                  60 
Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Ser 
65                  70                  75                  80 
Lys Thr Ser Ser Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Ile Leu Phe Glu Lys 
                85                  90                  95 
Arg Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Ile Gly Asn Gly Tyr Arg 
            100                 105                 110 
Gly Thr Met Ser Arg Thr Lys Ser Gly Val Ala Cys Gln Lys Trp Gly 
        115                 120                 125 
Ala Thr Phe Pro His Val Pro Asn Tyr Ser Pro Ser Thr His Pro Asn 
    130                 135                 140 
Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gln 
145                 150                 155                 160 
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 
                165                 170                 175 
Asn Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met Tyr Cys Ser Gly Glu Lys 
            180                 185                 190 
Tyr Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gln Ala 
        195                 200                 205 
Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ala Lys Phe 
    210                 215                 220 
Pro Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys His Asn Pro Asp Gly Glu 
225                 230                 235                 240 
Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu Tyr 
                 245                 250                 255 
Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Thr 
            260                 265                 270 
Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser 
        275                 280                 285 
Val Thr Val Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro 
    290                 295                 300 
His Arg His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu 
305                 310                 315                 320 
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr 
                325                 330                 335 
Thr Thr Asp Ser Gln Leu Arg Trp Glu Tyr Cys Glu Ile Pro Ser Cys 
            340                 345                 350 
Glu Ser Ser Ala Ser Pro Asp Gln Ser Asp Ser Ser Val Pro Pro Glu 
        355                 360                 365 
Glu Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Ser Asp Gly Gln Ser 
    370                 375                 380 
Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser 
385                 390                 395                 400 
Trp Ala Ala Met Phe Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu Asn Phe 
                405                 410                 415 
Pro Asp Ala Gly Leu Glu Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp 
            420                 425                 430 
Lys Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr 
        435                 440                 445 
Cys Asn Leu Lys Arg Cys Ser Glu Thr Gly Gly Ser Val Val Glu Leu 
    450                 455                 460 
Pro Thr Val Ser Gln Glu Pro Ser Gly Pro Ser Asp Ser Glu Thr Asp 
465                 470                 475                 480 
Cys Met Tyr Gly Asn Gly Lys Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ala Val Thr 
                485                 490                 495 
Ala Ala Gly Thr Pro Cys Gln Gly Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg 
            500                 505                 510 
His Ser Ile Phe Thr Pro Gln Thr Asn Pro Arg Ala Asp Leu Glu Lys 
        515                 520                 525 
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Asn Gly Pro Trp Cys Tyr 
    530                 535                 540 
Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Pro Leu Cys 
545                 550                 555                 560 
Ala Ser Ala Ser Ser Phe Glu Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys 
                565                 570                 575 
Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala Asn Pro His Ser 
            580                 585                 590 
Trp Pro Trp Gln Ile Ser Leu Arg Thr Arg Phe Thr Gly Gln His Phe 
        595                 600                 605 
Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ala Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His 
    610                 615                 620 
Cys Leu Glu Lys Ser Ser Arg Pro Glu Phe Tyr Lys Val Ile Leu Gly 
625                 630                 635                 640 
Ala His Glu Glu Tyr Ile Arg Gly Leu Asp Val Gln Glu Ile Ser Val 
                645                 650                 655 
Ala Lys Leu Ile Leu Glu Pro Ash Asn Arg Asp Ile Ala Leu Leu Lys 
            660                 665                 670 
Leu Ser Arg Pro Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu 
        675                 680                 685 
Pro Ser Pro Asn Tyr Met Val Ala Asp Arg Thr Ile Cys Tyr Ile Thr 
    690                 695                 700 
Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Arg Leu Lys Glu 
705                 710                 715                 720 
Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Val Glu Tyr 
                725                 730                 735 
Leu Asn Asn Arg Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly Gln Leu Ala 
            740                 745                 750 
Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys 
        755                 760                 765 
Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu 
    770                 775                 780 
Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg 
