PL202057B1 - Homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, sposób jego otrzymywania oraz cząsteczka DNA i wektor ekspresyjny zawierający to DNA - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy homodimerycznego bia lka fuzyjnego, b ed acego inhibitorem angiogenezy, zawieraj acym obszar Fc immunoglobuliny oraz bia lko docelowe. Przedmiotem wynalazku jest równie z cz asteczka DNA koduj aca sekwencj e sygna low a i bia lko fuzyjne wed lug wynalazku; wektor ekspresyj- ny do transfekowania komórki ssaczej obejmuj acy DNA wed lug wynalazku oraz sposób otrzymywania homodimerycznego bia lka fuzyjnego. Homodimeryczne bia lko fuzyjne mo ze by c zastosowane do wy- twarzania leku do leczenia guzów litych, nowotworów przenoszonych przez krew i przerzutów nowo- tworowych. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, zawierające obszar Fc immunoglobuliny oraz białko docelowe; DNA kodujący homodimeryczne białko fuzyjne według wynalazku, wektor ekspresyjny do transfekowania komórki ssaczej obejmujący DNA kodujące homodimeryczne białko fuzyjne oraz sposób otrzymywania homodimerycznego białka fuzyjnego.

Dwa silne inhibitory angiogenezy: angiostatyna [O'Reilly i in., (1994) Cell 79: 315] oraz endostatyna [O'Reilly i in., (1997) Cell 88: 277] zostały odkryte i w wyniku badań stwierdzono, że powstają one naturalnie w czasie rozwoju guzów pierwotnych. Obydwa białka są specyficznymi inhibitorami namnażania komórek śródbłonkowych i hamują wzrost guza przez blokowanie angiogenezy, czyli powstawania nowych naczyń krwionośnych, co sprzyja odżywianiu guza. Badania wykazały, że takie inhibitory nie są toksyczne, nawet w bardzo wysokich dawkach. Mogą one powstrzymać rozwój przerzutów i spowodować regresję pierwotnego guza do postaci nieczynnej. Oba inhibitory zidentyfikowano jako proteolityczne fragmenty znacznie większych, nie poddanych obróbce cząsteczek. Angiostatynę zidentyfikowano jako proteolityczny fragment plazminogenu [O'Reilly i in., (1994) Cell 79: 315-328 oraz patenty Stanów Zjednoczonych AP nr nr 5,733,876; 5,837,682 i 5,885,795]. Dokładniej mówiąc, angiostatyna jest wewnętrznym fragmentem plazminogenu o wielkości 38 kDa, zawierającym przynajmniej trzy obszary kringle plazminogenu. Endostatynę zidentyfikowano jako proteolityczny fragment kolagenu XVIII [O'Reilly i in., (1997) Cell 88: 277-285], a dokładniej fragment o wielkości 20 kDa z końca C kolagenu XVIII.

Wymienione białka wywołały duże zainteresowanie onkologów, ponieważ okazało się, że u myszy związki te powstrzymują rozwój wielu różnych rodzajów nowotworów, nie powodując efektów ubocznych i lekooporności. W tradycyjnej chemioterapii zwykle następuje nabyta lekooporność, spowodowana przede wszystkim przez genetyczną niestabilność komórek rakowych. Kuracje z wykorzystaniem inhibitorów angiogenezy nie są ukierunkowane na komórki rakowe, ale raczej na normalne komórki śródbłonkowe, wspierające rozwój guza. W związku z genetyczną stabilnością komórek śródbłonkowych, kuracja tego rodzaju może prowadzić do niższej lekooporności. U myszy poddanych przedłużonej kuracji z użyciem endostatyny, nie stwierdzano wystąpienia lekooporności. Ponadto, powtarzane cykle leczenia myszy endostatyną prowadziły do wydłużenia okresu nieczynności guza i braku nawrotów po przerwaniu kuracji [Boehm i in., (1997) Nature 390: 404].

Pomimo obiecujących wyników u myszy, nie udało się wyprodukować handlowych ilości klinicznie czystej, rozpuszczalnej, aktywnej angiostatyny lub endostatyny w układach ekspresyjnych obejmujących komórki E.coli, bakulowirusów, drożdży lub organizmów ssaków. Ekspresja w E.coli doprowadziła do wytworzenia nierozpuszczalnych agregatów białek o niezdefiniowanym składzie, których nie można było wstrzykiwać ludziom. W innych układach ekspresyjnych uzyskano bardzo niewielkie ilości rekombinowanych białek [O'Reilly i in. (1997) Cell 88:277].

Niskie wydajności ekspresji w tych układach można wytłumaczyć tym, że angiostatyna i endostatyna stanowią wewnętrzne fragmenty znacznie większych białek. Skrócone białka mogą nie fałdować się odpowiednio pod nieobecność reszt, które odcięto od cząsteczek prekursorowych. Na przykład, angiostatyna ma 26 reszt cysteinowych, które tworzą liczne wiązania disiarczkowe. Ekspresja angiostatyny może nie zapewniać optymalnego środowiska dla prawidłowego tworzenia wielu wiązań disiarczkowych na drodze wydzielniczej. Również białko rekombinowanej endostatyny, wytworzone w E.coli, wytrą ca się w czasie dializy, prawdopodobnie z powodu hydrofobowoś ci endostatyny [O'Reilly i in., (1997) Cell 88: 277].

Główną przeszkodę w zastosowaniu znanych dotychczas postaci angiostatyny i endostatyny stanowi konieczność iniekcji stosunkowo dużej ilości białka w ciągu tygodni lub miesięcy dla uzyskania pożądanego działania klinicznego. Przykładowo, optymalną skuteczność leczenia u myszy uzyskiwano, podając dawki 20 mg endostatyny/kg/dzień [Boehm i in., (1997) Nature 390:404]. Wobec pilnej potrzeby klinicznego sprawdzenia endostatyny i angiostatyny, bardzo ważne jest opracowanie sposobu wytwarzania dużych ilości materiałów o odpowiedniej czystości.

Jednym z układów ekspresyjnych o dużej wydajności uzyskiwania białek fuzyjnych w komórkach ssaków jest konstrukt DNA kodujący sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny i docelowe białko. Produkt konstruktu fuzyjnego określa się ogólnie jako białko fuzyjne z immunoglobuliną „immunofuzynę”. Kilka białek uzyskano w ten sposób, między innymi: IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, eiG-H3, Receptor IgE, PSMA i gp120. Konstrukty te przedstawiono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych nr nr 5,541,087 i 5,726,044.

PL 202 057 B1

Głównym celem uzyskania ekspresji rekombinowanych białek fuzyjnych w komórkach ssaków było nadanie nowych lub użytecznych właściwości cząsteczkom hybrydowym, na przykład, odpowiedniego fałdowania, zwiększonej rozpuszczalności, ukierunkowania cytokiny lub toksyny in vivo, wiązania receptora Fc, wiązania dopełniacza, wiązania białka A, wydłużenia półokresu trwania w układzie krążenia oraz zwiększonej zdolności do przekraczania bariery krew-mózg. Przykładami rekombinowanych białek fuzyjnych wytwarzanych w komórkach ssaków są immunogenne białka złożone cytokin [Gillies i in., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428; Gillies i in., (1993) Bioconjugate Chemistry 4: 230], immunoadhezyny [Capon i in., (1989) Nature 337: 525], immunotoksyny [Chaudhary i in., (1989) Nature 339: 394] i białko złożone czynnika wzrostu nerwu [Friden i in., (1993) Science 259: 373].

Celem wynalazku było dostarczenie nowych cząsteczek DNA, które ułatwią wytwarzanie z dużą wydajnością i wydzielanie inhibitorów angiogenezy w różnych komórkach ssaków. Innym celem wynalazku było opracowanie sposobów leczenia ssaków nukleinowymi kwasami kodującymi białkowe inhibitory angiogenezy, bądź sekwencjami aminokwasowymi białkowych inhibitorów angiogenezy, w tym również białka nie występujące naturalnie, uzyskane w wyniku syntezy biologicznej lub w inny sposób sztuczne białka takie, jak wytworzone w wyniku projektowania.

Przedmiotem wynalazku jest homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, zawierające obszar Fc immunoglobuliny oraz białko docelowe, w którym region Fc obejmuje region zawiasowy, domenę 2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, CH2, i domenę 3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, CH3, a białko docelowe jest sprzężone z końcem C obszaru Fc i jest wybrane z grupy obejmującej: endostatynę, angiostatynę i endostatynę-polilinker-angiostatynę, gdzie angiostatyna jest angiostatyną o pełnej długości lub obszar kringle 1, 2 lub 3, lub stanowi ich kombinacje. Korzystnie białko docelowe jest endostatyną korzystniej białko docelowe zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako sekwencja nr 4. W innym korzystnym rozwiązaniu immunoglobuliną jest lgG1.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka DNA kodująca sekwencję sygnałową i białko fuzjne według wynalazku.

Innym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny do transfekowania komórki ssaczej obejmujący DNA kodujący sekwencję sygnałową i białko fuzjne według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania homodimerycznego białka fuzyjnego według wynalazku, obejmujący etapy, w których transfekuje się komórkę ssaczą wektorem niosącym gen kodujący białko fuzyjne według wynalazku, następnie prowadzi się hodowlę tak uzyskanych komórek ssaczych aby wytworzyć białko fuzyjne, po czym uzyskuje się z komórek białko fuzyjne.

Białka fuzyjne według wynalazku zapewniają ekspresję biologiczną z dużą wydajnością czynnych białkowych inhibitorów angiogenezy. Inhibitory te mogą być następnie oddzielane i łączone z farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami, po czym podawane ssakom, na przykład ludziom. Alternatywnie, nukleinowe kwasy kodujące te białka fuzyjne, bądź sekwencje aminokwasowe zawierające białkowe inhibitory angiogenezy, można łączyć z farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami i podawać ssakom.

Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny oraz przynajmniej jedno docelowe białko, określane tu również mianem białkowy inhibitor angiogenezy, wybrany z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu wykazujący aktywność angiostatyny, fragment kolagenu XVIII wykazujący aktywność endostatyny oraz ich kombinacje. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego koduje kolejno w kierunku 5' do 3', sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny oraz sekwencję docelowego białka. W innym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje kolejno w kierunku 5' do 3', sekwencję sygnałową , sekwencję docelową oraz obszar Fc immunoglobuliny.

W korzystnym rozwią zaniu obszar Fc immunoglobuliny zawiera obszar zawiasowy i przynajmniej jeden stały obszar ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, na przykład CH2, CH3 oraz, w zależności od typu immunoglobuliny użytej do wytworzenia obszaru Fc, opcjonalnie domenę 4 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (CH4). W korzystniejszym rozwiązaniu obszar Fc immunoglobuliny zawiera obszar zawiasowy, domenę CH2 i domenę CH3. W pewnych okolicznościach, w obszarze tym korzystnie nie występuje przynajmniej domena CH1. Obszary Fc immunoglobulin mogą pochodzić z każdej klasy immunoglobulin, na przykład IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ale korzystnym źródłem jest IgG.

W kolejnym rozwiązaniu kwas nukleinowy według wynalazku może zostać włączony w zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, którym następnie transfekuje się komórki ssacze.

Niniejszy wynalazek obejmuje także białko fuzyjne zawierające obszar Fc immunoglobuliny połączony, bezpośrednio wiązaniem polipeptydowym lub za pomocą linkera polipeptydowego, z docelo4

PL 202 057 B1 wym białkiem wybranym z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny, fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny oraz ich kombinacje. Docelowe białko może być sprzęgane przez koniec C z końcem

N obszaru Fc immunoglobuliny, ale bardziej korzystne jest połączenie koń ca N biał ka z końcem C obszaru Fc.

W innej korzsytnej kompozycji białko fuzyjne moż e zawierać drugie białko docelowe wybrane z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny oraz fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny. W takim konstrukcje białka docelowe mogą być jednakowe bądź różne. Przykładowo, białko fuzyjne zawiera angiostatynę jako pierwsze białko docelowe, obszar Fc immunoglobuliny, oraz endostatynę jako drugie białko docelowe. Połączenie białek docelowych zachodzi bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy. W taki sam sposób białka mogą być połączone z obszarem Fc immunoglobuliny. W takim przypadku, pierwsze białko jest dołączone z końcem N obszaru Fc immunoglobuliny, a drugie - z końcem C obszaru Fc.

Inną możliwość stanowi asocjacja białek, wiązaniami kowalencyjnymi, na przykład wiązaniem disiarczkowym lub peptydowym, lub wiązaniami niekowalencyjnymi, prowadząca do powstania białka multimerycznego. W korzystnym rozwiązaniu, asocjacja zachodzi przez wiązania kowalencyjne za pomocą jednego lub więcej wiązań disiarczkowych między resztami cysteinowymi, korzystnie usytuowanymi w obszarach zawiasowych immunoglobuliny, rozmieszczonych w obszarach Fc obu łańcuchów.

Docelowe białko zawiera fragment plazminogenu o masie cząsteczkowej około 40 kD, oraz opcjonalnie, sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 3, w innym rozwiązaniu - fragment kolagenu XVIII z sekwencją aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 1. Ponadto, docelowe białko może być angiostatyną bądź endostatyną o pełnej długości, albo ich bioaktywnymi fragmentami. Wybór źródła do uzyskania docelowego białka zależy od jego przeznaczenia. Na przykład, jeżeli docelowe białko ma być podawane ludziom, powinno ono być pochodzenia ludzkiego.

Przedmiotem wynalazku są także sposoby wytwarzania białek fuzyjnych zawierających obszar Fc immunoglobuliny i białko docelowe wybrane z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny, fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny. Sposób obejmuje etapy, w których: a) przygotowuje się komórki ssacze, zawierające cząsteczkę DNA, kodującego odpowiednie białko, z sekwencją sygnałową lub bez i b) hoduje się komórkę w celu uzyskania pożądanego białka. Uzyskany produkt zbiera się , ponownie fałduje i oczyszcza znanymi sposobami. Zakładając, że białko zawiera miejsce cięcia proteolitycznego, rozdzielające obszar Fc immunoglobuliny i białko docelowe, białko docelowe można następnie oddzielić od białka fuzyjnego stosując znane enzymy proteolityczne, po czym jeżeli jest taka konieczność, oczyścić przed użyciem.

W opisie przedstawiono również sposoby leczenia ssaków, na przykład ludzi, wymagające zastosowania inhibitorów angiogenezy. Dotyczy to leczenia nowotworów. Działanie inhibitorów angiogenezy prowadzi do spowolnienia lub zatrzymania wzrostu guza, a w niektórych okolicznościach, do jego regresji. Inhibitor podaje się w postaci białka fuzyjnego lub jako kwas nukleinowy, korzystnie włączony w wektor ekspresyjny, z farmaceutycznie akceptowalnym noś nikiem.

Przedstawiona powyżej istota wynalazku, jego odmiany, właściwości i zalety staną się bardziej zrozumiałe po zapoznaniu się ze szczegółowym opisem i rysunkiem.

