CZ302303B6

CZ302303B6 - Homodimerní fúzní protein vykazující inhibicní aktivitu na angiogenezi, zpusob jeho produkce, molekula DNA a replikovatelný expresní vektor

Info

Publication number: CZ302303B6
Application number: CZ20010643A
Authority: CZ
Inventors: Lo@Kin-Ming; Li@Yue; D. Gillies@Stephen
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2011-02-16
Also published as: ATE462725T1; DE69942207D1; ZA200101290B; US20030139365A1; NO20010918D0; PL346703A1; JP2002523036A; CA2339331A1; PT1107989E; PL202057B1; NO20010918L; RU2240328C2; CA2339331C; BR9913331A; JP2013128490A; EP1107989A2; AU5583699A; US20130165634A1; CN101386651A; CN100422332C

Abstract

Homodimerní fúzní protein, vykazující inhibicní aktivitu na angiogenezi, zahrnující Fc oblast imunoglobulinu a cílový protein, pricemž Fc oblast obsahuje pantovou oblast, doménu CH.sub.2.n. a doménu CH.sub.3.n. a cílový protein vykazuje endostatinovou inhibicní aktivitu na angiogenezi, jedná se o fragment kolagenu XVIII a je pripojen k N-koncum nebo C-koncum Fc oblasti imunoglobulinu. Molekula DNA kódující signální sekvenci a tento fúzní protein. Replikovatelný expresní vektor pro transfekci savcí bunky, který obsahuje tuto DNA. Zpusob produkce výše uvedeného fúzního proteinu, který zahrnuje transfekci savcí bunky výše uvedeným vektorem; produkci fúzního proteinu kultivací této bunky; a izolaci fúzního proteinu.

Description

Homodimerní fúzní protein vykazující inhibíční aktivitu na angiogenezi, způsob jeho produkce, molekula DNA a replikovatelný expresní vektor

Oblast techniky

Vynález se týká homodimemího fúzního proteinu vykazujícího inhibíční aktivitu na angiogenezi, způsobu jeho produkce, kódující molekuly DNA a replikovatelného expresního vektoru obsahujícího tuto DNA. Konkrétněji se vynález vztahuje k fuzním proteinům označovaným jako imuno10 fuziny, kde tyto proteiny zahrnují imunoglobulinovou oblast Fc a inhibitor angiogeneze.

Dosavadní stav techniky i5 Byly objeveny dva účinné inhibitory angiogeneze, a to angiostaliu (G'Reiliy a další, Cell, 79:315, 1994) a endostatin (O'Reilly a další, Cell, 88:277, 1997) a bylo zjištěno, že tyto sloučeniny jsou přirozeně produkovány primárními nádory. Oba zmíněné proteiny jsou specifickými inhibitory proliferace endoteliálních buněk a růst nádorů inhibují tím, že blokují angiogenezi (vytváření nových krevních kapilár vyživujících nádory). Následné studie prokázaly, že tyto inhibitory angiogeneze nevykazují toxické účinky ani ve vysokých dávkách, a že mohou potlačovat růst metastáz a u primárních nádorů vyvolat regresi do dormantního stavu. Bylo zjištěno, že oba tyto inhibitory jsou proteolytickými fragmenty podstatně větších intaktních molekul. Angiostatin byl identifikován jako fragment plazminogenu a endostatin jako fragment kolagenu XVIII.

Oba zmíněné proteiny vyvolaly velký zájem v oblasti výzkumu rakoviny, a to vzhledem k jejich schopnosti potlačovat na myším modelu růst mnoha rozdílných typů nádorů bez pozorovatelných nežádoucích vedlejších účinků nebo vzniku rezistence. Při tradičně používané chemoterapeutické intervenci dochází k selekci rezistentních klonů buněk, a to především v důsledku nestability genomu rakovinných buněk. Cílem terapií využívajících inhibitory angiogeneze však nejsou buň30 ky nádorové, ale „normální“ buňky endoteliální, které podporují růst nádorů. Vzhledem k tomu, že endoteliální buňky jsou geneticky stabilní, je možné, že terapie využívající inhibitory angiogeneze budou vznikem rezistence zatíženy v daleko menší míře. Provedené studie naznačují, že u myší vystavených dlouhodobému terapeutickému působení endostatinu (s antiangiogenním účinkem) nedošlo ke vzniku rezistence vůči této látce.Opakované léčebné cykly s využitím endo35 statinu vedly u myší k prodloužení doby dormance nádorů a při ukončení terapie nebyla pozorována recidiva onemocnění (Boehm a další, Nátuře, 390:440, 1997).

I přes slibné výsledky experimentů prováděných na myším modelu nebylo možné v expresívních systémech E.coli, bakulovirech, kvasinkách a savčích buňkách připravit v komerčně výhodných množstvích rozpustný, aktivní angiostatin vhodný pro klinické testování. Výsledkem exprese v E.coli byly nerozpustné proteinové agregáty nedefinovatelného složení, které nemohly být použity k injekční aplikaci do organizmu lidí. Jiné postupy, jako například bakulovirový expresívní systém nebo expresívní systémy využívající savčí buňky, produkovaly pouze velmi malá množství rekombinantních proteinů (OReilly a další, Cell, 88:277,1997).

Nízké výtěžky získané v použitých expresívních systémech mohou být vysvětleny skutečností, že jak endostatin tak angiostatin jsou vnitřními fragmenty mnohem větších proteinů. Tyto zkrácené proteiny mohou být, v důsledku absence zbytků, které jsou z prekurzorových molekul odštěpeny, nesprávně „sbaleny“. Angiostatin například obsahuje 26 cysteinových zbytků, které vytvářejí velký počet disulfidových vazeb. Při expresi samotného angiotensinu možná není vytvořeno prostředí optimální pro vznik tohoto velkého počtu disulfidových vazeb. Rekombinantní endostatin produkovaný v E.coli v průběhu dialýzy precipitoval, což je pravděpodobně důsledkem hydrofobicity tohoto proteinu (O'Reilly a další, Cell, 88:277, 1997).

- 1 CZ 302303 B6

Hlavní překážkou pro použití angiostatinu a endostatinu v jejich současné formě je skutečnost, že k dosažení požadovaného terapeutického cíle musí být od organizmu po dobu týdnů až měsíců injekčně aplikována relativně velká množství těchto proteinů. U v současnosti používaného myšího modeluje k dosažení optimální účinnosti například nutno aplikovat 20 mg/kg/den endo5 statinu (Boehm a další, Nátuře, 390:440, 1997). Vezmeme-li v úvahu, že je nezbytné klinické testování endostatinu a angiostatinu, pak je nutné vyvinout způsob produkce velkého množství tohoto materiálu v čistotě vhodné pro klinické použití.

Jedním ze systémů, který byl použit k expresi velkých množství fúzních proteinů v savčích buňio kách, je konstrukt DNA kódující signální peptid, imunoglobulinovou oblast Fc a cílový (požadovaný) protein. Fúzní protein kódovaný tímto konstruktem je obvykle označován jako „imunofúzin“. Mezi cílové proteiny, které byly úspěšně exprimovány ve formě imunofúzinů patří: IL2,

CD26, Tat, Rev, OSF-2, pIG-H3, receptor pro IgE, PSMA a gpl20. Tyto expresívní konstrukty jsou popsány v přihláškách US 5 541 087 a US 5 726 044, které jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jej ich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Hlavním cílem při expresi rekombinantních fúzních proteinů v savčích buňkách bylo pokusit se takové hybridní molekule udělit nějaké nové nebo užitečné vlastnosti jako například umožnit správné „sbalení“ (tj. vytvoření správné terciární a/nebo kvartémí struktury), zvýšit rozpustnost,

2o směrovat cytokin nebo toxin in vivo, umožnit vazbu na receptor pro Fc, fixaci komplementu, vazbu na protein A, prodloužit biologický poločas a zvýšit schopnost přecházet hematoencefalickou bariérou. Příkladem rekombinantních fúzních proteinů produkovaných v savčích buňkách jsou imunokonjugáty cytokinů (Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428, 1992); Gillies a další, Bioconjugate Chemistry, 4:230, 1993), imunoadhesiny (Capon a další, Nátuře,

337:525, 1989) a konjugát nervového růstového faktoru (Friden a další, Science, 339:394, 1993).

Každá z následujících publikací je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Úkolem vynálezu bylo vyvinout nové sekvence DNA, které by usnadnily účinnou produkci a o sekreci inhibitorů angiogeneze v savčích hostitelských buňkách. Vynález je zaměřen na využití při léčení savců s využitím nukleových kyselin kódujících, nebo aminokyselinových sekvencí definujících, inhibitory angiogeneze, včetně nepřirozených, biosyntetických nebo jiných uměle vytvořených proteinů jako například proteinů vytvořených racionálním designem.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je homodimemí fúzní protein, vykazující inhibiční aktivitu na angiogenezi, zahrnující Fc oblast imunoglobulinu a cílový protein, přičemž Fc oblast obsahuje pantovou io oblast, doménu CH₂ a doménu CH₃ a cílový protein vykazuje endo stát i novou inhibiční aktivitu na angiogenezi, jedná se o fragment kolagenu XVIII a je připojen kNkoncům nebo C-koncům

Fc oblasti imunoglobulinu.

Výhodná provedení homodimemí ho fúzní ho proteinu podle vynálezu zahrnují zejména provede45 ní, v němž

- cílovým proteinem je endostatin nebo jeho bioaktivní fragment;

- cílový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No;

- cílový protein je připojen k C-konci Fc oblasti;

- homodimemí fúzní protein dále obsahuje druhý cílový protein, kterým je fragment plasmino50 genu nebo fragment kolagenu XVIII vykazující angiostatinovou nebo endostatinovou inhibiční aktivitu na angiogenezi, přičemž

- druhým cílovým proteinem endostatin nebo angiostatin nebo jeho bioaktivní fragment;

- druhý cílový protein připojen polypeptidovým linkerem k prvnímu cílovému proteinu;

- 7 CZ 302303 B6

- první cílový protein je připojen k N-koncům Fc oblasti a druhý cílový protein je připojen k C-koncům Fc oblasti;

- prvním cílovým proteinem je endostatin a druhým cílovým proteinem je angiostatin nebo jeho bioaktivní fragment;

- imunoglobulinem IgGl;

Předmětem vynálezu je dále také molekula DNA kódující signální sekvenci a fúzní protein podle některého z výše popsaných provedení.

io Předmětem vynálezu je dále také replikovatelný expresní vektor pro transfekci savčí buňky, který obsahuje DNA definovanou výše.

Konečně je předmětem vynálezu i způsob produkce homodimemího fúzního proteinu podle některého z výše popsaných provedení, který zahrnuje tyto stupně:

(a) transfekci savčí buňky vektorem podle nároku 12, (b) produkci fúzního proteinu kultivací této buňky a (c) izolaci fúzního proteinu.

V dalším popisuje vynález ilustrován v širším kontextu. Pro rozsah ochrany jsou vsak rozhodují20 cí pouze aspekty tvořící výše uvedený „předmět vynálezu'⁴ které jsou také uvedeny v připojených patentových nárocích.

Vynález tedy obecně popisuje kompozice a způsoby využitelné pro produkci a použití fúzních proteinů zahrnujících inhibitor angiogeneze.Tyto fúzní proteiny mohou usnadnit expresi velkých množství biologicky aktivních proteinových inhibitorů angiogeneze. Proteinové inhibitory angiogeneze mohou být následně z fúzního proteinu odštěpeny a před aplikací do organizmu savce (například člověka) smíchány s farmaceuticky přijatelným nosičem. Jinou možností je smíchat nukleotidové sekvence kódující, nebo aminokyselinové sekvence definující, fúzní proteiny zahrnující inhibitor angiogeneze s farmaceuticky přijatelným nosičem a tuto směs aplikovat do orga30 nizmu savce.

Přehled obrázků na výkresech

Cíle, charakteristické rysy a výhody předkládaného vynálezu uvedené v předcházejícím i následujícím textu, jakož i vynález sám, mohou být dokonale pochopeny z následujících výhodných provedení vynálezu a přiložených obrázků. Obrázky 1A až 1F jsou schématickým znázorněním ukázkových fúzních proteinů inhibitorů angiogeneze zkonstruovaných s využitím údajů uvedených ve vynálezu (viz. příklady 10 až 15). Na obrázcích jsou znázorněny:

Obrázek 1A - fúzní protein Fc-doména kringle 1 angiostatinu

Obrázek 1B - fúzní protein Fc-vnitřní část domény kringle 1 angiostatinu Obrázek 1C - fúzní protein Fc-endostatin-linker GlySer vnitřní část domény kringle 1 angiostatinu

Obrázek 1D - fúzní protein Fc-endostatin-linker GlySer doména kringle 1 angiostatinu

Obrázek 1E - fúzní protein Fc-endostatin—linker GlySer—angiostatin

Obrázek 1F - fúzní protein angiostatin-Fc-endostatin Svislé úsečky reprezentují disulfidické vazby (nemusí být přítomny) spojující cysteinové zbytky (C) v pantové oblasti domény Fc,

Jedním aspektem vynálezu jsou molekuly nukleových kyselin, například molekuly DNA nebo

RNA, kódující fúzní protein podle vynálezu. Daná molekula nukleové kyseliny kóduje signální sekvenci, Fc oblast imunoglobulinu a alespoň jeden cílový protein, v této přihlášce označovaný jako proteinový inhibitor angiogeneze, vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin,

- 3 CZ 302303 B6 fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, fragment kolagenu XVlll s aktivitou endostatinu ajejich kombinace. Ve výhodném provedení vynálezu kóduje molekula nukleové kyseliny postupně, ve směru 5' k 3', signální sekvenci, Fc oblast imunoglobulinu a sekvenci cílového proteinu. V jiném výhodném provedení vynálezu kóduje molekula nukleové kyseliny postupně, ve směru 5' k 3', signální sekvenci, sekvenci cílového proteinu a Fc oblast imunoglobulinu.

V jiném výhodném provedení vynálezu zahrnuje Fc oblast imunoglobulinu pantovou oblast imunoglobulinu a výhodně zahrnuje alespoň jednu konstantní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce, například konstantní doménu 2 (CH₂) těžkého řetězce, konstantní doménu 3 (CH₃) těžio kého řetězce a volitelně dále konstantní doménu 4 (CH₃) těžkého řetězce. V závislosti na typu použitého imunoglobulinu je tímto vytvořena oblast Fc. Ve výhodnějším provedení vynálezu zahrnuje Fc oblast imunoglobulinu pantovou oblast, doménu CH₂ a doménu CH₃. Za určitých podmínek není v Fc oblasti imunoglobulinu zastoupena alespoň doména CH]. Ačkoliv mohou být Fc oblasti imunoglobulinu odvozeny z jakékoliv třídy imunoglobulinů, například IgA, IgD,

IgE, IgG a IgM, ve výhodných provedeních jsou používány Fc oblasti imunoglobulinu odvozené z třídy IgG.

V jiném výhodném provedení vynálezu může být nukleová kyselina podle vynálezu začleněna do expres ívního vektoru schopného replikace a tímto vektorem mohou být následně transfekovány savěí hostitelské buňky. V jiném výhodném provedení vynález popisuje hostitelské buňky nesoucí nukleotidové sekvence podle vynálezu.

Jiná stránka vynálezu popisuje fúzní protein zahrnující Fc oblast imunoglobulinu připojenou, bud¹přímo peptidovou vazbou, nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k cílovému proteinu vybranému ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu a jejich kombinace. Cílový protein může být svým C-koncem připojen kN-konci Fc oblasti imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu je nicméně cílový protein připojen svým N-koncem k C-konci Fc oblasti imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu může fúzní protein podle vynálezu zahrnovat nějaký druhý cílový protein vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu a nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu. U tohoto typu konstruktu mohou být první a druhý cílový protein totožné nebo rozdílné. Ve výhodném prove35 dění vynálezu zmíněný fúzní protein například zahrnuje první cílový protein typu angiostatinu, Fc oblast imunoglobulinu a druhý cílový protein mohou být vzájemně spojeny buď přímo, nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru. V jiném uspořádání mohou být oba cílové proteiny připojeny, buď přímo, nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k Fc oblasti imunoglobulinu. V tomto případě je první cílový protein připojen k N-konci Fc oblasti imunoglobulinu a io druhý cílový protein připojen k C-konci Fc oblasti imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu mohou být dva fúzní proteiny spojeny buď kovalentně, například disulfidovou nebo peptidovou vazbou, nebo nekovalentně, čímž je vytvořen multimemí protein. Ve výhodném provedení jsou tyto dva fúzní proteiny spojeny kovalentně prostřednictvím jedné nebo více disulfidických vazeb mezi postranními řetězci cysteinů, které se ve výhodném provedení nalézají v pantových oblastech imunoglobulinů umístěných v obou řetězcích Fc oblastí imunoglobulinů.

Ve výhodném provedení vynálezu zmíněný cílový protein zahrnuje nějaký fragment plazmino50 genu o molekulové hmotnosti přibližně 40 kD a volitelně rovněž zahrnuje aminokyselinou sekvenci uvedenou jako SEK, ID. Č.: 3. V jiném provedení vynálezu zmíněný cílový protein zahrnuje nějaký fragment kolagenu XVIII s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako SEK. ID. Č.: 1. Cílovým proteinem může být rovněž nezkrácený angiostatin nebo endostatin nebo jejich biologicky aktivní fragmenty. Zdroj cílového proteinu použitého při vytváření daných fúzních pro-4CZ 302303 B6 teinů bude záviset na plánovaném použití tohoto cílového proteinu, Bude-li například cílový protein aplikován lidem, pak by tento cílový protein měl být lidského původu.

