JP2003517007A - 内皮細胞増殖阻害組成物および方法 - Google Patents

内皮細胞増殖阻害組成物および方法

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リー シム，キム
デイ，クララ
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Abstract

(57)【要約】 クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドのファミリーならびにその活性フラグメントに属するタンパク質を含む組成物および血管形成活性の調節法を提供する。より詳細には、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および／またはマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、およびその生物活性フラグメントなどのクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドを含む組成物および方法を提供する。本発明のＨＧＦタンパク質フラグメントは、ヒト細胞および他の動物細胞（特に、内皮細胞）に対して強力な血管形成活性を示す。より詳細には、ＨＧＦフラグメントおよび／またはＨＧＦフラグメントホモログを含む組成物を薬学的に許容可能な賦形剤またはキャリアと組み合わせることができ、これを使用して血管形成および癌、関節炎、黄斑変性症、および糖尿病性網膜症などの血管形成関連疾患を阻害することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［技術分野］ 本発明は、分散因子としても公知の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管形成依存
性癌を含む血管形成関連疾患の治療に有用な血管形成制御因子としてのマクロフ
ァージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、などのクリングルドメイン含有タンパク質お
よびペプチドの新規の用途に関する。より詳細には、本発明は、血管形成を制御
し得る、好ましくは阻害し得るＨＧＦおよび／またはＭＳＰの活性フラグメント
を含むクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドに関する。本発明は、
さらに、新規のＨＧＦおよび／またはＭＳＰフラグメント組成物ならびに癌、関
節炎、失明、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化
症など血管形成依存性障害の治癒方法に関する。さらに、本発明は、例えばＨＧ
Ｆ（およびそのフラグメント）とクリングルドメイン含有タンパク質およびペプ
チドに特異的な抗体の生合成をモニターするための分子プローブであるｃ−ｍｅ
ｔレセプターとの相互作用を妨害するクリングルドメイン含有タンパク質および
ペプチド抗体、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドに対するペプ
チドアゴニストおよびアンタゴニストの開発、ならびにレセプターペプチドに連
結した細胞傷害薬に関する。
【０００２】 ［発明の背景］ クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドは、三重ジスルフィドルー
プ構造で特徴づけられるという点で特異である。このようなタンパク質の例には
、肝細胞成長因子、マクロファージ刺激タンパク質、組織プラスミノゲンアクチ
ベーター、アポリポタンパク質（ａ）、プロトロンビン、ウロキナーゼ、および
アンギオスタチンタンパク質が含まれる。
【０００３】 肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、間充織由来の糖タンパク質であり、コラーゲン
基質中に腎臓上皮細胞を誘導して細管の分岐網を形成する能力から命名されてい
る(Grant et al., PNAS,1993; 90: 1937-1941)。当該分野で特徴づけられている
ように、ＨＧＦは、主に内皮細胞促進細胞運動性、増殖、プロテアーゼ生成、毛
細管様細管への浸潤および組織化に対して作用する強力な血管形成分子であると
考えられている(Rosen et al., Adv. Cancer Res. 1995; 67: 257-79)。
【０００４】 ＨＧＦは、プラスミノゲンと２９％同一であり、最初の４つのクリングルドメ
インにおいてＨＧＦはプラスミノゲンと４４％類似している。ＨＧＦは、マクロ
ファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）と約４４％同一である。さらに、全システイ
ンおよびトリプトファンおよびプロリンなどのほとんどの芳香族アミノ酸は、Ｈ
ＧＦとプラスミノゲンの間で保存されている。これは、α鎖（６９ｋＤａ）およ
びβ鎖（３４ｋＤａ）から構成される巨大なヘテロ二量体分子に切断される、７
２８個のアミノ酸の前駆体として産生される (Lokker et al., Prot. Engin., 1
994; 7: 895-903)。ＨＧＦは、ヘビーサブユニット（５８ｋＤａ）およびライト
サブユニット（３１ｋＤａ）からなる塩基性ヘパリン結合糖タンパク質である(G
rant et al.)。ＨＧＦの生物学的効果は、ＨＧＦとその高親和性レセプターｃ−
Ｍｅｔとの相互作用によって引き起こされる。ｃ−Ｍｅｔは、膜を１回横断する
１４５ｋＤａのβ鎖と５０ｋＤａの細胞外α鎖とを含むレセプター型チロシンキ
ナーゼである。ＨＧＦ−Ｍｅｔシグナル伝達は、ヒト癌の病原性および生物学に
おける重要な役割の支持に関連している。詳細には、自己分泌または傍分泌機構
によってＨＧＦ−Ｍｅｔシグナル伝達は腫瘍細胞増殖、浸潤、および血管形成を
促進すると考えられている。
【０００５】 上記のように、ＨＧＦの構造は、プラスミノゲンの構造に類似している。α鎖
はＮ末端ヘアピンループとそれに続く４つのクリングルドメインの存在により識
別され、β鎖は非機能的セリンプロテアーゼ様ドメインによって識別される。構
造機能研究により、ヘアピンループおよびクリングルドメインはＨＧＦのそのレ
セプターおよびプロテオグリカンへの結合に重要であることが示されている(To
et al., Oncl. Rep., 1998; 5: 1013-1024)。
【０００６】 マクロファージ刺激タンパク質 マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）は、肝臓によって一本鎖の生物学的
に不活性なプロＭＳＰとして血流に分泌される７８ｋＤの血漿タンパク質（７１
１ａａ）である。１つの部位でのタンパク質分解切断後、ＭＳＰは生物活性ジス
ルフィド結合αβ鎖ヘテロ二量体分子となる。ＭＳＰは、ＲＯＮと呼ばれるその
膜貫通チロシンキナーゼと相互作用して、その生物学的効果を媒介するシグナル
伝達経路の活性化を誘導する成長および運動因子である。
【０００７】 ＭＳＰおよびＨＧＦは共に、細胞表面タンパク質チロシンキナーゼレセプター
と相互作用するプラスミノゲン関連成長および運動因子である。それぞれが、ジ
スルフィド結合α鎖およびセリンプロテアーゼ様β鎖を含むヘテロ二量体タンパ
ク質である。ＭＳＰとＨＧＦは構造が類似するにもかかわらず、主要なレセプタ
ー結合部位は、ＨＧＦではα鎖上に位置するがＭＳＰではβ鎖上に位置する。
【０００８】 評価研究により、ＨＧＦおよびＨＧＦ１／ＭＳＰは、プラスミノゲン、ならび
にクリングルドメインの１つのコピー、セリンプロテアーゼドメイン、およびこ
の２つのドメインを接続する活性化ペプチドを含む祖先遺伝子由来のクリングル
−セリンプロテイナーゼスーパーファミリーの他のメンバーと共に進化している
ことが示された。したがって、プラスミノゲン、ＨＧＦ、およびＨＧＦ１／ＭＳ
Ｐ由来のクリングルドメインは、依然として抗血管形成などの類似の生物学的機
能を有し得る。
【０００９】 血管形成および癌 腫瘍成長は血管形成依存性であるという仮説は、１９７１年にJudah Folkman
によって最初に提唱された(N. Engl. Jour. Med. 285: 1182 1186, 1971)。最
も簡単に言えば、この仮説は、ある段階を超えた腫瘍体積の拡大には新規の毛細
血管の誘導が必要であるということを提唱している。例えば、マウスにおける初
期の前血管期での肺微小転移は、組織切片の高分解能顕微鏡観察による他には検
出不可能である。腫瘍成長が血管形成依存性であるという概念を支持する、さら
なる間接的な証拠は、その全てが本明細書中で参照により援用される米国特許第
５，６３９，７２５号、同第５，６２９，３２７号、同第５，７９２，８４５号
、同第５，７３３，８７６号、および同第５，８５４，２０５号に見出される。
【００１０】 血管形成を刺激するために、腫瘍は、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦおよびｂ
ＦＧＦ）(Kandel et al., 1991)および血管内皮細胞成長因子／血管透過因子（
ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）およびＨＧＦを含む種々の血管形成因子の生成を上方制御す
る。しかし、多数の悪性腫瘍はまた、アンギオスタチンタンパク質およびトロン
ボスポンジンを含む血管形成インヒビターも生成する(Chen et al., 1995; Good
et al., 1990;O’Reilly et al., 1994)。血管形成表現型は、これらの新血管
形成の陽性制御因子と陰性制御因子との間の全体的なバランスの結果であると予
想される(Good et al., 1990;O’Reilly et al., 1994;Parangi et al., 1996;
Rastinejad et al., 1989)。血管形成のいくつかの他の内因性インヒビターが同
定されているが、全てが腫瘍の存在に関連しているわけではない。これらには、
血小板因子４(Gupta et al., 1995; Maione et al., 1990)、インターフェロン
−α、インターロイキン１２および／またはインターフェロンγによって誘導さ
れる(Voest et al., 1995)インターフェロン誘導性タンパク質１０(Angiolillo
et al., 1995; Strieter et al., 1995)、ｇｒｏ−β(Cao et al., 1995)、およ
びプロラクチンの１６ｋＤａのＮ末端フラグメント(Clapp et al., 1993)が含ま
れる。
【００１１】 内皮細胞増殖を特異的に阻害する血管形成インヒビターの１つの例は、アンギ
オスタチンタンパク質である (O’Reilly et al., 1994)。アンギオスタチンタ
ンパク質は、約３８キロダルトン（ｋＤａ）の、内皮細胞増殖の特異的インヒビ
ターである。アンギオスタチンタンパク質は、プラスミノゲンの５つのクリング
ルのうちの少なくとも３つを含むプラスミノゲンの内部フラグメントである。ア
ンギオスタチンタンパク質は、ある種の腫瘍モデルの腫瘍重量を減少させ、転移
を阻害することが示されている(O’Reilly et al., 1994)。別の血管形成インヒ
ビターは、コラーゲンのカルボキシフラグメントまたはＸＶＩＩＩであるエンド
スタチンタンパク質である。(O’Reilly et al., 1997)。
【００１２】 単独でまたは公知の血管形成薬との組み合わせとして使用して癌および過剰増
殖障害を治療し得る、さらなる抗血管形成薬を発見および開発することが必要で
ある。
【００１３】 ［発明の概要］ 本発明は、分散因子としても公知の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管形成依存
性癌を含む血管形成関連疾患の治療に有用な血管形成制御因子としてのマクロフ
ァージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）などのクリングルドメイン含有タンパク質およ
びペプチドの新規の用途を含む。より詳細には、本発明は、血管形成を制御し得
る、好ましくは阻害し得るＨＧＦおよび／またはＭＳＰの活性フラグメントを含
むクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドに関する。本発明は、さら
に、新規のＨＧＦおよび／またはＭＳＰフラグメント組成物ならびに癌、関節炎
、失明、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化症な
どの血管形成依存性障害の治癒法に関する。さらに、本発明は、例えばＨＧＦ（
およびそのフラグメント）とクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチド
に特異的な抗体の生合成をモニターするための分子プローブであるｃ−ｍｅｔレ
セプターとの相互作用を妨害するクリングルドメイン含有タンパク質およびペプ
チド抗体、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドに対するペプチド
アゴニストおよびアンタゴニストの開発、ならびにレセプターペプチドに連結し
た細胞傷害薬に関する。本発明は、一般に、血管形成インヒビターとしてのクリ
ングルドメイン含有タンパク質およびペプチドおよびその活性フラグメントなら
びにその使用に関する。このようなタンパク質の例には、肝細胞成長因子（ＨＧ
Ｆ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、アポリポタンパク質、プロト
ロンビンウロキナーゼ、および組織プラスミノゲンアクチベーターが含まれる。
完全なＨＧＦは、内皮細胞機能および血管形成の強力かつ特異的な制御因子であ
るが、本明細書中で示すように、クリングルドメインを含むＨＧＦフラグメント
は、完全なＨＧＦとは逆に作用する。活性ＨＧＦフラグメントを使用した全身治
療により、腫瘍誘導性血管形成を抑制し、強力な抗腫瘍活性を示す。
【００１４】 分散因子としても公知のＨＧＦは、アミノ酸組成によって同定したところ、約
８７キロダルトンの分子量である。本明細書中に記載のように、新規のＨＧＦフ
ラグメントは、培養内皮細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、および他の種々の細胞の
内皮細胞機能を阻害し得る。
【００１５】 本発明は、望ましくない血管形成を有するヒトまたは動物への、本発明の新規
のＨＧＦおよび／またはＭＳＰ活性フラグメントなどのクリングルドメイン含有
タンパク質およびペプチドを含む組成物またはその誘導体の、血管形成の制御、
好ましくは阻害に十分な投薬量での投与によって、望ましくない制御不能な血管
形成により媒介される疾患および過程を治療するための方法および組成物を提供
する。より詳細には、本発明は、ＨＧＦおよび／またはＭＳＰのクリングル１〜
３および／またはクリングル２〜３に関する。本発明は、腫瘍成長の治療または
抑制に特に有用である。本発明で同定した新規のＨＧＦおよび／またはＭＳＰフ
ラグメントの、転移腫瘍を有するヒトまたは動物への投与により、腫瘍の成長ま
たは拡大が予防される。本発明は、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの内皮細胞機能を制御するための方法および組成物を提供する。
【００１６】 本発明はまた、同位元素、または陽電子放出断層撮影、オートラジオグラフィ
ー、フローサイトメトリー、放射受容体結合アッセイ、および免疫組織化学が含
まれるが、これらに限定されない最新技術で、ＨＧＦ結合部位の検出および視覚
化に使用される他の分子またはタンパク質で標識することができるＨＧＦペプチ
ドフラグメントなどの、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドを含
む。
【００１７】 本発明はまた、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチド、クリング
ルドメイン含有タンパク質およびペプチドのフラグメント、または治療および研
究目的の細胞障害薬に結合させたクリングルドメイン含有タンパク質およびペプ
チドレセプターアゴニストおよびアンタゴニストを含む。
【００１８】 本発明はまた、ＨＧＦ、ＨＧＦフラグメント、または治療および研究目的の細
胞障害薬に結合させたＨＧＦレセプターアゴニストおよびアンタゴニストを含む
。
【００１９】 本発明はまた、ＭＳＰ、ＭＳＰフラグメント、または治療および研究目的の細
胞障害薬に結合させたＭＳＰレセプターアゴニストおよびアンタゴニストを含む
。
【００２０】 さらに、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドは、クリングルド
メイン含有タンパク質レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストとして作用
し得るので、このようなタンパク質の生物活性を増大または妨害することができ
る。このようなタンパク質およびペプチドは、ＨＧＦレセプターなどのレセプタ
ーの単離に使用される。
【００２１】 驚いたことに、種々のＨＧＦ活性フラグメントは腫瘍保有動物に投与した場合
に徐放性抗血管形成化合物として作用し得るということを発見した。
【００２２】 本発明はまた、内皮細胞関連疾患および障害診断用の、クリングルドメイン含
有タンパク質およびペプチドおよびそのフラグメント、その相当する核酸配列、
ならびにインヒビターおよびそのペプチドに特異的に結合する抗体の使用法に関
する。
【００２３】 本発明は、レセプター特異的ＨＧＦフラグメントの同定法およびこのような方
法によって同定および単離されたレセプター分子をさらに含む。
【００２４】 重要な医学的方法の一つは、子宮内膜血管新生が阻害されて胚の着床を起こす
ことができないかまたは継続することができないように、ＨＧＦまたはＭＳＰな
どのクリングルドメイン含有タンパク質由来の有効量のクリングルドメインを雌
に投与する、新規の避妊形態である。
【００２５】 本発明の特に重要な態様は、血管形成関連疾患、特に血管形成依存性癌の患者
を治療し、血管形成依存性癌患者を治癒する新規の有効な方法の発見である。こ
の方法は、思いがけず、腫瘍成長の抑制および腫瘍質量の減少という医学的に重
要な結果を提供する。この方法は、本発明の活性ＨＧＦ（またはＭＳＰ）フラグ
メントおよび別のアンギオスタチンタンパク質(EntreMed, Inc. Rockville, MD
の抗血管形成化合物またはエンドスタチンタンパク質(EntreMed, Inc. Rockvill
e, MD)などの同時投与に関する。したがって、本発明はまた、血管形成依存性疾
患の治療または治癒に有効なＨＧＦクリングルフラグメント、ＭＳＰクリングル
フラグメント、アンギオスタチンタンパク質、および／またはエンドスタチンタ
ンパク質を含む処方物を含む。
【００２６】 したがって、本発明の目的は、血管形成障害治療に有用な活性ＨＧＦフラグメ
ントを含む、ＨＧＦなどのクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドを
含む組成物および方法を提供することにある。
【００２７】 本発明の別の目的は、血管形成障害の治療に有用なアンギオスタチンタンパク
質またはエンドスタチン（商標）タンパク質などの他の抗血管形成化合物と組み
合わせた、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドまたはクリングル
ドメイン含有タンパク質およびペプチドフラグメントを含む組成物および方法を
提供することにある。
【００２８】 本発明の別の目的は、血管形成障害の治療に有用なアンギオスタチンタンパク
質またはエンドスタチンタンパク質などの他の抗血管形成化合物と組み合わせた
ＨＧＦまたはＨＧＦクリングルドメイン含有フラグメントを含む組成物および方
法を提供することにある。
【００２９】 本発明の別の目的は、血管形成障害の治療に有用なアンギオスタチンタンパク
質またはエンドスタチンタンパク質などの他の抗血管形成化合物と組み合わせた
ＭＳＰまたはＭＳＰクリングルドメイン含有フラグメントを含む組成物および方
法を提供することにある。
【００３０】 本発明の別の目的は、血管形成によって媒介される疾患および過程を治療する
ための組成物および方法を提供することにある。
【００３１】 本発明のさらに別の目的は、血管形成によって媒介される血管腫、固形腫瘍、
白血病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、硬皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管形成、
プラーク新血管形成、冠動脈側副枝、脳側副枝、動静脈奇形、虚血性肢血管形成
(ischemic limb angiogenesis)、角膜疾患、ルベオーシス、血管新生緑内障、糖
尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症、関節炎、糖尿病性新血管形成、黄斑変性症
、創傷治癒、手術による癒着、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、
排卵、月経、および胎盤形成が含まれるが、これらに限定されない疾患および過
程、を治療するための組成物および方法を提供することにある。
【００３２】 本発明の別の目的は、癌の成長を治療または抑制するための組成物および方法
を提供することにある。
【００３３】 本発明のさらに別の目的は、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチ
ド、またはタンパク質およびペプチド分子を含む特定のクリングルドメイン領域
に選択的なクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドフラグメントに対
する抗体を含む組成物および方法を提供することにある。
【００３４】 本発明の別の目的は、ＨＧＦ、またはＨＧＦ分子の特定の領域に選択的なＨＧ
Ｆフラグメントに対する抗体を含む組成物および方法を提供することにある。
【００３５】 本発明のさらに別の目的は、ＭＳＰ、またはＭＳＰ分子の特定の領域に選択的
なＭＳＰフラグメントに対する抗体を含む組成物および方法を提供することにあ
る。
【００３６】 本発明の別の目的は、抗血管形成活性の検出または予後のための組成物および
方法を提供することにある。
【００３７】 本発明のさらに別の目的は、副作用が最小の癌治療法を提供することにある。
【００３８】 本発明のさらに別の目的は、癌の成長を治療または抑制するための細胞傷害薬
に結合した、ＨＧＦまたはＨＧＦペプチドフラグメントなどのクリングルドメイ
ン含有タンパク質およびペプチドを含む組成物を提供することにある。
【００３９】 本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および利点は、以下の開示した実施形
態の詳細な説明および添付の特許請求の範囲の検討によって明らかとなる。
【００４０】 ［発明の詳細な説明］ 本明細書中に含まれる以下の特定の実施形態の詳細な説明の参照によって、本
発明をより容易に理解することができる。本発明を、そのある実施形態の具体的
な詳細に関して説明しているが、このような詳述は本発明の範囲を制限するもの
としてみなされることを意図しない。本明細書中で言及する引例の全ての記載が
本明細書中で全体の参照により援用される。
【００４１】 出願人は、タンパク質分子クラスについて新規の性質を発見した。これらのタ
ンパク質分子は、典型的にクリングルドメインおよび／またはプロテアーゼドメ
インを含み、増殖している内皮細胞に添加した場合に驚くべき血管形成機能制御
能力を有するという点で特徴づけられる。組織プラスミノゲンアクチベーター、
アポリポタンパク質（ａ）、プロトロンビン、およびウロキナーゼと共に「肝細
胞成長因子」（ＨＧＦ）およびマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）は、こ
のようなタンパク質の例である。ＨＧＦおよびＭＳＰはプラスミノゲン関連クリ
ングルドメインファミリーに属し、本明細書中で使用されるように、用語ＨＧＦ
にはＨＧＦアナログ、ホモログ、ＨＧＦクリングルドメインフラグメント、およ
びその活性ペプチドが含まれ、用語ＭＳＰにはＭＳＰアナログ、ホモログ、およ
びその活性ペプチドが含まれると理解すべきである。
【００４２】 用語「肝細胞成長因子」（ＨＧＦ）は、一般に、アミノ酸組成で同定したとき
約８７キロダルトンのサイズのタンパク質、より詳細には約４３キロダルトンの
タンパク質、より好ましくは約３１キロダルトンのタンパク質をいう。ＨＧＦは
、プラスミノゲンと構造（図１）および配列相同性（図２）を共有する。図３に
示すように、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列を配列番号１に示す。用語ＨＧＦには、
プレプロペプチドおよびプロペプチドの前駆体形態、ならびに内皮細胞の増殖を
阻害することができる、実質的に類似のアミノ酸配列を有する改変タンパク質お
よびペプチドも含まれる。例えば、あるアミノ酸の構造的または化学的に類似の
アミノ酸との置換によるタンパク質の構造、高次構造、または活性が実質的に変
化しないアミノ酸のサイレント置換は当該分野で周知である。このようなサイレ
ント置換、付加、および欠失は、添付の特許請求の範囲内であることが意図され
る。
【００４３】 用語「マクロファージ刺激タンパク質」（ＭＳＰ）は、一般に、アミノ酸組成
によって同定したとき約７８キロダルトンのサイズで、プラスミノゲンと構造お
よび配列相同性を共有するタンパク質をいう。図５に示すように、ヒトＨＧＦの