Wynalazek został przykładowo przedstawiony na fig. 1A-1F, na której schematycznie przedstawiono przykładowe białkowe inhibitory angiogenezy, uzyskane według wynalazku (patrz przykłady 10-15). Na rysunku, fig. 1A przedstawia Fc-region Kringle'a angiostatyny; fig. 1B: Fc-wewnętrzny region Kringle'a angiostatyny; fig. 1C: Fc-endostatyna-linker GlySer-wewnętrzny region Kringle'a angiostatyny; fig. 1D: Fc-endostatyna-linker GlySer-region Kringle'a angiostatyny; fig. 1E: Fc-endostatyna-linker GlySer-angiostatyna; oraz fig. 1 F: angiostatyna-Fc-endostatyna. Linie pionowe przedstawiają opcjonalne wiązania disiarczkowe, łączące reszty cysteinowe (C) w obszarze zawiasowym cząsteczki Fc.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek obejmuje białka fuzyjne, określane z jęz. ang. immunofuzynami, wykorzystywane do wytwarzania handlowych ilości klinicznie dopuszczalnych inhibitorów angiogenezy. Przed użyciem inhibitory te można wyodrębnić z konstruktów białkowych. Stosuje się także, jeżeli jest wskazane leczenie inhibitorami angiogenezy, bezpośrednie podawanie ssakom immunogennych białek fuzyjnych lub kodujących je kwasów nukleinowych.

PL 202 057 B1

Białka według wynalazku zawierają obszar Fc immunoglobuliny i przynajmniej jedno docelowe białko, będące inhibitorem angiogenezy. Korzystnie inhibitor pochodzi z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny. Przypuszcza się również, że inne polipeptydy wykazujące podobną aktywność, można poddać ekspresji w celu uzyskania białek fuzyjnych według wynalazku.

Na fig. 1A-1F przedstawiono sześć przykładowych konstruktów białkowych, odpowiadających kompozycjom według wynalazku. Ponieważ najkorzystniejsze są produkty w postaci dimerów, wszystkie przedstawiono w tej postaci, połączone ze sobą parą wiązań disiarczkowych pomiędzy cysteinami sąsiednich jednostek. Na rysunku przedstawiono mostki disiarczkowe łączące ze sobą dwa obszary Fc immunoglobuliny przez ich obszar zawiasowy, podobnie jak to ma miejsce w przypadku naturalnych postaci tych cząsteczek. Mimo, że preferowane są konstrukty zawierające obszar zawiasowy Fc i wykazano, że rokują one doskonale jako leki, wynalazek obejmuje również sieciowanie w innych pozycjach. Ponadto w pewnych okolicznościach, użyteczne praktycznie dimery lub multimery można wytwarzać w drodze połączeń niekowalencyjnych, na przykład w wyniku oddziaływań hydrofobowych.

Figura 1 pokazuje konstrukty homodimerowe, gdyż są one istotnymi rozwiązaniami wynalazku. Należy jednak przyznać, że użyteczne są również heterodimery, chociaż ich oczyszczanie często sprawia trudności. Ponadto możliwe jest zastosowanie do hamowania angiogenezy u ssaków, w tym u ludzi, aktywnych konstruktów stanowiących mieszaninę homodimerów i heterodimerów. Na przykład jeden łańcuch struktury heterodimerycznej zawiera angiostatynę, a drugi - endostatynę.

Figura 1A przedstawia konstrukt dimerowy wytworzony zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 10. W każdym monomerze znajduje się obszar Fc immunoglobuliny 1 z obszarem zawiasowym, domena CH2 i domena CH3. Pierwszy obszar kringle z angiostatyny 2, zarówno pierścień wewnętrzny jak i zewnętrzny, jest bezpośrednio połączony z końcem C obszaru Fc1. Na fig. 1B pokazano drugie rozwiązanie według wynalazku (patrz przykład 11), zawierające ten sam obszar Fc1, jak na fig. 1A, przy czym z końcem C obszaru Fc1 połączony jest tylko wewnętrzny pierścień pierwszej domeny kringle angiostatyny 3. Na fig. od 1C do 1F pokazano różne rozwiązania konstruktów według wynalazku, w których jako docelowe biał ko wystę puje wiele inhibitorów angiogenezy ustawionych kolejno i połączonych przez linker. Na fig. 1C docelowe białko zawiera pełnej długości endostatynę 4, linker polipeptydowy 5 i wewnętrzny pierścień pierwszej domeny kringle angiostatyny 3. Na fig. 1D przedstawiono białko zawierające obszar Fc taki sam, jak na fig. 1A, i docelowe białko zawierające pełnej długości endostatynę 4, linker polipeptydowy 5 i całkowity obszar (obydwa pierścienie zewnętrzny i wewnętrzny) kringle 1 angiostatyny 2. Konstrukt na fig. 1E różni się od fig. 1D tym, że najdalszym obszarem na końcu C domeny białkowej jest kopia pełnej długości angiostatyny 7.

Na fig. 1A-1E pokazano konstrukty typu Fc-X, gdzie X oznacza docelowe białko, ale uważa się, że użyteczne są także konstrukty typu X-Fc, jak również X-Fc-X, gdzie X oznacza takie same lub różne białka. Na fig. 1F pokazano konstrukt, który zawiera w kierunku od końca N do C pełnej długości ludzką angiostatynę 7, ludzki obszar Fc immunoglobuliny 6 z obszarem zawiasowym, oraz domenę pełnej długości ludzkiej endostatyny 4.

Określenie „inhibitor angiogenezy” oznacza tu dowolny łańcuch polipeptydowy, który ogranicza lub hamuje powstawanie nowych naczyń krwionośnych u ssaków. W zakresie terapii przeciwnowotworowej, inhibitor tego rodzaju powstrzymuje tworzenie się nowych naczyń krwionośnych w obrębie guza lub na jego powierzchni, zwłaszcza na guzie litym. Użyteczne inhibitory angiogenezy można identyfikować za pomocą wielu znanych testów. Należą do nich, na przykład, test namnażania bydlęcych komórek śródbłonkowych, test błony omoczniowej kurcząt (CAM) lub test mysiej rogówki. Preferowany jest test CAM [patrz przykładowo O'Reilly i in., (1994) Cell 79: 315-328 i O'Reilly i in., (1997) Cell 88: 277-285]. W skrócie, z zapłodnionych trzydniowych jajek pobierano embriony z nietkniętym żółtkiem i umieszczano je na szalkach Petri'ego. Po inkubacji w temperaturze 37°C i w atmosferze 3% CO2 przez trzy dni, na błony omoczniowe poszczególnych embrionów nakładano krążek metylocelulozowy, zawierający przypuszczalny inhibitor angiogenezy. Po inkubacji przez 48 godzin, oglądano membrany pod mikroskopem celem stwierdzenia obecności obszarów o zahamowanym tworzeniu naczyń.

Korzystnymi inhibitorami angiogenezy użytecznymi według wynalazku są: angiostatyna i endostatyna. Określenia „angiostatyna” i „endostatyna” dotyczą nie tylko białek pełnej długości, ale także ich odmian i fragmentów aktywnych biologicznie, jak również aktywnych biologicznie fragmentów plazminogenu i kolagenu XVIII. Określenie „fragment aktywny biologicznie” w przypadku angiostatyny odnosi się do każdego białkowego fragmentu plazminogenu lub angiostatyny, który wykazuje przynajmniej

PL 202 057 B1

30%, korzystniej przynajmniej 70%, a zwłaszcza korzystnie przynajmniej 90% aktywności angiostatyny pełnej długości, oznaczonej testem CAM. W przypadku endostatyny określenie „fragment aktywny biologicznie” odnosi się do każdego białkowego fragmentu kolagenu XVIII lub endostatyny, który ma przynajmniej 30%, korzystniej przynajmniej 70%, a zwłaszcza korzystnie przynajmniej 90% aktywności endostatyny pełnej długości, oznaczonej testem CAM.

Określenie „odmiany” oznacza odmiany specyficzne i alleliczne, a także inne odmiany występujące i nie występujące naturalnie, na przykład wytworzone konwencjonalnymi technikami genetycznymi, które są przynajmniej w 70% podobne lub w 60% identyczne, bardziej korzystnie przynajmniej w 75% podobne lub w 65% identyczne, a zwłaszcza korzystnie przynajmniej w 80% podobne lub w 70% identyczne z naturalnie występującymi sekwencjami endostatyny lub angiostatyny.

W celu okreś lenia, czy dany polipeptyd wykazuje podobną lub identyczną do polipeptydu odniesienia aktywność, dokonuje się najpierw porównania sekwencji, korzystając z dynamicznego programu algorytmu opisanego przez Smitha i Watermana (1981) J.Mol.Biol. 147: 195-197, stosując macierz podstawienia BLOSUM62, opisaną na fig. 2 w publikacji Henikoff i Henikoff (1992), „Amino acid substitution matrices from protein blocks”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919., jego sekwencji aminokwasowej albo kodującej jej sekwencji kwasu nukleinowego. Według wynalazku odpowiednia wartość wag za wystąpienie pierwszej przerwy w sekwencji wynosi -12, a wartość wag za wydłużenie przerwy wynosi -4. Programy komputerowe wykonujące porównanie sekwencji na podstawie algorytmu Smitha-Watermana i matrycy BLOSUM62, np. oprogramowanie GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Anglia), są dostępne na rynku i szeroko stosowane.

Po dokonaniu przyrównania sekwencji można obliczyć w procentach stopień podobieństwa. Poszczególne reszty aminokwasowe z każdej sekwencji porównuje się kolejno ze sobą. Jeżeli w macierzy BLOSUM62 wartość dla dwóch porównywanych reszt aminokwasowych wynosi zero lub jest liczbą ujemną to stopień podobieństwa dla tej pary wynosi zero; w odwrotnym przypadku wynosi 1,0. Wynik podobieństwa jest sumą wyników dla porównanych reszt aminokwasowych. Wykonywana następnie normalizacja wyniku polega na podzieleniu go przez ilość aminokwasów w mniejszej z obu porównywanych sekwencji. Znormalizowany wynik określa procentowe podobieństwo dwóch polipeptydów. Alternatywnie, aby obliczyć w procentach stopień identyczności, porównywane reszty aminokwasowe z każdej sekwencji ponownie się porównuje. Jeżeli nie są one identyczne, wynik identyczności wynosi zero; w odwrotnym przypadku - wynosi 1.0. Wynik identyczności jest sumą wyników dla porównywanych aminokwasów. Wykonywana następnie normalizacja wyniku polega na podzieleniu go przez ilość aminokwasów w mniejszej z obu porównywanych sekwencji. Znormalizowany wynik określa w procentach identyczność dwóch polipeptydów. Przy obliczaniu procentowego podobieństwa i identycznoś ci pomija się insercje i delecje. Nie uwzglę dnia się takż e wartoś ci wag za przerwy w sekwencji, chociaż wykorzystuje się je w początkowym porównywaniu.

Docelowe białka uzyskuje się w wyniku ekspresji jako białka fuzyjne z obszarem Fc immunoglobuliny. Jak wiadomo, każdy stały obszar ciężkiego łańcucha immunoglobuliny składa się z czterech lub pięciu domen. Domeny są kolejno nazwane następująco: CH1-zawias-CH2-CH3(-CH4). W poszczególnych klasach immunoglobulin sekwencje DNA kodujące domeny ciężkiego łańcucha są wzajemnie homologiczne, na przykład, domena CH2 z IgG jest homologiczna z domeną CH2 z IgA i IgD, oraz domeną CH3 z IgM i IgE.

Określenie „obszar Fc immunoglobuliny” oznacza koniec karboksylowy stałego obszaru łańcucha immunoglobuliny, korzystnie stałego obszaru łańcucha ciężkiego, lub jego części. Na przykład, obszar Fc immunoglobuliny może zawierać 1) domenę CH1, domenę CH2 i domenę CH3, 2) domenę CH1 i domenę CH2, 3) domenę CH1 i domenę CH3, 4) domenę CH2 i domenę CH3, lub 5) połączenie dwóch lub więcej domen z zawiasowym obszarem immunoglobuliny. W korzystnej kompozycji według wynalazku obszar Fc kodowany przez konstrukt DNA zawiera przynajmniej obszar zawiasowy immunoglobuliny, domenę CH2 i domenę CH3, i nie zawiera przynajmniej domeny CH1.

Preferowaną klasą immunoglobulin, z której pochodzi stały obszar łańcucha ciężkiego, jest IgG (Igy) (podklasy γ 1,2, 3 lub 4). Mogą być także stosowane inne klasy immunoglobulin, IgA (Iga), IgD (^δ), IgE (^ε) oraz IgM (^μ). Wybór odpowiednich stałych obszarów łańcucha ciężkiego immunoglobuliny jest szczegółowo dyskutowany w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych AP nr nr 5,541,087 i 5,726,044. Dokonanie wyboru odpowiedniej klasy i podklasy tak, aby uzyskać określony rezultat wymaga wiedzy fachowej. Część konstruktu DNA kodującego obszar Fc immunoglobuliny korzystnie zawiera przynajmniej część domeny zawiasowej i przynajmniej część domeny CH₃ z Fcy bądź homologicznych domen z IgA, IgD, IgE lub IgM.

PL 202 057 B1

Zależnie od zastosowania, mogą być stosowane geny kodujące stały obszar pochodzący od innych gatunków niż ludzie, np. od myszy lub szczurów. Obszar Fc używany jako składnik immunofuzyjnego konstruktu DNA może pochodzić z każdego gatunku ssaczego. Jeżeli niepożądane jest w komórce gospodarza lub u zwierzęcia wystąpienie odpowiedzi immunologicznej na działanie Fc, należy dobrać taki obszar z tego samego gatunku, co komórka gospodarza lub zwierzę. Na przykład, można użyć ludzkiego Fc, jeżeli białko ma być stosowane u ludzi; podobnie używa się mysiego Fc dla myszy. Ponadto użyteczne mogą być również substytucje lub delecje w domenach stałych obszarów w konstruktach, obejmujące jedną lub więcej reszt aminokwasowych. Jako przykład można podać substytucję reszt aminokwasowowych w górnym obszarze CH2 celem uzyskania odmiany Fc o zmniejszonym powinowactwie wiązania z receptorami Fc [Cole i in., (1997) J. Immunol. 159: 3613]. Takie konstrukty można przygotować sposobami dobrze znanymi biologom molekularnym.

Zastosowanie ludzkiego Fcy1 jako sekwencji z obszaru Fc ma szereg zalet. Jeżeli białko fuzyjne z inhibitorem angiogenezy ma być zastosowane jako lek, domena Fcy1 może nadać białku fuzyjnemu aktywność funkcjonowania jako efektor. Aktywność ta obejmuje aktywność biologiczną taką jak wiązanie dopełniacza, komórkową cytotoksyczność skierowaną przeciwko przeciwciałom, przenoszenie przez barierę łożyska i zwiększony półokres trwania w surowicy. Domena Fc umożliwia także wykrywalnie testem ELISA anty-Fc i oczyszczanie przez związanie z białkiem A ze Staphylococcus aureus („Białko A”). W niektórych zastosowaniach może być korzystne wyeliminowanie określonych rodzajów aktywności obszaru Fc, np. wiązania z receptorem Fc lub wiązania dopełniacza.

