KR100477280B1 - 맥관형성에의한질환치료제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내피세포 억제제 및 이의 사용 방법을 포함한다. 내피 세포 증식 억제제는 약 14 kD의 분자량을 갖고 GPVGAGEPKCPLMVKVLDAV의 N-말단 서열을 가지며 시험관내 분석시 내피 세포 증식 억제능을 갖는 단백질이다.
Description
본 발명은 국립보건원 승인번호 P01-CA45548하에 정부 지원으로 완성되었다. 미국 정부는 본 발명의 특권을 소유할 수 있다.
본 발명은 신규 내피 세포 증식 억제제에 관한 것이다. 억제제는 질병에 관련된 맥관형성을 억제할 수 있고, 맥관형성 과정을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명은 진단 분석 및 생물학적 유체 샘플 내에 존재하는 억제제 양의 측정을 위한 키트, 억제제의 배치를 위한 조직화학적 키트, 억제제 생합성 및 분해를 모니터링하기 위해서 억제제 및 분자 탐침을 암호화하는 DNA 서열, 억제제에 특이적인 항체, 억제제 수용체로의 펩티드 효능제 및 길항제의 생성, 항-억제제 수용체-특이 항체 효능제 및 길항제, 및 억제제에 연결된 세포독성에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "맥관형성"은 조직 또는 기관으로의 신규한 혈관의 생성을 의미하고, 내피세포 증식을 수반한다. 정상적인 생리학적 조건 하에서, 인간 또는 동물은 매우 특정한 제한된 상황에서만 맥관형성을 수행한다. 예를 들면, 맥관형성은 통상적으로 상처 치유, 태아 및 배 발생, 및 황체, 자궁내막, 및 태반의 형성에서 관찰된다. 용어 "내피"는 혈청강, 림프관, 및 혈관을 라이닝하는 편평 내피 세포의 얇은 층을 의미한다.
조절 및 비조절 맥관형성 모두 유사한 방법으로 진행되는 것으로 생각된다. 기저막에 의해 둘러싸인 내피 세포 및 주세포가 모세혈관을 형성한다. 맥관형성은 내피세포 및 백혈구에 의해 방출된 효소에 의해 기저막의 미란을 시작한다. 이어서, 혈관의 루멘을 라이닝하는 내피세포가 막을 통하여 돌출한다. 맥관형성 자극제는 내피세포가 미란된 기저막을 통하여 이동하도록 유도한다. 이동하는 세포는 내피 세포가 유사분열을 수행하고 증식하는, 모혈관으로부터 "스프라우트"를 형성한다. 내피 스프라우트는 모세혈관 루프를 형성하기 위해서 서로 융합되어 신혈관을 생성한다.
지속적인, 비조절 맥관형성이 다수의 질병 상태, 종양 전이 및 내피 세포에 의한 비정상적인 생장에서 일어나고 이러한 조건에서 발견되는 병적 손상을 지지한다. 비조절 맥관형성이 존재하는 다른 병적 질병 상태가 맥관형성 의존성 또는 맥관형성 관련 질병으로서 함께 구분되어 왔다.
종양 생성이 맥관형성-의존성이라는 가설이 1971년에 최초로 제안되었다 [참조문헌: Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications., N. Engl. Jour. Med. 285:1182 1186, 1971]. 이의 가장 단순한 용어로 이것은 "일단 종양 '테이크'가 발생하면, 종양 세포군에서의 모든 증가는 종양에 집중하는 신모세혈관의 증가가 선행되어야 함을 언급한다. 종양 '테이크'는 몇 입방 밀리미터를 채우고 몇 백만 세포를 초과하지 않는 종양 세포군이 존재하는 숙주 미세관에서 생존할 수 있는 종양 생장의 예비도관상을 나타내는 것으로 널리 이해된다. 이 상을 초과한 종양 용적의 팽창은 신규 모세혈관의 유도를 요한다. 예를 들면, 마우스내 초기 예비도관 상의 폐 미세전이는 조직학적 단편상의 고배율 현미경에 의한 경우를 제외하고는 검출불가능하다.
이러한 개념을 지지하는 간접 증거의 예에는 하기가 포함된다.
(1) 마우스내 피하 투명 챔버에 이식된 종양의 생장률은 신혈관형성 전에는 느리고 선형이며, 신혈관형성 후에는 빠르고 거의 지수형이다. [참조문헌: Algire GH, et al. Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6: 73-85, 1945]
(2) 혈관이 증식하지 않는 분리 관류된 기관에서 생장한 종양은 1 내지 2 mm3으로 제한되지만 이들이 쥐로 이식되어 신혈관형성될 경우 이 용적의 1000배 이상으로 신속하게 팽창한다. [참조문헌: Folkman J, et al., Tumor behavior in isolated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164;491-502, 1966]
(3) 구혈 각막에서의 종양 생장은 느리게 선형 비율로 진행하지만, 신혈관형성 후 지수 생장으로 전환한다 [참조문헌: Gimbrone, M.A., Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Institute 52:41-427, 1974].
(4) 토끼 눈의 전방 챔버의 수성 유체에 현탁된 종양은 존속성이고 구혈성이며 1 mm3 미만의 크기로 제한된다. 일단 이들이 홍채 혈관층에 이식되면, 이들은 신혈관형성하고 신속하게 생장하여, 2주내에 원 용적의 16,000배에 도달한다. [참조문헌: Gimbrone MA Jr., et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136:261-276]
(5) 종양을 병아리 배 융모요막에 이식할 경우, 이들은 72시간 이상의 구혈상 동안 서서히 생장하지만, 0.93 + 0.29 mm의 평균 직경을 초과하지 않는다. 신속한 종양 팽창이 신혈관형성 개시후 24시간 내에 일어나고 7일까지 이러한 혈관형성 종양은 8.0 + 2.5 mm의 평균 직경에 도달한다. [참조문헌: Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35:347-356, 1977]
(6) 토끼 간에서 전이의 혈관 원주가 전이 크기에 있어서의 이질성을 나타내지만 혈관형성이 존재하는 크기에 대한 상대적으로 균일한 절단점을 나타낸다. 종양은 일반적으로 직경 1 mm 이하의 구혈성이지만, 그 직경 이하로도 신혈관형성된다. [참조문헌: Lien W., et al., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970]
(7) 췌장 아일릿의 베타 세포에서 암종이 발생하는 트랜스제닉 마우스에서, 예비혈관 이상증식성 아일릿은 1 mm 이하의 크기로 제한된다. 6 내지 7 주 시기에, 아일릿의 4 내지 10 %가 신혈관형성하게 되고, 이러한 아일릿으로부터 예비혈관 아일릿 용적의 1000배 이상의 대량의 혈관형성 종양이 발생한다. [참조문헌: Folkman J, et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339:58-61, 1989]
(8) VEGF에 대한 특이 항체(혈관 내피 생장 인자)는 미세혈관 밀도를 감소시키고 (누드 마우스에서) 맥관형성의 단독 매개체로서 VEGF에 의존하는 세 인간 종양 생장의 "현저하거나 극적인" 억제를 유발한다. 항체는 시험관내에서 종양 세포의 생장을 억제하지 않는다. [참조문헌: Kim K J, et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362: 841-844, 1993]
(9) 항-bFGF 모노클론 항체는 맥관형성의 유일한 매개체로서 bFGF의 분비에 의존성인 마우스 종양 생장의 70% 억제를 유발한다. 항체는 시험관내 종양 세포의 생장을 억제하지 않는다. [참조문헌: Hori A, et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991]
(10) bFGF의 복강내 주사는 종양의 모세혈관 내피 세포의 생장을 자극함으로써 제 1 종양의 생장 및 이의 전이를 증진시킨다. 종양 세포 자체는 bFGF에 대한 수용체가 부족하고 bFGF는 시험관내 종양 세포에 대한 유사분열물질이 아니다. [참조문헌: Gross JL, et al. Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31:79, 1990]
(11) 특정 맥관형성 억제제(AGM-1470)는 생체내 종양 생장 및 전이를 억제하지만, 시험관내 종양 세포 증식 억제에는 훨씬 덜 활성적이다. 이는 종양 세포 증식을 억제하는 것보다 4 로그 더 낮은 농도에서 최대의 절반으로 혈관 내피 세포 증식을 억제한다. [참조문헌: Ingber D, et al., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48:555-557, 1990]
(12) 유리질에 전이성인 인간 망막아종은 이들이 존속성이고 3H-티미딘을 포함한다(적출된 안구로부터 제거하고 시험관내에서 분석시)는 사실에도 불구하고 1 mm3 이하로 제한되는 구혈의 구형체로 발전한다.
(13) 난소의 암종은 작은 구혈 백색 시드(1-3 mm3)로서 복막으로 전이한다. 이러한 이식체는 드물게 이들 중 하나 이상이 신혈관형성될 때까지 더 크게 생장한다.
(14) 유방암 [참조문헌: Weidner N, et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991, and Weidner N, et al., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J Natl. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992] 및 전립선암 [참조문헌: Weidner N, Carroll PR, Flax J, Blumenfeld W, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2): 401-419, 1993]에서의 신혈관형성의 강도는 장래 전이의 위험과 매우 연관된다.