Jiná stránka vynálezu popisuje způsoby produkce fúzního proteinu zahrnujícího Fc oblast imunoglobulinu a cílový protein vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu a nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu. Tento způsob zahrnuje následující kroky: (a) vytvoření savčí buňky nesoucí DNA kódující takový fúzní protein buď s, nebo bez signální sekvence; a (b) kultivaci takové buňky za účelem produkce zmíněného fúzního proteinu. Tento fúzní protein může být následně sebrán, je-li to nezbytné renaturován, a, s využitím standardních purifikačních technik v současnosti známých, vyčištěn. Za předpokladu, že ve zmíněném fúzním proteinu se mezi Fc oblastí imunoglobulinu a cílovým proteinem nalézá proteolyticky štěpitelná sekvence, pak může být cílový protein z fúzního proteinu s využitím běžně používaných proteolytických enzymů odštěpen a, je-li to nezbytné, před použitím purifikován.

Jiná stránka vynálezu popisuje způsoby léčby savců, například lidí, u kterých je žádoucí provést léčbu využívající inhibitory angiogeneze. Do rozsahu vynálezu například spadá aplikace inhibitorů angiogeneze lidem s nádorovými onemocněními. Léčba s využitím inhibitorů angiogeneze může zpomalit nebo zastavit růst nádorů a za určitých okolností může vyvolat regresi nádorů. Tato léčba může zahrnovat aplikaci inhibitoru angiogeneze do organizmu savce v množství dostačujícím ke zpomalení nebo zastaveni růstu nádorů. Inhibitor angiogeneze může být aplikován ve formě fúzního proteinu nebo jako nukleová kyselina, ve výhodném provedení funkčně spojena s nějakým expresívním vektorem, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Vynález popisuje fúzní proteiny, v této přihlášce označované jako imunofúziny, které jsou využitelné k produkci komerčně výhodných množství inhibitorů angiogeneze v čistotě vhodné pro klinické použití. Před použitím mohou být tyto inhibitory angiogeneze z imunofúzních proteinů odštěpeny. Do rozsahu vynálezu nicméně rovněž spadá možnost aplikace imunofúzinů nebo nukleových kyselin kódujících imunofúziny s nějakým inhibitorem angiogeneze do organizmu savců přímo bez odštěpení.

Vynález popisuje fúzní proteiny zahrnující Fc oblast imunoglobulinu a alespoň jeden cílový protein, označovaný v této přihlášce jako inhibitor angiogeneze. Inhibitor angiogeneze je ve výhodném provedení vybrán ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu. Je nicméně rovněž zřejmé, že ve formě fúzních proteinů stejného typu, jaký je popsán v této přihlášce, mohou být exprimovány i jiné polypeptidy schopné inhibovat angíogenezi, a to jak peptidy v současnosti známé, tak objevené v budoucnosti.

Na obrázcích 1A až AF je znázorněno šest proteinových konstruktů použitelných při průmyslovém využití vynálezu. Jelikož ve výhodném provedení vynálezu jsou využívány dimemí konstrukty, všechny tyto konstrukty jsou znázorněny ve formě dimerů spojených dvojicí disulfldických vazeb mezi cysteiny přítomnými v jednotlivých podjednotkách. Tyto disulfídové můstky na obrázcích spojují dvě Fc oblasti imunoglobulinu v pantové oblasti, což je charakteristickým znakem nativním forem těchto molekul. I když konstrukty zahrnující pantovou oblast Fc úseku jsou upřednostňovány a jejich použití terapeutických agens je nadějné, do rozsahu vynálezu rovněž spadají i možnosti zesíťování v jiných místech. Za určitých okolnosti mohou být rovněž produkovány d i mery nebo multimery vhodné pro praktické využití vynálezu, kde tyto dimery nebo multimery jsou spojené nekovalentně, například hydrofobními interakcemi.

Jelikož jsou homodimemí konstrukty důležitými modelovými konstrukty vynálezu, jsou tyto konstrukty znázorněny Obrázku 1. Je zřejmé, že heterodimemí konstrukty jsou rovněž využitelné, ale odborníci vědí, že takové konstrukty je často velmi obtížné puriflkovat. Mohou být nicméně vytvořeny konstrukty zahrnující směs homodimerů a heterodimerů, kde tyto konstrukty

-5 CZ 302303 B6 jsou využitelné k inhibici angiogeneze u nejrůznějších druhů savců, včetně člověka. Jeden řetězec heterodimemí struktury může například zahrnovat en dostat in a druhý například angio stati n.

Obrázek 1A znázorňuje dimerní konstrukt připravený postupem uvedeným v příkladu 10, Každá monomemí jednotka tohoto dimeru zahrnuje Fc oblast imunoglobulinu (1) včetně pantové oblasti, domény CH₂ a domény CH₃. Přímo k C-konci Fc oblasti (1) je připojena první doména kringle angiostatinu (2), a to jak její vnitřní, tak vnější část. Obrázek 1B, ilustrující další provedení vynálezu (viz. příklad 11), zahrnuje Fc oblast totožnou s Fc oblastí na obrázku 1A, kjejímuž Ckonci je tentokrát připojena pouze vnitřní část první doména kringle angiostatinu (3). Obrázky 1C ío až 1F ilustrují různé modelové proteinové konstrukty podle vynálezu. V těchto konstruktech je cílovým proteinem kombinace inhibitorů angiogeneze v tandemovém uspořádání a spojená linkerem. V konstruktu znázorněném na obrázku 1C zahrnuje cílový protein nezkrácený endostatin (4), polypeptidový linker (5) a vnitřní část první domény kringle angiostatinu (3). Obrázek 1D znázorňuje protein zahrnující Fc oblast totožnou z Fc oblastí na obrázku 1A a cílový protein zahrnující nezkrácený endostatin (4), polypeptidový linker (5) a celou první doménu kringle angiostatinu (jak vnitřní, tak vnější část) (2). Konstrukt ilustrovaný obrázkem 1E se od konstruktu na obrázku ID liší tím, že na C-konci celého konstruktu je umístěn nezkrácený řetězec angiostatinu (7).

2o Ačkoliv obrázky 1A až 1F reprezentují konstrukty typu Fc-X, kde X je cílový protein, do rozsahu vynálezu rovněž spadají konstrukty typu X-Fc, které jsou použitelné při průmyslovém využití vynálezu. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají proteiny podle vynálezu popsané vzorcem X-FcX, kde X mohou označovat totožné nebo odlišné cílové proteiny. Obrázek 1F ilustruje takový konstrukt, který ve směru od N-konce k C-konci zahrnuje nezkrácený lidský angiostatin (7), Fc oblast lidského imunoglobulinu (6) včetně pantové oblasti a nezkrácenou doménu lidského endostatinu (4).

Termín „inhibitor angiogeneze“ označuje jakoukoliv molekulu, které potlačuje nebo inhibuje tvorbu nových krevních kapilár v organizmu savců. Při léčbě rakoviny inhibitory angiogeneze potlačují nebo inhibují tvorbu nových krevních kapilár v nebo na nádorech, výhodně pak v nebo na pevných nádorech. Výhodně využitelné inhibitory angiogeneze mohou být identifikovány pomocí nej různějších stanovení v současnosti známých a používaných. Mezi taková stanovení patří například sledování proliferace bovinních endoteliálních buněk tvořících kapiláry, stanovení na kuřecích chorioalantoických membránách (CAM) nebo stanovení na myší rohovce.

V současnosti je nicméně s výhodou používáno stanovení CAM (viz. například CTReilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a O Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997; tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Stručně řečeno, z oplodněných bílých vajec (3 dny po oplození) jsou vyjmuta embrya spolu s nepoškozených žloutkem a tato jsou umístěna na Petriho misky. Po třídenní inkubaci při 37 °C v atmosféře 3%

CO₂ je na chorioalantoickou membránu každého z embryí umístěn disk z methylcelulózy obsahující předpokládaný inhibitor angiogeneze. Po přibližně 48 hodinové inkubaci jsou chorioalantoické membrány pozorovány pod mikroskopem a jsou zde sledovány známky inhibice angiogeneze.

Příkladem inhibitorů angiogeneze výhodně používaných při praktickém využití vynálezu jsou angiostatin (0'Reilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a přihlášky US 5 733 876, US 5 837 682 a US 5 885 795) a endostatin (O Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997; a přihláška US 5 854 205). Jak již bylo zmíněno v předchozím textu, angiostatin i endostatin jsou specifickými inhibitory proliferace endoteliálních buněk a jsou schopny inhibovat růst nádorů tím, že blokují angiogenezi, což je tvorba nových krevních kapilár vyživujících nádory.

Angiostatin byl identifikován jako proteolytický fragment plasminogenu (O'Retlly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a přihlášky US 5 733 876, US 5 837 682 a US 5 885 795; tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Přes55 něji řečeno, angiostatin je vnitřní fragment plasminogenu o velikostí 38 kDa zahrnující alespoň

-6CZ 302303 B6 tři domény kringle plazminogenu. Endostatin byl identifikován jako proteolytický fragment kolagenu XVIII (O'Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Přesněji řečeno, endostatin je C—koncový fragment kolagenu XVIII o velikosti 20 kDa. Termíny „angiostatin“ a „endostatin“ označují nejenom nezkrácené proteiny, ale rovněž jejich varianty a biologicky aktivní fragmenty a rovněž biologicky aktivní fragmenty plasminogenu, respektive kolagenu XVIII. Jako biologicky aktivní fragmenty angiostatinu jsou označovány jakékoliv proteinové fragmenty plasminogenu nebo angiostatinu, které při stanovení CAM vykazují alespoň 30 %, ve výhodném provedení alespoň 70 % a nej výhodněji pak přinejmenším 90 % biologické aktivity nezkráceného angiostatinu. Jako biologicky aktivní fragmenty endostatinu jsou označovány jakékoliv proteinové fragmenty kolagenu XVI11 nebo endostatinu, které při stanovení CM A vykazují alespoň 30 %, ve výhodném provedení alespoň 70 % a nej výhodněji pak přinejmenším 90 % biologické aktivity nezkráceného endostatinu.

Tciiiiíii „Vaiiaiiíy“ zaminuje diUnOVc a alčhcké Varianty, jakOŽ i ualŠi μιιΓΟζ,βιιέ Sc Vyskytující nebo nepřirozené varianty, například varianty vytvořené genovými manipulacemi, kde tyto varianty vykazují přinejmenším 70% podobnost nebo 60% identitu, výhodněji pak 75% podobnost nebo 65% identitu a nejvýhodněji alespoň 80% podobnost nebo 70% identitu s přirozeně se vyskytujícími sekvencemi endostatinu nebo angiostatinu popsanými v této přihlášce.

Skutečnost, zda-li daný polypeptid vykazuje vzhledem k referenčnímu polypeptidu požadované procento podobnosti nebo identity, je stanovena srovnáním (alígnmentem) aminokyselinové sekvence testovaného polypeptidu s aminokyselinovou sekvencí referenčního polypeptidu s využitím dynamického algoritmu popsaného v publikaci Smith a Waterman, J. Mol. Biol,, 147:195 až 197, 1981 v kombinaci se substituční maticí BLOSUM62 popsanou na obrázku 2 v publikaci Henikoff a Henikoíf, „Aminoacid substitution matrices from protein blocks“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:10915 až 10919, 1992. Pro potřeby této přihlášky je vložení mezery do sekvence penalizovaného hodnotou -12 a prodloužení mezery pak hodnotou -4. Počítačové programy provádějící srovnávání sekvencí (alignment) s využitím algoritmu Smith-Waterman a matice BLOSUM62 jako například programový balík GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, England) jsou komerčně dostupné a odborníky často využívané.

Jakmile je provedeno srovnání kandidátní sekvence se sekvencí referenční, může být spočteno procento podobnosti. U jednotlivých aminokyselin je postupně srovnávána jejich vzájemná podobnost. Je-li v matici BLOSUM62 hodnota dvou vzájemně si přiřazených aminokyselin nulová nebo záporná, pak skóre pro tuto dvojici je nula; v jiném případě je skóre pro tuto dvojici 1,0. Prvotní neupravené skóre podobnosti je poté součtem hodnot podobností pro jednotlivé dvojice aminokyselin. Neupravené skóre je následně normalizováno dělením počtem aminokyselin v kratší ze srovnávaných sekvencí. Toto normalizované skóre odpovídá procentu podobnosti. Procento identity je počítáno obdobně. Vzájemně si přiřazené aminokyseliny jsou postupně srovnávány. Jestliže dvě vzájemně si přiřazené aminokyseliny nejsou totožné, pak hodnota identity je nulová; v opačném případě je hodnota identity rovna 1,0. Prvotní neupravené skóre identity je součtem hodnot identit aminokyselinových párů. Neupravené skóre je následně normalizováno dělením počtem aminokyselin v kratší ze srovnávaných sekvencí. Toto normalizované skóre odpovídá procentu identity. Při výpočtu procenta identity nebo podobnosti jsou inzerce a delece ignorovány. Ve stejném duchu nejsou v těchto výpočtech rovněž zahrnuty penalizace za vlození/prodloužení mezery, ačkoliv tyto jsou použity při počátečním srovnání sekvencí (alignmentu).

Cílové proteiny popsané v přihlášce jsou exprimovány ve formě fúzních proteinů s Fc oblastí nějakého imunoglobulinu. Je známo, že každá konstantní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce se skládá ze čtyř nebo pěti domén. Tyto domény jsou označovány následovně: CHi-pantová oblast-CH₂“CH₃-(-CH4). Sekvence DNA jednotlivých domén těžkých řetězců vykazují zkříženou homologii mezi jednotlivými třídami imunoglobulinů. Doména CH₂ imunoglobulinu IgG je například homologní s doménou CH₂ imunoglobulinů IgA a IgD a s doménou CH₃ imunoglobulinů IgM a IgE.

-7CZ 302303 B6

Termín „Fc oblast imunoglobulinu“ označuje C-koncovou část konstantní oblasti imunoglobulinového řetězce, výhodněji pak konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část. Fc oblast může například zahrnovat: 1) doménu CH], doménu CH₂ a doménu CH₃, 2) doménu

CH] a doménu CH₂, 3) doménu CH| a doménu CH₃, 4) doménu CH₂ a doménu CH₃ nebo 5) kombinaci dvou nebo více domén a pantové oblasti imunoglobulinu. Ve výhodném provedení vynálezu zahrnuje Fc oblast v konstruktu DNA alespoň pantovou oblast imunoglobulinu, doménu CH₂ a doménu CH₃ a ve výhodném provedení postrádá alespoň doménu CHj.

io Ve výhodném provedení vynálezu jsou jako zdroj konstantních částí těžkých řetězců využívány imunoglobuliny typu IgG (Igy) (podtřídy 1, 2, 3 nebo 4). Mohou být nicméně rovněž použity jiné imunoglobulínové třídy jakými jsou IgA (Iga), IgD (Igó), IgE (Ige) a IgM (Igp). Volna vhodné konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu je detailně diskutována v přihláškách US 5 541 087 a US 5 726 044. Předpokládá se, že odborníci budou schopni zvolit vhodné sekvence i? konstantních oblastí těžkých řetězců imunoglobulinů z dostupných imunoglobulinových tříd a subtypů tak, aby bylo dosaženo požadovaného výsledku. Část konstruktu DNA kódující Fc oblast imunoglobulinu ve výhodném provedení zahrnuje alespoň část pantové oblasti a rovněž alespoň část domény CH₃ odvozené z Fcy nebo homologních domén v imunoglobulinech typu IgA, IgD,

IgE nebo IgM.

V závislosti na způsobu využití mohou být použity rovněž geny kódující konstantní oblasti z jiných živočišných druhů, například myší nebo potkanů. Oblast Fc, použitá jako fúzní partner v konstruktu DNA kódující imunofúzin, může být obecně odvozena zjakéhokoliv druhu savce. Je-li nežádoucí vyvolat v hostitelské buňce nebo organizmu imunitní odpověď vůči použité Fc oblasti, pak tato oblast může být odvozena ze stejného druhu kjakému náleží hostitelská buňka nebo živočich. Je-li například hostitelská buňka lidského původu nebo je-li hostitelem člověk, pak je použita lidská oblast Fc; obdobně je použita myší oblast Fc v případech, kdy je hostitelským živočichem myš. Využitelné jsou rovněž substituční nebo deleční mutanty oblastí Fc, kde je v doménách konstantní oblasti odstraněn nebo nahrazen jeden nebo více aminokyselinových zbytků. Jedním z příkladů je zavedení aminokyselinových substitucí v doméně CH₂, čímž je vytvořen mutant se sníženou afinitou vůči receptorům pro Fc (Cole a další, J. Immunol, 159:3613, 1997). Odborník bude s využitím metod molekulární biologie schopen takové konstrukty snadno připravit.

Použití lidských Fcyl jako oblastí Fc s sebou nese řadu výhod. Bude-li například fúzní protein inhibitor angiogeneze-Fc využit jako biologický léčivý přípravek, pak doména Fcyl může v tomto proteinu vykonávat určité efektorové funkce. Mezi tyto efektorové funkce patří biologické aktivity jako například fixace komplementu, buněčná toxicita vyvolaná protilátkou, přechod přes placentu a prodloužení biologického poločasu v krevním oběhu. Doména Fc rovněž umožňuje detekci metodou ELISA s využitím protilátek proti Fc a purifikaci s využitím vazby na protein A z mikroorganizmu Staphylococcus aureus („protein A“). Při některých aplikacích je nicméně žádoucí odstranit určité efektorové funkce oblasti Fc, jako například vazbu na receptory pro Fc nebo fixaci komplementu.

