JP2001518304A

JP2001518304A - アンギオスタチン成分を含む融合タンパク質及び抗腫瘍療法におけるその使用

Info

Publication number: JP2001518304A
Application number: JP2000513958A
Authority: JP
Inventors: ボラノウスキ，マーク・エイ; キャパロン，メイアー・エイチ; キャスパーソン，ジェラルド・エフ; グレゴリー，スーザン・エイ; クレイン，バーバラ・ケイ; マッカーン，ジョン・ピー
Original assignee: ジー・ディー・サール・アンド・カンパニー
Priority date: 1997-10-01
Filing date: 1998-09-30
Publication date: 2001-10-16
Also published as: EP1705248A1; AU9673998A; WO1999016889A1; EP1019515A1; CA2303401A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｒ₁又はＲ₁−Ｒ₁なる式の新規多機能タンパク質（ＭＦＰ）の開発に関する。ここで、Ｒ₁はアンギオスタチンであり、Ｒ₂はエンドスタチン、ヒトＩ型インターフェロン、トロンボスポンジン、インターフェロン誘導性タンパク質１０及び血小板因子４から選択され、Ｌ₁はＲ₁をＲ₂に連結し得るリンカーである。本発明はまた、ＭＦＰをコードする核酸、ＭＦＰの製造法、ＭＦＰの使用法、ＭＦＰで腫瘍を治療する方法を包含する血管形成介在性の疾患をＭＦＰで治療する方法及びＭＦＰをコードするベクターを使用する遺伝子治療によって腫瘍を治療する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】優先権本出願は、１９９７年１０月２日に出願された米国仮出願第６０／０６０，６
０９号の優先権を３５ＵＳＣセクション１１９のもとに主張する。発明の分野本発明は、Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−
Ｒ₁又はＲ₁−Ｒ₁なる式の新規多機能タンパク質（ＭＦＰ）の開発に関する（ここで、Ｒ₁はアンギオスタチンであり、Ｒ₂はエンドスタチン、ヒトＩ型インター
フェロン、トロンボスポンジン、インターフェロン誘導性タンパク質１０、血小
板因子４から選択され、Ｌ₁はＲ₁をＲ₂に連結し得るリンカーである）。本発明はまた、ＭＦＰをコードする核酸、ＭＦＰの製造法、ＭＦＰの使用法、ＭＦＰで
腫瘍を治療する方法を包含する血管形成介在性の疾患をＭＦＰで治療する方法及
びＭＦＰをコードするベクターを使用する遺伝子治療によって腫瘍を治療する方
法に関する。発明の背景血管形成、つまり新しい血管の増殖は、癌の増殖及び転移に重要な役割を果た
す。ヒトでは、腫瘍における脈管構造の広がりが、様々な癌の患者予後に関連す
ることが示されてきた（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＭｅ
ｄｉｃｉｎｅｏｆｔｈｅＢｅｔｈＩｓｒａｅｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂ
ｏｓｔｏｎ３３３（２６）：１７５７−１７６３，１９９５；Ｇａｓｐａｒｉ
ｎｉ，Ｇ．，ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ３２Ａ
（１４）：２４８５−２４９３，１９９６；Ｐｌｕｄａ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｅｍｉｎ
ａｒｓｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２４（２）：２０３−２１８，１９９７）。
正常な成人では、血管形成は創傷治癒や女性の生殖系のように十分制御された状
況に制限されている（Ｂａｔｔｅｇａｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ７３
：３３３−３４６，１９９５；Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．
Ｍｅｄ．，３１５：１６５０−１６５９，１９８６）。

【０００２】動物試験は、腫瘍が休眠状態で存在し、そこで腫瘍増殖が高速度の増殖と高速
度のアポトーシスとの間のバランスによって制限されていることを示唆する（Ｈ
ｏｌｍｇｒｅｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（Ｎ．Ｙ．）１（２）：１４９−１
５３，１９９５；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ
ａｓｓ．）８６（３）：３５３−３６４，１９９６）。血管形成の表現型へのス
イッチによって、おそらくは腫瘍細胞のアポトーシス速度が減少する結果として
、腫瘍細胞は休眠状態から脱して急速に増殖するようになる（Ｂｏｕｃｋ，Ｃａ
ｎｃｅｒＣｅｌｌｓ，２（６）：１７９−１８５，１９９０；Ｄａｍｅｒｏｎ
ら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，
５９：４８３−４８９，１９９４）。血管形成の制御は、新しい血管形成を促進
する要因と血管新生の形成を抑制する抗血管形成因子とのバランスであると考え
られている（Ｂｒｏｕｋ，Ｎ．ら、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓｅａｒｃｈ６９：１３５−１７３，１９９６；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅ
ｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）７９（２）：３１５−３２８，１９９
４）。

【０００３】塩基性及び酸性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ及びａＦＧＦ）及び血管透過性
因子／血管内皮細胞増殖因子（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）を包含する多種多様な前血管
形成因子が特徴付けられてきた（Ｐｏｔｇｅｎｓ，Ａ．Ｊ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ３７６：５７−７０，１９９５；Ｆｅｒ
ｒａｒａ，Ｎ．，ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ３
２Ａ（１４）：２４１３−２４４２，１９９６；Ｂｉｋｆａｌｖｉ，Ａ．ら、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ１８：２６−４５，１９９７）。また、ア
ンギオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓ
ｓ．）７９（２）：３１５−３２８，１９９４）、エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉ
ｌｌｙら、Ｃｅｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）８８（２）：２７７−
２８５，１９９７）、インターフェロンα（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚら、Ｎ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｍａｙ２８，３２６（２２）：１４５６−１４６３，１９
９２）、トロンボスポンジン（Ｇｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８７（１７）：６６２４−６６２８，１９９０；Ｔｏｌｓｍａら
、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２２（２）：４９７−５１１，１９９３）及び血
小板因子４（ＰＦ４）（Ｍａｉｏｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：（４９３８
）７７−７９，１９９０）を包含するいくつかの内因性抗血管形成因子も特徴付
けられてきた。

【０００４】アンギオスタチンは、プラスミノーゲンのはじめ３つ又は４つのクリングルド
メインを含む３８ｋＤのタンパク質であり、１９９４年に初めて記載された（Ｏ
’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）７９
（２）：３１５−３２８，１９９４）。原発性（ルイス肺癌−低転移性）腫瘍を
担っているマウスは、角膜マイクロポケットアッセイにおいてｂＦＧＦのような
血管形成性の刺激に反応せず、これらマウスにおける転移性腫瘍の増殖は、この
原発性腫瘍が切除されるまで抑制されていた。この血管形成及び腫瘍増殖の阻害
の原因となる因子はマウスアンギオスタチンと命名された。アンギオスタチンは
また内皮細胞の増殖をｉｎｖｉｔｒｏで阻害することも示された。

【０００５】ヒトアンギオスタチンは、プラスミノーゲンを豚のエラスターゼ（Ｏ’Ｒｅｉ
ｌｌｙら、Ｃｅｌｌ７９（２）：３１５−３２８，１９９４）又はヒトのメタ
ロエラスターゼ（Ｄｏｎｇら、Ｃｅｌｌ８８，８０１−８１０，１９９７）で
消化することにより調製され得る。豚エラスターゼ消化により産生されるアンギ
オスタチンはマウスにおいて転移及び原発性腫瘍の増殖を阻害した。Ｏ’Ｒｅｉ
ｌｌｙら（Ｃｅｌｌ７９（２）：３１５−３２８，１９９４）は、ヒトアンギ
オスタチンがＳＣＩＤマウスにおいてルイス肺癌の転移を阻害することを示した
。次いで同グループ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（Ｎ．
Ｙ．）２（６）：６８９−６９２，１９９６）は、ヒトアンギオスタチンがＳＣ
ＩＤマウスにおいてヒト腫瘍のＰＣ３前立腺癌、クローンＡ結腸癌及びＭＤＡ−
ＭＢ乳癌の増殖を阻害することを示した。ヒトアンギオスタチンはまた、Ｃ５７
Ｂｌマウスにおいてマウス腫瘍のルイス肺癌、Ｔ２４１繊維肉腫及びＭ５０７６
細網細胞癌の増殖を阻害した。酵素的に調製されるこれらアンギオスタチンは生
化学的に十分特徴付けられていないので、これら分子の正確な組成は知られてい
ない。

【０００６】組成が知られているアンギオスタチンは組換えＤＮＡ技術及び異種細胞系での
発現の手段によって調製され得る。クリングルドメイン１−４（Ｋ１−４）を含
む組換えヒトアンギオスタチンが酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおいて
産生された（Ｓｉｍら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：１３２９−１３３４，１
９９７）。この組換えヒトタンパク質は、内皮細胞の増殖をｉｎｖｉｔｒｏで
阻害し、Ｃ５７Ｂｌマウスにおいてルイス肺癌の転移を阻害した。組換えマウス
アンギオスタチン（Ｋ１−４）は、昆虫細胞で産生された（Ｗｕら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３６：６５１−６５４，１９９７
）。この組換えマウスタンパク質は、内皮細胞の増殖をｉｎｖｉｔｒｏで阻害
し、原発性ルイス肺癌の増殖をｉｎｖｉｖｏで阻害した。これらの実験は、は
じめ４つのクリングルドメインがアンギオスタチン活性に十分であることを示し
たが、どのクリングルドメインが必要なのかは決定しなかった。

【０００７】Ｃａｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４６１−２９４６７，１９
９６）は、組換えタンパク質の大腸菌でのタンパク質分解及び発現によってヒト
プラスミノーゲンのフラグメントを産生した。この著者らは、プラスミノーゲン
のクリングル１及びわずかにクリングル４がｉｎｖｉｔｒｏにおける内皮細胞
の増殖阻害の原因であることを示した。特に言えば、Ｋ１が単独で４倍高い濃度
で内皮細胞の増殖を阻害したのに対し、クリングル１−４及びクリングル１−３
は同様の濃度でそれを阻害した。クリングル２及び３はより少ない程度で阻害し
た。さらに最近、Ｃａｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９２４−２
２９２８，１９９７）は、組換えマウス又はヒトのクリングル５が内皮細胞の増
殖をアンギオスタチン（Ｋ１−４）より低い濃度で阻害することを示した。これ
らの実験はｉｎｖｉｔｒｏでのアンギオスタチン様活性を示したが、腫瘍及び
その転移に対するｉｎｖｉｖｏ作用に対しては触れなかった。

【０００８】国際特許出願ＷＯ９５／２９２４２Ａ１、ＷＯ９６／４１１９４Ａ１及びＷＯ
９６／３５７７４Ａ２は、アンギオスタチンの発現、精製及び特徴付けを記載す
る。ＷＯ９５／２９２４２Ａ１９５１１０２は、内皮細胞の増殖を阻害するタ
ンパク質をＨＰＬＣによって血液及び尿から精製することを開示する。このタン
パク質は、３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量及びマウスプラスミノ
ーゲン分子のアミノ酸７９位から始まるマウスプラスミノーゲンフラグメントと
実質的に同一のアミノ酸配列を有する。ＷＯ９６／４１１９４Ａ１９６１２１
９は、血管形成依存性の疾患を診断及び監視するための化合物及び方法を開示す
る。ＷＯ９６／３５７７４Ａ２９６１１１４は、アンギオスタチン内に存在す
るクリングル構造にほぼ対応しているタンパク質フラグメントの構造を開示する
。それはまた、内皮細胞阻害活性を有する凝集形態のアンギオスタチンも開示し
、腫瘍の血管形成を阻害する方法及び血管形成介在性の疾患を治療する方法を提
供する。

【０００９】コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ｋＤａ（１８４アミノ酸）カルボキシフラグメン
トであるエンドスタチンは、血管内皮腫によって産生される血管形成阻害剤であ
る（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ
．）８８（２）：２７７−２８５，１９９７；及びＷＯ９７／１５６６６）。エ
ンドスタチンは内皮細胞の増殖を特異的に阻害し、血管形成及び腫瘍増殖を阻害
する。大腸菌由来エンドスタチンの非再生懸濁液で処置された原発性腫瘍は、休
眠性の顕微鏡的な病巣へ後退した。毒性は観察されず、免疫組織学的試験は、高
い増殖による血管形成が腫瘍細胞のアポトーシスに相殺されて阻止されているこ
とを示した。

【００１０】インターフェロンα（ＩＦＮα）は、高度に相同なファミリーであり、抗ウイ
ルス、抗新生物及び免疫調節の複合活性を有する種特異的なタンパク質である（
研究論文集“Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃａｇｅｎｔｓ，ｉｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎａｌｆａ”，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＨｏｓｐｉｔａ
ｌＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓ，Ｉｎｃ．，１９９６に詳しく解説されている）。
インターフェロンαはまた、抗増殖及び抗血管形成性を有し、細胞分化に対して
特定の効果を有する（Ｓｒｅｅｖａｌｓａｎ，“ＢｉｏｌｏｇｉｃＴｈｅｒａ
ｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ”，ｐｐ．３４７−３６４，（ｅｄｓ．Ｖ．Ｔ．Ｄｅ
ＶｉｔａＪｒ．，Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ，とＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ），Ｊ
．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９
９５）。

【００１１】インターフェロンαは、毛様細胞白血病、慢性骨髄性白血病、悪性黒色腫及び
カポシ肉腫を包含する多種多様な癌に有効である。ＩＦＮαがその抗腫瘍活性を
発揮する正確な機序は完全には明らかでなく、腫瘍のタイプや疾患のステージに
より異なる可能性がある。ＩＦＮαの抗増殖特性は、腫瘍遺伝子及び／又は癌原
遺伝子の発現のモジュレーションに起因する可能性があるが、ヌードマウスで増
殖する腫瘍細胞系とヒト腫瘍の両方について示されている（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ
，Ｊ．Ｕ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１９８
−１２０５，１９９４）。

【００１２】インターフェロンはまた、幼児における血管腫の成功した治療（Ｅｚｅｋｏｗ
ｉｔｚら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｍａｙ２８，３２６（２２）１４５
６−１４６３，１９９２）及びカポシ肉腫に対するＩＦＮαの有効性（Ｋｒｏｗ
ｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４（２Ｓｕｐｐｌ．３）：２７−３３，１９
８７）によって示されたように、抗血管形成因子とも考えられている。この抗血
管形成効果の根底にある機序は明らかでなく、腫瘍（前血管形成因子の分泌を減
少させること）又は血管新生に対するＩＦＮα作用の結果である可能性がある。
ＩＦＮ受容体は多種多様な細胞のタイプについて同定されている（Ｎａｖａｒｒ
ｏら、ＭｏｄｅｒｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ９（２）：１５０−１５６，１９９
６）。

【００１３】Ｗｅｉｓｓｍａｎｎによる米国特許第４，５３０，９０１号は、形質転換され
た宿主系におけるＩＦＮαタイプ分子のクローニング及び発現を記載する。米国
特許第４，５０３，０３５号、Ｐｅｓｔｋａは、調製用高速液体クロマトグラフ
ィーを使用して１０種のヒト白血球インターフェロンを精製する改良法を記載す
る。米国特許第５，２３１，１７６号、Ｇｏｅｄｄｅｌは、その天然型において
１６６個より多く１７２個以下のアミノ酸を含有する、新規で独自のヒト白血球
インターフェロンファミリーのクローニングを記載する。

【００１４】Ｓｔａｂｉｎｓｋｙによる米国特許第５，５４１，２９３号は、コンセンサス
ヒトインターフェロンの合成、クローニング及び発現を記載する。これらは、合
成オリゴヌクレオチドから組立てられた、ヒト（白血球）インターフェロンαの
天然に存在しない類似体である。コンセンサスインターフェロンの配列は、イン
ターフェロンのＩＦＮαファミリーである１３種のメンバーの配列を比較し、各
位置で選好されるアミノ酸を選択して決定された。これら変異体は、１つ又はそ
れ以上のアミノ酸の同一性及び／又は位置、及び１種又はそれ以上の生物学的及
び薬理学的特性（例えば、抗体反応性、力価又は持続効果）に関して天然に存在
する形態と異なるが、他のそのような特性は保持している。