アミノ酸配列を配列番号４で示す。用語ＭＳＰには、プレプロペプチドおよびプ
ロペプチドの前駆体形態、ならびに内皮細胞の増殖を阻害することができる、実
質的に類似のアミノ酸配列を有する改変タンパク質およびペプチドも含まれる。
例えば、あるアミノ酸の構造的または化学的に類似のアミノ酸との置換によりタ
ンパク質の構造、高次構造、または活性が実質的に変化しないアミノ酸のサイレ
ント置換は当該分野で周知である。このようなサイレント置換、付加、および欠
失は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【００４４】 用語「ＨＧＦ」および「ＭＳＰ」にはタンパク質の片方もしくは両方の末端か
ら、またはタンパク質の内部領域から１つもしくは複数のアミノ酸が除去され血
管形成制御活性を保持している短縮タンパク質またはペプチドが含まれることが
認識される。ＨＧＦおよびＭＳＰには、タンパク質の片方もしくは両方の末端に
、またはタンパク質の内部位置に１つもしくは複数のアミノ酸が付加され、血管
形成制御活性を保持している延長タンパク質またはペプチドも含まれる。例えば
、第１位にチロシンが付加されたこのような分子は、アッセイ用の125Ｉでの放
射性ヨウ化などの標識に有用である。他の放射性同位元素での標識は、ＭＳＰレ
セプターのＨＧＦを含む標的細胞の単離および同定用の分子ツールを提供する上
で有用であり得る。リシンなどの分子を用いる他の標識により、ＨＧＦまたはＭ
ＳＰレセプターを用いた細胞破壊の機構を得ることができる。本発明はまた、Ｈ
ＧＦの活性ペプチドを単独か他のペプチドおよびタンパク質と組み合わせて、活
性ＨＧＦまたはＭＳＰペプチドを含むキメラタンパク質を形成することができる
ことを意図する。特に目的とする活性ＨＧＦフラグメントには、配列番号２に記
載のＨＧＦのクリングル１〜３（２６９個のアミノ酸、３１キロダルトン）およ
び配列番号３に記載のＨＧＦのクリングル１〜４（３６８個のアミノ酸、４３キ
ロダルトン）が含まれる。配列番号２および３を、Pichia産生クローンから得た
。
【００４５】 「実質的な配列相同性」は、クリングルドメイン含有タンパク質アナログ、ホ
モログ、または誘導体の配列中のアミノ酸残基配列とクリングルドメイン含有タ
ンパク質の配列が少なくとも約７０％相同、好ましくは少なくとも約８０％相同
、より好ましくは少なくとも約９０％相同であることを意味する。
【００４６】 ＨＧＦなどのクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドを、ヒトを含
む種々の種由来の正常、過形成性、原発性および転移性組織から単離することが
できる。ＨＧＦおよびＭＳＰを、精液、血清、尿、および腹水が含まれるが、こ
れらに限定されない体液から単離するか、化学的または生物学的方法（例えば、
ペプチド合成および活性ＨＧＦを得るための前駆体分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素
触媒）によって合成することもできる。クリングルドメイン含有タンパク質およ
びペプチドを、組換え供給源、動物に移植した遺伝子組換え細胞、腫瘍、および
細胞培養物ならびに他の供給源から作製することができる。組換え技術には、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したＤＮＡ供給源からの遺伝子増幅、およ
び逆転写酵素／ＰＣＲを使用したＲＮＡ供給源からの遺伝子増幅が含まれる。
【００４７】 以下の理論に拘束されることを望むものではないが、ＨＦＧまたはＭＳＰなど
のクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドファミリー中の糖タンパク
質フラグメントは、特異的、最も有望には可逆的な内皮細胞増殖の抑制によって
血管形成活性を制御する。本発明のインヒビタータンパク質分子は、避妊薬とし
て、また、血管形成関連疾患、特に血管形成依存性癌および腫瘍の治療に有用で
ある。タンパク質分子はまた、血管形成依存性癌および腫瘍の治癒に有用である
。これらの新規の化合物の血管形成依存性癌および腫瘍の予期せぬ驚くべき治療
および治癒能力は、医学分野で長い間感じられてきた満たされぬ必要性に答える
ものであり、人類に重要な利点を提供する。
【００４８】 本明細書中で使用されている重要な用語を以下のとおり定義する。「癌」は、
血管形成依存性癌および腫瘍、すなわち、その成長（体積および／または質量の
拡大）には血液を供給するための血管数および密度を増加させる必要がある腫瘍
を意味する。「抑制」は、腫瘍質量およびサイズの減少をいう。
【００４９】 本明細書中で使用されるように、用語「血管形成」、および「血管形成性」な
どの関連用語は、内皮細胞増殖、内皮細胞移動、および毛細血管形成が含まれる
が、これらに限定されない血管成長および発達に関連する活性をいう。
【００５０】 本明細書中で使用される、用語「抗血管形成薬」は、内皮細胞増殖、内皮細胞
移動、および毛細管形成の阻害が含まれるが、これらに限定されない血管形成を
阻害することができる組成物等をいう。
【００５１】 血管形成過程は複雑であり、ＦＧＦ−２および／またはＶＥＧＦ刺激内皮細胞
増殖および移動などｉｎ ｖｉｔｒｏで個別に研究することができる多数の組織
化された工程を含む。例えば、アンギオスタチンタンパク質およびエンドスタチ
ンタンパク質は、これらの過程を阻害する（米国特許第５，６３９，７２５号お
よび同第５，８５４，２０５号を参照のこと）。本件発明者らは、驚いたことに
、クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドファミリーに属するタンパ
ク質の抗血管形成性を、内皮細胞増殖、移動、および浸潤に対するこれらのタン
パク質、例えばＨＧＦ、の効果の証明および体系的評価によって発見した。
【００５２】 ＨＧＦを「主に細胞移動、増殖、プロテアーゼ生成、浸潤、毛細管様血管への
組織化を誘導する、内皮細胞に対して作用する強力な血管形成分子」と特徴づけ
た先行技術の教示(Rosen et al., Adv. Cancer Res., 1995; 67: 257-79)とは対
照的に、本件発明者らは、新規のＨＧＦフラグメントの抗血管形成分子としての
反対の効果を示す。本明細書中に記載の新規のＨＧＦフラグメントの発見まで、
ＨＧＦは血管形成の誘導のみに関連すると考えられていた「ＨＧＦ／ＳＦは、内
皮細胞増殖および移動を刺激して、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管形成を誘導すること
が示されている。ＨＧＦ／ＳＦはまた、血管平滑筋細胞中の血管内皮細胞成長因
子（ＶＥＧＦ）の発現の上方制御によって新規の血管形成を増強することができ
得る。」(To et al., 1998)。よって実際に、先行技術の教示は、任意の血管形
成活性を示すＨＧＦ関連タンパク質またはＨＧＦフラグメントの研究から離れて
いる。
【００５３】 血管形成活性に対する本発明の新規のＨＧＦフラグメントの効果は、ヒト臍帯
静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で示される。精製ヒトＨＧＦフラグメントは、ＨＵ
ＶＥＣ細胞のＦＧＦ−２刺激増殖に対する強力且つ用量関連阻害活性を示す。Ｈ
ＧＦフラグメントが種々の内皮細胞を阻害するか、または単純にＨＵＶＥＣに対
する特異性を示すかどうかを同定するために、ＨＧＦの、ウシ副腎皮質内皮細胞
（ＢＣＥ）およびヒト微小血管真皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄ）増殖の阻害能力も示
された。ＦＧＦ−２刺激内皮細胞増殖に対するＨＧＦの効果もまた示された。
【００５４】 ＨＧＦフラグメントが一般的な細胞増殖の抑制と対照的に抗血管形成効果を発
揮することを示すために、本発明者らは癌細胞増殖に対する直接的刺激または阻
害効果を示す実験を示す。
【００５５】 本発明者らは、このようなフラグメントの抗血管形成効果をさらに確認するた
めに、内皮細胞移動に対するＨＧＦフラグメントの効果を示す。ＦＧＦ−２また
はＶＥＧＦに反応する内皮細胞移動に対するＨＧＦフラグメントのｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ効果を評価するために、ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層を掻きとって単
層の一部を取り出し、精製ヒトＨＧＦフラグメントの存在下または非存在下でＦ
ＧＦ−２またはＶＥＧＦと培養する。
【００５６】 本発明者らは、さらに、内皮細胞浸潤に対する効果の証明によってＨＧＦフラ
グメントの抗血管形成性を示す。これらの実験は、阻害は用量依存性であり、内
皮細胞が生存可能のようであり、且つ細胞によって接合部が作成されないため、
毒性の結果ではないことを示す。これらの所見は、内皮細胞浸潤に対するＨＧＦ
フラグメントの阻害効果をさらに支持し、ＨＧＦフラグメントの抗血管形成活性
がさらに確認される。
【００５７】 本発明のＨＧＦフラグメントが、アンギオスタチンタンパク質など他のクリン
グルドメイン含有タンパク質と同様に機能するかどうかを同定するために、さら
なる研究を行う。例えば、本発明者らは、アンギオスタチンタンパク質がＨＧＦ
レセプターｃ−ｍｅｔに結合し、ＨＧＦ結合と競合するアンタゴニストとして作
用して腫瘍形成を阻害するかどうかを同定するために実験を行う。本発明者らは
、ｃ−ｍｅｔレセプターを発現する腫瘍細胞株を使用して、アンギオスタチンタ
ンパク質がＨＧＦの下流の効果（細胞移動、増殖、形態、サイトカイン産生レベ
ル、リン酸化など）を妨害するかどうかを同定する。
【００５８】 ＨＧＦフラグメントについて対応する上記の実験を、ＭＳＰについても行う。
【００５９】 上記実験を行うプロトコールおよび方法は当業者に周知であり、以下の実施例
および米国特許出願第０９／３１６，８０２号に詳述している。
【００６０】 以下の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のＨＧＦフラグメ
ントの抗血管形成性はタンパク質のクリングル活性に関連すると考えられる。よ
り詳細には、抗血管形成活性は、クリングル１〜３（配列番号２）またはクリン
グル１〜４（配列番号３）中に位置する可能性が高いと考えられる。ＭＳＰおよ
びそのフラグメントの抗血管形成性は、タンパク質のクリングル活性に関連し、
このような抗血管形成活性は、ＭＳＰのクリングル１〜３またはクリングル１〜
４中に位置するとも考えられる。
【００６１】 上記の実験の実行により、驚いたことに、本件発明者らは、ある種の新規のＨ
ＧＦフラグメントが、種々の培養内皮細胞に対して強力な抗増殖および抗移動活
性を示す血管形成の内皮細胞特異的インヒビターであることを初めて示す。さら
に、これらの新規のＨＧＦフラグメントは、マトリゲルにおける毛細血管形成の
内皮細胞特異的血管形成過程を阻害する。
【００６２】 本発明者らの新規の所見に基づいて、本発明は、抗血管形成過程の制御のため
に、クリングルドメイン含有タンパク質ファミリーに属するタンパク質を投与す
ることを含む方法および組成物に関する。より詳細には、本発明の方法および組
成物は、血管形成の阻害および関連する癌または腫瘍成長の減少のための新規の
ＨＧＦまたはＭＳＰフラグメントの投与を含む。
【００６３】 本発明の新規の抗血管形成ＨＧＦまたはＭＳＰフラグメントを、当業者に周知
の自動タンパク質合成法によって作製することができる。あるいは、ＨＧＦまた
はＭＳＰおよびそのペプチドフラグメントを、共通または類似のアミノ酸配列を
共有するより大きな公知のプレプロペプチドから単離することができる。
【００６４】 手動および自動タンパク質合成を含むこれらおよび他の供給源由来のタンパク
質およびペプチドを、ヒト臍帯静脈内皮細胞増殖アッセイ（ＨＵＶＥＣ）および
ウシ毛細管内皮細胞増殖アッセイ（ＢＣＥ）などの生物学的アッセイを使用して
抗血管形成活性について迅速且つ容易に試験することができる。このようなアッ
セイは、本明細書中で参照により援用される米国特許第５，６３９，７２５号に
記載されている。他の活性阻害バイオアッセイには、ニワトリＣＡＭアッセイ、
マウス角膜アッセイ、および移植腫瘍に対する単離または合成タンパク質投与の
効果が含まれる。ニワトリＣＡＭアッセイは、O’Reilly et al.,により「転移
性成長の血管形成制御（Angiogenic Regulation of Metastatic Growth）」(Cel
l vol. 79 (2), October 21, 1994, pp. 315-328)、に記載され、その全体が本
明細書中で参照により援用されている。出願人の発明はまた、抗血管形成クリン
グルドメイン含有タンパク質およびペプチドに対応しおよびコードする核酸配列
、およびこのようなタンパク質分子に特異的に結合するモノクローナルおよびポ