V případě imunofúzinů s inhibitorem angiogeneze je jednou z funkcí oblasti Fc usnadnit správné „sbalení“ daného inhibitoru angiogeneze tak, aby byl vytvořen aktivní inhibitor angiogeneze, a zvýšit rozpustnost aktivních částí fúzního proteinu, a to přinejmenším v extracelulámím médiu. Jelikož oblast Fc je hydrofilní, pak její imunofúziny s inhibitory angiogeneze jsou, na rozdíl například od rekombinantního endostatinu produkovaného v E.coli, rovněž snadno rozpustné (O'Reilly, Cell, 88:277, 1997). Ve všech příkladech uvedených v této přihlášce bylo dosaženo vysoké hladiny produkce imunofúzinů. Imunofúziny s inhibitory angiogeneze byly obvykle sekretovány do média v koncentracích přibližně 30 až 100 gg/ml a mohly být snadno purifikovány chromatografií na Sepharóze s navázaným proteinem A (protein A-sepharóza). Imunofúziny s inhibitory angiogeneze mohou být rovněž rozštěpeny a dále purifi kovány s využitím standard-8CZ 302303 B6 nich purifikačních postupů využívajících například heparin-Sepharózu, lysin-Sepharózu nebo nějaký způsob afinitní purifikace.

Mimo vysokých hladin exprese se fúzní proteiny podle vynálezu rovněž vyznačují dalšími biolo5 gickými poločasy v krevním oběhu, a to pravděpodobně v důsledku jejich větších molekulových hmotností. Biologický poločas fúzního proteinu lidský Fc-lidský angiostatin v krevním oběhu myší je například 33 hodin. Biologický poločas lidského angiostatinu je pro srovnání pouze 4 až 6 hodin (O^rReilly a další, Nátuře Médieine, 2:689, 1996). Předpokládá se, že angiostatin s molekulovou hmotností 40 kDa a endostatin s molekulovou hmotností 20 kDa jsou dostatečně malé, io aby mohly být odstraněny filtrací v ledvinách. Naproti tomu dimemí formy Fc-angiostatin a Fcendostatin mají molekulové hmotnosti 145 kDa, respektive 100 kDa, a to proto, že ke dvěma molekulám angiostatinu nebo dvěma molekulám endostatinu jsou připojeny dvě oblasti Fc imunoglobulinu. Tyto dvoj vazné struktury mohou vykazovat vyšší vazebné afinity k receptorům pro angiostatin nebo endostatin. Je-li inhibiční aktivita angiogeneze zprostředkovaná receptorem, pak fúzní proteiny s oblastí Fc jsou při potlačení růstu nádorů potenciálně daleko účinnější než samotný monovalentní angiostatin nebo endostatin. Mimo to, jestliže angiostatin a/nebo endostatin patří do skupiny dimemích proteinových ligandů, pak připojená oblast Fc „vnutí“ angiostatinu nebo endostatinu takové prostorové uspořádání, že dimerizace bude probíhat intramolekulámě, dimerizační rovnováha bude posunuta směrem k tvorbě dimeru a tím dojde k zesílení vazby na příslušný receptor. Standardními rekombinantními technikami manipulace DNA můžou být rovněž na vhodná místa monomerů umístěny cysteinové zbytky a vytvořením kovalentní disulfidické vazby může být dimer stabilizován.

Termín „multivalentní“ označuje rekombinantní molekulu, která zahrnuje dvě nebo více biolo25 gicky aktivních částí. Proteinové fragmenty vytvářející multivalentní molekulu mohou být spojeny polypeptidovým řetězcem, který spojuje jednotlivé části, aniž by přitom docházelo k posunu čtecího rámce, a umožňuje všem těmto částem fungovat nezávisle.

Termín „bivalentní“ označuje multivalentní rekombinantní molekulu, která ve fúzním konstruktu podle vynálezu zahrnuje dva cílové proteiny, například molekulu Fc-X, kde část X je nezávisle zvolená ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin nebo jejich varianty. Jelikož k imunoglobulinové oblasti Fc jsou připojeny dvě části X (oblast Fc je obvykle dimer fragmentů těžkých řetězců zahrnující přinejmenším část pantové oblasti a domény CH₃ a volitelně doménu CH₂), tato molekula je bivalentní (viz. například obr. 1A). Jestliže může být fúzní konstrukt podle vynálezu popsán vzorcem Fc-X-X, pak výsledná dimemí molekula Fc je tetravalentní. Zmíněné dva proteiny vytvářející molekulu Fc-X-X mohou být spojeny peptidovým linkeřem. Zdánlivá vazebná afinita mezi bivalentní molekulou a receptorem může být vyšší než u molekuly monovalentní. Jestliže se například jedna endostatinová Část fúzního proteinu Fc-endostatin váže na receptor na povrchu buněk s určitou afinitou, pak druhá endostatinová část téhož fúzního proteinu

4ϋ Fc-endostatin se může na receptor na téže buňce vázat s výrazně vyšší afinitou (zdánlivou afinitou). Tato skutečnost je způsobena fyzickým přiblížením druhé endostatinové části k příslušnému receptoru po navázání první endostatinové části. V případech vazby protilátky na anti gen je zdánlivá afinita zvýšena přinejmenším 10000-krát.

Termíny „multimemí“ a „multimer“ označují stabilní spojení (asociaci) dvou nebo více póly peptidových řetězců. Tyto řetězce mohou být spojeny buď kovalentně, například disulfidickou vazbou, nebo nekovalentně, například hydrofobními interakcemi. Termín multimer zahrnuje jak homomultimery, kde jsou všechny polypeptidy totožné, tak heteromultimery, v nichž jsou polypeptidy rozdílné.

Termín „dimemí (molekula)“ je specifickým typem multimemí molekuly, v níž jsou dva proteinové polypeptidové řetězce spojeny kovalentní nebo nekovalentní vazbou. Mělo by být zřejmé, že imunoglobulinová oblast Fc (fragment Fc) je obvykle dimer fragmentů těžkých řetězců zahrnující přinejmenším část pantové oblasti a domény CH₃ a volitelně doménu CH₂. Je známo množství proteinových ligandů, které se na příslušné receptory vážou ve formě dimerů. Jestliže

-9 Q7. 302303 B6 proteinový ligand X dimeruje přirozeně, pak část X v molekule Fc-X bude dimerovat daleko snadněji, protože dimerizace je koncentračně závislá. Fyzické přiblížení dvou molekul X spojených asociovanými imunoglobulinovými oblastmi Fc způsobí, že dimerizace bude probíhat intramolekulámě, dimerizační rovnováha bude posunuta směrem k tvorbě dimeru a tím dojde k zesílení vazby na příslušný receptor.

Je pochopitelné, že v přihlášce jsou k vytváření fúzních proteinů s oblastí Fc, použitelných při průmyslovém využití vynálezu, používány metody práce s rekombinantní DNA. Fúzní konstrukty s oblastí Fc jsou ve výhodném provedení konstruovány na úrovni DNA a takto připravené DNA io jsou integrovány do expresívních vektorů a exprimovány. Tímto způsobem jsou připravovány imunofúziny. Termín „vektor“ označuje jakoukoliv nukleovou kyselinu obsahující nukleotidové sekvence, které mohou být inkorporovány do hostitelské buňky, a zde rekombinovat s nebo se integrovat do genomu takové buňky nebo se replikovat autozomně ve formě epizomu. Mezi takové vektory patří lineární nukleové kyseliny, plazmidy, fágmidy, kosmidy, vektory na bázi

RNA, virové vektory a podobně. Příkladem virových vektorů jsou retroviry, adenoviry a viry asociované s adenoviry. Termíny „genová exprese, exprese genu nebo exprese“ cílového proteinu zahrnují transkripci sekvence DNA, translaci příslušného transkriptu mRNA a sekreci fúzního proteinu s oblastí Fc.

Výhodně používaný expresívním vektorem je expresívní vektor pdCs (Lo a další, Protein Engineering, 1 1:495 až 500, 1998; tato citace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). V tomto vektoru je k transkripci genu Fc-X využíván posilovač transkripce/promotor z lidského cytomegaloviru a polyadenylační signál SV40. Sekvence posilovače transkripce a promotoru lidského cytomegaloviru byly odvozeny z nukleotidů -601 až +7 v sekvenci popsané v publikaci Boshart a další, Cell, 41:521, 1985; tato citace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Tento vektor rovněž jako selekční markér obsahuje gen pro mutantní dihydrofolát reduktázu (Simonsen a Levinson, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80:2495, 1983; tato citace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu).

Vhodné hostitelské buňky mohou být transformovány nebo transfekovány sekvencemi DNA podle vynálezu a využity k expresi a sekreci cílového proteinu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou jako hostitelské buňky využívány imortalizované hybridomové buňky, buňky myelomu NS/0, buňky 293, buňky z ování čínského křečka, buňky HeLa a buňky COS.

Fúzní proteiny podle vynálezu jsou ve výhodném provedení konstruovány tradičními metodami práce s rekombinantní DNA. Tyto fúzní proteiny jsou ve výhodném provedení produkovány expresí molekuly DNA kódující signální sekvenci, oblast Fc imunoglobulinu a nějaký cílový protein (v této přihlášce rovněž označován jako inhibitor angiogeneze) v hostitelských buňkách.

Ve výhodném provedení tyto konstrukty, ve směru od 5' ke 3', kódují signální sekvenci, oblast Fc imunoglobulinu a příslušný cílový protein. Alternativně mohou tyto konstrukty, ve směru od 5' ke 3', kódovat signální sekvenci, příslušný cílový protein a oblast Fc imunoglobulinu.

Termín „signální sekvence, signální peptid“ označuje peptidovou sekvenci, která umožňuje sek45 reci fúzního proteinu imunoglobulinu a inhibitoru angiogeneze, a která je následně od tohoto imunofúzinu odštěpena. Signální sekvencí je polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci zahajující transport proteinu přes membránu endoplazmatického réti kul a. Mezi signální sekvence využitelné ve vynálezu patří signální sekvence z lehkých řetězců protilátek, například protilátky 14.18 (Gillies a další, J. of Immunol. Meth., 125:191 až 202, 1989), signální sekvence z těžkých řetězců protilátek, například signální sekvence z těžkého řetězce protilátky MOPC141 (Sakano a další, Nátuře, 286:5774, 1980) a jakékoliv jiné signální sekvence v současnosti známé (viz. například Watson, Nucleic Acid Res., 12:5145, 1984). Každá z těchto citací je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

- 10 CZ 302303 B6

Signální sekvence jsou v současnosti dobře charakterizovány a obvykle zahrnují 16 až 30 aminokyselin; mohou nicméně zahrnovat více nebo méně aminokyselin. Typický signální peptid zahrnuje tři oblasti: Bazickou N-koncovou oblast, střední hydrofobní oblast a polárnější C-koncovou oblast. Střední hydrofobní oblast zahrnuje 4 až 12 hydrofobních aminokyselinových zbytků, které při transportu nascentního polypeptidu ukotvují signální peptid ve dvojvrstvě lipidové membrány. Následně je signální peptid obvykle v lumen endoplazmatického retikula odštěpen enzymy označovanými jako signální peptidázy. Místa potenciálního štěpení jsou obvykle definována pravidlem „(-3, -1)“. Typický signální peptid má tedy v oblasti -1 až -3 obvykle malé neutrální aminokyselinové zbytky a nevyskytuje se zde prolin. Příslušná signální peptidáza io rozštěpí signální peptid mezi aminokyselinami -1 a +1. Signální sekvence (kódovaná příslušným úsekem DNA) může být tedy od N-konce imunofúzinu v průběhu sekrece odštěpena. Výsledkem pak je sekrece imunofúzinu zahrnujícího oblast Fc a cílový protein. Detailní popis signálních sekvencí je uveden v publikaci von Heijne, Nucleic Acid Res., 14:4683, 1986, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Odborníkům je zřejmé, že volba signální sekvence vhodné pro použití ve vynálezu může vyžadovat provedení několika rutinních experimentů, jako například určení schopnosti použité signální sekvence řídit sekreci připojeného imunofúzinu a rovněž stanovení optimální konfigurace, genomové DNA nebo cDNA, této sekvence k dosažení účinné sekrece imunofúzinu. Odborník je rov20 něž schopen na základě pravidel popsaných v publikaci von Heijne (citace uvedena výše) vytvořit syntetický signální peptid a standardními experimenty stanovit jeho účinnost. Signální sekvence muže být rovněž označována jako „signální peptid“, „vedoucí peptid“ nebo „vedoucí sekvence“.

Konstrukt vzniklý připojením signální sekvence k imunoglobulinové oblasti Fc je někdy v přihlášce označován jako sekretomí kazeta. Příkladem sekretomí kazety použitelné při průmyslovém využití vynálezu je polynukleotid kódující, ve směru od 5' k 3', gen pro signální sekvenci lehkého imunoglobulinového řetězce a gen pro oblast Fcyl lidského imunoglobulinu yl. Oblast Fcyl genu pro lidský imunoglobulin γΐ ve výhodném provedení zahrnuje alespoň část pantové oblasti a část domény CH₃ nebo alternativně alespoň část pantové oblasti a část domény CH₂ a domény CH₃. DNA kódující sekretomí kazetu se může nacházet v konfiguraci genomové DNA nebo cDNA.

V jiném provedení vynálezu je mezi sekvence kódující sekretomí kazetu a inhibitor angiogeneze vložena sekvence DNA kódující proteolyticky štěpitelné místo. Toto místo umožňuje proteolytické štěpení kódovaného fúzního proteinu a tudíž oddělení domény Fc od inhibitoru angiogeneze. Termín „proteolyticky štěpitelné místo“ označuje aminokyselinové sekvence, které jsou přednostně Štěpeny proteolytickými enzymy nebo jinými látkami schopnými proteolýzy. Výhodně využívaná proteolyticky štěpitelná místa zahrnují aminokyselinové sekvence, které jsou roz40 poznávány proteolytickými enzymy jako například trypsinem, ptasminem nebo enterokinázou K. Je známo množství dvojic štěpitelné místo/proteolytické agens. Viz. například přihláška US 5 726 044, která je zde uvedená záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Je-li cílovým proteinem prekurzorová molekula angiostatinu, endostatinu nebo nějaké z jejich aktivních variant, pak požadovaný proteinový produkt může být štěpen endogenními proteolytickými enzymy jako například elastinem nebo plasminem nebo urokinázou.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají fúzní proteiny obsahující různé kombinace rekombinantního angiostatinu nebo endostatinu nebo jejich fragmentů, které mohou být připraveny ve velkých množstvích. I přes prokazatelnou účinnost při potlačování růstu nádorů není mechanizmus, kte50 rým angiostatin a endostatin blokují angiogenezi, dokonale pochopen. Angiostatin zahrnuje několik domén typu kringle a endostatin obsahuje různé strukturní motivy, z nichž každý může být odpovědný za nebo přispívající k vazbě na proteiny endoteliálních buněk a antioangiogenní aktivitu. Do rozsahu vynálezu tudíž spadají cílové proteiny, které jsou biologicky aktivními fragmenty angiostatinu, jako například kringle I, kringle 2, kringle 3 ajejich kombinace, a biologicky

-11CZ 302303 B6 aktivní fragmenty endostatinu, které vykazují aktivity fyziologicky podobné přirozeně se vyskytujícím nezkráceným molekulám angiostatinu nebo endostatinu.

Další provedení vynálezu popisuje bifiinkční hybridní konstrukty inhibitorů angiogeneze. Termín „bifiinkční hybridní molekula“ označuje protein vytvořený kombinací dvou proteinových podjednotek, kde tyto dvě podjednotky mohou pocházet z odlišných proteinů. Každá z těchto proteinových podjednotek má svou nezávislou funkci a v dané hybridní molekule mohou být funkce těchto dvou podjednotek aditivní nebo synergické. Tyto funkční hybridní proteiny by umožnily prozkoumat synergické účinky angiostatinu a endostatinu na živočišných modelech. Ve výhod10 ném provedení zahrnují bifiinkční hybridy alespoň dva rozdílné inhibitory angiogeneze tandemově spojné přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru. Ve výhodném provedení vynálezu například cílová sekvence kóduje alespoň část angiostatinu připojenou ve stejném čtecím rámci k části endostatinu a jak angiostatinová, tak endostatinová doména vykazují anti-angiogenní aktivitu nebo inhibici angiogeneze. Tyto dvě jednotky mohou být spojeny polypeptidovým linkerem.

Termín „polypeptidový linker“ označuje nějakou peptidovou sekvenci, která může spojovat dva proteiny nebo nějaký protein a oblast Fc. Polypeptidový linker ve výhodném provedení zahrnuje větší množství aminokyselin jakými jsou například glycin a/nebo serin. Ve výhodném provedení zahrnuje polypeptidový linker sérii peptidů obsahujících glycin a serin v počtu přibližně 10 až 15 zbytků. Viz. například přihláška US 5 258 698, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Je nicméně zřejmé, že optimální délka linkeru a optimální aminokyselinové složení mohou být určeny standardními experimenty.