W przypadku immunogennych białek fuzyjnych z inhibitorem angiogenezy, jedną z funkcji składnika fuzyjnego będącego obszarem Fc immunoglobuliny jest ułatwienie odpowiedniego sfałdowania białkowego inhibitora angiogenezy, zapewniającego uzyskanie aktywności i ograniczenia rozpuszczalności tylko do cząsteczek aktywnych, przynajmniej w przestrzeni międzykomórkowej. Ponieważ składnik białka fuzyjnego, Fc, jest hydrofilowy, uzyskane immunogenne białko fuzyjne z inhibitorem jest łatwo rozpuszczalne, w przeciwieństwie, na przykład, do rekombinowanej endostatyny, wytwarzanej w E.coli [O'Reilly (1997) Cell 88: 277]. We wszystkich podanych przykładach, uzyskano wysoką wydajność wytwarzania immunogennych białek fuzyjnych. Były one wydzielane do pożywek zwykle w stężeniach od około 30 do 100 μg/ml i oczyszczane z łatwością chromatograficznie z zastosowaniem białka A. Ponadto, możliwe jest oddzielanie tych białek i dalsze oczyszczanie znanymi metodami, np. z zastosowaniem sefarozy heparynowej, sefarozy lizynowej i chromatografią powinowactwa.

Oprócz wysokiej wydajności ekspresji, białka fuzyjne według wynalazku charakteryzują się dłuższymi okresami półtrwania w surowicy, przypuszczalnie z powodu większych rozmiarów cząsteczek. Na przykład, ludzki Fc-ludzka angiostatyna ma półokres trwania w surowicy wynoszący 33 godziny u myszy, w porównaniu z 4 do 6 godzin dla ludzkiej angiostatyny [O'Reilly i in., (1996) Nature Medicine 2: 689]. Uważa się, że angiostatyna o masie cząsteczkowej 40 kD i endostatyna o masie 20 kD, są dostatecznie małe, aby ulegać efektywnemu usuwaniu przez nerki. Przeciwnie, Fc-angiostatyna i Fc-endostatyna w postaci dimeru mają masy cząsteczkowe, odpowiednio, 145 kD i 100 kD, ponieważ zawierają po dwa obszary Fc immunoglobuliny i po dwie cząsteczki angiostatyny lub endostatyny. Tego rodzaju dwuwartościowa struktura może wykazywać większe powinowactwo wiązania z receptorami angiostatyny lub endostatyny. Jeżeli aktywność inhibitora angiogenezy jest uzależniona od receptora, to białka fuzyjne zawierające Fc są potencjalnie bardziej skuteczne w ograniczaniu nowotworu niż sama jednowartościowa angiostatyna lub endostatyna. Ponadto, jeżeli angiostatyna i/lub endostatyna należą do klasy dimerowych ligandów białkowych, to fizyczne ograniczenie spowodowane przez Fc, powoduje, że dimeryzacja staje się procesem wewnątrzcząsteczkowym, jej równowaga przesuwa się w stronę dimeru, a wiązanie z receptorem ulega wzmocnieniu. Stosując standartowe techniki z użyciem rekombinowanego DNA można także w odpowiednie pozycje monomeru wprowadzać reszty cysteinowe w celu stabilizacji dimeru w wyniku tworzenia kowalencyjnego wiązania disiarczkowego.

Określenie „wielowartościowy” oznacza tu cząsteczkę rekombinowaną zawierającą dwa lub więcej segmentów czynnych biologicznie. Fragmenty białkowe tworzące cząsteczkę wielowartościową mogą być połączone linkerem polipeptydowym, który łączy części składowe, nie powodując przesunięcia ramki i umożliwiając im niezależne działanie.

Określenie „dwuwartościowy” oznacza wielowartościową cząsteczkę rekombinowaną zawierającą w fuzyjnym konstrukcje dwa białka docelowe według wynalazku, na przykład cząsteczka Fc-X, gdzie X wybrano niezależnie spośród angiostatyny, endostatyny lub ich odmian. Cząsteczkę określamy jako dwuwartościową (patrz np. fig. 1A), gdy zawiera dwie cząstki X dołączone do obszaru Fc immunoglobuliny (który zwykle sam jest dimerem złożonym z fragmentów ciężkiego łańcucha z przynajmniej

PL 202 057 B1 częścią obszaru zawiasowego i domeną CH3, oraz opcjonalnie domeną CH2). Jeżeli konstrukt fuzyjny według wynalazku ma postać Fc-X-X, uzyskana dimerowa cząsteczka Fc jest czterowartościowa. Dwa białka tworzące cząsteczkę Fc-X-X mogą być połączone linkerem peptydowym. Dwuwartościowa cząsteczka może zwiększać pozorne powinowactwo wiązania pomiędzy cząsteczką a jej receptorem. Przykładowo, jeżeli jedna cząsteczka endostatyny w grupie Fc-endostatyna może wiązać się z receptorem komórki z określonym powinowactwem, to druga cząsteczka endostatyny z tej samej grupy może wiązać się ze znacznie większą intensywnością (powinowactwo pozorne) z drugim receptorem tej samej komórki. Wynika to z fizycznej bliskości drugiej cząsteczki endostatyny do receptora po związaniu się pierwszej cząsteczki. W przypadku wiązania się przeciwciała z antygenem, pozorne powinowactwo zwiększa się przynajmniej 10⁴ razy.

Określenia „multimetr” i „multimerowy” dotyczą stabilnego połączenia dwóch lub więcej łańcuchów polipeptydowych, kowalencyjnie, na przykład przez oddziaływanie kowalencyjne zwłaszcza wiązanie disiarczkowe, bądź niekowalencyjne, na przykład przez interakcję hydrofobową. Multimer oznacza zarówno homomultimer, w którym obydwa polipeptydy są jednakowe, jak również heteromultimer złożony z różnych polipeptydów.

Określenie „dimerowy” dotyczy cząsteczki multimerowej, w której dwa łańcuchy polipeptydowe białka są stabilnie połączone w wyniku oddziaływań kowalencyjnych lub niekowalencyjnych. Należy rozumieć, że fragment obszaru Fc immunoglobulinowy jest zwykle dimerem złożonym fragmentów ciężkiego łańcucha zawierających przynajmniej część obszaru zawiasowego i domenę CH3, oraz opcjonalnie domenę CH2. Wiadomo, że wiele ligandów białkowych wiąże się z receptorami jako dimery. Jeżeli ligand białkowy X dimeryzuje naturalnie, to część X w cząsteczce Fc-X będzie ulegać dimeryzacji w znacznie większym stopniu, ponieważ proces dimeryzacji jest zależny od stężenia. Fizyczna bliskość dwóch cząsteczek X, połączonych poprzez wiążący obszar Fc immunoglobuliny, powoduje, że dimeryzacja staje się procesem wewnątrzcząsteczkowym, jej równowaga przesuwa się znacznie w stronę dimeru, a wią zanie biał ka z receptorem ulega wzmocnieniu.

Należy rozumieć, że w przedstawionym wynalazku wykorzystuje się konwencjonalne techniki rekombinacji DNA w celu wytworzenia użytecznych białek fuzyjnych Fc. Konstrukty wytwarza się korzystnie na poziomie DNA, po czym uzyskany DNA wprowadza się wektorów ekspresyjnych i poddaje ekspresji prowadzącej do otrzymania immunogennych białek fuzyjnych. Określenie „wektor” oznacza kwas nukleinowy, zawierający sekwencję nukleotydową odpowiednią do umieszczenia w komórce gospodarza i rekombinacji lub wbudowania do genomu komórki gospodarza, bądź autonomicznej replikacji jako epizom. Wektory obejmują kwasy nukleinowe w postaci linowej, plazmidy, fagemidy, kosmidy, wektory RNA, wektory wirusowe itp. Wektorami wirusowymi mogą być retrowirusy, adenowirusy i parwowirusy związane z adenowirusem. Określenie „ekspresja genowa” lub „ekspresja” docelowego białka oznacza transkrypcję sekwencji DNA, translację transkryptu mRNA i wydzielenie otrzymanego białka fuzyjnego Fc.

Użytecznym wektorem ekspresyjnym jest pdCs [Lo i in., (1988) Protein Engineering 11: 495], w którym do transkrypcji genu Fc-X wykorzystuje się enhancer/promotor wirusa ludzkiej cytomegalii i sygnał poliadenylacji SV40. Sekwencja enchancera/promotora wirusa ludzkiej cytomegalii pochodzi z nukleotydów od -601 do +7 sekwencji opracowanej przez Bosharti'ego in., 1985, Cell 41: 521. Wektor zawiera także zmutowany gen kodujący reduktazę dihydrofolanową jako marker selekcyjny [Simonsen i Levinson, (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 2495].

Odpowiednia komórka gospodarza może być transformowana lub transfektowana sekwencją DNA według wynalazku, po czym wykorzystana do ekspresji i wydzielania docelowego białka. Korzystnie stosuje się komórki hybrydomy, mielomy NS/O, komórki 293, komórki jajników chomika syryjskiego, komórki HeLa i komórki COS.

Białka fuzyjne według wynalazku są korzystnie wytwarzane przy użyciu konwencjonalnych technik rekombinacji DNA. Korzystnie prowadzi się ekspresję w komórce gospodarza cząsteczki DNA kodującego sekwencję sygnałową obszaru Fc immunoglobuliny i docelowe białko (określane również jako inhibitor angiogenezy). Korzystne konstrukty mogą kodować w kierunku 5' do 3' sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny i docelowe białko. Alternatywę stanowi kodowanie w kierunku 5' do 3' sekwencji sygnałowej, docelowego białka i obszaru Fc immunoglobuliny.

Określenie „sekwencja sygnałowa” oznacza segment peptydowy, który w komórce gospodarza ukierunkowuje wydzielanie immunogennego białka fuzyjnego, będącego inhibitorem angiogenezy, a następnie jest odcinany po translacji. Sekwencja sygnałowa według wynalazku jest polinukleotydem, który koduje sekwencję aminokwasową inicjującą transport białka przez błonę retikulum endoplazmiPL 202 057 B1 cznego. Do użytecznych sekwencji sygnałowych według wynalazku należą sygnałowe sekwencje przeciwciał z lekkim łańcuchem, np. przeciwciała 14.18 (Gillies i in., 1989, Jour. of Immunol. Meth. 125:

191-202), sekwencje sygnałowe ciężkiego łańcucha przeciwciał, np. przeciwciała MOPC141 (Sakano i in.,

1980, Nature 286: 5774), a także inne znane sekwencje sygnałowe (patrz Watson, 1984, Nucleic Acids

Research 12: 5145).

Sekwencje sygnałowe są dobrze znane. Zwykle mają od 16 do 30 reszt aminokwasowych, a mogą także zawierać więcej lub mniej. Typowy peptyd sygnałowy zawiera trzy obszary: podstawowy obszar końca N, centralny obszar hydrofobowy oraz bardziej polarny obszar końca C. Centralny obszar hydrofobowy zawiera od 4 do 12 reszt hydrofobowych, które kotwiczą peptyd sygnałowy w dwuwarstwowej błonie lipidowej w czasie transportu powstającego polipeptydu. Po inicjacji, peptyd sygnałowy jest zazwyczaj odcinany w świetle retikulum endoplazmatycznego przez enzymy komórkowe, znane jako peptydazy sygnałowe. Potencjalne pozycje odcinania peptydu sygnałowego generalnie odpowiadają „regule (-3, -1)”. Wynika stąd, że w pozycjach -1 i -3 typowy peptyd sygnałowy ma małe, obojętne reszty aminokwasowe, i nie ma w tym obszarze reszt proliny. Peptydaza sygnałowa tnie peptyd pomiędzy aminokwasami -1 i +1. W ten sposób, część DNA, kodująca sekwencję sygnałową może być odcinana od strony końca aminowej immunogennego białka fuzyjnego w czasie jego wydzielania. Wynikiem tego jest wydzielenie immunogennego białka fuzyjnego złożonego z obszaru Fc i białka docelowego. Szczegółowy opis sekwencji peptydu sygnałowego podał von Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14: 4683.

Oczywiste jest, że wybór odpowiedniej sekwencji sygnałowej może wymagać przeprowadzenia kilku rutynowych doświadczeń. Należą do nich określenie zdolności sekwencji sygnałowej do ukierunkowania wydzielania immunogennego białka fuzyjnego, a także określenie optymalnej konfiguracji, genomowego lub cDNA, sekwencji, której użycie zapewni skuteczne wydzielenie immunogennego białka fuzyjnego. Ponadto, przy odpowiedniej wprawie, można wytworzyć syntetyczny peptyd sygnałowy w oparciu o reguły podane przez von Heijne'a, a następnie sprawdzić jego wydajność. Sekwencję sygnałową określa się także mianem „peptydu sygnałowego”, „sekwencji prowadzącej” lub „peptydu prowadzącego”.

Połączenie sekwencji sygnałowej i obszaru Fc immunoglobuliny określa się czasem jako kasetę wydzielniczą. Przykładową kasetę wydzielniczą według wynalazku stanowi polinukleotyd, kodujący w kierunku 5' do 3', sekwencję sygnał ową genu kodują cego lekki ł a ń cuch immunoglobuliny i genu kodującego obszar Fcy1 ludzkiej immunoglobuliny γ1. Gen kodujący obszar Fcy1 immunoglobuliny Fcy1 korzystnie zawiera przynajmniej część domeny zawiasowej i przynajmniej część domeny CH3, lub alternatywnie przynajmniej część domeny zawiasowej, domeny CH2 i domeny CH3. DNA kodujący kasetę wydzielniczą może mieć postać genomową lub cDNA.

W innym rozwiązaniu, sekwencja DNA zawiera miejsce cięcia proteolitycznego, wstawioną pomiędzy kasetę wydzielniczą a białkowy inhibitor angiogenezy. Miejsce cięcia umożliwia proteolityczne odcięcie kodowanego białka fuzyjnego, co pozwala oddzielić domenę Fc od białkowego inhibitora angiogenezy. Jako „miejsce cięcia proteolitycznego” określa się sekwencje aminokwasowe, które ulegają cięciu przez enzym proteolityczny lub inne proteolityczne czynniki rozszczepiające. Do użytecznych miejsc cięcia proteolitycznego należą sekwencje aminokwasowe, które są rozpoznawane przez enzymy proteolityczne, jak trypsyna, plazmina i enterokinaza K. Znane są liczne pary: miejsce cięcia/enzym tnący; patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5,726,044. Jeżeli sekwencja docelowego białka jest wyjściową cząsteczką dla angiostatyny, endostatyny lub ich aktywnej odmiany, pożądane białko można uzyskać przez odcięcie przy pomocy endogenicznego enzymu proteolitycznego, jak elastyna, plazmina lub urokinaza.

Niniejszy wynalazek obejmuje także białka fuzyjne zawierające różne kombinacje rekombinowanej angiostatyny i endostatyny lub ich fragmentów, które można wytworzyć w dużych ilościach. Pomimo stwierdzonej efektywności w hamowaniu rozwoju nowotworów, mechanizm blokowania angiogenezy przez angiostatynę i endostatynę nie jest dokładnie znany. Angiostatyna ma kilka struktur Kringle, a endostatyna - inne motywy strukturalne, z których każdy może być samodzielnie odpowiedzialny lub brać udział w wiązaniu białek z komórkami śródbłonkowymi, co daje efekt zatrzymania angiogenezy. Zatem wynalazek dotyczy docelowych białek, które są bioaktywnymi fragmentami angiostatyny, jak kringle ΐ, kringle 2 i kringle 3, tudzież ich kombinacji, oraz endostatyny, które wykazują oddziaływanie podobne fizjologicznie do naturalnej angiostatyny i endostatyny o pełnej długości.