(15) 신혈관형성에 앞선 인간 피부 흑색종으로부터의 전이는 드물다. 신혈관형성의 개시는 손상의 증가된 두께 및 증가하는 전이의 위험을 초래한다. [참조문헌: Srivastava A, et al., The Prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76-4.0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133:419-423, 1988]
(16) 방광암에서, 맥관형성 펩티드 bFGF의 소변 수준은 세포진단이라기 보다 질병의 상태 및 정도의 더욱 민감한 지시자이다. [참조문헌: Nguyen M. et al., Elevated levels of an angiogenic peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst. 85:241-242, 1993]
따라서, 맥관형성이 암의 전이에 중요한 역할을 함이 명백하다. 이러한 맥관형성 활성이 억제되거나 제거되거나 이와 달리 통제되고 조절될 수 있는 경우, 종양은 존재하더라도 생장하지 않을 것이다. 질병 상태에서, 맥관형성의 방지는 신규 미세혈관 시스템의 침입에 의해 초래된 손상을 피할 수 있다. 맥관형성 과정의 통제에 관련된 치료는 이러한 질병의 완치 또는 완화를 초래할 수 있다.
그러므로 필요한 것은 내피 세포 증식, 예를 들면, 특히, 종양으로의 불필요한 혈관의 생장을 억제할 수 있는 조성물 및 방법이다. 또한 필요한 것은 조성물의 검출, 측정 및 배치 방법이다. 조성물은 예비전이 종양의 내생 생장 인자의 활성을 극복하고 종양내 모세혈관의 형성을 막아서 이로인해 종양의 생장을 억제할 수 있어야 한다. 조성물, 조성물의 단편 및 조성물에 특이적인 항체는 또한 상처 치유 및 재생과 같은 기타 맥관형성 과정에서 모세혈관의 형성을 조절할 수 있어야 한다. 맥관형성을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 바람직하게는 무독성이고 부작용을 거의 일으키지 않아야 한다. 또한 조성물을 위한 결합 부위 및 조성물 생합성 부위의 검출, 측정 및 배치의 방법이 필요하다. 조성물 및 조성물의 단편은 방사선 및 비-방사선 표지의 의도로 기타 분자와 결합될 수 있어야 한다.
본 발명은 내피 증식 활성을 억제하기 위해서 플라스미노겐의 분리된 크링글 5 영역을 사용하는 방법을 포함한다. 억제 활성을 갖는 분리된 크링글 5 펩티드 단편은 하기의 약 80개의 아미노산 서열을 포함한다:
상기 서열에서,
본 발명의 내피 세포 증식 펩티드는 아미노산 약 462의 인간 플라스미노겐에서 시작하여 약 80개의 아미노산을 연장하는 인간 플라스미노겐으로부터 생성된 펩티드 단편에 상응한다.
본 발명은 또한 체액내 억제 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하기 위한, 내피 세포 증식을 조절하기 위해서 치료에 유효량의 화합물이 필요한 환자에게 펩티드를 특이적으로 결합시키는 펩티드 또는 항체의 투여를 위한 진단 및 치료 방법을 포함한다. 또한, 억제 펩티드를 펩티드의 억제 효과를 완화하는 화합물에 대해 시험하기 위해서, 즉, 내피 세포 증식의 억제를 극복하거나 역전시킬 수 있는 생장 인자 또는 기타 화합물을 스크리닝 하기 위해서 시험관내에서 증식하는 내피 세포 배양물과 병행하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 실질적으로 인간 플라스미노겐의 아미노산 462에서 시작하는 크링글 5 영역에 해당하는 인간 플라스미노겐의 약 80개의 아미노산 펩티드 단편을 포함하는 내피 세포 증식 억제제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 내피 세포 증식, 특히 맥관형성에 의해 매개되는 질병 및 진행과정의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진단 및 예지 방법 및 체액 또는 조직내 억제제의 존재 및 양의 검출을 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈관종, 충실성 종양, 백혈병, 암전이, 모세관확장증, 건선, 경피증, 화농성 육아종, 심근 맥관형성, 플라크 신혈관형성, 동맥 측부, 대뇌 측부, 동정맥 기형, 허혈성 하지 맥관형성, 각막 질환, 루베오시스, 신혈관 육아종, 당뇨성 망막증, 수정체후부 섬유증식증, 관절염, 당뇨성 신혈관형성, 반점 생성, 상처 치유, 소화성 궤양, 헬리코박터 관련 질병, 골절, 켈로이드, 소맥관형성, 조혈, 배란, 월경, 태반형성 및 묘조열이 포함되지만 이에 제한되지 않는 맥관형성에 의해 매개되는 질병 및 진행과정의 치료 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 암 성장의 치료 또는 억제를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 본 발명의 억제제를 생체내 또는 시험관내에서 생성하는 효소의 생성 또는 활성을 조절하거나 모방하는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 억제제 DNA의 이러한 처치를 필요로하는 인간 또는 동물로의 직접 주사에 의해 억제제 또는 항-억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 체액내 억제제에 특이적인 항체의 존재를 검출하고 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암의 검출 또는 예지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 억제제의 결합 부위를 생체내 및 시험관내에서 가시화하고 정량하는데에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 억제제 생합성의 검출 및 정량에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 부작용이 최소인 암 치료법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 내피 세포 증식 억제제 또는 세포독성제에 연결된 억제제 펩티드 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특이적인 배치로 억제제-관련 조성물의 표적화된 이송을 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 맥관형성 과정과 같은 내피 세포 증식의 조절을 위한 유전자 치료에 유용한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 및 기타 목적, 특성 및 장점은 하기의 기재 양태의 상세한 설명 및 청구의 범위를 검토한 후 명백해질 것이다.
도 1은 세포에 첨가된 인간 플라스미노겐의 분리된 크링글 5 펩티드 단편의 농도의 함수로서의 세포수의 퍼센트 변화로서 내피 세포 증식의 억제를 도시한다.
도 2는 인간 플라스미노겐으로부터 분리된 크링글 5 펩티드 단편 제조의 겔 전기영동 분석을 도시한다. 레인 1은 분리된 크링글 5이고 레인 2는 분자량 마커이다.
도 3은 인간 플라스미노겐의 크링글 영역 1, 2, 3, 4 및 5의 아미노산 컴패션을 도시한다.
도 4는 아미노 카본산 (AMCHA) 존재 및 부재시의 인간 플라스미노겐 크링글 5의 항-내피 세포 증식 활성을 도시하고, 리신 결합 부위가 크링글 5의 항-내피 세포 증식 활성을 책임지지 않음을 증명한다.
도 5는 소의 내피 세포 증식에 대한 재조합 크링글 5의 억제 효과를 도시한다.
본 발명에 따라서, 내피 세포 증식을 억제하고, 맥관형성을 조절하며, 불필요한 맥관형성, 특히 종양 생장과 관련된 맥관형성을 억제하는데 유효한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명은 크링글 5와 같이 인간 플라스미노겐으로부터 분리가능한 약 80개의 아미노산 서열임을 특징으로하는 단백질 내피 세포 증식 억제제를 포함한다. 억제제의 아미노산 서열은 종간에 약간 변할 수 있다. 활성 억제제 분자내 아미노산의 수는 변할 수 있고 내피 억제 활성을 갖는 모든 근접한 상동 아미노산 서열이 본 발명에 포함되는 것으로서 사려된다는 점이 이해되어야 한다.
본 발명은 불필요하고 비조절된 내피 세포 증식, 예를 들면, 맥관형성에 의해 매개되는 질병 및 진행과정을 바람직하지 않은 내피 세포 증식을 갖는 인간 또는 동물에 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제할 수 있는 인간 플라스미노겐의 약 크링글 5를 포함하는 조성물을 투여함으로써 치료하는 방법 및 조성물을 제공한다. 바람직하게는 분리된 단백질은 적어도 약 80% 순도, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 좀더 바람직하게는 적어도 약 95% 순도이다. 본 발명은 특히 종양을 치료하거나 종양 생장을 억제하는 데에 특히 유용하다. 억제제를 예비혈관형성된 전이된 종양을 갖는 인간 또는 동물에 투여함은 종양의 생장 또는 팽창을 방지하도록 돕는다.
본 발명은 또한 내피 세포 증식 억제제, 내피 세포 증식 억제제를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터 및 억제제를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 하나 이상의 발현 벡터를 함유하는 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 내피 세포 증식 억제제를 암호화하는 DNA 서열을 생체내 억제제 수준을 변경하기 위해서 환자에게 도입하는 유전자 치료 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 진단 방법, 및 생물학적 유체 및 조직내의 내피 세포 증식 억제제의 검출 및 측정을 위한 키트 및 조직 및 세포내 억제제의 배치를 위한 키트를 포함한다. 진단 방법 및 키트는 당분야 통상의 전문가들에게 익히 공지된 구성일 수 있다. 본 발명은 또한 내피 세포 증식 억제제에 특이적인 항체 및 이의 이부 및 내피 세포 증식 억제제에 특이적인 항체의 결합을 억제하는 항체를 포함한다. 이러한 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 내피 세포 증식 억제제는 맥관형성에 의해 매개되는 암 또는 다른 질병의 발생 또는 재발에 대해 진단적이거나 예지적인 억제제의 존재 및 양을 검출하기 위해서 진단 키트에 사용될 수 있다. 내피 세포 증식 억제제에 특이적인 항체는 또한 인간 또는 동물을 억제제에 대해 수동적으로 면역시키고, 이로인해 맥관형성 억제를 감소시키기 위해서 인간 또는 동물에 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 진단 방법 및 생체 유체내 내피 세포 증식 억제제를 결합시키는 항체의 존재 및 양을 검출하기 위한 키트를 포함한다. 진단 방법 및 키트는 당분야 통상의 전문가들에게 익히 공지된 구성일 수 있다.