785                 790                 795                 800 
Phe Val Asp Trp Ile Glu Arg Glu Met Arg Asn Asn 
                805                 810 
(2)SEQ ID NO：2的信息： 
(i)序列特征： 
(A)长度：339氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(C)链型： 
(D)拓扑结构：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(iii)假设：无 
(vi)来源： 
(A)生物体：小鼠 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2： 
Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Ile Gly Asn Gly Tyr Arg Gly 
1               5                   10                  15 
Thr Met Ser Arg Thr Lys Ser Gly Val Ala Cys Gln Lys Trp Gly Ala 
            20                  25                  30 
Thr Phe Pro His Val Pro Asn Tyr Ser Pro Ser Thr His Pro Asn Glu 
        35                  40                  45 
Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gln Gly 
    50                  55                  60 
Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asn 
65                  70                  75                  80 
Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met Tyr Cys Ser Gly Glu Lys Tyr 
                85                  90                  95 
Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gln Ala Trp 
            100                 105                 110 
Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ala Lys Phe Pro 
        115                 120                 125 
Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys His Asn Pro Asp Gly Glu Pro 
    130                 135                 140 
Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu Tyr Cys 
145                 150                 155                 160 
Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Thr Tyr 
                165                 170                 175 
Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val 
            180                 185                 190 
Thr Val Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro His 
        195                 200                 205 
Arg His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu 
    210                 215                 220 
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr 
225                 230                 235                 240 
Thr Asp Ser Gln Leu Arg Trp Glu Tyr Cys Glu Ile Pro Ser Cys Glu 
                245                 250                 255 
Ser Ser Ala Ser Pro Asp Gln Ser Asp Ser Ser Val Pro Pro Glu Glu 
            260                 265                 270 
Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Ser Asp Gly Gln Ser Tyr 
        275                 280                 285 
Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp 
    290                 295                 300 
Ala Ala Met Phe Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu Asn Phe Pro 
305                 310                 315                 320 
Asp Ala Gly Leu Glu Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Lys 
                325                 330                 335 
Gly Pro Trp 
(2)SEQ ID NO：3的信息： 
(i)序列特征： 
(A)长度：339氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(C)链型： 
(D)拓扑结构：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(iii)假设：无 
(vi)来源： 
(A)生物体：人 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3： 
Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly 
1               5                   10                  15 
Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser 
            20                  25                  30 
Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu 
        35                  40                  45 
Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly 
    50                  55                  60 
Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp 
65                  70                  75                  80 
Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr 
                85                  90                  95 
Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp 
            100                 105                 110 
Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro 
        115                 120                 125 
Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu 
    130                 135                 140 
Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys 
145                 150                 155                 160 
Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr 
                165                 170                 175 
Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val 
            180                 185                 190 
Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His 
        195                 200                 205 
Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu 
    210                 215                 220 
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr 
225                 230                 235                 240 
Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp 
                245                 250                 255 
Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu 
            260                 265                 270 
Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr 
        275                 280                 285 
Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp 
    290                 295                 300 
Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro 
305                 310                 315                 320 
Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys 
                325                 330                 335 
Gly Pro Trp 
(2)SEQ ID NO：4的信息： 
(i)序列特征： 
(A)长度：339氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(C)链型： 