W innym rozwiązaniu wynalazku przedstawiono dwufunkcyjne hybrydowe konstrukty inhibitorów angiogenezy. Jako dwufunkcyjną hybrydową cząsteczkę lub konstrukt określa się białko wytworzone

PL 202 057 B1 przez połączenie dwóch podjednostek białkowych, pochodzących z różnych białek. Każda podjednostka białkowa ma swoją niezależną aktywność tak, że w cząsteczce hybrydowej działania te mogą być addytywne lub synergiczne. Dzięki białkom hybrydowym możliwe jest badanie synergicznego wpływu angiostatyny i endostatyny na zwierzęta. Korzystna dwufunkcyjna hybryda może zawierać przynajmniej dwa różne inhibitory angiogenezy połączone kolejno, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy. Przykładowo, w korzystnym rozwiązaniu sekwencja docelowa koduje przynajmniej część angiostatyny połączoną w ramce z przynajmniej częścią endostatyny, przy czym domeny angiostatyny i endostatyny wykazują czynność antyangiogenetyczną lub hamującą angiogenezę. Jednostki mogą być połączone przez linker polipeptydowy.

Określenie „linker polipeptydowy” oznacza sekwencję peptydową która może łączyć dwa białka lub białko z obszarem Fc. Linker polipeptydowy korzystnie zawiera wiele reszt aminokwasów, takich jak glicyna i/lub seryna, szczególnie serie peptydów glicynowych i serynowych o długości 10-15 reszt; patrz patent Stanów Zjednoczonych AP nr 5,258,698. Uważa się, że optymalną długość i kompozycję aminokwasową linkera należy dobrać doświadczalnie.

Stwierdzono, że w ekspresji różnych części angiostatyny jako fuzyjnych cząsteczek z Fc uzyskuje się wysokie wydajności, przypuszczalnie dlatego, że część Fc działa jako nośnik, wspomagając poprawne fałdowanie polipeptydu na końcu C. Ponadto, obszar Fc może ulegać glikozylacji i uzyskiwać wysoki ładunek przy fizjologicznej wartości pH, co sprzyja rozpuszczaniu hydrofobowych białek.

Niniejszy wynalazek ujawnia także sposoby wytwarzania, jako białek fuzyjnych Fc, angiostatyny i endostatyny z gatunków innych niż ludzie. Są one użyteczne w przedklinicznych badaniach inhibitorów angiogenezy, ponieważ ocena skuteczności i toksyczności leków białkowych musi być wykonana, przed podaniem ich ludziom, na organizmach zwierzęcych. Ludzkie białko może nie oddziaływać w oczekiwany sposób na myszy z powodu wywoływania reakcji immunologicznej i/lub wykazywać odmienną farmakokinetykę, co zniekształca wyniki testu. W związku z tym do badań na myszach używa się równoważnego białka mysiego.

Do porównania rozpuszczalnych białek huFc-hu angiostatyna, huFc-hu endostatyna, muFc-mu angiostatyna, muFc-mu endostatyna, z nierozpuszczalnymi białkami wytwarzanymi w układzie ekspresyjnym z E. coli stosowano standardowy model raka płuc u myszy według Lewisa [O' Reilly i in., (1997) Cell 88: 277]. Rozpuszczalne białka fuzyjne Fc znacznie bardziej efektywnie tłumiły wzrost guza w modelu Lewisa niż odpowiadające im białka wytworzone w E.coli. Ponadto, myszy laboratoryjne były pochodzenia wsobnego, a ich nowotwory powstały w wyniku indukcji, a nie spontanicznie. A zatem, efektywność u myszy może nie korelować z prawdopodobną efektywnością leczenia nowotworów u ludzi. Przedkliniczne badania na psach dostarczą dokładniejszych informacji o skuteczności inhibitorów angiogenezy w przypadkach spontanicznych guzów, ponieważ u psów pojawia się naturalnie wiele nowotworów tego rodzaju. Opracowanie sposobów wytwarzania mysich białek fuzyjnych (mu) Fc-mu angiostatyna, muFc-mu endostatyna, oraz psich (ca) Fc-ca angiostatyna, caFc-ca endostatyna według wynalazku, umożliwi przedkliniczne badania inhibitorów angiogenezy w organizmach myszy i psów.

Rozwiązania według wynalazku mogą być wykorzystywane w leczeniu stanów chorobowych wywołanych przez angiogenezę, dzięki podawaniu DNA, RNA lub białek według wynalazku. Do leczonych stanów chorobowych należą na przykład: guzy stałe; guzy krwiopochodne; przerzuty nowotworowe; nowotwory łagodne, w tym naczyniaki krwionośne, nerwiaki nerwu słuchowego, włókniakonerwiaki, jaglice i ziarniaki ropotwórcze; reumatoidalne zapalenie stawów; łuszczyca; choroby naczyń ocznych (retinopatia cukrzycowa, fibroplazja pozasoczewkowa, zwyrodnienie plamki, odrzucenie przeszczepu rogówki, jaskra naczyniowa); rubeoza, zespół Oslera-Webbera; angiogeneza mięśnia sercowego; unaczynienie płytkowe; telangiektazja; naczyniowłókniak hemofilowy; oraz ziaminowanie ran; a także nadmierna lub nieprawidłowa stymulacja komórek śródbłonkowych, zrosty jelitowe, zwężenie tętnic, blizny stwardnieniowe lub przerostowe skóry, tj. bliznowce.

Przedstawione tutaj konstrukty DNA można stosować w terapii genowej, podając do komórki gen kodujący endostatynę lub angiostatynę różnymi sposobami, na przykład jako natywny DNA sprzężony z promotorem lub DNA wbudowany w wektor wirusowy. Po umieszczeniu w komórce, następuje ekspresja genów angiostatyny i/lub endostatyny bądź ich fragmentów i wytwarzanie in vivo białka przeznaczonego do uzyskania określonego skutku biologicznego. Konstrukt DNA według wynalazku zapewnia wysoką wydajność ekspresji białka fuzyjnego. Białka fuzyjne według wynalazku mogą być również przydatne w leczeniu stanów chorobowych związanych z angiogenezą a ich efektywność kliniczna jest większa od natywnych i rekombinowanych inhibitorów angiogenezy, ponieważ immunogenne białka fuzyjne zawierające inhibitory angiogenezy według wynalazku charakteryzują się dłużPL 202 057 B1 szym okresem półtrwania surowicy. Struktura dwuwartościowa i dimerowa białek według wynalazku sprawia, że wykazują one wyższe powinowactwo wiązania. Dwufunkcyjne hybrydowe cząsteczki według wynalazku mają wyższą efektywność kliniczną w wyniku synergicznych działań dwóch różnych inhibitorów angiogenezy połączonych przez sprzężony obszar Fc lub elastyczny linker polipeptydowy.

Kompozycje według wynalazku dostarcza się zwierzętom różnymi odpowiednimi sposobami, bezpośrednio (np. miejscowo, przez iniekcję, wszczepienie lub miejscowe podanie do tkanki) lub ogólnoustrojowo (np. pozajelitowo lub doustnie). Przy dostarczaniu pozajelitowym, jak podawanie dożylne, podskórne, dooczne, dootrzewnowe, domięśniowe, policzkowe, doodbytnicze, dopochwowe, dooczodołowe, domózgowe, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzrdzeniowe, dokomorowe, dooponowe, dozbiornikowe, wewnątrztorebkowe, donosowe, lub w postaci aerozolu, kompozycja zawiera korzystnie część wodnej lub ciekłej zawiesiny bądź roztworu odpowiednich fizjologicznie. Nośnik lub vehiculum jest fizjologicznie dopuszczalny, jeśli nie wpływa niekorzystnie na równowagę elektrolitową i/lub objętościową u pacjenta, wspomagając jedynie dostarczanie pożądanej kompozycji pacjentowi. Ośrodkiem ciekłym może być zwykła sól fizjologiczna (np. 9,85% roztwór wodny NaCI, 0,15 M, pH 7-7,4).

Korzystne dawki immunogennych białek fuzyjnych wynoszą od 50 ng/m² do 1 g/m², korzystniej od 5 ng/m² do 200 mg/m², a najkorzystniej od 0,1 mg/m² do 50 mg/m². Korzystne dawki kwasów nukleinowych kodujących immunogenne białka fuzyjne wynoszą od 1 μg/m² do 100 mg/m², korzystniej od 20 μg/m² do 10 mg/m², a najkorzystniej 400 μg/m² do 4 mg/m². Uważa się, że optymalne sposoby podawania oraz dawki należy określać doświadczalnie.

W dalszej części opisu przedstawione przykłady, które nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Ekspresja białka fuzyjnego huFc-hu endostatyna

Ludzką endostatynę poddawano ekspresji jako białko fuzyjne o składzie: ludzki obszar Fc-ludzka endostatyna (huFc-huEndo) według wskazówek Lo i in. (1998) Protein Engineering 11: 495. Fc oznacza fragment Fc ludzkiej immunoglobuliny gamma (sekwencja DNA przedstawiona jako SEQ ID NO: 1; sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID NO: 2). Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) została wykorzystana do uzyskania cDNA kodującego endostatynę (SEQ ID NO: 3; sekwencja aminokwasowa podana w SEQ ID NO: 4) tak, aby uzyskać ekspresję do fuzyjnego białka Fc-Endo. Wiodącym primerem był albo 5' - CC CCG GGT AAA CAC AGC CAC CGC GAC TTC C (SEQ ID NO: 5; kodowane aminokwasy pokazano jako SEQ ID NO: 6) albo 5' - C AAG CTT CAC AGC CAC CGC GAC TTC C (SEQ ID NO: 7; kodowane aminokwasy pokazane jako SEQ ID NO: 8), gdzie po miejscu restrykcyjnym Xmal lub Hindlll następowała sekwencja kodująca koniec N endostatyny. Primer z miejscem restrykcyjnym Xmal umożliwił wprowadzenie cDNA kodującego endostatynę w miejsce Xmal na końcu domeny CH3 obszaru Fc IgG. Primer z miejscem restrykcyjnym Hindlll dostosował cDNA kodujący endostatynę do połączenia się z miejscem restrykcyjnym Hindlll wektora pdCs-Fc(D4K), który zawiera miejsce rozpoznania enterokinazy Asp4-Lys [LaVallie i in., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2331123317] na złączu białka fuzyjnego. Wstecznym primerem był 5' - C CTC GAG CTA CTT GGA GGC AGT CAT G (SEQ ID NO: 9), który zaprojektowano tak aby umieścić kodon stop translacji (antykodon, CTA) bezpośrednio po końcu C endostatyny, przy czym po kodonie stop występowało miejsce restrykcyjne Xhol. Produkty PCR klonowano i sekwencjonowano, a fragment Xmal-Xhol wprowadzano do uzyskanego wektora pdCs-Fc ciętego przez Xmal i Xhol. Podobnie fragment Hindlll-Xhol kodujący endostatynę wprowadzano w odpowiednio cięty wektor pdCs-huFc(D4K). Stabilne klony prowadzące ekspresję Fc-Endo lub Fc(D4K)-endostatyna uzyskiwano w wyniku eloktroporacji komórek NS/0, a następnie selekcji w pożywce wzrostowej, zawierającej 100 nM metotreksanu. Poziom ekspresji białka oceniano testem ELISA pod kątem zawartości anty-ludzkiego Fc (przykład 3) i potwierdzano analizą SDS-PAGE, uzyskując białko o wielkości ok. 52 kD. Najlepsze klony wklonowywano przez ograniczone rozcieńczenie.

P r z y k ł a d 2

Transfekcja i hodowla komórek

W celu uzyskania czasowej transfekcji, plazmid wprowadzano do komórek 293 ludzkiej nerki przez współstrącenie plazmidu DNA fosforanem wapniowym [Sambrook i in., (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY] lub infekcję liposomami przy użyciu LipofectAMINE Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) według protokołu producenta.

W celu uzyskania stabilnie transferowanych klonów, plazmid DNA wprowadzano do komórek NS/0 mysiego szpiczaka przez elektroporację. Komórki NS/0 hodowano w pożywce Eagle zmodyfiko12

PL 202 057 B1 wanej wg Dulbecco, uzupełnionej 10% bydlęcą surowicą płodową. Około 5x10⁶ komórek przemyto jednokrotnie PBS i zawieszono ponownie w 0,5 ml PBS. 10 μg plazmidu DNA inkubowano następnie wraz z komórkami w kuwecie Gene Pulser (szczelina elektrody 0,4 cm, BioRad, Hercules, CA) na lodzie przez 10 minut. Elektroporację wykonano w urządzeniu Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) przy ustawieniach 0,25 V i 500 nF. Komórki pozostawiano aby odzyskały normalne funkcjonowanie przez 10 minut na lodzie, po czym zawieszano je ponownie w pożywce wzrostowej i przenoszono na dwie płytki z 96 studzienkami. Stabilnie transfekowane klony wybierano przez wzrost w obecności 100 nM metotreksanu (MTX), który wprowadzano dwa dni po transfekcji. Komórki odżywiano co 3 dni jeszcze trzykrotnie, a po upływie 2 do 3 tygodni pojawiły się klony odporne na MTX. Supernatanty z klonów oznaczano testem ELISA na obecność anty-Fc w celu identyfikacji wydajnych producentów. Wysokowydajne klony oddzielano i wysiewano w pożywce wzrostowej zawierającej 100 nM MTX.

P r z y k ł a d 3

Procedury ELISA

Do oznaczania stężenia produktów białkowych w supernatantach klonów odpornych na MTX innych próbkach testowych, używano trzech różnych oznaczeń metodą ELISA. Analizę z użyciem anty-ludzkiego Fc (huFc) stosowano do oznaczania ilości białek zawierających ludzki Fc. Odpowiednio przy oznaczaniu ilości białek zawierających mysie Fc i psie Fc wykorzystywano przeciwciała mysiego anty-Fc (muFc) i psiego anty-Fc (caFc). Poniżej szczegółowo opisano sposób postępowania przy wykonywania analizy ELISA dla anty-huFc.

A. Powlekanie płytek

Płytki do ELISA pokrywano AffiniPure Goat anti-Human IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) w ilości 5 μg/ml w PBS i 100 μl/studzienkę na płytkach z 96 studzienkami (Nunc-lmmuno plate MaxiSorp™, Nalge Nunc International, Rochester, NY). Pokryte płytki przykrywano i inkubowano w temperaturze 4°C przez noc. Następnie przemywano je czterokrotnie 0,05% Tween 20 w PBS, i blokowano 1% BSA/1% kozią surowicą w PBS, 200 μl/studzienkę. Po inkubacji z buforem blokującym w temperaturze 37°C przez 2 godziny, płytki przemywano czterokrotnie 0,05% Tween 20 w PBS i nakłuwano do osuszenia na papierowych ręcznikach.