Bylo zjištěno, že expresí různých částí angiostatinu ve fúzi s oblastí Fc je možné dosáhnout vysokých hladin exprese. Důvodem je pravděpodobně skutečnost, že část Fc funguje jako nosič usnadňující správné „sbalení“ polypeptidu na C-konci, Oblast Fc může být navíc glykosylována a při fyziologické hodnotě pH je vysoce nabitá a tudíž usnadňuje solubilizaci hydrofobních proteinů.

Vynález rovněž popisuje způsoby produkce fúzních proteinů oblastí Fc a angiotensinu a endostatinu z jiných živočišných druhů. Fúzní proteiny s inhibitory angiogeneze z jiných druhů než člověk jsou vhodné pro preklinické studie inhibitorů angiogeneze, jelikož před testováním na lidech musí být účinnost a toxicita proteinových léčiv testována na živočišných modelech. Lidské pro35 teinové sekvence nemusí na myších modelech fungovat, jelikož tyto proteiny mohou vyvolávat imunitní reakci a/nebo vykazovat odlišné farmakokinetické parametry, čímž by docházelo ke zkreslení výsledků. Ekvivalentní myší proteiny jsou tudíž pro testování na myších modelech nejlepší náhražkou proteinů lidských.

Srovnání rozpustných fúzních proteinů huFc-huAngiostatin, huFc-huEndostatin, muFc-muAngiostatin a muFc-muEndostatin s totožnými nerozpustnými proteiny produkovanými v expresívním systému E.coli bylo provedeno na standardním myším modelu Lewisova karcinomu plic (O Reilly a další, Cell, 88:277, 1997). Rozpustné fúzní proteiny byly při potlačení růstu nádorů v modelu Lewisova karcinomu plic výrazně účinnější než odpovídající proteiny produkované v E.coli. Laboratorní myši jsou navíc inbrední a nádory se nevytvářejí spontánně, ale jejich tvorba je indukována. Účinnost na myších modelech tudíž nemusí korelovat s předpokládanou účinností vůči lidským nádorům. Preklinické studie prováděné na psech poskytnou o účinnosti těchto inhibitorů angiogeneze na spontánně vytvořené nádory daleko přesnější informace, jelikož existuje velké množství přirozeně se vyskytujících, spontánně vytvořených nádorů v organizmu psů. Způsoby produkce fúzních proteinů myší (mu) Fc-mu angiostatin, m u Fc m u Endo stati n a psí (ca) Fc-ca angiostatin, caFc-caEndostatin podle vynálezu usnadní preklinické studie inhibitorů angiogeneze jak na myších, tak na psích systémech.

Vynález popisuje způsoby léčby potíží zprostředkovaných/doprovázených nefyziologickou angiogenezí, a to aplikací DNA, RNA nebo proteinů podle vynálezu. Mezi patologické stavy

- 12CZ 302303 B6 doprovázené nefyzio logickou angiogenezi patří například: pevné nádory, leukémie, metastázy, benigní nádory včetně hemangiomů, neurofibromů, trachomů a pyrogenních granulomů; revmatická arthritida; lupénka; poškození zrakového aparátu (diabetická retinopatie, retinopatie způsobená předčasným narozením, degenerace makuly, odvržení štěpu rohovky, neovaskulámt glau5 kom), retrolentální fibroplazie, rubeosis iridis, Osler-Webberův syndrom; angiogeneze na srdečním svalu; neovaskularizace atherosklerotických plátů; teleangiektazie; angioftbromy kloubů hemofíliků; a granulace poranění; a nadměrná nebo abnormální stimulace endoteliálních buněk, srůst střev, artheroskleróza, sklerodermální a hypertrofované jizvy, tj. keloidy.

io

Konstrukty DNA popsané v této přihlášce mohou být využitelné při genových terapiích, při nichž je gen pro angiostatin nebo endostatin zaveden do buněk jedním z mnoha způsobů, kdy například nativní DNA je spojena s promotorem nebo DNA ve virovém vektoru. Jakmile je tato DNA zavedena do buňky, gen pro angiostatin a/nebo endostatin nebo gen pro fragmenty těchto molekul je exprimován a příslušný protein je produkován in vivo a může vykonávat svou normální uiuiugiuKuu luiiKci. z-avcucni KonsiiuKiu pouic vynaiczu uo nosiiiciSKc ounxy ma za následek vysokou hladinu exprese příslušného fúzního proteinu. Fúzní proteiny podle vynálezu mohou být rovněž využitelné při léčbě potíží zprostředkovaných/doprovázených nefyzio logickou angiogenezí a mohou vykazovat, ve srovnání s nativními inhibitory angiogeneze nebo jinými rekombinantními inhibitory angiogeneze, vyšší účinnost, a to vzhledem ke skutečnosti, že imunofúzní proteiny s inhibitory angiogeneze podle vynálezu mají delší biologický poločas než samotné nativní inhibitory angiogeneze nebo jiné rekombinantní inhibitory angiogeneze. Bivalentní a dimemí formy podle vynálezu by, vzhledem k jejich bivalentní a dimemí struktuře, měly mít vyšší vazebnou afinitu. Bifunkční hybridní molekuly podle vynálezu mohou vykazovat vyšší klinickou účinnost, a to vzhledem k možným synergickým účinkům dvou odlišných inhibitorů angiogeneze spojených oblastí Fc nebo flexibilním polypeptidovým linkerem.

Přípravky podle vynálezu mohou být do organizmu živočichů aplikovány jakýmkoliv vhodným způsobem, přímo (například lokálně injekcí, implantátem nebo místní aplikací na postiženou tkáň) nebo systémicky (například parenterálně nebo orálně). Je-li přípravek aplikován parenterál30 ně, například intravenózně, subkutánně, do oka, intraperitoneálně, intramuskulámě, na tkáň tváře, rektálně, vaginálně, intraorbitálně, intracerebrálně, intrakraniálně, intraspinálně, intravetrikálámě, intrathekálně, intracisternálně, intrakapsulámě, intranazálně nebo prostřednictvím aerosolu, pak ve výhodném provedení část tohoto přípravku zahrnuje vodnou suspenzi nebo roztok nebo suspenzi nebo roztok v jiné fyziologicky přijatelné kapalině. Použitý nosič nebo vehikulum jsou tudíž fyziologicky přijatelné, takže s výjimkou umožnění aplikace daného přípravku do organizmu pacienta, tyto složky žádným nežádoucím způsobem neovlivňují rovnováhu elektrolytů a/nebo objem v organizmu pacienta. Kapalné médium pro použitou sloučeninu může tudíž například zahrnovat fyziologický roztok (například 9,85% vodný roztok NaCI, 0,15 M, pH 7,0 až 7,4).

Ve výhodném provedení je na jednu aplikaci použito množství imunofúzinu v intervalu 50 ng/m²až 1 g/m², výhodněji pak 5 pg/m² až 200 mg/m² a nejvýhodněji 0,1 až 50 mg/m². Ve výhodném provedení je na jednu aplikaci použito množství nukleové kyseliny kódující imunofúzin v intervalu 1 pg/m² az 10 mg/m², výhodněji pak 20 pg/m² až 10 mg/m² a nejvýhodněji 400 pg/m² až 4 mg/m². Je zřejmé, že optimální způsoby aplikace a dávkování mohou být stanoveny na základě výsledků standardních experimentů v současnosti známých.

- 13 CZ 302303 B6

Příklady provedení vynálezu

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které ovšem nelimitují rozsah vynálezu.

Příklad 1

Exprese huFc-hu Endostatin io Lidský endostatin byl exprimován ve formě fúzního proteinu lidský Fc-lidský endostatin postupem popsaným v publikaci Lo a další, Protein Engineering, 11:495 až 500, 1998. Symbol Fc označuje Fc fragment lidského imunoglobulinu gama (sekvence DNA je uvedena jako SEK. ID. Č.: 1; aminokyselinová sekvence pak jako SEK. ID. Č.: 2). cDNA kódující endostatin (SEK. ID, Č.: 3; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 4) byla polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) upravena tak, aby mohla být exprimována jako fúzní protein Fc-Endo. Použitými přímými primery byl buď primer 5-CCCCGGTAAACACAGCCACCGCGACTTCC (SEK. ID. Č.: 5; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 6), nebo primer 5 -CAAGCTTCACAGCCACCGCGACTTCC (SEK. ID. Č.: 7; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK.ID.Č.:8), kde sekvenci kódující N-konec endostatinu předcházely sekvence rozpoznávané restrikční endonukleázou Xmal, respektive Hin-dlll. Primer obsahující místo Xmal upravoval cDNA pro endostatin tak, aby mohla být zaligována do místa Xmal na konci domény CH₃v oblasti IgGFc. Primer obsahující místo HindlII upravoval cDNA pro endostatin tak, aby mohla být zaligována do místa HindlII ve vektoru pdCs-Fc(D₄K). Tento vektor obsahuje sekvenci Asp4-Lys rozpoznávanou enterokinázou (LaVallie a další, J. Biol. Chem., 268:23311 až 23317,

1993). Použitým reverzním primerem byl primer 5'-CCTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATG (SEK. ID. Č.: 9), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec endostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol. Produkty amplifikované PCR byly klonovány a osekvenovány a fragment ohraničený restrikčními místy Xmal-Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-Fc štěpeného stejnou dvojicí enzymů. Obdobně byl fragment ohraničený restrikčními místy HindiiI/Xhol byl zaligován do vektoru pd-Cs-huFc(D₄K) štěpeného stejnou dvojicí enzymů. Stabilní klony exprimující Fc-endo nebo Fc(D₄K)-endostatin byly získány elektroporací buněk N/S0 a následnou selekcí v kultivačním médiu obsahujícím ΙΟΟπΜ methotrexát Exprese proteinů byla testována metodou ELISA využívající protilátky proti lidskému Fc (Příklad 3) a potvrzena SDS-PAGE, kde byl pozorován proteinový produkt o velikosti

3? přibližně 52 kDa, Klony produkující největší množství proteinu byly subklonovány limitním ředěním.

Příklad 2

Kultivace buněk a transfekce

Transientní transfekce byly provedeny tak, že příslušný plazmid byl do lidských ledvinných buněk 293 zaveden koprecipitací plazmídové DNA s fosforečnanem vápenatým (Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) nebo lipofekcí s využitím Lipofectaminu Plus (Life Technologies, Gaithesburg, MD) postupem doporučeným výrobcem.

Stabilně transfekované klony byly připraveny elektroporací plazmídové DNA do buněk myšího myelomu NS/0. Buňky NS/0 byly kultivovány v Eaglově médiu modifikovaném podle Dulbecca doplněném 10% fetálním telecím sérem. Přibližně 5 x 10⁵ buněk bylo jednou promyto PBS a rozsuspendováno v 0,5 ml PBS. S takto připravenými buňkami bylo následně v elektroporaění kyvetě Gene Pulser (vzdálenost elektrod 0,4 cm, BioRad, Hercules CA) po dobu 10 minut při 0 °C inkubováno deset mikrogramů linearizované plazmídové DNA. Elektroporace byla provedena elektroporátorem Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) s nastaveními 0,25 V a 500 pF, Buňky

- 14CZ 302303 B6 byly ponechány 10 minut na ledu a poté rozsuspendovány v kultivačním médiu a vysety na 96-ti jamkové destičky. Stabilně transfekované klony byly selektovány kultivací v médiu obsahujícím lOOnM methotrexát (MTX), který byl do média přidán dva dny po transfekci. Selekční médium bylo měněno každé tři dny a klony rezistentní vůči methotrexátu se začaly objevovat za 2 až 3 s týdny. Klony exprimující požadovaný protein byly identifikovány metodou ELIS A s využitím protilátek proti Fc. Klony produkující velká množství rekombinantních proteinů byly izolovány a namnoženy v kultivačním médiu obsahujícím lOOnM MTX.

io Příklad 3

ELISA

Koncentrace proteinových produktů v supematantech po kultivaci klonů rezistentních vůči MTX a v jmych testovaných vzorcích byly stanovovány trenn odlišnými metodami ELIS A. Obsah proteinů zahrnujících lidský Fc byl stanovován metodou ELISA využívající protilátky proti lidskému Fc (hu-Fc). Obsah proteinů zahrnujících myší Fc a psí Fc byl stanovován metodou ELISA využívající protilátky proti myšímu Fc (muFc), respektive psímu Fc (caFc). Postup ELISA využívající protilátky proti lidskému Fc je detailněji popsán v dalším textu.

A. Potahování destiček

96—tí jamkové destičky (Nunc-Immuno plate MaxiSorp™, Nalge Nunc International, Rochester, NY) byly potaženy Af-finiPure Goat anti-Human IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch

Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 gg/ml v PBS v objemu 100 μΙ/jamka. Potažené destičky byly zakryty a inkubovány při 4 °C přes noc. Následně byly destičky 4—krát promyty 0,05% Tweenem v PBS a blokovány roztokem 1% BSA/1% kozí sérum v PBS v objemu 200 μΙ/jamka. Blokování probíhalo 2 hodiny při 37 °C, destičky byly následně 4-krát promyty 0,05% Tweenem v PBS a vysušeny poklepem na suché papírové ručníky.

B. Inkubace s testovaným vzorkem a sekundární protilátkou

Testované vzorky byly na vhodnou koncentraci zředěny vzorkovým pufrem obsahujícím 1% BSA/1% kozí sérum/0,05% Tween v PBS. S využitím chimérické protilátky (s lidským Fc) o známé koncentraci byla vytvořena standardní křivka. Standardní křivka byla vytvořena tak, že byla připravena ředění standardu ve vzorkovém pufru v intervalu 125 až 3,9ng/ml. Zředěné vzorky a standardy byly naneseny na destičky v objemu 100 μΙ/jamka a destičky byly následně inkubovány po dobu 2 hodin při 37 °C. Po inkubaci byly destičky 8-krát promyty 0,05% Tweenem v PBS. Následně bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ sekundární protilátky proti lids40 kému IgG konjugované s křenovou peroxidázou (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) v ředění přibližně 1:120 000 ve vzorkovém pufru. Přesné ředění sekundární protilátky musí být stanoveno pro každou šarži protilátky proti lidskému IgG konjugované s HRP, Po dvouhodinové inkubaci při 37 °C byly destičky 8-krát promyty 0,05% Tweenem v PBS.

C. Barvení

Roztok substrátu byl připraven rozpuštěním 30 mg (1 tableta) o-fenylendiamin dihydrochloridu (OPD) v 15 ml pufru o složení 0,025M kyselina citrónová/0,05 M Na₂HPC>4, pH 5, s čerstvě při50 daným 0,03% H₂O₂. Do každé jamky na destičce bylo přidáno 100 μΐ tohoto substrátu. Barevná reakce probíhala v temnu 30 minut při pokojové teplotě. Trvání barevné reakce může být měněno v závislosti na variabilitě v potažení destiček, variabilitě sekundárních protilátek atp. Barevná reakce byla ukončena přídavkem 4N H₂SO₄ v objemu 100 μΙ/jamka. Absorbance byla detekována

- 15 CZ 302303 B6 na čtečce destiček s nastavením odečítajícím od hodnot naměřených při vlnové délce 490 nm pozadí při vlnové délce 650 nm.

Stanovení ELISA využívající protilátky proti muFc bylo podobně pouze s tou výjimkou, že jako primární protilátka byla použita AffiniPure Goat anti-muríne IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 pg/ml v PBS v objemu 100 μΙ/jamka; a jako sekundární protilátka, použitá v ředění 1 ku 5000, pak protilátka proti myšímu IgG (Fcy) konjugovaná s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Obdobně při stanovení ELISA využívající protilátky proti caFc byly destičky potaženy Affiniio Pure rabbit anti-dog IgG, specifické vůči Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 pg/ml v PBS v objemu 100 μΙ/jamka; a jako sekundární protilátka, použitá v ředění 1 ku 5000, pak protilátka proti psímu IgG (specifická vůči Fc) konjugovaná s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA).

Příklad 4

Exprese huFc-huAngiostatin

Lidský angiostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.; 10; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.; 11) byl exprimován ve formě fúzního proteinu lidský Fc-lidský angiostatin (huEc-huAngio) způsobem v podstatě identickým postupu uvedenému v Příkladu 1. cDNA kódující angiostatin (SEK. ID. Č.: 3) byla metodou PCR upravena tak, aby mohla být exprimována ve vektorech pdCs-huFc nebo pdCs-huFc (D₄K). Použitými přímými primery byl buď primer 5-CCCCGGGTAAGAAAGTGTATCTCTCAGAG (SEK. ID. Č.: 12; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 13) nebo primer 5 -CCCCAAGCTTAAAGTGTATCTCTCAGAG (SEK. ID. Č..‘ 14; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 15), kde sekvenci kódující N-konec angiostatinu předcházely sekvence rozpoznávané restrikční cndonukleázou Xmal, respektive HindlII. Použitým reverzním primerem byl primer 5'3(i CCCCTCGAGCTACGCTTCTGTTCCTGAGCA (SEK. ID. Č.: 16), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec angiostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol. Produkty amplifikované PCR byly klonovány a osekvenovány a fragment ohraničený restrikčním i místy Xmal-Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-Fc štěpeného stejnou dvojicí enzymů. Obdobně byl fragment ohraničený restrikčním i místy Hindlll/Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-huFc(D₄K). Stabilní klony NS/0 exprimující huFc-huAngio nebo huFc(D₄K)-huAngio byly selektovány a exprese testována postupy popsanými v příkladech 2 a 3.