(D)拓扑结构：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(iii)假设：无 
(vi)来源： 
(A)生物体：恒河猴 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4： 
Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly 
1               5                   10                  15 
Thr Met Ser Lys Thr Arg Thr Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser 
            20                  25                  30 
Thr Ser Pro His Arg Pro Thr Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu 
        35                  40                  45 
Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Gly Gln Gly 
    50                  55                  60 
Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Glu Arg Phe Asp Tyr Cys Asp 
65                  70                  75                  80 
Ile Pro Glu Cys Glu Asp Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr 
                85                  90                  95 
Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp 
            100                 105                 110 
Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro 
        115                 120                 125 
Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro 
    130                 135                 140 
Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys 
145                 150                 155                 160 
Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr 
                165                 170                 175 
Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asp Val Ala Val 
            180                 185                 190 
Thr Val Ser Gly His Thr Cys His Gly Trp Ser Ala Gln Thr Pro His 
        195                 200                 205 
Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu 
    210                 215                 220 
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Lys Ala Pro Trp Cys Tyr Thr 
225                 230                 235                 240 
Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Glu 
                245                 250                 255 
Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Pro Leu Asp Pro Thr Ala Pro Pro Glu 
            260                 265                 270 
Leu Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr 
        275                 280                 285 
Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp 
    290                 295                 300 
Ser Ser Met Thr Pro His Trp His Glu Lys Thr Pro Glu Asn Phe Pro 
305                 310                 315                 320 
Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys 
                325                 330                 335 
Gly Pro Trp 
(2)SEQ ID NO：5的信息： 
(i)序列特征： 
(A)长度：339氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(C)链型： 
(D)拓扑结构：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(iii)假设：无 
(vi)来源： 
(A)生物体：猪 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5： 
Ile Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly 
1               5                   10                  15 
Thr Thr Ser Lys Thr Lys Ser Gly Val Ile Cys Gln Lys Trp Ser Val 
            20                  25                  30 
Ser Ser Pro His Ile Pro Lys Tyr Ser Pro Glu Lys Phe Pro Leu Ala 
        35                  40                  45 
Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Lys Gly 
    50                  55                  60 
Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Thr Arg Phe Asp Tyr Cys Asp 
65                  70                  75                  80 
Ile Pro Glu Cys Glu Asp Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu His Tyr 
                85                  90                  95 
Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Ile Glu Cys Gln Ser Trp 
            100                 105                 110 
Gly Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Leu Pro Ser Lys Phe Pro 
        115                 120                 125 
Asn Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro 
    130                 135                 140 
Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Phe Cys 
145                 150                 155                 160 
Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Thr Ser Gly Pro Thr Tyr 
                165                 170                 175 
Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val 
            180                 185                 190 
Thr Ala Ser Gly His Thr Cys Gln Arg Trp Ser Ala Gln Ser Pro His 
        195                 200                 205 
Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu 
    210                 215                 220 
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr 
225                 230                 235                 240 
Thr Asp Ser Glu Val Arg Trp Asp Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Gly 
                245                 250                 255 
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Glu His Leu Asp Ala Pro Val Pro Pro Glu 
            260                 265                 270 
Gln Thr Pro Val Ala Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Glu Ser Tyr 
        275                 280                 285 
Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln Ser Trp 
    290                 295                 300 
Val Ser Met Thr Pro His Arg His Glu Lys Thr Pro Gly Asn Phe Pro 
305                 310                 315                 320 
Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys 
                325                 330                 335 
Ser Pro Trp 
(2)SEQ ID NO：6的信息： 
(i)序列特征： 
(A)长度：339氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(C)链型： 