【００１５】トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）は、１８０ｋＤａポリペプチドの３コ
ピーを含有する三量体である。ＴＳＰ−１は、血小板、線維芽細胞及び内皮細胞
を包含する多くの細胞型によって産生され（Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．３（５）：７９２−７９９，１９９１）、このサブユ
ニットをコードするｃＤＮＡがクローニングされた（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、１９
８９，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０８（２）：７２９−７３６；Ｌａｗｌｅｒ
とＨｙｎｅｓ，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０３（５）：１６３５−１６４８，
１９８６）。ネイティブなＴＳＰ−１は、ｉｎｖｉｔｒｏで内皮細胞の遊走を
、ｉｎｖｉｖｏで血管新生を阻止することが示された（Ｇｏｏｄら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７（１７）：６６２４−６６２８，
１９９０）。腫瘍細胞におけるＴＳＰ−１の発現は、腫瘍発生及び腫瘍誘導性の
血管形成も抑制する（ＳｈｅｉｂａｎｉとＦｒａｚｉｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２（１５）６７８８−６７９２，１９９５；Ｗ
ｅｉｎｓｔａｔ−Ｓａｓｌｏｗら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４（２４）：６５
０４−６５１１，１９９４）。ＴＳＰ−１の抗血管形成活性は、このタンパク質
の２つの特徴的なドメインに存在することが示された（Ｔｏｌｓｍａら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌＢｉｏｌ．１２２（２）：４９７−５１１，１９９３）。これらドメイ
ンの１つはネイティブなＴＳＰ−１の残基３０３〜３０９からなり、他方はＴＳ
Ｐ−１の残基４８１〜４９９からなる。もう１つの重要なドメインは、ある種の
腫瘍細胞型とＴＳＰ−１との結合に介在するらしいＣＳＶＴＣＧ配列である（Ｔ
ｕｓｚｙｎｓｋｉとＮｉｃｏｓｉａ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１８（１）：７１−
７６，１９９６）。これらの結果は、ＣＳＶＴＣＧ又は関連配列が他の成分を腫
瘍細胞へ標的化するために使用され得ることを示唆する。まとめると、既存のデ
ータは、ＴＳＰ−１が腫瘍の増殖及び血管新生にある役割を果たすことを示す。
従って、ＴＳＰ−１のサブフラグメントは、キメラの抗血管形成成分として及び
／又は他のタンパク質を特定の腫瘍細胞へ標的化することにおいて有用であり得
る。サブフラグメントは、標準的な方法（特定のＴＳＰ−１ドメイン又はサブド
メインのタンパク質分解フラグメンテーション、又はそのＤＮＡ増幅、クローニ
ング、発現及び精製等）によって産生され、当技術分野で知られている方法によ
って抗血管形成又は抗腫瘍活性について試験され得る（Ｔｏｌｓｍａら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌＢｉｏｌ．１２２（２）：４９７−５１１，１９９３；Ｔｕｓｚｙｎｓ
ｋｉとＮｉｃｏｓｉａ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１８（１）：７１−７６，１９９
６）。

【００１６】様々なｉｎｖｉｖｏ実験は、ケモカインである血小板因子４（ＰＦ−４)及びインターフェロン誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）が腫瘍の増殖を遅らせ
ることを示す。ＰＦ−４は、マウスにおける原発性腫瘍（マウス黒色腫及びヒト
結腸癌）の増殖を阻止する（Ｓｈａｒｐｅら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩ
ｎｓｔ．８２，８４８−８５３；Ｍａｉｏｎｅら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１
，２０７７−２０８３，１９９１）。ＩＰ−１０の投与は、マウスにおける非小
胞性肺腫瘍の形成及びバーキットリンパ腫の皮下腫瘍を阻止する（Ａｒｅｎｂｅ
ｒｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，９８１−９９２，１９９６；Ｓｇａｒｄ
ａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，１３７９１
−１３７９６，１９９６）。ＰＦ−４は、カポシ肉腫、膠芽腫、黒色腫、腎細胞
癌及び結腸癌について現在臨床試験中である。ＩＰ−１０が活性化リンパ球の注
射部位への遊走を促進することは、免疫調節特性を有する可能性を示唆する。こ
の免疫調節特性はＩＰ−１０の抗腫瘍能力に寄与し得る。

【００１７】抗血管形成療法は、癌治療について従来の化学療法に優るいくつかの利点を提
供する可能性がある。抗血管形成薬は前臨床試験において低い毒性を示し、薬剤
耐性の発生も観察されていない（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓｉ
ｎＭｅｄｉｃｉｎｅｏｆｔｈｅＢｅｔｈＩｓｒａｅｌＨｏｓｐｉｔ
ａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ３３３（２６）：１７５７−１７６３，１９９５）。血管
形成は内皮細胞の侵襲、増殖及び遊走を包含する多くの工程からなる複雑なプロ
セスなので、複合療法が最も効果的であろうと期待され得る。事実、化学療法と
抗血管形成療法との複合療法は、すでに前臨床モデルにおいて有望な結果を示し
た（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒ
ｃｈａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ３６：２２７−２３６，１９９５；Ｔｅｉ
ｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅ
ｒ３２Ａ（１４）：２４６１−２４６６，１９９６）。

【００１８】アンギオスタチンとエンドスタチンのような他の抗血管形成タンパク質とのキ
メラは、いくつかの機序を介して作用することにより改善された生物学的特性を
有する可能性がある。この２種のタンパク質は独自の機序を有し得るので、２つ
の別個の作用点において血管形成プロセスを阻止することにより効果を高めるこ
とが可能になる。他の方法では、２種のタンパク質は、高められた結合活性によ
り結合又は他の作用が強まって、同一の細胞型に作用し得る。この場合、各分子
は他のドメインを適切な作用部位へ標的化する効果も有するだろう。アンギオス
タチン、エンドスタチン、又は他の抗血管形成タンパク質とそれら自身又は他の
タンパク質とのダイマー又はより高次の多量体は、これらの機序のいずれかによ
り高められた効力及び／又は力価を有するだろう。

【００１９】アンギオスタチンキメラの活性を高める第一の機序は、同一細胞上の２つの個
別受容体に結合する能力（例えば、受容体作動薬）に由来し、単一細胞上の受容
体との相互作用により増強された活性を示す。これらのキメラは、１）標的細胞
リガンドの全体的なオン又はオフ比率又はＫ_a又はＫ_dの変化、２）相補的な受容
体シグナル経路の活性化又は妨害、及び／又は３）関心対象の細胞成分の１つ又
は両方をより特異的に標的化すること、のような様々な機序を介して治療特性を
改善し得る。同クラスの機序の例は、Ａ_vＢ₃−アンギオスタチン、アンギオスタ
チン−ＩＰ−１０及びアンギオスタチン−ＩＦＮαのような、内皮細胞結合性の
二重受容体作動薬（又は拮抗薬）である。例えば、アンギオスタチンと非ＥＬＲ
−Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインとのキメラ形成から、内皮細胞に対して抗血管形成効果
を発揮する受容体作動薬を産生することが期待される。また、ＩＰ−１０−アン
ギオスタチンキメラは、腫瘍に対する白血球の動員に影響する免疫調節成分を含
有することが期待される。ＩＰ−１０はまた原発性腫瘍及び転移に対する効果を
有することも期待される。さらに、このキメラタンパク質は独特の薬物動態分布
及びクリアランスプロフィールを有することが期待される（Ｄｅｈｍｅｒら、Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９１，２１８８−２１９４，１９９５；Ｔａｎａｋａら
、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，３，４３７−４４２，１９９７）。

【００２０】第二のクラスの機序は、同一の細胞に対する受容体結合によるものではなく、
キメラタンパク質が２つの成分それぞれと比較した場合より改善されたｉｎｖ
ｉｖｏ特性を有するところにある。このことは生物分布又は半減期における変化
の結果である可能性がある。他には、１つ又はそれ以上の受容体に対するキメラ
の結合性、薬物動態又は取込みが好ましいやり方で変化している。これらのタン
パク質は、相補的な機序を介して作用するの可能性がある。従って、抗増殖活性
及び抗血管形成活性を含有するキメラタンパク質は、２つの異なる機序を用いる
ことによって改善された抗腫瘍活性をもたらし、腫瘍増殖を減少させる可能性が
ある。抗血管形成因子が急速な腫瘍増殖に必要とされる血管新生の増殖を妨げる
ことにより間接的に作用するのに対し、抗増殖部分は腫瘍に直接作用してその増
殖を減少させる。この機序の１例にはアンギオスタチン／ＩＦＮαキメラが含ま
れ得る。発明の要約本発明の新規なタンパク質は以下の式によって表され：Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｒ₁及びＲ₁ −Ｒ₁ ここで、Ｒ₁は修飾されたヒトアンギオスタチンのアミノ酸配列であり、Ｒ₂は修飾されたエンドスタチン、ヒトＩ型インターフェロン、トロンボスポンジン又はそのフラグメント、インターフェロン誘導性タンパク質１０、血小板因
子４及び同様の活性をもったタンパク質であり、Ｌ₁はＲ₁をＲ₂に連結し得るリンカーであり、前記タンパク質は所望により（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）、（メチオニン ^-2 、アラニン^-1）、（セリン^-1）、（メチオニン^-2、セリン^-1）、（システイン ^-1 ）又は（メチオニン^-2、システイン^-1）によって直前に先行され得る。

【００２１】好ましくは、Ｒ₁は、アンギオスタチンＫ１、アンギオスタチンＫ５、アンギオスタチンＫ１−Ｋ３、アンギオスタチンＫ１−Ｋ４又はそれらの機能的相同体
からなる群から選択される。

【００２２】好ましくは、Ｒ₂は、インターフェロンαＡ／Ｄ及びインターフェロンα２ｂからなる群から選択される。さらにより好ましくは、Ｒ₂は、インターフェロンα２ａ、インターフェロン α２ｂ、インターフェロンαハイブリッドＡ／Ｄ、Ｉ型インターフェロン変異体
及びコンセンサスインターフェロン又はそれらの機能的相同体又は変異タンパク
質からなる群から選択される。

【００２３】さらに、本発明は、この多機能タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
む組換え発現ベクター、関連する微生物及び真核細胞の発現系、及び多機能タン
パク質の製造法に関する。本発明は、多機能タンパク質を含有する医薬組成物及
び多機能タンパク質を使用する方法にも関する。定義「多機能タンパク質」という用語は、２種の異なる活性を本来的に有する単一
のポリペプチドを意味する。本発明の文脈では、抗血管形成活性及び／又は抗腫
瘍活性が考慮される。ポリペプチドは２種の異なるタンパク質又はその部分、又
は同一タンパク質の２コピー又はその部分の共有結合によって形成され得る。

【００２４】「抗腫瘍」という用語は、腫瘍の増殖をｉｎｖｉｖｏで遅延又は停止させる
か又はそれを殺す、又は他のやり方でそれを害する活性を有することを意味する
。

【００２５】「ネイティブな配列」という用語は、遺伝子又はタンパク質の野生型又は元の
形態に同一であるアミノ酸又は核酸の配列に言及する。「突然変異アミノ酸配列」、「突然変異タンパク質」、「変異タンパク質」、
「ムテイン」又は「突然変異ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の付加、欠
失、置換又はその３つすべてによりネイティブな配列から変化しているか、又は
ネイティブな配列から派生した意図的に製造した変異体由来のヌクレオチド配列
によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに言及する。

【００２６】「アンギオスタチン」という用語は、抗血管形成活性を有するプラスミノーゲ
ンのＨ鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）のタンパク質フラグメントを意味する。
前記フラグメントの活性は、血管形成に関するマウス角膜マイクロポケットアッ
セイ又は内皮細胞増殖のｉｎｖｉｔｒｏ阻害によって定量され得る。

【００２７】「クリングル」又は「Ｋ」という用語は、ジスルフィド結合したシステイン残
基によってつながっていて、プラスミノーゲン全体の中でとるものに似た構造を
保持する、プラスミノーゲン又はアンギオスタチンのフラグメント又は基礎構造
を意味する。クリングルドメインはまた、他のクリングルドメインとそれを連結
させるのに役立つクリングル内配列を包含し得る。Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ
５という用語は特定のクリングルドメインに言及し、例えばＫ１−３又はＫ２−
４のような用語は、クリングル間配列を包含する、最初のクリングルから最後の
クリングルに至る連続したタンパク質セグメントに言及する。

【００２８】「インターフェロン」という用語は、Ｉ型インターフェロン、Ｉ型インターフ
ェロン変異体、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフ
ェロンαハイブリッドＡ／Ｄ、コンセンサスインターフェロン、それらの機能的
相同体、及びＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２９及びＳＥＱＩＤＮＯ：３１に関連したＤＮＡ配列によって
コードされるものを包含する、抗ウイルス及び抗腫瘍活性を有するタンパク質の
群の１つを包含する。

【００２９】「トロンボスポンジン」という用語は、トロンボスポンジン及び抗血管形成活
性を有するトロンボスポンジンの内部フラグメントと同一であるか又は実質的に
同一であるタンパク質を意味する。発明の詳細な説明本発明は、２種の異なる活性を本来的に有する多機能タンパク質（ＭＦＰ）を
網羅する。本発明の文脈では、抗血管形成活性及び／又は抗腫瘍活性が考慮され
る。ポリペプチドは２種の異なるタンパク質又はその部分の共有結合によって形
成され得る。それぞれの異なるタンパク質セグメントは、相補的な生物学的活性
を発動するために、異なる特定の細胞受容体を介して作用し得る。ＭＦＰはまた
同一のタンパク質から派生して共有結合したポリペプチドからも形成され得る。
ペプチド結合したキメラ融合タンパク質本発明の新規化合物は以下の群から選択される式によって表される：Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｒ₂、Ｒ₂−Ｒ₁、Ｒ₁−Ｒ₁ ここでＲ₁及びＲ₂は上記の定義通りである。

【００３０】Ｒ₂は、好ましくはＲ₁とは異なるが相補的な活性をもったタンパク質又はタン
パク質フラグメントである。相補的な活性とは、もう１つの細胞モジュレーター
に対する応答を増強又は変化させる活性であることを意味する。Ｒ₁ポリペプチドは直接又はリンカーセグメントを介してＲ₂ポリペプチドに結合している。「直接」という用語は、ポリペプチドがペプチドリンカー無しで結合している多機
能タンパク質を定義する。従って、Ｌ₁は、Ｒ₁及びＲ₂がいずれもフレーム結合した（joined in frame）化学結合又はポリペプチドセグメントを表す。最も一般的には、Ｌ₁は、Ｒ₁及びＲ₂がアミド結合によって結合される直鎖のペプチドであり、Ｒ₁のカルボキシ末端がＬ₁のアミノ末端に連結し、Ｌ₁のカルボキシ末端がＲ₂のアミノ末端に連結している。「フレーム結合した」とは、Ｒ₁及びＲ₂ をコードするＤＮＡのリーディングフレーム間に翻訳終止又は妨害部分がないこ
とを意味する。

【００３１】さらに、本発明は、修飾されたＲ₁又はＲ₂分子、又はこれらＲ₁又はＲ₂分子を
コードする突然変異したか又は修飾されたＤＮＡ配列の使用を網羅する。本発明
はまた、Ｒ₁又はＲ₂が変異体である多機能タンパク質を包含する。

【００３２】結合基（Ｌ₁）は、一般に１〜５００アミノ酸の長さのポリペプチドである。２つの分子を結合するリンカーは、好ましくは、（１）２つの分子を折り込んで
それぞれ独立に作用することを可能にする、（２）２つのタンパク質の機能ドメ
インに干渉し得る秩序立った二次構造に発展する傾向を有さない、（３）機能タ
ンパク質ドメインと相互作用し得る最少の疎水特性を有する、及び（４）Ｒ₁及びＲ₂が単一細胞上のそれぞれの対応受容体と同時に相互作用し得るようにＲ₁と
Ｒ₂を立体的に分離させるように設計されている。典型的には、柔軟なタンパク質領域の表面アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを包含する。Ｇｌｙ、Ａｓ
ｎ及びＳｅｒを含有するアミノ酸配列ならばどんな順序にしても上記のリンカー
配列の判定基準を満たすと考えられる。Ｔｈｒ及びＡｌａのような他の中性アミ
ノ酸もリンカー配列に使用され得る。多機能タンパク質の構築を促進するために
リンカー配列に独自の制限部位を追加することによって、追加のアミノ酸もリン
カーに包含され得る。

【００３３】本発明の好ましいＬ₁リンカーは、以下の式の群から選択される配列を包含する：（Ｇｌｙ³Ｓｅｒ）ⁿ （ＳＥＱＩＤＮＯ：８８）、（Ｇｌｙ⁴Ｓｅｒ）ⁿ （ＳＥＱＩＤＮＯ：８９）、（Ｇｌｙ⁵Ｓｅｒ）ⁿ （ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）、（ＧｌｙⁿＳｅｒ）ⁿ （ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）又は（ＡｌａＧｌｙＳｅｒ）ⁿ （ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）高度に柔軟なリンカーの１例は、繊維状バクテリオファージ、例えばバクテリ
オファージＭ１３又はｆｄのｐＩＩＩタンパク質内に存在するグリシン及びセリ
ンリッチなスペーサー領域である（Ｓｃｈａｌｌｅｒら、ＰＮＡＳＵＳＡ７
２：７３７−７４１，１９７５）。この領域は、ｐＩＩＩ表面タンパク質の２つ
のドメイン間にある長くて柔軟なスペーサー領域をもたらす。このスペーサー領
域は以下のアミノ酸配列からなる：