Příklad 5

Exprese muFc-muEndostatin

Myší endostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 17; aminokyselinová sekvence uve45 děna jako SEK. ID. Č.: 18) a myší Fc (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 19; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 20) byly exprimovány ve formě fúzního proteinu myší Fc-myší endostatin (muFc-muEndo) způsobem v podstatě identickým postupu uvedeném v Příkladu 1. cDNA kódující endostatin (SEK. ID. Č.; 4) byla metodou PCR upravena tak, aby mohla být exprimována ve vektoru pdCs-muFc(D₄K). Použitým přímým primerem byl primer

5 -CCCCAAGCTTCATACTCATCAGGACTTTC (SEK. ID. Č.: 21; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK, ID. C.: 22), kde sekvenci kódující N-konec endostatinu předcházela sekvence rozpoznávaná restrikční endonukleázou HindlII. Použitým reverzním primerem byl primer 5 CCCCTGAGCTATTTGGAGAAAGAGGTC (SEK. ID. Č.: 23), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec endostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) násle55 dováný restrikčním místem Xhol. Produkt amplifikovaný PCR byl osekvenován a fragment

- 16CZ 302303 B6 kódující endostatin a ohraničený restrikčními místy HindlII/XhoI byl zaligován do vektoru pdCs-muFc(D₄K). Stabilní klony NS/0 exprimující muFc (D₄K)-muEndo byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti muFc) postupy popsanými v příkladech 2 a 3.

Příklad 6

Exprese muFc-muAngiostatin

Myší angiostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 24; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 25) byl exprimován ve formě fůzního proteinu myší Fc-myší angiostatin (muFc-muAngio) způsobem v podstatě identickým postupu uvedeném v Příkladu 1. cDNA kódující angiostatin (SEK. ID. Č.: 6) byla metodou PCR upravena tak, aby mohla být exprimoi5 vána ve vektoru pdCs-Fc(D₄K). Použitým přímým primerem byi primer 5 -CCCCAAGCTTGTGTATCTGTCAGAATGTAAGCCCTCCTGTCTCTGAGCA (SEK. ID.Č.: 26; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 27), kde sekvenci kódující N-konec angiostatinu předcházela sekvence rozpoznávaná restrikční endonukleázou HindlII. Použitým reverzním primerem byl primer 5'-CCCCTCGAGCTACCCTCCTGTCTCTGAGCA (SEK. ID. Č.: 28), který byl

2o navržen tak, aby okamžitě za C-konec angiostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol (CTCGAG). Produkt ampliftkovaný PCR byl osekvenován a fragment kódující angiostatin a ohraničený restrikčními místy HindlII/XhoI byl zaligován do vektoru pdCs-muFc(D₄K). Stabilní klony NS/0 exprimující muFc(D₄K)muAngio byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti muFc) postupy popsa25 nými v příkladech 2 a 3.

Příklad 7

Exprese psího Fc (caFc)

K izolaci mRNA byly využity monocyty z periferní krve psů. Po syntéze prvního řetězce cDNA s využitím reverzní transkriptázy a oligo(dT) byl psí Fc (Kazuhiko a další, JN 1992040894-A1, 1992) amplifikován přístupem PCR. Použitým přímým primerem byl primer 5’-CCTTAAGC35 GAAAATGGAAGAGTTCCTCGC (SEK. ID. Č.: 29; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 30), kde sekvenci kódující pantovou oblast psího Fc předcházela sekvence rozpoznávaná restrikční endonukleázou AflII. Použitým reverzním primerem byl primer 5-CCTCGAGTCATTTACCCGGGGAATGGGAGAGGGATTTCTG (SEK. ID. Č.: 31), který za kodon pro ukončení translace (antikodon TCA) v sekvenci psího Fc zavádí restrikční místo Xhol. Tento reverzní primer rovněž do sekvence zavedl tichou mutaci, kterou bylo vzniklo restrikční místo Xmal usnadňující konstrukci vektoru pdCs-caFc(D₄K) tím, že bude využito linkeru-adaptoru a ligace konstruktů DNA kódujících psí endostatin a angiostatin. Expres ívní vektor pdCs-caFc byl zkonstruován způsobem podobných postupu při konstrukci vektoru pdCs-huFc (Lo a další, Protein Engineering, 11:495, 1998). Fragment kódující psí Fc a ohraničený restrikčními místy AflU45 Xhol byl ligován s fragmentem Xbal-AflII kódujícím signální peptid pro lehký řetězec a vektorem pdCs, štěpeným restrikčními endonukleázami Xbal-Xhol. Takto připravený expres ívní vektor pdCs-caFc byl následně využit k transfekci buněk 293, Přibližně tři dny po transfekci byl supematant purifi kován chromatografií na Sepharóze s navázaných proteinem A. Exprese psího Fc (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. C.: 32; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK.

ID. Č.: 33) byla potvrzena SDS-PAGE a následným Western blotem využívajícím králičí protilátku proti písmu IgG konjugovanou s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA),

- 17CZ 302303 B6

Příklad 8

Exprese caFc-caEndostatin

K sekvenci kódující psí endostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ÍD. Č.: 34; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 35) byla metodou PCR přidána místa HindllI/Xhol tak, aby získaný fragment mohl být exprimován ve formě fúzního proteinu s Fc (postup je v podstatě totožný s postupem popsaným v příkladu 5). Na 3' konci byl metodou PCR za kodon kódující C-koncový lysin zaveden stop kodon a restrikční místo Notl. Na 5' konci již bylo příio tomno restrikční místo DralII využitelné pro další klonování. Chemickou syntézou byl připraven oligonukleotidový duplex ohraničený kohézními konci HindiII a DraliI a tento duplex byl použit k ligaci s restrikčním fragmentem DralII/XhoI kódujícím zbylou část cDNA psího endostatinu.

Použitý duplex má následující sekvenci:

HindlII

5'-AGCTTCACACCCACCAGGACTTCCAGCCGGTGCTGCACCTG (SEK. ID. Č.: 36)

AGTGTGGGTGGTCCTGAAGGTCGGCCACGACGTG-5' (SEK. ID. Č.: 38) i5 DralII

První CAC triplet kóduje N-koncový histidinový zbytek psího endostatinu. Fragment HindlIIZXhol, kódující nezkrácený psí endostatin, může být tudíž zaligován do expresívního vektoru pdCs-caFc štěpeného restrikčními enzymy HindlII/Xhol (viz. Příklad 7). Stabilní klony NS/0 io exprimující caFc-caEndo byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti caFc) postupy popsanými v příkladech 2 a 3. Proteinový produkt byl analyzován SDSPAGE a exprese byla potvrzena Western blotem.

Příklad 9

Exprese caFc-caAngiostatin cDNA kódující nezkrácený psí angiostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 39; ami30 nokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 40) byla pro expresi ve formě fúzního proteinu s caFc upravena způsobem v podstatě identickým s postupy uvedenými v předchozích příkladech, Stručně vzato, na 3' konci byl metodou PCR za kodon kódující C-koncový lysin zaveden stop kodon a restrikční místo Notl. Místem Notl bylo nahrazeno místo Xhol, protože toto místo (Xhol) je rovněž přítomno uvnitř sekvence cDNA kódující psí angiostatin. Na 5' konci bylo, ve 35 stejném čtecím rámci, před sekvenci kódující N-konec angiostatinu, zavedeno restrikční místo

HindlU. Fragment HindlII/Notl, kódující nezkrácený psí angiostatin, byl následně zaligován do expresívního vektoru pdCs-caFc štěpeného restrikčními enzymy HindlII/Notl (zde bylo místo Notl zavedeno v místě Xhol ligaci linkeru). Stabilní klony NS/0 exprimující caFc-caAngio byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti caFc) postupy popsanými v příkladech 2 a 3. Proteinový produkt byl analyzován SDS-PAGE a exprese byla potvrzena Western blotem.

Příklad 10

Exprese muFe muKl z muAngio

Angiostatin zahrnuje první čtyři z pěti domén kringle přítomných v plazminogenu. Za účelem stanovení, zda-li je za pozorovanou anti-angiogenní aktivitu angiostatinu zodpovědná jakákoliv z domén kringle nebo několik domén kringle, je možné exprimovat každou doménu kringle

- 18 CZ 302303 B6 samostatně nebo kombinace těchto domén. Aby bylo možné prokázat vhodnost oblasti Fc jako fúzního partnera, byla nejprve následujícím způsobem exprimována první doména kringle myšího angiostatinu (Kl). První doména kringle myšího angiostatinu je ukončena aminokyselinovým zbytkem Glu-87 (SEK. ID. Č.: 25). V sekvenci cDNA je na této pozici vhodné restrikční místo Nsil; tedy, po rozštěpení cDNA restrikční endonukleázou Nsil byl čtyř nukleotidový 3-přesah odstraněn polymerázou T4, čímž byl vytvořen tupý konec. Ligaci palindromového iínkeru TGACTCGAGTCA (SEK. ID. Č.: 41) byl po směru transkripce za triplet GAA kódující Glu-87 vložen stop kodon (TGA) následovaný restrikčním místem Xhol. Fragment Hindlll/Xhol kódující tento zkrácený angiostatin, tj. pouze první doménu kringle, byl následně zaligován do expresívního vektoru pdCs-muFc(D₄K). Analýza exprese prováděná metodou ELIS A s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně. tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 11

Exprese muFc-vnitřní Kl z muAngio

Každá doména kringle obsahuje několik smyček, a to včetně vnější a vnitřní smyčky. V první doméně kringle myšího angiostatinu je vnitřní smyčka definována aminokyselinovými zbytky Cys55 a Cys79, které spoluvytvářejí disulfidovou vazbu v základně smyčky. Aminokyselinový zbytek Cys67 ve vnitřní smyčce vytváří další disulfidovou vazbu s cystě i novým zbytkem z vnější smyčky, čímž vzniká struktura kringle. Za účelem zjištění, zda-li vnitřní smyčka vykazuje antiangiogenní aktivitu, byl následujícím postupem exprimován fúzní protein muFc-vnitřní Kl (kringle 1). Metodou PCR, využívající jako templát fragment DNA kódující první doménu kringle a mutagenní přiměř o sekvenci 5 '-GGGCCTTGGAGCTACACTACA (SEK. ID. Č.: 42; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 43), byl triplet TGC kódující Cys65 zaměněn za triplet AGC kódující serin. Tato mutageneze zajišťuje, že Cys67 nebude vytvářet disulfidickou vazbu v případě, když bude vnitřní smyčka domény kringle 1 exprimována bez smyčky vnější. K zavedení restrikčního místa HindlII (ve stejném čtecím rámci) okamžitě na 5' konec kodonu pro Ser45 (AGT) byl použit přímý primer o sekvencí 5 -GCGGATCCAAGCTTAGTACACATCCCAATGAGGG (SEK. ID. Č.; 44; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 45). Okamžitě proti směru transkripce před místo HindlII bylo zavedeno místo BamHI. Toto místo BamHI je užitečné pro ligaci do místa BamHI na konci flexibilního linkeru Ser-Gly (viz. Příklad 12). Fragment DNA ohraničený restrikčními místy Hindlll/Xhol a v myším angiostatinu kódující aminokyselinové zbytky Ser43 až Glu87 byl zaligován do expresívního vektoru pdCsmuFc(D₄K). Analýza exprese muFc-vnitřní Kl prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 12

Exprese muFc-muEndo-GIySer linker-vnitřní Kl z muAngio

Hybridní molekula muFc-muEndo-vnitřní Kl zahrnuje část muFc-muEndo připojenou k vnitřní smyčce první domény kringle myšího angiostatinu prostřednictvím polypeptidového linkeru obsahujícího glycinové a serinové zbytky. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem.

Na 3' konci cDNA kódující myší endostatin je restrikční místo BspHI. Flexibilní linker glycinových a serínových aminokyselinových zbytků byl na C-konec myšího endostatinu připojen tak, že fragment H indii Ι/BspHI o velikosti 540-bp kódující endostatin byl ligován s dvoj vláknovou strukturou (duplexem) vytvořenou z oligonukleotidů popsaných sekvencemi SEK. ID. Č.: 46 a

- 19CZ 302303 B6

SEK. ID. Č.: 48. Aminokyselinová sekvence kódovaná nukleotídovou sekvencí SEK. ID. Č.: 46 je uvedenajako sekvence SEK. ID. Č.: 47.

Fragment HindlII/BamHI kódující myší endostatin a linker Gly-Ser byl subklonován do stan5 dardního klonovacího vektoru. Místo BamHI bylo následně využito kzaklonování fragmentu

BamHI/XhoI kódujícího vnitrní KI z Příkladu II. Takto připravený fragment Hindlll/Xhol kódující muEndo-GlySer linker-vnitřní KI byl zaligován do expresívního vektoru pdCsmuFc(D₄K). Analýza exprese muFc-muEndo-GlySer linker-vnitřní KI prováděná metodou EL1SA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u to tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 13

Exprese muFc—muEndo-GlySer linker-Kl z muAngio

Hybridní molekula muFc-muEndo-ΚΙ zahrnuje část muFc-muEndo připojenou k první doméně kringle myšího angiostatinu prostřednictvím polypeptidového linkeru obsahujícího glycinové a serinové zbytky. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem.

K ligaci BamHI konce fragmentu ohraničeného restrikčními místy HindlII/BamHI kódujícího muEndo-TjlySer linker (Příklad 12) k fragmentu Hindlll/Xhol kódujícímu doménu kringlel myšího angiostatinu (Příklad 10) byl využit následující adaptor:

BamHI

5' GATCCTCAGGCC (SEK. ID. Č.: 49)

GAGTCCGGTCGA (SEK. ID. Č.: 50) ₂₅ HindlII

Tento adaptor obsahuje kohezní konec HindlII', který ale po ligaci restrikční místo HindlII zruší. Takto připravený fragment Hindlll/Xhol kódující muEndo-GlySer linker-Kl byl zaligován do expresívního vektoru pdCs-muFc(D₄K). Analýza exprese muFc-muEndo-GlySer linker-Kl prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 14

Exprese muFc-muEndo-GlySer linker-muAngio

Hybridní molekula muFc-muEndo-GlySer linker-muAngio zahrnuje část muFc-muEndo připojenou k myšímu angiostatinu prostřednictvím polypeptidového linkeru obsahujícího glycinové a serinové zbytky. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem. Prostřednictvím adaptoru popsaného v Příkladu 13 byl BamHI konec fragmentu ohraničeného restrikčními místy HindlII/BamHI kódujícího muEndo-GlySer linker (Příklad 12) připojen k fragmentu HindlII/Xhol kódujícímu myší angiostatin. Takto připravený fragment Hindlll/Xhol kódující muFcmuEndo-GIySer linker-muAngio byl zaligován do expresívního vektoru pdCs-muFc(D₄K).

Analýza exprese muFc-muEndo-GlySer linker-muAngio prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

-20CZ 302303 B6

Příklad 15

Exprese huAngio-huFc-huEndo

Hybridní molekula huAngio-huFc-huEndo obsahuje lidský angiostatin připojený peptidovou vazbou k huFc-huEndo. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem. Nejprve byl metodou PCR připraven fragment HindlII/XhoI kódující lidský angiostatin bez stop kodonu. Za kodonem pro poslední aminokyselinový zbytek angiostatinu okamžitě následovala sekvence io CTCGAG rozpoznávaná restrikěním enzymem Xhoí. S využitím adaptoru AflII/HindllT byl 5' konec (s místem Hindi IT) tohoto fragmentu ligován s fragmentem Xbal/Aflll kódujícímu signální peptid lehkého řetězce (Lo a další, Protein Engineering, 11:495, 1998). Sekvence použitého adaptoru AfHI/HindlIT je následující:

AflII

5' TTAAGCGGCC (SEK. ID. Č. : 51)

CGCGGGTCGA (SEK. ID. Č.: 52) _l5 HindlII'

Tento adaptor obsahuje kohezní konec HindlII', který ale po ligaci restrikČní místo HindlII zruší. Místo Xhoí na 3' konci bylo prostřednictvím adaptoru XhoT/AflII ligováno do místa AflII z fragmentu AflII/XhoI kódujícího huFc-huEndo. Sekvence použitého adaptoru Xhoí'/AflII je následující:

Xhoí'

5'TCGACTCCGGC (SEK. ID. Č.: 53)

GAGGCCGAATT (SEK. ID. Č. : 54)

AflII

Tento adaptor obsahuje kohezní konec Xhoí', který ale po ligaci restrikění místo Xhoí zruší.

Takto připravený fragment Xbal/Xhol kódující signální peptid-lidský angiostatin-huFc-lidský endostatin byl zaligován do expresívního vektoru pdCs. Analýza exprese rekombinantního proteinu prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfeko váných buněk.

Příklad 16

Farmakokinetika

V jedné sérii farmakokinetických experimentů bylo myším C57/BL6 s implantovanými nádory Lewisova karcinomu plic o objemu 100 až 200 mm³ do ocasní žíly injikováno 720 pg huFchuAngio na jednu myš. Objem nádorů a dávka huFc-huAngio byly zvoleny tak, aby napodobovaly protokol popsaný v publikaci OReilly a další, Nátuře Medicine, 2:689, 1996. 1/2, 1, 2, 4, 8, 24 a 48 hodin po injekci byly myším retrorbitálně odebírány vzorky krve. Tyto vzorky byly ana40 lyžovány metodou ELISA s využitím protilátek proti huFc a Western blotem. Bylo zjištěno, že huFc-huAngio má v organizmu myší biologický poločas přibližně 32 hodin a analýza metodou Western blot prokázala, že více než 90 % huFc-huAngio zůstává v krevním oběhu v intaktní formě.