B. Inkubacja z badanymi próbkami i przeciwciałami drugorzędowymi

Próbki testowe rozcieńczano do odpowiednich stężeń w buforze próbki, zawierającym 1% BSA/1% kozią surowicę/0,05% Tween/w PBS. Krzywą wzorcową przygotowano przy użyciu chimerycznego przeciwciała (z ludzkim Fc) o znanym stężeniu. W tym celu wykonano serię rozcieńczeń w buforze tak, aby uzyskać krzywą w zakresie od 125 ng/ml do 3,9 ng/ml. Rozcieńczone próbki i wzorce dodawano do płytek w ilości 100 μl/studzienkę, po czym płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez godziny, a następnie przemywano 8 razy 0,05% Tween w PBS. Z kolei do każdej studzienki dodawano 100 μl drugorzędowego przeciwciała, peroksydazy chrzanowej (HRP) sprzężonej z ludzkim anty-lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA), rozcieńczonego 1:120,000 w buforze próbki. Dokładne rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego oznaczano dla każdej partii. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 2 godziny, płytkę przemywano 8 razy 0,05% Tween w PBS.

C. Wywoływanie

Roztwór substratu przygotowywano przez rozpuszczanie 30 mg (1 tabletka) dichlorowodorku o-fenylenodiaminy (OPD) w 15 ml buforu z 0,025 M kwasu cytrynowego i 0,05 M Na2HPO4, zawierającego 0,03% świeżo dodanego H₂O₂. Roztwór nanoszono na płytkę w ilości 100 μl/studzienkę. Pozostawiano do uzyskania barwy na 30 minut, w temperaturze pokojowej w ciemności. Czas wywoływania był zmienny, zależnie od różnorodności partii na pokrytych płytkach, przeciwciała drugorzędowego, itd. Reakcję zatrzymywano, dodając 4N H₂SO₄ w ilości 100 μl/studzienkę. Odczyty z płytki dokonywano przy użyciu czytnika, ustawionego zarówno na 490 nm, jak i 650 nm, i nastawionego tak, odejmował wartość tła przy 650 nm od odczytu przy 490 nm.

Postępowanie przy analizie ELISA dla mysiego anty-muFc było podobne, za wyjątkiem tego, że płytki pokrywano AffiniPure Goat anti-murine IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) w ilości 5 μg/ml w PBS i 100 μl/studzienkę; a przeciwciało drugorzędowe stanowiła peroksydaza chrzanowa (HRP) sprzężona z mysim anty-lgG, Fcy (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), rozcieńczona 1:5,000. Podobnie, w przypadku ELISA dla anty-caFc, płytki pokrywano AffiniPure Rabbit anti-dog IgG, specificzna dla fragmentu Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) w ilości 5 μg/ml w PBS i 100 μl/studzienkę; a przeciwciało drugorzędowe stanowiła peroksydaza chrzanowa (HRP) sprzężona z AffiniPure Rabbit anti-dog IgG, specyficzna dla fragmentu Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), rozcieńczona 1: 5,000.

PL 202 057 B1

P r z y k ł a d 4

Ekspresja białka fuzyjnego huFc-hu angiostatyna

Ludzką angiostatynę (sekwencja DNA pokazana jako SEQ ID NO: 10; sekwencja aminokwasowa pokazana jako SEQ ID NO: 11) poddawano ekspresji jako białko fuzyjne o składzie ludzki Fc-ludzka angiostatyna ( huFc -huAngio), jak opisano w przykładzie 1. Łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) wykorzystano do dostosowania cDNA kodującego angiostatynę (SEQ ID NO: 3) do przeprowadzenia ekspresji w wektorze pdCs-huFc lub pdCs-huFc(D4K). Odpowiednimi wiodącymi primerami były 5'-CC CCG GG T AAG AAA GTG TAT CTC TCA GAG (SEQ ID NO: 12; kodowane aminokwasy przedstawiono jako SEQ ID NO: 13) i 5' - C CCC AAG CTT AAA GTG TAT CTC TCA GAG (SEQ ID NO: 14; kodowane aminokwasy przedstawiono jako SEQ ID NO: 15), gdzie po miejscach cięcia Xmal lub Hindlll następowała sekwencja kodująca koniec N angiostatyny. Wstecznym primerem był 5' - CCC CTC GAG CTA CGC TTC TGT TCC TGA GCA (SEQ ID NO: 16), który zaprojektowano tak aby wprowadzić kodon stop (antykodon, CTA) bezpośrednio po końcu C angiostatyny, po kodonie stop występowało miejsce cięcia Xhol. Produkty PCR klonowano i sekwencjonowano, a uzyskany fragment Xmal-Xhol i fragment Hindlll-Xhol, kodujący angiostatynę, wprowadzono odpowiednio, do wektorów pdCs-huFc i pdCs-huFc (D4K). Do ekspresji huFc-huAngio i huFc(D4K)-huAngio wybierano stabilne klony NS/0 i oznaczano je, jak opisano w przykładach 2 i 3.

P r z y k ł a d 5

Ekspresja muFc-mu endostatyna

Mysia endostatyna (sekwencja DNA pokazana jako SEQ ID NO: 17; sekwencja aminokwasowa pokazana jako SEQ ID NO: 18) i mysi Fc (sekwencja DNA pokazana jako SEQ ID NO: 19; kodowane aminokwasy pokazane jako SEQ ID NO: 20) uzyskiwano w wyniku ekspresji białka fuzyjnego mysi Fc-mysia endostatyna (muFc-muEndo) w zasadzie tak, jak opisano w przykładzie 1. Użyto PCR, aby uzyskać ekspresję cDNA kodującego endostatynę (SEQ ID NO: 4) w wektorze pdCs-muFc(D4K). Primerem wiodącym był 5' - C CCC AAG CTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C (SEQ ID NO: 21; kodowane aminokwasy przedstawiono jako SEQ ID NO: 22), gdzie po miejscu cięcia Hindlll występowała sekwencja kodująca koniec N endostatyny. Primerem wstecznym był 5' - CCC CTC GAG CTA TTT GGA GAA AGA GGT C (SEQ ID NO: 23), który zaprojektowano tak, aby umieścić kodon stop (antykodon, CTA) bezpośrednio po końcu C endostatyny, przy czym po kodonie stop występowało miejsce cięcia Xhol. Produkty PCR klonowano i sekwencjonowano, a uzyskany fragment Xmal-Xhol, kodujący endostatynę, wprowadzano do wektora pdCs-muFc(D4K). Do ekspresji muFc(D4K)-muEndo wybierano stabilne klony NS/0, i oznaczano je, jak w przykładach 2 i 3.

P r z y k ł a d 6

Ekspresja muFc-mu angiostatyna

Mysia angiostatyna (sekwencja DNA pokazana jako SEQ ID NO: 24; sekwencja aminokwasowa pokazana jako SEQ ID NO: 25) była rozwijana do białka fuzyjnego mysi Fc-mysia angiostatyna (muFc-muAngio) w zasadzie tak, jak opisano w przykładzie 1. Użyto PCR, aby uzyskać odpowiednie cDNA kodujące angiostatynę (SEQ ID NO: 6) do ekspresji w wektorze pdCs-Fc(D4K). Primerem wiodącym był 5' - C CCC AAG CTT GTG TAT CTG TCA GAA TGT AAG CCC TCC TGT CTC TGA GCA (SEQ ID NO: 26; kodowane aminokwasy ujawnione jako SEQ ID NO: 27), gdzie po miejscu Hindlll występowała sekwencja kodująca koniec N angiostatyny. Primerem wstecznym był 5' - CCC CTC GAG CTA CCC TCC TGT CTC TGA GCA (SEQ ID NO: 28), który zaprojektowano tak, aby umieścić kodon stop (antykodon, CTA) bezpośrednio po końcu C endostatyny, przy czym po kodonie stop występowało miejsce cięcia Xhol (CTCGAG). Produkty PCR klonowano i sekwencjonowano, a uzyskany fragment Hindlll-Xhol, kodujący angiostatynę, dołączano do wektora pdCs-muFc(D4K). Do ekspresji muFc(D4K)-muAngio wybierano stabilne klony NS/0 i oznaczano je ( ELISA dla anty-muFc), jak opisano w przykładach 2 i 3.

P r z y k ł a d 7

Ekspresja psiego Fc (caFc)

Do przygotowania mRNA użyto monocytowych komórek krwi obwodowej (PBMCs) wyodrębnionych z krwi psa. Po syntezie pierwszego łańcucha cDNA przy użyciu wstecznej transkryptazy i oligo(dT), przeprowadzono reakcję amplifikacji techniką PCR psiego Fc [Kazuhiko i in., (1992) JP 1992040894-A1], stosując jako primer wiodący 5' - CC TTA AGC GAA AAT GGA AGA GTT CCT CGC (SEQ ID NO: 29; kodowane aminokwasy ujawnione jako SEQ ID NO: 30), w którym miejsce Aflll wprowadzono bezpośrednio „upstream” względem sekwencji kodującej obszar zawiasowy psiego Fc, a jako primer wsteczny 5' - C CTC GAG TCA TTT ACC CGG GGA ATG GGA GAG GGA TTT CTG (SEQ ID NO: 31), w którym miejsce Xhol wprowadzono po kodonie stop translacji (antykodon, TCA) psiego Fc. Primer

PL 202 057 B1 wsteczny wprowadził także bezobjawową mutację celem wytworzenia pozycji miejsca restrykcyjnego Xmal, które umożliwi utworzenie wektora pdCs-caFc(D4K) poprzez linker-adapter, i połączenie z konstruktami DNA kodującymi psią endostatynę lub angiostatynę. Podobnie jak uzyskano konstrukt pdCs-huFc, opisany szczegółowo przez Lo i in. [Lo i in., Protein Engineering (1998) 11: 495], wektor ekspresyjny pdCs-caFc uzyskano następująco. Fragment Aflll-Xhol, kodujący psi Fc, połączono z fragmentem Xbal-Aflll, kodującym peptyd sygnałowy lekkiego łańcucha i wektor pdCs cięty Xbal-Xhol. Otrzymany wektor ekspresyjny pdCs-caFc został następnie użyty do transfektowania komórek 293. Po 3 dniach od transfekcji supernatant oczyszczono chromatograficznie na zł o ż u z biał kiem A. Ekspresję psiego Fc (sekwencja DNA pokazana jako SEQ ID NO: 32; sekwencja aminokwasowa pokazana jako SEQ ID NO: 33) potwierdzono testem SDS-PAGE, a następnie techniką Western-blot przy użyciu peroksydazy sprzężonej z króliczą skierowaną przeciwko psiej-lgG, specyficzną dla fragmentu Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

P r z y k ł a d 8

Ekspresja caFc-ca endostatyna

Sekwencję kodującą psią endostatynę (sekwencja DNA pokazana jako SEQ ID NO: 34; sekwencja aminokwasowa pokazana jako SEQ ID NO: 35) dostosowano do fragmentu Hindlll-Xhol w celu ekspresji białka fuzyjnego Fc, zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 5. Na końcu 3', wprowadzano kodon stom, na przykład techniką PCR, bezpośrednio po kodonie kodującym resztę lizyny na końcu C, a nastę pnie prowadzono miejsce restrykcyjne Notl. Jednocześnie na końcu 5' znajdowało się również miejsce restrykcyjne Dralll, odpowiednie do uzyskania połączenia. Dokonano chemicznej syntezy dupleksu oligonukleotydowego, zawierającego lepkie końce Hindlll i Dralli, i użyto go do połączenia z fragmentem restrykcyjnym Dralll-Xhol, który obejmuje cDNA kodującego pozostałą część psiej endostatyny. Użyty dupleks pokazano poniżej:

Hindlll

5' - AGCTT CAC ACC CAC CAG GAC TTC GAG CCG GTG CTG CAC CTG (SEQ ID NO: 36)

A GTG TGG GTG GTC CTG AAG GTC GGC CAC GAC GTG - 5' (SEQ ID NO: 38)

Dralll

Pierwszy CAC w dupleksie koduje resztę histydyny końca N psiej endostatyny. Fragment Hindlll-Xhol kodujący psią endostatynę pełnej długości może być zatem włączony do wektora pdCs-caFc ciętego Hindlll-Xhol (patrz przykład 7) celem ekspresji. Wybrano stabilne klony NS/0 prowadzące ekspresję caFc-caEndo i oznaczono testem ELISA z anty-caFc, jak opisano w przykładach 2 i 3. Produkt białkowy analizowano testem SDS-PAGE i potwierdzano techniką Western-blot.

P r z y k ł a d 9

Ekspresja białka fuzyjnego caFc-ca angiostatyna cDNA kodujący psią angiostatynę pełnej długości (sekwencja DNA pokazana jako SEQ ID

NO: 39; sekwencja aminokwasowa pokazana jako SEQ ID NO: 40) dostosowano tak, aby uzyskać ekspresję białka fuzyjnego caFc, w zasadzie tak, jak opisano w powyższych przykładach. Skrótowo, na końcu 3', wprowadzono kodon stop, na przykład techniką PCR, bezpośrednio po kodonie kodującym resztę lizyny na końcu C, a następnie umieszczono miejsce restrykcyjne Notl zamiast miejsca Xhol, ponieważ wewnętrzne miejsce restrykcyjne Xhol znajdowało się w obrębie cDNA kodującego psią angiostatynę. Na końcu 5', wprowadzono miejsce Hindlll w ramce odczytu, bezpośrednio „upstream” względem końca N angiostatyny. Następnie, aby uzyskać ekspresję, fragment Hindlll-Notl kodujący psią angiostatynę pełnej długości włączono do wektora pdCs-caFc ciętego Hindlll-Notl (gdzie miejsce Notl wprowadzono w miejsce Xhol przez ligację z linkerem). Stabilne klony NS/0 prowadzące ekspresję caFc-caAngio wybrano i oznaczono testem ELISA z anty-caFc, jak opisano w przykładach 2 i 3. Produkt białkowy analizowano SDS-PAGE i potwierdzano techniką Western-biot.