(D)拓扑结构：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(iii)假设：无 
(vi)来源： 
(A)生物体：牛 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6： 
Ile Tyr Leu Leu Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Gln Thr Tyr Arg Gly 
1               5                   10                  15 
Thr Thr Ala Glu Thr Lys Ser Gly Val Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ala 
            20                  25                  30 
Thr Ser Pro His Val Pro Lys Phe Ser Pro Glu Lys Phe Pro Leu Ala 
        35                  40                  45 
Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Asn Gly 
    50                  55                  60 
Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp 
65                  70                  75                  80 
Ile Pro Glu Cys Glu Asp Lys Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr 
                85                  90                  95 
Glu Gly Lys Ile Ala Lys Thr Met Ser Gly Arg Asp Cys Gln Ala Trp 
            100                 105                 110 
Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro 
        115                 120                 125 
Asn Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro 
    130                 135                 140 
Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Gln Lys Arg Trp Glu Phe Cys 
145                 150                 155                 160 
Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Lys Tyr 
                165                 170                 175 
Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Lys Asn Tyr Gly Gly Thr Val Ala Val 
            180                 185                 190 
Thr Glu Ser Gly His Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro His 
        195                 200                 205 
Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu 
    210                 215                 220 
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Lys Ala Pro Trp Cys Tyr Thr 
225                 230                 235                 240 
Thr Asn Ser Glu Val Arg Trp Glu Tyr Cys Thr Ile Pro Ser Cys Glu 
                245                 250                 255 
Ser Ser Pro Leu Ser Thr Glu Arg Met Asp Val Pro Val Pro Pro Glu 
            260                 265                 270 
Gln Thr Pro Val Pro Gln Asp Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr 
        275                 280                 285 
Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln Ser Trp 
    290                 295                 300 
Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Leu Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro 
305                 310                 315                 320 
Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys 
                325                 330                 335 
Ser Pro Trp 

Claims (10)

1.药物组合物，该组合物包含：
(1)编码血管生成抑制素蛋白质的核酸序列，其中血管生成抑制素蛋白质具有抗血管生成活性，或者
(2)包含编码血管生成抑制素蛋白质的核酸序列的载体，其中血管生成抑制素蛋白质具有抗血管生成活性，且所述载体当存在于细胞中时能够表达血管生成抑制素蛋白质，
其中所述血管生成抑制素蛋白质是人纤溶酶原的内皮抑制性片段，包含所述人纤溶酶原的至少Kringle区域1-3的氨基酸序列，而且其中，所述药物组合物用于治疗血管生成介导的疾病和过程。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述核酸序列编码包含氨基端氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述血管生成抑制素蛋白质具有38kDa至45kDa的分子量。
4.权利要求2的药物组合物，其中所述血管生成抑制素蛋白质具有38kDa至45kDa的分子量。
5.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述血管生成抑制素蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸93-470。
6.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述血管生成抑制素蛋白质具有内皮细胞增殖抑制活性。
7.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述血管生成抑制素蛋白质能够治疗血管生成介导的或者血管生成相关的过程或疾病。
8.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述血管生成抑制素蛋白质能够抑制癌症生长。
9.体外基因转移的方法，包括将权利要求1-8任一项中定义的核酸序列或者载体转染细胞，其中所述核酸序列或者载体当存在于细胞中时能够表达血管生成抑制素蛋白质。
10.权利要求1-8任一项中定义的核酸序列或者载体在制备用于治疗血管生成介导的疾病和过程的药物组合物中的应用。
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Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040214807A1 (en) * 1993-08-06 2004-10-28 D'amato Robert J. Estrogenic compounds as anti-mitotic agents
US5504074A (en) * 1993-08-06 1996-04-02 Children's Medical Center Corporation Estrogenic compounds as anti-angiogenic agents
US6908910B2 (en) 1993-08-06 2005-06-21 The Children's Medical Center Corporation Estrogenic compounds as anti-mitotic agents
US6949511B1 (en) 1994-04-26 2005-09-27 The Children's Medical Center Corporation Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of kringle region fragments of plasminogen
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5945403A (en) * 1997-05-30 1999-08-31 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
WO2001019987A1 (en) * 1999-09-13 2001-03-22 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
KR19990008029A (ko) * 1995-04-26 1999-01-25 윌리엄 뉴 안기오스타틴 단편과 안기오스타틴 응집체 및 이의 이용방법
US5861372A (en) * 1996-02-22 1999-01-19 The Children's Medical Center Corporation Aggregate angiostatin and method of use
CZ334097A3 (cs) * 1995-04-26 1998-04-15 The Children's Medical Center Corporation Fragmenty angiostatinu, agregovaný angiostatin a způsoby jeho použití
US6440729B1 (en) 1995-06-30 2002-08-27 University Of Kansas Medical Center Treating angiogenesis-mediated diseases with the α2 monomer of type IV collagen
US6358735B1 (en) 1995-06-30 2002-03-19 University Of Kansas Medical Center Method for inhibiting angiogenesis and tumors with the isolated NC1 α3 chain monomer of type IV collagen
US5854205A (en) * 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6346510B1 (en) 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
CN1202932A (zh) 1995-10-23 1998-12-23 儿童医学中心公司 治疗用抗血管生成的组合物和方法
ES2217340T3 (es) * 1995-12-13 2004-11-01 The Children's Medical Center Corporation Inhibidor de la proliferacion de celulas endoteliales y utilizacion de este.