-21 CZ 302303 B6

Tyto farmakokínetické studie byly rovněž opakovány s využitím myší Swiss bez nádorů a při použití dávek 200 pg/myš. V tomto případě byl biologický poločas huFc-huAngio v organizmu myší přibližně 33 hodin.

Předkládaný vynález může být, bez odchýlení se od své podstaty nebo základních charakteristik, aplikován i jinými než popsanými způsoby. Příklady provedení vynálezu uvedené v předchozích textu by tudíž měly být považovány za toliko ilustrativní a ne jakýmkoliv způsobem limitující rozsah vynálezu. Rozsah vynálezu je tudíž definován především připojenými patentovými nároky a ne uvedeným popisem a veškeré změny, které jsou ekvivalentní údajům popsaným patentovými io nároky spadají rovněž do rozsahu vynálezu.

SEZNAM SEKVENCÍ <U0> Lo, Kin-Ming

Li, Yue

Gillíes, Stephen D <120> Exprese a export inhibitorů angiogeneze ve formě imunofúzinů <I30> LEX-006Pc <I4O>

<141>

<150> US 60/09788 <151> 1998-08-25 <160> 54 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> I <211> 696 <212> DNA <213> Homosapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(696) <223> Fragment Fc lidského imunoglobulinu typu gama

- 22 CZ 302303 B6 <400> 1

gag Glu 1

ccc aaa

tet Ser

tet gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca

48

Pro

Lys

Ser Asp Lys Thr His Thr

Cys

Pro

Pro Cys

Pro 15

Ala

5

10

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

96

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

144

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

192

Val

Asp

Val

ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

50

55

60

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

cag

240

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

288

Tyr

Asn

Šer

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

85

90

95

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

336

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

100

105

110

ctc

cca

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

384

Leu Pro

Ala 115

Pro

Ile

Glu

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro

120

125

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tea

cgg

gag

atg

acc

4 32

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

ser

Arg

Glu

Met

Thr

130

135

140

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

CCC

agc

480

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Šer

145

150

155

160

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

tac

528

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

165

170

175

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ctc

tat

576

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

ggg

aac

gtc

ttc

624

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

tea

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

get

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

672

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

agc

ctc

tcc

ctg

tcc

ccg

ggt

aaa

696

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

225

230

-23 CZ 302303 B6 <210 2 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 2

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin

90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110

Leu	Pro	Ala 115	Pro	Ile	Glu	Lys	Thr 120
Arg	Glu 130	Pro	Gin	Val	Tyr	Thr 135	Leu
Lys 145	Asn	Gin	Val	Ser	Leu 150	Thr	Cys
Asp	Ile	Ala	Val	Glu 165	Trp	Glu	Ser
Lys	Thr	Thr	Pro 180	Pro	Val	Leu	Asp
Ser	Lys	Leu 195	Thr	Val	Asp	Lys	Ser 200
Ser	Cys 210	Ser	Val	Met	His	Glu 215	Ala
Ser 225	Leu	Ser	Leu	Ser	Pro 230	Gly	Lys

Ile Ser Lys Ala Lys G? y Gin ?io Ϊ25

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 155 160

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 185 190

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 220 <210> 3 io <211> 549 <212> DNA <213> Homo sapiens <220 <221> CDS <222> (1)..(549) <223> endostatin

-24 CZ 302303 B6

<400> 3

cac agc

cac cgc gac ttc cag

ccg gtg ctc cac ctg gtt gcg ctc

aac Asn

48

His 1

Ser

His

Arg

Asp 5

Phe

Gin

Pro

Val

Leu His Leu Val Ala Leu

10

15

agc

ccc

ctg

tca

ggc

atg

cgg

ggc

atc cgc ggg gcc

gac ttc

cag

96

Ser

Pro

Leu

Ser

Gly Gly

Met

Arg

Gly

Ile Arg Gly Ala

Asp Phe

Gin

20

25

30

tgc

ttc

cag

gcg

cgg

gcc

gtg

ggg

ctg gcg ggc acc

ttc cgc

gcc

144

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

Gly

Leu Ala Gly Thr

Phe Arg

Ala

35

40

45

ttc

ctg

tcc

tcg

cgc

ctg

cag

gac

ctg

tac agc atc gtg

cgc cgt

gcc

192

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr Ser Ile Val

Arg Arg

Ala

50

55

60

gac

cgc

gca

gcc

gtg

ccc

atc

gtc

aac

ctc aag gac gag

ctg ctg

ttt

240

Asp

Arg

Ala

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu Lys Asp Glu

Leu Leu.

Phe

65

70

75

80

ccc

agc

tgg

gag

gct

ctg

ttc

tca

99=

tet gag ggt ccg

ctg aag

ccc

288

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser Glu Gly Pro

Leu Lys

Pro

85

90

95

ggg

gca

cgc

atc

ttc

tcc

ttt

gac

ggc

aag gac gtc ctg agg cac ccc

336

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro

100

105

110

acc

tgg

ccc

cag

aag

agc

gtg

tgg

cat

ggc tcg gac ccc aac ggg cgc

384

Thr

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg

115

120

125

agg

ctg

acc

gag

agc

tac

tgt

gag

acg

tgg cgg acg gag gct ccc tcg

432

Arg

Leu

Thr

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser

130

135

140

gcc

acg

gg<=

cag

gcc

tcc

tcg

ctg

ggg ggc agg ctc ctg ggg cag

430

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin

145

150

155

160

agt

gcc

gcg

agc

tgc

cat

cac

gcc

tac

atc gtg ctc tgc att gag aac

528

Ser

Ala

Ser

Cys

His

Ala

Tyr

Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn

165

170

175

agc

ttc

atg

act

gcc

tcc

aag

549

Ser

Phe

Met

Thr

Ala

Ser

Lys

ISO <210> 4 5 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens

-25 CZ 302303 B6 <400> 4

His 1

Ser His Arg

Asp 5

Phe

Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn

10

15

Ser

Pro

Leu

Ser

Gly

Met

Arg

Gly

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp

Phe

Gin

20

25

30

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Ala

50

55

60

Asp

Arg

Ala

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Phe

65

70

75

80

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

Pro

Leu

Lys

Pro

85

90

95

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Lys Asp

Val

Leu

Arg

His

Pro

100

105

110

Thr

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly Ser Asp

Pro

Asn

Gly

Arg

115

120

125

Arg

Leu

Thr

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp Arg

Thr

Glu

Ala

Pro

Ser

130

135

140

Ala

Thr'

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Gly Gly

Arg

Leu

Gly

Gin

145

150

155

160

Ser

Ala

Ser

Cys

His

Ala

Tyr

Ile

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

Ser

Phe

Met

Thr

Ala

Ser

Lys

180 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

io <221> CDS <222> (3)..(29) <400> 5 cc ccg ggt aaa cac age cac ege gac ttc c Pro Gly Lys His Ser His Arg Asp Phe

5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 6

Pro Gly Lys His Ser His Arg Aso Phe 1 5

-26CZ 302303 B6 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220 <223> Popis uměle připravená sekvence: Přímý přiměř pro lidský Fc-Endo <220 <221> CDS <222> (2)..(25) <400 7 c aag ctt cac agc cac cgc gac ttc c Lys Leu His Ser His Arg Asp Phe

5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 8

Lys Leu His Ser His Arg Asp Phe 1 5 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravená sekvence: Reverzní primer pro lidský Fc-Endo <400> 9 cctcgagcta cttggaggca gtcatg <210 10 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(1089) <223> angiostatin

-27CZ 302303 B6 <400> 10 aaa gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

10 15 ggg acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgc caa aaa tgg agt

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly lle Thr Cys Gin Lys Trp Ser

25 30 tcc act tet ccc cac aga cct aga ttc tca cct get aca cac ccc tca

Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser

40 45 gag gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gin

55 60 ggg ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

70 75 80 gac att ctt gag tgt gaa gag gaa tgt atg cát tgc agt gga gaa aac

Asp lle Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

90 95 tat gac ggc aaa att tcc aag acc atg tet gga ctg gaa tgc cag gcc

Tyr Asp Gly Lys lle Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gin Ala

144

192

240

288

335

-28 CZ 302303 B6

100

105

110

tog

gac

tet

cag

agc

cca

cac

get

cat

gga

tac

att

cct

tcc

aaa

ttt

384

Trp

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

115

120

125

cca

aac

aag

aac

ctg

aag

aat

tac

tgt

cgt

aac

ccc

gat

agg

gag

432

Pro

Asn

lys

Asn

Leu

Lys

Asn

Tyr Cys

Arg

Asn

Pro

Asp Arg

Glu

130

135

140

ctg

cgg

cct

tgg

tgt

ttc

acc

gac

ccc

aac

aag

ege

tgg

gaa

ctt

480

Leu

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu

145

150

155

160

tgc

gac

atc

ccc

ege

tgc

aca

cct

cca

tet

ggt

ccc

acc

528

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Gly

Pro

Thr

165

•Ί r\ X f v

175

tac

cag

tgt

ctg

aag

gga

aca

ggt

gaa

aac

tat

ege

ggg

aat

gtg

get

576

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn

val

Ala

180

185

190

gtt

acc

gtt

tcc

ggg

cac

acc

tgt

cag

cac

tgg

agt

gca

cag

acc

cct

624

Val

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

195

200

205

cac

aca

cat

aac

agg

aca

cca

gaa

aac

ttc

ccc

tgc

aaa

aat

ttg

gat

672

His

Thr

His

Asn

Arg.

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

210

215

220

gaa

aac

tac

tgc

ege

aat

cct

gac

gga

aaa

agg

gcc

cca

tgg

tgc

cat

720

Glu

Asn

Tyr

Cys Arg

Asn

Pro

Asp

Gly Lys

Arg

Ala

Pro

Trp

Cys

His

225

230

235

240

aca

acc

aac

agc

caa

gtg

cgg

tgg

gag

tac

tgt

aag

ata

ccg

tcc

tgt

768

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

245

250

255

gac

tcc

cca

gta

tcc

acg

gaa

caa

ttg

get

ccc

aca

gca

cca

cct

816

Asp

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro

260

265

270

gag

cta

acc

cct

gtg

gtc

cag

gac

tgc

tac

cat

ggt

gat

gga

cag

agc

864

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Gin

Asp

Cys

Tyr

His

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

275

280

285

tac

ega

ggc

aca

tcc

acc

aca

gga

aag

tgt

cag

tet

912

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Lys

Cys

Gin

Ser

290

295

300

tgg

tea

tet

atg

aca

cca

cac

cgg

cac

cag

aag

acc

cca

gaa

aac

tac

960

Trp

Ser

Meť

Thr

Pro

His

Arg

His

Gin

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Tyr

305

310

315

320

cca

aat

get

ggc

ctg

aca

atg

aac

tac

tgc

agg

aat

cca

gat

gcc

gat

1008

Pro

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp

325

330

335

aaa

ggc

ccc

tgg

rgt

ttt

acc

aca

gac

ccc

agc

gtc

agg

tgg

gag

tac

1056

-29CZ 302303 B6

1089

Lys Gly Pro Trp	Cys	Phe Thr Thr	Asp 345	Pro	Ser Val Arg Trp Glu Tyr 350
	340
tgc	aac	ctg	aaa	aaa	tgc	tca	gga	a ca	gaa	gcg
Cys	Asn	Leu.	Lys	Lys	Cys	Ser	Gly	Thr	Glu	Ala
		355					360

<210> <211> <212>

<213>

343

PRT

Homo sapiens <400> 11

Lys 1

Val

Tyr

Leu

Ser 5

Glu

Cys

Lys

Thr

Gly 10

Asn

Gly

Lys

Asn

Tyr 15

Arg

Gly

Thr

Met

Ser 20

Lys

Thr

Lys

Asn

Gly 25

Ile

Thr

Cys

Gin

Lys 30

Trp

Ser

Thr

Ser 35

Pro

His

Arg

Pro

Arg 40

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr 45

His

Pro

Ser

Glu

Gly 50

Leu

Glu

Asn

Tyr 55

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp 60

Asn

Asp

Pro

Gin

Gly 65

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 70

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys 75

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys 80

Asp

Ile

Leu

Glu

Cys 85

Glu

Cys

Met 90

His

Cys

Ser

Gly

Glu 95

Asn

Tyr

Asp

Gly

Lys 100

Ile

Ser

Lys

Thr

Met 105

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys 110

Gin

Ala

Trp

Asp

Ser 115

Gin

Ser

Pro

His

Ala 120

His

Gly

Tyr

Ile

Pro 125

Ser

Lys

Phe

Pro

Asn 130

Lys

Asn

Leu

Lys

Lys 135

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn 140

Pro

Asp

Arg

Glu

Leu 145

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe 150

Thr

Asp

Pro

Asn 155

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu 160

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg 165

Cys

Thx

Thr

Pro

Pro 170

Pro

Ser

Gly

Pro 175

Thr

Tyr

Gin

Cys

Leu 180

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu 185

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn 190

Val

Ala

Val

Thr

Val 195

Ser

Gly

His

Thr

Cys 200

Gin

His

Trp

Ser

Ala 205

Gin

Thr

Pro

His

Thr 210

His

Asn

Arg

Thr

Pro 215

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys 220

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu 225

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn 230

Pro

Asp

Gly

Lys

Arg 235

Ala

Pro

Trp

Cys

His 240

-30CZ 302303 B6

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

245

250

255

Asp

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro

260

265

270

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Gin

Asp

Cys

Tyr

His

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

275

280

285

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Lys

Cys

Gin

Ser

290

295

300

Trp

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Gin

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Tyr

305

310

315

320

Pro

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp

325

330

335

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

340

345

350

Cys

Asn

Leu

Lys

Cys

Ser

Gly

Thr

Glu

Ala

355

360

<210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Přímý primer pro lidský Fc-Angio <220>

<221> CDS <222> (2)..(29) <400> 12 cc ccg ggt aag aaa gtg tat ctc tca gag Pro Gly Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu

5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 13

Pro Gly Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu 1 5 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<221> CDS

-31 CZ 302303 B6 <222> (2)..(28) <400> 14 c ccc aag ctt aaa gtg tat ctc tea gag Pro Lys Leu Lys Val Tyr Leu Ser Glu

5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> IImele připravená sekvence <400> 15

Pro Lys Leu Lys Val Tyr Leu Ser Glu 1 5 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro lidský Fc-Angio <400> 16 cccctcgagc tačgcttctg ttcctgagca <210> 17 <211> 552 <212> DNA <213> Mus museuIus <220>

<221> CDS <222> (1)..(552) <223> endostatin

<400> 17
cat	act	cat	cag	gac	ttt	cag	cca	gtg
His	Thr	His	Gin	Asp	Phe	Gin	Pro	Val
1				5
acc	ccc	ctg	tet	gga	ggc	atg	cgt	ggt
Tbr	Pro	Leu	Ser	Gly	Gly	Met	Arg	Gly
			20					25
tgc	ttc	cag	caa	gcc	ega	gcc	gtg	ggg
Cys	Phe	Gin	Gin	Ala	Arg	Ala	Val	Gly
		35					40

ctc	cac	ctg	gtg	gca	ctg	aac	48
Leu 10	His	Leu	Val	Ala	Leu 15	Asn
atc	cgt	gga	gca	gat	ttc	cag	96
Ile	Arg	Gly	Ala	Asp 30	Phe	Gin
ctg	tcg	ggc	acc	ttc	cgg	get	144
Leu	Ser	Gly	Thr 45	Phe	Arg	Ala

ttc ctg tcc Phe Leu Ser 50	tet agg	ctg Leu	cag gat ctc tat agc atc gtg cgc cgt gct	192
Ser	Arg	Gin 55	Asp	Leu	Tyr Ser	Ile 60	Val Arg Arg Ala
gac cgg ggg	tet	gtg	ccc	atc	gtc	aac	ctg aag	gac	gag gtg cta tet	240
Asp Arg Gly	Ser	Val	Pro	Ile	Val	Asn	Leu Lys	Asp	Glu Val Leu Ser
65			70				75		80
ccc agc tgg	gac	tcc	ctg	ttt	tet	ggc	tcc cag	ggt	caa gtg caa ccc	288
Pro Ser Trp	Asp	Ser	Leu	Phe	Ser	Gly	Ser Gin	Gly	Gin Val Gin Pro
		85					90		95
ggg gcc cgc	atc	ttt	tet	ttt	gac	ggc	aga gat	gtc	ctg aga cac cca	336
Gly Ala Arg	Ile	Phe	Ser	Phe	Asp Gly Arg Asp	Val	Leu Arg His Pro
	100					105			110
gcc tgg ccg	cag	asg	agc	/»+ o T? ***	tgg	cac	ggc tcg	gac	ccc agt ggg cgg	384
Ala Trp Pro	Gin	Lys	Ser	Val	Trp	His	Gly Ser	Asp	Pro Ser Gly Arg
115					120				125
agg ctg atg	gag	agt	tac	tgt	gag	aca	tgg ega	act	gaa act act ggg	432
Arg Leu Met	Glu	Ser	Tyr	Cys	Glu	Thr	Trp Arg	Thr	Glu Thr Thr Gly
130				135				140
gct aca ggt	cag	gcc	tcc	tcc	ctg	ctg	tea ggc	agg	ctc ctg gaa cag	480
Ala Thr Gly	Gin	Ala	Ser	Ser	Leu	Leu	Ser Gly Arg	Leu Leu Glu Gin