P r z y k ł a d 10

Ekspresja muFc-K1 z muAngio

Angiostatyna zawiera pierwsze cztery z pięciu domen kringle plazminogenu. Aby ustalić, czy jedna lub kilka z tych domen jest odpowiedzialna za obserwowaną aktywność hamowania angiogenezy przez angiostatynę, uzyskuje się pojedyncze domeny Kringle lub ich kombinacje. W celu pokazania użyteczności Fc jako składnika białka fuzyjnego, przeprowadzono ekspresję pierwszej domeny kringle mysiej angiostatyny (K1) w następujący sposób. Pierwsza domena kringle kończy się Glu-87 mysiej angiostatyny (SEQ ID NO: 25). W tej pozycji w cDNA znajduje się korzystne miejsce restrykcyjne Nsil tak, że po cięciu enzymem Nsil, czterozasadowy fragment 3' jest usunięty przez polimerazę T4 i powstaje tępy koniec. Wprowadzono kodon stop translacji bezpośrednio „downstream” względem GAA

PL 202 057 B1 kodującego Glu-87 przez ligację z palindromowym linkerem TGA CTC GAG TCA (SEQ ID NO: 41), gdzie po kodonie stop, TGA, występuje miejsce Xhol. Aby uzyskać ekspresję, fragment Hindlll-Xhol kodujący tę skróconą angiostatynę, tj. tylko pierwszą domenę kringle, został następnie włączony do wektora pdCs-muFc(D4K). Uzyskano wysokie wydajności zarówno czasowej, jak i stałej ekspresji, co potwierdzono analizami ELISA z anty-muFc i analizą SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 11

Ekspresja muFc-wewnętrzna K1 z muAngio

Domena kringle składa się z wielu pętli, w tym wewnętrznej i zewnętrznej. W pierwszej domenie Kringle mysiej angiostatyny, pętlę wewnętrzną wyznaczają Cys 55 i Cys 79, które tworzą wiązanie disiarczkowe u podstawy pętli. Cys-67 z wewnętrznej pętli tworzy inne wiązanie disiarczkowe z resztą cysteinową zewnętrznej pętli, formując strukturę kringle. Aby sprawdzić, czy pętla wewnętrzna wykazuje aktywność przeciwko tworzeniu naczyń przeprowadzono ekspresję fragmentu kodującego pętlę wewnętrzną jako muFc-wewnętrzny K1 (kringle 1) w następujący sposób. Biorąc fragment DNA kodujący pierwszą domenę kringle jako matrycę, użyto mutagennego primera mającego sekwencję 5' GGG CCT TGG AGC TAC ACT ACA (SEQ ID NO: 42; kodowane aminokwasy ujawnione jako SEQ ID NO: 43) aby przeprowadzić mutagenezę TGC (Cys-67) w AGC (Ser) techniką PCR. Dzięki temu uzyskuje się pewność, że Cys-67 nie utworzy wiązania disiarczkowego w czasie ekspresji wewnętrznej pętli kringle 1, bez zewnętrznej pętli. Do wprowadzenia pozycji Hindlll do ramki bezpośrednio 5' względem kodonu kodującego Ser-43 (AGT) użyto primera „upstream” mającego sekwencję 5' GCGGATCCAAGCTT AGT ACA CAT CCC AAT GAG GG (SEQ ID NO: 44; kodowane aminokwasy ujawniono jako SEQ ID NO: 45). Miejsce BamHI także wprowadzono „upstream” bezpośrednio za pozycją Hindlll. Miejsce BamHI jest użyteczne przy ligacji z miejscem BamHI na końcu elastycznego linkera Gly-Ser pokazanego w poniższym przykładzie 12. W ten sposób fragment Hindlll-Xhol DNA kodującego Ser-43 do Glu-87 mysiej angiostatyny został włączony do wektora ekspresyjnego pdCs-muFc(D4K). Zarówno w przypadku czasowej, jak i stałej ekspresji uzyskano wysokie wydajności, co potwierdzono analizą ELISA z anty-muFc i w żelu SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 12

Ekspresja muFc-muEndo-linker GlySer-wewnętrzna K1 z muAngio

Hybrydowa cząsteczka muFc-muEndo-wewnętrzna K1 zawiera muFc-muEndo połączone polipeptydowym linkerem, zawierającym reszty glicyny i seryny, do wewnętrznej pętli pierwszej domeny kringle mysiej angiostatyny. Konstrukt DNA uzyskano następująco.

Na końcu 3' cDNA kodującego mysią endostatynę znajduje się miejsce BspHI. Aby wprowadzić elastyczny linker złożony z reszt glicyny i seryny na koniec C mysiej endostatyny, fragment Hindlll-BspHI wielkości 540 par zasad, kodujący endostatynę, włączono do nakładającego się dupleksu oligonukleotydowego, utworzonego przez oligonukleotydy przedstawione jako SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 48. Linker aminokwasowy kodowany przez SEQ ID NO: 46 przedstawiono jako SEQ ID NO: 47.

Fragment Hindlll-BspHI kodujący mysią endostatynę i kodujący linker Gly-Ser wklonowano w standartowy wektor ekspresyjny. Miejsce BamHI użyto następnie do wprowadzenia fragmentu BamHI-Xhol kodującego wewnętrzną pętlę K1 z przykładu 11. Uzyskany fragment Hindll-Xhol, kodujący połączenie muEndo-linker GlySer-wewnętrzna K1, włączono do wektora ekspresyjnego pdCs-muFc(D4K). Zarówno w przypadku czasowej, jak i stałej ekspresji białka fuzyjnego muFc-muEndo-linker GlySer-wewnętrzny K1, uzyskano wysokie wydajności, co potwierdzono analizą ELISA z anty-muFc i w żelu SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 13

Ekspresja muFc-muEndo-linker GlySer-K1 z muAngio

Hybrydowa cząsteczka muFc-muEndo-K1 zawierająca muFc-muEndo połączone linkerem polipeptydowym, zawierającym reszty glicyny i seryny, z pierwszą domeną kringle mysiej angiostatyny. Konstrukt DNA uzyskano następująco.

Koniec BamHI fragmentu Hindlll-BamHI kodującego muEndo-linker GlySer (przykład 12) dołączono do fragmentu Hindlll-Xhol kodującego domenę kringle 1 mysiej angiostatyny (przykład 10) poprzez następujący adapter:

BamHI

5' GA TCC TCA GGC C (SEQ ID NO: 49)

G AGT CCG GTCGA (SEQ ID NO: 50)

Hindlll

Adapter ma lepki koniec Hindlll', który po ligacji, nie odtwarza miejsca Hindlll. Uzyskany w ten sposób fragment Hindlll-Xhol, który koduje muEndo-linker GlySer-kringle 1, włączono do wektora eks16

PL 202 057 B1 presyjnego pdCs-muFc(D4K). Zarówno w przypadku czasowej, jak i stałej ekspresji muFc-muEndo-linker GlySer-K1 uzyskano wysokie wydajności, potwierdzone analizami ELISA dla anty-muFc i w żelu

SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 14

Ekspresja muFc-muEndo-linker GlySer-muAngio

Hybrydowa cząsteczka muFc-muEndo-linker GlySer-muAngio zawiera muFc-muEndo połączone linkerem polipeptydowym, zawierającym reszty glicyny i seryny z mysią angiostatyny. Konstrukt DNA uzyskano następująco. Koniec BamHI z fragmentu Hindlll-Bam HI kodującego muEndo-linker GlySer (przykład 12) dołączono do fragmentu Hindlll-Xhol kodującego mysią angiostatynę przez adapter opisany w przykładzie 13. Uzyskany fragment Hindlll-Xhol, który koduje muEndo-linker GlySer-muAngio, dołączono do wektora ekspresyjnego pdCs-muFc(D4K). Zarówno dla przejściowej, jak i stabilnej ekspresji połączenia muFc-muEndo-linker GlySer-muAngio uzyskano wysokie wydajności, potwierdzone analizami ELISA dla anty-muFc i SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 15

Ekspresja huAngio-huFc-HuEndo

Hybrydowa cząsteczka huAngio-huFc-HuEndo zawiera ludzką angiostatynę połączoną wiązaniem peptydowym z huFc-huEndo. Konstrukt DNA uzyskano następująco. Najpierw wytworzono, techniką PCR, fragment Hindlll-Xhol, który koduje ludzką angiostatynę, bez kodonu stop tak, że kodon kodujący ostatnią resztę aminokwasową angiostatyny następował bezpośrednio przed miejscem Xhol, CTCGAG. Znajdujący się na końcu 5' miejsce HindHI ligowo z fragmentem Xbal-Aflll kodującym peptyd sygnałowy lekkiego łańcucha [Lo i in., Protein Engineering (1998) 11:495] poprzez adapter Afll-HindHIII':

Aflll

5' TTA AGC GGC C (SEQ ID NO: 51)

CG CGG GTCGA (SEQ ID NO: 52)

Hindlll'

Lepki koniec Hindlll' adaptera, po dołączeniu, nie odtwarza miejsca Hindlll. Na końcu 3' miejsce Xhol ligowano z miejscem Aflll fragmentu Aflll-Xhol kodującego huFc-huEndo przez następujący adapter Xhol'-Aflll:

Xhol'

5' TC GAC TCC GGC (SEQ ID NO: 53)

G AGG CCG AATT (SEQ ID NO: 54)

Aflll

Lepki koniec Xhol' adaptera, po ligacji, nie odtwarza miejsca Xhol. Uzyskany fragment Xbal-Xhol kodujący peptyd sygnałowy-ludzka angiostatyna-huFc-ludzka endostatyna wklonowano do wektora ekspresyjnego pdCs. Zarówno w przypadku czasowej, jak i stałej ekspresji uzyskano wysokie wydajności, potwierdzone techniką ELISA z anty-muFc i w żelu SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 16

Farmakokinetyka

W jednym z zestawów badań farmakokinetycznych myszom C57/BL6 z implantowanymi nowotworami płuc Lewisa o objętości 100-200 mm³ wstrzykiwano do żyły ogonowej po 720 μg huFc-huAngio. Wielkość guza i dawki huFc-huAngio do tego badania dobrano tak, aby odtworzyć rzeczywisty przebieg kuracji opisany przez O'Reilly [O'Reilly i in., (1996) Nature Medicine 2: 689]. Krew pobierano pozaoczodołowo po 1/2, 1, 2, 4, 8, 24 i 48 godzinach po wstrzyknięciu. (Próbki krwi analizowano, techniką ELISA z anty-huFc, a następnie techniką Western-blot. Stwierdzono, że półokres trwania w krążeniu HuFc-huAngio wynosi około 32 godzin u myszy, a według analizy Western ustalono, że ponad 90% huFc-huAngio pozostaje w obiegu jako cząsteczka nienaruszona.

Badania farmakokinetyczne powtórzono na myszach szwajcarskich bez nowotworów przy dawce 200 μg/mysz. W tym przypadku półokres trwania w układzie krążenia wyniósł około 33 godziny.

Równoważniki

Można utworzyć inne specyficzne postacie, nie naruszając idei i podstawowych cech wynalazku.

Zakres wynalazku jest wskazany przez załączone zastrzeżenia niż przez powyższy opis, a wszelkie zmiany poczynione w obszarze zastrzeżeń i ich równoważników będą zatem uważane za wchodzące w zakres wynalazku.

PL 202 057 B1

Opisy sekwencji <110> Lo, Kin-Ming Li, Yue

Gillies, Stephen D <12O> Ekspresja i eksport inhibitorów angiogenezy jako immunofuzyn <13O> LEX-006PC <140>

<141>

<150> US 60/097,883 <151> 1998-08-25 <160> 54 <170> Patentln Ver, 2.0 <210> 1 <211> 696 <212> DNA <£13> Komo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(696) <22 3> fragment FC ludzkiej immunoglobuliny gamma <400> i

gag Glu 1

CCC Pro

aaa Lys

tet Ser

tet Ser 5

gac Asp

aaa Lys

act Thr

cac His

a ca Thr 10

tgc Cys

cca Pro

ccg Pro

tgc Cys

cca Pro 15

gca Ala

48

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

96

Pro

Glu

Leu

Leu 20

Gly

Gly

Pro

Ser

Val 25

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 30

Lys

Pro

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

gtg

144

Lys

Asp

Thr 35

Leu

Met

Ile

Ser

Arg 40

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 45

Cys

Val

Val

gtg

gac

g^g

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

192

Val

Asp 50

Val

Ser

His

Glu

Asp 55

Pro

Glu

Val

Lys

Phe 60

Asn

Trp

Tyr

Vai

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gee

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

gag

cag

240

Asp 65

Gly

Val

Glu

Val

His 70

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 75

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 80

tac

aac

age

a cg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

288

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 85

Arg

Val

Val

Ser

Val 90

Leu

Thr

Val

Leu

His 95

Gin

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aaa

gee

336

Asp

Trp

Leu

Asn 100

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 105

Cys

Lys

vai

Ser

Asn 110

Lys

Ala

etc

cca

gee

CCC

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gee

aaa

ggg

cag

ccc

384

PL 202 057 B1

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro lis 120 125 ' ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tca cgg gag gag atg acc 4 32Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 13S 140 aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc 480

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160 gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 528

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr

165 .170 175 aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc etc tat 57 6

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

agc Ser

aag Lys

ctc acc gtg

gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac

gtc Val

ttc Phe

624

Leu 195

Thr Val

Asp

Lys

Ser Arg 200

Trp

Gin

Gin

Gly 205

Asn

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

672

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 696

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 ' <210> 2 <21I> 232 , <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys pro Pro Cy© Pro Ala 15 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys The Lys Pro Arg Glu Glu Gin

70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin

90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110

PL 202 057 B1

Leu Pro Ala

Pro

Ile

Glu Lys Thr 120

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 125

Gly

Gin

Pro

115

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

130

135

140

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

165

170

175

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

225 230 <210> 3 <211> 549 <212> DNA <213> Homo sapiens <220 <221> CDS <222> (1) . .(549) <223> endostatyna <400> 3

cac

agc

cac

cgc

gac

ttc

cag

ccg

gtg

ctc

cac ctg

gtt

gcg

ctc

aac

48

His

Ser

His

Arg

Asp

Phe

Gin

Pro

Val

Leu

His Leu

Val

Ala

Leu

Asn

1

5

10

15

gc

ccc

ctg

tca

ggc

ggc

atg

cgg

ggc

atc

cgc ggg

gcc

gac

ttc

cag

96

Ser

Pro

Leu

Ser

Gly

Gly

Met

Arg

Gly

Ile

Arg Gly

Ala

Asp

Phe

Gin

20

25

30

tgc

ttc

cag

cag

gcg

cgg

gcc

gtg

ggg

ctg

gcg ggc

a cc

ttc

cgc

gcc

144

cys

Phe

Gin

Gin

Ala

Arg

Ala

val

Gly

Leu

Ala Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

ttc

ctg

tcc

tcg

cgc

ctg

cag

gac

ctg

tac

agc atc

gtg

cgc

cgt

gcc

192

Phe

Leu

Ser

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser Ile

VaL

Arg

Arg

Ala

50

55

60

gac

cgc

gca

gcc

gtg

CCC

atc

gtc

aac

ctc

aag gac

gag

ctg

ctg

ttt

240

Asp

Arg

Ala

Ala

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys Asp

Glu

_ Leu

Leu

Phe

65

70

75

80

ccc

agc

tgg

gag

gct

ctg

ttc

tca

ggc

tct

gag ggt

ccg

ctg

aag

ccc

288

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu Gly

Pro

Leu

Lys

Pro

85

90

95

PL 202 057 B1

ggg gca

cgc atc Arg Ile 100

ttc Phe

tcc ttt

gac Asp

ggc aag gac gtc ctg agg cac

ccc Pro

336

Gly

Ala

Ser

Phe

Gly Lys 105

Asp

Vał

Leu

Arg 110

His

acc

tgg

ccc

cag

aag

agc

gtg

tgg

cat

ggc

tcg

gac

ccc

aac

ggg

cgc

384

Thr

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Asn

Gly

Arg

115

120

125

agg

ctg

acc

gag

agc

tac

tgt

gag

acg

tgg

cgg

acg

gag

gct

ccc

tcg

432

Arg

Leu

Thr

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Ala

Pro

Ser

130

135

140

gcc

acg

ggc

cag

gcc

tcc

tcg

ctg

ctg

ggg

ggc

agg

ctc

ctg

ggg

cag

480

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gly

Arg

Leu

Leu

Gly

Gin

145

150

155

160

agt

gcc

gcg

agc

tgc

cat

cac

gcc

tac

atc

gtg

ctc

tgc

att

gag

aac

528

Ser

Ala

Ala

Ser

Cys

His

His

Ala

Tyr

Ile

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

ago

ttc

atg

act

gcc

tcc

aag

549

Ser

Phe

Met

Thr

Ala

Ser

Lys

180 <210> 4 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

His 1

Ser

His

Arg

Asp 5

Phe

Gin

Pro

Val

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

Leu 15

Asn

Ser

Pro

Leu

Ser 20

Gly

Gly

Met

Arg

Gly 25

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp 30

Phe

Gin

Cys

Phe

Gin 35

Gin

Ala

Arg

Ala

Val 40

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr 45

Phe

Arg

Ala

Phe

Leu 50

Ser

Ser

Arg

Leu

Gin 55

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile 60

Val

Arg

Arg

Ala

Asp

Arg

Ala

Ala

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Leu

Phe

70 75 80

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala 85

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser 90

Glu

Gly

Pro

Leu

Lys 95

Pro

Gly

Ala

Arg

Ile 100

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly 105

Lys

Asp

Val

Leu

Arg 110

His

Pro

Thr

Trp

Pro 115

Gin

Lys

Ser

Val

Trp 120

His

Gly

Ser

Asp

Pro 125

Asn

Gly

Arg

Arg

Leu 130

Thr

Glu

Ser

Tyr

Cys 135

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr 140

Glu

Ala

Pro

Ser

PL 202 057 B1

Ala 145

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser 150

Ser

Leu

Leu

Gly

Gly Arg 155

Leu

Leu

Gly

Gin 160

Ser

Ala

Ala

Ser

Cys 165

His

His

Ala

Tyr

Ile 170

Val Leu

Cys

Ile

Glu 175

Asn

Ser

Phe

Met

Thr 180

Ala

Ser

Lys

<210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Q_pjs sei^enęjj sztucznej: Primer wiodący dla ludzkiej Fc - Endo <220>