【００３４】

【化１】

【００３５】本発明はまた、エンドペプチダーゼ認識配列が包含されるリンカーを包含する
。そのような開裂部位は、多機能タンパク質の各成分がｉｎｖｉｔｒｏで適切
に折り込まれていて活性であるかどうかを決定するためにそれらを分離するのに
有用であり得る。様々なエンドペプチダーゼの例は、限定しないが、プラスミン
、エンテロキナーゼ、カリクレイン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性
化因子、クロストリパイン、キモシン、コラゲナーゼ、ラッセルマムシ毒プロテ
アーゼ、プロリン後開裂酵素、Ｖ８プロテアーゼ、トロンビン及びＸａ因子を包
含する。

【００３６】免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＥのＨ鎖のヒンジ領
域由来のペプチドリンカーセグメントは、付着したポリペプチドの間に角度のあ
る関係を提供する。特に有用なのは、システインがセリンに置換されているヒン
ジ領域である。本発明の好ましいリンカーは、システインがセリンに変化したマ
ウスＩｇＧ−γ２ｂヒンジ領域由来の配列を包含する。これらリンカーはまたエ
ンドペプチダーゼ開裂部位も包含し得る。そのようなリンカーの例は以下の配列
を包含する：

【００３７】

【化２】

【００３８】しかしながら、本発明は、利用されるリンカー配列の形態、サイズ又は数によ
っては制限されない。リンカーについての唯一の必要条件は、多機能タンパク質
の分子それぞれの折り込み及び機能に機能的に干渉しない、ということである。

【００３９】多機能タンパク質の精製又は同定を促進するための追加ペプチド配列（例、ポ
リ−Ｈｉｓ）もリンカーに加え得る。特定のモノクローナル抗体による他機能タ
ンパク質の迅速アッセイ及び簡便な精製を可能にし得る、高度に抗原性のペプチ
ドも加え得る。

【００４０】本発明の多機能タンパク質は、単一因子と比較したときに同等又はそれ以上の
生物学的活性を有する、改善された半減期又は減少した有害な副作用、又はこれ
らの組み合わせを有するといった、有用な特性を示し得る。

【００４１】活性をほとんど又は少しも有さない多機能タンパク質は、免疫学又は免疫療法
に使用される抗体の産生用の抗原として、遺伝子プローブとして又は他の有用な
ムテインを構築するために使用される中間体として有用であり得る。

【００４２】本発明の多機能タンパク質の生物学的活性は、腫瘍細胞増殖アッセイ、内皮細
胞増殖アッセイ、内皮細胞遊走アッセイ、内皮細胞管形成アッセイ、マウス角膜
マイクロポケット血管形成アッセイ及び腫瘍増殖アッセイによって定量し得る。
ルイス肺癌アッセイ（ＳｕｇｉｕｒａとＳｔｏｃｋ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，
１５：３８−５１，１９５５；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ，Ｍａｓｓ．）７９（２）：３１５−３２８，１９９４）のようなマウスの
腫瘍増殖の同系モデル、及びヒト乳癌、前立腺癌又は黒色腫細胞系を使用するヌ
ード又はＳＣＩＤマウスにおけるヒト腫瘍の異種移植片モデルも使用される（Ｐ
ｒｉｃｅ，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｒｅａ
ｔｍｅｎｔ，３９：９３−１０２，１９９６；Ｓａｓａｋｉら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ
．５５：３５５１−３５５７，１９９５；Ｐｒｅｔｌｏｗら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．
５１：３８１４−３８１７，１９９１；Ｐａｓｓａｎｉｔｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ，５１：３１８−３２４，１９９２；Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍ
ａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９：２０１８−２０２２，１９９
２）。

【００４３】それぞれのタンパク質サブユニットの生物学的活性は、特定のアッセイを使用
して実施され得る。例えば、インターフェロンの抗ウイルス活性は、水疱性口内
炎ウイルスに感染したＭａｄｉｎＤａｒｂｙウシ腎臓細胞に対するインターフ
ェロン調製物の力価を検定することによって実施され得る（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉ
ｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７（２）：７５５−７５８，１９８１）。

【００４４】本発明の多機能タンパク質は、単一作用性の抗血管形成又は抗腫瘍性タンパク
質に比較したときに、改善された治療プロフィールを有し得る。例えば、本発明
のある多機能タンパク質は、他の抗腫瘍タンパク質に比較して同等又はより強力
な抗腫瘍活性を有しても同等又は対応して増加する副作用を有さない場合がある
。治療ターゲット本発明の多機能タンパク質は、癌、糖尿病性網膜症及び黄斑変性のような血管
形成介在性疾患の治療に有用であり得る。本発明のポリペプチドを用いた処置に
感受性のある癌には、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、
腎癌、膀胱癌、黒色腫、肝腫瘍、肉腫及びリンパ腫がある。

【００４５】本発明は、改善された生物学的活性を有する多機能タンパク質を利用する方法
を提供するという点で、固形癌を治療する既存の方法に対する改良を提供する。
本発明の上記多機能タンパク質で腫瘍を治療的に処置することは、現在利用し得
る薬剤を用いた治療によって引き起こされる所望されない副作用を回避し得る。
固形癌の治療は、多機能タンパク質を含有する医薬組成物の患者への投与を包含
し得る。

【００４６】本発明の他の側面は上記の病態を治療するための方法及び治療用組成物である
。そのような組成物は、製剤的に許容される担体とともに本発明の１種又はそれ
以上の多機能タンパク質の治療有効量を含む。組成物はまた、化学療法剤又は免
疫療法剤のような補助薬剤を含有する混合剤であり得る。この組成物は、腸管外
、静脈内又は皮下から投与し得る。経鼻及び経皮ルート、及び吸入を包含する、
他の投与経路も考慮される。投与されるとき、本発明に使用される治療用組成物
は、好ましくは発熱物質のない、腸管外投与が許容される水溶液の形態である。
適切なｐＨ、等張性、安定性等を有するそのような腸管外投与が許容されるタン
パク質溶液を調製することは、当技術分野のなかにある。

【００４７】上記病態の治療法に関わる処方用量は、薬物の作用を変化させる様々な要因、
例えば患者の状態、体重、性及び食事、感染症の重症度、投与時間及び他の臨床
要因を考慮する担当医によって決定され得る。一般に、多機能タンパク質の１日
投与量は、約１．０μｇ／ｋｇ体重であり得る。用量はある一定の多機能タンパ
ク質の活性により調整されるので、処方用量が０．１マイクログラム／ｋｇ体重
／日ほどの低さ又は１００ミリグラム／ｋｇ体重／日ほどの高さを包含し得ると
しても不合理ではない。

【００４８】さらに、多機能タンパク質の用量が０．２〜１００，０００マイクログラム／
ｋｇ体重より高いかまたは低いように調整され得る特殊な状況も存在し得る。こ
れには他の抗血管形成又は抗腫瘍タンパク質又は変異体との同時投与、化学療法
剤又は免疫療法剤のような補助薬剤との同時投与、化学療法剤及び／又は放射線
との同時投与；グリコシル化多機能タンパク質の使用；及び本節のはじめに述べ
た患者関連の様々な問題が含まれる。上記のように、治療法及び組成物はまた他
のヒト抗腫瘍タンパク質との同時投与も包含する。

【００４９】他の適切な抗血管形成又は抗腫瘍性の薬剤又は療法の非限定的なリストには、
化学療法、放射線療法、ホルモン療法又はインターロイキン−２又はそれらの組
み合わせが含まれる。上記の用量は、治療用組成物のそのような追加成分の代償
となるために調整され得る。

【００５０】多機能タンパク質の患者へのデリバリーは遺伝子治療を介しても実施され得る
。遺伝物質を宿主細胞へ導入するには、当業者に知られた様々な方法がある。治
療用遺伝子を原発性の細胞へ導入するためのウイルス性及び非ウイルス性ベクタ
ーが数多く開発されている。ウイルスをベースとするベクターには、複製欠失組
換えレトロウイルス（Ｂｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅとＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１０２−１０９，１９９３；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａ
ｗｒｉｅとＴｅｍｉｎ，Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．
７１６：５９−７１，１９９４；Ｍｉｌｌｅｒ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１−２４，１９９２）及び複製欠失
組換えアデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６
１６−６２９，１９８８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６，１９９２；ＢｒｏｄｙとＣ
ｒｙｓｔａｌ，Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９
０−１０３，１９９４）が含まれる。非ウイルスベースのベクターには、タンパ
ク質／ＤＮＡ複合体（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら、ＰＮＡＳＵＳＡ９０：２１２
２−２１２６，１９９３；Ｃｕｒｉｅｌら、ＰＮＡＳＵＳＡ８８：８８５０
−８８５４，１９９１；Ｃｕｒｉｅｌ，Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．７１６：３６−５８，１９９４）、エレクトロポレーション及びカ
チオン性リポソーム（Ｆａｒｈｏｏｄら、Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．７１６：２３−３５，１９９４）のようなリポソーム介在性デリ
バリーが含まれる。多機能タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び発現本発明はまた、多機能タンパク質をコードするＤＮＡ配列、実質的に同等で実
質的に同一の機能を果たすＤＮＡ配列、及び本発明の多機能タンパク質をコード
するＤＮＡと遺伝暗号の縮重性によってのみ異なるＤＮＡ配列を包含する。本発
明にまた含まれるのは、突然変異ＤＮＡを構築するために使用されるオリゴヌク
レオチド中間体及びこれらオリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ドである。

【００５１】当技術分野の標準である遺伝子工学技術（米国特許第４，９３５，２３３号及
びＳａｍｂｒｏｏｋら、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）が本発明のＤＮＡ配列の構築に使用され得る。そ
のような方法の１つにカセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ３４：
３１５−３２３，１９８５）があるが、ここでは、プラスミド内のコード配列の
一部が２つの制限部位間の遺伝子部分で所望のアミノ酸置換をコードする合成オ
リゴヌクレオチドに置換されている。

【００５２】所望の遺伝子をコードする相補的な合成オリゴヌクレオチドの対を作って、お
互いにアニールすることが可能である。このオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は
、配列が置換された及び／又は欠失したものを除き、所望される遺伝子のアミノ
酸配列をコードする。

【００５３】プラスミドＤＮＡは選択された制限エンドヌクレアーゼで処置し、次いでアニ
ールされたオリゴヌクレオチドへ連結することができる。連結された混合物を使
用して、適当な抗生物質への耐性に向けて大腸菌コンピテント細胞を形質転換す
ることができる。単一コロニーを摘出し、所望の遺伝子を有するプラスミドを同
定するためにプラスミドＤＮＡを制限分析及び／又はＤＮＡ配列決定によって試
験することが可能である。

【００５４】新規の多機能タンパク質をコードするＤＮＡ配列のクローニングは、中間ベク
ターの使用により達成し得る。他のやり方では、ある遺伝子を他の遺伝子を含有
するベクターへ直接クローン化することができる。リンカーとアダプターは、Ｄ
ＮＡ配列をつなげるだけでなく、関心対象領域の内側に制限部位があった失われ
た配列を置換するために使用され得る。従って、１つのポリペプチド、ペプチド
リンカー及び他のポリペプチドをコードする遺伝物質（ＤＮＡ）を、細菌、酵母
、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を形質転換するために使用される好適な発現ベクタ
ーへ挿入し得る。形質転換された生物体又は細胞系を生育し、標準技術によって
タンパク質を単離する。従って、得られた生成物は、第一のタンパク質の全部又
は一部とリンカー領域によってつながった第二のタンパク質の全部又は一部を有
する新しいタンパク質である。

【００５５】本発明のもう１つの側面は、上記の新規多機能タンパク質の発現に使用される
プラスミドＤＮＡベクターを包含する。これらベクターは、本発明のポリペプチ
ドをコードする上記の新規ＤＮＡ配列を含有する。多機能タンパク質を発現し得
る微生物又は細胞系を形質転換することができる適切なベクターは、使用される
宿主細胞により選択される転写及び翻訳の調節配列と結合した多機能タンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。

【００５６】上記のような修飾された配列を取込んだベクターは本発明に包含され、多機能
タンパク質の生産に有用である。この方法に利用されるベクターはまた、本発明
のＤＮＡコード配列と機能的に連結し、選択された宿主細胞においてその複製及
び発現を指示し得る、選択された調節配列を含有する。

【００５７】新規多機能タンパク質の製造法は、本発明のもう１つの側面である。本発明の
方法は、新規多機能タンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列を含有するベクタ
ーで形質転換された、好適な細胞又は細胞系を培養することを含む。好適な細胞
又は細胞系は細菌細胞であり得る。例えば、様々な大腸菌株がバイオテクノロジ
ー分野の宿主細胞としてよく知られている。そのような菌株の例には大腸菌株の
ＪＭ１０１（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ３３：１０３−１１
９，１９８５）及びＭＯＮ１０５（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚら、ＡｐｐｌｉｅｄＥ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５８：１５１１−１５
２３，１９９２）が含まれる。本発明にまた含まれるのは、バクテリオファージ
Ｍｕ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ１２６：２５−３３，１９９３）に基づ
いた大腸菌の染色体発現ベクターを利用する多機能タンパク質の発現である。様
々なＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）の株もこの方法に利用し得る。当業者に知
られている多くの酵母細胞系も本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞として
利用できる。

【００５８】大腸菌の細胞質で発現されるとき、本発明の多機能タンパク質をコードする遺
伝子はまた、Ｍｅｔ^-2−Ａｌａ^-1、Ｍｅｔ^-2−Ｓｅｒ^-1、Ｍｅｔ^-2−Ｃｙｓ^-1又
はＭｅｔ^-1をタンパク質のＮ末端においてコードするようにこの遺伝子の５’末
端へコドンを追加するように構築され得る。大腸菌の細胞質で作られるタンパク
質のＮ末端は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＢｅｎＢａｓｓａｔら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１〜７５７，１９８７）及びあるいは他のペ
プチダーゼにより、発現と同時にメチオニンがＮ末端から開裂されるような翻訳
後プロセシングにより影響される。本発明の多機能タンパク質は、Ｍｅｔ^-1、Ａ
ｌａ^-1、Ｓｅｒ^-1、Ｃｙｓ^-1、Ｍｅｔ^-2−Ａｌａ^-1、Ｍｅｔ^-2−Ｓｅｒ^-1又はＭ
ｅｔ^-2−Ｃｙｓ^-1をＮ末端に有する多機能タンパク質／ポリペプチドを包含し得
る。これら突然変異多機能タンパク質はまた、分泌シグナルペプチドをＮ末端に
融合させることによって大腸菌で発現され得る。このシグナルペプチドは分泌プ
ロセスの一部としてポリペプチドから開裂される。

【００５９】本発明の使用にまた適しているのは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞のような哺乳動物の細胞である。哺乳動物の細胞で異種遺伝子を発現させる
一般的な方法については、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９８７，“Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄ
ｓ”，Ｖｏｌ．９，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編、プレナムプレス、ニューヨーク、
に論じられている。多機能タンパク質のコード領域と翻訳的につながっている真
核性の分泌シグナルペプチドコード領域の転写が、哺乳動物の細胞において機能
し得る強いプロモーターによって推進される発現ベクターが構築される。例えば
、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＲＳＶ及びｐＲｃ／ＣＭＶのようなプラス
ミド（インビトロジェン社、サンディエゴ、カリフォルニアより入手）が使用さ
れ得る。真核性の分泌シグナルペプチドコード領域は、遺伝子そのものに由来し
得るか、又は別の分泌される哺乳類タンパク質から由来し得る（Ｂａｙｎｅ，Ｍ
．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２６３８−
２６４２，１９８７）。この遺伝子を含有するベクターを構築した後で、ベクタ
ーＤＮＡはＣＯＳ７、Ｈｅｌａ、ＢＨＫ、ＣＨＯ又はマウスＬ系のような哺乳動
物細胞へトランスフェクトされる。この細胞は、例えばＤＭＥＭ培地（ＪＲＨサ
イエンティフィック）において培養され得る。培地へ分泌されるポリペプチドは
、細胞トランスフェクション後、又は抗生物質耐性に対する選択により安定な細
胞系が確立された後２４〜７２時間の一過性発現から標準的な生化学的アプロー
チによって回収され得る。好適な哺乳動物の宿主細胞の選択及び形質転換、培養
、増殖、スクリーニング及び生成物の産生及び精製の方法は当技術分野で知られ
ている。例えば、ＧｅｔｈｉｎｇとＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：
６２０−６２５，１９８１；又は別のやり方では、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５（７）：１７５０−１７５９，１９８５；又はＨｏｗ
ｌｅｙら、米国特許第４，４１９，４４６号を参照のこと。他の好適な哺乳動物
の細胞系はサルのＣＯＳ−１細胞系及びＣＶ−１細胞系である。