US5854221A (en) * 1996-12-12 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use
US6299895B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US5801146A (en) * 1996-05-03 1998-09-01 Abbott Laboratories Compound and method for inhibiting angiogenesis
US6699838B1 (en) 1996-05-03 2004-03-02 Abbott Laboratories Antiangiogenic peptides
JP4426650B2 (ja) * 1996-05-03 2010-03-03 アボット・ラボラトリーズ 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法
US6080728A (en) * 1996-07-16 2000-06-27 Mixson; A. James Carrier: DNA complexes containing DNA encoding anti-angiogenic peptides and their use in gene therapy
US5801012A (en) * 1996-09-17 1998-09-01 Northwestern University Methods and compositions for generating angiostatin
WO2001040464A1 (en) * 1999-11-30 2001-06-07 Genentech, Inc. Interleukin-1-receptor associated kinase-3 (irak3) and its use in promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
US7112338B2 (en) 1997-03-12 2006-09-26 The Regents Of The University Of California Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US5994388A (en) * 1997-03-18 1999-11-30 The Children's Medical Center Corporation Cytochalasin and isoindolinone derivatives as inhibitors of angiogenesis
WO2000053752A2 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
KR20010020342A (ko) * 1997-04-28 2001-03-15 자끄 사비나 종양치료용 맥관형성 길항제의 아데노바이러스-매개 종양내 전달방법
US6638949B1 (en) 1997-08-25 2003-10-28 Judah Folkman Prevention of adhesions and excessive scar formation using angiogenesis inhibitors
US20020002294A1 (en) * 1997-09-24 2002-01-03 D' Amato Robert J. Estrogenic compounds as antiangiogenic agents
EP1019515A1 (en) * 1997-10-01 2000-07-19 G.D. SEARLE & CO. Fusion proteins comprising an angiostatin moiety and their use in anti-tumour treatment
US6475784B1 (en) * 1997-11-14 2002-11-05 Valentis, Inc. Inhibition of angiogenesis by delivery of nucleic acids encoding anti-angiogenic polypeptides
WO1999026480A1 (en) * 1997-11-20 1999-06-03 Genetix Pharmaceuticals, Inc. Anti-angiogenic gene therapy vectors and their use in treating angiogenesis-related diseases
US6797488B1 (en) 1997-12-08 2004-09-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of producing anti-angiogenic proteins
IL136668A0 (en) * 1997-12-08 2001-06-14 Beth Israel Hospital Restin and methods of use thereof
CA2693296C (en) 1997-12-08 2013-09-10 Merck Patent Gmbh Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
ATE366121T1 (de) 1998-02-03 2007-07-15 Protiva Biotherapeutics Inc Systemische verabreichung von serum-stabilen plasmid-lipid partikeln zur krebstherapie
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
WO1999046282A1 (en) * 1998-03-13 1999-09-16 The General Hospital Corporation Plasminogen-related gene b polypeptides
AU3109199A (en) * 1998-03-25 1999-10-18 Large Scale Biology Corporation Benzoates derivatives for inhibiting angiogenesis
US6433012B1 (en) * 1998-03-25 2002-08-13 Large Scale Biology Corp. Method for inhibiting inflammatory disease
ATE329622T1 (de) * 1998-04-15 2006-07-15 Lexigen Pharm Corp Steigerung der antikörper-zytokin- fusionsproteinmediierten immunantwort durch mitverabreichung mit einem angiogeneseinhibitor
CA2327382C (en) * 1998-04-28 2012-12-18 Toshikazu Nakamura Neovascularization inhibitors
JP2002516337A (ja) * 1998-05-22 2002-06-04 アボット・ラボラトリーズ ガン、関節炎および網膜症を処置するための抗血管形成薬
WO1999065515A2 (en) 1998-06-15 1999-12-23 Arch Development Corporation Combination of radiotherapy and anti-angiogenic factors
MXPA01002546A (es) * 1998-09-14 2004-06-11 Genentech Inc Promocion o inibhicion de angiogenesis y cardiovascularizacion.
EP1734051A3 (en) * 1998-12-01 2007-09-12 Genetech, Inc. Composition and methods for the diagnosis of tumours
KR100529270B1 (ko) * 1998-12-01 2005-11-21 제넨테크, 인크. 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
US6201104B1 (en) 1998-12-04 2001-03-13 Entremed, Inc. Angiogenesis—inhibiting protein binding peptides and proteins and methods of use
US20030013739A1 (en) * 1998-12-23 2003-01-16 Pharmacia Corporation Methods of using a combination of cyclooxygenase-2 selective inhibitors and thalidomide for the treatment of neoplasia
JP2002535372A (ja) * 1999-01-28 2002-10-22 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション プラスミノーゲンクリングル４領域フラグメントおよび利用法
AU2600800A (en) * 1999-03-08 2000-09-28 Genentech Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
KR100553300B1 (ko) * 1999-03-08 2006-02-20 제넨테크, 인크. 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법
US7144854B1 (en) 1999-09-10 2006-12-05 Conjuchem, Inc. Long lasting anti-angiogenic peptides