<221> CDS <222> (3)..(29) <400> 5 cc ccg ggt aaa cac agc cac cgc gac ttc c 30

Pro Gly Lys His Ser His Arg Asp Phe

5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna <400> 6

Pro Gly Lys His Ser His Arg Asp Phe 1 5 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

^<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer wiodący dla ludzkiej Fc - Endo <220>

<221> CDS <222> (2) . . (25) <400> 7 c aag ctt cac agc cac cgc gac ttc c 26

Lys Leu His Ser His Arg Asp Phe

5 <210> 8

PL 202 057 B1 <211> 8 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 8

Lys Leu His Ser His Arg Asp Phe 1 5 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer wsteczny dla ludzkiej Fc - Endo <400> 9 cctcgagcta cttggaggca gtcatg 26 <210> 10 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1) .. (1089) <223> Angiostatyna <400> 10

aaa Lys 1

gtg Val

tat Tyr

ctc Leu

tca Ser 5

gag tgc Glu Cys

aag Lys

act Thr

ggg Gly 10

aat Asn

gga Gly

aag Lys

aac Asn

tac Tyr 15

aga Arg

48

ggg

a cg

atg

tcc

aaa

aca

aaa

aat

ggc

atc

acc

tgt

caa

aaa

tgg

agt

96

Gly

Thr

Met

Ser

Lys

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

20

25

30

tcc

act

tct

ccc

cac

aga

cct

aga

ttc

tca

cct

gct

aca

cac

ccc

tca

144

Ser

Thr

Ser

Pro

His

Arg

Pro

Arg

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

Ser

35

40

45

gag

gga

ctg

gag

gag

aac

tac

tgc

agg

aat

cca

gac

aac

gat

ccg

cag

192

Glu

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Pro

Gin

50

55

60

ggg

ccc

tgg

tgc

tat

act

act

gat

cca

gaa

aag

aga

tat

gac

tac

tgc

240

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

65

70

75

80

gac

att

ctt

gag

tgt

gaa

gag

gaa

tgt

atg

cat

tgc

agt

gga

gaa

aac

283

Asp

Ile

Leu

Glu

Cys

Glu

Glu

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

90 95 tat gac ggc aaa att tcc aag acc atg tct gga ctg gaa tgc cag gcc 336

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gin Ala

PL 202 057 B1

100

105

110

tgg

gac

tet

cag

age

cca

cac

get

cat

gga

tac

att

cct

tcc

aaa

ttt

384

Trp

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

115

120

125

cca

aac

aag

aac

ctg

aag

aag

aat

tac

tgt

cgt

aac

ccc

gat

agg

gag

432

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Lys

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Arg

Glu

130

135

140

ctg

cgg

cct

tgg

tgt

ttc

acc

acc

gac

ccc

aac

aag

ege

tgg

gaa

ctt

480

Leu

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu

145

150

155

160

tgc

gac

atc

ccc

ege

tgc

aca

aca

cct

cca

cca

tet

tet

ggt

ccc

acc

52Θ

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

Pro

Thr

165

no

175

tac

cag

tgt

ctg

aag

gga

aca

ggt

gaa

aac

tat

ege

ggg

aat

gtg

get

576

Tyr

Gin

Cys

leu

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn

Val

Ala

180

185

190

gtt

acc

gtt

tcc

ggg

cac

acc

tgt

cag

cac

tgg

agt

gca

cag

acc

cct

624

Val

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

195

200

205

cac

aca

cat

aac

agg

aca

cca

gaa

aac

ttc

ccc

tgc

aaa

aat

ttg

gat

672

His

Thr

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

210

215

220

gaa

aac

tac

tgc

ege

aat

cct

gac

gga

aaa

agg

gee

cca

tgg

tgc

cat

720

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Lys

Arg

Ala

Pro

Trp

Cys

His

225

230

235

240

aca

acc

aac

age

caa

gtg

cgg

tgg

gag

tac

tgt

aag

ata

ccg

tcc

tgt

768

Thr

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

245

250

255

gac

tcc

tcc

cca

gta

tcc

a cg

gaa

caa

ttg

get

ccc

aca

gca

cca

cct

816

Asp

Ser

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro

Pro

260

265

270

gag

eta

acc

cct

gtg

gtc

cag

gac

tgc

tac

cat

ggt

gat

gga

cag

age

864

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Asp

Cys

Tyr

His

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

275

280

285

tac

ega

ggc

aca

tcc

tcc

acc

acc

acc

aca

gga

aag

aag

tgt

cag

tet

912

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Thr

Thr

Gly

Lys

Lys

Cys

Gin

Ser

290

295

300

tgg

tea

tet

atg

aca

cca

cac

cgg

cac

cag

aag

acc

cca

gaa

aac

: tac

960

Trp

Ser

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Gin

i Lys

Thr

Pro

1 Glu

i Asr

i Tyr

305

310

315

320

cca

aat

get

ggc

. ctg

aca

atg

aac

: tac

tgc

: agę

1 aat

: ces

i gat

; gee gat

1008

Pro

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

i Tyr

Cys

; Arg Asn Pro Asp Ala Asp

325

330

335

aaa

ggc

: ccc

tgg

i tgt

ttt

acc

aca

i gac ccc age gtc agg tgg gag tac

1056

PL 202 057 B1

Lys Gly Pro Trp Cys

Phe

Thr Thr

Asp 345

Pro

Ser Val Arg Trp Glu Tyr 350

340

tgc

aac

ctg

aaa

aaa

tgc

tea

gga

aca

gaa

gcg

1089

Cys

Asn

Leu

Lys

Lys

Cys

Ser

Gly

Thr

Glu

Ala

355

360

<21O> 11 <211> 363 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 .

Lvs Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

5 10 15

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gin Lys Trp Ser

25 30

Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 35 40 Ί5

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gin 50 55 60

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

65

70

75

80

Asp

Ile

Leu

Glu

Cys 85

Glu

Glu

Glu

Cys

Met 90

His

Cys

Ser

Gly

Glu 95

Asn

Tyr

Asp

Gly

Lys 100

Ile

Ser

Lys

Thr

Met 105

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys 110

Gin

Ala

Trp

Asp

Ser 115

Gin

Ser

Pro

His

Ala 120

His

Gly

Tyr

Ile

Pro 125

Ser

Lys

Phe

Pro

Asn 130

Lys

Asn

Leu

Lys

Lys 135

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn 140

Ero

Asp

Arg

Glu

Leu 145

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe 150

Thr

Thr

Asp

Pro

Asn 155

LyS

Arg

Trp

Glu

Leu 160

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg 165

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro 170

Pro

Ser

Ser

Gly

Pro 175

Thr

Tyr

Gin

Cys

Leu 180

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu 185

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn 190

Val

Ala

Val

Thr

Val 195

Ser

Gly

His

Thr

Cys 200

Gin

His

Trp

Ser

Ala 205

Gin

Thr

Pro

His

Thr 210

His

Asn

Arg

Thr

Pro 215

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys 220

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu 225

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn 230

Pro

Asp

Gly

Lys

Arg 235

Ala

Pro

Trp

Cys

His 240

PL 202 057 B1

Thr Thr Asn Ser Gin Val Arg Trp Glu Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser 255

Cys

245

250

Asp

Ser

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro

Pro

260

265

270

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Asp

Cys

Tyr

His

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

275

280

285

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Thr

Thr

Gly

Lys

Lys

Cys

Gin

Ser

290

295

300

Trp

Ser

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Gin

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Tyr

305

310

315

320

Pro

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp

325

330

335

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

34 0

345

350

Cys

Asn

Leu

Lys

Lys

Cys

Ser

Gly

Thr

Glu

Ala

355

360

<210> 12 <211> 29 <212> DNA < 213 > Sekwencja sztuczna <220>

<2 23 > Opis sekwencji sztucznej: Primer wiodący dla ludzkiej Fc - Angio <220>

<221> CDS <222> (3)..(29) <400> 12 cc ccg ggt aag aaa gtg tat ctc tca gag 29

Pro Gly Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu

5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna ^: <400> 13

Pro Gly Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu 1 5 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <2i3> Sekwencja sztuczna

PL 202 057 B1

<220>
<223>	Opis sekwencji sztucznej: Primer wiodący dla ludzkiej Fc - Angio
<220>
<221>	CDS
<222>	(2) ·	. . (28)
<400>	14
c ccc	aag	ctt aaa gtg tat ctc tca gag	28
Pro	Lys	Leu Lys Val Tyr Leu Ser Glu
1		5

<210>	15
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<400>	15

Pro Lys Leu Lys Val Tyr Leu Ser Glu 1 5 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Opis sekwencji sztucznej: Primer wsteczny dla ludzkiej Fc - Angio <400> 16 cccctcgagc tacgcttctg ttcctgagca 30 <210> 17 <211> 552 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> Cl) .. (552) <223> Endostatyna <400> 17

cat His 1

act Thr

cat His

cag gac ttt

cag Gin

cca Pro

gtg Val

ctc Leu 10

cac His

ctg gtg Leu Val

gca Ala

ctg aac

48

Gin Asp 5

Phe

Leu 15

Asn

acc

ccc

ctg

tct

gga

ggc

atg

cgt

ggt

atc

cgt

gga

gca

gat

ttc

cag

96

Thr

Pro

Leu

Ser

Gly

Gly

Met

Arg

Gly

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp

Phe

Gin

20

25

30

tgc

ttc

cag

ca a

gcc

ega

gcc

gtg

ggg

ctg

tcg

ggc

acc

ttc

cgg

gct

144

Cys

Phe

Gin

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

Gly

Leu

Ser

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

40 45

PL 202 057 B1

ttc Phe

ctg Leu 50

tcc Ser

tet Ser

agg ctg Arg Leu

cag Gin 55

gat etc

tat Tyr

age Ser

atc Ile 60

gtg val

ege Arg

cgt Arg

get Ala

192

Asp

Leu

gac

cgg

ggg

tet

gtg ccc

atc

gtc

aac

ctg

aag

gac

gag

gtg

eta

tet

240

Asp

Arg

Gly

Ser

Val Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Val

Leu

Ser

65

70

75

BO

ccc

age

tgg

gac

tcc ctg

ttt

tet

ggc

tcc

cag

ggt

caa

gtg

caa

ccc

288

Pro

Ser

Trp

Asp

Ser Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Gin

Gly

Gin

Val

Gin

Pro

85

90

95

ggg

gee

ege

atc

ttt tet

ttt

gac

ggc

aga

gat

gtc

ctg

aga

cac

cca

336

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe Ser

Phe

Asp

Gly

Arg

Asp

Val

Leu

Arg

His

Pro

100

105

110

gcc

tgg

ccg

cag

aag ago

gta

tgg

cac

ggc

teg

gac

ccc

agt

ggg

cgg

364

Ala

Trp

Pro

Gin

Lys Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Ser

Giy

Arg

115

120

125

agg

ctg

atg

gag

agt tac

tgt

gag

aca

tgg

ega

act

gaa

act

act

ggg

432

Arg

Leu

Met

Glu

Ser Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Thr

Thr

Gly

130

135

140

get

aca

ggt

cag

gee tcc

tcc

ctg

ctg

tea

ggc

agg

etc

ctg

gaa

cag

480

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala Ser

Ser

Leu

Leu

Ser

Gly

Arg

Leu

Leu

Glu

Gin

145

150

155

160

aaa

get

gcg

age

tgc cac

aac

age

tac

atc

gtc

ctg

tgc

att

gag

aat

528

Lys

Ala

Ala

Ser

Cys His

Asn

Ser

Tyr

Ile

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

age

ttc

atg

acc

tet ttc

tcc

aaa

552

Ser

Phe

Met

Thr

Ser Phe

Ser

Lys

180 <210> 18 <211> 184 <212> PRT <213> Mus musculus <4ΟΟ> 18

His 1

Thr

His

Gin

Asp 5

Phe

Gin

Pro

Val

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

Leu 15

Asn

Thr

Pro

Leu

Ser 20

Gly

Gly

Met

Arg

Gly 25

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp 30

Phe

Gin

Cys

Phe

Gin 35

Gin

Ala

Arg

Ala

Val 40

Gly

Leu

Ser

Gly

Thr 45

Phe

Arg

Ala

Phe

Leu 50

Ser

Ser

Arg

Leu

Gin 55

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile 60

Val

Arg

Arg

Ala

Asp

Arg

Gly

Ser

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Val

Leu

Ser

70 75 80

PL 202 057 B1

Pro

Ser

Trp

Asp

Ser 85

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser 90

Gin

Gly

Gin

Val

Gin 95

Pro

Gly

Ala

Arg

Ile 100

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly 105

Arg

Asp

Val

Leu

Arg 110

His

Pro

Ala

Trp

Pro 115

Gin

Lys

Ser

Val

Trp 120

His

Gly

Ser

Asp

Pro 125

Ser

Gly

Arg

Arg

Leu 130

Met

Glu

Ser

Tyr

Cys 135

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr 140

Glu

Thr

Thr

Gly

Ala 145

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser 150

Ser

Leu

Leu

Ser

Gly 155

Arg

Leu

Leu

Glu

Gin 160

Lys

Ala

Ala

Ser

Cys 165

His

Asn

Ser

Tyr

Ile 170

Val

Leu

Cys

Ile

Glu 175

Asn

Ser

Phe

Met

Thr 180

Ser

Phe

Ser

Lys

<210> 19 <211> 699 <212> DNA

<213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1J.(699) <223> Fc <400> 19