145 150 155 160

aaa Lys

gct gcg agc tgc cac

aac Asn

agc tac atc gtc ctg tgc att

gag Glu 175

aat Asn

528

Ala Ala Ser

Cys His 165

Ser

Tyr

Ile 170

Val

Leu

Cys

Ile

agc

ttc

atg

acc

tet

ttc

tcc

aaa

552

Ser

Phe

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180

<210> 18 <211> 184 <212> PRT <213> Musmusculus <400> 18

His 1

Thr

His

Gin

Asp 5

Phe

Gin

Pro

Val

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

Leu 15

Asn

Thr

Pro

Leu

Ser 20

Gly

Met

Arg

Gly 25

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp 30

Phe

Gin

Cys

Phe

Gin 35

Gin

Ala

Arg

Ala

Val 40

Gly

Leu

Ser

Gly

Thr 45

Phe

Arg

Ala

Phe

Leu 50

Ser

Arg

Leu

Gin 55

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile 60

Val

Arg

Ala

Asp

Arg

Gly

Ser

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Val

Leu

Ser

70 75 80

-33CZ 302303 B6

Pro Ser Trp Asp Ser Leu

Phe

Ser

Gly Ser Gin 90

Gly 31-i

Val

Gin 95

85

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Arg

Asp

Val

Leu

Arg

His

Pro

100

105

110

Ala

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly Arg

115

120

125

Arg

Leu

Met

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Thr

Gly

130

135

140

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Ser

Gly

Arg

Leu

Glu

Gin

145

150

155

160

Lys

Ala

Ser

Cys

His

Asn

Ser

Tyr

Ile

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

Ser

Phe

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180 <210> 19 <21I> 699 <212> DNA <213> Mus musculus ιο

<220> <221> CDS <222> (1)..(699) <223> Fc

<400> 19

gag

ccc

aga

ggg

ccc

aca

atc

aag

ccc

tgt

cct

cca

tgc

aaa

tgc

cca

48

Glu

Pro

Arg

Gly

Pro

Thr

Ile

Lys

Pro

Cys

Pro

Cys

Lys

cys

Pro

1

5

10

15

gca

cct

aac

ctc

ttg

ggt

gga

cca

tcc

gtc

ttc

atc

ttc

cct

cca

aag

96

Ala

Pro

Asn

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Lys

20

25

30

atc

aag

gat

gta

ctc

atg

atc

tcc

ctg

agc

ccc

ata

gtc

aca

tgt

gtg

144

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Met

Ile

Ser

Leu

Ser

Pro

Ile

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

gtg

gat

gtg

agc

gag

gat

gac

cca

gat

gtc

cag

atc

agc

tgg

ttt

192

Val

Asp

Val

Ser

Glu

Asp

Pro

Asp

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

50

55

60

gtg

aac

gtg

gaa

gta

cac

aca

gct

cag

aca

caa

acc

cat

aga

gag

240

Val

Asn

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

Gin

Thr

Gin

Thr

His

Arg

Glu

65

70

75

80

gat

tac

aac

agt

act

ctc

cgg

gtg

gtc

agt

gcc

ctc

ccc

atc

cag

cac

288

Asp

Tyr

Asn

Ser

Thr

Leu

Arg

val

Val

Ser

Ala

Leu

Pro

Ile

Gin

His

85

90

95

cag

gac

tgg

atg

agt

ggc

aag

gag

ttc

aaa

tgc

aag

gtc

aac

aaa

336

Gin

Asp

Trp

Met

Ser

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Cys

Lys

Val

Asn

Lys

- 34CZ 302303 B6

100

105

110

gac

ctc

cca

gcg

ccc

atc

gag

aga

acc

atc

tca

aaa

ccc

aaa

ggg

tca

384

Asp

Leu

Pro

Ala

Pro

lle

Glu

Arg

Thr

lle

Ser

Lys

Pro

Lys

Gly

Ser

115

120

125

gta

aga

gct

cca

cag.

gta

tat

gtc

ttg

cct

cca

gaa

gag

atg

4 32

Val

Arg

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Glu

Met

130

135

140

act

aag

aaa

cag

gtc

act

ctg

acc

tgc

atg

gtc

aca

gac

ttc

atg

cct

480

Thr

Lys

Gin

Val

Thr

Leu

Thr

Cys

Met

Val

Thr

Asp

Phe

Met

Pro

145

150

155

160

gaa

gac

att

tac

gtg

gag

tgg

acc

aac

ggg

aaa

aca

gag

cta

aac

528

Glu

Asp

lle

Tyr

Val

Glu

Trp

Thr

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Leu

Asn

165

170

175

tac

aag

aac

act

gaa

cca

gtc

ctg

gac

tet

gat

ggt

tet

tac

ttc

atg

576

Tyr

Lys

Asn

Thr

Glu

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

Met

180

185

190

tac

agc

aag

ctg

aga

gtg

gaa

aag

aac

tgg

gtg

gaa

aga

aat

agc

624

Tyr

Ser

Lys

Leu

Arg

Val

Glu

Lys

Asn

Trp

Val

Glu

Arg

Asn

Ser

195

200

205

tac

tcc

tgt

tca

gtg

gtc

cac

gag

ggt

ctg

cac

aat

cac

acg

act

672

Tyr

Ser

Cys

Ser

Val

His

Glu

Gly

Leu

His

Asn

His

Thr

210

215

220

aag

agc

ttc

tcc

cgg

acc

ccg

ggt

aaa

699

Lys

Ser

Phe

Ser

Arg

Thr

Pro

Gly

Lys

225 230 <210> 20 <211> 233 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

Glu Pro Arg Gly Pro Thr lle Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro

5 10 15

Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Lys

25 30

Tle Lys Asp Val Leu Met lle Ser Leu Ser Pro lle Val Thr Cys Val 35 40 45

Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gin lle Ser Trp Phe 50 55 60

Val Asn Asn Val Glu Val Kis Thr Ala Gin Thr Gin Thr His Arg Glu

70 75 80

Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro lle Gin His

90 95

-35 CZ 302303 B6

Gin Asp Trp Met Ser Gly	Lys	Glu	Phe Lys Cys Lys 105	Val Asn Asn Lys 110
	100
Asp	Leu Pro Ala Pro Ile	Glu	Arg	Thr Ile Ser Lys	Pro Lys Gly Ser
	115		120		125
Val	Arg Ala Pro Gin Val	Tyr	Val	Leu Pro Pro Pro	Glu Glu Glu Met
	130	135		140
Thr	Lys Lys Gin Val Thr	Leu	Thr	Cys Met Val Thr	Asp Phe Met Pro
145	150			155	160
Glu	Asp Ile Tyr Val Glu	Trp	Thr	Asn Asn Gly Lys	Thr Glu Leu Asn
	165			170	175
Tyr	Lys Asn Thr Glu Pro	Val	Leu	Asp Ser Asp Gly	Ser Tyr Phe Met
	ISO			185	190
Tyr	Ser Lys Leu Arg Val	Glu	Lys	Lys Asn Trp Val	Glu Arg Asn Ser
	195		200		205
Tyr	Ser Cys Ser Val Val	His	Glu	Gly Leu His Asn	His His Thr Thr
	210	215		220
Lys	Ser Phe Ser Arg Thr	Pro	Gly	Lys
225	230
<210> 21
<211:	> 29
<212> DNA
<213> Uměle připravená sekvence
<220>
<223> Popis uměle připravené sekvence:	: Přímý primer pro myší Fc—Endo

ίο <220>

<221> CDS <222> (2)..(28) <400> 21 c ccc aag ctt cat act cat cag gac ttt c Pro Lys Leu His Thr His Gin Asp Phe

5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 22

Pro Lys Leu His Thr His Gin Asp Phe 1 5 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní přiměř pro myší Fc-Endo

-36CZ 302303 B6 <400 23 cccctcgagc tatttggaga aagaggtc 28 <210> 24 <211> 1086 <212> DNA <213> Musmusculus <220>

o <221> CDS <222> (1)..(1086) <223> angiostatin <400> 24

gtg Val 1

tat Tyr

ctg tea gaa tgt aag acc

ggc atc ggc aac ggc

tac aga gga

48

Leu Ser Glu 5

Cys

Lys

Thr

Gly lle 10

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg 15

Gly

acc

atg

tcc

agg

aca

aag

agt

ggt

gtt

gcc

tgt

caa

aag

tgg

ggt

gcc

96

Thr

Met

Ser

Arg

Thr

Lys

Ser

Gly

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp.

Gly

Ala

20

25

30

acg

ttc

ccc

cac

gta

ccc

aac

tac

tet

ccc

agt

aca

cat

ccc

aat

gag

144

Thr

Phe

Pro

His

Val

Pro

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Thr

His

Pro

Asn

Glu

35

40

45

gga

cta

gaa

gag

aac

tac

tgt

agg

aac

cca

gac

aat

gat

gaa

caa

ggg

192

Gly

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Gin

Gly

50

55

60

cct

tgg

tgc

tac

act

aca

gat

ccg

gac

aag

aga

tat

gac

tac

tgc

aac

240

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn

65

70

75

80

att

cct

gaa

tgt

gaa

gag

gaa

tgc

atg

tac

tgc

agt

gga

gaa

aag

tat

288

lle

Pro

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys

Tyr

85

90

95

gag

ggc

aaa

atc

tcc

aag

acc

atg

tet

gga

ctt

gac

tgc

cag

gcc

tgg

336

Glu

Gly

Lys

lle

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

gat

tet

cag

agc

cca

cat

get

cat

gga

tac

atc

cct

gcc

aaa

ttt

cca

384

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

lle

Pro

Ala

Lys

Phe

Pro

115

120

125

agc

aag

aac

ctg

aag

atg

aat

tat

tgc

cac

aac

cct

gac

ggg

gag

cca

432

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

His

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

agg

ccc

tgg

tgc

ttc

aca

gac

ccc

acc

aaa

ege

tgg

gaa

tac

tgt

480

-37CZ 302303 B6

Arg Pro Trp Cys 145

Phe Thr 150

Thr Asp Pro

Thr

Lys Arg Trp Glu Tyr Cys

155

160

gac

atc

ccc

ege

tgc

aca

ccc

ccg

ccc

cca

ccc

age

cca

acc

tac

528

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

caa

tgt

ctg

aaa

gga

aga

ggt

gaa

aat

tac

ega

ggg

acc

gtg

tet

gtc

576

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

Val

180

185

190

acc

gtg

tet

ggg

aaa

acc

tgt

cag

ege

tgg

agt

gag

caa

acc

cct

cat

624

Thr

Val

Ser

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

agg

cac

aac

agg

aca

cca

gaa

aat

ttc

ccc

tgc

aaa

aat

ctg

gaa

gag

672

Arg

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

210

215

220

aac

tac

tgc

cgg

aac

cca

gat

gga

gaa

act

gct

ccc

tgg

tgc

tat

acc

720

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

act

gac

age

cag

ctg

agg

tgg

gag

tac

tgt

gag

att

cca

tcc

tgc

gag

768

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu

245

2S0

255

tcc

tca

gca

tca

cca

gac

cag

tca

gat

tcc

tca

gtt

cca

gag

816

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp

Ser

Val

Pro

Glu

260

265

270

caa

a ca

cct

gtg

gtc

cag

gaa

tgc

tac

cag

age

gat

ggg

cag

age

tat

864

Gin

Thr

Pro

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly

Gin

Ser

Tyr

275

280

285

cgg

ggt

aca

tcg

tcc

act

acc

atc

aca

ggg

aag

tgc

cag

tcc

tgg

912

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp

290

295

300

gca

gct

atg

ttt

cca

cac

agg

cat

tcg

aag

acc

cca

gag

aac

ttc

cca

960

Ala

Met

Phe

Pro

His

Arg

His

Ser

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

305

310

315

320

gat

gct

ggc

ttg

gag

atg

aac

tac

tgc

agg

aac

ccg

gat

ggt

gac

aag

1008

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Lys

325

330

335

ggc

cct

tgg

tgc

tac

acc

act

gac

ccg

age

gtc

agg

tgg

gaa

tac

tgc

1056

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

340

345

350

aac

ctg

aag

cgg

tgc

tca

gag

aca

gga

ggg

1086

Asn

Leu

Lys

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr

Gly

355 360

-38CZ 302303 B6 <210 25 <211> 362 <212> PRT <213> Mus musculus <400 25

Val 1

Tyr

Leu

Ser

Glu 5

Cys

Lys

Thr

Gly

Ile 10

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg 15

Gly

Thr

Met

Ser

Arg 20

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 25

Ala

cys

Gin

Lys

Trp 30

Gly

Ala-

Thr

Phe

Pro 35

His

Val

Pro

Asn

Tyr 40

Ser

Pro

Ser

Thr

His 45

Pro

Asn

Glu

Gly

Leu 50

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 60

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro €5

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 75

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 80

Ile

Pro

Glu

Cy3

Glu 85

Glu

Cys

Met

Tyr 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys 95

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 100

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 105

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin 110

Ala

Trp·

Asp

Ser

Gin 115

Ser

Pro

His

Ala

His 120

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala 125

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 130

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 135

Tyr

Cys

His

Asn

Pro 140

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 145

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 150

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Pro

Pro 170

Pro

Ser

Pro

Thr 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly Arg

Gly

Glu

Asn 185

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val 190

Ser

Val

Thr

Val

Ser 195

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin 200

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin 205

Thr

Pro

His

Arg

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Glu

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 235

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 240

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu 245

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 250

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys 255

Glu

Ser

Ala

Ser 260

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp 265

Ser

Val

Pro

Pro 270

Glu

Gin

Thr

Pro 275

Val

Gin

Glu

Cys 280

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly 285

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp

290 295 300

-39CZ 302303 B6

Ala 305

Ala

Met

Phe

Pro

His 310

Arg

His

Ser

Lys

Thr 315

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro 320

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu 325

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg 330

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp 335

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys 340

Tyr

Thr

Asp

Pro 345

Ser

Val

Arg

Trp

Glu 350

Tyr

Cys

Asn

Leu

Lys 355

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr 360

Gly

<210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Přímý primer pro myší Fc-Angio <220>

<221> CDS <222> (2)..(49) <400> 26 c ccc aag ctt gtg tat ctg tca gaa tgt aag 31

Pro Lys Leu Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys

10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Umele připravená sekvence <400> 27

Pro Lys Leu Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro myší Fc-Angio <400> 28 cccctcgagc taccctcctg tctctgagca 3Q <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravená sekvence: Přímý primer pro psí Fc <220>

-40CZ 302303 B6 <221> CDS <222> (3)..(29) <400> 29 cc tta agc gaa aat gga aga gtt cct cgc 29

Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg

5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 30

Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg 1 5 <2l0> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro psí Fc <400> 31 cctcgagtca tttacccggg gaatgggaga gggatttctg 4 0 <210> 32 <211> 702 <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(702) <223> Fc <400> 32 gaa aat gga aga gtt cct cgc cca cct gat tgt ccc aaa tgc cca gcc 4 8

Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala

10 15 cct gaa atg ctg gga ggg cct tcg gtc ttc atc ttt ccc ccg aaa ccc 96

Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Lys Pro

25 30 aag gac acc ctc ttg att gcc ega aca cct gag gtc aca tgt gtg gtg 144

-41 CZ 302303 B6

Lys Asp Thr

Leu Leu Ile

Ala

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35

40

45

gtg

gat

ctg

gga

cca

gaa

gac

cct

gag

gtg

cag

atc

agc

tgg

ttc

gtg

192

Val

Asp

Leu

Gly

Pro

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

Val

50

55

60

gac

ggt

aag

cag

atg

caa

a ca

gcc

aag

act

cag

cct

cgt

gag

cag

240

Asp

Gly

Lys

Gin

Met

Gin

Thr

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

ttc

aat

ggc

acc

tac

cgt

gtg

gtc

agt

gtc

ctc

ccc

att

ggg

cac

cag

288

Phe

Asn

Gly

Thr

Tyr Arg

Val

Ser

Val

Leu

Pro

Ile

Gly

His

Gin

85

90

95

gac

tgg

ctc

aag

ggg

aag

cag

ttc

acg

tgc

aaa

gtc

aac

aaa

gcc

336

Asp

Trp

Leu

Lys

Gly

Lys

Gin

Phe

Thr

Cys

Lys

Val

Asn

Lys

Ala

100

105

110

ctc

cca

tcc

ccg

atc

gag

agg

acc

atc

tcc

aag

gcc

aga

ggg

cag

gcc

384

Leu

Pro

Ser

Pro

Ile

Glu

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Arg

Gly

Gin

Ala

115

120

125

cat

cag

ccc

agt

gtg

tat

gtc

ctg

ccg

cca

tcc

cgg

gag

ttg

agc

432

His

Gin

Pro

Ser

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Ser

Arg

Glu

Leu

Ser

130

135

140

aag

aac

a ca

gtc

agc

ttg

aca

tgc

ctg

atc

aaa

gac

ttc

cca

cct

480

Lys

Asn

Thr

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Ile

Lys

Asp

Phe

Pro

145

150

155

160

gac

att

gat

gtg

gag

tgg

cag

agc

aat

gga

cag

gag

cct

gag

agc

528

Asp

Ile

Asp

Val

Glu

Trp

Gin

Ser

Asn

Gly

Gin

Glu

Pro

Glu

Ser

165

170

175

aag

tac

cgc

acg

acc

ccg

ccc

cag

ctg

gac

gag

gac

ggg

tcc

tac

ttc

576

Lys

Tyr Arg

Thr

Pro

Gin

Leu

Asp

Glu

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

180

185

190

ctg

tac

agc

aag

ctc

tet

gtg

gac

aag

agc

cgc

tgg

cag

cgg

gga

gac

624

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Ser

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Arg

Gly Asp

195

200

205

acc

ttc

ata

tgt

gcg

gtg

atg

cat

gaa

get

cta

cac

aac

cac

tac

aca

€72

Thr

Phe

Ile

Cys

Ala

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

210

215

220

cag

aaa

tcc

ctc

tcc

cat

tet

ccg

ggt

aaa

702

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

225 230 <210> 33 <211> 234 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 33

Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala

-42CZ 302303 B6

1

5

10

15

Pro

Glu

Met

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

Lys

Asp

Thr

Leu

Ile

Ala

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Asp

Leu

Gly

Pro

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

Val

50

55

60

Asp

Gly

Lys

Gin

Met

Gin

Thr

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

Phe

Asn

Gly

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Pro

Ile

Gly

His

Gin

85

90

95

Asp

Trp

Leu

Lys

Gly

Lys

Gin

Phe

Thr

Cys

Lys

Val

Asn

Lys

Ala

100

105

110

Leu

Pro

Ser

Pro

Ile

Glu

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Arg

Gly

Gin

Ala

115

120

125

His

Gin

Pro

Ser

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Ser

Arg

Glu

Leu

Ser

130

135

140

Lys

Asn

Thr

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Ile

Lys

Asp

Phe

Pro

145

150

155

160

Asp

Ile

Asp

Val

Glu

Trp

Gin

Ser

Asn

Gly

Gin

Glu

Pro

Gxu

Ser

165

170

175

Lys

Tyr

Arg

Thr

Pro

Gin

Leu

Asp

Glu

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

180

185

190

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Ser

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Arg

Gly Asp

195

200

205

Thr

Phe

Ile

Cys

Ala

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

210

215

220

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

225 230 <210> 34 <211> 552 <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(552) io <223> Endostatin <400> 34

cac

acc cac cag

gac ttc cag

ccg gtg

ctg cac ctg gtg gcc ctg aac

His

Thr

His

Gin

Asp

Phe

Gin

Pro

Val

Leu

His

Leu

Val

Ala

Leu

Asn

1

5

10

15

-43 CZ 302303 B6

age ccg cag ccg

ggc ggc

atg Met

ega ggc

atc cgg gga gcg

gac ttc cag

96

Ser

Pro

Gin

Pro 20

Gly

Arg

Gly 25

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp 30

Phe

Gin

tgc

ttc

cag

gcg

ege

gcc

gcg

ggg

ctg

gcc

ggc

acc

ttc

cgg

gcc

144

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

ttc

ctg

tcg

cgg

ctg

cag

gac

ctc

tac

age

atc

gtg

ege

gcc

192

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Ala

50

55

60

gac

ege

acc

ggg

gtg

ccc

gtc

aac

ctc

agg

gac

gag

gtg

ctc

ttc

240

Asp

Arg

Thr

Gly

Val

Pro

Val

Asn

Leu

Arg

Asp

Glu

Val

Leu

Phe

65

70

75

80

ccc

age

tgg

gag

gcc

tta

ttc

tcg

ggc

tcc

gag

ggc

cag

ctg

aag

ccc

288

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

Gin

Leu

Lys

Pro

85

90

95

ggg

gcc

ege

atc

ttc

tet

ttc

gac

ggc

aga

gat

gtc

ctg

cag

cac

ccc

336

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly Arg

Asp

Val

Leu

Gin

His

Pro

100

105

110

gcc

tgg

ccc

cgg

aag

age

gtg

tgg

cac

ggc

tcc

gac

ccc

age

ggg

ege

384

Ala

Trp

Pro

Arg

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly

Arg

115

120

125

ege

ctg

acc

gac

age

tac

tgc

gag

acg

tgg

cgg

acg

gag

gcc

ccg

gcg

432

Arg

Leu

Thr

Asp

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Ala

Pro

Ala

130

135

140

gcc

acc

ggg

cag

gcg

tcg

ctg

gcg

ggc

agg

ctg

gag

cag

480

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Ala

Gly

Arg

Leu

Glu

Gin

145

150

155

160

gag

gcc

gcg

age

tgc

ege

cac

gcc

ttc

gtg

ctc

tgc

atc

gag

aac

528

Glu

Ala

Ser

Cys

Arg

His

Ala

Phe

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

age

gtc

atg

acc

tcc

ttc

tcc

aag

552

Ser

Val

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180 <210> 35 <211> 184 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 35

His 1

Thr

His

Gin

Asp 5

Phe

Gin

Pro

Val

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

Leu 15

Asn

Ser

Pro

Gin

Pro 20

Gly

Met

Arg

Gly 25

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp 30

Phe

Gin

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

-44 CZ 302303 B6

40 45

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Ala

50

55

60

Asp

Arg

Thr

Gly

Val

Pro

Val

Asn

Leu

Arg

Asp

Glu

Val

Leu

Phe

65

70

75

80

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Seř

Gly

Ser

Glu

Gly

Gin

Leu

Lys

Pro

85

90

95

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly Arg Asp

Val

Leu

Gin

His

Pro

100

105

110

Ala

Trp

Pro

Arg

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly

Arg

115

120

125

Arg

Leu

Thr

Asp

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Ala

Pro

Ala

130

135

140

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Ala

Gly

Arg

Leu

Glu

Gin

145

150

15S

160

Glu

Ala

Ser

Cys

Arg

His

Ala

Phe

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

Ser

Val

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker Hindlíí/Draíll: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (3)..(41) <400> 36 ag ctt cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg 41

Leu His Thr His Gin Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu

10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 37 ag ctt cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg 41

Leu His Thr His Gin Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu

10 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence

-45CZ 302303 B6 <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker Hindi Π/DraIII: spodní řetězec <400> 38 gtgcagcacc ggctggaagt cctggtgggt gtga <210> 39 <211> 1077 <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(1077) <223> Angiostatin <400> 39

ata tat Ile Tyr 1

ctt Leu

tea gag

tgc Cys

aag act gga aat

ggg aaa acc tac agg

ggg Gly

48

Ser

Glu 5

Lys

Thr

Gly

Asn 10

Gly

Lys

Thr

Tyr

Arg 15

acc

atg

gcc

aaa

acg

aag

aat

gat

gtt

gcc

tgt

caa

aaa

tgg

agt

gac

96

Thr

Met

Ala

Lys

Thr

Lys

Asn

Asp

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Asp

20

25

30

aat

tet

ccg

cac

aaa

CCt

aac

tat

acg

CCt

gag

aag

cac

ccc

ttg

gag

144

Asn

Ser

Pro

His

Lys

Pro

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Lys

His

Pro

Leu

Glu

35

40

45

ggg

ctg

gag

aac

tat

tgc

agg

aac

CCt

gac

aac

gac

gag

aac

ggg

192

Gly

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Asn

Gly

50

55

60

ccc

tgg

tgc

tac

acc

aca

aac

cca

gac

gtg

agg

ttc

gac

tac

tgc

aac

240

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asn

Pro

Asp

Val

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asn

65

70

75

80

att

cca

gaa

tgt

gaa

gag

gaa

tgt

atg

cat

tgc

agt

ggg

gaa

aat

tat

288

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

85

90

95

gag

ggc

aaa

att

tcc

aag

aca

aag

tet

gga

ctc

gag

tgc

caa

gcc

tgg

336

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

aac

tet

caa

acc

cca

cat

get

cat

gga

tat

att

CCt

tcc

aaa

ttt

cca

38 4

Asn

Ser

Gin

Thr

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125

agc

aag

aac

ttg

aag

atg

aat

tac

tgc

cgt

aac

CCt

gat

ggg

gag

ccc

432

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130 135 140

-46 CZ 302303 B6

cgc cca Arg Pro 145

tgg tgt

ttc Phe

acc Thr 150

atg gat ccc

aac aaa ege tgg gaa ttc tgt

480

Trp

Cys

Met

Asp

Pro

Asn

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys 160

gac att

ccc

ege

tgt

aca

cca

ccc

cct

tcg

ggc

cca

acg

tac

528

Asp lle

Pro

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Gly

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

cag tgt

ctg

aag

ggc

aga

ggg

gag

agc

tac

ega

ggg

aag

gtg

tcc

gtc

576

Gin Cys

Leu

Lys

Gly Arg

Gly

Glu

Ser

Tyr Arg

Gly Lys

Val

Ser

Val

180

185

190

act gtc

tet

gga

cat

aca

tgt

cag

cac

tgg

agt

gaa

cag

acc

cct

cac

624

Thr Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

aag cac

aac

agg

acc

cca

gaa

aac

ttc

cct

tgc

aaa

aat

ttg

gat

gaa

672

Lys His

.Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

210

215

220

aac tac

tgt

ege

aac

cct

gat

gga

gaa

aca

gct

cca

tgg

tgc

tac

aca

720

Asn Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

acc aac

agt

gag

gtg

agg

tgg

gaa

cac

tgc

cag

att

ccg

tcc

tgt

gag

768

Thr Asn

Ser

Glu

Val

Arg

Trp

Glu

His

Cys

Gin

lle

Pro

Ser

Cys

Glu

245

250

255

tcc tet

cca

ata

acc

aca

gaa

tat

ttg

gat

gcc

cca

gct

tca

gtg

cca

816

Ser Ser

Pro

lle

Thr

Glu

Tyr

Leu

Asp

Ala

Pro

Ala

Ser

Val

Pro

260

265

270

cct gaa

caa

act

cct

gtg

gtc

cag

gag

tgc

tac

cac

ggc

aat

ggg

cag

864

Pro Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

His

Gly

Asn

Gly

Gin

275

280

285

agt tat

ega

ggc

aca

tca

tcc

act

atc

aca

gga

aga

aaa

tgt

cag

912

Ser Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

lle

Thr

Gly Arg

Lys

Cys

Gin

290

295

300

tet tgg

tca

tet

atg

aca

cca

cac

ega

cat

gag

aag

acc

cca

gaa

cac

960

Ser Trp

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Glu

His

305

310

315

320

ttc ccg

gag

gct

ggc

ctg

aca

atg

aac

tac

tgc

agg

aat

ccc

gac

gcc

1008

Phe Pro

Glu

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

325

330

335

gac aaa

agc

cct

tgg

tgt

tac

acc

gac

ccc

tet

gtg

ege

tgg

gag

1056

Asp Lys

Ser

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

340

34S

350

ttc tgt

aac

ttg

aga

aaa

tgc

1077

Phe Cys

Asn

Leu

Arg

Lys

Cys

355

-47CZ 302303 B6 <210> 40 <211> 359 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 40

Ile 1

Tyr

Leu

Ser

Glu 5

Cys

Lys

Thr

Gly

Asn 10

Gly

Lys

Thr

Tyr

Arg 15

Gly

Thr

Met

Ala

Lys 20

Thr

Lys

Asn

Asp

Val 25

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Ser

Asp

Asn

Ser

Pro 3S

His

Lys

Pro

Asn

Tyr 40

Thr

Pro

Glu

Lys

His 45

Pro

Leu

Glu

Gly

Leu 50

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 60

Asp

Glu

Asn

Gly

Pro 65

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asn

Pro

Asp

Val

Arg 75

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asn 80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 85

Glu

Cys

Met

His 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 95

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 100

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser 105

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin 110

Ala

Trp

Asn

Ser

Gin 115

Thr

Pro

His

Ala

His 120

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 125

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 130

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 135

Tyr

Cys

Arg

Asn

pro 140

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 145

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 150

Met

Asp

Pro

Asn

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys 160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Pro

Pro 170

Pro

Ser

Gly

Pro

Thr 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly Arg

Gly

Glu

Ser 185

Tyr

Arg

Gly

Lys

Val 190

Ser

Val

Thr

Val

Ser 195

Gly

His

Thr

Cys

Gin 200

His

Trp

Ser

Glu

Gin 205

Thr

Pro

His

Lys

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Asp

Glu

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 235

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 240

Thr

Asn

Ser

Glu

Val

Arg

Trp

Glu

His

Cys

Gin

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu

245 250 255

Ser Ser Pro Ile

Thr

Thr Glu Tyr Leu Asp 265

Ala

Pro

Ala

Ser Val 270

Pro

260

Pro

Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

His

Gly

Asn

Gly

Gin

275

280

285

-48CZ 302303 B6

Ser

Tyr Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Xle

Thr

Gly Arg

Lys

Cys

Gin

290

295

300

Ser

Trp

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Glu

His

305

310

315

320

Phe

Pro

Glu

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

325

330

335

Asp

Lys

Ser

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

340

345

350

Phe

Cys

Asn

Leu

Arg

Lys

Cys

355 <210> 41 <211> 12 <2I2> DNA <213> U měle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: palindromový linker, kde je stop kodon TGA následován restrikčním místem Xhol <400> 41 tgactcgagt ca 12 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: mutagenní primer pro myši angiostatin <220>

<221> CDS <222> (1)..(21) <400> 42 ggg cct tgg agc tac act aca 21

Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr

5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 43

Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr 1 5 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

-49CZ 302303 B6 <223>

Popis uměle připravené sekvence: primer použitý k zavedení místa HindlII do myšího angiostatinu <220>

<221> CDS <222> (9)..(32) io <400> 44 gcggatcc aag ctt agt aca cat ccc aat gag gg Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu

5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> U měle připravená sekvence <400> 45

Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu 1 5 <210> 46 <211> 59 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker BspHI/BamHI: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (2)..(58) <400> 46 c atg acc tet ttc tcc aaa tcg agc ggg ggc agc ggg ggc gga ggc agc 4 9 Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

10 15 ggc ggg ggc g 59

Gly Gly Gly <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> U měle připravená sekvence <400> 47

Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Gly Gly Gly <210> 48 <211> 59 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

- 50CZ 302303 B6 <223> Popis uměle připravené sekvence: linker BspHI/BamHI: spodní řetězec <400> 48 gatccgcccc cgccgctgcc tccgcccccg ctgcccccgc tcgatttgga gaaagaggt 59 <210> 49 <211> 12 <212> DNA <213> Umele připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker BamHI/HindlII: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (3)..(11) <400> 49 ga tcc tca ggc c

Ser Ser Gly 1 <210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker BamHI/HindlII: spodní řetězec <400> 50 agctggcctg ag 12 <210> 51 <211> 10 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker AfllI/HindlII: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (1)..(9) <400> 51 tta agc ggc c

Leu Ser Gly ¹⁰ <210> 52 <211> 10 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker AflII/HindllI: spodní řetězec

-51 CZ 302303 B6 <400> 52 agctgggcgc <210> 53 <211> II <212> DNA <213> Umele připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker Xhol/Aflll: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (3)..(11) <400> 53 tc gac tcc ggc

Asp Ser Gly 1 <2i0> 54 <211> II <212> DNA <213> U měle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker Xhol/Aflll: spodní řetězec <400> 54 ttaagccgga g

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

35 1. Homodimemí fúzní protein, vykazující inhibiční aktivitu na angiogenezi, zahrnující Fc oblast imunoglobulinu a cílový protein, přičemž Fc oblast obsahuje pantovou oblast, doménu CH₂ a doménu CH₃ a cílový protein vykazuje endostatinovou inhibiční aktivitu na angiogenezi, jedná se o fragment kolagenu XVIII a je připojen kN-koncům nebo C-koncům Fc oblasti imunoglobulinu.
2. Homodimemí fúzní protein podle nároku 1, v němž je cílovým proteinem endostatin nebo jeho bioaktivní fragment.
3. Homodimemí fúzní protein podle nároku 2, v němž cílový protein obsahuje aminokyselino45 vou sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 4.
4. Homodimemí fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vněmžje cílový protein připojen k C-konci Fc oblasti.

-52 CZ 302303 B6
5. Homodimemí fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, který dále obsahuje druhý cílový protein, kterým je fragment plasminogenu nebo fragment kolagenu XVIH vykazující angiostatinovou nebo endostatinovou inhibiční aktivitu na angiogenezi.

5
6. Homodimemí fúzní protein podle nároku 5, v němž je druhým cílovým proteinem endostatin nebo angiostatin nebo jeho bioaktivní fragment.
7. Homodimemí ťuzní protein podle nároku 5 nebo 6, v němž je druhým cílový protein připojen polypeptidovým linkerem k prvnímu cílovému proteinu.

io
8. Homodimemí fúzní protein podle nároku 7, v němž první cílový protein je připojen k Nkoncům Fc oblasti a druhý cílový protein je připojen k C-koncům Fc oblasti.
9. Homodimemí fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8, v němž prvním cílovým 15 proteinem je endostatin a druhým cílovým proteinem je angiostatin nebo jeho bioaktivní fragment.
10. Homodimemí fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků l až 9, v němž je imunoglobulinem IgGl.
11. Molekula DNA kódující signální sekvenci a fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.
12. Repliko vatě lný expresní vektor pro transfekci savčí buňky, který obsahuje DNA podle 25 nároku 11.
13. Způsob produkce homodimemího fúzního proteinu podle kteréhokoliv z nároků t až 10, vyznačující se tím, že zahrnuje tyto stupně;

(a) transfekci savčí buňky vektorem podle nároku 12, jo (b) produkci fúzního proteinu kultivací této buňky a (c) izolaci fúzního proteinu.