US6329336B1 (en) * 1999-05-17 2001-12-11 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
PT1212417E (pt) * 1999-06-02 2008-07-29 Genentech Inc Promoção ou inibição de angiogénese e cardiovascularização
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
RU2263118C2 (ru) * 1999-08-09 2005-10-27 Лексиген Фармасьютикэлс Корп. Комплексы антител с несколькими цитокинами
US7087592B1 (en) * 1999-08-23 2006-08-08 Entre Med, Inc. Compositions comprising purified 2-methoxyestradiol and methods of producing same
JP2003514552A (ja) 1999-11-12 2003-04-22 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態
JP2003530146A (ja) 2000-02-10 2003-10-14 マサチューセッツ・アイ・アンド・イア・インファーマリー 眼の状態を処置するための光力学的治療
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
US6835806B2 (en) 2000-04-03 2004-12-28 Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Cell growth regulation system
JP2004506413A (ja) * 2000-06-23 2004-03-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 血管形成に関与する疾患の診断と治療のための組成物と方法
DK1294401T3 (da) * 2000-06-29 2007-10-08 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistof/cytokin-fusionsproteinmedierede immunresponser ved kombineret behandling med immuncytokin-optagelsesforberende midler
US6995278B2 (en) * 2000-08-18 2006-02-07 Entre Med, Inc. Antiangiogenic agents
US20050192258A1 (en) * 2000-08-18 2005-09-01 Agoston Gregory E. Antiangiogenic agents
US7135581B2 (en) * 2000-08-18 2006-11-14 Entremed, Inc. Antiangiogenic agents
EP1197550A3 (en) * 2000-08-25 2002-11-20 Pfizer Products Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating disorders involving angiogenesis
JP2004508048A (ja) 2000-09-05 2004-03-18 カロリンスカ　イノベーションズ　アクティーエボラーグ 内皮細胞増殖阻害物質に関する材料と方法
US20020159992A1 (en) * 2000-09-29 2002-10-31 Jack Henkin Antiangiogenic polypeptides and methods for inhibiting angiogenesis
JP2002112768A (ja) * 2000-10-04 2002-04-16 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk アンジオスタチン特異的モノクローナル抗体、及びこのモノクローナル抗体を用いたアンジオスタチンの検出方法等
ES2290091T3 (es) * 2000-11-30 2008-02-16 The Children's Medical Center Corporation Sintesis de enantiomeros de 4-amino-talidomida.
WO2002053191A1 (en) 2001-01-05 2002-07-11 Viromed Limited Compositions for gene therapy of rheumatoid arthritis including a gene encoding an anti-angiogenic protein or parts thereof
CA2440221C (en) * 2001-03-07 2013-02-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
PL205352B1 (pl) * 2001-05-03 2010-04-30 Merck Patent Gmbh Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu
EP1454138B1 (en) * 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
WO2003063791A2 (en) * 2002-01-30 2003-08-07 Entremed, Inc. Non-steroidal analogs of 2-methoxyestradiol
NZ579419A (en) * 2002-02-07 2011-02-25 Dyax Corp Albumin-fused kunitz domain peptides
AU2003299509A1 (en) * 2002-06-21 2004-05-13 University Of Utah Research Foundation Crosslinked compounds and methods of making and using thereof
EP1539179B1 (en) 2002-07-22 2016-03-02 Teva Pharmaceuticals International GmbH Angiogenesis inhibition by cephalotaxine alkaloids, derivatives, compositions and uses thereof
RU2366664C2 (ru) * 2002-12-17 2009-09-10 Мерк Патент Гмбх Гуманизированное антитело (н14.18) на основании антитела 14.18 мыши, связывающееся с gd2, и его слияние с il-2
US8324184B2 (en) 2003-05-15 2012-12-04 University Of Utah Research Foundation Anti-adhesion composites and methods of use thereof
AU2004275693A1 (en) * 2003-05-28 2005-04-07 Entremed, Inc. Antiangiogenic agents
US20050250694A1 (en) * 2003-10-10 2005-11-10 Ma Jian-Xing Compounds useful in inhibiting vascular leakage, inflammation and fibrosis and methods of making and using same
US20050143300A1 (en) * 2003-10-10 2005-06-30 Ma Jian-Xing Compounds useful in inhibiting vascular leakage, inflammation and fibrosis and methods of making and using same
US20100330143A1 (en) 2003-12-04 2010-12-30 University Of Utah Research Foundation Modified macromolecules and methods of making and using thereof
EP1694712A1 (en) 2003-12-04 2006-08-30 University of Utah Research Foundation Modified macromolecules and methods of making and using thereof
US20050130897A1 (en) * 2003-12-11 2005-06-16 Ma Jian-Xing Compounds useful in inhibiting vascular leakage, inflammation and fibrosis and methods of making and using same
CA2558014A1 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 Entremed, Inc. Antiangiogenic agents
US20070004689A1 (en) * 2004-03-12 2007-01-04 Agoston Gregory E Antiangiogenic agents
MX2007006214A (es) * 2004-11-24 2008-04-16 Therakine Ltd Un implante para suministro de farmaco intraocular.