【００６０】所望されるならば、本発明の方法における宿主細胞として昆虫細胞を利用し得
る。例えば、Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．Ｊ．Ｌ．Ｃｌ
ｅｌａｎｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ニューヨーク、ＮＹ：１８３−２１８及
び本明細書に引用される参考文献を参照のこと。さらに、バキュロウイルスベク
ターを使用して昆虫細胞で異種遺伝子を発現させる一般的な方法が、Ｏ’Ｒｅｉ
ｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒら、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．
ニューヨーク、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー社、１９９２及びＫｉ
ｎｇ，Ｌ．Ａ．とＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，ＴｈｅＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｕｉｄｅ，
ロンドン、チャップマン・アンド・ホールに記載されている。強いバキュロウイ
ルスプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）が、多機能タンパク質
のコード領域と翻訳的につながっている真核性の分泌シグナルペプチドコード領
域の転写を推進するバキュロウイルス導入ベクターを含む発現ベクターが構築さ
れる。例えば、プラスミドｐＶＬ１３９３（インビトロジェン社、サンディエゴ
、カリフォルニアより入手）が使用され得る。多機能タンパク質をコードする遺
伝子を担うベクターを構築した後、このＤＮＡの２マイクログラムをバキュロウ
イルスＤＮＡの１マイクログラムとともにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐ
ｅｒｄａの昆虫細胞、Ｓｆ９系へ同時トランスフェクトする。他のやり方では、
Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ^TM ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ライフテクノ
ロジー社、ロックビル、ＭＤ）として販売されているバキュロウイルスのシャト
ルベクターシステム（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（８）
：４５６６−４５７９，１９９３）を使用して、組換えバキュロウイルスを創出
し得る。多機能タンパク質を担う純粋な組換えバキュロウイルスを使用して、例
えばＥｘｃｅｌｌ４０１無血清培地（ＪＲＨバイオサイエンス、レネキサ、カン
サス）又はＳｆ９００−ＩＩ（ライフテクノロジー社）において培養される細胞
に感染させる。培地に分泌される多機能タンパク質は標準的な生化学アプローチ
によって回収し得る。多機能タンパク質を発現する哺乳動物又は昆虫の細胞に由
来する上澄液を、数多くの市販濃縮ユニットのいずれかを使用してまず濃縮し得
る。

【００６１】以下の実施例は本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら特定の実施例
に限定されないことがわかるだろう。本開示を読んだ当業者には、本発明の精神
及び範囲に逸脱しない他の様々な実施例が明らかであろう。そのような他の実施
例はすべて付帯された特許請求の範囲内に包含されると考えられる。材料と方法一般法クローニング、発現及びタンパク質の特徴付けに関する一般的な方法は、Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８２；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；及び参照により本明細書に組
込まれている本明細書に引用される参考文献に見出される。

【００６２】特に断らなければ、スペシャルティケミカルはすべてシグマ社（セントルイス
、ＭＯ）から入手した。制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼはニュ
ーイングランドバイオラボ社（ビバリー、ＭＡ）又はベーリンガーマンハイム（
インディアナポリス、ＩＮ）から入手した。大腸菌株の形質転換ＤＨ５α^TM（ライフテクノロジーズ社、ゲイサースブルグ、ＭＤ）及びＴＧ１
（アマーシャム社、アーリントンハイツ、ＩＬ）のような大腸菌株（表１）を連
結反応の形質転換のために使用し、ＪＭ１０１（ＹａｎｉｓｃＨ−Ｐｅｒｒｏｎ
ら、Ｇｅｎｅ，３３：１０３−１１９，１９８５）及びＭＯＮ１０５（Ｏｂｕｋ
ｏｗｉｃｚら、Ａｐｐｌ．ａｎｄＥｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒ．，５８：１５１１−
１５２３，１９９２）のような大腸菌株を本発明の多機能タンパク質を細胞質又
は細胞周辺腔において発現させるために使用し得る。

【００６３】

【表１】

【００６４】ＤＨ５α^TMサブクローニング効率細胞がコンピテント細胞として購入され、製
造業者のプロトコールを使用する形質転換用に供されるのに対し、大腸菌株ＴＧ
１及びＭＯＮ１０５は、ＣａＣｌ₂法を使用して、ＤＮＡを取込めるコンピテントな細胞へされる。典型的には、２０〜５０ｍＬの細胞を、ボシュロム（ロチェ
スター、ＮＹ）スペクトロニック分光光度計で測定して６００ナノメーターでの
光学密度（ＯＤ６００）が約１．０の密度になるまでＬＢ培地（１％バクトトリ
プトン、０．５％バクト−酵母抽出物、１５０ｍＭＮａＣｌ）において生育さ
せる。遠心分離によって細胞を回収し、１／５培養液量のＣａＣｌ₂溶液（５０ｍＭＣａＣｌ₂，１０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ７．４）で再懸濁し、３０分間４℃に保つ。再び遠心分離によって細胞を回収し、１／１０培養液量のＣａＣｌ ₂ 溶液に再懸濁する。この細胞０．２ｍＬへ連結ＤＮＡを加え、このサンプルを３０〜６０分間４℃に保つ。このサンプルを２分間４２℃へ移し、ＬＢ１．０ｍ
ｌを加えた後、３７℃で１時間振盪する。このサンプル由来の細胞を、アンピシ
リン（１００マイクログラム／ｍＬ，μｇ／ｍＬ）［アンピシリン耐性の形質転
換体を選択するとき］かスペクチノマイシン（７５μｇ／ｍＬ）［スペクチノマ
イシン耐性の形質転換体を選択するとき］のいずれかを含有するプレート（ＬＢ
培地＋１．５％バクト−寒天）へ播く。プレートを一晩３７℃でインキュベート
する。

【００６５】コロニーを摘出し、適切な抗生物質（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ又はスペ
クチノマイシン７５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢへ接種して、振盪しながら３７℃で
増殖させる。

【００６６】クローニング及び発現ＤＮＡの単離と特徴付けプラスミドＤＮＡは数多くの異なる方法によって、当業者に知られている市販
キットを使用して単離され得る。プラスミドＤＮＡは、プロメガ社（マジソン、
ＷＩ）のＷｉｚａｒｄ^TM Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット又はキアジェン（Ｑｉａｇｅ
ｎ，チャツワース、ＣＡ）のＱＩＡｗｅｌｌＰｌａｓｍｉｄ単離キット又はＱ
ｉａｇｅｎＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉ又はＭｉｎｉキットを使用して単離され
る。これらキットはプラスミドＤＮＡ単離の一般的な方法に準拠している。簡略
に言うと、遠心分離（５０００ｘｇ）によって細胞をペレットにし、連続的なＮ
ａＯＨ／酸処理によってプラスミドＤＮＡを遊離させ、遠心分離（１００００ｘ
ｇ）によって細胞の破片を除去する。（プラスミドＤＮＡを含有する）上澄液を
ＤＮＡ結合性の樹脂を含有するカラムへのせ、カラムを洗浄し、プラスミドＤＮ
Ａを溶出させる。関心対象のプラスミドを有するコロニーをスクリーニングした
後、適切な抗生物質を含むＬＢ５０〜１００ｍｌへ大腸菌細胞を接種して、空気
インキュベーターにおいて振盪させながら３７℃で一晩増殖させる。精製したプ
ラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ配列の決定、制限酵素によるさらなる消化、ＤＮＡフ
ラグメントの追加サブクローニング及び大腸菌、哺乳動物細胞又は他の細胞型へ
のトランスフェクションのために使用され得る。配列決定精製したプラスミドＤＮＡをｄＨ₂Ｏに再懸濁し、ボシュロムスペクトロニック６０１ＵＶ分光光度計における２６０／２８０ｎｍでの吸光度を測定してその
濃度を定量する。ＤＮＡサンプルは、製造業者の推奨プロトコール（通常、配列
決定用の混合物へ５％ＤＭＳＯを加える変更がなされる）に基づいて、ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ^TM ＤｙｅＤｅｏｘｙ^TMターミネーター（パーキンエルマー社、リン
カーンシティ、ＣＡの応用バイオシステム部）配列決定用化学キット（部品番号
４０１３８８又は４０２０７８）を使用して配列を決定する。配列決定用の反応
は、推奨された増幅条件に従って、ＤＮＡ熱サイクラー（パーキンエルマー社、
ノーウォーク、ＣＴ）において実施される。サンプルを精製し、Ｃｅｎｔｒｉ−
Ｓｅｐ^TMスピンカラム（プリンストンセパレーションズ、アデルフィア、ＮＪ）
で過剰なダイターミネーターを除去し、凍結乾燥する。蛍光色素標識した配列決
定反応液を脱イオン化ホルムアミドに再懸濁し、ＡＢＩモデル３７３Ａ及びモデ
ル３７７自動化ＤＮＡシークエンサーを使用して、変性４．７５％ポリアクリル
アミド−８Ｍ尿素ゲルにて配列決定する。重複しているＤＮＡ配列フラグメント
は、シークエンサーＤＮＡ分析ソフトウェア（ジーンコード社、アンアーバー、
ＭＩ）を使用して分析し、マスターＤＮＡコンティグへ組立てられる。哺乳動物細胞のトランスフェクション／ならし培地の生産ＢＨＫ−２１細胞系はＡＴＣＣ（ロックビル、ＭＤ）から入手し得る。細胞は
、２ｍＭ・Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベ
ッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ／高グルコース）で培養する。この組成は増殖
培地として表される。選択培地は、４５３ユニット／ｍＬのヒグロマイシンＢ（
カルビオケム、サンディエゴ、ＣＡ）を補充したＢＨＫ増殖培地である。ＢＨＫ
−２１細胞系はＨＳＶトランス活性化タンパク質ＶＰ１６（プラスミドｐＭＯＮ
３３５９及びｐＭＯＮ３６３３上にあるＩＥ１１０プロモーター及びｐＭＯＮ３
３６０Ｂに存在するＩＥ１７５プロモーターをトランス活性化する）ですでに安
定的にトランスフェクトされた（Ｈｉｐｐｅｎｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１０３７−１０４１，１９９３を参照のこと）。ＶＰ１６
タンパク質はＩＥ１１０又はＩＥ１７５の背後に挿入された遺伝子の発現を促進
する。トランス活性化タンパク質ＶＰ１６を発現するＢＨＫ−２１細胞は、ＢＨ
Ｋ−ＶＰ１６と表される。プラスミドｐＭＯＮ１１１８（Ｈｉｇｈｋｉｎら、Ｐ
ｏｕｌｔｒｙＳｃｉ．，７０：９７０−９８１，１９９１を参照のこと）は、
ＳＶ４０プロモーター由来のヒグロマイシン耐性遺伝子を発現する。同様のプラ
スミド、ｐＳＶ２−ｈｐｈはＡＴＣＣから入手可能である。

【００６７】ＢＨＫ−ＶＰ１６細胞を培養皿あたり３ｘ１０⁵細胞で６０ミリメートル（ｍｍ）組織培養皿へまき、２４時間後にトランスフェクトする。関心対象の遺伝子
を含有するプラスミドＤＮＡ１０μｇ、ヒグロマイシン耐性プラスミドｐＭＯＮ
１１１８、３μｇ及びＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ「ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ」^TM８
０μｇを各皿に含有する「ＯＰＴＩＭＥＭ」^TM（ギブコ−ＢＲＬ、ゲイサースブ
ルグ、ＭＤ）３ｍＬにおいて１６時間、細胞をトランスフェクトする。次いで培
地を吸引し、増殖培地３ｍＬに交換する。トランスフェクション後４８時間目に
各皿から培地を回収し、活性をアッセイする（一過性ならし培地）。トリプシン
−ＥＤＴＡによって細胞を皿から除去し、１０倍希釈し、選択培地１０ｍＬを含
有する１００ｍｍ組織培養皿へ移す。選択培地で約７日後、耐性のある細胞は直
径数ミリメートルのコロニーへ生育する。コロニーをフィルター紙で皿から除去
し（コロニーと同一のサイズへ切断してトリプシン／ＥＤＴＡに浸漬する）、選
択培地１ｍＬを含有する２４穴プレートの各穴へ移す。クローンが周密状態まで
増殖した後、ならし培地を再アッセイし、ポジティブなクローンを増殖培地へ拡
大培養する。大腸菌におけるキメラの発現関心対象のプラスミドを収容している大腸菌株ＭＯＮ１０５又はＪＭ１０１を
、ニューブランズウィック・サイエンティフィック（エジソン、ＮＪ）のモデル
Ｇ２５空気インキュベーターで振盪しながら、カサミノ酸入りＭ９培地において
３７℃で増殖させる。増殖をＯＤ₆₀₀でモニターし、それが１．０の値になった時点で、最終濃度が５０μｇ／ｍＬになるようにナリジクス酸（１０ｍｇ／ｍＬ
）／０．１ＮＮａＯＨを加える。次いでこの培養液を３７℃で３〜４時間さら
に振盪する。所望される遺伝子産物の最大生産を達成するために、培養期間中は
高度の通気性を維持する。細胞に封入体（ＩＢ）が存在しているかを光学顕微鏡
で検査する。培養液の１ｍＬアリコートを分取し、ペレット化した細胞を煮沸し
、還元緩衝液でそれを処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動をしてタンパク
質含量を分析する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，１９８２を参照のこと）。培
養液は遠心分離（５０００ｘｇ）して細胞をペレットにする。

【００６８】精製封入体の単離３３０ｍＬの大腸菌培養液からの細胞ペレットを１５ｍＬの音波処理用緩衝液
（１０ｍＭ塩酸２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）１，３−プロパンジオー
ル（トリスＨＣｌ），ｐＨ８．０＋１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ））に再懸濁する。ＳｏｎｉｃａｔｏｒＣｅｌｌＤｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｗ
−３７５モデル、ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社、ファ
ーミンデール、ニューヨーク）のマイクロチッププローブを使用してこの再懸濁
された細胞を音波処理する。音波処理用緩衝液で３回音波処理してから遠心分離
して、細胞を破壊し封入体（ＩＢ）を洗浄する。第１回目の音波処理は３分バー
スト後１分バーストであり、終わり２回の音波処理はそれぞれ１分間バーストで
ある。封入体ペレットからのタンパク質の抽出及びリフォールディング全工程は４℃である。アンギオスタチンＫ１−４封入体を、６Ｍ尿素、５ｍＭ
ＤＴＴ、５０ｍＭビストリスプロパン，ｐＨ１０．８に溶かして１．２ｍｇ／ｍ
ｌとした。この溶液を２時間撹拌し、次いで６−アミノへキサン酸（１Ｍストッ
ク溶液）を加えて６ｍＭの濃度とし、さらにシスチン（０．２Ｍストック溶液、
ｐＨ１０．５）を加え１ｍＭとした。これを５分間撹拌し、次いで７５ｍＭビス
−トリスプロパンを加えてＫ１−４アンギオスタチンを０．２ｍｇ／ｍｌへ希釈
した。次いでそれを７２時間撹拌してタンパク質のリフォールディングを完了さ
せた。精製アンギオスタチンＫ１−４の精製は、セファロース−Ｌｙｓアフィニティーカ
ラムに次いでＱ−セファロースクロマトグラフィーを使用して達成した。５０ｍ
ＭＮａＰＯ₄，ｐＨ８．０に対してサンプルを透析し、１μＭフィルターを通して濾過し、澄明にした。このサンプルを、５０ｍＭＮａＰＯ₄，ｐＨ８．０において平衡化したセファロース−Ｌｙｓカラムにかけた。この負荷量は樹脂１
ｍＬにつきＫ１−４約１．５ｍｇであった。カラムにかけた後、それを１カラム
容量の平衡緩衝液で洗浄し、次いで１０カラム容量の６−アミノヘキサン酸０−
８ｍＭ勾配液／５０ｍＭＮａＰＯ₄，ｐＨ８．０でＫ１−４を溶出した。

【００６９】分画をＳＤＳ−ゲル電気泳動及び／又はＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、１つ
にまとめた。このプールを４０ｍＭトリスＣｌとして、ｐＨ９．０に調整した。
次いでこれを４０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０に対して十分透析し、同緩衝液
で平衡化したＱ−セファロースＨＰカラム（タンパク質約５ｍｇ／樹脂ｍｌ）に
かけた。次いでＮａＣｌの０−０．１Ｍ勾配液／平衡化緩衝液を使用してＫ１−
４を溶出した。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び／又はＳＤＳゲル電気泳動で分画を分析し、
プールした。

