CZ182898A3 - Inhibitor proliferace endothelových buněk a jeho použití - Google Patents
Inhibitor proliferace endothelových buněk a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ182898A3 CZ182898A3 CZ981828A CZ182898A CZ182898A3 CZ 182898 A3 CZ182898 A3 CZ 182898A3 CZ 981828 A CZ981828 A CZ 981828A CZ 182898 A CZ182898 A CZ 182898A CZ 182898 A3 CZ182898 A3 CZ 182898A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- inhibitor
- protein
- cells
- peptide
- amino acid
- Prior art date
Links
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title abstract description 218
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 108
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 69
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 54
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 44
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 42
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 18
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 7
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 27
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 27
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 16
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 15
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 15
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 15
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 11
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 10
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 10
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 9
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 9
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 9
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 7
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 5
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 102000008076 Angiogenic Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010074415 Angiogenic Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 4
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 4
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 4
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 4
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 229940121863 DNA inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003732 Cat-scratch disease Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N Lactic Acid Natural products CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 206010037649 Pyogenic granuloma Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- 206010043189 Telangiectasia Diseases 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 230000002482 anti-endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 230000010046 negative regulation of endothelial cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000009056 telangiectasis Diseases 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000050 Abdominal adhesions Diseases 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical compound NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011017 Corneal graft rejection Diseases 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 201000004404 Neurofibroma Diseases 0.000 description 1
- MSHZHSPISPJWHW-PVDLLORBSA-N O-(chloroacetylcarbamoyl)fumagillol Chemical compound C([C@H]([C@H]([C@@H]1[C@]2(C)[C@H](O2)CC=C(C)C)OC)OC(=O)NC(=O)CCl)C[C@@]21CO2 MSHZHSPISPJWHW-PVDLLORBSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 229940122791 Plasmin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000390203 Trachoma Species 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000007488 abnormal function Effects 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 208000004064 acoustic neuroma Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 208000021921 corneal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N fumagillin Chemical class C([C@H]([C@H]([C@@H]1[C@]2(C)[C@H](O2)CC=C(C)C)OC)OC(=O)\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O)C[C@@]21CO2 NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M iodine-131(1-) Chemical compound [131I-] XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 208000011906 peptic ulcer disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002806 plasmin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Inhibitor proliferace endothelových buněk a jeho použití
Tento vynález mohl být vytvořen s vládní podporou grantu P01-CA45548 National Institutes of Health. Vláda Spojených států může na tento vynález uplatňovat určitá práva.
Oblast techniky
Fředložený vynalez. tyká nuvych xiihrbitoru proliferace endothelových buněk. Inhibitor je schopen inhibovat choroby související s angiogenesí a modulovat angíogenní pochody.
předložený vynález týká diagnostických testů stanovování množství inhibitoru ve vzorcích
Kromě toho se a souprav pro biologických tekutin, histochemických souprav k lokalisaci kódujících inhibitor a molekulových biosyniézy a degradace inhibitoru, pro inhibitor specifické, vývoje peptidických agonistů a antagonistů pro receptor inhibitoru, agonistů a antagonistů protilátky specifické pro receptor inhibitoru a cytotoxických činidel vázaných na inhibitor.
inhibitoru, DNA sekvencí zkoušek k monitorování protilátek, které jsou
Dosavadní stav techniky
Termínem angiogenese, jak se zde používá, se rozumí vytváření nových krevních cév ve tkáni nebo v orgánu a zahrnuje proliferaci endothelových buněk. U lidí a zvířat za normálních fysiologických podmínek dochází k angiogenesí < ►- · I jen ve velmi specificky omezených případech. Angiogenese je na příklad obvykle pozorována při hojení ran, při vývoji plodu a embrya a při tvorbě žlutého tělíska, děložní sliznice a placenty. Termínem éndothel se rozumí tenká vrstva plochých epithelových buněk, která vystýlá seróžní dutiny, lymfatické cévy a krevní cévy.
« ··
Má se za to, že jak kontrolovaná tak nekontrolovaná angiogenese probíhají podobným způsobem. Endothelové buňky a pericyty obklopené základovou membránou tvoří kapilární krevní cévy. Angiogenese začíná erosí základové membrány enzymy, které uvolňují endothelové buňky a leukocyty. Endothelové buňky“které lémuj’í průsvit krevních cév potom prostupuj í vyvolávaj í
Ó Iz 1 O zl ΛϊΛΓίΐ 1 λ_ι ςΛ.ν ςΛ V*· τ w základovou membránou. Angiogenní stimulanty migraci endothelových buněk přes erodovanou matečné krevní cévě, kde endothelové buňky podléhají mitose a proliferují. Endothelové výhonky se navzájem spojují a vytvářej í nové krevní cévy.
K trvalé, neregulované angiogenesi dochází při mnoha nemocných stavech, metastázi nádorů a abnormáním růstu endothelových buněk a napomáhá pathologickým poškozením, ke kterým za takových podmínek dochází. Různá pathologická stadia nemoci, ve kterých dochází k neregulované angiogenesi, byla společně zařazena jako angiogenně závislé nebo s angiogenesi související nemoci.
Hypothesa, že růst tumoru je závislý na angiogenesi, byla poprvé navržena v roce 1971. (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications., N. Engl. Jour. Med. 285:1182-1186, 1971). V nejjednodušším vyjádření konstatuje: Jakmile se začíná vytvářet tumor, musí být každé zvětšení populace buněk tumoru předcházeno nárůstem nových kapilár soustřeďuj ících se do nádoru. Běžně se rozumí, že vytváření tumoru indikuje prevaskulární fázi růstu tumoru, v níž populace nádorových buněk zaujímá objem několika krychlových milimetrů a nepřekračujíc několik milionů buněk, může přežívat na existujících hostitelských mikrocévách. Expanse objemu tumoru za tuto fázi vyžaduje vznik nových kapilárních krevních cév. Plicní mikrometastázy v časné prevaskulární fázi u myší mohou být na příklad nezjistitelné, pokud se nepoužije vysokorozlišovací mikroskopie na histologických řezech.
Příklady nepřímých důkazů, které podporují tuto představu, zahrnuj i:
(1) Rychlost růstu tumoru implantovaného do subkutánních transparentních dutíňnmyšl je~prSd riéóvaskularisací pomalá a lineární a rychlá a téměř exponenciální po neovaskularisaci. (Algire GH a další, Vascular reactions of normál and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normál and neoplastic transplants. J. Nati. Cancer Inst. 6:73-75, 1945).
(2) Tumory vyrostlé v isolovaných promytých orgánech, kde krevní cévy nepodléhají proliferaci, jsou omezeny na 1-2 o mm , avšak rychle expandují na >1000 větší objem, pokud jsou transplantovány do myší a dojde u nich k neovaskularisaci. (Folkman J. a další, Tumor behavior in isolated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy materiál in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164:491-502, 1966).
(3) Růst tumoru v avaskulární rohovce probíhá pomalu a lineární rychlostí, ale po neovaskularisaci nastává růst exponenciální. (Gimbrone M. A., Jr. a další, Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Nati. Cancer Institute 52:41-427, 1974).
(4) Tumory suspendované ve vodné kapalině přední komory králičího oka zůstávají životaschopné, avaskulární a co do •5 velikosti omezené na <1 mnr. Jakmile jsou implantovány do cévního lůžka duhovky, nastává neovaskularisace a rychle rostou, dosahujíce šestnáctitisící násobek svého původního objemu během dvou týdnů. (Gimbrone M, A. , Jr. a další, Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularisation. J. Exp. Med. 136:261-276).
(5) Když se tumory implantují do chorioallantoické ·»
4
4 ·
··· ·
4 44 ·4>· 4
4 4
44 membrány kuřecího embrya, během avaskulární fáze >72 hodin rostou pomalu, ale nepřekročí střední průměr 0,93 + 0,29 mm. K rychlé expansi tumoru dochází během 24 hodin po náběhu neovaskularisace a v sedmém dni dosahuj i tyto vaskularisované tumory střední průměr 8,0 + 2,5 mm. (Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor gřówth in the cHick embryo. British J. Cancer, 35:347-356, 1997), (6) Vaskulární tvoření metastáz v králičích játrech se projevuje různorodostí v ruzměrech metastáz, ale vykazuje poměrně jednotnou hranici velikosti při níž vaskularisace nastupuje. Nádory jsou obvykle avaskulární až do průměru 1 mm, avšak za tímto průměrem dochází k neovaskularisaci. (Lien V. a další, The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normál and tumor vessels of the liver vith the use of perfused silícone rubber. Surgery 68:334-340, 1970).
(7) U transgenních myší, u kterých se karcinomy vyvíjejí v ostrůvcích pankreatu, jsou prevaskulární hyperplastické ostrůvky omezeny na velikost <1 mm. Ve stáří 6-7 týdnů nastává neovaskularisace 4-10 % ostrůvků a z těchto ostrůvků vznikají velké vaskularisované tumory s více než tisícinásobně větším objemem než měly ostrůvky prevaskulární. (Folkman J. a další, Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nátuře 339:58-61,, 1989).
(8) Specifická protilátka proti VEGF (vaskulární endothelální růstový faktor) snižuje hustotu mikrocév a způsobuje význačnou nebo dramatickou inhibici růstu tří lidských nádorů, které jsou odkázány na VEGF jako jediného prostředníka angiogenese (u holých myší). Protilátka neinhibuje růst nádorových buněk in vitro. (Kim K.J. a další, Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nátuře
I • · ·· ··· · · • · · • · ··
362:841-844, 1993).
(9) Anti-bFGF monoklinální protilátka působí u myší 70 %-ní inhibici růstu tumoru,. která je závislá na sekreci bFGF jako jejího jediného prostředníka angiogenese. Protilátka neinhibuje růst nádorových buněk in vitro. (Hoři A. a další, Suppression of solid tumor grovth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroplast grovth factor, Cancer Research, 51:6180-6184, 199Í).
(10) Intraperitonální injekce bFGF zvětšuje růst primárního tumoru a jeho metastáz stimulací růstu kapilárních endothelových buněk v tumoru. Nádorovým buňkám samotným chybí receptory pro bFGF a bFGF není mitogenem pro nádorové buňky in vitro. (Gross J.L. a další, Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proč. Arner. Assoc. Canc. Des. 31:79, 1990) .
(11) Specifický inhibitor angiogenese (AGM - 1470) inhibuje růst tumoru a metastáz in vivo, avšak je mnohem méně účinný při inhibici proliferace nádorových buněk in vitro.
poloviční proliferaci vaskulárních při o 4 řády nižší koncentraci než je inhibována proliferace nádorových buněk. (Ingber D. a další, Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin vhichinhibit angiogenesis and suppress tumor grovth. Nátuře, 48:555-557, 1990). Existují i nepřímé klinické důkazy, že růst tumoru je závislý na angiogenesi.
(12) Lidské retinoblastomy, jež sklivce, se vyvíjejí do avaskulárních
Inhibuje maximálně endothelových buněk jsou metastatické do sferoidů, které jsou omezeny na méně než 1 mír navzdory skutečnosti, že jsou schopné růstu a inkorporují ^H-thymidin (když jsou vyňaty z enukleovaného oka a analyzovány in vitro).
(13) Karcinom ovaria metastázuje do peritonální membrány jako drobná avaskulární bílá zrnka (1-3 mm). Tyto implantáty
Μ» · ♦ · ·· • · « ·· ·· zřídka vyrostou větší pokud u jednoho nebo více z nich nedojde k neovasvularisaci.
(14) Intenzita neovaskularisace při rakovině prsu (Veidner N. a další, Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma, N. Engl. J. Med.