リクローナル抗体を含む。生物活性タンパク質分子、このタンパク質に対応する
核酸配列、および本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、ｉｎ ｖｉｖ
ｏでの血管形成過程の調整、および例えば遺伝子治療による内皮細胞関連疾患の
診断および治療に有用である。
【００６５】 ＨＧＦフラグメントおよびＨＧＦフラグメントアナログなどのクリングルドメ
イン含有タンパク質およびペプチドに対応するかコードする核酸配列を、アミノ
酸配列の知識ならびにコドン（３つの核酸塩基の配列）およびアミノ酸の間の当
該分野で認識された対応に基づいて調製することができる。コドン中の第３の塩
基が同一のアミノ酸のさらなるコードを変化し得る遺伝コードの縮重により、多
数の異なる可能なコード核酸配列が任意の特定のタンパク質またはペプチドフラ
グメントについて誘導可能である。
【００６６】 当該分野で周知の自動システムを使用して核酸配列を合成する。全配列を合成
するか、一連の小さなオリゴヌクレオチドを作製後ライゲーションして全長配列
を得ることができる。あるいは、核酸配列は、Ｎ末端アミノ酸配列および周知の
遺伝子材料のクローニング技術に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用したジーンバンクに由来し得る。
【００６７】 本発明はまた、ＨＧＦまたはＭＳＰフラグメントなどのクリングルドメイン含
有タンパク質およびペプチドをコードする遺伝子を患者中で制御する遺伝子治療
を含む。遺伝子産物タンパク質発現用の細胞へのＤＮＡの種々の導入もしくは輸
送法、または遺伝子治療という方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物体細胞への
遺伝子導入(Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo）（N. Yang
, Crit. Rev. Biotechn. 12 (4): 335-356 (1992）に開示されている。遺伝子治
療は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ治療において用いる体細胞もしくは
生殖系列細胞へのＤＮＡ配列の組み込みを含む。遺伝子治療は、遺伝子を置換し
、正常または異常な遺伝子機能を増強し、感染症および他の病態に対処するよう
に機能する。
【００６８】 遺伝子治療を使用したこれらの医学的問題の治療ストラテジーには、欠陥遺伝
子の同定、および当該欠陥遺伝子の機能の置換もしくはわずかに機能的な遺伝子
の増強のための機能的遺伝子の付加などの治療ストラテジーまたは、病態を治療
するか、治療計画に対してより感受性の高い組織もしくは器官を作製する産物タ
ンパク質の遺伝子の付加などの予防ストラテジーが含まれる。予防ストラテジー
の例を以下に示す：所望のＨＧＦフラグメントの遺伝子などの遺伝子を患者に移
植して血管形成が生じるのを予防すること、または腫瘍細胞の照射に対する感受
性をより高める遺伝子を挿入後に腫瘍に照射して腫瘍細胞の死滅を増加させるこ
と。
【００６９】 クリングルドメイン含有タンパク質ＤＮＡまたは対応する調節配列の多数の導
入プロトコールを本発明で想定している。このようなタンパク質に特異的に会合
する通常見出される配列以外のプロモーター配列またはこれらのタンパク質の産
生を増加させる他の配列のトランスフェクションもまた、遺伝子療法として想定
している。細胞中のエリスロポイエチン遺伝子をオンにする「遺伝子スイッチ」
を挿入するための相同組換えを使用するこのような技術の例は、Transkaryotic
Therapies,Inc., of Cambridge、Massachusettsに見られる。Genetic Engineerin
g News, April 15, 1994を参照のこと。このような「遺伝子スイッチ」を使用し
て、ＨＧＦ（またはＨＧＦレセプター）を通常は発現しない細胞中でＨＧＦ（ま
たはＨＧＦレセプター）を活性化することができる。
【００７０】 遺伝子治療用の遺伝子導入法は、以下の３つの広範なカテゴリーに分類される
：物理学的、すなわち、エレクトロポレーション、直接的遺伝子導入、および微
粒子銃、化学的（脂質ベースのキャリアまたは他の非ウイルスベクター）、なら
びに生物学的（ウイルス由来のベクターおよびレセプター取り込み）。例えば、
ＤＮＡで被覆したリポソームを含む非ウイルスベクターを使用することができる
。このようなリポソーム／ＤＮＡ複合体を、患者に直接静脈内注射することがで
きる。リポソーム／ＤＮＡ複合体が肝臓中に濃縮されてＤＮＡをマクロファージ
およびクッパー細胞に送達すると考えられる。これらの細胞は長寿なので、送達
したＤＮＡが長期間発現する。さらに、遺伝子のベクターまたは「裸の」ＤＮＡ
を、治療ＤＮＡの標的送達のために所望の器官、組織、もしくは腫瘍に直接注射
することができる。
【００７１】 遺伝子治療法を送達部位によって説明することもできる。基本的遺伝子送達法
には、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入、およびｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ遺伝子導入が含まれる。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入では、患者から細胞
を採取し、細胞培養で増殖させる。ＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、トラン
スフェクト細胞数を増大して、患者に再移植する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入
では、形質転換細胞は組織培養細胞など培養によって増殖させた細胞であり、特
定の患者由来の特定の細胞ではない。これらの「研究用細胞」をトランスフェク
トし、トランスフェクト細胞を選択し、患者への移植または他の用途のために拡
大する。
【００７２】 ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入は、患者中に細胞が存在する場合に患者の細胞にＤ
ＮＡを移入することを包含する。この方法には非感染性ウイルスを使用して患者
に遺伝子を導入するか患者のある部位に裸のＤＮＡを注射するウイルス媒介遺伝
子導入の使用が含まれ、遺伝子産物タンパク質が発現した細胞の割合によってＤ
ＮＡが取り込まれる。さらに、ＨＧＦクリングルドメインまたはＨＧＦ調節配列
をコードするＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ挿入のために本明細書中に記載の「遺伝
子銃」の使用など他の方法を使用することができる。
【００７３】 化学的遺伝子治療法は、細胞膜を通過してＤＮＡを輸送するための、必ずしも
リポソームではない脂質ベースの化合物を含み得る。負荷電のＤＮＡに結合する
脂質ベースの陽イオンであるリポフェクチンまたはサイトフェクチンは、細胞膜
を通過して細胞内にＤＮＡを提供することができる複合体を作製することができ
る。別の化学的方法は、細胞表面レセプターへの特異的リガンドの結合およびそ
の被覆および細胞膜を通過する輸送を含むレセプターベースのエンドサイトーシ
スを使用する。リガンドはＤＮＡに結合し、全複合体は細胞に輸送される。リガ
ンド遺伝子複合体を血流に注射し、レセプターを有する標的細胞がリガンドに特
異的に結合し、リガンド−ＤＮＡ複合体を細胞に輸送する。
【００７４】 多数の遺伝子治療法は、遺伝子を細胞に挿入するためにウイルスベクターを使
用する。例えば、改変したレトロウイルスベクターがｅｘ ｖｉｖｏ法で、遺伝
子を周辺の腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、または他の体細胞に
導入するのに使用されている。次いで、これらの改変細胞は患者に挿入ＤＮＡ由
来の遺伝子産物を得るために移入される。
【００７５】 ｉｎ ｖｉｖｏプロトコールを用いて細胞に遺伝子を挿入するために、ウイル
スベクターも使用されてきた。外来遺伝子の組織特異的発現を指向するために、
組織特異的であることが公知のシス作用調節エレメントまたはプロモーターを使
用することができる。あるいは、ＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ送達またはｉｎ ｖｉ
ｖｏでの特定の解剖学的部位に対するウイルスベクターを使用してこれを行うこ
とができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管への遺伝子導入は、動脈壁上の選
択された部位へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入内皮細胞の移植によって行われ
た。同様に遺伝子産物を発現する周囲の細胞にウイルスを感染させた。例えばカ
テーテルによってｉｎ ｖｉｖｏ部位に直接ウイルスベクターを送達させること
ができるので、一定の領域のみにウイルスを感染させて長期の部位特異的遺伝子
発現を得ることができる。改変ウイルスの、器官に通じる血管への注射によって
、乳房組織および肝組織でレトロウイルスベクターを使用したｉｎ ｖｉｖｏ遺
伝子導入も行われている。
【００７６】 遺伝子治療プロトコールで使用したウイルスベクターには、レトロウイルス、
ポリオウイルスまたはシンドビスウイルスなど他のＲＮＡウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア、および
他のＤＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されない。複製欠失マウスレト
ロウイルスベクターは、最も広範に利用されている遺伝子導入ベクターである。
マウス白血病レトロウイルスは、タンパク質コア（ｇａｇ）によって包まれ、宿
主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）に包囲された核コアタン
パク質およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素と複合化した一本鎖ＲＮＡから構成さ
れている。レトロウイルスのゲノム構造には、５’および３’長末端反復（ＬＴ
Ｒ）付近で包囲されたｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子が含まれる。レトロ
ウイルスベクター系は、５’および３’ＬＴＲおよび封入シグナルを含む最小ベ
クターが、封入細胞株においてウイルス構造タンパク質がｉｎ ｔｒａｎｓで供
給される場合にベクター封入、感染、および標的細胞への組み込みに十分である
という事実を利用している。遺伝子導入用のレトロウイルスベクターの基本的な
利点には、ほとんどの細胞型における有効な感染および遺伝子発現、標的細胞染
色体ＤＮＡへの正確な１つのコピーベクター組み込み、およびレトロウイルスゲ
ノム操作の容易さが含まれる。
【００７７】 アデノウイルスは、コアタンパク質と複合化し、キャプシドタンパク質で包囲
された線状の二本鎖ＤＮＡから構成されている。分子ウイルス学における進歩に
より、これらの生物の、ｉｎ ｖｉｖｏでの標的細胞に新規の遺伝子配列を形質
導入することができるベクターを作製する生物学的性質を利用する能力がもたら
された。アデノウイルスベースのベクターは、高レベルで遺伝子産物ペプチドを
発現する。アデノウイルスベクターは、ウイルスが低力価でさえも高い感染効率
を有する。さらに、ウイルスは、無細胞ビリオンとして十分に感染性を示すので
、産生細胞株の注入は必要ない。アデノウイルスベクターの別の潜在的な利点は
、ｉｎ ｖｉｖｏで異種遺伝子の長期発現を行う能力である。
【００７８】 機械的ＤＮＡ導入法には、リポソームまたは膜融合用の他の小胞などの融合誘
導脂質小胞、リポフェクチンなどのＤＮＡ組み込みカチオニックリピドの脂質粒
子、ポリリジン媒介性ＤＮＡ導入、生殖細胞または体細胞へのＤＮＡの微量注入
などのＤＮＡの直接注入、「遺伝子銃」で使用する金粒子などの空気的送達ＤＮ
Ａ被覆粒子、およびリン酸カルシウムトランスフェクションなどの無機化学的ア
プローチが含まれる。別法であるリガンド媒介遺伝子治療は、ＤＮＡと特定のリ
ガンドを複合化して、ＤＮＡを特定の細胞または組織に指向するためのリガンド
−ＤＮＡ抱合体を形成することを包含する。
【００７９】 筋細胞へのプラスミドＤＮＡの注射により、トランスフェクトされて、マーカ
ー遺伝子を継続して発現する細胞が高率で得られることが見出された。プラスミ
ドのＤＮＡは、細胞ゲノムに組み込まれても組み込まれなくても良い。トランス
フェクトＤＮＡの非組込みにより、細胞またはミトコンドリアゲノムの変異挿入
、欠失、もしくは改変を心配することなく長期間にわたって、最終的に分化した
非増殖性細胞中で遺伝子産物タンパク質がトランスフェクトおよび発現される。
長期間であるが永久である必要はない治療遺伝子の特定の細胞への導入により、