【００７０】ある場合、フォールドされたタンパク質は、適切なマトリックスに付いたモノ
クローナル抗体又は受容体サブユニットのようなアフィニティー試薬を使用して
アフィニティー精製され得る。精製はまた、イオン交換、ゲル濾過又は疎水性ク
ロマトグラフィー又は逆相ＨＰＬＣのような様々なクロマトグラフィー方法を使
用して達成され得る。このようなタンパク質の精製法については、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２巻、「ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅ
ｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，ＭｕｒｒａｙＤｅｕｔｓｃｈｅｒ編、ア
カデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア、１９９０に詳しく記載され
ている。タンパク質の特徴付け精製したタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、エレクトロスプレー質量分析法及び
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。タンパク定量は、アミノ酸組成、ＲＰ−
ＨＰＬＣ及びブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク定量によってなさ
れる。ある場合は、タンパク質の同一性を確かめるために、エレクトロスプレー
質量分析法とともにトリプシンペプチドマッピングが実施される。

【００７１】生物学的アッセイヒトインターフェロン誘導性抗ウイルス活性のアッセイヒトインターフェロンによって誘導される抗ウイルス活性は、水疱性抗内炎様
ウイルス（ＶＳＶ）（ＡＴＣＣＶＲ−１５８）によるＭａｄｉｎＤａｒｂｙ
ウシ腎細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ＃２２）の感染から通常は生じる細胞変性効果の
阻害として分光光度計により測定する（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．３７（２）：７５５−７５８，１９８１）。ＶＳＶストックはマウスＬ細胞
（Ｌ９２９）（ＡＴＣＣＣＣＬ＃１）をもとに調製する。インターフェロンサ
ンプルを９６穴プレートフォーマットで系列滴定し、各穴４ｘ１０⁴個の細胞とともにインキュベートし、６時間後、細胞あたり０．１プラーク形成単位の感染
多重度でウイルスを加える。感染後２０〜２４時間において、細胞をクリスタル
バイオレットで染色し、染色度を６８０ｎｍで分光光度計により測定する。サン
プルの相対効力をイントロンＡ（シェーリングプラウ社により生産され、処方箋
により入手される組換えインターフェロン）と比較する。Ｄａｕｄｉ細胞の増殖に対する阻害効果ヒトバーキットリンパ腫のＤａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ）を９６穴組織培養プレ
ートに２ｘ１０⁴個／穴の細胞でまき、細胞を３日間、系列用量のｒｈＩＦＮα ２ｂの存在下又は不在下で培養する。培養期の最後の１時間、培養液を³Ｈ−チミジンでパルスし、³Ｈ−チミジンの取込み量（カウント／分：ｃｐｍ）をベータプレートリーダーで測定する。全サンプルを同一３検体でアッセイする。内皮細胞の増殖アッセイ内皮細胞の増殖アッセイは、Ｃａｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２
９４６１−２９４６７，１９９６）の記載のように実施した。簡略に言うと、ヒ
トの皮膚微小血管系内皮細胞（ＨｄＭＶＥＣ，クローンティクス）又はウシの微
小血管系内皮細胞（ＢａｃＥｎｄ，インセル）を、５％の熱不活性化胎仔血清（
ＦＢＳ，ハイクローン）、抗生物質、１００μｇ／ｍｌヘパリン（シグマ）及び
１００μｇ／ｍｌ内皮マイトジェン（バイオメディカルテクノロジーズ）を含有
するＭＣＤＢ１３１に維持した。２〜５回の継代で集密的単層となった細胞を０
．０５％トリプシンに分散し、完全培地に再懸濁した。１．２５ｘ１０⁴個の細胞を含有する完全培地５００μｌを、０．１％ゼラチン（シグマ）で被覆した２
４穴組織培養プレートの穴へまいた。細胞を３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした後で、５％ＦＢＳ及び様々な濃度の阻害剤を含有する培地２５０μｌ
に培地を置換した。３０分間インキュベーションした後に、１ｎｇ／ｍｌのｂＦ
ＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）を含有する培地２５０μｌを加え、細胞をさらに７２
時間インキュベートした後でトリプシン処理し、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターで計
数した。内皮細胞のｉｎｖｉｔｒｏ管形成アッセイ管形成アッセイは既報（Ｇａｔｅｌｙら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５６：４８
８７−４８９０，１９９６）のように実施する。血管形成阻害剤の効果は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏの血管形成アッセイ、即ち内皮細胞のマトリックス上の管形成にお
いて試験され得る。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ベクトン・ディクソン）を
氷上で融解し、緩衝液コントロールか試験化合物のいずれかを含有する、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン補充ＭＣＤＢ１３１培地で等量希釈した。等量希釈マトリゲル
の０．５ｍｌアリコートを２室Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋポリスチレンスライド（Ｎ
ｕｎｃ）の各穴にプレートし、少なくとも３０分間３７℃で重合化させた。ウシ
副腎皮質由来のウシ一次毛細管内皮細胞（インセルより購入）を（ウシ内皮細胞
の増殖について記載したように）培養した。トリプシン処理後、細胞を３回洗浄
し、Ｌ−グルタミン及び１％胎仔血清を補充した、緩衝液コントロールか試験化
合物のいずれかを含有するＭＣＤＢ１３１培地に、３．５ｘ１０⁵細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。内皮細胞（３．５ｘ１０⁵細胞／ｍｌの０．５ｍｌ）を、上記と同じ添加物を含有する、マトリゲルで被覆した穴上にプレートした。５％Ｃ
Ｏ₂インキュベーターにて３７℃で１６〜２４時間インキュベーションした後、培養物の管形成（発芽）を評価した。各実験条件の無作為フィールドを、ニコン
Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡下で、ニコンＮ６００６カメラを使用して写真撮影した。
次いで管の全長を測定することによってこの写真を定量化した。管形成はまたイ
メージ分析ソフトウェアを使用しても定量化し得る。内皮細胞の管ネットワーク
は、−２０℃で７〜１０分間、１００％メタノールに漬けて固定化し、リン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で４回濯ぎ、ウサギのポリクローナル抗ヒトＶＩＩＩ
因子関連抗原（フォンビルブランド因子、ｖＷＦ）（Ｄａｋｏ）とともに４℃で
一晩インキュベートした。翌日、二次抗体であるＣｙ３結合性ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｆ（ａｂ’）２特異的）（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）
で細胞を染色した。イメージ分析ソフトウェア付きコンピュータに連結した蛍光
フィルター付きニコンマイクロフォト−ＦＸＡを使用して、管形成を視覚化した
。管形成は以下のようにして測定した：内皮細胞の管に覆われている全エリア／
全内皮細胞表面エリア。内皮細胞の遊走アッセイ内皮細胞遊走アッセイは実質的に既報（Ｇａｔｅｌｙら、ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．５６：４８８７−４８９０，１９９６）のように実施する。内皮細胞の遊走
を阻害するアンギオスタチンの能力を定量するために、８ｍｍ孔サイズのポリカ
ーボネート膜を含有するトランスウェルチャンバー（コスター）において遊走ア
ッセイを実施した。このアッセイに利用した細胞は、Ｅｍｏｒｙからのヒト微小
血管内皮細胞かウシ内皮細胞（Ｇａｔｅｌｙ，ノースウェスタン大学、エバンス
トン、ＩＬの好意により提供された）のいずれかである。細胞を一晩飢餓状態に
した後、ＭＣＤＢ１３１＋０．１％ＢＳＡ（ヒトの細胞）又はＤＭＥＭ＋０．１
％ＢＳＡ（ウシの細胞）を使用し、採取し、同じ培地に１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁した。トランスウェルの下サイドを、３０分間３７℃で０．１％ゼラチンによ
り被覆した後、上サイドに２ｘ１０⁵個の細胞を加えた。このトランスウェルを、下のチャンバーに化学誘引物質（ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦ）を含有する穴へ移し
た。３７℃で一晩遊走をさせた。次いで膜を固定化して染色し、膜の下サイドへ
遊走した細胞の数を３ハイパワーフィールドで計数した。抗血管形成活性を評価するマイクロポケットアッセイ試験化合物の抗血管形成活性をマウスで評価するために、角膜マイクロポケッ
トアッセイを開発した。ＢＡＬＢｃ又はＣ５７ＢＬ系マウスをアベルチン（トリ
ブロモエタノール、１２５ｍｐｋ，０．３〜０．４ｍｌ／マウス、ｉ．ｐ．，２
５ゲージ針）で麻酔する。眼は０．５％プロパラカインで局所麻酔する。使用す
るのは片眼だけである。小鉗子を用いて眼を突出させ、手術用顕微鏡下で、＃１
５手術ナイフを用いて、外側直筋の挿入部分に平行して中心器質内の直線状角膜
切開を実施する。次いで改良白内障用ナイフ（１ｘ２０ｍｍ）を挿入して、側頭
角膜縁の１ｍｍ内へ層状のマイクロポケットを剥離する。塩基性繊維芽細胞増殖
因子又は血管内皮細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦ）のいずれかを含有する
単一Ｈｙｄｒｏｎペレットをこの眼球上に置き、鉗子の一方のアームを使ってそ
のポケット部分に押し込む。弁状の部分は自然に閉じる。抗生物質の軟膏（Ｎｅ
ｏｂａｃｉｍｙｘ）を一回塗布して感染を防ぎ、不規則な眼球表面の刺激を少な
くする。

【００７２】手術後すぐに化合物を投与する。それは、化合物のバイオアベイラビリティ及
び効力により、経口、腹膜腔内、皮下又は静脈内のいずれかで投与され得る。投
与量は、経口化合物では１日１〜３回、ｉ．ｐ．又はｓ．ｑ．では１日１〜２回
、及び尾静脈を介したｉ．ｖ．デリバリーでは１日１回、である。用量は、経口
では５ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．又はｓ．ｑ．では１０ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．では２
．５ｍｌ／ｋｇを越えない。注射はすべて２５ゲージ針を用いてなされる。

【００７３】手術後５〜６日目にマウスをアベルチン（１２５ｍｐｋ，ｉ．ｐ．）で麻酔し
、眼球を突出させ、血管新生の程度を最大血管の長さ及び関連する近接周縁ゾー
ンを定量して評価する。楕円面積の公式を使用して、新生血管の面積を測定する
。麻酔状態にある間に開胸術を施し、動物を確実に安楽死させる。眼球のいくつ
かは組織学用に除去する。化合物の血液レベルを調べるのに血液サンプルが必要
とされるならば、角膜血管新生評価の直後に心臓を穿刺してマウスを出血させる
。このことは１インチの２３ゲージ針を用いる胸骨下のアプローチを介してなさ
れ、動物はすぐに安楽死する。

【００７４】手術後動物を毎日モニターする。手術を施した眼球の刺激を緩和するためには
必要に応じてプロパラカイン局注を用いる。１匹あたりの最大出血回数は、３日
おきに４回であるが、典型的には２回だけ必要で、１回目は４〜６日目、もう１
回は終了時である。抗腫瘍活性のマウスモデルキメラタンパク質の抗腫瘍活性を評価するためには、原発性腫瘍の増殖に対す
る直接効果か転移に対する効果のいずれかについて、いくつかのマウスモデルが
使用され得る。これらは主に２つのクラスへ分類し得る：ルイス肺癌（Ｓｕｇｉ
ｕｒａとＳｔｏｃｋ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１５：３８−５１，１９５５；
Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）７９（２）：
３１５−３２８，１９９４）のようなマウス腫瘍の同系モデル、及びヌードマウ
ス又は重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植モデ
ルである。ヒト腫瘍の異種移植の例には、乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ−４３５（
Ｐｒｉｃｅ，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｒｅ
ａｔｍｅｎｔ，３９：９３−１０２，１９９６）及びＭＤＡ−２３１（Ｓａｓａ
ｋｉら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５５：３５５１−３５５７，１９９５）、ヒト前立腺
癌細胞系のＰＣ−３（Ｐｒｅｔｌｏｗら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５１：３８１４−３
８１７，１９９１；Ｐａｓｓａｎｉｔｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５１：
３１８−３２４，１９９２）及びヒト黒色腫系のＭ２１（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａ
ｂｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９：２０１８−２０２２
，１９９２）が包含される。

【００７５】

【実施例】

実施例１．インターフェロンα２ｂをコードするプラスミドの構築ｐＭＯＮ３０４２２の構築プライマーセットのＩＦスタート（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及びＩＦストッ
プ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を使用して、ＡＴＣＣクローンＮｏ．６７９７９
由来のプラスミドＤＮＡからインターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）遺伝子を
増幅した。

【００７６】

【化３】

【００７７】このプライマーは、遺伝子を発現プラスミドへクローニングすることを可能にす
る適当な制限酵素認識部位を包含するように設計された。ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）増幅の条件は３５サイクル９２℃、１分間変性、１分間４０℃でアニ
ーリング、及び１分間７２℃で延長、であった。１００μｌの反応液は、各プラ
イマー１００ピコモルと鋳型ＤＮＡ（ＱｉａｇｅｎＭｉｎｉｐｒｅｐにより単
離される）１μｇ；及び１ｘＰＣＲ反応緩衝液、２００μＭｄＮＴＰ及びＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム）０．６ユニットを含有した。
ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲ
ルで精製した。ｐｔａｃプロモーター、Ｇ１０Ｌリボソーム結合部位及びＰ２２
ターミネーターをコードするベクターｐＭＯＮ６８７５を制限エンドヌクレアー
ゼＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたＰＣＲ産物及びベクター
フラグメントを一緒にして連結させた。この連結反応液の一部分を使用して大腸
菌株ＭＯＮ２０８を形質転換した。形質転換された細菌をスペクチノマイシン含
有プレート上で選択した。正確なインサートを確かめるために、プラスミドＤＮ
Ａを単離して配列を決定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３０４２２と命名
した。ｐＭＯＮ３０４２６の構築大腸菌におけるＩＦＮα２ｂの発現を最適化するために、プライマーセットの
ＮｅｗＩＦ−Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）及びＩＦストップ（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２）を使用して、ｐＭＯＮ３０４２２由来のプラスミドＤＮＡから、最
適化されたＮ末端を有する新しい遺伝子を増幅した。

【００７８】

【化４】

【００７９】このプライマーは、遺伝子を発現プラスミドへクローニングすることを可能にす
る適当な制限酵素部位を包含するように設計された。ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）増幅の条件は３５サイクル９２℃、１分間変性、１分間４０℃でアニーリ
ング、及び１分間７２℃で延長、であった。１００μｌの反応液は、各プライマ
ー１００ピコモルと鋳型ＤＮＡ１μｇ；及び１ｘＰＣＲ反応緩衝液、２００μＭ
ｄＮＴＰ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社）０．６
ユニットを含有した。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、ゲルで精製した。ｐｔａｃプロモーター、Ｇ１０Ｌリボソー
ム結合部位及びＰ２２ターミネーターをコードするベクターＤＮＡを制限エンド
ヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたＰＣＲ産物及
びベクターフラグメントを一緒にして連結させた。この連結反応液の一部分を使
用して大腸菌株ＭＯＮ２０８を形質転換した。形質転換された細菌をスペクチノ
マイシン含有プレート上で選択した。正確なインサートを確かめるために、プラ
スミドＤＮＡを単離して配列を決定した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ３０４
２６と命名した。ｐＭＯＮ３０４２２とｐＭＯＮ３０４２６はいずれも同じペプ
チドをコードする。