324:1-8, 1991, a Veidner N. a JoZ-sť/Tumor árigiogenesís: ÍC new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J. Nati. Cancer Inst.
r, t rin r -a η rt •'“T Λ Λ \ pil piudiaij' lunux n . T
Carroll P.R., Flax J., Blumenfeld V., Folkman J., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostatě carcinoma, American Journal of Pathology, 143(2):401-409, 1993) vysoce koreluje s risikem budoucí metastáze.
(15) Metastáze kožního melanomu je před neovaskularisací vzácná. Počátek neovaskularisace vede ke zvětšení tlouštky postiženého místa a zvýšenému risiku metastáze. (Srivastava A. a další, The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0,76-4,0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133:419-423, 1988).
(16) Při rakovině močového měchýře je hladina angiogenního peptidu bFGF v moči citlivějším indikátorem stavu a rozsahu nemoci než je cytologie. (Nguyen M. a další, Elevated levěls of an angíogeníc peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Nati. Cancer Inst. 85:241-242, 1993).
Je tudíž jasné, že angiogenese hraje významnou roli při metastázi rakoviny. Jestliže by tato angiogenní aktivita mohla být potlačena nebo eliminována, anebo jiným způsobem kontrolována a modulována, potom by tumor, i když bude přítomen, nerostl. Prevence angiogenese ve stadiu nemoci může odvrátit poškození způsobené invasí nového mikrovaskulárního systému. Terapie zaměřené na ovládání angiogenních procesů mohou vést k odstranění nebo zmírnění těchto chorob.
»»« 9 » · ·· • 9 · · · · · ·· ··
Co je zapotřebí, je tedy komposice a metoda, které mohou inhibovat proliferaci endothelových buněk jako je nežádoucí růst krévních cév, zvláště do tumorů. Potřebná je také metoda pro detekci, měření a lokalizaci komposice. Komposice by měla být schopna překonat aktivitu endogenních růstových faktorů v přemetastatických tumorech, zabránit tvorbě kapilár v tumorech a takto inhibovat růst nádorů. Komposice, fragmenty komposice a protilátky specifické pro komposici by měly být rovněž scliopny modul o v nt tvorbu, kupilár v j iriýcb angiogenních pochodech jako je hojení ran a reprodukce. Komposice a metoda pro inhibici angiogenese mají být nejlépe netoxické a mít málo vedlejších účinků. Potřebná je rovněž metoda pro detekci, měření a lokalisaci vazebných míst pro komposici právě tak jako míst pro biosyntézu komposice. Komposice a fragmenty komposice by měly být schopny konjugovat s jinými molekulami pro účely jak radioaktivního, tak neradioaktivního značení.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález zahrnuje metody využití isolované Kringle 5 oblasti plasminogenu pro inhibici aktivity endothelové proliferace. Isolovaný peptidový fragment Kringle 5, který má inhibiční aktivitu, obsahuje přibližně osmdesát (80) aminokyselin v sekvenci:
CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDVAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP VCYTTNPRKLYDYCDVPQ SEQ ID N0:l
kde Č = Cys | Y = Tyr | D = Asp |
M = Met | R = Arg | V = Trp |
F = Phe | T = Thr | H = His |
G = Gly | V = Vál | S = Ser |
• ·· »·· · 1
N = Asn K = Lys E = Glu
P = Pro Q = Gin L = Leu
I = Ile A = Ala
Peptid ~přčilkTádánehcT proliferace endothelových buněk podle vynálezu odpovídá péptTdóvéihů fragmentů generovanému z lidského plasminogenu, začínajícímu přibližně u aminokyseliny 462 lidského plasminogenu a obsahujícímu yixuiXA-iiv υυ unixiiuruj avxxn .
také diagnostické přítomnosti nebo tělních tekutinách
Předkládaný vynález zahrnuj e a terapeutické metody zjišťování nepřítomnosti inhibujícího peptidu v a způsoby podávání peptidu nebo peptid specificky vázajících protilátek pacientovi, který potřebuje terapeuticky efektivní množství takových sloučenin, aby se regulovala proliferace endothelových buněk. Vedle toho může být inhibující peptid použit ve spojení s kulturami in vitro proliferujících endothelových buněk pro testování sloučenin, které zmírňují inhibiční efekt peptidu - tj. pro vyhledávání růstových faktorů nebo jiných sloučenin schopných překonat nebo změnit inhibici proliferace endothelových buněk.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnout komposici, která obsahuje inhibitor proliferace endothelových buněk zahrnující peptidový fragment lidského plasminogenu o přibližně 80 aminokyselinách, odpovídající v podstatě oblasti Kringle 5, začínající u aminokyseliny 462 lidského plasminogenu.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob léčení nemocí a procesů, které probíhají prostřednictvím proliferace endothelových buněk, zvláště angiogenese.
Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout diagnostickou nebo prognostickou metodu a soupravu ··» ·· • · ·· ··· * • « ·
pro stanovení přítomnosti a množství inhibitoru v tělní tekutině nebo tkáni.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu ještě je poskytnout metodu a komposici pro léčení chorob a procesů, které probíhají prostřednictvím angiogenese a zahrnují, avšak •neomezuji—se—j-en na hemangiOitr; tvrdé nádory, leiikemfiT metastazi, telangiektasii, psoriasis, sklerodermii, pyogenní granulom, myokardiální angiogenesi, neovaskularisaci plátů, koronární kolaterály, cersbrální kolaterály, artsricvenosní malformace, ischemické angiogenese údů, nemoci rohovky, rubeosis, neovaskulární glaukom, diabetickou retinopathii, retrolentální fibroplasii, arthritis, diabetickou neovaskularisaci, makulární degeneraci, léčení ran, peptický vřed, choroby související s Helicobacter, fraktury, keloidy, vaskulogenesi, hematopoesi, ovulaci, menstruaci, placentaci a horečku kočičího poškrábání.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout komposici pro léčení nebo potlačování růstu rakoviny.
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout sloučeniny, které modulují nebo napodobují produkci nebo aktivitu enzymů, které produkují inhibitor podle předkládaného vynálezu in vivo nebo in vitro.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout inhibitor nebo antiinhibitorní protilátky podané přímou injekcí inhibitorní DNA člověku nebo zvířeti, potřebujícím takové ošetření.
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob detekce a kvantifikace přítomnosti protilátky specifické pro inhibitor v tělní tekutině.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí metody pro zjištění nebo prognosu rakoviny.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout komposici použitelnou pro visualisaci a kvantifikování
444 vazebných míst inhibitoru in vivo a in vitro.
Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout komposici použitelnou pro detekci a kvantifikaci biosyntézy inhibitoru.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je ještě poskytnout—pro—rakovinu-terapii^-která^má“minimáljTí~ve(Ílejši“ účinky.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je ještě poskytnout komposici obsahující inhibitor proliferace endothelových buněk podle předkládaného vynálezu nebo fragment peptidového inhibitoru vázaný na cytotoxické činidlo.
J iným předmětem předkládaného vynálezu j e poskytnout způsob pro zacílené podání s inhibitorem souvisejících směsí na specifická místa.
Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout komposici použitelnou v genové terapii pro modulaci proliferace endothelových buněk jako na příklad angíogenních procesů.
Tyto a další předměty, charakteristiké znaky a výhody překládaného vynálezu se stanou zřejmé po přehledu následujícího detailního popisu objevených provedení a připojených patentových nároků.
V souhlase s předkládaným vynálezem se poskytuj í komposice a metody, které jsou účinné při inhibici proliferace endothelových buněk, při modulaci angiogenese a při inhibici nežádoucí angiogenese, zvláště angiogenese, která se týká růstu tumoru. Předkládaný vynález zahrnuje proliferace endothelových buněk, sekvence přibližně 80 aminokyselin pocházející z lidského plasminogenu jako Kringle 5. Sekvence aminokyselin v inhibitoru se může mezi jednotlivými species mírně lišit. Je třeba mít za to, že počet aminokyselin proteinový inhibitor charakterisovaný jako ♦ ·* v molekule aktivního inhibitoru se může měnit, a že na všechny blízko homologické sekvence aminokyselin s inhibiční endothelovou aktivitou je třeba nahlížet jako na spadající do rozsahu předkládaného vynálezu.
Předládaný vynález poskytuje způsoby a komposice “k^OseXřoválřL^čhorob a procesů^ které se dějů prostřednictvím nežádoucí a nekontrolované proliferace endothelových buněk, jako je angiogenese, tak, že člověku nebo zvířeti s nežádoucí nrril -ϊ F T- -j -í -Λ.
A-n rl /-»+· Ti a 1 λττ/γλΙ-.
ί-llL· XU V Jř 1^1.1 ___]/ —Z puudva
Komposice obsahující přibližně Kringle 5 lidského plasminogenu schopného inhibovat při testech ín vitro proliferaci endothelových buněk. U isolovaného proteinu je žádoucí čistota nejméně kolem 80 %, více žádaná je čistota kolem nejméně 90 %, zvláště nejméně kolem 95 %. Předkládaný vynález je užitečný zejména pro léčení nebo pro potlačování růstu tumorů. Lidem nebo zvířatům s prevaskularisovanými metastazovanými tumory pomáhá podávání inhibitoru zamezit růst nebe expansi takových tumorů
Předkládaný vynález také zahrnuje sekvence DNA kódující inhibitor proliferace endothelových buněk, expresivní vektory obsahující sekvence DNA kódující inhibitor proliferace endothelových buněk a buňky zahrnující jeden nebo více expresivních vektorů obsahuj icích sekvence DNA kóduj ící inhibitor. Předkládaný vynález dále obsahuje metody genové terapie, pomocí kterých se zavádí do pacienta sekvence DNA kódující inhibitor proliferace endothelových buněk, aby se in νίνο modifikovaly hladiny inhibitorů.
Předkládaný vynález také zahrnuje diagnostické metody a soupravy pro detekci a měřeni inhibitoru proliferace endothelových buněk v tělních tekutinách a tkáních a pro lokalisaci inhibitoru ve tkáních a buňkách. Diagnostická metoda a souprava může být v jakékoliv sestavě dobře známé běžným odborníkům. Předkládaný vynález zahrnuje také
9 • 9 protilátky specifické pro inhibitor proliferace endothelových buněk a jeho části a protilátky, které inhibují vázání protilátek specifických pro inhibitor proliferace endothelových buněk. Tyto protilátky mohou být polyklonálními protilátkami nebo monoklonálními protilátkami. Protilátky specifické—pro—inhibitor—proiiferaee—endothelových·—buněk“ mohou být užívány v diagnostických soupravách pro stanovení přítomnosti a množství inhibitoru, které je diagnostické nebo prognostické pro výskyt nebo opětovný výskyt rakoviny nehn jiné choroby probíhající prostřednictvím angiogenese. Protilátky specifické pro inhibitor proliferace endothelových. buněk mohou být být také podávány lidem a zvířatům, aby člověka nebo zvíře pasivně imunisovaly proti inhibitoru a tím snížily angiogenní inhibici.
Předkládaný vynález také zahrnuje diagnostické metody a soupravy pro stanovení přítomnosti a množství protilátek, které vážou inhibitor proliferace endothelových buněk v tělních tekutinách. Diagnostické metody a soupravy mohou být v jakékoliv sestavě běžně známé kvalifikovaným odborníkům.
Předkládaný vynález také zahrnuje pro receptor specifické protilátky anti-inhibitoru, které se vážou na receptor inhibitoru a přenášej! příslušný signál do buňky a působí jako agonisté nebo antagonisté.
Předkládaný vynález zahrnuje také peptidové fragmenty inhibitoru a analogy, které mohou být značeny isotopicky nebo jinými molekulami či proteiny pro použití ke stanovení a visualisaci vazebných míst inhibitoru pomocí technik obsahujících, ale neomezujících se jen na positronovou emisní tomografii, autoradiografii, flow cytometrii, testy vazby radíoreceptorů a imunohistochemii.