본 발명은 또한 억제제의 수용체에 결합하고 적합한 시그널을 세포에 전달하며 효능제 또는 길항제로서 작용하는 항-억제제 수용체-특이 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 동위원소로 또는 양전자 방출 단층 촬영법, 자기방사법, 유동 혈구계산, 방사수용체 결합 분석 및 면역조직화학이 포함하지만 이에 제한되지 않는 기술로 억제제 결합 부위의 검출 및 가시화에 사용되는 다른 분자 또는 단백질로 표지될 수 있는 억제제 펩티드 단편 및 동족체를 포함한다.
이러한 억제제 펩티드 및 동족체는 또한 억제제 수용체에서 효능제 또는 길항제로서 작용하고, 이로 인해 내피 세포 증식 억제제의 생물학적 활성을 증진하거나 차단한다. 이러한 펩티드는 억제제에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 분자의 분리에 사용된다.
본 발명은 또한 내피 세포 증식 억제제, 억제제 단편, 억제제에 특이적인 항혈청, 및 치료 및 조사 적용을 위한 세포 독성제에 연결된 억제제 수용체 효능제 및 수용체 길항제를 포함한다. 또한, 억제제, 이의 단편, 이에 특이적인 항혈청, 억제제 수용체 효능제 및 억제제 수용체 길항제를 치료 조성물을 형성하기 위해서 약학적으로 허용되는 부형제 및 임의로 지속-방출 화합물 또는 조성물, 예를 들면, 생분해성 중합체 및 매트릭스와 결합시킨다.
본 발명은 내피 세포 증식 억제제의 전사 및 해독에 수반되는 리보핵산 및 디옥시리보핵산에 대한 분자 탐침을 포함한다. 이러한 분자 탐침은 조직 및 세포내 억제제 생합성을 검출하고 측정하기에 유용하다.
좀더 상세하게, 본 발명은 질병의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법, 및 내피 세포 증식, 예를 들면 맥관형성에 의해 매개되거나 연계된 과정을 포함한다. 억제제 활성을 갖는 분리된 Kringel 5 펩티드 단편은 하기의 약 80개의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 서열에서,
억제제는 플라스미노겐, 예를 들면, 인간 플라스미노겐으로부터 분리하거나, 화학적 또는 생물학적 방법(예를 들면, 세포 배양, 재조합 유전자 발현, 펩티드 합성, 활성 억제제를 수득하기 위한 플라스미노겐 또는 플라스민의 생체내 효소 촉매작용)에 의해 합성할 수 있다. 재조합 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 DNA원으로부터의 유전자 증폭 및 역전사효소/PCR을 사용한 RNA원으로부터의 유전자 증폭을 포함한다.
본 발명은 또한 내피 세포 증식 억제제를 암호화하는 DNA 서열을 함유하고 세포내에 존재시 억제제를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물, 억제제 또는 단편 또는 동족체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하고 세포내에 존재시 억제제를 발현할 수 있는 벡터를 함유하는 세포를 포함하는 조성물, 및 억제제를 암호화하는 DNA 서열을 함유하고 세포내에 존재시 억제제를 발현할 수 있는 벡터를 함유하는 세포를 인간 또는 비-인간 동물로 이식함을 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 상동성인"은 억제제 아미노산 및 핵산 서열에 관하여 사용할 경우 내피 세포 증식 억제 활성을 갖고 대략의 분자량을 갖고 또한 본원에 기재된 특정 N-말단 아미노산 서열을 갖는, 단백질에 고도의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 대략의 분자량 및 본원에 기재된 특정 N-말단 아미노산 서열에 고도의 상동성을 갖는 내피 세포 증식 억제제를 암호화하는 핵산 서열을 의미한다.
고도의 상동성은 적어도 약 80% 아미노산 상동성, 바람직하게는 적어도 약 90% 아미노산 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 약 95% 아미노산 상동성을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "내피 억제 활성"은 일반적으로 맥관형성을 억제하는, 예를 들면, 섬유아세포 생장 인자의 존재하에 배양시 소의 모세관 내피 세포의 생장을 억제하는 분자의 능력을 의미한다.
본 발명은 또한 암과 같은 질병의 진단 또는 예지의 목적으로 생체 유체 및 조직내 억제제의 검출을 포함한다. 본 발명은 또한 세포 및 조직내 억제제 결합 부위 및 수용체의 검출을 포함한다. 본 발명은 또한 맥관형성 질병 및 관절염 및 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 과정을 억제제의 생성을 자극함으로써, 및/또는 분리된 억제제 또는 바람직한 정제 억제제 또는 억제제 효능제 또는 길항제, 및/또는 억제제-특이 항혈청 또는 억제제-특이 항혈청에 대해 관련된 항혈청을 환자에게 투여함으로써 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 부가적인 치료 방법은 억제제, 생물학적으로 활성인 단편, 억제제 동족체, 억제제-특이 항혈청, 또는 세포독성제에 연결된 억제제 수용체 효능제 및 길항제를 포함한다.
억제제를 특이적으로 결합시키는 항체를 사용하는 수동적인 항체 치료는 맥관형성-의존성 과정, 예를 들면, 생식, 발생 및 상처 치유 및 조직 복구를 조절하기 위해서 사용될 수 있다. 또한 억제제-특이 항체의 Fab 영역에 관련된 항혈청을 억제제를 결합시키는 내생 억제제-특이 항혈청의 능력을 억제하기 위해서 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자, 이로인해 억제제를 암호화하는 유전자가 환자내에서 조절되는 요법를 포함한다. 유전자 산물 단백질의 발현을 위한, 달리 유전자 치료라고 언급되는 DNA를 전달하거나 이송하는 다양한 방법이 본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 문헌 [참조: Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 (1992)]에 기재되어 있다. 유전자 치료는 생체외 또는 생체내 치료에 사용하기 위한 체세포 또는 생식 세포로 DNA 서열을 혼입함을 포함한다. 유전자 치료는 유전자를 대체하고 정상 또는 비정상 유전자 작용을 증대시키고 전염성 질병 및 기타 병리상태를 퇴치하는 기능을 한다.
이러한 의학적 문제를 유전자 치료로 치료하기 위한 전략은 결함있는 유전자의 기능을 대체하거나 약간 기능성인 유전자를 증대시키기 위해서 결함있는 유전자를 동정하고 이어서 기능성 유전자를 첨가함과 같은 치료 전략; 또는 상태를 처리하고 조직 또는 기관을 좀더 치료 양생법에 더욱 민감성이 되도록 할 산물 단백질을 위한 유전자를 첨가함과 같은 예방 전략을 포함한다. 예방 전략의 예로서, 억제제를 암호화하기 위한 핵산 서열을 환자에게 배치하여 맥관형성의 발생을 방지할 수 있거나 종양 세포를 방사선에 더욱 민감성이 되도록 하는 유전자가 삽입되고 이어서 종양의 방사선 처리가 종양 세포의 증가된 사멸을 유발할 것이다.
억제제 DNA 또는 억제제 조절 서열의 전달을 위한 다수의 프로토콜이 본 발명에서 계획된다. 억제제와 특이적으로 연계된 통상적으로 발견된 것이 아닌 프로모터 서열의 형질감염 또는 억제제 단백질의 생성을 증가시킬 기타 서열이 또한 유전자 치료의 방법으로서 계획된다. 이러한 기술의 예가 매사추세츠 캠브리지의 Transkaryotic Therapeis, Inc.에서 세포내 에리스로포이에틴 유전자를 작동시키는 "유전자 스위치"를 삽입하는 상동 재조합을 사용하여 발견되었다 [참조문헌: Genetic Engineering News, April 15, 1994]. 이러한 "유전자 스위치"는 보통 억제제(또는 억제제를 위한 수용체)를 발현하지 않는 세포내에서 억제제(또는 억제제 수용체)를 활성화하기 위해서 사용될 수 있다.
유전자 치료를 위한 유전자 전달 방법은 3 가지의 광범위한 범주, 물리적 (예를 들면, 전기영동, 직접 유전자 전달 및 입자 충격), 화학적 (지질 기제 담체, 또는 기타 비-바이러스 벡터) 및 생물학적 (바이러스-유도 벡터 및 수용체 획득) 범주에 속한다. 예를 들면, DNA로 코팅된 리포좀을 포함하는 비-바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 리포좀/DNA 복합체를 환자에게 직접 정맥내로 주사할 수 있다. 리포좀/DNA 복합체가 DNA를 마크로파지 및 Kupffer 세포를 이송하는 간에서 농축된다고 여겨진다. 이러한 세포는 오래 살고 따라서 이송된 DNA의 장기 발현을 제공한다. 또한, 벡터 또는 유전자의 "네이키드" DNA를 치료 DNA의 표적화된 이송을 위해 목적하는 기관, 조직 또는 종양으로 직접 주사할 수 있다.