遺伝病または予防目的の治療が得られ得る。ＤＮＡを定期的に再注射して、レシ
ピエント細胞のゲノムを変異させずに遺伝子産物レベルを維持することができる
。外因性ＤＮＡの非組込みにより、１つの細胞中にいくつかの異なる外因性ＤＮ
Ａ構築物を、その全てが種々の遺伝子産物を発現する状態で存在させることがで
きる。
【００８０】 粒子媒介遺伝子導入法は、植物組織の形質転換に最初に使用された。微粒子銃
デバイスまたは、「遺伝子銃」を使用して、標的器官、組織、もしくは細胞を貫
通させるほど高速にＤＮＡ被覆高密度粒子（金またはタングステンなど）を加速
させる推進力を発生させる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、またはｅｘ ｖｉｖ
ｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ技術と共に微粒子銃を使用して、ＤＮＡを細胞、組織
、または器官に移入することができる。
【００８１】 遺伝子導入用のエレクトロポレーションは、細胞または組織をエレクトロポレ
ーション媒介遺伝子導入に感受性とするために電流を使用する。所与の電界強度
の短い電気刺激を使用して、ＤＮＡ分子が細胞に浸透することができる方法で膜
の浸透性を増加させる。この技術をｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、またはｅｘ
ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ技術と共に使用して、細胞、組織、もしくは器
官にＤＮＡを移入することができる。
【００８２】 ｉｎ ｖｉｖｏでのキャリア媒介遺伝子導入を使用して、細胞に外来遺伝子を
トランスフェクトすることができる。キャリア−ＤＮＡ複合体を体液または血流
に都合よく導入して、体内の標的器官または組織に部位特異的に指向させること
ができる。ポリリジン、リポフェクチン、またはサイトフェクチンなどリポソー
ムおよびポリカチオンを共に使用することができる。細胞特異的または器官特異
的リポソームを開発して、リポソームによって輸送された外来ＤＮＡを標的細胞
が取り込むことができる。レセプターを保有する細胞へのＤＮＡの便利な挿入法
として、一定の細胞上の特定のレセプターに標的された免疫リポソームの注入を
使用することができる。使用した別のキャリア系は、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入
用の肝細胞へのＤＮＡの輸送用のアシアログリコプロテイン／ポリリジン抱合体
系である。
【００８３】 ＤＮＡがレシピエント細胞に輸送されて細胞質または核質中に存在するように
、トランスフェクトＤＮＡを他の種のキャリアと複合化することもできる。ＤＮ
Ａを、特異的に操作した小胞複合体中のキャリア核タンパク質に結合して、核に
直接輸送することができる。
【００８４】 例えば、ＨＧＦ遺伝子、もしくはＨＧＦ遺伝子に関連している調節領域、また
は転写もしくは翻訳速度を改変するための対応するＲＮＡ転写物に結合する化合
物の投与によって、ＨＧＦクリングルフラグメントなどのクリングルドメイン含
有タンパク質およびペプチドの遺伝子調節を行うことができる。さらに、ＨＧＦ
をコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトした細胞を患者に投与して、ＨＧＦ
フラグメントのｉｎ ｖｉｖｏ供給源を得ることができる。例えば、ＨＧＦをコ
ードする核酸配列を含むベクターで細胞をトランスフェクトすることができる。
本明細書中で使用されるように、用語「ベクター」は、細胞に特定の核酸配列を
輸送するように機能する特定の核酸配列を含むか関連しうるキャリアを意味する
。ベクターの例には、プラスミドおよびウイルスなど感染性微生物、リガンド−
ＤＮＡ抱合体などの非ウイルスベクター、リポソーム、脂質−ＤＮＡ複合体が含
まれる。ＨＧＦ ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子が、発現調節配列に作動可
能的にに連結して、ＨＧＦを発現することができる発現ベクターを形成すること
が望ましい。トランスフェクト細胞は、患者の正常な組織、患者の罹患組織由来
の細胞であり得るか、非患者細胞であり得る。
【００８５】 例えば、患者から取り出した腫瘍細胞を、本発明のＨＧＦタンパク質を発現す
ることができるベクターでトランスフェクトして、患者に再導入することができ
る。トランスフェクト腫瘍細胞は、患者において腫瘍成長を阻害するＨＧＦレベ
ルを産生する。患者は、ヒトであっても非ヒト動物であってもよい。細胞を、非
ベクター、すなわち、当該分野で公知のエレクトロポレーション、イオノポレー
ション、または「遺伝子銃」によるなど物理的もしくは化学的方法によってトラ
ンスフェクトすることもできる。さらに、ＨＧＦ ＤＮＡをキャリアの援助なし
に患者に直接注射することができる。特に、ＨＧＦ ＤＮＡを、皮膚、筋肉、ま
たは血液に注射することができる。
【００８６】 ＨＧＦなどのクリングルドメイン含有タンパク質の患者へのトランスフェクシ
ョン用の遺伝子治療プロトコールは、細胞の細胞質または核質中での細胞のゲノ
ム、ミニ染色体への、または個別の複製もしくは非複製ＤＮＡ構築物としてのＨ
ＧＦ ＤＮＡの組み込みであり得る。ＨＧＦ発現を長期間継続するか、定期的に
再注射して細胞、組織、もしくは器官中の所望のＨＧＦタンパク質レベルまたは
同定された血液レベルを維持することができる。
【００８７】 本発明は、ＨＧＦフラグメントなどのクリングルドメイン含有タンパク質およ
びペプチド産生の刺激による、および／または実質的に精製されたＨＧＦフラグ
メントまたはＨＧＦフラグメントアゴニストもしくはアンタゴニストおよび／ま
たはＨＧＦフラグメント抗血清の患者への投与による、関節炎および腫瘍が含ま
れるが、これらに限定されない血管形成疾患および過程の治療または予防法を含
む。さらなる治療法には、ＨＧＦフラグメント、ＨＧＦ抗血清、または細胞傷害
薬に結合したＨＧＦレセプターアゴニストおよびアンタゴニストの投与が含まれ
る。ＨＧＦは動物起源であってもヒト起源であっても良いと理解すべきである。
ＨＧＦを、化学反応または発現系を組み合わせた組換え技術によって合成するこ
ともできる。ＨＧＦおよびそのフラグメントを、ＨＧＦセグメントと配列相同性
または同一性を有するＨＧＦ前駆体を含む異なる分子を酵素切断して抗血管形成
活性を有するペプチドを得ることにより作成することもできる。
【００８８】 本発明は、さらにＭＳＰフラグメントなどのクリングルドメイン含有タンパク
質およびペプチド産生の刺激による、および／または実質的に精製されたＭＳＰ
フラグメントまたはＭＳＰフラグメントアゴニストもしくはアンタゴニストおよ
び／またはＨＧＦフラグメント抗血清の患者への投与による、関節炎および腫瘍
が含まれるが、これらに限定されない血管形成疾患および過程の治療または予防
法を含む。さらなる治療法には、ＨＧＦ、ＭＳＰフラグメント、ＭＳＰ抗血清、
または細胞傷害薬に結合したＭＳＰレセプターアゴニストおよびアンタゴニスト
の投与が含まれる。ＭＳＰは動物起源であってもヒト起源であっても良いと理解
すべきである。ＭＳＰを、化学反応または発現系を組み合わせた組換え技術によ
って合成することもできる。ＭＳＰおよびそのフラグメントを、ＭＳＰセグメン
トと配列相同性または同一性を有するＭＳＰ前駆体を含む異なる分子を酵素切断
して抗血管形成活性を有するペプチドを得ることにより作成することもできる。
【００８９】 ＨＧＦフラグメントなどのクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチド
に特異的に結合する抗体を使用して、再生、発生、ならびに創傷治癒および組織
修復など内皮依存性過程を調整することができる。さらに、例えばＨＧＦ抗体の
Ｆａｂ領域に指向する抗血清を投与して、内因性ＨＧＦ抗血清のＨＧＦフラグメ
ント結合能力を妨害することができる。
【００９０】 ＨＧＦフラグメントおよびＨＧＦフラグメントアナログなどの、抗体特異的ク
リングルドメイン含有タンパク質およびペプチドを、当該分野で周知の技術およ
びプロトコールにしたがって作製する。抗体は、ポリクローナルであってもモノ
クローナルであっても良い。抗体は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫アッセイ、
および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）を含む競合および非競合免疫アッセイなどの
周知の免疫アッセイ形式で、体液中の本発明の内皮増殖インヒビターの有無を同
定するために利用されている。体液の例には、精液、血液、血清、腹水、胸水、
脳脊髄液、子宮液、唾液、および粘液が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】 本発明のタンパク質、核酸配列および抗体は、内皮細胞関連疾患および障害の
診断および治療に有用である。特に重要な内皮細胞過程は、血管形成、血管の形
成、である。血管形成関連疾患は、本発明の内皮細胞増殖阻害タンパク質を使用
して診断および治療することができる。血管形成関連疾患には、血管形成依存性
癌（例えば、固形腫瘍、白血病などの血腫、および腫瘍転移を含む；良性腫瘍、
例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；慢
性関節リウマチ；乾癬；眼の血管形成疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網
膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベ
オーシス；オスラー−ウェバー症候群；心筋血管形成失明；プラーク新血管形成
；毛細血管拡張；血友病性関節；血管線維腫；および創傷肉芽形成が含まれるが
、これらに限定されない。本発明の内皮細胞増殖阻害タンパク質は、内皮細胞の
過剰もしくは異常な刺激による疾患の治療に有用である。これらの疾患には、腸
管癒着症、アテローム性動脈硬化症、硬皮症、および肥厚性瘢痕、すなわちケロ
イドが含まれるが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、ネコ引っ掻
き病(Rochele minalia quintosa)、および潰瘍(Helicobacter pylorii)など病気
の結果としての血管形成を有する疾患の治療にも有用である。
【００９２】 本発明の血管形成制御タンパク質を、胚の着床に必要な子宮血管新生の減少ま
たは防止による避妊薬として使用することができる。したがって、本発明は、胚
の着床を予防するのに十分な量の、たとえば阻害性ＨＧＦフラグメントを含むク
リングルドメイン含有タンパク質組成物を雌に投与する有効な避妊法を提供する
。避妊法の１つの態様では、性交および受精がおこる前後に胚の着床の妨害に十
分な量の阻害タンパク質を投与して、有効な避妊法あるいは「モーニングアフタ
ー(morning after)」法を得る。この記載に拘束されることを望むものではない
が、子宮内膜の血管新生阻害により、胚盤胞の着床が阻害されると考えられる。
卵管粘膜の類似の血管新生阻害により胚盤胞の着床が阻害されて卵管妊娠の発生
を予防する。投与法には、丸薬、注射（静脈内、皮下、筋肉内）、坐剤、膣用海
綿、膣用タンポン、および子宮内デバイスが含まれ得るが、これらに限定されな
い。本発明の抗血管形成組成物の投与は、胎盤の血管新生の正常な促進および首
尾よく着床された胚盤胞内血管の発達ならびに胚および胎児の発達も阻害すると
も考えられる。
【００９３】 それに対して、レセプターアンタゴニストとして作用する対応アナログでのク
リングルドメイン含有タンパク質レセプターの妨害により、内皮化および血管新
生などの血管形成活性を促進することができる。このような効果は、子宮内膜の
不適切な血管新生および関連する不妊、創傷修復、切断および切開の治癒、糖尿
病における血管（特に、網膜および周囲の血管）の不具合の治療、筋肉および皮
膚を含む移植組織の血管新生の促進、特に心臓または心臓組織の移植後およびバ
イアス手術後の心筋血管新生の促進、細胞毒素送達の促進用の固形および比較的
無血管の腫瘍の血管新生の促進、大脳皮質および脊髄が含まれるが、これらに限
定されない神経系への血流の増大の状況で望ましい。
【００９４】 本発明はまた、ＨＧＦなどのクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチ
ドの血管形成ペプチドフラグメント、ＨＧＦフラグメントに対応する核酸配列、
およびＨＧＦフラグメントおよび関連ペプチドに特異的に結合する抗体の使用法
、内皮細胞関連疾患および障害の診断法に関する。
【００９５】 本発明は、さらに、クリングルドメイン含有タンパク質特異的レセプターの同
定法ならびにそれによって同定および単離されたレセプター分子を含む。本発明