Tyto peptidové inhibitory a analoga působí také jako agonisté a antagonisté u receptoru inhibitoru, takže zvyšují • 4
4 • 44
nebo blokují biologickou aktivitu inhibitoru proliferace endothelových buněk. Takové peptidy se používají při isolaci molekul receptorů schopných vázat se specificky na inhibitor.
Předkládaný vynález zahrnuje také inhibitor proliferace endothelových buněk, fragmenty inhibitoru, antisera speGÍ-f-ieká-pro—inhibitor-a—reeeptorové—agonisty-a—receptorové antagonisty inhibitoru, vázané na cytotoxická činidla pro terapeutické a výzkumné aplikace. Aby se vytvořily terapeutické komposice, kombinují se dále ještě inhibitor, fragmenty z něho, pro něj specifická antisera, receptoroví agonisté inhibitoru a receptoroví antagonisté inhibitoru s farmaceuticky přijatelnými excipienty a popřípadě sloučeninami, nebo komposicemi pro trvalé uvolňování, jako jsou biodegradabilní polymery a matrice.
Předkládaný vynález se týká molekulových sond pro ribonukleovou a deoxyribonukleovou kyselinu, které se zúčastňují při transkripci a translaci inhibitoru proliferace endothelových buněk. Tyto molekulové sondy se užívají ke stanovení a měření biosyntézy inhibitoru ve tkáních a buňkách.
Předkládaný vynález zejména pak zahrnuje komposice a metody pro určení a léčení chorob a procesů, které jsou zprostředkovány nebo spojeny s proliferací endothelových buněk, jako je angiogenese. Isolovaný Kringle 5 fragment peptidu, který má inhibitorní aktivitu, obsahuje sekvenci přibližně osmdesáti (80) aminokyselin:
CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDVAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP VCYTTNPRKLYDYCDVPQ SEQ ID N0:l kde C = Cys
M = Met F = Phe
Y = Tyr R = Arg T = Thr
D = Asp V = Trp H = His
G = Gly | V = Val | S = Ser |
N = Asn | P = Pro | I = Ile |
K = Lys | Q = Gin | A = Ala |
E = Glu | L = Leu |
lži viiro enzymovou poskytuj ící aktivní zahrnuj í genovou
Inhibitor lze isolovat z plasminogenů jako je lidský plasminogen, nebo může být sytetizován chemickými nebo biologickými postupy (např. kulturou buněk, rekombinantní genovou expresí, syntézou peptidu a katalýzou plasminogenů nebo plasminu inhibitor). Rekombinantní techniky amplifikaci ze zdrojů DNA pomocí řetězové reakce polymerázy (PCR) a genovou amplifikaci ze zdrojů RNA při použití reversní transkriptázy/PCR.
Předkládaný vynález zahrnuje také komposici obsahující vektor obsahující sekvenci DNA, kódující inhibitor proliferace endothelových buněk, při čemž vektor, pokud je v buňce přítomen, má schopnost exprimovat inhibitor, dále komposici zahrnující vektor obsahující buňku, při čemž vektor obsahuje sekvenci DNA, která kóduje inhibitor nebo jeho fragmenty či analoga, a v níž vektor, pokud je v buňce přítomen, je schopen exprimovat inhibitor, a dále metodu spočívaj ící na implantování buňky obsahuj ící vektor do lidského nebo zvířecího jedince, při čemž vektor obsahuje inhibitor kódující sekvenci DNA a kde vektor, pokud je v buňce přítomen, je schopen exprimovat inhibitor.
Termínem značně podobný” nebo v podstatě homologický pokud je používán ve vztahu k aminokyselinám inhibitoru a sekvencím nukleové kyseliny, se mini sekvence aminokyselin, která má inhibiční aktivitu pro proliferaci endothelových buněk, která má molekulární hmotnost kolem 14 kD, která má také vysoký stupeň sekvenční homologie s proteinem, který má zde publikovanou specifickou sekvenci N-koncových ·♦ aminokyselin anebo sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje inhibitor proliferace endothelových buněk o molekulární hmotnosti kolem 14 kD a má vysoký stupeň homologie s aminokyselinou mající zde publikovanou, specifickou sekvenci N-koncové aminokyseliny.
Vysoký stupeň homologie představuje nejméně přibližně 80 % homologie aminokyselin, žádoucí je nejméně přibližně 90 % homologie aminokyselin a lépe je nejméně přibližně 95 % homologie aminokyselin. Termínem endotneiová inhibiční aktivita, jak je zde používán, se rozumí schopnost molekuly inhibovat obecně angiogenesi a na příklad inhibovat růst hovězích kapilárních endothelových buněk v kultuře za přítomnosti růstového faktoru fibroblastu.
Předkládaný vynález se také týká detekce inhibitoru v tělních tekutinách a tkáních za účelem diagnosy nebo prognosy chorob jako je rakovina. Předkládaný vynález se také týká detekce vazebných míst a receptorů v buňkách a tkáních. Předkládaný vynález zahrnuje také způsoby léčení nebo prevence angiogenních chorob a procesů, které představují arthritis a tumory, stimulace produkce inhibitoru, a/nebo podávání isolovaného inhibitoru nebo žádaného vyčištěného inhibitoru, nebo inhibitorního agonisty nebo antagonisty, a/nebo specifická antiséra inhibitoru nebo antiséra podávaná pacientovi proti specifickým antisérům inhibitoru, avšak nejsou omezeny jen na ně. Další léčebné způsoby představují podávání inhibitoru, jeho biologicky aktivních fragmentů, analogů inhibitoru, specifických antisér inhibitoru nebo agonistů a antagonistů receptorů inhibitoru spojených s cytotoxickými činidly.
Pasivní protilátková terapie užívající protilátky, které specificky vážou inhibitor, může být používána pro modulování angiogenně podmíněných procesů jako je reprodukce, vývoj a hojení poranění a obnova tkání. Mimo to antiséra zaměřená • · ·· • 04 « 4 • 4 4 ·· 44 na Fab oblasti specifických protilátek inhibitoru mohou být podávána ke blokování schopnosti antisér specifických pro endogenní inhibitor, inhibitor vázat.
Předkládaný vynález zahrnuje také genovou terapii, čímž se reguluje u pacienta gen kódující inhibitor. Různé metody nebo dodáňT přenosu nebo dodání DNA do buněk pro expresi proteinu produkovaného genem, jinak označované jako genová terapie, jsou popsány v Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4): 335-356 (1992), na které se inkorporaci zárodečných takto odkazuje. Genová terapie představuje somatických buněk nebo buď ex vivo nebo in vivo k náhradě genů, zvětšení sekvencí DNA do buněk k použití v terapii. Genová terapie slouží normální nebo abnormální funkce genů a k boji proti infekčním chorobám a jiným pathologickým procesům.
Strategie pro ošetřování těchto medicínských problémů genovou terapií se skládají z terapeutických strategií jako je identifikace vadného genu a poté přidání funkčního genu buď k náhradě funkce vadného genu nebo pro zvýšení funkce málo funkčního genu; nebo se skládají z profylaktických? strategií jako je přidání genu pro produkt proteinu, který upraví stav, nebo který učiní tkáň nebo orgán citlivější pro léčebný režim. Jako příklad profylaktické strategie může být do pacienta umístěna sekvence nukleové kyseliny kódující inhibitor a tím zamezen výskyt angiogenese nebo může být vložen gen, který činí buňky tumoru citlivější vůči radiaci a ozařování tumoru by způsobilo zvýšené usmrcování buněk tumoru.
Tento vynález předpokládá různé postupy pro přenos DNA inhibitoru nebo sekvencí regulujících inhibitor. Jako metoda genové terapie se rovněž předpokládá transfekce sekvencí j iného promotoru než toho, který se normálně nalézá specificky spojený s inhibitorem, nebo další sekvence, které ··· · • · ··· · · • · «* by zvyšovaly produkci proteinu inhibitoru. Příklad této technologie se nalézá v Transkaryotic Therapies, lne., z Cambridge, Massachusetts, kde se užívá homologní rekombinace ke vložení genetického spínače, který v buňkách spouští erythropoetinový gen. Viz Genetic Engineering News, -Apríl—15·; “19947 Takové’ genetické spínače mohou být využívány k aktivaci inhibitoru (nebo receptorů inhibitoru) v buňkách, u kterých normálně k expresi inhibitoru (nebo receptorů pro inhibitor) nedochází.
Metody genového přenosu pro genovou terapii spadají do tří širokých kategorií: fysikální (např. elektroporace, přímý genový přenos a bombardování částic), chemické (nosiče založené na lipidech nebo jiné nevirové vektory) nebo biologické (z viru derivovaný vektor a absorpce receptorů). Mohou být na příklad použity nevirové vektory, které obdsahují liposomy pokryté DNA. Takové komplexy liposom/DNA mohou být inttavenosně přímo pacientovi injikovány. Má se Za to, že komplexy liposom/DNA se koncentrují v játrech, kde předávají DNA makrofágům a Kupfférovým buňkám. Tyto buňky mají dlouhou životnost a tím poskytují dlouhodobou expresi dodávané DNA. Mimo to genové vektory nebo nahou DNA lze přímo injikovat do požadovaného orgánu, tkáně nebo tumoru pro cílené dodání terapeutické DNA.
Metodologie genové terapie mohou být popisovány také z hlediska nasazení. Základní cesty podávání genů představuje genový přenos ex vivo, genový přenos in vivo a genový přenos in vitro. Při genovém přenosu ex vivo jsou buňky odebrány pacientovi a pěstovány v buněčné kultuře. DNA se transfikuje do buněk, počet transfikovaných buněk se zmnoží a potom se provede jejich reimplantace pacientovi. Při genovém přenosu in vitro jsou transformované buňky pěstovány v kultuře, jako je. tkáňová kultura a nikoliv jednotlivé buňky jednotlivého pacienta. Tyto laboratorní buňky se transfikuj i, transfikované buňky se vytřídí a zmnoží buď pro implantaci pacientovi nebo pro jiná použití.
Genový přenos in vivo představuje zavedení DNA do pacientových buněk, při čemž tyto buňky zůstávaj í uvnitř pacientova těla. Metody zahrnují užití virově zpros-t-ředk-ovaného—genového-přenosu při použití neinfekčního viru k dodání genu pacientovi nebo injikování nahé DNA do dané oblasti u pacienta a DNA je přijímána určitým procentním podílem buněk. v kterém je genově produkovaný protein exprimován. Kromě toho může být pro inserci DNA inhibitoru proliferace endothelových buněk nebo sekvencí regulujících* inhibitor in vitro použito i jiných zde popsaných metod, jako je použití genového děla.
Chemické metody genové terapie mohou k dopravení DNA přes membránu buňky obsahovat sloučeninu na basi lipidů, nikoli nezbytně liposom. Lipofektiny nebo cytofektiny, jež se jako na basi lipidů positivně nabité ionty vážou na negativně nabitou DNA, vytvářejí komplex, který může proniknout membránou buňky a poskytnout DNA do vnitřku buňky. Jiná chemická metoda využívá endocytosu na basi receptorů, která představuje vázání specifického ligandu na receptor na povrchu buňky, obaluje jej a transportuje přes membránu buňky. Ligand se váže na DNA a celý komplex je transportován do buňky. Genový komplex ligandu je injektován do krevního oběhu a potom budou cílové buňky s receptořem specificky vázat ligand a transportovat komplex ligand-DNA do buňky.