유전자 치료 방법은 또한 이송 부위에 의해 설명될 수 있다. 유전자를 이송하는 기본적인 방법은 생체외 유전자 전달, 생체내 유전자 전달, 및 생체내 유전자 전달을 포함한다. 생체외 유전자 전달에서, 세포를 환자로부터 취하여 세포 배양액에서 배양한다. DNA를 세포로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 수적으로 확장하고 이어서 환자에게 재이식한다. 생체내 유전자 전달에서, 형질전환된 세포는 배양액에서 생장하는 세포, 예를 들면, 조직 배양 세포이고 특별한 환자로부터의 특별한 세포가 아니다. 이러한 "실험실 세포"를 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 선별하고 환자로의 이식을 위해 또는 기타 용도를 위해 확장한다.
생체내 유전자 전달은 세포가 환자내에 있을 경우 DNA를 환자의 세포로 도입함을 포함한다. 방법은 환자의 유전자를 이송하기 위해서 비감염 바이러스를 사용하는 바이러스 매개 유전자 전달을 사용하거나 네이키드 DNA를 환자의 부위로 주입함을 포함하고 DNA는 유전자 산물 단백질이 발현되는 세포의 퍼센티지에 의해서 취해진다. 또한 본원에 기재된 다른 방법, 예를 들면, "유전자 총"의 사용은 내피 세포 증식 억제제 DNA 또는 억제제 조절 서열의 생체내 삽입을 위해 사용될 수 있다.
유전자 치료의 화학적인 방법은 DNA를 세포막을 가로질러 수송하는, 반드시 리포좀이 아닌 지질 기제 화합물을 포함할 수 있다. 리포펙틴 또는 사이포펙틴, 음으로 하전된 DNA에 결합하는 지질-기제 양이온은 세포막을 건널 수 있는 복합체를 제조하고 DNA를 세포 내부로 공급한다. 다른 화학적 방법은 특정 리간드를 세포 표면 수용체에 결합시키고 둘러싸고 이것을 세포막을 가로질러 수송함을 수반하는 수용체-기제 내포작용을 사용한다. 리간드가 DNA에 결합하고 전체 복합체가 세포로 수송된다. 리간드 유전자 복합체가 혈류로 주입되고 이어서 수용체를 갖는 표적 세포가 리간드를 특이적으로 결합시키고 리간드-DNA 복합체를 세포로 수송한다.
다수의 유전자 치료 방법은 유전자를 세포로 삽입하기 위해서 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들면, 선택된 레트로바이러스 벡터를 유전자를 말초 및 종양-침투 림프구, 간세포, 표피 세포, 근세포, 또는 기타 체세포로 도입하기 위해서 생체외 방법에서 사용해 왔다. 이러한 변경된 세포를 삽입된 DNA로부터 유전자 산물을 제공하기 위해서 환자에게 도입한다.
바이러스 벡터는 또한 생체내 프로토콜을 사용하여 유전자를 세포로 삽입하기 위해서 사용해왔다. 외부 유전자의 조직-특이성 발현을 지시하기 위해서, 조직 특이성으로 알려져 있는 시스-작용 조절 요소 또는 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 이것은 DNA 또는 바이러스 벡터의 생체내 특이 해부학적 부위로의 자체 이송을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 생체내 혈관으로의 유전자 전달은 선택된 부위 또는 동맥벽의 시험관내에서 형질도입된 내피 세포를 이식함으로써 달성된다. 바이러스는 또한 유전자 산물을 발현하는 주변 세포를 감염시킨다. 바이러스 벡터는 생체 부위로 예를 들면 카테테르에 의해서 직접 이송될 수 있고, 이렇게하여 특정 영역만이 바이러스에 의해서 감염되도록 하고 장기의 부위 특이성 유전자 발현을 공급할 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 사용하는 생체내 유전자 전달이 또한 포유동물 조직 및 간 조직에서 선택된 바이러스의 기관으로 인도하는 혈관으로의 주입에 의해서 입증되었다.
유전자 치료 프로토콜을 위해 사용되어 온 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 폴리오 바이러스 또는 Sindbis 바이러스와 같은 기타 RNA 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스, 허프스 바이러스, SV 40, 박시니아 및 DNA 바이러스가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 복제-결함성 쥐 레트로바이러스 벡터는 가장 널리 이용되는 유전자 전달 벡터이다. 쥐 백혈병 레트로바이러스는 핵산 코어 단백질과 폴리머라제(pol) 효소로 복합되고, 단백질 코어(gag)에 의해 싸여지고 숙주 범위를 결정하는 당단백질 인벨롭(env)에 의해 둘러싸인 일본쇄 RNA로 구성된다. 레트로바이러스의 게놈 구조는 5' 및 3' 긴 말단 반복부 (LTR)에 의해서 에워싸인 gag, pol 및 env를 포함한다. 레트로바이러스 벡터 시스템은 단, 바이러스 구조 단백질이 패키징 세포주에 트랜스로 제공된다는 조건하에, 5' 및 3' LTR과 패키징 시그널을 함유하는 최소 벡터가 벡터 패키징, 감염 및 표적 세포로의 통합을 허용하기에 충분하다는 사실을 이용한다. 유전자 전달을 위한 레트로바이러스 벡터의 기본적인 장점은 대부분의 세포 유형내 효율적인 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체 DNA로의 정확한 단일 복제 벡터 통합 및 레트로바이러스 게놈의 조작의 용이함을 포함한다.
아데노바이러스는 코어 단백질과 복합되고 캡시드 단백질로 둘러싸인 선형, 이본쇄 DNA로 구성된다. 분자 바이러스학에서의 진보는 신규 유전자 서열을 생체내 표적 세포로 형질감염시킬 수 있는 벡터를 생성하기 위해서 이러한 미생물학을 이용하는 능력으로 이끌었다. 아데노바이러스-기제 벡터는 유전자 산물 펩티드를 높은 수준으로 발현할 것이다. 아데노바이러스는 저역가의 바이러스로도 고효율의 감염성을 갖는다. 또한, 바이러스가 세포 유리 비리온으로서 완전히 감염성이어서 생성자 세포주의 주입은 필수적이지 않다. 아데노바이러스 벡터의 다른 잠재적인 장점은 생체내 이종 유전자의 장기적인 발현을 달성하는 능력이다.
DNA 이송의 기계적인 방법은 융합유전자 지질 소포, 예를 들면, 리포좀 또는 막 융합을 위한 기타 소포, 리포펙틴과 같은 양이온성 지질을 포함하는 DNA의 지질 입자, DNA의 폴리리신-매개 전달, DNA의 직접 주입, 예를 들면, DNA의 체세포 또는 생식 세포로의 미세주입, 공기로 이송되는 DNA-코팅된 입자, 예를 들면 "유전자 총"에 사용되는 금 입자, 및 무기 화학적 접근법, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 형질감염을 포함한다. 다른 방법, 리간드-매개 유전자 치료는 DNA를 특정 세포 또는 조직으로 인도하는 리간드-DNA 접합체를 형성하기 위해서 특정 리간드와 DNA를 복합시킴을 수반한다.
플라스미드 DNA를 근육 세포로 주입함은 높은 퍼센티지의 형질감염된 세포를 수득하고 마커 유전자를 지속적으로 발현시킨다. 플라스미드의 DNA는 세포의 게놈으로 통합되거나 될 수 없다. 형질감염된 DNA의 비-통합은 장기간 동안 말단에서 분화된 비-증식 조직에서 세포 또는 미토콘드리아 게놈내 돌연변이 삽입, 결실 또는 변경을 우려하지 않고 형질감염 및 유전자 산물 단백질의 발현을 허용한다. 장기간이지만 반드시 영속적이지 않은 특정 세포로의 치료 유전자의 전달은 유전자 질병의 치료 또는 예방의 용도를 제공할 수 있다. DNA는 수령 세포의 게놈내에 돌연변이를 발생시키지 않으면서 유전자 산물 수준을 유지하기 위해서 주기적으로 재주입될 수 있다. 외생 DNA의 비-통합은 다양한 유전자 산물을 발현하는 모든 구조물과 함께 한 세포내의 여러 다른 외생 DNA 구조물의 존재를 허용할 수 있다.
입자-매개 유전자 전달 방법은 식물 조직의 형질전환에서 최초로 사용되었다. 입자 충격 장치, 또는 "유전자 총"으로, 동력을 DNA-코팅 고밀도 입자(예를 들면, 금 또는 텅스텐)를 표적 기관, 조직 또는 세포의 침투를 허용하는 높은 속도로 가속하기 위해서 생성한다. 입자 충격은 DNA를 세포, 조직 또는 기관으로 도입하기 위해서 시험관내 시스템에서 또는 생체외 또는 생체내 기술로 사용할 수 있다.