はまた、このようなレセプターの定量法を提供する。
【００９６】 本発明の特に重要な態様は、腫瘍成長の阻害および腫瘍質量の顕微鏡サイズま
での継続的抑制に十分な量のＨＧＦフラグメントの、単独または１つもしくは複
数のエンドスタチンタンパク質、アンギオスタチンタンパク質、メタスタチンタ
ンパク質(Entremed, Inc., Rockville, MD)などの抗血管形成薬との組み合わせ
での投与である。したがって、本発明はまた、血管形成依存性癌および腫瘍の治
療または治癒に有効な処方物を含む。
【００９７】 より詳細には、例えば、昆虫細胞またはＥ．ｃｏｌｉ由来の組換えＨＧＦフラ
グメントは、血管形成および転移物の成長を強力に阻害することができる。ＨＧ
Ｆフラグメントを患者の精液、血液、尿などの体液から単離することができるか
、ＨＧＦフラグメントを当業者に周知の組換えＤＮＡ法または化学的ペプチド合
成法によって作製することができることが本発明の一部として意図される。タン
パク質精製法は、当該分野で周知である。
【００９８】 組換えＤＮＡ技術を使用したＨＧＦフラグメントなどの所望のクリングルドメ
イン含有タンパク質の作製法の一例は、（１）上記で考察され、以下により完全
に記載するようにＨＧＦフラグメントを同定する工程と、（２）前記タンパク質
配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを合成する工程と、（３）ヒ
ト肝臓ｃＤＮＡ由来のＰＣＲを行う工程と、（４）遺伝子を発現ベクターなどの
適切なベクターに挿入する工程と、（５）遺伝子含有ベクターを、阻害遺伝子を
発現することができる微生物または他の発現系に挿入する工程と、（６）組換え
により作製したインヒビターを単離する工程とが必要である。上記の技術は、「
分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A laboratory Manual)
」（最新版、Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989）などの実験
マニュアルにより完全に記載されている。
【００９９】 ＨＧＦフラグメントなどの本発明の所望のタンパク質のさらに別の作製法は、
ペプチド合成である。例えば、一旦ＨＧＦの生物活性フラグメントが見出される
と、これを、例えば自動ペプチド配列決定法によって配列決定することができる
。あるいは、例えば上記の方法によって一旦ＨＧＦフラグメントをコードする遺
伝子またはＤＮＡ配列が単離されると、ＤＮＡ配列を同定してアミノ酸配列に関
する情報を得ることができる。したがって、生物活性フラグメントをトリプシン
消化など特定の方法で作製する場合、またはフラグメントがＮ末端配列決定され
ている場合、残りのアミノ酸配列を、対応するＤＮＡ配列から決定することがで
きる。
【０１００】 一旦ペプチドのアミノ酸配列、例えば、２０個のＮ末端アミノ酸が判明すると
、フラグメントを、当該分野で周知の技術（例えば、「固相ペプチド合成：実践
アプローチ（Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach）」(E. A
therton and R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford England)）で合成することが
できる。同様に、互いに連続的に結合してより大きなフラグメントを形成する複
数のフラグメントを合成することができる。特定の位置におけるアミノ酸置換に
よりこれらの合成ペプチドフラグメントを作製して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉ
ｎ ｖｉｖｏでの作動活性および拮抗活性を試験することもできる。
【０１０１】 ＨＧＦなどのクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドの合成ペプチ
ドフラグメントは種々の用途がある。高い特異性および結合活性でＨＧＦレセプ
ターに結合するペプチドは放射性標識され、オートラジオグラフィーおよび膜結
合技術を使用した結合部位の視覚化および定量に使用する。ＨＧＦレセプターの
結合特性の知識により、レセプターに関連したシグナル変換機構の調査が容易に
なる。
【０１０２】 インタクトなＨＧＦ分子の異なるペプチドフラグメントを、以下のいくつかの
適用、すなわちＨＧＦ結合部位で活性なアゴニストおよびアンタゴニスト、ＨＧ
Ｆに結合する細胞の標的死滅用の細胞障害剤に結合したペプチドとしての特定の
抗血清開発用の抗原が含まれるが、これらに限定されない、のために合成するこ
とができる。これらのペプチドを含むアミノ酸配列は、分子の外部領域上の位置
に基づいて選択され、抗血清への結合にアクセス可能である。標準的な微量化学
的設備でペプチドを合成し、ＨＰＬＣおよび質量分析で純度をチェックすること
ができる。ペプチド合成法、ＨＰＬＣ精製法、および質量分析法は、当業者に公
知である。
【０１０３】 ＨＧＦクリングル含有フラグメントまたはペプチドを、組換えＥ．ｃｏｌｉま
たは昆虫もしくは酵母発現系、哺乳動物細胞発現系、およびトランスジェニック
発現系で作製するか、カラムクロマトグラフィーで精製することもできる。
【０１０４】 種々の適用のために、ＨＧＦペプチドを、同位元素、酵素、キャリアタンパク
質、細胞障害剤、蛍光分子、および他の化合物に化学結合することができる。結
合反応効率を、特定の反応に適した技術を使用して同定される。
【０１０５】 合成ペプチド中の系統的アミノ酸配列置換により、そのレセプターへのＨＧＦ
の結合を増大または減少させるＨＧＦレセプターに対する高親和性ペプチドアゴ
ニストおよびアンタゴニストが得られる。このようなアゴニストは原発性および
転移性腫瘍の成長を抑制するのに利用され、それによってガンの拡がりを制限す
る。ＨＧＦのアンタゴニストは、不適切な血管新生に適用してＨＧＦの阻害効果
遮断し、おそらく血管形成を促進する。この処理は、糖尿病の創傷治癒を促進す
る治療効果があり得る。
【０１０６】 ＨＧＦペプチドは、培養細胞からのＨＧＦレセプターの単離用のアフィニティ
ーカラムを開発するのに利用される。ＨＧＦレセプターの単離および精製後、ア
ミノ酸配列決定を行う。次に、ヌクレオチドプローブがレセプターの発現用ベク
ターへの挿入用に開発される。これらの技術は当業者に周知である。これらの技
術は、レセプター結合用のＨＧＦの最小構造の特定に有益であり得る。
【０１０７】 リシンなどの細胞障害剤を、ＨＧＦクリングルフラグメントおよび高親和性Ｈ
ＧＦペプチドフラグメントなどの本発明のクリングルドメイン含有タンパク質お
よびペプチドに結合して、ＨＧＦに結合する細胞の破壊ツールを得る。これらの
細胞を、転移性および原発性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない多数の位
置で見出すことができる。細胞障害剤に結合したペプチドを、所望の位置への送
達を最大にするようにデザインした様式で融合する。例えば、リシン結合高親和
性ＨＧＦフラグメントを、カニューレを介して標的部位に供給する血管に、また
は直接標的に送達させる。このような薬剤はまた、調節された様式で注入カニュ
ーレに連結した浸透圧ポンプによって送達させる。ＨＧＦアンタゴニストの組み
合わせを血管形成の刺激物質と共に同時投与して、組織の血管新生を増大させる
ことができる。
【０１０８】 ＨＧＦフラグメントなどのクリングルドメイン含有タンパク質およびペプチド
に対する抗血清を作製することができる。ペプチド合成および精製後、モノクロ
ーナルおよびポリクローナル抗血清は、当業者に公知の確立された技術を使用し
て作製される。例えば、ポリクローナル抗血清を、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、また
は他の動物で作製することができる。ウシ血清アルブミンなどのキャリア分子と
抱合したＨＧＦペプチドを、アジュバント混合物と組み合わせ、乳化し、背中、
首、脇腹、および時として足蹠の複数の部位に皮下注射する。２〜４週間毎など
の規則的な間隔で追加免疫注射を行う。例えば各注射から約７〜１０日後に拡張
後の辺縁性耳静脈を使用した静脈穿刺によって血液サンプルを得る。血液サンプ
ルを４℃で一晩凝固させ、約２４００×ｇ、４℃で約３０分間遠心分離する。
【０１０９】 ポリクローナル抗血清の作製における全血清サンプルまたはモノクローナル抗
血清の作製における培地サンプルを、力価の同定について分析する。いくつかの
手段、例えばドットブロットおよび密度分析、およびプロテインＡ、二次抗体、
冷エタノール、またはチャコール−デキストランを使用した放射性標識ペプチド
−抗体複合体の沈殿後のガンマカウンターでの活性の測定、によって力価を確立
する。最も高い力価の抗血清を、市販のアフィニティーカラムでも精製する。Ｈ
ＧＦペプチドを、アフィニティーカラム中のゲルに結合させる。カラムに抗血清
サンプルを通すと、抗ＨＧＦフラグメント抗体はカラムに結合したままである。
これらの抗体を、続いて溶出し、回収し、力価および特異性の決定のために評価
を行う。
【０１１０】 最も高い力価のＨＧＦフラグメント抗血清を試験して以下を確立する：ａ）抗
原の最も高い特異的結合および最も低い非特異的結合のための至適抗血清希釈、
ｂ）標準的置換曲線における漸増量のＨＧＦペプチドの結合能力、ｃ）ＨＧＦ関
連種を含む関連ペプチドおよびタンパク質との潜在的交差反応性、ｄ）精液、結
晶、尿、組織の抽出液および細胞培養培地中のＨＧＦペプチドの検出能力。
【０１１１】 本発明によれば、ＨＧＦフラグメント組成物などのクリングルドメイン含有タ
ンパク質組成物を、疾患治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用
することができる。例えば、腫瘍を、ＨＧＦフラグメント組成物を組み合わせる
か組み合わせない手術、照射、または化学療法で慣習的に処理し、次に、この組
成物を患者に投与して微小転移の休止状態を延長し、任意の残りの原発性腫瘍を
安定化することができる。
【０１１２】 本発明は血管形成活性を有するクリングルドメイン含有タンパク質およびペプ
チドの任意の誘導体を含むことを意図すると理解すべきである。本発明は、クリ
ングルドメイン、ＨＧＦタンパク質の誘導体、およびＨＧＦタンパク質の生物活
性フラグメントを含む全ＨＧＦタンパク質を含む。これらには、アミノ酸が置換
されているかアミノ酸官能基に結合した糖または他の分子を有するＨＧＦ活性を
有するタンパク質が含まれる。本発明はまた、ＨＧＦおよびＨＧＦレセプター、
ＨＧＦクリングルドメインをコードする遺伝子、およびこれらの遺伝子によって
発現したタンパク質を含む。
【０１１３】 本発明は、全ＭＳＰタンパク質、ＭＳＰタンパク質の誘導体、ＭＳＰクリング
ルフラグメント、およびＭＳＰタンパク質の生物活性フラグメントを含む。これ
らには、アミノ酸が置換されているかアミノ酸官能基に結合した糖または他の分
子を有するＭＳＰ活性を有するタンパク質が含まれる。本発明はまた、ＭＳＰお
よびＭＳＰレセプター、およびＭＳＰクリングルドメインフラグメントをコード
する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子によって発現したタンパク質を含む。
【０１１４】 上記の血管形成活性を有するクリングルドメイン含有タンパク質を、当業者に
公知の処方を使用して、薬学的に許容可能な処方物中の単離および実質的に精製
されたタンパク質およびタンパク質フラグメントとして得ることができる。これ
らの処方物を、標準的な経路で投与することができる。一般に、この組み合わせ
たものを、局所、経皮的、腹腔内、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、経口
、直腸、または非経口（例えば、静脈内、脊髄内、皮下、もしくは筋肉内）経路
で投与することができる。さらに、タンパク質を生分解性ポリマーに組み込んで
化合物を徐放させることができ、例えば、腫瘍部位での薬物送達が好ましい場合
にポリマーを近傍に移植するか、ＨＧＦが全身にゆっくりと放出されるように移
植する。浸透圧ミニポンプを使用して、カニューレを介して転移の成長部に直接
または腫瘍に供給する血管などの目的の部位への高濃度のＨＧＦクリングルフラ
グメントの送達を調節することもできる。生分解性ポリマーおよびその使用は、
例えば、Brem et al., J. Neurosurg, 74, 441-446,1991に詳述されている。
【０１１５】 本発明の処方物には、経口、直腸、眼（硝子体内または房内を含む）、鼻腔、
局所（頬側および舌下を含む）、子宮内、膣内、または非経口（皮下、腹腔内、
筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外を含む）投与に適切なも
のが含まれる。処方物は、好都合なことに、単位投薬形態で存在することができ