Mnohé metodologie genové terapie využívají ke vkládání genů do buněk virových vektorů. Alterované vektory retrovirů byly na příklad použity při ex vivo metodách zavádění genů do periferálních a tumor infiltrujících lymfocytů, hepatocytů, epidermálních buněk, myocytů nebo jiných somatických buněk. Tyto alterované buňky se potom zavádějí do pacienta, aby se z vložené DNA získal produkt genu.
Virové vektory byly také využity pro vkládání genů do buněk při postupech in vivo. Pro směrování tkáňově specifické exprese cizích genů mohou být využity cis-působící regulační elementy nebo promotory, o kterých se ví, že jsou pro tkáň specifické. Toho může být alternativně dosaženo pomocí
-dodávání—DNA—nebo“vir o výctrvektoru in šitu do specifických anatomických oblastí in vivo. Genový přenos do krevních cév in vivo byl transdukovanÝch in vitro implantací o zvolených míst na například dosažen endothelových buněk stěnách arterií. Virus infikoval obklopující buňky, u kterých došlo také k.expresi,produktu genu. Virový vektor může být dodáván přímo do místa in vivo na příklad katetrem, takže se infikují virem jen určité oblasti a zajistí se dlouhodobá, místně specifická exprese genu. Genový transfer in vivo pomocí vektoru retroviru byl také demonstrován na tkáni prsu a jaterní tkáni injekcí alterovaného viru do krevních cév vedoucích k orgánům.
Virové vektory, které byly použity v postupech genové terapie, zahrnují, avšak neomezují se na ně, retroviry, jiné RNA viry jako je virus dětské obrny nebo Sindbis virus, adenovirus, adeno-asociovaný virus, herpes viry, SV 40, viry kravských neštovic a další DNA viry. Replikačně defektní, retrovirové vektory z myší, jsou nejčastěji užívanými vektory genového přenosu. Retroviry nyší leukemie jsou složeny z jediného vlákna RNA komplexovaného s proteinem buněčného jádra a enzymy polymerázy (pol), obaleného proteinovým jádrem (gag) a obklopeného glykoproteinovou obálkou (env), která určuje rozsah uhoštění. Genomová struktura retrovirů zahrnuje gag, pol a env geny vymezené 5 a 3 dlouhými terminálními repeticemi (LTR). Retrovirové vektorové systémy využívají skutečnost, že minimální vektor obsahující 5 a 3 LTR a signál pro sbalování jsou dostatečné, aby došlo ke sdružování vektoru, infekci a integraci do cílových buněk » · » ·· · « 4 • · · ·« ·* způsobující, že virové strukturální proteiny jsou dodávány in trans v obalové buněčné linii. Základní výhody retrovirových vektorů pro genový přenos zahrnují účinnou infekci a expresi genu u většiny typů buněk, přesnou integraci jediné kopie vektoru do cílové buňky chromosomální DNA a snadnou manipulaci-s—re t-r ov i r ovýnr~genomemT
Adenovir komplexované še skládá s proteiny z lineární, dvouvláknové DNA jádra, obklopené kapsidovými proteiny. Pokroky v molekulární virologii přinesly schopnost využívat biologii těchto organismů, aby se vytvořily vektory schopné převést nové genetické sekvence do cílových buněk in vivo. Vektory založené na adenovirech budou dávat vysoké hladiny peptidů produkovaných expresí genů. Adenovirové vektory vykazují vysoké účinnosti infektivity i při nízkých titrech viru. Kromě toho je virus plně infektivní jako buňky prostý virion, takže nejsou nutné injekce produkčních buněčných linií. Jiná potenciální vektorů je schopnost dosáhnout heterologických genů in vivo.
Mechanické metody dodávání DNA zahrnují fusogenní lipidové měchýřky jako jsou liposomy nebo jiné měchýřky pro fusi s membránou, lipidové částice DNA inkorporující kationidní lipid jako je lipofektin, polylysinem zprostředkovaný přenos DNA, přímou injekci DNA jako je mikroinjekce DNA do zárodečných nebo somatických buněk, pneumaticky dodávané částice potažené DNA, jako jsou částečky zlata používané v genovém děle a anorganické chemické přístupy jako je transfekce kalcium fosfátem. Jinou metodou genové terapie prostřednictvím ligandu je komplexace DNA specifickými ligandy za vzniku konjugátů ligand-DNA, aby se DNA nasměrovala do specifické buňky nebo tkáně.
Bylo zjištěno, že injektování plasmidu DNA do svalových buněk poskytuje vysoké procento buněk, které se transfektují výhoda adenovirových dlouhodobé exprese • ·
a udržují expresi signálních genů. DNA plasmidu může nebo nemusí se integrovat s genomem buněk. Pokud transfikovaná DNA neintegruje, umožnila by přenesení a expresi genů produkujících proteiny v terminálně diferencovaných, neproliferativních tkáních po prodlouženou dobu bez obavy, že dojde-k mutačním insercím, delecím nebo změnám buněčného nebo mitochondriálního genomu. Dlouhodobý, ne však nezbytně permanentní transfer terapeutických genů do specifických
léčení při genetických chorobách a být užíván při profylaxi. DNA může být periodicky reinjektována, aby se - udržela hladina genového produktu bez mutací probíhaj ících v genomech recipientních buněk. Pokud se exogenní DNA neíntegrují, může být umožněna přítomnost několika různých útvarů exogenní DNA v jedné buňce se všemi útvary exprimuj ícími různé produkty genů.
Metody genového přenosu prostřenictvím částic byly nejprve použity při trasformaci rostlinných tkání. V zařízení pro bombardování částicemi čili v genovém děle se vytváří hnací síla pro akceleraci částic o vysoké hustotě (jako je zlato nebo wolfram), obalených DNA, na vysokou rychlost, která umožňuje průnik cílovými orgány, tkáněmi nebo buňkami. Bombardování částicemi může být používáno v systémech in vitro nebo při ex vivo či in vivo technikách zavádění DNA do buněk, tkání nebo orgánů.
Elektroporace užívá pro genový transfer elektrický proud, aby se buňky nebo tkáně staly citlivé pro genový transfer prostřednictvím elektroporace. Pro zvýšení permeabilíty membrány takovým způsobem, aby molekuly DNA mohly proniknout do buněk, se používá krátký elektrický impuls při dané sile pole, Tato technika může být použita v systémech in vitro, nebo při ex vivo či in vivo technikách pro zavádění DNA do buněk, tkání nebo orgánů.
K transfekci cizí DNA do buněk může být využit genový v * přenos in vivo prostřednictvím nosiče. Komplex nosič-DNA může být běžným způsobem zaveden do tělní tekutiny nebo krevního oběhu a potom být specificky nasměrován v těle do cílového orgánu nebo tkáně. Mohou být použity jak liposomy tak polykationty jako pólylysin, lipofektiny nebo cytofektiny. Mohotrbyt vyvinuty liposomy, které jsou specifické pro buňky nebo specifické pro orgány a tak cizí DNA nesená liposomem bude cílovými buňkami vstřebána. Injekce imunoliposomů, které jsou zacíleny na specifický receptor určitých buněk, může být užívána jako vhodná metoda inserce DNA do buněk nesoucích receptor. Jiný -použitý‘ systém nosiče je systém konjugátu asíaloglykoprotein/polylysin pro vnesení DNA k hepatocytům při genovém transferu in vivo.
Transfikovaná DNA může být také komplexována s jinými druhy nosičů tak, že DNA je vnesena do cílové buňky a potom se usadí v cytoplasmě nebo v nukleoplasmě. DNA může být sdružována s nosičem z jaderných proteinů ve specificky vytvořených měchýřkových komplexech a vnášena přímo do jádra.
Genová regulace inhibitoru podle předkládaného vynálezu může být uskutečněna podáváním sloučenin, které se vážou ke genu pro inhibitor, nebo kontrolují oblasti spojené s genem nebo jemu odpovídajícím přepisem RNA, aby se modifikoval stupeň transkripce nebo translace. Kromě toho buňky transfikované sekvencí DNA kódující inhibitor mohou být podávány pacientovi, aby poskytly zdroj inhibitoru in vivo. Buňky mohou být transfikovány na příklad s vektorem, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, jež kóduje inhibitor.
Zde používaným terminem vektor je míněn nosič, který může obsahovat nebo se sdružovat se specifickými sekvencemi nukleové kyseliny a jehož funkcí je transportovat do buňky specifické sekvence nukleové kyseliny. Příklady vektorů představují plasmidy a přenosné mikroorganismy jako viry, nebo nevirové vektory jako konjugáty ligand-DNA, liposomy,
komplexy lipid-DNA. Může být žádoucí, že molekula rekombinantní DNA, obsahující DNA sekvenci inhibitoru proliferace endothelových buněk, je operativně připojena k sekvenci kontroly exprese, aby vznikl expresivní vektor schopný exprese inhibitoru. Transfikované buňky mohou pocházet—z-normální—tkáně—pacienta-;—z^chorobiré pacientovy tkáně nebo to mohou být buňky, které pacientovi nepatří.
Buňky z pacientova tumoru mohou být na příklad transfikovány s vektorem schopným exprese proteinu inhibitoru podle předkládaného vynálezu a znovu zavedeny do pacienta. Transfikované tumorové buňky produkují v pacientovi* hladiny inhibitoru, které růst tumoru ínhibují. Pacienty mohou být jedinci lidští nebo zvířecí. Inhibitor DNA může být mimo to injikován pacientovi přímo bez pomoci nosiče. Inhibitor DNA může být injikován zejména do kůže, svalu nebo krve.
Exprese inhibitoru může pokračovat po dlouhou dobu anebo může být inhibitor DNA podáván periodicky, aby se v buňce, tkáni nebo orgánu či biologické tekutině udržovala požadovaná hladina inhibičního proteinu.
Třebaže, nechtíce se vázat následující hypotézou, se má za to, že stává-li se tumor angiogenním, uvolňuje jeden nebo více angíogenních peptidů (např. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF atd.), které působí lokálně, jejich terčem je endothel v sousedství primárního tumoru ze směru extravaskulárního a necirkulují (nebo cirkulují s krátkým poločasem). Tyto angiogenní peptidy musí být produkovány v množství dostatečném, aby se u primárního tumoru překonalo působení inhibitoru endothelových buněk (inhibitorů angiogenese) pokračovat v expansi populace jeho buněk. Jakmile již takový primární tumor narůstá, trvale uloňuje do oběhu inhibitory endothelových buněk. Podle této hypotézy působí tyto inhibitory na dálku ve vzdálenosti od primárního tumoru, jejich terčem je kapilární endothel metastáze •
z íntravaskulárního směru a pokračují v cirkulaci. Takže již v době, kdy vzdálená metastáze může začínat iniciaci angiogenese, může být přicházejícím inhibitorem inhibován kapilární endothel v jejím sousedství.
Produkce inhibitoru proliferace endothelových buněk podle—pře dkláďarreho vynálezu se uskutečňuje pomocí podobných technik. Může být provedena technikou rekombinantní DNA zahrnující (1) stupeň identifikace a čistění inhibitoru jak je zde popsáno a znázorněno na obrázcích, (2) stupeň určující N-koncovou sekvenci aminokyselin vyčištěného inhibitoru, (3) stupeň syntetického generování primerů 5 a 3' DNA’ oligonukleotidu pro sekvenci inhibitoru, (4) stupeň amplifikace inhibitoru genové sekvence pomocí polymerázy, (5) stupeň inserce amplifikované sekvence do příslušného vektoru jako expresivního vektoru, (6) stupeň inserce genu obsahujícího vektor do mikroorganismu nebo jiného expresivního systému, schopného exprimovat gen inhibitoru a (7) stupeň isolace rekombinančně produkovaného inhibitoru. Vhodnými vektory jsou expresivní vektory virové, bakteriální a eukaryotické (jako kvasinky). Shora zmíněné techniky jsou podrobněji popsány v laboratorních manuálech jako je Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, od Sambrooka a spol., Cold Spring Harbor Press, 1989, který je zde ocitován.