【００８０】実施例２．ヒトインターフェロンαＡ／Ｄキメラの創出ｐＭＯＮ２０４０５の構築プラスミドｐＭＯＮ３０４２６のＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化すると、３２０７ｂｐのベクターフラグメントが生成した。ｐＭＯＮ３
０４２６由来のプラスミドＤＮＡをＮｃｏＩ及びＢｇｌＩＩで消化すると、１９
２ｂｐのベクターフラグメントが生成した。この１９２ｂｐフラグメントを、合
成オリゴヌクレオチドＩＦＮＤ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、ＩＦＮＤ２（
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、ＩＦＮＤ３Ｘ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、Ｉ
ＦＮＤ４Ｘ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、ＩＦＮＤ５（ＳＥＱＩＤＮＯ：
１５）、ＩＦＮＤ６（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、ＩＦＮＤ７（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１７）及びＩＦＮＤ８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）から組立てた３１
５ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとともに、先のベクターフラ
グメントに連結した。この連結反応液の一部分を使用して大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ
１０１を形質転換した。形質転換された細菌をスペクチノマイシン含有プレート
上で選択した。正確なインサートを確かめるために、プラスミドＤＮＡを単離し
、制限分析によって解析し、配列を決定した。プラスミドｐＭＯＮ２０４０５由
来の遺伝子要素は、ｐＢＲ３２７の複製起点、ｔａｃプロモーター、ヒトインタ
ーフェロン（ｈＩＦＮ）αＡ／Ｄハイブリッドに結合した遺伝子１０リーダー（
ｇ１０−Ｌ）リボソーム結合部位、Ｐ２２転写ターミネーター、及びストレプト
マイシンアデニルトランスフェラーゼ遺伝子である。ｐＭＯＮ２０４０７の構築プラスミドｐＭＯＮ３１２３６のＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化すると、３１５９ｂｐのベクターフラグメントが生成した。ｐＭＯＮ２
０４０５由来のプラスミドＤＮＡをＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化すると、
５０７ｂｐのフラグメントが生成し、これをベクターフラグメントに結合した。
この連結反応液の一部分を使用して大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した
。形質転換された細菌をスペクチノマイシン含有プレート上で選択した。スペク
チノマイシン含有ＬＢブロスで増殖させたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、制限分析によって解析した。プラスミドｐＭＯＮ２０４０７由来の遺伝子要
素は、ｐＢＲ３２７の複製起点、ｒｅｃＡプロモーター、ヒトインターフェロン
（ｈＩＦＮ）αＡ／Ｄハイブリッドに結合した遺伝子１０リーダー（ｇ１０−Ｌ
）リボソーム結合部位、Ｐ２２転写ターミネーター、及びストレプトマイシンア
デニルトランスフェラーゼ遺伝子である。ｐＭＯＮ２０４０８の構築ｐＭＯＮ２４６４６−Ａ７由来のプラスミドＤＮＡを、ストラタジーン（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ；ラホヤ、ＣＡ）のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異
誘発キットを使用して突然変異させた。ヒトアンギオスタチンのＫ３ドメインに
存在するＮｃｏＩ部位を、合成オリゴヌクレオチドＨＰＬＧＮ−ＣＤ１（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１９）及びＨＰＬＧＮ−ＣＤ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）を
用いて塩基７１４をＡからＴへ変化させることによって除去した。プラスミドｐ
ＭＯＮ２０４０８由来の遺伝子要素は、ｐＢＲ３２７の複製起点、ｒｅｃＡプロ
モーター、ヒトアンギオスタチンＫ１−３に結合した遺伝子１０リーダー（ｇ１
０−Ｌ）リボソーム結合部位、Ｔ７転写ターミネーター、及びストレプトマイシ
ンアデニルトランスフェラーゼ遺伝子である。ｐＭＯＮ２０４０９の構築ストラタジーンのＰｆｕ・ＤＮＡポリメラーゼと合成オリゴヌクレオチドＨＡ
ＮＧＥＣＳＫ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）及びＡＮＧＥＣＮ３（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２２）を用いるＰＣＲによって、プラスミドｐＭＯＮ２０４０８由来
のＫ１−３アンギオスタチンＤＮＡの５’末端にＮｃｏＩ部位を創出した。次い
でＰＣＲ反応液をＴａｑポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム、インディアナ
ポリス、ＩＮ）で処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ（サンディエゴ、ＣＡ）のＴＡクローニングキットを使用してｐＣＲ２．
１ベクターへ連結させた。この連結反応液の一部分を使用してコンピテント大腸
菌Ｋ−１２株ＩＮＶαＦ’を形質転換した。形質転換された細菌をアンピシリン
含有プレート上で選択した。正確なインサートを確かめるために、プラスミドＤ
ＮＡを単離し、制限分析によって解析し、配列を決定した。ｐＭＯＮ２０４１０の構築融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの構築に使用さ
れる中間プラスミド、ｐＭＯＮ２０４１０の構築。ｐＭＯＮ２０４１０は、Ｇｌ
ｙＳｅｒポリペプチドリンカーでＫ１−３アンギオスタチンに５’融合したＩＬ
−３変異体をコードする。ｐＭＯＮ３１２５０由来で３５５１ｂｐのＡｆｌＩＩ
Ｉ，ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントをｐＭＯＮ２０４０９由来で８１２ｂｐの
ＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントと連結した。この連結反応液の一部
分を使用してコンピテント大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転
換された細菌をスペクチノマイシン含有プレート上で選択した。スペクチノマイ
シン含有ＬＢブロスで増殖させたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、正確
なインサートを確かめるために、制限分析によって解析し、配列決定した。この
中間プラスミドｐＭＯＮ２０４１０由来の遺伝子要素は、ｐＢＲ３２７の複製起
点、ｒｅｃＡプロモーター、遺伝子１０リーダー（ｇ１０−Ｌ）リボソーム結合
部位、ＧｌｙＳｅｒポリペプチドリンカーでヒトアンギオスタチンＫ１−３に結
合したＩＬ−３変異体、Ｔ７転写ターミネーター、及びストレプトマイシンアデ
ニルトランスフェラーゼ遺伝子である。ｐＭＯＮ２０４１１の構築ｐＭＯＮ３１２５０由来で３５５２ｂｐのＡｆｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フ
ラグメントをｐＭＯＮ２０４０７由来で５０７ｂｐのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
制限フラグメントと連結した。この連結反応液の一部分を使用してコンピテント
大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換された細菌をスペクチノ
マイシン含有プレート上で選択した。スペクチノマイシン含有ＬＢブロスで増殖
させたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析によって解析した。こ
の中間プラスミドｐＭＯＮ２０４１１由来の遺伝子要素は、ｐＢＲ３２７の複製
起点、ｒｅｃＡプロモーター、遺伝子１０リーダー（ｇ１０−Ｌ）リボソーム結
合部位、ＧｌｙＳｅｒポリペプチドリンカーでヒトインターフェロンαＡ／Ｄハ
イブリッドに結合したＩＬ−３変異体、Ｔ７転写ターミネーター、及びストレプ
トマイシンアデニルトランスフェラーゼ遺伝子である。ｐＭＯＮ２０４１２の構築インターフェロンαＡ／Ｄハイブリッドに５’融合したＫ１−３アンギオスタ
チンをコードする、ｐＭＯＮ２０４１２の構築。ｐＭＯＮ２０４１１由来のプラ
スミドＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｍａＩで消化すると、３６９５ｂｐのベ
クターフラグメントを生成した。ｐＭＯＮ２０４０９由来のプラスミドＤＮＡを
ＮｃｏＩ及びＭｆｅＩで消化して生成した７９７ｂｐのフラグメントを、合成オ
リゴヌクレオチドＫ１Ｋ３ＩＮＴＵ．ＲＥＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）とＫ
１Ｋ３ＩＮＴＬ．ＲＥＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）のアニール対及び先のベ
クターフラグメントと連結した。この連結反応液の一部分を使用して大腸菌Ｋ−
１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換された細菌をスペクチノマイシン含
有プレート上で選択した。ＬＢブロスで増殖させたコロニーからプラスミドＤＮ
Ａを単離し、正確なインサートを確かめるために、制限分析によって解析し、配
列決定した。他の遺伝子要素には、ｐＢＲ３２７の複製起点、ｒｅｃＡプロモー
ター、遺伝子１０リーダー（ｇ１０−Ｌ）リボソーム結合部位、Ｔ７転写ターミ
ネーター及びストレプトマイシンアデニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる
。ｐＭＯＮ２０４２０の構築ＧｌｙＳｅｒポリペプチドリンカーでＫ１−３アンギオスタチンに５’融合し
たインターフェロンαＡ／Ｄハイブリッドをコードする、ｐＭＯＮ２０４２０の
構築。ｐＭＯＮ２０４１０由来のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｍ
ａＩで消化すると、４０００ｂｐのベクターフラグメントを生成する。ｐＭＯＮ
２０４０７由来のプラスミドＤＮＡをＮｃｏＩ及びＡｃｃＩで消化して生成する
４６７ｂｐのフラグメントを、合成オリゴヌクレオチドＩＦＡＤＩＮＴＵ．ＲＥ
Ｑ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）とＩＦＡＤＩＮＴＬ．ＲＥＱ（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２６）のアニール対及び先のベクターフラグメントと連結する。この連結
反応液の一部分を使用して大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換する。形質転
換された細菌をスペクチノマイシン含有プレート上で選択する。ＬＢブロスで増
殖させたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、正確なインサートを確かめる
ために、制限分析によって解析し、配列決定した。他の遺伝子要素には、ｐＢＲ
３２７の複製起点、ｒｅｃＡプロモーター、遺伝子１０リーダー（ｇ１０−Ｌ）
リボソーム結合部位、Ｔ７転写ターミネーター及びストレプトマイシンアデニル
トランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。ｐＭＯＮ２０４２１の構築ＧｌｙＳｅｒポリペプチドリンカーでインターフェロンαＡ／Ｄハイブリッド
に５’融合したＫ１−３アンギオスタチンをコードする、ｐＭＯＮ２０４２１の
構築。ｐＭＯＮ３１２５１由来で３４８０ｂｐのＡｆｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制
限フラグメントをｐＭＯＮ２０４０７由来で５０７ｂｐのＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩ
ＩＩ制限フラグメントと連結する。この連結反応液の一部分を使用してコンピテ
ント大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換する。形質転換された細菌をスペク
チノマイシン含有プレート上で選択する。スペクチノマイシン含有ＬＢブロスで
増殖させたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析によって解析した
。他の遺伝子要素には、ｐＢＲ３２７の複製起点、ｒｅｃＡプロモーター、遺伝
子１０リーダー（ｇ１０−Ｌ）リボソーム結合部位、Ｔ７転写ターミネーター及
びストレプトマイシンアデニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。ｐＭＯＮ２０４２２の構築ＧｌｙＳｅｒポリペプチドリンカーでＫ１アンギオスタチンに５’融合したイ
ンターフェロンαＡ／Ｄハイブリッドをコードする、ｐＭＯＮ２０４２２の構築
。ｐＭＯＮ３１２５２由来のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｍａＩ
で消化すると、３３９１ｂｐのベクターフラグメントを生成する。ｐＭＯＮ２０
４０７由来のプラスミドＤＮＡをＮｃｏＩ及びＡｃｃＩで消化して生成する４６
７ｂｐのフラグメントを、合成オリゴヌクレオチドＩＦＡＤＩＮＴＵ．ＲＥＱ（
ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）とＩＦＡＤＩＮＴＬ．ＲＥＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ
：２６）のアニール対及び先のベクターフラグメントと連結する。この連結反応
液の一部分を使用してコンピテント大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換する
。形質転換された細菌をスペクチノマイシン含有プレート上で選択する。ＬＢブ
ロスで増殖させたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、正確なインサートを
確かめるために、制限分析によって解析し、配列決定する。他の遺伝子要素には
、ｐＢＲ３２７の複製起点、ｒｅｃＡプロモーター、遺伝子１０リーダー（ｇ１
０−Ｌ）リボソーム結合部位、Ｔ７転写ターミネーター及びストレプトマイシン
アデニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。ｐＭＯＮ３１２５０の構築中間プラスミド、ｐＭＯＮ３１２５０は、多機能タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を含有するプラスミドを構築するために使用された。それは、ＧｌｙＳｅ
ｒポリペプチドリンカーに５’融合したＩＬ−３変異体をコードし、このポリペ
プチドリンカーの３’末端にＡｆｌＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのクローニング部
位を含有する。ｐＭＯＮ３１２３６由来で３１５９ｂｐのＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩ
ＩＩ制限フラグメントを、ｐＭＯＮ１３１８０由来で４１３ｂｐのＮｃｏＩ，Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントと連結した。この連結反応液の一部分を使用して
コンピテント大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換された細菌
をスペクチノマイシン含有プレート上で選択した。スペクチノマイシン含有ＬＢ
ブロスで増殖させたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析によって
解析した。他の遺伝子要素には、ｐＢＲ３２７の複製起点、ｒｅｃＡプロモータ
ー、遺伝子１０リーダー（ｇ１０−Ｌ）リボソーム結合部位、Ｔ７転写ターミネ
ーター及びストレプトマイシンアデニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。

【００８１】実施例３．アンギオスタチン／インターフェロンα２ｂキメラの創出ｐＭＯＮ２０４１３の構築インターフェロンα２ｂ配列に５’融合したＫ１アンギオスタチンをコードす
る、プラスミドｐＭＯＮ２０４１３の構築。プラスミドｐＭＯＮ３１２５１を制
限酵素ＡｆｌＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化すると、３４７７ｂｐのＡｆｌＩ
ＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントを生成した。インターフェロンα２
ｂをコードするプラスミドｐＭＯＮ３０４２６をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
消化すると、５０７ｂｐのフラグメントが遊離された。これら制限フラグメント
を連結し、この連結反応液を使用して大腸菌株ＪＭ１０１を形質転換した。形質
転換された細菌をスペクチノマイシン含有プレート上で選択した。コロニーから
プラスミドＤＮＡを単離し、正確なインサートを確かめるために配列を決定した
。ｐＭＯＮ２０４１４の構築Ｋ１アンギオスタチン配列に５’融合したインターフェロンα２ｂをコードす
る、ｐＭＯＮ２０４１４の構築。プラスミドｐＭＯＮ３１２５２を制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＸｍａＩで消化すると、３４４７ｂｐのＮｃｏＩ／ＸｍａＩベクターフ
ラグメントを生成した。インターフェロンα２ｂをコードするプラスミドｐＭＯ
Ｎ３０４２６を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢｓｐＨＩで消化すると、４４７ｂｐのＮ
ｃｏＩ／ＢｓｐＨＩフラグメントが生成した。このｐＭＯＮ３０４２６由来で４
４７ｂｐのＮｃｏＩ／ＢｓｐＨＩフラグメントを、以下のアニールした相補オリ
ゴヌクレオチド対と３時間連結した：

【００８２】

【化５】

【００８３】組立てられたオリゴヌクレオチドはＢｓｐＨＩ及びＸｍａＩ制限末端を創出し、
インターフェロンα２ｂ配列から終止コドンを除去する。これによりインターフ
ェロンα２ｂ配列はＧｌｙＳｅｒリンカー配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）に
５’融合される。３時間の連結の後、３４４７ｂｐのＮｃｏＩ，ＸｍａＩによる
ｐＭＯＮ３１２５２のＤＮＡフラグメントをこの混合物に加え、さらに１５時間
連結を続けた。これを使用して大腸菌株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換さ
れた細菌をスペクチノマイシン含有プレート上で選択した。コロニーからプラス
ミドＤＮＡを単離し、正確なインサートを確かめるために配列を決定した。ｐＭＯＮ２０４１６の構築インターフェロンα２ｂ配列に５’融合したＫ１−Ｋ３アンギオスタチンをコ
ードする、ｐＭＯＮ２０４１６の構築。プラスミドｐＭＯＮ３１２５９を制限酵
素ＡｆｌＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化すると、４０１７ｂｐのＡｆｌＩＩＩ
，ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントを生成した。インターフェロンα２ｂを
コードするプラスミドｐＭＯＮ３０４２６をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化
すると、５０７ｂｐのＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが生成した。これ
ら制限フラグメントを連結し、この連結反応混合物を使用して大腸菌Ｋ−１２株
ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換された細菌をスペクチノマイシン含有プレ
ート上で選択した。コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、正確なインサート
を確かめるために配列を決定した。ｐＭＯＮ３１２５１の構築融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの構築に使用さ
れる中間プラスミド、ｐＭＯＮ３１２５１の構築。ｐＭＯＮ３１２５１は、Ｇｌ
ｙＳｅｒリンカー配列に５’融合したＫ１アンギオスタチンをコードし、インサ
ートＤＮＡの３’末端にＡｆｌＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を含
有する。プラスミドｐＭＯＮ３１２５２を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｍａＩで消化
すると、３２０８ｂｐのＮｃｏＩ，ＸｍａＩベクターフラグメントを生成した。
アンギオスタチンのＫ１ドメインをコードするプラスミドｐＭＯＮ２４６４９を
ＮｃｏＩ及びＥａｒＩで消化すると、２５５ｂｐのＮｃｏＩ／ＥａｒＩフラグメ
ントが生成した。このｐＭＯＮ２４６４９由来で２５５ｂｐのＮｃｏＩ／Ｅａｒ
Ｉフラグメントを、以下のアニールした相補オリゴヌクレオチド対と３時間連結
した：