、従来の薬学系技術によって調製することができる。このような技術は、有効成
分および薬学的キャリアまたは賦形剤を会合させる工程を包含する。一般に、処
方物を、液体キャリアまたは細かく分割した固体キャリアもしくはその両方との
有効成分の均一、かつ密接な会合および必要ならば生成物の成形によって調製す
る。
【０１１６】 非経口投与に適切な処方物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬を含み得る、水性
および非水性滅菌注射用溶液、および意図するレシピエントの血液と処方物を等
張にする溶液、および懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁
液が含まれる。処方物は単位用量または複数回投与用量コンテナ、例えば密封ア
ンプルおよびバイアル中に存在することができ、使用直前に滅菌液体キャリア、
例えば注射用の水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で
保存することができる。先に記載の種類の滅菌の粉末、顆粒、および錠剤から注
射用溶液および懸濁液を即座に調製することができる。
【０１１７】 本発明の組成物の投薬量は、治療する疾患の状態または症状およびヒトまたは
動物の体重および症状ならびに化合物の投与経路など他の臨床要因に依存して変
化する。例えば、ヒトまたは動物の治療には、約０．５〜５００ｍｇ／キログラ
ムがＨＧＦタンパク質またはＨＧＦのクリングルドメインフラグメントを含む組
成物投与の典型的な広範囲である。特定の動物またはヒトのタンパク質の半減期
に依存して、１日に数回から１週間に１回の間でタンパク質を投与することがで
きる。本発明は、ヒトおよび動物に適用されると理解すべきである。本発明の方
法は、同時または長期間投与する場合に単回および複数回投与を意図する。
【０１１８】 好ましい単位投薬量の処方物は、本明細書中に記載のように、投与した成分の
１日用量または単位量、１日亜用量(sub-dose)、もしくはその適切な画分を含む
ものである。特に上記のように、成分に添加する本発明の処方物には、当該処方
物の型に関して当該分野で従来の他の薬剤が含まれることを理解すべきである。
【０１１９】 本発明を、以下の実施例にしたがってさらに例示しているが、本発明の範囲を
制限すると決して解釈されない。それに対して、本明細書中の記載を読めば、種
々の他の実施形態、変形形態、および等価物を使用することができ、本発明の精
神および／または併記の特許請求の範囲を逸脱することなく、これらを当業者が
示唆することができることが明らかに理解される。
【０１２０】 ［実施例］ 実施例１ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉで発現する精製ヒト組換えＨＧＦ Ｋ２−３（図
６）。 ＨＧＦ Ｋ２−３遺伝子を、ｐＰＩＣＺａＡにクローン化し、Ｘ３３ Ｐ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ株で発現させた。発酵上清をイオン交換および疎水性相互作用ク
ロマトグラフィーによって精製した。１１μｇの精製ＨＧＦ Ｋ２−３を、クー
マシーブルーで染色した変性および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。
【０１２１】 実施例２ ＨＧＦ Ｋ２−３は、ＶＥＧＦおよびＨＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ移動を阻害する（
図７ａおよび７ｂ）。 微量走化性アッセイ 装置： チャンバー：Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ４８ウェル走化性チ
ャンバー（カタログ番号ＡＰ４８（３０１−２２９−８５９８）） フィルター膜：ＰｏｒｅｔｉｃｓメンブレーンポリカーボネートＰＶＰ Ｆｒ
ｅｅ ８ミクロン、２５×８０ｍｍ（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、８００−４
４４−８２１２、カタログ番号１０４７４） 鉗子：ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ８００−２３４−９３００（カタログ
番号２５６８１〜２６９）。膜の操作を容易にするために、これらの鉗子を使用
する。 フィルター膜の調製 １００ｍｇ／ｍｌのラット尾コラーゲン１型（ＢＤ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ Ｒｅｓ．、カタログ番号４０２３６）の２９ｍｌ０．２Ｎ酢酸溶液で膜を
コートする。０．２Ｎ酢酸作製のため、３４５ｍｌの氷酢酸（９９％）を２９．
６６滅菌Ｈ２０（ＢＲＬ）に添加する。 １． ５０ｍｌのコニカルチューブ中でコラーゲン（１００ｍｇ／ｍｌ）を０
．２Ｎ酢酸で希釈する。十分に混合する。 ２． ペトリ皿または小さなプラスチック製の染色ボックスのいずれかにコラ
ーゲン溶液を入れる。膜を個別に浸す（１０個の膜）。 ３． 室温のロッカー上で４８時間ゆっくりと振盪する。 ４． 開けたペトリ皿上のフィルターの重層によって層流フードにてフィルタ
ーを風乾する。 ５． 乾燥フィルターを覆いをしたコンテナ内で室温で保存する（２週間）。 アッセイ： アッセイ培地： １％Ｌ−グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）および０
．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８４１２）を補足した２００培地。 １． トリプシン処理によってＨＵＶＥＣ ｐ２−ｐ７をフラスコから回収す
る。成長培地でトリプシンを中和する。１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によ
ってトリプシン／ベルセン(versene)／培地を取り除く。１０ｍｌのアッセイ培
地に再懸濁する。細胞を過剰にトリプシン処理または過剰に遠心分離しないこと
。 ２． トリパンブルー溶液で希釈して細胞を計数する。生存度を同定する。ア
ッセイ培地で２×１０５／ｍｌに細胞を再懸濁する。 ３． チャンバーに細胞を添加する前に、１７×１００ｍｍ（１４ｍｌ）のポ
リプロピレン丸底チューブ（Ｆａｌｃｏｎ３５〜２０５９）中で試験タンパク質
と共に細胞を３７℃５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートする。管の頂部を
閉めないこと。コントロール細胞をアッセイ培地でインキュベートする。 ４． 細胞を添加する約５分前にチャンバーを準備する。下側のチャンバーの
最初の３つのカラムに約２８ｍｌのアッセイ培地のみを添加する。この体積は、
各チャンバーで２５〜３０ｍｌのばらつきがある。わずかに陽性のメニスカスが
ウェル上で形成されるように体積を調整する。残りのウェルを２〜１０ｎｇ／ｍ
ｌの化学誘引物質（例えば、ＶＥＧＦ１６５ Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２９３−Ｖ
Ｅ）で満たす。アッセイ培地でＶＥＧＦを再構成する。至適濃度は細胞に依存す
る。最後の３つのカラムは、刺激コントロールである。 ５． 膜を用いた全ての操作は、鉗子で行う。膜の端を少し切り取り、切取コ
ーナーをＮＰ（商標）に向ける。下側のチャンバーの上段に膜を光沢のある面を
上にして置く。ウェルを汚染することがあるので膜を調整しないこと。 ６． 膜の上にシリコーンパッキンを静かに置く。次いで、チャンバーの上の
部分を商標で方向を合わせて置く。均等に圧力をかけてつまみナットを強く締め
る。注記：これを正確に行っていないと細胞が漏れる。 ７． ５０ｍｌのコントロール細胞または処理細胞を上側のチャンバーに添加
する。気泡を避けるために、細胞の添加中はピペットの先を持ち上げる。膜を突
き刺さないように注意すること。 ８． 湿らせたペーパータオルを入れた１５０ｍｍペトリ皿にチャンバーを置
く。チャンバーを５％ＣＯ２で、３７℃で６時間インキュベートする。 ９． ６時間後、つまみナットおよび上側のチャンバーを静かに取り出す。鉗
子でガスケットに重なった膜を剥ぎ取る。 １０． 以下のようにフィルター膜を固定および染色する：Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉ
ｋ（Ｄａｄｅ Ｉｎｔ．、カタログ番号８４１３２−１０）で２分間固定；溶液
Ｉで２分間；溶液ＩＩで３分間。 １１． 膜を蒸留水で２回リンスする。膜を３×２ガラス顕微鏡スライド（Ｖ
ＷＲ、カタログ番号２８３５１−１００）上に置く。動かないように膜を抑えな
がら、移動していない細胞を湿ったキムワイプで除去する。細胞の除去後膜を乾
燥させる。ｓｕｐｅｒ−ｇｌｕｅの４つの小滴を各スライドの端に置く（ピペッ
トチップを使用。さらなるスライドを上に置く。顕微鏡で観察して全移動細胞数
を同定する。
【０１２２】 ＨＵＶＥＣの移動を、細胞の移動および方向を測定可能な上記の微量走化性チ
ャンバー（Ｂｏｙｄｅｎチャンバー、Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤを改変）を用いて評価した。ＨＧＦ Ｋ２−３また
は基本培地（０．１％ＢＳＡを含むＭ−２００）と３７℃で３０分間前処理した
ＨＵＶＥＣを、上側のチャンバーに置いた。下側のチャンバーは、（ａ）ＶＥＧ
Ｆ（５ｎｇ／ｍｌ）または（ｂ）ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含むか何も含んで
いない、基本培地を含んでいた。１００μｇ／ｍｌのラット尾コラーゲン１型（
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅ
ｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で被覆した８ｍｍのポリカーボネートＰＶＰフリーフィルタ
ーを通って細胞が移動した。次いで、上記のようにチャンバーを６時間インキュ
ベートした。非移動細胞を除去し、フィルターをＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｄａｄｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｑｕａｄｏ、Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ）で固定お
よび染色した。移動細胞数を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ分析システム（Ｍ
ｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使
用して同定した。１００μｇ／ｍｌのＢＳＡでは、成長因子刺激ＨＵＶＥＣの移
動に阻害効果は示されなかった（データ示さず）。
【０１２３】 実施例３ ＨＧＦ Ｋ２−３は、ＨＵＶＥＣ管形成を阻害する（図８）。 ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、アッセイ培地（ＬＳＧＳおよび５％熱不活性
ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した２００培地）に１×１０５細胞／ｍｌに再
懸濁した。アッセイに用いる１００ｍｌのＨＧＦＫ２−３の希釈物および１００
μｌのＨＵＶＥＣをマトリゲル下層（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上に３７℃で１６時間
置いた。インキュベーション後、内皮細胞を顕微鏡で試験し、接合部数の計数に
よって管形成を評価した。２００μｇ／ｍｌのＢＳＡでは、阻害効果は認められ
なかった（データ示さず）。
【０１２４】 実施例４ アンギオスタチンタンパク質は、ＨＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ移動を阻害する（図９
）。 ＨＵＶＥＣの移動を、微量走化性チャンバー（Ｂｏｙｄｅｎチャンバー、Ｎｅ
ｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤを改変）を用
いて評価した。アンギオスタチンタンパク質または基本培地（０．１％ＢＳＡを
含むＭ−２００）と３７℃で３０’前処理したＨＵＶＥＣを、上側のチャンバー
に置いた。下側のチャンバーは、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含むか何も含んで
いない、基本培地を含んでいた。１００ｍｇ／ｍｌのラット尾コラーゲン１型（
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅ
ｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で被覆した８ｍｍのポリカーボネートＰＶＰフリーフィルタ