Ještě dalším způsobem produkováni inhibitoru nebo jeho biologicky aktivních fragmentů je syntéza peptidů. Sekvence aminokyselin inhibitoru může být na příklad určena metodami automatisovaného sekvenování peptidu. Jakmile je isolován gen nebo sekvence DNA, která kóduje inhibitor na příklad shora popsanými metodami, může být sekvence DNA stanovena alternativně pomocí v oboru běžně známých manuálních nebo automatisováných sekvenčních metod. Sekvence nukleové kyseliny pak poskytuje informaci týkající se pořadí • 4 > 4 4 t 4 4 1 ·· 4 « aminokyselin.
Jakmile je zjištěno pořadí aminokyselin v peptidu, mohou být peptidové fragmenty syntetizovány v oboru běžně známými technikami, jaké jsou na příklad popsány v Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, E. Atherton a R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford, England. Mohou se syntetizovat rozmanité fragmenty a následně se spolu spojují za vzniku fragmentů větších. Tyto syntetické peptidové fragmenty lze také pripravir substitucemi aminokyselin na specifickém místě, aby se otestovala agonistní nebo antagonistní aktivita in vitro a in vivo. Peptidové fragmenty, které mají vysokou vazebnou afinitu ke tkáním, mohou být použity na afinitních kolonách k isolaci receptorů vázajících inhibitor.
Inhibitor je účinný při ošetřování chorob nebo procesů jako je angiogenese, které se dějí prostřednictvím nebo zahrnují proliferaci endothelových buněk. Předkládaný vynález obsahuje způsob ošetřování angiogenesí zprostředkované choroby účinným množstvím inhibitoru nebo jeho biologicky aktivního fragmentu anebo kombinací fragmentů inhibitoru, které mají společně anti-angiogenní aktivitu, nebo agonisty a antagonisty inhibitoru. Angiogenesí zprostředkované choroby představují tvrdé tumory, v krvi vznikající tumory jako leukemie, tumorové metastáze, benigní tumory, na příklad hemangiomy, akustické neuromy, neurofibrimy, trachomy a pyogenní granulomy, reumatoidní arthritis, psoriasis, oční angiogenní choroby na příklad diabetická retinopathie, retinopathie nedonošenců, makulární degenerace, odmítání rohovkových štěpů, neovaskulární glaukom, retrolentální fibroplasie, rubeosa, Oslerův-Vebberův syndrom, myokardiální angiogenese, neovaskularisace plátů, telangiektasie, hemofilické klouby, angiofibrom a granulace ran, avšak neomezují se jen na ně.
Inhibitor je užitečný při léčení nemocí nadbytečné nebo abnormální stimulace endothelových buněk. Tyto choroby představuje intestinální adhese, atherosklerosa, skleroderma a hypertrofické jizvy tj. keloidy, ale nejsou omezeny jen na ně. Inhibitor může být použit jako činidlo regulace porodnosti prevencí vaskularisace nutné pro implantaci embrya. Inhibitor je užitečný při ošetřování chorob, u nichž je angiogenese pathologickým důsledkem, jako je nemoc kočičího poškrábání (Rochele minalia quintosa) a vředy (Kehobacter pylorz) .
Syntetické peptidové fragmenty inhibitoru mají rozličné použití .·** Peptid, který se váže na receptor schopný vázat inhibitor s vysokou specificitou a aviditou se radioaktivně labeluje a používá pro visualisaci a kvantifikaci vazebných míst pomocí autoradiografických a na membránu se vázajících technik.
Labelování inhibitoru nebo jeho peptidových fragmentů pomocí isotopů s krátkou životností umožňuje vedle toho visualisaci vazebných míst receptorů in vivo pomocí tomografie positronové emise nebo jiných moderních radiografických technik, za účelem lokalisace tumoru s vazebnými místy inhibitoru.
Cytotoxická činidla jako ricin se spojují s inhibitorem nebo jeho vysoce afinitními peptidovými fragmenty, poskytujíce takto nástroj pro destrukci buněk, které inhibitor vážou. Tyto buňky lze nalézt na mnoha místech mezi něž patři mikrometastázy a primární tumory, avšak není to omezeno jen na tyto. Infuse peptidů spojených s cytotoxickými činidly se provádí způsobem, který je určen k maximalisaci podání do požadovaného místa. Podávání může být na příklad provedeno kanylou do cév zásobujících cílové místo nebo přímo do cílového místa. Taková činidla mohou být také podávána kontrolovaným způsobem přes osmotické čerpadlo spojené s kanylou pro infusi. Kombinace antagonistů inhibitoru může být ke zvýšení vaskularisace tkáně aplikována spolu se stimulátory angiogenese. Tento terapeutický režim poskytuje efektivní prostředek pro destrukci metastatického karcinomu.
--1nh i bi t or- -může— být--použ i ván v— kombiňači š j inými komposicemi a postupy léčení chorob. Tumor může být na přlKIaď obvyklým způsobem ošetřen chirurgicky, ozařováním nebo chemoterapií v kombinaci s inhibitorem a potom může být inhibitor následně podán pacientovi, aby se rozšířil klidový stav mikrometastáz a stabiiisoval a inhiboval růst jakéhokoliv residuálního primárního tumoru. Kromě toho se inhibitor, jeho fragmenty, pro'inhibitor”specifická antisera, agonisti a antagonisti receptoru inhibitoru anebo jejich kombinace, kombinují pro vytvoření terapeutických komposicí s farmaceuticky přijatelnými excipienty a popřípadě s matricí pro trvalé uvolňováni, jako jsou biodegradabilní polymery.
Matrice pro trvalé uvolňování, jak je zde uváděna, je matrice vytvořená z materiálů, zpravidla polymerů, které jsou degradabiní enzymatickou, nebo kyselou či zásaditou hydrolýzou anebo rozpuštěním. Jakmile se matrice dostane do těla, působí na ni enzymy a tělní tekutiny. Matrice pro trvalé uvolňování se výhodně volí mezi biokompatabilními materiály jako jsou liposomy, polylaktidy (polykyselina mléčná), polyglykolidy (polymery kyseliny glykolové), kopolymery laktidů a glykolidů (kopolymery kyseliny mléčné a glykolové), polyanhydridy, póly(ortho)estery, polypeptidy, hyaluronová kyselina, kolagen, chondritin sulfát, karboxylové kyseliny, mastné kyseliny, fosfolipidy, polysacharidy, nukleové kyseliny, jako fenylalanin, polyvinylpropylen, polymemí aminokyseliny, aminokyseliny tyrosin, isoleucin, polynukleotidý, polyvinylpyrrolidon a silikon.
Preferovanou biodegradabilní matricí je některá buď z polylaktidů, polyglykolidů nebo kopolymerů laktidů a glykolidů (kopolymerů kyseliny mléčné a glykolové), • ·
Angiogenesi modulující terapeutické komposice podle předkládaného vynálezu mohou být tuhé, kapalné nebo ve formě aerosolů a mohou být podávány některým ze známých způsobů _ - aplikace —Příkladem — tuhých — terapeutických komposic jsou’ pilulky, krémy a implantovatelné dávkovači přípravky. Pilulky ‘ lze podávat orálně, terapeutické krémy mohou být aplikovány místně. Implantovatelné dávkovači přípravky mohou být aplikovány lokálně, na příklad v místě tumoru anebo ty, které mohou být implantovány pro systémové uvolňování terapeutické komposice modulující angiogenesi, na příklad subkutánně. Příklady kapalných komposicí představují formulace adaptované pro injekci subkutánní, intravenosní, intraarteriální a formulace pro aplikaci místní nebo nitrooční. Mezi příklady aerosolových formulací patří inhalačnx přípravky pro aplikaci do plic.
Inhibiční protein podle předkládaného vynálezu může být také využit pro generování protilátek, které jsou specifické pro inhibitor a jeho receptor. Protilátky mohou být buď polyklonálními protilátkami nebo monoklonálnimi protilátkami. Tyto protilátky, které se specificky vážou na inhibitor nebo receptory inhibitoru, mohou být využity v diagnostických metodách a soupravách, které jsou dobře známé pro detegování nebo kvantifikování hladin inhibitoru nebo hladin receptorů inhibitoru v tělní tekutině nebo tkáni praktikům orientovaným v oboru. Výsledky těchto testů mohou být využity k diagnostikování nebo predikování výskytu nebo opětovného výskytu tumoru a jiných angiogenně zprostředkovaných chorob.
Inhibitor může být rovněž využit k vyvíjení diagnostické metody a souprav pro detekci a kvantifikování protilátek schopných vázat inhibitor. Tyto soupravy umožňují detekci cirkulujících, pro inhibitor specifických protilátek. U pacientů, kteří mají takové cirkulující antiinhibitorní protilátky, se mohou s větší pravděpodobností vyvinout četné • · tumory a karcinomy a mohou s větší pravděpodobností mít opětovný výskyt rakoviny po ošetřeních nebo periodách poklesu. Fab fragmenty těchto protilátek mohou být využity __j ako -antigeny -pro—generování- ant i inhibitor =špěčíf ického séra
Fab-fragmentu, které může být užito k neutralisaci ~~ etn til ηΚΐ bi tor nich protilátek. Taková metoda redukuje odstranění cirkulujícího inhibitoru pomocí antiinhibitorních protilátek a tím efektivní zvýšení hladin cirkulujícího inhibitoru.
Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob - - blokování-účinku' přebytku endogenního inhibitoru. Toho může být dosaženo pasivním imunisováním člověka nebo zvířete protilátkami specifickými pro inhibitor, který je v systému nežádoucí. Toto ošetření může být důležité při léčeni abnormální ovulace, menstruace, tvoření placenty a vaskulogenese. Poskytuje to užitečný nástroj ke zjištění efektů odstranění inhibitoru na metastatické procesy. Fab fragment inhibitorně specifických protilátek obsahuje vazebné místo pro inhibitor. Tento fragment se isoluje z inhibitorně specifických protilátek za použití technik, které jsou odborníkům známé. Fab fragmenty inhibitor-specifického séra se používají jako antigeny vyvolávající produkci séra anti-Fab fragmentu. Infuse tohoto antisera proti Fab fragmentům specifickým pro inhibitor zabraňuje, aby se inhibitor vázal na protilátky inhibitoru. Terapeutický užitek se získává neutralisaci endogenních anti-inhibitorních protilátek pomocí blokování vazby inhibitoru na Fab fragmenty antiinhibitoru. Čistý efekt tohoto ošetřeni je usnadnění schopnosti endogenně cirkuluj ícího inhibitoru dosáhnout cílové buňky a tím snížit rozrůstáni metastáz.
Je třeba chápat, že předkládaný vynález je myšlen tak, že zahrnuje jakékoliv deriváty inhibitoru, které mají inhibitorní aktivitu na proliferaci endothelové buňky.
’ · · « » · ♦· *·· · «
Předkládaný vynález zahrnuje celistvý inhibiční protein, deriváty inhibičního proteinu a biologicky aktivní fragmenty inhibičního proteinu. Tyto obsahují proteiny s inhibitorní aktivitou, které mají substituce aminokyselin nebo mají cukry nebo jiné molekuly vázané na funkční skupiny aminokyselin.
Předkládaný vynález zahrnuje také geny, které kódují inhibitor a receptor inhibitoru, i proteiny, které jsou těmito geny exprimovány.