【００８４】

【化６】

【００８５】組立てられたオリゴヌクレオチドはＥａｒＩ及びＸｍａＩ制限末端を創出し、ア
ンギオスタチンＫ１配列から終止コドンを除去する。これによりアンギオスタチ
ンＫ１配列はＧｌｙＳｅｒリンカー配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）に融合さ
れる。３時間の連結の後、この混合物に３２０８ｂｐのＮｃｏＩ，ＸｍａＩによ
るｐＭＯＮ３１２５０のＤＮＡフラグメントをこの混合物に加え、さらに１５時
間連結を続けた。これを使用して大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。
形質転換された細菌をスペクチノマイシン含有プレート上で選択した。コロニー
からプラスミドＤＮＡを単離し、正確なインサートを確かめるために配列を決定
した。ｐＭＯＮ３１２５２の構築融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの構築に使用さ
れる中間プラスミド、ｐＭＯＮ３１２５２の構築。ｐＭＯＮ３１２５２は、Ｇｌ
ｙＳｅｒコード配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）に３’融合したＫ１アンギオ
スタチンをコードする。プラスミドｐＭＯＮ３１２５０を制限酵素ＡｆｌＩＩＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩで消化すると、２７５ｂｐのＡｆｌＩＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ
ベクターフラグメントを生成した。プラスミドｐＭＯＮ２４６４９を制限酵素Ｎ
ｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化すると、３５５２ｂｐのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントを生成した。これら制限フラグメントを連結し、この連結反応
液を使用して大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換された細菌
をスペクチノマイシン含有プレート上で選択した。コロニーからプラスミドＤＮ
Ａを単離し、正確なインサートを確かめるために配列を決定した。ｐＭＯＮ３１２５９の構築融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの構築に使用さ
れる中間プラスミド、ｐＭＯＮ３１２５９の構築。ｐＭＯＮ３１２５９は、Ｇｌ
ｙＳｅｒリンカー配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）に５’融合したアンギオス
タチンのＫ１〜Ｋ３ドメインをコードし、インサートＤＮＡの３’末端にＡｆｌ
ＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を含有する。プラスミドｐＭＯＮ３
１２５０を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｍａＩで消化すると、３２０８ｂｐのＮｃｏ
Ｉ，ＸｍａＩベクターフラグメントを生成した。プラスミドｐＭＯＮ２０４０９
をＮｃｏＩ及びＭｆｅＩで消化すると、７９８ｂｐのＮｃｏＩ／ＭｆｅＩフラグ
メントが遊離された。このｐＭＯＮ２０４０９由来で７９８ｂｐのＮｃｏＩ／Ｍ
ｆｅＩフラグメントを、以下のアニールした相補オリゴヌクレオチド対と３時間
連結した：

【００８６】

【化７】

【００８７】組立てられたオリゴヌクレオチドはＭｆｅＩ及びＸｍａＩ部位を創出し、Ｋ１−
Ｋ３アンギオスタチン配列から終止コドンを除去する。これによりアンギオスタ
チンＫ１−Ｋ３配列はＧｌｙＳｅｒリンカー配列に融合される。３時間の連結の
後、３２０８ｂｐのＮｃｏＩ，ＸｍａＩによるｐＭＯＮ３１２５０のＤＮＡフラ
グメントをこの混合物に加え、さらに１５時間連結を続けた。これを使用して大
腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換された細菌をスペクチノマ
イシン含有プレート上で選択した。コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、正
確なインサートを確かめるために配列を決定した。

【００８８】実施例４．アンギオスタチンのクリングルドメインをコードするプラスミドの
構築ｐＭＯＮ２４６２４の構築ヒトプラスミノーゲンのＨ鎖（ｐＭＯＮ２４６２４，ＳＥＱＩＤＮＯ：３
７）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーｈｐｌｇｎ−ｓ１
（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）及びｈｐｌｇｎ−ｎ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：
１０５）を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、ヒト肝臓ｍＲＮＡから合成
したｃＤＮＡを鋳型として使用して合成した。このｃＤＮＡは、ヒトプラスミノ
ーゲンのシグナルペプチド、Ｎ末端ペプチド及び５つのクリングルドメインをコ
ードする。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し、すで
に同じように開裂された哺乳動物の発現ベクターｐＭＯＮ３３６０Ｂへ連結した
。この連結反応液の一部分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂを形質転換した。アン
ピシリン耐性細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を
確かめるために制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定
した。ｐＭＯＮ２４６２５の構築ヒトプラスミノーゲンの初め４種のクリングルドメイン（Ｋ１−４）（２４６
２５ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌク
レオチドプライマーａｎｇｐｃｒ−ｓ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６）及びａ
ｎｇｐｃｒ−ｎ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）を使用するポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮ
ｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでに同じように開裂された哺乳動物の発
現ベクターｐＭＯＮ３６３３へ連結した。この連結反応液の一部分を使用して大
腸菌株ＤＨ１０Ｂを形質転換した。アンピシリン耐性細菌コロニーからプラスミ
ドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌクレアーゼ
開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６２５から発現され
て生成したタンパク質は、プラスミノーゲンのクリングルドメインのアミノ末端
において、タンパク質産物の分泌を保証するようなやり方で融合したヒトインタ
ーロイキン−３のシグナルペプチド（ベクター配列によってコードされる）を包
含する。ｐＭＯＮ２４６２６の構築ヒトプラスミノーゲンの初め３種のクリングルドメイン（Ｋ１−３）（２４６
２６ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌク
レオチドプライマーａｎｇｐｃｒ−ｓ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６）及びａ
ｎｇｐｃｒ−ｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８）を使用するポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮ
ｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでに同じように開裂された哺乳動物の発
現ベクターｐＭＯＮ３６３３へ連結した。この連結反応液の一部分を使用して大
腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーからプラス
ミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌクレアー
ゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６２６から発現さ
れて生成したタンパク質は、プラスミノーゲンのクリングルドメインのアミノ末
端において、タンパク質産物の分泌を保証するようなやり方で融合したヒトイン
ターロイキン−３のシグナルペプチド（ベクター配列によってコードされる）を
包含する。ｐＭＯＮ２４６２７の構築ヒトプラスミノーゲンの２〜４番目のクリングルドメイン（Ｋ２−４）（２４
６２７ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーａｎｇｐｃｒ−ｓ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９）及び
ａｎｇｐｃｒ−ｎ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）を使用するポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでに同じように開裂された哺乳動物の
発現ベクターｐＭＯＮ３６３３へ連結した。この連結反応液の一部分を使用して
大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌクレア
ーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６２７から発現
されて生成したタンパク質は、プラスミノーゲンのクリングルドメインのアミノ
末端において、タンパク質産物の分泌を保証するようなやり方で融合したヒトイ
ンターロイキン−３のシグナルペプチド（ベクター配列によってコードされる）
を包含する。ｐＭＯＮ２４６２８の構築ヒトプラスミノーゲンの２〜３番目のクリングルドメイン（Ｋ２−３）（２４
６２８ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーａｎｇｐｃｒ−ｓ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９）及び
ａｎｇｐｃｒ−ｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８）を使用するポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでに同じように開裂された哺乳動物の
発現ベクターｐＭＯＮ３６３３へ連結した。この連結反応液の一部分を使用して
大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌクレア
ーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６２８から発現
されて生成したタンパク質は、プラスミノーゲンのクリングルドメインのアミノ
末端において、タンパク質産物の分泌を保証するようなやり方で融合したヒトイ
ンターロイキン−３のシグナルペプチド（ベクター配列によってコードされる）
を包含する。ｐＭＯＮ２４６３０の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２５を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された１１６１ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインタ
ーロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンのはじめの
４種ドメイン（Ｋ１−４）（２４６２５ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）を
コードする。バキュロウイルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１をＢａｍＨＩで
開裂し、エビ（Ｓｈｒｉｍｐ）アルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げ
た。この開裂ベクターと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一
部分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コ
ロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限
エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６３１の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２６を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された８７３ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインター
ロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンのはじめの３
種ドメイン（Ｋ１−３）（２４６２６ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）をコ
ードする。バキュロウイルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１をＢａｍＨＩで開
裂し、エビアルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げた。この開裂ベクタ
ーと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一部分を使用して大腸
菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーからプラスミ
ドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌクレアーゼ
開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６３２の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２５を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された１１６１ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインタ
ーロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンのはじめの
４種ドメイン（Ｋ１−４）（２４６２５ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）を
コードする。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓの発現ベクターｐＰＩＣ３をＢａ
ｍＨＩで開裂し、エビアルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げた。この
開裂ベクターと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一部分を使
用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーか
らプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌ
クレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６３３の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２６を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された８７３ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインター
ロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンのはじめの３
種ドメイン（Ｋ１−３）（２４６２６ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）をコ
ードする。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓの発現ベクターｐＰＩＣ３をＢａｍ
ＨＩで開裂し、Ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げた
。この開裂ベクターと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一部
分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロ
ニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６３６の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２７を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された９０９ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインター
ロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンの２〜４番目
のドメイン（Ｋ２−４）（２４６２７ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）をコ
ードする。バキュロウイルスの発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１をＢａｍＨＩで
開裂し、Ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げた。この
開裂ベクターと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一部分を使
用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーか
らプラスミドＤＮＡを単離し、同一性を確かめるために制限エンドヌクレアーゼ
開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６３７の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２８を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された６２１ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインター
ロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンの２〜３番目
のドメイン（Ｋ２−３）（２４６２８ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）をコ
ードする。バキュロウイルスの発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１をＢａｍＨＩで
開裂し、Ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げた。この
開裂ベクターと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一部分を使
用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーか
らプラスミドＤＮＡを単離し、同一性を確かめるために制限エンドヌクレアーゼ
開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６３８の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２７を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された９０９ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインター
ロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンの２〜４番目
のドメイン（Ｋ２−４）（２４６２７ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）をコ
ードする。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓの発現ベクターｐＰＩＣ３をＢａｍ
ＨＩで開裂し、Ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げた
。この開裂ベクターと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一部
分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロ
ニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６３９の構築プラスミドｐＭＯＮ２４６２８を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂し
た。そのような消化によって遊離された６２１ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトインター
ロイキン−３のシグナルペプチドに融合したヒトプラスミノーゲンの２〜３番目
のドメイン（Ｋ２−３）（２４６２８ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）をコ
ードする。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓの発現ベクターｐＰＩＣ３をＢａｍ
ＨＩで開裂し、Ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼで消化して再環化を妨げた
。この開裂ベクターと先のｃＤＮＡをともに連結させた。この連結反応液の一部
分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロ
ニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６４２の構築ヒトプラスミノーゲンのはじめ４種のクリングルドメイン（Ｋ１−４^*）（２４６４２ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）をコードするｃＤＮＡを、オリゴ
ヌクレオチドプライマーａｎｇｅｃ−ｓ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０３）及び
ａｎｇｅｃ−ｎ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１００）を使用するポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡ
ｆｌＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
開裂した大腸菌の発現ベクターｐＭＯＮ５７２３へ連結した。この連結反応液の
一部分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをスペクチノマイシン耐性へ形質転換した
。大腸菌における発現を最適化するために、５’ＰＣＲプライマー（ａｎｇｅｃ
−ｓ１）は、はじめ数コドンの第３位に縮重部分を含んでいた。これにより、そ
れぞれ同一のタンパク質をコードするが、はじめ数コドンのいくつかに様々なサ
イレント突然変異を有するプラスミドの集団が生成した。ＤＨ１０Ｂ宿主株から
プラスミドを単離し、それを使用して大腸菌株ＭＯＮ１０５をスペクチノマイシ
ン耐性へ形質転換した。それぞれの単離物をタンパク質発現でスクリーニングし
た。細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめる
ために制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐ
ＭＯＮ２４６４２によりコードされるタンパク質は、ｐＭＯＮ２４６４３のｃＤ
ＮＡによりコードされるＫ１−４のやや長いバージョンである。ｐＭＯＮ２４６４３の構築ヒトプラスミノーゲンのはじめ４種のクリングルドメイン（Ｋ１−４）（２４
６４３ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーａｎｇｅｃ−ｓ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２）及びａ
ｎｇｅｃ−ｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９９）を使用するポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡｆｌ
ＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂
した大腸菌の発現ベクターｐＭＯＮ５７２３へ連結した。この連結反応液の一部
分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。大
腸菌における発現を最適化するために、５’ＰＣＲプライマー（ａｎｇｅｃ−ｓ
２）は、はじめ数コドンの第３位に縮重部分を含んでいた。これにより、それぞ
れ同一のタンパク質をコードするが、はじめ数コドンのいくつかに様々なサイレ
ント突然変異を有するプラスミドの集団が生成した。ＤＨ１０Ｂ宿主株からプラ
スミドを単離し、それを使用して大腸菌株ＭＯＮ１０５をスペクチノマイシン耐
性へ形質転換した。それぞれの単離物をタンパク質発現でスクリーニングした。
細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるため
に制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６４４の構築ヒトプラスミノーゲンの２〜３番目のクリングルドメイン（Ｋ２−３）（２４
６４４ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーａｎｇｅｃ−ｓ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１）及びａ
ｎｇｅｃ−ｎ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：９８）を使用するポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡｆｌ
ＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂
した大腸菌の発現ベクターｐＭＯＮ５７２３へ連結した。この連結反応液の一部
分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。大
腸菌における発現を最適化するために、５’ＰＣＲプライマー（ａｎｇｅｃ−ｓ
３，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１）は、はじめ数コドンの第３位に縮重部分を含
んでいた。これにより、それぞれ同一のタンパク質をコードするが、はじめ数コ
ドンのいくつかに様々なサイレント突然変異を有するプラスミドの集団が生成し
た。ＤＨ１０Ｂ宿主株からプラスミドを単離し、それを使用して大腸菌株ＭＯＮ
１０５をスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。それぞれの単離物をタンパク
質発現でスクリーニングした。細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃ
ＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、
ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６４５の構築ヒトプラスミノーゲンの２〜４番目のクリングルドメイン（Ｋ２−４）（２４
６４５ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーａｎｇｅｃ−ｓ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１）及びａ
ｎｇｅｃ−ｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９９）を使用するポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡｆｌ
ＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂
した大腸菌の発現ベクターｐＭＯＮ５７２３へ連結した。この連結反応液の一部
分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。大
腸菌における発現を最適化するために、５’ＰＣＲプライマー（ａｎｇｅｃ−ｓ
３）は、はじめ数コドンの第３位に縮重部分を含んでいた。これにより、それぞ
れ同一のタンパク質をコードするが、はじめ数コドンのいくつかに様々なサイレ
ント突然変異を有するプラスミドの集団が生成した。ＤＨ１０Ｂ宿主株からプラ
スミドを単離し、それを使用して大腸菌株ＭＯＮ１０５をスペクチノマイシン耐
性へ形質転換した。それぞれの単離物をタンパク質発現でスクリーニングした。
細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるため
に制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６４６の構築ヒトプラスミノーゲンのはじめ３種のクリングルドメイン（Ｋ１−３）（２４
６４６ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドプライマーａｎｇｅｃ−ｓ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２）及びａ
ｎｇｅｃ−ｎ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：９８）を使用するポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡｆｌ
ＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂
した大腸菌の発現ベクターｐＭＯＮ５７２３へ連結した。この連結反応液の一部
分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。大
腸菌における発現を最適化するために、５’ＰＣＲプライマー（ａｎｇｅｃ−ｓ
２）は、はじめ数コドンの第３位に縮重部分を含んでいた。これにより、それぞ
れ同一のタンパク質をコードするが、はじめ数コドンのいくつかに様々なサイレ
ント突然変異を有するプラスミドの集団が生成した。ＤＨ１０Ｂ宿主株からプラ
スミドを単離し、それを使用して大腸菌株ＭＯＮ１０５をスペクチノマイシン耐
性へ形質転換した。それぞれの単離物をタンパク質発現でスクリーニングした。
細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるため
に制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６４８の構築ヒトプラスミノーゲンの第一のクリングルドメイン（Ｋ１）（２４６４８ｓｅ
ｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）をコードするｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチド
プライマーｈａｎｇｅｃ−ｓｋ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０）及びａｎｇｅ
ｃ−ｎ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：９８）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及び
ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、すでにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂した大腸菌
の発現ベクターｐＭＯＮ５７２３へ連結した。この連結反応液の一部分を使用し
て大腸菌株ＤＨ１０Ｂをスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。大腸菌におけ
る発現を最適化するために、５’ＰＣＲプライマー（ｈａｎｇｅｃ−ｓｋ１）は
、ｐＭＯＮ２４６４６のＫ１−３ｃＤＮＡに見出されるのと同一のヌクレオチ
ド配列を含んでいた。ＤＨ１０Ｂ宿主株からプラスミドＤＮＡを単離し、それを
使用して大腸菌株ＭＯＮ１０５をスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。それ
ぞれの単離物をタンパク質発現でスクリーニングした。細菌コロニーからプラス
ミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌクレアー
ゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６４９の構築ヒトアンギオスタチンの第一のクリングルドメインをコードするｃＤＮＡを、
ｐＭＯＮ２４６４６−Ａ７を鋳型として使用し、プライマーＨａｎｇ−ｅｃ−ｓ
ｋ１．ｓｅｑ及びａｎｇ−ｅｃ−ｎ４．ｓｅｑを使用するポリメラーゼ連鎖反応
によって合成した。生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＨｉ
ｎｄＩＩＩで開裂し、すでにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂した大腸菌の発
現ベクターｐＭＯＮ５７２３へ連結した。この連結反応液の一部分を使用して大
腸菌株ＤＨ１０Ｂをスペクチノマイシン耐性へ形質転換した。ＤＨ１０Ｂ宿主株
からプラスミドを単離し、それを使用して大腸菌株ＭＯＮ１０５をスペクチノマ
イシン耐性へ形質転換した。それぞれの単離物をタンパク質発現でスクリーニン
グした。細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確か
めるために制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した
。ｐＭＯＮ２４６５０の構築ｐＭＯＮ２４６４９をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ヒトプラスミノ
ーゲンの第一クリングル（Ｋ１）（２４６４９ｓｅｑ，ＳＥＱＩＤＮＯ：１
１２）をコードするｃＤＮＡを遊離させた。このＫ１ｃＤＮＡを、すでに同じ
ように開裂された哺乳動物の発現ベクターｐＭＯＮ３６３３へ連結した。この連
結反応液の一部分を使用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換
した。細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめ
るために制限エンドヌクレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＮ２４６５２の構築ｐＭＯＮ２０４１２をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＩＦＮαＡ／Ｄ
のｃＤＮＡに融合したヒトプラスミノーゲンのはじめ３種のクリングルをコード
するｃＤＮＡを遊離させた。このｃＤＮＡを、すでに同じように開裂された哺乳
動物の発現ベクターｐＭＯＮ３６３３へ連結した。この連結反応液の一部分を使
用して大腸菌株ＤＨ１０Ｂをアンピシリン耐性へ形質転換した。細菌コロニーか
らプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの同一性を確かめるために制限エンドヌ
クレアーゼ開裂によって解析し、ＤＮＡ配列を決定した。