ーを通って細胞が移動した。次いで、上記のようにチャンバーを６時間インキュ
ベートした。非移動細胞を除去し、フィルターをＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｄａｄｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｑｕａｄｏ、Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ）で固定お
よび染色した。移動細胞数を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ分析システム（Ｍ
ｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使
用して同定した。１００ｎｇ／ｍｌのＢＳＡでは、成長因子刺激ＨＵＶＥＣの移
動に阻害効果は示されなかった（データ示さず）。
【０１２５】 実施例５ アンギオスタチンタンパク質は、ｃ−ｍｅｔリン酸化を誘導しない（図１０）
。 Ａ５４９細胞を、無血清培地＋０．１％ＢＳＡ中で６時間飢えさせ、アンギオ
スタチンタンパク質またはＨＧＦで３７℃で１０分間処理した。細胞を溶解し、
上清を１５μｌのウサギ抗ｃ−ｍｅｔ抗体で免疫沈澱させ、抗ホスホチロシン抗
体（４Ｇ１０）または抗ｃ−ｍｅｔ抗体で探索するウェスタンブロットで分析し
た。
【０１２６】 実施例６ アンギオスタチンタンパク質は、ＨＧＦ刺激ｃ−ｍｅｔリン酸化を阻害しない
（図１１）。 ＨＵＶＥＣを、無血清培地＋０．１％ＢＳＡ中で６時間飢えさせ、アンギオス
タチンタンパク質で４℃で３０分間処理した。冷培地を同濃度のアンギオスタチ
ンを含む新鮮な培地（３７℃）と置換し、次に２０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦで３７℃
で１０分間誘導した。細胞を溶解し、上清を１５μｌのウサギ抗ｃ−ｍｅｔ抗体
で免疫沈澱させ、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０）または抗ｃ−ｍｅｔ抗体で
探索するウェスタンブロットで分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＧＦとプラスミノゲンの構造比較を示す図である。成熟ＨＧＦは、Ｎ末端ヘ
アピンドメインおよび４つのクリングルドメインを含むα鎖、ならびにセリンプ
ロテアーゼ様ドメインを含むβ鎖から構成されるヘテロ二量体分子である。α鎖
は、レセプター結合ドメインとして同定されている。ＨＧＦ／ＮＫ１、ＨＧＦ／
ＮＫ２、ＨＧＦ／ＮＫ３、およびＨＧＦ／ＮＫ４を、Ｎ末端ヘアピンドメイン＋
最初のクリングル（ＮＫ１）、またはＮ末端ヘアピンドメイン＋最初の２クリン
グル（ＮＫ２）などと定義する。ＨＧＦ Ｋ２〜３は、第２および第３のＨＧＦ
クリングルを含む。プラスミノゲンは、クリングルドメインおよびセリンプロテ
アーゼドメインから構成される。アンギオスタチンタンパク質は、プラスミノゲ
ンの最初の３クリングル（Ｋ１〜３）を含む。
【図２】 ＨＧＦおよびプラスミノゲンのクリングル１〜４の間のタンパク質配列の比較
を示す図である。タンパク質の一次配列の比較により、プラスミノゲンクリング
ルドメインおよびＨＧＦクリングルドメインは、配列が４９％を超えて類似して
おり、全てのシステインが高度に保存されていることが明らかとなった。
【図３】 ＨＧＦのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図４】 ＨＧＦフラグメントのアミノ酸配列（配列番号２および３）を示す図である。
【図５】 ＭＳＰのアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図６】 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉで発現した組換えＨＧＦ Ｋ２〜３のＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルである。
【図７】 図７ａおよび図７ｂ ＨＧＦ Ｋ２〜３がＶＥＧＦおよびＨＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ移動を阻害すること
を示すグラフである。
【図８】 ＨＧＦ Ｋ２〜３がＨＵＶＥＣ血管形成を阻害することを示すグラフである。
【図９】 アンギオスタチンタンパク質がＨＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ移動を阻害することを示
すグラフである。
【図１０】 アンギオスタチンタンパク質がＨＧＦ刺激ｃ−ｍｅｔリン酸化を阻害しないこ
とを示すグラフである。
【図１１】 抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０）または抗ｃ−ｍｅｔ抗体で探索したウェス
タンブロットを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/14 9/10 １０１ 17/02 9/14 17/06 17/02 17/12 17/06 19/02 17/12 27/02 19/02 29/00 １０１ 27/02 31/04 29/00 １０１ 35/00 31/04 43/00 １０５ 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デイ，クララ アメリカ合衆国 メリーランド 20874 ジャーマンタウン スキップ ジャック ドライブ 12115 Ｆターム(参考） 4B063 QQ07 QR48 QX10 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 CA18 CA53 DA02 DB57 DB62 DB70 NA14 ZA36 ZA45 ZA53 ZA66 ZA68 ZA89 ZA91 ZA96 ZB15 ZB21 ZB26 ZB35 ZC03 ZC33

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 動物に血管形成阻害量の、クリングルドメイン含有タンパク
    質およびペプチドを含む組成物を投与することを含む、動物の血管形成の阻害法
    。
  2. 【請求項２】 前記クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドが、
    肝細胞成長因子、マクロファージ刺激タンパク質、およびその生物活性フラグメ
    ントを含む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記肝細胞成長因子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列ま
    たはその抗血管形成フラグメントを有する、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 前記組成物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペ
    プチドをさらに含む、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記組成物が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するペ
    プチドをさらに含む、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記動物が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマ
    チ、乾癬、眼の血管形成疾患、オスラー−ウェバー症候群、心筋血管形成、プラ
    ーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、創傷肉芽形成、腸
    管癒着症、アテローム性動脈硬化症、硬皮症、肥厚性瘢痕、ネコ引っ掻き病、お
    よびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ潰瘍からなる群から選択される血
    管形成媒介疾患を罹患している、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 増殖細胞に増殖阻害量の、ＨＧＦの生物活性フラグメントを
    含む組成物を投与して細胞増殖を阻害することを含む、細胞増殖の阻害法。
  9. 【請求項９】 前記細胞増殖が、内皮細胞増殖および平滑筋細胞増殖を含む
    、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドが
    、肝細胞成長因子、マクロファージ刺激タンパク質、およびその生物活性フラグ
    メントを含む、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記肝細胞成長因子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列
    またはその抗増殖フラグメントを有する、請求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記組成物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
    ペプチドをさらに含む、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記組成物が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する
    ペプチドをさらに含む、請求項１１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記細胞増殖が、血管形成媒介疾患に関連する、請求項１
    １記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記血管形成媒介疾患が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、
    慢性関節リウマチ、乾癬、眼の血管形成疾患、オスラー−ウェバー症候群、心筋
    血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、創
    傷肉芽形成、腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、硬皮症、肥厚性瘢痕、ネコ
    引っ掻き病、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ潰瘍からなる群か
    ら選択される、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 生体サンプルを得ることおよび、前記サンプル中のＨＧＦ
    レベルを同定することを含む、血管形成によって媒介された疾患の診断法または
    疾患の予後の同定法。
  17. 【請求項１７】 前記クリングルドメイン含有タンパク質およびペプチドが
    、肝細胞成長因子、マクロファージ刺激タンパク質、およびその生物活性フラグ
    メントを含む、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記肝細胞成長因子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列
    またはその抗血管形成フラグメントを含む、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記マクロファージ刺激タンパク質が、配列番号４に記載
    のアミノ酸配列またはその抗血管形成フラグメントを含む、請求項１７記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 前記血管形成媒介疾患が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、
    慢性関節リウマチ、乾癬、眼の血管形成疾患、オスラー−ウェバー症候群、心筋
    血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、創
    傷肉芽形成、腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、硬皮症、肥厚性瘢痕、ネコ
    引っ掻き病、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ潰瘍からなる群か
    ら選択される、請求項１６記載の方法。
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