Shora popsané proteiny a proteinové fragmenty s inhibitorní aktivitou mohou být poskytovány jako isolované a v podstatě vyčištěné proteiny a proteinové fragmenty ve farmaceuticky přijatelných formulacích při použití formulačních způsobů, které jsou odborníkům zběhlým v oboru známy. Tyto formulace mohou být aplikovány standardními způsobyKombinace obyčejně mohou být aplikovány topicky, transdermálně, intraperitonálně, intrakraniálně, intracerebroventrikulárně, intracerebrálně, intravaginálně, intrauterálně, orálně, rektálně nebo parenterálně (např. intravenosně, intraspinálně, intramuskulárně). Inhibitor může být biodegradabilních polymerů umožňujících trvalé uvolňování sloučeniny. Polymery se implantují do blízkosti místa, kde se požaduje podávání léku, na příklad na místo tumoru nebo se implantuje tak, že se inhibitor pomalu systemicky uvolňuje. K zajištění kontrolovaného podávání vysokých koncentrací inhibitoru kanylou na požadované místo, jako přímo do rostoucí metastázy nebo do vaskulárního přívodu k takovému tumoru, se může použít i osmotické miničerpadlo. Biodegradabilní polymery a jejich použití jsou na příklad podrobně popsány v Brém a spol., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991), což je zde citováno ve své celistvosti.
Dávkování inhibitoru podle předkládaného vynálezu bude záviset na chorobném stavu nebo na podmínkách ošetřování a subkutánně nebo mimo to začleněn do • 4 • 4 4 4
4 4«
4*4 « 4
4 4 jiných klinických faktorech jako je hmotnost a stav člověka či zvířete a způsob aplikace sloučeniny. Při léčbě lidí nebo zvířat může být podáváno přibližně 0,5 mg/kg až 500 mg/kg. V závislosti na poloviční životnosti inhibitoru v jednotlivém zvířeti nebo člověku může být inhibitor podáván mezi “několikrát za den až do jedenkrát za týden. Rozumí se, že předkládaný vynález má aplikaci jak v humánní tak ve veterinární medicíně. Metody podle předloženého vynálezu jsou předpokládány pro jednotlivou stejně jako pro opakovanou aplikaci, prováděnou současně nebo po delší dobu.
Formulace’ inhibitoru zahrnují ty, které jsou vhodné pro aplikaci orální, rektální, oftalmickou (včetně intravitrální nebo intrakamerální), nasální, topickou (včetně ústní a sublingvální), intrauterální, vaginální nebo parenterální (včetně subkutánní, intraperitonální, intramuskulární, intravenosní, intradermální, intrakraniální, intratracheální a epidurální). Formulace inhibitoru mohou být výhodně presentovány ve formě jednotek dávky a mohou být připraveny konvenčními farmaceutickými technikami. Takové techniky představuj í sdružování aktivní ingredience a farmaceutického nosiče(ů) nebo excipientu(ň). Obecně mohou být formulace připraveny stejnoměrným a důkladným promísením aktivní ingredience s kapalným nosičem nebo jemně rozetřeným pevným nosičem nebo s oběma a potom, pokud je to nutné, zformováním produktu.
Formulace vhodné pro parentrální aplikaci představují vodné i nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické přípravky a soluty, které činí formulaci isotonickou s krví zamýšleného příjemce a dále vodné i nevodné sterilní suspense, které obsahují suspendující a zahušfovací činidla. Formulace mohou být presentovány v nádobkách pro jednotkovou dávku nebo pro opakované dávkování, na příklad zatavených ampulích a fiolách a mohou být skladovány ve vymrazením vysušené (lyofilisované) podobě, vyžadující bezprostředně před použitím pouze přidání sterilního kapalného nosiče, na příklad vody pro injekce. Podle receptu se injekční roztoky a suspense mohou připravovat ze sterilních prášků, granulí a tablet dříve popsaného druhu.
Preferované formulace jednotkových dávek jsou ty, které z podávané ingredience obsahují denní dávku nebo jednotku, denní subdávku nebo její příslušnou část. Je třeba chápat, že kromě shora zvlášť zmiňovaných ingrediencí, formulace podle předkládaného vynálezu mohou “obsahovat jiná, v oboru běžná činidla, která přicházejí v úvahu s ohledem na typ formulace. Podle volby mohou být inkorpórována, nebo jiným způsobem s inhibitorem proteinu kombinována, cytotoxická činidla nebo jejich biologicky funkční peptidové fragmenty, aby se pacientovi poskytla zdvojená terapie.
Angiogenesl· inhibující peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být syntetizovány standardními mikrochemickými přístupy a v čistotě ověřené HPLC a hmotnostní spektrofotometrií. Metody peptidové syntézy, čistění pomocí HPLC a hmotnostní spektrofotometrie jsou odborníkům v těchto oborech dobře známé. Peptidy inhibitoru a peptidy receptorů inhibitoru jsou produkovány rovněž v rekombinantních expresivních systémech E. coli nebo kvasinek a čistí se sloupcovou chromatografií.
Různé peptidové fragmenty celé molekuly inhibitoru mohou být syntetizovány pro použití při více aplikacích zahrnujících, ale na následující se neomezujících: Používají se jako antigeny pro rozvíjení specifického antiséra, jako agonisti a antagonisti aktivní na vazebných místech inhibitoru, jako peptidy, které se mají vázat anebo být použity v kombinaci s cytotoxickými činidly pro cílené usmrcování buněk, které vážou inhibitor. Sekvence • · ··· · · ·· ·· aminokyselin, které obsahují tyto peptidy, se vybírají na základě jejich posice na vnějších oblastech molekuly a jsou dosažitelné pro vazbu na antisérum. Aminové a karboxylové zakončení inhibitoru, stejně jako střední část molekuly jsou mezi fragmenty, které mají být syntetizovány, representovány odděleně.
Tyto peptidové sekvence se porovnávají se známými sekvencemi a využívá se při tom databasí proteinových sekvencí jako GenBank, Brookhaven Protein, SVISS-PROT a PIR pro stanovení potenciálních sekvenčních homologií. Tato • * * -w ♦. -P .
informace usnadňuje eliminaci sekvencí, které vykazují vysoký stupeň sekvenční homologie vůči ostatním molekulám, zvyšujíce takto možnost vysoké specificity ve vyvíjení antisér, agonistů a antagonistů inhibitoru.
Inhibitor a od inhibitoru odvozené peptidy mohou být spojovány s jinými molekulami pomocí standardních metod. Aminové i karboxylové zakončení inhibitoru obsahuje tyrosinové a lysinové zbytky a mnoha technikami se značkují isotopicky i neisotopicky, na příklad radioaktivním labelováním pomocí běžných technik (tyrosinové zbytky
- chloraminem T, jodogenem, laktoperoxidázou; lysinové zbytky
- Boltonovým-Hunterovým činidlem). Tyto techniky spojování jsou dobře známé odborníkům zběhlým v oboru. Alternativně se tyrosin nebo lysin přidává ke fragmentům, které tyto zbytky nemají, aby se usnadnilo značkování reaktivních aminoa hydroxyskupin peptidu. Technika spojování se volí podle funkčních skupin, které jsou k disposici na aminokyselinách, včetně skupiny aminové, sulfhydrylové, karboxylové, amidové, fenolické a imidazolové, avšak neomezuje se to jen na ně. Různá činidla, která se používají k provádění tohoto spojování, mezi jiným zahrnují glutaraldehyd, diazotovaný benzidin, karbodiimid a p-benzochinon.
Inhibiční peptidy se pro rozličné aplikace chemicky » · 4« • •4 4 I
4 « • 4 44 spojují s isotopy, enzymy, proteinovými nosiči, cytotoxickými činidly, fluorescenčními molekulani, chemiluminescenčními, bioluminescenčními a jinými sloučeninami. Účinnost spojovací reakce se určuje za použití různých technik vhodných pro specifickou reakci. Radioaktivní značkování peptidu které obsahují lysinové spojovány s vyčištěným t-·- -V25- inhibitoru pomocí Α *T se na příklad provádí chloraminem T a Na I o vysoké specifické aktivitě. Reakce se zakončuje metabisulfitem sodným a směs se odsoluje na jednoúčelových kolonách. Labelovaný peptid se eiuuje ze sloupce a sbírají se frakce. Z každé frakce se odbírají alikvotní podíly a gamma počítačem se ' měří radioaktivita. Tímto způsobem se od značkovaného inhibičního peptidu oddělí nezreagovaný Na^^^I. Peptidové frakce s nejvyšší specifickou radioaktivitou se uchovávají pro následující použiti jako je analýza schopnosti vazby na antiséra inhibitoru.
Jinou. aplikací spojování peptidu je produkce polyklonálního antiséra. Tak na příklad peptidy inhibitoru, zbytky, jsou pomocí glutaraldehydu albuminem hovězího séra. Účinnost reakce se určí měřením inkorporace radioaktivně označeného peptidu. Nezreagovaný glutaraldehyd a peptid se oddělí dialýzou. Konjugát se uchovává pro další použití.
Může být připraveno pro inhibitor specifické antisérum, analogy inhibitoru, peptidové fragmenty inhibitoru a receptor inhibitoru. Po syntéze a vyčistění peptidu mohou být, za použití technik známých odborníkům zběhlým v oboru, vypěstována jak monoklonální tak polyklonální antiséra. Polyklonální antiséra mohou být pěstována na příklad u králíků, ovcí, koz nebo jiných zvířat. Inhibiční peptidy, kojugované s molekulou nosiče jako je albumin hovězího séra, nebo samotný inhibitor se kombinují s adjuvantni směsí, emulsifikují se a subkutánně se injektují na četná místa na zádech, na krku, na bocích a někdy do chodidel. Opakované ··· ·
I »w ··· · 1 • · 1 ·· ·· injekce se dávají v pravidelných intervalech, jako každé dva až čtyři týdny. Vzorky krve se získávají odběrem ze žil, na příklad z okrajových žil učního lalůčku po dilataci, zhruba 7 až 10 dní po každé injekci. Krevní vzorky se nechají srazit přes noc při 4 Ca odstřeďují se 30 minut při zhruba 2400 “X'g'a při-4~C“Serum se odďěTí, připraví se z něho arikvotni“ podíly a uchovávají se pro bezprostřední použití při 4 “C a pró následnou analýzu při -20 C až -90 C.
τ,λΤ,,Μ ««/1 --— -.„A__
Λ ±UliCl±iIXliU dli UÍ.ŮC1 d nebo vzorky prostředí z produkce monóklonálního antiséra se analýzuji-prostanovení titruprotilátek. Titr se stanovuje' několika způsoby, na příklad tečkováním a analýzou hustoty a také srážením radioaktivně značených komplexů protilátek peptidů za použití studeného ethanolu následovaným měřením proteinu A, sekundárního antiséra, nebo dextranu na aktivním uhlí, aktivity gamma počítačem. Antiséra s nejvyšším titrem se rovněž čistí na afinitních kolonách, které jsou komerčně dostupné. Inhibiční peptidy se spojují s gelem v afinitní koloně. Vzorky antiséra procházejí kolonou a protilátky inhibitoru zůstávají vázány v koloně. Následně se tyto protiláky vymývají, shromažďují a zhodnotí stanovením titru a specificity.
Pro inhibitor specifická antiséra s nejvyšším titrem se testují pro stanovení následujících údajů: a) optimálního ředění antiséra pro nejvyšší specifickou vazbu na antigen a nejnižší vazbu nespecifickou, b) schopnosti vázat rostoucí množství inhibičního peptidu ve standardní křivce substituce, c) potenciální křížové reaktivity s příbuznými peptidy a proteiny příbuzných species, d) peptidy inhibitoru v extraktech a v kultivačních mediích buněk.