유전자 전달을 위한 전기투공은 전류를 사용하여 세포 또는 조직이 전기투공-매개 유전자 전달되기 쉽게 만든다. 주어진 장 강도를 갖는 짧은 전기 임펄스를 사용하여 DNA 분자가 세포로 침투할 수 있도록 막의 투과도를 증가시킨다. 이러한 기술은 DNA를 세포, 조직 또는 기관으로 도입하기 위해서 시험관내 시스템에서, 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용될 수 있다.
생체내 담체 매개 유전자 전달은 외부 DNA를 세포로 형질감염시키기 위해서 사용될 수 있다. 담체-DNA 복합체는 생체 유체 또는 혈류 및 이어서 생체내 표적 기관 또는 조직으로 특이적으로 인도되는 부위로 편리하게 도입될 수 있다. 리포솜과 폴리양이온, 예를 들면, 폴리리신, 리포펙틴 또는 사이포펙틴이 사용될 수 있다. 리포좀은 세포 특이적이거나 기관 특이적인 리포좀을 생성할 수 있고 이렇게하여 리포좀에 의해 운반된 외부 DNA는 표적 세포에 의해 흡인될 것이다. 특정 세포상의 특정 수용체에 표적화되는 이뮤노리포좀의 주입은 DNA를 수용체를 생성하는 세포에 주입하는 통상의 방법으로서 사용될 수 있다. 사용된 다른 담체 시스템은 생체내 유전자 전달을 위해 DNA를 간세포로 운반하기 위한 아시알로글리코프로테인/폴리리신 접합체 시스템이다.
형질감염된 DNA는 또한 DNA가 수령 세포로 운반되고 이어서 세포질 또는 핵질내 체류하도록 기타 종류의 담체와 함께 복합체를 형성할 수 있다. DNA는 특이적으로 공학처리된 복합체내 담체 핵 단백질에 커플링되고 핵으로 직접 운반될 수 있다.
본 발명의 억제제의 유전자 조절은 전사율 또는 해독율을 변경하기 위해서 억제제를 위한 유전자, 또는 유전자에 연계된 조절 영역, 또는 상응하는 RNA 전사물에 결합하는 화합물을 투여함으로써 달성될 수 있다. 또한, 억제제를 암호화하는 DNA로 형질감염된 세포를 억제제의 생체내 생산원을 공급하기 위해서 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 세포를 억제제를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터로 형질감염시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 특정 핵산 서열을 세포로 수송하는 기능을 하는, 특정 핵산 서열을 함유하거나 이와 연계될 수 있는 담체를 의미한다. 벡터의 예에는 플라스미드 및 감염성 미생물, 예를 들면, 바이러스, 또는 비-바이러스 벡터, 예를 들면, 리간드-DNA 접합체, 리포좀, 지질-DNA 복합체가 포함된다. 내피 세포 증식 억제제 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자는 억제제를 발현할 수 있는 발현 벡터를 형성하기 위해서 발현 조절 서열에 작동적으로 연결됨이 바람직할 수 있다. 형질감염된 세포는 환자의 정상 조직, 환자의 질병 조직으로부터 유도된 세포일 수 있거나 비-환자 세포일 수 있다.
예를 들면, 환자로부터 제거된 종양 세포는 본 발명의 억제제 단백질을 발현할 수 있는 벡터로 형질감염되고 환자로 재도입될 수 있다. 형질감염된 종양 세포는 종양의 생장을 억제하는 환자내 억제제의 수준을 생성한다. 환자는 인간이거나 비-인간 동물일 수 있다. 또한 억제제 DNA는 담체의 보조없이 환자에게 직접 주입될 수 있다. 특히, 억제제 DNA는 피부, 근육 또는 혈액으로 주입될 수 있다.
억제제 발현은 장시간 동안 계속될 수 있거나 억제제 DNA는 세포, 조직 또는 기관 또는 생물학적 유체내 억제제 단백질의 바람직한 수준을 유지하기 위해서 정기적으로 투여될 수 있다.
하기의 가설에 의해 구속될 필요는 없지만, 종양이 맥관형성성이 될 경우, 국부적으로 작용하고 혈관외 방향으로부터 1차 종양의 인접부의 내피세포를 표적화하고 순환하지 않는 (또는 단기 반감기로 순환하는) 하나 이상의 맥관형성 펩티드 (예를 들면, aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF 등)를 방출한다고 여겨진다. 이러한 맥관형성 펩티드는 군을 계속해서 확장하려는 1차 종양에 대한 내피 세포 억제제 (맥관형성의 억제제)의 작용을 극복하기에 충분한 양으로 생성되어야 한다. 일단 이러한 1차 종양이 잘 생장하고 있다면, 이것은 내피 세포 억제제를 순환중으로 계속해서 방출한다. 이러한 가설에 따라서, 이러한 억제제는 1차 종양으로부터 원거리에서 작용하고 혈관내 방향으로부터 전이의 모세관 내피세포를 표적화하고 계속해서 순환한다. 따라서, 원거리에 있는 전이가 맥관형성을 개시하기 시작할 시기에, 주변부의 모세혈관 내피세포는 들어오는 억제제에 의해 억제될 수 있다.
본 발명의 대략의 내피 세포 증식 억제제의 생성이 (1) 본원에 기재되고 도면에 의해 예시된 억제제를 동정하고 정제하고, (2) 정제된 억제제의 N-말단 아미노산 서열을 결정하고, (3) 억제제 서열을 위해 5' 및 3' DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성으로 생성하고 (4) 억제제 유전자 서열을 폴리머라제를 사용하여 증폭하고 (5) 증폭된 서열을 발현 벡터와 같은 적합한 백터로 삽입하고 (6) 벡터를 함유하는 유전자를 미생물 또는 억제제 유전자를 발현할 수 있는 기타 발현 시스템으로 삽입하고 (7) 재조합으로 생성된 억제제를 분리하는 단계를 포함하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 달성될 수 있는 유사한 방법을 사용하여 달성된다. 적합한 벡터에는 바이러스, 세균 및 진핵세포 (예를 들면, 효모) 발현 벡터가 포함된다. 상기의 기술은 본원에 참조로 인용되는 실험 매뉴얼 [참조: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989]에 더욱 상세히 기술되어 있다.
억제제, 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 생성하는 다른 방법은 펩티드 합성에 의한 것이다. 억제제의 아미노산 서열은 예를 들면, 자동화된 펩티드 서열분석 방법에 의해 결정할 수 있다. 또한, 억제제를 암호화하는 유전자 또는 DNA 서열은 예를 들면, 상술된 방법에 의해서 분리되고, DNA 서열은 당해분야의 익히 공지된 매뉴얼 또는 자동화된 서열분석 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 핵산 서열은 순서대로 아미노산 서열에 관한 정보를 제공한다.
일단 펩티드의 아미노산 서열을 알면, 펩티드 단편은 당해분야에 익히 공지되고 문헌[참조: "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton and R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford, England]에 의해 예시된 기술에 의해서 합성될 수 있다. 더 큰 단편을 형성하기 위해서 함께 연속적으로 연결된 다중 단편을 합성할 수 있다. 이러한 합성 펩티드 단편을 시험관내 및 생체내 효능제 및 길항제 활성을 시험하기 위해서 특정 위치에서 아미노산 치환으로 제조할 수 있다. 조직에 높은 친화성을 갖는 펩티드 단편을 친화성 컬럼 상에서 억제제를 결합시키는 수용체를 분리하기 위해서 사용할 수 있다.
억제제는 내피 세포 증식을 매개하거나 수반하는 맥관형성과 같은 질병 또는 과정 치료시 효과적이다. 본 발명은 맥관형성 매개 질병을 유효량의 억제제, 또는 생물학적으로 활성인 단편, 또는 항-맥관형성 활성을 집합적으로 소유하는 억제제 단편의 조합 또는 억제제 효능제 또는 길항제로 치료하는 방법을 포함한다. 맥관형성 매개 질병에는 충실성 종양; 혈액성 종양, 예를 들면, 백혈병; 종양 전이; 양성 종양, 예를 들면, 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마, 및 화농성 육아종; 류마티스성 관절염; 건선; 눈 맥관형성 질환, 예들 들면, 당뇨성 망막증, 조숙 망막증, 반점 퇴행, 각막 이식 거부증, 신혈관형성 녹내장, 수정체뒤 섬유증식증, 피부조홍; 오슬러-웨버 증후군; 심근 맥관형성; 플라크 신혈관형성; 모세관확장증; 혈우병 조인트; 섬유성혈관종 및 상처 과립형성이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
억제제는 내피 세포의 과도하거나 비정상적인 자극의 질병의 치료에 유용하다. 이러한 질병에는 내장 고착증, 아테롬성동맥경화증, 경피증 및 비대성 상처, 예를 들면, 켈로이드가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 억제제는 배 이식에 요구되는 혈관형성을 방해함으로써 산아 조절제로서 사용될 수 있다. 억제제는 묘조병(Rochele minalia quintosa) 및 궤양(Helicobacter pylori)과 같은 병리학적 결과로서 맥관형성하는 질병의 치료에 유용하다.
억제제의 합성 펩티드 단편은 다양한 용도를 지닌다. 억제제를 높은 특이성 및 결합성으로 결합시킬 수 있는 수용체에 결합하는 펩티드는 방사 표지되어 방사선촬영술 및 막 결합 기술을 사용하여 결합 부위의 가시화 및 정량을 위해 사용된다.