EP1819343A2 (en) * 2004-11-29 2007-08-22 EntreMed, Inc. A method of administering anti-angiogenic agents and a method of treating disease using same
US20070185069A1 (en) * 2005-11-14 2007-08-09 Plum Stacy M Anti-angiogenic activity of 2-methoxyestradiol in combination with anti-cancer agents
US20070176403A1 (en) * 2006-02-01 2007-08-02 Dennis Calderone Air adjustable seat
JP2009530388A (ja) * 2006-03-20 2009-08-27 エントレメッド インコーポレイテッド ２−メトキシエストラジオールの疾患修飾性抗関節炎活性
EP2012803A4 (en) * 2006-04-20 2012-08-01 Univ Utah Res Found POLYMER COMPOSITIONS AND METHODS OF PRODUCTION AND USE THEREOF
US8747870B2 (en) 2006-04-20 2014-06-10 University Of Utah Research Foundation Polymeric compositions and methods of making and using thereof
WO2007127767A2 (en) * 2006-04-28 2007-11-08 Ludwig Institute For Cancer Research Quantification of enzyme activity by mass spectrometry
US20080032920A1 (en) * 2006-07-11 2008-02-07 Prestwich Glenn D Macromolecules modified with electrophilic groups and methods of making and using thereof
WO2008094665A1 (en) * 2007-01-31 2008-08-07 Entremed, Inc. Method of treating amyloidosis mediated diseases
WO2008109779A2 (en) * 2007-03-07 2008-09-12 The Johns Hopkins University Use of follistatin-like related gene (flrg) to increase muscle mass
US20080287341A1 (en) * 2007-05-18 2008-11-20 Danyang Chen Treatment of vascular abnormalities using nanoparticles
US20110073412A1 (en) 2009-09-28 2011-03-31 Tlt-Babcock, Inc. Axial fan compact bearing viscous pump
WO2013010045A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 Biotime Inc. Novel methods and formulations for orthopedic cell therapy
EP2628748A1 (en) 2012-02-14 2013-08-21 Szilak Laboratories Bioinformatics & Molecule-Design Ltd. Angiostatin chimeras and uses thereof
EP3746151B1 (en) * 2018-02-28 2024-04-24 Plas-Free Ltd. Extracorporeal device and matrix for removing fibrinolytic proteins from biological fluids, methods and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5836391A (ja) * 1981-08-07 1983-03-03 Sankyo Co Ltd 新生理活性物質アンジオスタチン
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
US5192744A (en) * 1990-01-12 1993-03-09 Northwestern University Method of inhibiting angiogenesis of tumors

Also Published As

Publication number Publication date
AU2461795A (en) 1995-11-16
WO1995029242A1 (en) 1995-11-02
DE69535405T2 (de) 2007-11-15
HU9602952D0 (en) 1996-12-30
CZ312296A3 (en) 1997-05-14
CN1149319A (zh) 1997-05-07
JP2006213724A (ja) 2006-08-17
HUT76095A (en) 1997-06-30
CA2188813C (en) 2010-08-03
JPH09512173A (ja) 1997-12-09
JP2005046148A (ja) 2005-02-24
JP3880064B2 (ja) 2007-02-14
EP0758390B1 (en) 2007-02-28
AU692865B2 (en) 1998-06-18
CN1309833C (zh) 2007-04-11
NO964598D0 (no) 1996-10-30
US5885795A (en) 1999-03-23
CN1636594A (zh) 2005-07-13
JP3880593B2 (ja) 2007-02-14
EP0758390A1 (en) 1997-02-19
MX9605109A (es) 1997-08-30
NZ285501A (en) 1998-02-26
IL113509A0 (en) 1995-07-31
IL113509A (en) 2005-12-18
BR9507479A (pt) 1997-09-16
CA2188813A1 (en) 1995-11-02
ATE355379T1 (de) 2006-03-15
DE69535405D1 (de) 2007-04-12

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