Soupravy pro měření inhibitoru a receptorů inhibitoru jsou rovněž považovány za součást předkládaného vynálezu.
schopnosti detegovat plasmy, moči, tkání • Φ » φ φφφ Μ» « φ
Antiséra, která mají nejvyšší titr i specificitu a mohou delegovat peptidy inhibitoru v extraktech plasmy, moči, tkání a v kultivačních mediích buněk, jsou dále zkoumána, aby zdokonalovala snadnost použití souprav pro rychlé, spolehlivé a specifické změření a lokalisaci inhibitoru. Tyto soupravy -pro analýzy! které nejsou omezeny jen na následuj ící techniky, obsahují kompetitivní a nekompetitivní assaye, radiační imunoanalýzu, bioluminescenční a chemiluminiscenční
F1 πητ·ητηρ+
-a- -a- u w-a- van» -*»
Λ' _ „ _ l ociiuviuuvc tuitixyzý , imunoradiometrické analýzy, tečkovací techniky, enzymové analýzy včetně ·-ELI SAv*—·destičky· pro 'mikrotitraci,' pásky’ potažené protilátkami nebo namáčecí tyčinky pro rychlé monitorování moči nebo krve a pro imunocytochemii. Pro každou soupravu se stanovuje rozsah, citlivost, přesnost, spolehlivost, specificita a reprodukovatelnost analýzy.
Odchylka v rámci jedné analýzy a mezi analýzami se stanovuje v bodech 20 %, 50 % a 80 % na standardní křivce substituce nebo aktivity.
Jedním z příkladů analytické soupravy užívané běžně ve výzkumu i v klinické praxi je souprava pro radioimunoanalýzu (RIA). Inhibitorová RIA je popsána níže. Po úspěšné jodaci radioaktivním jodem a vyčistění inhibitoru nebo inhibičního peptidu se přidá antisérum s nejvyšším titrem v několika ředěních ve vhodném systému pufru, ke zkumavkám obsahujícím relativně konstantní množství radioaktivity jako 10 000 cpm. Jiné zkumavky obsahují pufr nebo sérum před imunisací, aby se stanovila nespecifická vazba. Po inkubaci při 4 C po 24 hodin se přidá protein A, zkumavky se protřepou, inkubuji 90 minut při teplotě místnosti a centrifugují zhruba při 2000 - 2500 X g při 4 ’C, aby se vysrážely komplexy protilátek vázaných na labelovaný antigen. Supernatant se odsaje a radioaktivita pelet spočítá pomocí gamma počítače. Roztok antiséra, které váže přibližně 10 % až 40 % labelovaného • · peptidu po odečteni nespecifické vazby, se charakterisuje dále.
Potom se stanoví rozmezí ředění (přibližně 0,1 pg až 10 ng) peptidu inhibitoru použitého pro vypěstování antisera přidáním známého množství peptidu do zkumavek, které obsahují radiačně labelovaný peptid a antisérum. Po dodatečné inkubační periodě, na příklad po 24 až 48 hodinách, se přidá protein A, zkumavky se centrifugují, odtáhne se supernatant a odečte se radioaktivita pelet. Substituce vazby radiačně labelovaného inhibičního peptidu nelabeíovaným inhibičním peptidém (standard)’ poskytuj e “Lstandardní křivku .^‘“ Pro' charakterisaci specificity antiséra inhibitoru se do zkušebních zkumavek přidávaj i různé koncentrace j iných fragmentů inhibičního peptidu, inhibitor z různých species a homologické peptidy.
Připravují se extrakty různých tkání, včetně, ale ne jenom, primárních a sekundárních tumorů, Lewisova plicního karcinomu, kultur buněk produkujících inhibitor, placenty, dělohy a jiných tkání jako mozku, jater a střev. Po lyofilisaci nebo Speed Vac tkáňových extraktů se přidá testový pufr a do RIA nádobek se umístí různé alikvotní podíly. Extrakty buněk produkujících inhibitor tvoří substituční křivky, které jsou paralelní ke standardní křivce, zatímco extrakty tkání, které neprodukují inhibitor, nesubstituují radioaktivně značený inhibitor v inhibitoru. Kromě toho extrakty moči, plasmy a cerebrospinální tekutiny živočichů s Lewisovým plicním karcinomem se přidávají do zkušebních zkumavek ve zvýšených množstvích. Paralelní substituční křivky indikují užitečnost testu inhibice pro změření inhibitoru v tkáních a tělesných tekutinách.
Extrakty tkání, které obsahují inhibitor, se navíc charakterisuji tím, že se alikvotní podíly podrobí reversně fázové HPLC. Frakce eluátu se shromažďují, vysuší ve Speed • · * · • · · · · • ··· · ·
Vac, rekonstituují v RIA pufru a analyzují v inhibiční RIA. Maximální množství inhibitorní imunoreaktivity se nalézá ve frakcích odpovídajících eluční posici inhibitoru.
Souprava pro analýzu poskytuje instrukce, antisérum, inhibitor nebo inhibiční peptid a možno i radiačně labelovaný inhibitor a/nebo činidla pro srážení vázaných komplexů inhibitor-protilátka inhibitoru. Souprava je užitečná pro měření inhibitoru v biologických tekutinách a extraktech tkání zvířat a lidí majících i nemající tumory.
Jiná souprava se používá pro lokalisaci inhibitoru v tkáních*“ a™ buňkáchT^Tato^sóupráva pro imunohistochemii’’ inhibitoru poskytuje instrukce, antisérum inhibitoru a možno i blokovací sérum a sekundární antisérum vázané na fluoresceční molekulu jako isothiokyanát fluoresceinu nebo na některá další činidla používaná k visualisaci primárního antiséra. Imunohistochemické techniky jsou dobře známy odborníkům orientovaným v oboru. Tato souprava pro imunohistochemii inhibitoru dovoluje lokalisaci inhibitoru v tkáňových řezech a pěstovaných buňkách při použití mikroskopie světelné i elektronové. Je používána jak pro výzkumné tak i pro klinické účely. Aby se zjistila místa produkce inhibitoru, jsou na příklad tumory podrobeny biopsii nebo shromážděny a úseky tkání nařezány mikrotomem. Taková informace je užitečná pro diagnostické a možné terapeutické účely při detekci a léčení karcinomu. Jiná metoda pro visualisaci míst syntézy inhibitoru představuje radiační labelisace nukleových kyselin pro užití k hybridisaci in šitu na zkoušku pro mediátorovou RNA. Podobně může být pomocí imunohistochemických technik lokalisován, visualisován a kvantifikován receptor inhibitoru.
» 4 4 4 4 44·· · »« 4 · 4 44 4 « 4 «· 4*4 444
4444 ·4 4 44 44
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 zobrazuje inhibici proliferace endothelových buněk jako procentovou změnu v počtu buněk v závislosti na koncentraci isolovaného Kringle 5 peptidového fragmentu lidského plasminogenu přidávaného k buňkám.
Obrázek 2 ukazuje analytické výsledky gelové elektroforesy preparace peptidového fragmentu Kringle 5 isolovaného z lidského plasminogenu. Sloupec 1 je isolovaný Kringle 5; sloupec 2 vyznačuje údaje o molekulové hmotnosti.
' Obrázek3ukazuje okruK'aminokyselin v Kringle-oblasti’ 1, 2, 3, 4, a 5 lidského plasminogenu (SEQ ID NOS:2-6).
Obrázek 4 znázorňuje aktivitu lidského plasminogenu Kringle 5 proti proliferaci endothelových buněk ve spojení a bez spojení s aminokarboxylovou kyselinou (AMCHA) a ukazuje, že vazebná místa lysinu nebyla zodpovědná za aktivitu Kringle 5 proti proliferaci endothelových buněk.
Obrázek 5 ukazuje inhibiční efekt rekombinantního Kringle 5 na proliferaci hovězích endothelových buněk.
Předkládaný vynález je kromě tohoto ilustrován následujícími příklady, které nejsou žádným způsobem sestaveny tak, že by měly tvořit omezení jeho rozsahu. Je naopak jasné, že mohou být východiskem pro různá další provedení, modifikace a jejich obdoby, které po přečtení zde uvedeného popisu, mohou napadnout odborníky orientované v oboru.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
DEMONSTRACE INHIBITORNÍ AKTIVITY PROLIFERACE ENDOTHELOVÝCH • · ·
BUNĚK PRO KRINGLE 5 Z LIDSKÉHO PLASMINOGENU
Zdroj: Lidský plasminogen byl štěpen příslušnými enzymy, aby poskytl fragment Kringle 5. Peptidový fragment byl isolován a vyčištěn standardními metodami pro čistění proteinu a pepťrdu; odborníkům v oboru dobře známými. Čistota isolovaného Kringle 5 je znázorněna na obrázku 2, který ukazuje výsledky průběhu preparace gelovou elektroforesou. Analýza: Inhibitorní aktivita endothelových buněk byla analyzována pomocí syntézy DNA (inkorporace [methyl-^H]
--** thymidinuj — v-* hovězích •‘kapilár nich endothelových buňkách?
Kapilární endothelové buňky byly získány z hovězích nadledvinek a pěstovány na želatinou potažených mikrotitračních destičkách se 48 jímkami.
Ke kultivovaným buňkám byla přidána různá množství isolovaného Kringle 5 a určila se změna počtu buněk. Procentická změna počtu buněk je vynesena jako funkce množství Kringle 5 přidaného ke kultuře a jejím výsledkem je graf na obrázku 1.
Obrázek 3 ukazuje srovnání podobných sekvencí 80 aminokyselin pocházejících z Kringle oblastí 1, 2, 3, 4 a 5 lidského plasminogenu.
Claims (32)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob inhibice proliferace endothelových buněk in vitro vyznačující se tím, že se do endothelové buňky aplikuje efektivní množství proteinu, který^má sekvenci aminokyselin peptidu Kringle 5 z molekuly plasmi nogenu,
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že protein obsahuje přibližně 80 aminokyselin.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že protein má molekulovou hmotnost přibližně 14 kD.
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že plasminogenem je lidský plasminogeň.
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se ti m, ž e protein má sekvenci aminokyselin podstatně podobnou s SEQ ID N0:l.
- 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že protein má sekvenci aminokyselin podstatně podobnou s SEQ ID NO:6.
- 7. Způsob ošetřování jedince, který má angiogenesi zprostředkovanou chorobu vyznačující se tím, že se jedinci podává efektivní množství proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu Kringle 5 z molekuly plasminogenu.
- 8.tím,Způsob podle nároku 7, vyznačujíc! ž e protein obsahuje přibližně 80 aminokyselin.• · 9
- 9 9 9 99*99 99 9 99. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že protein má molekulovou hmotnost přibližně 14 kD.
- 10. Způsob podle nároku 7, vyznačující se -t—í—m- ž-e plasmirrogenem je lidsky plasminogen,
- 11. Způsob podle nároku 7, vy tím. že protein má sekvenci podobnou s SEQ ID N0:l.značující se aminokyselin podstatné značující se aminokyselin podstatně značující se inhibovat proliferaci značující se značui ící
- 12. Způsob podle nároku 7, vy ti m, ž e protein má sekvenci podobnou s SEQ ID NO:6.
- 13. Způsob podle nároku 7, vy tím, že protein má schopnost endothelových buněk.
- 14. Způsob podle nároku 7, vy tím, že jedincem je člověk.
- 15. Způsob podle nároku 7, vy tím, že angiogenesí zprostředkovaná choroba je rakovina.
- 16. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že rakovinou je tvrdý tumor.
- 17. Způsob inhibice proliferace endothelových buněk jedince vyznačující se tím, že se jedinci podává efektivní množství proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu Kringle 5 z molekuly plasminogenů.
- 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že protein obsahuje přibližně 80 aminokyselin.