또한, 억제제 또는 펩티드 단편을 단생의 동위원소로 표지함은 종양을 억제제 결합 부위와 배치하기 위해서 수용체 결합 부위를 양전자 방출 단층촬영법 또는 기타 현대 방사선촬영술을 사용하여 생체내에서 가시화할 수 있게 한다.
리신과 같은 세포독성제는 억제제 및 고친화성 펩티드 단편과 연결되고, 이로인해 억제제를 결합시키는 세포 파괴 기구가 제공된다. 이러한 세포는 미세전이 및 1차 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 위치에서 발견할 수 있다. 세포독성제와 연결된 펩티드는 목적하는 위치로의 이송은 최대화하기 위해서 디자인된 방법으로 주입된다. 예를 들면, 이송은 캐뉼러를 통하여 표적 부위를 공급하는 혈관 또는 표적으로 직접 달성될 수 있다. 이러한 시제는 또한 주입 캐뉼라에 커플링된 삼투 펌프를 통하여 조절된 방식으로 이송된다. 억제제 맥관형성제의 배합물을 조직의 혈관형성을 증가시키기 위해서 맥관형성 자극제와 함께 적용시킬 수 있다. 이러한 치료 양생법은 전이성 암을 퇴치하는 효과적인 방법을 제공한다.
억제제를 질병 치료를 위해 기타 조성물 및 절차와 병행하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 종양은 억제제와 병행한 수술, 방사선처리 또는 화학요법으로 통상적으로 치료될 수 있고 이어서 억제제를 미세전이의 휴면을 연장하고 잔여 1차 종양의 생장을 억제하기 위해서 환자에게 후속적으로 투여할 수 있다. 또한, 억제제, 이의 단편, 억제제-특이성 항혈청, 억제제 수용체 효능제 및 길항제, 또는 이들의 배합물을 치료 조성물을 형성하기 위해서 약학적으로 허용되는 부형제, 임의로 지속-방출 매트릭스, 예를 들면 생분해 중합체와 배합한다.
본원에 사용된 지속-방출 매트릭스는 효소 또는 산/염기 가수분해에 의해 또는 용해에 의해 분해가능한 물질, 보통 중합체이다. 일단 신체에 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 작용한다. 지속-방출 매트릭스는 바람직하게는 생체상용성 물질, 예를 들면, 리포좀, 폴리락타이드 (폴리락트산), 폴리글리콜라이드 (글리콜산의 중합체), 폴리락타이드 코-글리콜라이드 (락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리안하이드라이드, 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알우론산, 콜라겐, 황산 콘드로이틴, 카복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘 중에서 선택된다. 바람직한 생분해 매트릭스는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 또는 폴리락타이드 공-글리콜라이드 (락트산과 글리콜산의 공중합체) 중의 하나의 매트릭스이다.
본 발명의 맥관형성-조절 치료 조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸일 수 있고 공지된 투여 경로에 의해서 투여될 수 있다. 고체 치료 조성물의 예에는 환제, 크림 및 주입가능한 용량 단위가 포함된다. 환제는 경구 투여되고 치료 크림은 국부 투여될 수 있다. 주입가능한 용량 단위는 국부적으로, 예를 들면, 종양 부위에 또는 치료 맥관형성-조절 조성물의 전신성 방출을 위해 주입될 수 있는 곳에, 예를 들면, 피하에 투여될 수 있다. 액체 조성물의 예에는 피하, 정맥내, 동맥내 주사를 위해 적용된 제형, 및 국부적 및 안내 투여를 위한 제형이 포함된다. 에어로졸 제형의 예로는 폐로의 투여를 위한 흡입 제형이 포함된다.
본 발명의 억제제 단백질은 또한 억제제 및 이의 수용체에 특이적인 항체를 생성하기 위해서 사용될 수 있다. 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 억제제 또는 억제제 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 진단 방법 및 생체 유체 또는 조직내 억제제 수준 또는 억제제 수용체의 수준을 검출하고 정량하기 위해서 당해분야 전문가들에게 익히 공지된 키트에 사용될 수 있다. 이러한 시험으로부터의 결과는 암 및 기타 맥관형성 매개 질병의 발생 또는 재발을 진단하고 예지하기 위해서 사용될 수 있다.
억제제는 또한 억제제와 결합할 수 있는 항체를 검출하고 정량하기 위한 진단 방법 및 키트의 개발에 사용될 수 있다. 이러한 키트는 순환하는 억제제-특이 항체의 검출을 허용할 것이다. 이러한 순환하는 항-억제제 항체를 지닌 환자는 다발성 종양 및 암을 더 일으키기 쉬울 수 있고 치료 또는 경감기 후 암이 재발하기 더 쉬울 수 있다. 이러한 항체의 Fab 단편은 항-억제제 항체를 중화하기 위해서 사용될 수 있는 항-억제제-특이 Fab-단편 항혈청을 생성하기 위해서 항원으로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 항-억제제 항체에 의해 순환하는 억제제의 제거를 감소시키고, 이로인해 순환하는 억제제 수준을 효과적으로 상승시킨다.
본 발명의 다른 양태는 과량 내생 억제제의 작용을 차단하는 방법이다. 이것은 인간 또는 동물을 계내에서 바람직하지 않은 억제제에 특이적인 항체로 수동적으로 면역시킴으로서 수행될 수 있다. 이러한 치료는 비정상적인 배란, 월경 및 태반형성 및 혈관형성 치료에 중요하다. 이것은 억제제 제거의 전이 과정에 대한 영향을 조사하기 위한 유용한 기구를 제공한다. 억제제-특이 항체의 Fab 단편은 억제제를 위한 결합 부위를 함유한다. 이러한 단편은 당해분야에 공지된 기술을 사용하여 억제제-특이 항체로부터 분리된다. 억제제-특이 항혈청의 Fab 단편은 항-Fab 단편 혈청의 생성을 유발하기 위해서 항원으로서 사용된다. 억제제에 특이적인 Fab 단편에 대해 이러한 항혈청의 주입은 억제제가 억제제 항체에 결합하는 것을 방지한다. 치료 이점은 억제제가 항-억제제의 Fab 단편에 결합하는 것을 차단함으로써 내생 항-억제제 항체를 중화함으로써 수득된다. 이러한 치료의 네트 효과는 표적 세포에 도달하는 내생 순환 억제제의 능력을 촉진하여, 전이의 확산을 감소시키는 것이다.
본 발명이 내피 세포 증식 억제 활성을 갖는 억제제의 유도체를 포함하는 것으로 사려됨이 이해되어야 한다. 본 발명은 전체 억제제 단백질, 억제제 단백질의 유도체, 억제제 단백질의 생물학적-활성 단편을 포함한다. 이들은 아미노산 치환을 갖거나 아미노산 작용 그룹에 부착된 당 또는 기타 분자를 갖는 억제제 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 억제제 및 억제제 수용체를 암호화하는 유전자 및 이들 유전자에 의해서 발현되는 단백질을 포함한다.
상술된 억제제 활성을 갖는 단백질 및 단백질 단편이 당해분야에 공지된 제형 방법을 사용하여 약학적으로 허용되는 제형내의 분리되고 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 이러한 제형은 표준 경로에 의해서 투여될 수 있다. 일반적으로 배합물은 국부, 경피, 복강내, 두개골내, 대뇌실내, 대뇌내, 초막내, 자궁내, 경구, 직장 또는 비경구(예를 들면, 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한 억제제는 화합물의 지속 방출을 허용하는 생분해 중합체에 혼입될 수 있고, 중합체는 약물 이송이 바람직한 부근에, 예를 들면, 종양 부위에 주입되고, 억제제가 체계적으로 서서히 방출되도록 주입된다. 삼투압 미니펌프는 전이 생장으로 직접 또는 그 종양으로의 혈관 공급으로와 같이 캐뉼라를 통해 해당 부위로의 고농도의 억제제의 조절된 이송을 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 생분해 중합체 및 이의 사용이 예를 들면 본원에 참조로 인용되는 문헌[참조: Brem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991)]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 억제제의 용량은 질병 상태 또는 치료되는 증상 및 인간 또는 동물의 체중 및 증상과 같은 임상적 인자 및 화합물 투여의 경로에 좌우될 것이다. 인간 또는 동물의 치료를 위해, 억제제 대략 0.5 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏이 투여될 수 있다. 특히 동물 또는 인간에서는 억제제의 반감기에 따라, 하루에 여러 번 내지 일주일에 한 번 정도로 억제제가 투여될 수 있다. 본 발명은 인간과 가축용 모두로 적용됨이 이해될 수 있다. 본 발명의 방법은 동시에 또는 장기간에 걸쳐 1회 및 다수의 투여가 제공되는 것으로 숙지되고 있다.
억제제 제형은 경구, 직장, 눈(유리체내 또는 카메라내 포함), 비강, 국소(구강 및 혀밑 포함), 자궁내, 질 또는 비경구(피하, 복강내, 근육내, 정맥내, 피내, 두개내, 기관내, 및 경막외 포함) 투여에 적당한 것을 포함한다. 억제제 제형은 편의상 단위 투여량의 형태로 존재할 수 있고 종래의 약학 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분과 약학 담체 또는 부형제와의 결합 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 균일하면서도 밀접하게 액형 담체 또는 미세하게 등분된 고형 담체 또는 이 둘 모두와 활성 성분을 결합한 다음, 필요시, 산물의 형상을 취해 제조된다.