【００８９】実施例５．アンギオスタチン／インターフェロンα２ｂキメラの精製アンギオスタチンＫ１−３／インターフェロンＡ／Ｄキメラタンパク質をコー
ドするプラスミドｐＭＯＮ２４６５２をＢＨＫ／ＶＰ１６細胞へトランスフェク
トし、上記材料と方法（Ｈｉｐｐｅｎｍｅｙｅｒ，Ｐ．とＨｉｇｈｋｉｎ，Ｍ．
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１０３７−１０４１，１９９３）のよう
にして安定な細胞系を選択した。３６個のクローンを単離し、ローラーボトルで
試験する６個のクローンを選択した。市販のヒトＩＦＮαＥＬＩＳＡキット（Ｂ
ｉｏｓｏｕｒｃｅ＃ＫＨＣ４０１２）を使用するＥＬＩＳＡによって、キメラ
の濃度を定量した。クローン１５が最大のキメラ（１４．４μｇ／ｍｌ）を産生
したのに対し、他の５クローンのキメラ産生量はずっと少なかった（クローン８
、１４、２９、３２及び３６で、それぞれ１．１７、２．２２、０．０４、０．
２０及び１．１２μｇ／ｍｌ）。

【００９０】５０ｍｌのリジンセファロースカラムを４℃で５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．４により平衡状態にした。ならし無血清培地（ＳＦ−ＢＨＫ）の１２倍濃
縮液約５００ｍｌを流速約２．５ｍｌ／分、４℃でカラムにかけた。５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．４でカラムを洗浄した後、５００ｍＭＮａＣｌ／５
０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で洗浄し、非特異結合タンパク質を除去し
た。次いで２カラム容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４を用いてこの
カラムを低塩環境に戻した。２００ｍＭε−アミノカプロン酸／５０ｍＭリン酸
ナトリウム、ｐＨ７．４でカラムを洗浄することによって、所望のキメラを溶出
させた。約１０．５ｍｌの分画を回収し、ＵＶ吸収で溶出をモニターした。有意
なＵＶ吸収のあった分画４〜６を集めた。この分画を４リットルの５０ｍＭリン
酸ナトリウム、ｐＨ７．４に対して４℃で３回透析し、除菌濾過した。分析用リ
ジンセファロースクロマトグラフィーにより約０．６ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得
た。

【００９１】精製されたサンプルを還元又は非還元ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したとこ
ろ、キメラがその期待されたサイズに近い位置へ移動することが示された。エレ
クトロンスプレー質量分析法は分子量約５１，５５６ダルトンを示し、ＢＨＫ細
胞から単離された物質が部分的にグリコシル化されていることを示した。

【００９２】精製キメラの内皮細胞遊走性について、材料と方法に記載されているように、
同一３検体でアッセイした。以下の表にその結果を示す：

【００９３】

【表２】

【００９４】市販インターフェロンαＡ／Ｄ（ジェンザイム）及びアンギオスタチン／ＩＦ
Ｎ・Ａ／Ｄキメラも、それぞれ１ｎＭの濃度から始める３倍希釈系列を使用する
Ｄａｕｄｉ細胞増殖アッセイで２回試験した。インターフェロンＡ／Ｄ及びアン
ギオスタチン／インターフェロンＡ／Ｄキメラも同様の阻害プロフィールを示し
た（図５）。

【００９５】本明細書に引用されるすべての参考文献、特許又は出願はそのまま参照により
本明細書に組込まれている。

【００９６】

【表３】

【００９７】

【表４】

【００９８】

【表５】

【００９９】

【表６】

【０１００】

【表７】

【０１０１】

【表８】

【０１０２】

【表９】

【０１０３】

【表１０】

【０１０４】

【表１１】

【０１０５】

【表１２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＩＬ−３シグナルペプチドが先行するクリングルドメインを含有する
選択されたクローン化アンギオスタチンフラグメントの概略図を示す。Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４及びＫ５という標識は、ヒトプラスミノーゲン又はア
ンギオスタチン内部の特定クリングルドメインに言及する。プラスミドｐＭＯＮ
２４６２４は、Ｎ末端ペプチド（ＮＴＰ）及びシグナルペプチド（ＳＰ）を包含
する、ヒトプラスミノーゲンＨ鎖の配列を含有する。プラスミドｐＭＯＮ２４６
２５（Ｋ１−Ｋ４）、ｐＭＯＮ２４６２６（Ｋ１−Ｋ３）、ｐＭＯＮ２４６２７
（Ｋ２−Ｋ４）、ｐＭＯＮ２４６２８（Ｋ２−Ｋ３）及びｐＭＯＮ２４６５０（
Ｋ１）は、ＩＬ−３シグナルペプチド（ＩＬ−３）が先行する、様々なクリング
ルドメインをそれぞれ含有する。これらのプラスミドはまた哺乳動物（例、ＢＨ
Ｋ）細胞からのタンパク質の発現及び分泌に必要な配列を含有する。

【図２】図２は、クリングルドメインを含有する選択されたクローン化アンギオスタチ
ンフラグメントの概略図を示す。プラスミドｐＭＯＮ２４６４２は、クリングルＫ１−Ｋ４並びに図のベタ領域
に示される５’及び３’末端の追加ヒトプラスミノーゲン配列をコードする。プ
ラスミドｐＭＯＮ２４６４３（Ｋ１−Ｋ４）、ｐＭＯＮ２４６４４（Ｋ２−Ｋ３
）、ｐＭＯＮ２４６４５（Ｋ２−Ｋ３）、ｐＭＯＮ２４６４６（Ｋ１−Ｋ３）及
びｐＭＯＮ２４６４８（Ｋ１）は、ヒトプラスミノーゲンの特定のクリングルド
メインを含有する。これらのプラスミドはまたコード化ポリペプチドの大腸菌に
おける発現に必要な配列も含有する。

【図３】図３は、選択されたアンギオスタチン／インターフェロンα２ｂキメラ融合タ
ンパク質の概略図を示す。プラスミドｐＭＯＮ２０４１３は、グリシン−セリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リン
カーペプチドを介してインターフェロンαに融合したＫ１クリングルドメインを
コードする。プラスミドｐＭＯＮ２０４１４はｐＭＯＮ２０４１３に似ているが
、プラスミノーゲン（アンギオスタチン）のＫ１クリングルドメインに融合した
Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーに融合したインターフェロンαをＮ末端に含有するキメ
ラ融合タンパク質をコードする。プラスミドｐＭＯＮ２０４１６は、Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒリンカーでインターフェロンαに融合したクリングルドメインＫ１−Ｋ３か
らなる融合タンパク質をコードする。

【図４】図４は、選択されたアンギオスタチン／インターフェロンαＡ／Ｄキメラ融合
タンパク質の概略図を示す。プラスミドｐＭＯＮ２０４１２は、Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーでハイブリッドＡ
／Ｄインターフェロンに融合したＫ１−Ｋ３クリングルをコードする。プラスミ
ドｐＭＯＮ２０４２０は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してＫ１−Ｋ３クリング
ルに融合したハイブリッドＡ／Ｄインターフェロンを含有する融合タンパク質を
コードする。プラスミドｐＭＯＮ２０４２１は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーでハイ
ブリッドＡ／Ｄインターフェロンに融合したクリングルＫ１をコードする。プラ
スミドｐＭＯＮ２０４２２は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してクリングルＫ１
に融合したハイブリッドＡ／Ｄインターフェロンを含有する融合タンパク質をコ
ードする。

【図５】図５は、インターフェロンＡ／Ｄ及びインターフェロンＡ／Ｄ・Ｋ１−３アン
ギオスタチンキメラタンパク質の存在下でのダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞の増殖
を示す。インターフェロンＡ／Ｄ（標準品、ジェンザイム）及びインターフェロンＡ／
Ｄ・Ｋ１−３アンギオスタチンキメラタンパク質の存在下でのダウディ細胞の増
殖を表す同一２検体のアッセイを示す。タンパク質サンプルは１ｍＭの濃度から
はじめて連続希釈した。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月２１日（２０００．１２．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/78 14/56 Ｃ１２Ｎ 9/68 14/78 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 9/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者キャパロン，メイアー・エイチアメリカ合衆国ミズーリ州63017，チェスターフィールド，ビーチウッド・コート 109 (72)発明者キャスパーソン，ジェラルド・エフアメリカ合衆国ミズーリ州63011，ボールウィン，クレイモント・ドライブ 314 (72)発明者グレゴリー，スーザン・エイアメリカ合衆国ミズーリ州63130，ユニバーシティ・シティ，コーネル・コート 8136 (72)発明者クレイン，バーバラ・ケイアメリカ合衆国ミズーリ州63131，セント・ルイス，トッピング・エステーツ 12917 (72)発明者マッカーン，ジョン・ピーアメリカ合衆国ミズーリ州63038，グレンコー，バブラー・メドウズ・ドライブ 18612 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA23 BA80 CA04 CA07 DA02 DA05 EA04 FA20 GA11 HA01 HA03 4B050 CC03 CC04 DD11 FF14E LL01 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA41 DA22 NA14 ZA332 ZB112 ZB262 4H045 AA10 BA41 CA40 DA01 DA16 EA20 FA72 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式のアミノ酸配列を含んでなる多機能タンパク質：Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₂；Ｒ₂−Ｌ₁−Ｒ₁；Ｒ₁−Ｌ₁−Ｒ₁；Ｒ₁−Ｒ₂；Ｒ₂−Ｒ₁；及びＲ₁−Ｒ₁；ここで、Ｒ₁はアンギオスタチンであり；Ｒ₂は、エンドスタチン、ヒトＩ型インターフェロン、トロンボスポンジン、インターフェロン誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）及び血小板因子４から選
択され；Ｌ₁はＲ₁をＲ₂に連結し得るリンカーであり；前記タンパク質は所望により（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）、（メチオニ
ン^-2、アラニン^-1）、（セリン^-1）、（メチオニン^-2、セリン^-1）、（システイ
ン^-1）又は（メチオニン^-2、システイン^-1）によって直前に先行され得る。
【請求項２】Ｒ₁がアンギオスタチンＫ１、アンギオスタチンＫ１−Ｋ３、アンギオスタチンＫ１−Ｋ４、アンギオスタチンＫ１−Ｋ５、アンギオスタチ
ンＫ５及びそれらの機能的相同体からなる群から選択される、請求項１に記載の
多機能タンパク質。
【請求項３】前記Ｉ型インターフェロンがＩ型インターフェロン変異体、
インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンαハイブ
リッドＡ／Ｄ、コンセンサスインターフェロン及びそれらの機能的相同体からな
る群から選択される、請求項１に記載の多機能タンパク質。
【請求項４】前記リンカー（Ｌ₁）がＳＥＱＩＤＮＯ：７９、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８２、
ＳＥＱＩＤＮＯ：８３、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：
８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８７及びそれらの機能
的相同体からなる群から選択される１種又はそれ以上のペプチド配列である、請
求項１、２又は３に記載の多機能タンパク質。
【請求項５】アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：５３、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５５、ＳＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：５７、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：５９、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１、ＳＥＱＩＤＮＯ：６
２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：６５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：６７、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：６８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９、ＳＥＱＩＤＮＯ：７０、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：７１、ＳＥＱＩＤＮＯ：７２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７３
、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４、ＳＥＱＩＤＮＯ：７５又はそれらの機能的相
同体からなる群から選択される、請求項１に記載の多機能タンパク質。
【請求項６】腫瘍増殖を阻害する治療用医薬品を製造するための、請求項
１に記載の多機能タンパク質フラグメントの使用。
【請求項７】腫瘍増殖を阻害する治療用医薬品を製造するための、請求項
２に記載の多機能タンパク質フラグメントの使用。
【請求項８】腫瘍増殖を阻害する治療用医薬品を製造するための、請求項
３に記載の多機能タンパク質フラグメントの使用。
【請求項９】請求項１に記載の前記多機能タンパク質をコードする核酸分
子。
【請求項１０】請求項２に記載の前記多機能タンパク質をコードする核酸
分子。
【請求項１１】請求項３に記載の前記多機能タンパク質をコードする核酸
分子。
【請求項１２】核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６
、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ
：３９、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：４５、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、ＳＥＱＩＤＮＯ：４７、
ＳＥＱＩＤＮＯ：４８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９、又はそれらの組み合わ
せ又はそれらの機能的相同体からなる群から選択される、請求項１に記載の前記
多機能タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１３】請求項９、１０、１１又は１２に記載の核酸分子を含んで
なる複製可能なベクターで形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主細
胞を、前記多機能タンパク質を発現させて前記多機能タンパク質を回収するよう
に、好適な栄養条件下で増殖させることを含んでなる多機能タンパク質の生産法
。
【請求項１４】請求項１、２又は３に記載の多機能タンパク質の治療有効
量及び製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】補助薬剤をさらに含み、前記補助薬剤が化学療法剤及び免
疫療法剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】血管形成介在性の疾患をもったヒト患者へ請求項１に記載
の多機能タンパク質の有効量を投与することを含んでなる、前記患者を治療する
方法。
【請求項１７】血管形成介在性の疾患が癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性及
び関節炎からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】請求項１、２又は３に記載の多機能タンパク質の有効量を
患者へ投与する工程を含んでなる、患者の腫瘍をモジュレートする方法。
【請求項１９】請求項１、２又は３に記載の多機能タンパク質の有効量を
患者へ投与する工程を含んでなる、患者における腫瘍細胞の産生を阻害する方法
。
【請求項２０】腫瘍細胞が肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌
、結腸癌、腎癌、膀胱癌、黒色腫、肝腫瘍、肉腫及びリンパ腫からなる群から選
択される１つに特徴的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】（ａ）腫瘍サイズを測定すること；（ｂ）担体中の多機能タンパク質の有効量を投与すること；及び（ｃ）腫瘍サイズの減少を定期的にモニターすること；という工程を含んでなる、固形癌を有する患者の治療法。
【請求項２２】腫瘍の内側又は近傍にある細胞へ遺伝子デリバリー担体を
デリバリーすることを含み、前記担体が多機能タンパク質をコードする、ヒト遺
伝子治療の方法。
【請求項２３】前記担体が腫瘍増殖を阻害し得るポリペプチドをコードす
る核酸を含んでなるベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記多機能タンパク質が請求項１、２、３、４又は５に記
載されるタンパク質の群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】腫瘍増殖を阻害し得るポリペプチドをコードする核酸を含
んでなる遺伝子治療用ベクター。
【請求項２６】生理学的に許容し得る希釈剤中に、腫瘍増殖を阻害し得る
ポリペプチドをコードする治療有効量の核酸を含む組成物。
【請求項２７】凍結乾燥されている、請求項２６に記載の遺伝子治療用担
体。
【請求項２８】脱水されている、請求項２６に記載の遺伝子治療用担体。