- 19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že protein má molekulovou hmotnost přibližně 14 kD.
- 20. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že plasminogenem je lidský plasminogen.
- 21. Způsob podle nároku 17, vyznačující se - ti - m,i ž—O*·* protein™ má-''sekvenci“* aminokyselin podstatně’ podobnou s SEQ ID NO:6.
- 22. Způsob podle nároku 17, vyznačující se t í m, ž e protein má sekvenci aminokyselin podstatně podobnou s SEQ ID N0:l.
- 23. Způsob podle nároku 17, vyznačujíc! se tím, že jedincem je člověk.
- 24. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že jedinec má angiogenesí zprostředkovanou chorobu.
- 25. Způsob podle nároku 24,vyznačuj ící se tím, že angiogenesí zprostředkovanou chorobou je rakovina
- 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že rakovinou je tvrdý tumor.
- 27. Farmaceutická komposice vyznačující se tím, že obsahuje proliferaci endothelových buněk inhibující množství proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu Kringle 5 z molekuly plasminogenu, a farmaceuticky • «·* přijatelný nosič.
- 28. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že protein obsahuje přibližně 80 aminokyselin.
- 29. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že protein má molekulovou hmotnost přibližně 14 kD.
- 30. «Kompozice*podle-“·nároku-27, v y ž bačuj ic'f se tím, že plasminogenem je lidský plasminogen.
- 31. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že protein má sekvenci aminokyselin podstatně podobnou s SEQ ID NO:6.
- 32. Kompozice podle nároku 27, se tím, že protein má podstatně podobnou s SEQ ID N0:l.vyznačuj ící sekvenci aminokyselin • · ·· · tI « ♦ ·* · ·· · »« * · % změny v počtu buněk toProtein konc. (nM)R> 5 ά> Ců -L ΓΌ MOOOOOOo©
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US851995P | 1995-12-13 | 1995-12-13 | |
US08/763,528 US5854221A (en) | 1996-12-12 | 1996-12-12 | Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ182898A3 true CZ182898A3 (cs) | 1998-10-14 |
CZ298612B6 CZ298612B6 (cs) | 2007-11-21 |
Family
ID=26678280
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ0182898A CZ298612B6 (cs) | 1995-12-13 | 1996-12-13 | Inhibitor proliferace endothelových bunek a jeho použití |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20010016644A1 (cs) |
EP (1) | EP0869970B1 (cs) |
JP (1) | JP3684371B2 (cs) |
KR (1) | KR100477280B1 (cs) |
CN (1) | CN1554444A (cs) |
AT (1) | ATE262537T1 (cs) |
AU (1) | AU710612B2 (cs) |
BR (1) | BR9612115A (cs) |
CA (1) | CA2240296C (cs) |
CZ (1) | CZ298612B6 (cs) |
DE (1) | DE69631972T2 (cs) |
DK (1) | DK0869970T3 (cs) |
ES (1) | ES2217340T3 (cs) |
HK (1) | HK1017692A1 (cs) |
HU (1) | HUP9900979A3 (cs) |
NO (1) | NO321775B1 (cs) |
NZ (1) | NZ330537A (cs) |
PL (1) | PL188719B1 (cs) |
PT (1) | PT869970E (cs) |
WO (1) | WO1997023500A1 (cs) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ330537A (en) * | 1995-12-13 | 2001-06-29 | Childrens Medical Center | Kringle 5 rerion of plasminogen as an endothelial cell proliferation inhibitor |
US6699838B1 (en) | 1996-05-03 | 2004-03-02 | Abbott Laboratories | Antiangiogenic peptides |
DE69733756T2 (de) * | 1996-05-03 | 2006-06-01 | Abbott Laboratories, Abbott Park | Antiangiogenische peptiden, dafür kodierende polynukleotide und verfahren zur hemmung der angiogenesis |
US5801146A (en) * | 1996-05-03 | 1998-09-01 | Abbott Laboratories | Compound and method for inhibiting angiogenesis |
US5801012A (en) | 1996-09-17 | 1998-09-01 | Northwestern University | Methods and compositions for generating angiostatin |
JP2002510209A (ja) * | 1997-06-26 | 2002-04-02 | カロリンスカ イノベイションズ アクチボラゲット | インビボで血管形成を調節することができるプラスミノーゲンのクリングルドメイン1−5 |
WO1999026480A1 (en) * | 1997-11-20 | 1999-06-03 | Genetix Pharmaceuticals, Inc. | Anti-angiogenic gene therapy vectors and their use in treating angiogenesis-related diseases |
US6632961B1 (en) | 1998-05-22 | 2003-10-14 | Abbott Laboratories | Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy |
US7144854B1 (en) | 1999-09-10 | 2006-12-05 | Conjuchem, Inc. | Long lasting anti-angiogenic peptides |
CA2373252C (en) * | 1999-05-17 | 2007-08-07 | Conjuchem Inc. | Long lasting anti-angiogenic peptides |
WO2000069911A1 (en) | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Conjuchem, Inc. | Long lasting insulinotropic peptides |
JP2003517007A (ja) * | 1999-12-15 | 2003-05-20 | エントレメッド インコーポレイテッド | 内皮細胞増殖阻害組成物および方法 |
CA2421251A1 (en) | 2000-09-05 | 2002-03-14 | Karolinska Innovations Ab | Recombinant endothelial cell growth inhibitors derived from a mammalian plasminogen |
AU2002239414A1 (en) * | 2000-11-02 | 2002-05-27 | Bristol-Myers Squibb Company | Modified plasminogen related peptide fragments and their use as angiogenesis inhibitors |
EP1714151A4 (en) * | 2004-01-21 | 2009-06-10 | Fujirebio America Inc | DETECTION OF PEPTIDES RELATED TO MESOTHELIN / MEGAKARYOCYTIC POTENTIAL FACTOR IN PERITONEAL LIQUID FOR THE ASSESSMENT OF THE PERITONEUM AND PERITONEAL CAVE |
CN100355458C (zh) * | 2005-03-16 | 2007-12-19 | 北京大学 | 人增殖抑制基因-腺病毒表达载体的应用 |
US20120220015A1 (en) | 2009-05-26 | 2012-08-30 | Biolex Therapeutics | Compositions and methods for production of aglycosylated plasminogen |
CN103060265B (zh) * | 2013-01-23 | 2014-12-03 | 山东大学 | 老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4929444A (en) * | 1985-05-28 | 1990-05-29 | Burroughs Wellcome Co. | Low pH pharmaceutical formulation containing t-PA |
US5149533A (en) * | 1987-06-04 | 1992-09-22 | Zymogenetics, Inc. | Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle |
US5302390A (en) * | 1987-07-01 | 1994-04-12 | Beecham Group Plc | Hybrid proteins of human plasminogen and human t-PA, pharmaceutical compositions and methods of treatment |
US5491129A (en) * | 1992-07-30 | 1996-02-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Synthetic peptides derived from vitronectin and pharmaceutical compositions comprising them |
EP0758390B1 (en) * | 1994-04-26 | 2007-02-28 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin and method of use for inhibition of angiogenesis |
JPH09512426A (ja) * | 1994-04-26 | 1997-12-16 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | 好中球の接着および移動の遮断に有用なMac−1 I−ドメイン蛋白質 |
CZ334097A3 (cs) * | 1995-04-26 | 1998-04-15 | The Children's Medical Center Corporation | Fragmenty angiostatinu, agregovaný angiostatin a způsoby jeho použití |
NZ330537A (en) * | 1995-12-13 | 2001-06-29 | Childrens Medical Center | Kringle 5 rerion of plasminogen as an endothelial cell proliferation inhibitor |
-
1996
- 1996-12-13 NZ NZ330537A patent/NZ330537A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-12-13 KR KR10-1998-0704447A patent/KR100477280B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-12-13 JP JP52383197A patent/JP3684371B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-13 DK DK96945635T patent/DK0869970T3/da active
- 1996-12-13 AT AT96945635T patent/ATE262537T1/de active
- 1996-12-13 EP EP96945635A patent/EP0869970B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-13 ES ES96945635T patent/ES2217340T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-13 CN CNA2004100432779A patent/CN1554444A/zh active Pending
- 1996-12-13 BR BR9612115A patent/BR9612115A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-12-13 PL PL96327200A patent/PL188719B1/pl unknown
- 1996-12-13 HU HU9900979A patent/HUP9900979A3/hu unknown
- 1996-12-13 PT PT96945635T patent/PT869970E/pt unknown
- 1996-12-13 CA CA002240296A patent/CA2240296C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-13 DE DE69631972T patent/DE69631972T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-13 WO PCT/US1996/020447 patent/WO1997023500A1/en active IP Right Grant
- 1996-12-13 CZ CZ0182898A patent/CZ298612B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-12-13 AU AU16870/97A patent/AU710612B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-06-12 NO NO19982715A patent/NO321775B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-06-23 HK HK99102688.5A patent/HK1017692A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-12-29 US US09/753,064 patent/US20010016644A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR19990072126A (ko) | 1999-09-27 |
CA2240296A1 (en) | 1997-07-03 |
PL188719B1 (pl) | 2005-04-29 |
HUP9900979A3 (en) | 2001-10-29 |
AU1687097A (en) | 1997-07-17 |
BR9612115A (pt) | 1999-02-17 |
NO321775B1 (no) | 2006-07-03 |
KR100477280B1 (ko) | 2005-07-18 |
PT869970E (pt) | 2004-08-31 |
HK1017692A1 (en) | 1999-11-26 |
NO982715L (no) | 1998-08-12 |
NO982715D0 (no) | 1998-06-12 |
NZ330537A (en) | 2001-06-29 |
DE69631972T2 (de) | 2005-01-05 |
US20010016644A1 (en) | 2001-08-23 |
JP2002502359A (ja) | 2002-01-22 |
ATE262537T1 (de) | 2004-04-15 |
EP0869970B1 (en) | 2004-03-24 |
PL327200A1 (en) | 1998-11-23 |
ES2217340T3 (es) | 2004-11-01 |
CA2240296C (en) | 2004-05-04 |
JP3684371B2 (ja) | 2005-08-17 |
HUP9900979A2 (hu) | 1999-07-28 |
DE69631972D1 (de) | 2004-04-29 |
EP0869970A1 (en) | 1998-10-14 |
WO1997023500A1 (en) | 1997-07-03 |
AU710612B2 (en) | 1999-09-23 |
CZ298612B6 (cs) | 2007-11-21 |
CN1554444A (zh) | 2004-12-15 |
DK0869970T3 (da) | 2004-07-05 |
EP0869970A4 (en) | 2002-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5854221A (en) | Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use | |
JP3880593B2 (ja) | アンジオスタチンおよび血管形成の抑制におけるその使用 | |
KR100336452B1 (ko) | 앤지오스타틴및맥관형성억제를위한이의사용방법 | |
US5861372A (en) | Aggregate angiostatin and method of use | |
US6521439B2 (en) | Nucleic acids encoding plasminogen fragments | |
US5801146A (en) | Compound and method for inhibiting angiogenesis | |
CZ182898A3 (cs) | Inhibitor proliferace endothelových buněk a jeho použití | |
JP2001506506A (ja) | アンジオスタチンフラグメントおよび使用方法 | |
JPH11508228A (ja) | アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン凝集体および使用方法 | |
WO1999000420A1 (en) | Kringle domains 1-5 of plasminogen, capable of modulating angiogenesis in vivo | |
WO2000061179A1 (en) | Kringle domains of plasminogen, capable of modulating angiogenesis in vivo | |
CN101307106B (zh) | 内皮细胞增殖抑制剂及其应用方法 | |
MXPA99011041A (en) | Angiostatin fragments and method of use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20141213 |