비경구 투여에 적당한 제형은 의도된 수용체의 혈액과 등장성인 제형을 만드는 항-산화제, 완충액, 제균제 및 용출제를 함유한 수성 및 비-수성 살균 주사액; 및 현탁제와 농후제를 포함한 수성 및 비-수성 살균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들면, 봉입된 앰풀 및 작은 병에 존재할 수 있고, 즉각적인 사용 이전에, 살균성 액형 담체, 예를 들면, 주사용 물의 첨가만을 요구하면서 동결 건조(냉동 건조) 상태로 저장될 수 있다.
바람직한 단위 투여량 제형은 투여된 성분의 일일 투여량 또는 단위, 일일 부-투여량, 또는 적절한 분획을 함유한 것이다. 특히 앞서 언급된 성분 뿐만 아니라, 본 발명의 제형은 제형의 형태가 의심스러운 것으로 간주되는 당해 분야의 종래 기타 시제가 포함될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 임의로는, 환자에게 이중 치료법을 제공하기 위해, 세포 독성제는 억제제 단백질 또는 생물학적 작용 펩티드 분획과 통합되거나 다른 방법에 의해 결합될 수 있다.
본 발명의 맥관형성 억제 펩티드는 표준 마이크로화학 기구에 의해 합성될 수 있고 순도는 HPLC와 질량 분광광도계로 체크될 수 있다. 펩티드 합성, HPLC 정제 및 질량 분광광도계법은 당해분야 전문가에게 일반적으로 공지되어 있다. 억제제 펩티드와 억제제 수용체 펩티드도 또한 재조합 이. 콜라이 또는 효모 발현 시스템에서 생성되고 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제된다.
완전한 억제제 분자의 상이한 펩티드 단편은 특이 항혈청의 개발을 위한 항원, 억제제 결합 부위에서 활성이 있는 효능제 및 길항제, 억제제와 결합하는 세포의 표적화된 사멸을 위한 세포 독성제에 연결되거나 이와 결합하여 사용되는 펩티드를 포함한 여러 적용시 유용하게 합성될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 펩티드로 이루어진 아미노산 서열은 분자의 외부 영역상의 위치에 기초하여 선택되고 항혈청에 결합되도록 접근하기가 쉽다. 억제제의 아미노와 카복실 말단, 및 분자의 중간-영역은 합성 가능한 단편 중 따로따로 표현된다.
이러한 펩티드 서열은 잠재적인 서열 상동성을 결정하기 위해 GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT, 및 PIR과 같은 단백질 서열 데이타베이스를 사용하여 공지된 서열과 비교된다. 이러한 정보는 기타 분자와 높은 정도의 서열 상동성을 나타내는 서열의 제거를 용이하게 하여, 억제제에 대해 항혈청, 효능제 및 길항제의 발달에 있어 높은 특이성에 대한 잠재성을 증진시킨다.
억제제 및 억제제 유도 펩티드는 표준법을 사용하여 기타 분자와 커플링될 수 있다. 억제제의 아미노와 카복실 말단 모두는 티로신과 라이신 잔기를 함유하고 다수의 기술, 예를 들면 종래의 기술(티로신 잔기- 클로라민 T, 이오도겐, 락토퍼록시다제; 라이신 잔기- 볼톤-헌터 시제)을 사용한 방사성 동위원소 표지법을 이용해 동위원소적 및 비동위원소적으로 표지된다. 이러한 커플링 기술은 당해분야 전문가에게 익히 공지되어 있다. 다른 방법에 의해, 티로신 또는 라이신은 펩티드상의 반응성 아미노 및 하이드록실 그룹의 표지를 용이하게 하기위해 이러한 잔기를 지니지 않은 단편에 첨가된다. 커플링 기술은 아미노, 설프하이드릴, 카복실, 아미드, 페놀, 및 이미다졸을 포함한 아미노산에서 이용 가능한 작용 그룹에 기초하여 선택되지만, 이에만 한정되는 것은 아니다. 이러한 커플링을 일으키는데 사용되는 다양한 시제는 기타 중, 글루타르알데히드, 디아조화 벤지딘, 카보디이미드, 및 p-벤조퀴논을 포함한다.
억제제 펩티드는 다양한 적용을 위해 동위원소, 효소, 담체 단백질, 세포 독성제, 형광 분자, 화학발광성, 생물학적발광성 화합물 및 기타 화합물과 화학적으로 커플링된다. 커플링 반응의 효율은 특정 반응에 적절한 상이한 기술을 사용하여 측정된다. 예를 들면, 125I를 지닌 억제제 펩티드의 방사성 동위원소 표지는 높은 특이 활성의 클로라민 T와 Na125I를 사용하여 달성된다. 반응은 나트륨 메타비설파이트를 이용해 종결되고 혼합물은 일회용 컬럼상에서 탈염된다. 표지된 펩티드가 컬럼에서 용출되고 분획이 수집된다. 부분 표본은 각각의 분획에서 제거되고 방사능은 감마 계수관에서 측정된다. 이러한 방법으로, 반응하지 않은 Na125I는 표지된 억제제 펩티드로부터 분리된다. 최고의 특이 방사능을 지닌 펩티드 분획은 억제제 항혈청과의 결합능 분석과 같이 차후의 용도를 위해 저장된다.
펩티드 접합의 또다른 적용은 폴리클로날 항혈청의 생성을 위한 경우이다. 예를 들면, 라이신 잔기를 함유한 억제제 펩티드는 글루타르알데히드를 사용하여 정제된 소 혈청 알부민과 연결된다. 반응의 효율은 방사성 동위원소로 표지된 펩티드의 결합을 측정하여 결정된다. 반응하지 않은 글루타르알데히드와 펩티드는 투석에 의해 분리된다. 접합체는 차후의 용도를 위해 저장된다.
억제제, 억제제 유사체, 억제제와 억제제 수용체의 펩티드 단편에 특이적인 항혈청이 형성될 수 있다. 펩티드 합성 및 정제 후, 모노클로날 및 폴리클로날 항혈청 모두는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 설정 기술을 사용하여 생성된다. 예를 들면, 폴리클로날 항혈청은 토끼, 양, 염소 또는 기타 동물에서 형성될 수 있다. 소 형청 알부민과 같은 담체 분자 또는 억제제 자체와 접합된 억제제 펩티드는 보조 혼합물과 합쳐지고, 유화되며 등, 목, 옆구리 및 때때로 풋패드상의 다수 부위에 피하 주사된다. 부스터 주사는 2 내지 4 주당과 같이, 일정한 간격으로 이루어진다. 혈액 샘플은 예를 들면, 주사 후 대략 7 내지 10일 간의 확장 후, 가장자리 귀 정맥을 이용하여, 정맥천자에 의해 수득된다. 혈액 샘플은 4℃에서 밤새 응고되고 4℃에서 약 30 분간 대략 2400 X g으로 원심분리된다. 혈청은 제거되고, 부분 표본화되며 즉각적인 용도를 위해서는 4℃, 또는 차후의 분석을 위해서는 -20 내지 -90℃에서 저장된다.
폴리클로날 항혈청에서 발생된 모든 혈청 샘플 또는 모노클로날 항혈청에서 생성된 배지 샘플은 항체 역가의 측정을 위해 분석된다. 역가는 예를 들면, 도트 블랏과 밀도 분석을 이용한 여러 방법, 및 단백질 A, 2차 항혈청, 콜드 에탄올 또는 목탄-덱스트란을 이용해 방사성 동위원소로 표지된 펩티드-항체 복합체의 침전에 이어 감마 계수관을 이용한 활성 측정을 통해 설정된다. 최고의 역가 항혈청도 또한 시판되는 친화성 컬럼상에서 정제된다. 억제제 펩티드는 친화성 컬럼에서 겔과 커플링된다. 항혈청 샘플은 컬럼을 통과하고 항-억제제 항체는 컬럼에 결합되어 남아있게 된다. 이러한 항체는 차후 용출되고, 수집되며 역가 및 특이성 측정을 위해 평가된다.
최고의 역가 억제제-특이 항혈청은 하기의 a) 항원의 최고의 특이 결합과 최저의 비특이 결합을 위한 최적 항혈청 희석, b) 표준 치환 곡선에서 억제제 펩티드의 증가된 양과의 결합능, c) 관련 펩티드 및 관련 종의 단백질과의 잠재적인 가교-반응성, d) 혈장, 소변, 조직, 및 세포 배양 배지의 추출물에서 억제제 펩티드의 검출능을 설정하기 위해 시험된다.
억제제 및 억제제 수용체의 측정용 키트도 또한 본 발명의 일부로 간주되고 있다. 최고의 역가 및 특이성을 소유하고 혈장, 소변, 조직, 및 세포 배양 배지의 추출물에서 억제제 펩티드를 검출할 수 있는 항혈청은 빠르고, 신뢰성이 있으며, 민감하면서도 특정 측정을 위한 키트의 사용을 용이하게하고 억제제의 배치를 설정하도록 추가 시험되고 있다. 이러한 분석 키트는 하기의 기술; 경쟁 및 비경쟁 분석법, 방사 면역 분석법, 생물학적발광 및 화학발광 분석법, 형광 분석법, 샌드위치 분석법, 면역 방사 분석법, 도트 블롯, ELISA를 포함한 효소 결합 분석법, 마이크로역가 플레이트, 소변 또는 혈액의 빠른 모니터링을 위한 항체 코팅 스트립 또는 딥스틱, 및 면역 세포화학법을 포함하지만 이에만 한정되는 것은 아니다. 각각의 키트의 경우 분석의 범위, 감도, 정밀도, 신뢰도, 특이성 및 재현성이 설정된다. 분석내 및 분석간 편차는 치환 또는 활성의 표준 곡선상의 20%, 50% 및 80% 지점에서 설정된다.
조사 및 임상에서 일반적으로 사용되는 분석 키트의 한 예는 방사 면역 분석 (RIA) 키트이다. 억제제 RIA는 하기에서 설명된다. 성공적인 방사성 요오드화 및 억제제 또는 억제제 펩티드의 정제 후, 최고의 역가를 지닌 항혈청은 적당한 완충 시스템에서 10,000 cpm과 같이 상대적으로 일정한 양의 방사능을 함유한 튜브에 여러번 희석하여 첨가된다. 기타 튜브는 비특이 결합을 측정하기 위해 완충액 또는 예비면역 혈청을 함유한다. 4℃에서 24 시간 동안 배양한 후, 단백질 A를 첨가하고 튜브는 와동하고, 실온에서 90 분간 배양하며, 표지된 항원에 결합된 항체 복합체를 침전시키기 위해 4℃에서 대략 2000 내지 2500 X g으로 원심분리한다. 상등액은 흡인 제거하고 펠렛내의 방사능을 감마 계수관에서 계산한다. 비특이 결합을 제거한 후 표지된 펩티드의 대략 10% 내지 40%와 결합하는 항혈청 희석을 추가 특징으로 한다.
다음, 항혈청의 생성에 사용되는 억제제 펩티드의 희석 범위(대략 0.1 pg 내지 10 ng)는 방사성 동위원소로 표지된 펩티드와 항혈청을 함유한 튜브에 기지량의 펩티드를 첨가시켜 평가한다. 예를 들면, 24 내지 48 시간과 같이, 추가적인 배양 기간 후, 단백질 A를 첨가하고 튜브를 원심분리하며, 상등액을 제거한 다음, 펠렛내의 방사능을 계산한다. 표지되지않은 억제제 펩티드(표준)에 의한 방사성 동위원소로 표지된 억제제 펩티드의 결합의 치환이 표준 곡선을 제공한다. 기타 억제제 펩티드 단편, 상이한 종에서 유래된 억제제, 및 상동 펩티드의 수회 농축물을 억제제 항혈청의 특이성을 특징으로 하기 위해 분석 튜브에 첨가한다.
1차 및 2차 종양, 루이스 폐 종양, 억제제 생성 세포, 태반, 자궁과 뇌, 간 및 장과 같은 기타 조직의 배양액을 포함하는 다양한 조직의 추출물이 제조되지만 이에만 한정되는 것은 아니다. 조직 추출물의 동결 건조 또는 Speed Vac 후, 분석 완충액을 첨가하고 상이한 부분표본을 RIA 튜브에 배치한다. 억제제 생성 세포의 추출물이 표준 곡선에 평행한 치환 곡선을 생성하지만, 억제제를 생성하지 않는 조직의 추출물은 억제제로부터 방사성 동위원소로 표지된 억제제를 치환하지 못한다. 또한, 루이스 폐 종양을 지닌 동물에서 유도된 소변, 혈장, 및 뇌척수액의 추출물을 증가된 양의 분석 튜브에 첨가한다. 평행 치환 곡선은 조직 및 체액에서 억제제를 측정하기 위한 억제제 분석의 유용성을 나타낸다.
억제제를 함유한 조직 추출물은 추가로 부분 표본에 역상 HPLC를 행함을 특징으로 한다. 용출액 분획을 수집하고, Speed Vac에서 건조하며, RIA 완충액에서 재작제하며 억제제 RIA로 분석한다. 최대량의 억제제 면역 반응성이 억제제의 용출 위치에 상응하는 분획에 배치된다.
분석 키트는 사용 설명서, 항혈청, 억제제 또는 억제제 펩티드, 및 가능한 방사성 동위원소로 표지된 억제제 및/또는 결합된 억제제-억제제 항체 복합체의 침전용 시제를 제공한다. 키트는 생물 유체 및 종양을 지니거나 지니지 않은 동물과 인간의 조직 추출물내의 억제제 측정에 유용하다.
또다른 키트는 조직 및 세포에서 억제제의 배치에 사용된다. 이러한 억제제 면역 조직 화학 키트는 사용 설명서, 억제제 항혈청, 및 플루오레신 이소티오시아네이트와 같은 형광 분자, 또는 1차 항혈청을 가시화하는데 사용되는 몇몇 기타 시제에 연결된 가능한 차단 혈청 및 2차 항혈청을 제공한다. 면역 조직 화학 기술은 당해 분야의 숙련인에게 익히 공지되어 있다. 이러한 억제제 면역 조직 화학 키트는 광학 및 전자 현미경 모두를 사용하여 조직 구획과 배양된 세포내에서 억제제의 배치를 가능케 한다. 이는 조사와 임상 목적 모두에 사용된다. 예를 들면, 억제제 생성 부위를 시험하기 위해 종양은 생검이 실시되거나 수집되고 조직 구획은 마이크로톰을 이용해 절단된다. 이러한 정보는 암의 검출 및 치료시 진단과 가능한 치료 목적을 위해 유용하다. 억제제 생합성 부위를 가시화하는 또다른 방법은 억제제 메신저 RNA의 탐침을 위해 정상 위치에서 사용되는 방사성 동위원소로 표지된 핵산이 관련된다. 유사하게는, 억제제 수용체는 면역 조직 화학 기술에 의해 위치가 추정되고, 가시화되며 정량될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 어떠한 방법으로든지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석될 수는 없다. 반면에, 본원의 상세한 설명을 숙지한 후, 당해 분야 전문가가 연상할 수 있는 다양한 기타 양태, 변형 및 등가물에 의지할 수 있음이 명확히 이해될 것이다.
실시예 1
인간 플라스미노겐의 크링글 5의 내피 세포 증식 억제제 활성의 입증
재료: 크링글 5 단편을 얻기 위해 적절한 효소로 인간 플라스미노겐을 절단한다. 펩티드 단편을 분리하고 당해 분야 전문가에게 익히 공지된 단백질과 펩티드 정제의 표준법에 의해 정제한다. 분리된 크링글 5의 순도는 겔 전기영동에 의한 런닝 펩티드의 제조 결과를 도시한 도 2에서 입증되고 있다.
분석: 내피 세포 억제 활성을 소 모관 내피 세포에서 DNA 합성([메틸-H3]타이민 결합)의 억제에 의해 분석한다. 모관 내피 세포는 소 부신에서 제조되고 젤라틴으로 코팅된 48-웰 마이크로타이터 플레이트상에서 배양한다.
다양한 양의 분리된 크링글 5를 배양 세포에 첨가하고 세포 수의 변화를 측정한다. 도 1의 그래프를 얻기 위해 세포수의 변화 %를 배양액에 첨가된 크링글 5의 양에 대한 함수로 도시화한다.
도 3은 인간 플라스미노겐의 크링글 영역 1, 2, 3, 4 및 5에서 유도된 유사한 80개의 아미노산 서열의 비교를 도시하고 있다.
Claims (12)
- 플라스미노겐의 크링글 5 펩티드 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 약 14kD의 분자량을 가지며 맥관형성을 억제하는 활성을 갖는 단백질을 함유함을 특징으로 하는, 맥관형성에 의한 질환 치료제.
- 제1항에 있어서, 단백질이 약 80개의 아미노산인 치료제.
- 제1항에 있어서, 플라스미노겐이 인간 플라스미노겐인 치료제.
- 제1항에 있어서, 단백질이 인간 플라스미노겐의 약 아미노산 462에서 시작하여 약 80개의 아미노산을 연장하는 아미노산 서열을 갖는 치료제.
- 제1항에 있어서, 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 치료제.
- 제1항에 있어서, 단백질이 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 치료제.
- 플라스미노겐의 크링글 5 펩티드 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드로서, 약 14kD의 분자량을 가지며 맥관형성을 억제하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 함유함을 특징으로 하는, 맥관형성에 의한 질환 치료제.
- 제7항에 있어서, 단백질이 약 80개의 아미노산인 치료제.
- 제7항에 있어서, 플라스미노겐이 인간 플라스미노겐인 치료제.
- 제7항에 있어서, 단백질이 인간 플라스미노겐의 약 아미노산 462에서 시작하여 약 80개의 아미노산을 연장하는 아미노산 서열을 갖는 치료제.
- 제7항에 있어서, 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 치료제.
- 제7항에 있어서, 단백질이 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 치료제.
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