gag Glu 1

ccc Pro

aga Arg

ggg Gly

ccc Pro 5

aca Thr

atc Ile

aag Lys

ccc Pro

tgt Cys 10

cct Pro

cca Pro

tgc Cys

aaa Lys

tgc Cys 15

cca Pro

48

gca Ala

cct Pro

aac Asn

ctc Leu 20

ttg Leu

ggt Gly

gga Gly

cca Pro

tcc Ser 25

gtc Val

ttc Phe

atc Ile

ttc Phe

cct Pro 30

cca Pro

aag Lys

96

atc Ile

aag Lys

gat Asp 35

gta Val

ctc Leu

atg Met

atc Ile

tcc Ser 40

ctg Leu

agc Ser

ccc Pro

ata Ile

gtc Val 45

aca Thr

tgt Cys

gtg Val

144

gtg Val

gtg Val 50

gat Asp

gtg Val

agc Ser

gag Glu

gat Asp 55

gac Asp

cca Pro

gat Asp

gtc Val

cag Gin 60

atc Ile

agc Ser

tgg Trp

ttt Phe

192

gtg Val 65

aac Asn

aac Asn

gtg Val

gaa Glu

gta Val 70

cac His

aca Thr

gct Ala

cag Gin

aca Thr 75

ca a Gin

acc Thr

cat His

aga Arg

gag Glu 80

240

gat Asp

tac Tyr

aac Asn

agt Ser

act Thr 85

ctc Leu

cgg Arg

gtg Val

gtc Val

agt Ser 90

gcc Ala

ctc Leu

ccc Pro

atc Ile

cag Gin 95

cac His

288

cag Gin

gac Asp

tgg Trp

atg Met

agt Ser

ggc Gly

aag Lys

gag Glu

ttc Phe

aaa Lys

tgc Cys

aag Lys

gtc Val

aac Asn

aac Asn

aaa Lys

336

PL 202 057 B1

100

105

110

gac

etc

cca

gcg

ccc

atc

gag

aga

acc

atc

tea

aaa

ccc

aaa

ggg

tea

384

Asp

Leu

Pro 115

Ala

Pro

Ile

Glu

Arg 120

Thr

Ile

Ser

Lys

Pro 125

Lys

Gly

Ser

gta

aga

get

cca

cag

gta

tat

gtc

ttg

cct

cca

cca

gaa

gaa

gag

atg

4 32

Val

Arg 130

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr 135

Val

Leu

Pro

Pro

Pro 140

Glu

Glu

Glu

Met

act

aag

aaa

cag

gtc

act

ctg

acc

tgc

atg

gtc

aca

gac

ttc

atg

cct

4 80

Thr 145

Lys

Lys

Gin

Val

Thr 150

Leu

Thr

Cys

Met

Val 155

Thr

Asp

Phe

Met

Pro 160

gaa

gac

att

tac

gtg

gag

tgg

acc

aac

aac

ggg

aaa

aca

gag

eta

aac

528

Glu

Asp

Ile

Tyr

Val 165

Glu

Trp

Thr

Asn

Asn 170

Gly

Lys

Thr

Glu

Leu 175

Asn

tac

aag

aac

act

gaa

cca

gtc

ctg

gac

tet

gat

ggt

tet

tac

ttc

atg

576

Tyr

Lys

Asn

Thr 160

Glu

Pro

Val

Leu

Asp 185

Ser

Asp

Gly

Ser

Tyr 190

Phe

Met

tac

agc

aag

ctg

aga

gtg

gaa

aag

aag

aac

tgg

gtg

gaa

aga

aat

agc

624

Tyr

Ser

Lys 195

Leu

Arg

Val

Glu

Lys 200

Lys

Asn

Trp

Val

Glu 205

Arg

Asn

Ser

tac

tcc

tgt

tea

gtg

gtc

cac

gag

ggt

ctg

cac

aat

cac

cac

acg

act

672

Tyr

Ser 210

Cys

Ser

Val

Val

His 215

Glu

Gly

Leu

His

Asn 220

His

His

Thr

Thr

aag agc ttc tcc cgg acc ccg ggt aaa Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 230

699 <210> 20 <211> 233 <212> PRT <213> Mus musculus <40O> 20

Glu 1

Pro

Arg

Gly

Pro Thr 5

Ile

Lys

Pro

Cys 10

Pro

Pro

cys

Lys

Cys 15

Pro

Ala

Pro

Asn

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Lys

20

25

30

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Met

Ile

Ser

Leu

Ser

Pro

Ile

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Val

Asp

Val

Ser

Glu

Asp

Asp

Pro

Asp

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

50

55

60

Val

Asn

Asn

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

Gin

Thr

Gin

Thr

His

Arg

Glu

65

70

75

80

Asp

Tyr

Asn

Ser

Thr

Leu

Arg

Val

Val

Ser

Ala

Leu

Pro

Ile

Gin

His

85

90

95

PL 202 057 B1

Gin

Asp

Trp

Met 100

Ser

Gly

Lys

Glu

Phe 105

Lys

Cys

Lys

Val

Asn 110

Asn

Lys

Asp

Leu

Pro 115

Ala

Pro

Ile

Glu

Arg 120

Thr

Ile

Ser

Lys

Pro 125

Lys

Gly

Ser

Val

Arg 130

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr 135

Val

Leu

Pro

Pro

Pro 140

Glu

Glu

Glu

Met

Thr 145

Lys

Lys

Gin

Val

Thr 150

Leu

Thr

Cys

Met

Val 155

Thr

Asp

Phe

Met

Pro 160

Glu

Asp

Ile

Tyr

Val 165

Glu

Trp

Thr

Asn

Asn 170

Gly

Lys

Thr

Glu

Leu 175

Asn

Tyr

Lys

Asn

Thr 180

Glu

Pro

Val

Leu

Asp 185

Ser

Asp

Gly

Ser

Tyr 190

Phe

Met

Tyr

Ser

Lys 195

Leu

Arg

Val

Glu

Lys 200

Lys

Asn

Trp

Val

Glu 205

Arg

Asn

Ser

Tyr

Ser 210

Cys

Ser

Val

Val

His 215

Glu

Gly

Leu

His

Asn 220

His

His

Thr

Thr

Lys 225

Ser

Phe

Ser

Arg

Thr 230

Pro

Gly

Lys

<210> 21 <211> 29 <212> DNA <2ΐ3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer wiodący dla mysiej Fc - Endo <220>

<221> CDS <222> (2)..(28) <400> 21 c ccc aag ctt cat act cat cag gac ttt c Pro Lys Leu His Thr His Gin Asp Phe

5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 22

Pro Lys Leu His Thr His Gin Asp Phe 1 5 <210> 23 <211> 28

PL 202 057 B1 <212 > DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer wsteczny dla mysiej Fc - Endo <400> 23 cccctcgagc tatttggaga aagaggtc <210> 24 <211> 1086 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(1086) <223> Angiostatyna <400 24

ggc	atc	ggc	aac	ggc	tac	aga	gga	48
Gly	Ile	Gly	Asn	Gly	Tyr	Arg	Gly
	10					15
gtt	gcc	tgt	caa	aag	tgg	ggt	gcc	96
Val	Ala	Cys	Gin	Lys	Trp	Gly	Ala
25					30
tct	ccc	agt	aca	cat	ccc	aat	gag	144
Ser	Pro	Ser	Thr	His	Pro	Asn	Glu

gga eta gaa gag aac tac tgt agg aac cca gac aat gat gaa caa ggg 192

Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gin Gly

55 60 cct tgg tgc tac act aca gat ccg gac aag aga tat gac tac tgc aac 240

Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asn

70 ⁸⁰ att cct gaa tgt gaa gag gaa tgc atg tac tgc agt gga gaa aag tat 288

Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met Tyr Cys Ser Gly Glu Lys Tyr

90 ⁹⁵ gag ggc aaa atc tcc aag acc atg tct gga ctt gac tgc cag gcc tgg Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gin Ala Trp

100 105 HO

336 gat tct cag age cca cat gct cat gga tac atc cct gcc aaa ttt cca 384

Asp Ser Gin Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ala Lys Phe Pro

115 120 125 age aag aac ctg aag atg aat tat tgc cac aac cct gac ggg gag cca Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys His Asn Pro Asp Gly Glu Pro

130 135 140

432 agg ccc tgg tgc ttc aca aca gac ccc acc aaa ege tgg gaa tac tgt

480

PL 202 057 B1

Arg 145

Pro Trp

Cys

Phe

Thr 150

Thr

Asp

Pro Thr

Lys Arg Trp Glu Tyr Cys

155

160

gac

atc

ccc

ege

tgc

aca

aca

ccc

ccg

ccc

cca

CCC

age

cca

acc

tac

528

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

Ser

Pro

Thr

Tyr

165

no

175

caa

tgt

ctg

aaa

gga

aga

ggt

gaa

aat

tac

ega

ggg

acc

gtg

tet

gtc

576

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

Val

180

185

190

acc

gtg

tet

ggg

aaa

acc

tgt

cag

ege

tgg

agt

gag

caa

acc

cct

cat

624

Thr

Val

Ser

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

agg

cac

aac

agg

aca

cca

gaa

aat

ttc

ccc

tgc

aaa

aat

ctg

gaa

gag

672

Arg

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

210

215

220

aac

tac

tgc

cgg

aac

cca

gat

gga

gaa

act

gct

ccc

tgg

tgc

tat

acc

720

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

act

gac

age

cag

ctg

agg

tgg

gag

tac

tgt

gag

att

cca

tcc

tgc

gag

768

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu

245

250

255

tcc

tca

gca

tca

cca

gac

cag

tca

gat

tcc

tca

gtt

cca

cca

gag

gag

816

Ser

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp

Ser

Ser

val

Pro

Pro

Glu

Glu

260

265

270

caa

aca

cct

gtg

gtc

cag

gaa

tgc

tac

cag

age

gat

ggg

cag

age

tat

864

Gin

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly

Gin

Ser

Tyr

275

280

285

cgg

ggt

aca

tcg

tcc

act

acc

atc

aca

ggg

aag

aag

tgc

cag

tcc

tgg

912

Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gin Ser Trp 290 295 300 gca gct atg ttt cca cac agg cat tcg aag acc cca gag aac ttc cca 960

Ala Ala Met Phe Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu Asn Phe Pro

305 310 315 320

gat gct ggc ttg

gag atg aac tac tgc

agg Arg 330

aac ccg gat

ggt Gly

gac Asp 335

aag Lys

1008

Asp

Ala

Gly Leu

Glu Met Asn 325

Tyr

Cys

Asn

Pro

Asp

ggc

cct

tgg

tgc

tac

acc

act

gac

ccg

age

gtc

agg

tgg

gaa

tac

tgc

1056

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

340

345

350

aac ctg aag cgg tgc tca gag aca gga ggg 1086

Asn Leu Lys Arg Cys Ser Glu Thr Gly Gly

355 360 · <210> 25 <211> 362 <212> PRT

PL 202 057 B1 <213> Mus musculus <400> 25

Val 1

Tyr

Leu

Ser

Glu 5

Cys

Lys

Thr

Gly

Ile 10

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg 15

Gly

Thr

Met

Ser

Arg 20

Thr

Lys

Ser

Gly

Val 25

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Gly

Ala

Thr

Phe

Pro 35

His

Val

Pro

Asn

Tyr 40

Ser

Pro

Ser

Thr

His 45

Pro

Asn

Glu

Gly

Leu 50

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 60

Asp

Glu

Gin

Gly

Pro 65

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg 75

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn 80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu 85

Glu

Glu

Cys

Met

Tyr 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys 95

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 100

Ser

Lys

Thr

Met

Ser 105

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin 110

Ala

Trp

Asp

Ser

Gin 115

Ser

Pro

His

Ala

His 120

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala 125

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 130

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 135

Tyr

Cys

His

Asn

Pro 140

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 145

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 150

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 170

Pro

Pro

Ser

Pro

Thr 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn 185

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val 190

Ser

Val

Thr

Val

Ser 195

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin 200

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin 205

Thr

Pro

His

Arg

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 235

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 240

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu 245

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 250

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys 255

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser 2 60

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp 265

Ser

Ser

Val

Pro

Pro 270

Glu

Glu

Gin

Thr

Pro 275

Val

Val

Gin

Glu

Cys 280

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly 285

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly 290

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr 295

Ile

Thr

Gly

Lys

Lys 300

cys

Gin

Ser

Trp

PL 202 057 B1

Ala

Ala

Met

Phe

Pro

His

Arg

His

Ser

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

305

310

315

320

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Lys

325

330

335

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

340

345

350

Asn

Leu

Lys

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr

Gly

Gly

355

360

<210> 26 <211> 31 <212> DNA <2ΐ3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Qpj_s sekwencji sztucznej: Primer wsteczny dla mysiej Fc - Endo <220>

<221>	CDS
<222>	(2)	. . (49)
<400>	26
c ccc	aag	Ctt gtg	tat	ctg	tca	gaa	tgt	aag	31
Pro	Lys	Leu Val	Tyr	Leu	Ser	Glu	Cys	Lys

10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 27

Pro Lys Leu Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys 15 10 <210> 28 <21ł> 30 <212> DNA <2i3> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Opis sekwencji sztucznej: Primer wiodący dla mysiej Fc - Angio <400> 28 cccctcgagc taccctcctg tctctgagca 30 <210> 29 <211> 29 <212> DNA

PL 202 057 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer wiodący dla psiego Fc <22O>

<22l> CDS <222> (3)..(29) <400> 29 cc tta agc gaa aat gga aga gtt cct cgc 29

Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg

5 .

<210> 30 <211> 9 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna <400> 30

Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg 1 5 <2l0> 31 <211> 40 <212> DNA <2i3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sekwencji sztucznej: Primer wsteczny dla psiego Fc <400> 31 cctcgagtca tttacccggg gaatgggaga gggatttctg 40 <2l0> 32 <2ll> 702 <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1),.(702) <223> Fc <400> 32

gaa Glu 1

aat Asn

gga Gly

aga Arg

gtt Val 5

cct Pro

cgc Arg

cca Pro

cct Pro

gat Asp 10

tgt Cys

ccc Pro

saa Lys

tgc Cys

cca Pro 15

gcc Ala

48

cct

gaa

atg

ctg

gga

ggg

cct

tcg

gtc

ttc

atc

ttt

ccc

ccg

aaa

ccc

96

Pro

Glu

Met

Leu 20

Gly

Gly

Pro

Ser

Val 25

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 30

Lys

Pro

aag

gac

acc

ctc

ttg

att

gcc

ega

aca

cct

gag

gtc

aca

tgt

gtg

gtg

144

PL 202 057 B1

Lys Asp

Thr 35

Leu Leu

Ile Ala

Arg 40

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 45

Cys

Val

Val

gtg

gat

ctg

gga

cca

gaa

gac

cct

gag

gtg

cag

atc

agc

tgg

ttc

gtg

192

Val

Asp

Leu

Gly

Pro

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

Val

50

55

60

gac

ggt

aag

cag

atg

caa

aca

gcc

aag

act

cag

cct

cgt

gag

gag

cag

240

Asp

Gly

Lys

Gin

Met

Gin

Thr

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

65

70

75

80

ttc

aat

ggc

acc

tac

cgt

gtg

gtc

agt

gtc

ctc

ccc

att

ggg

cac

cag

288

Phe

Asn

Gly

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Pro

Ile

Gly

His

Gin

85

90

95

gac

tgg

ctc

aag

ggg

aag

cag

ttc

acg

tgc

aaa

gtc

aac

aac

aaa

gcc

336

Asp

Trp

Leu

Lys

Gly

Lys

Gin

Phe

Thr

Cys

Lys

Val

Asn

Asn

Lys

Ala

100

105

110

ctc

cca

tcc

ccg

atc

gag

agg

acc

atc

tcc

aag

gcc

aga

ggg

cag

gcc

384

Leu

Pro

Ser

Pro

Ile

Glu

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Arg

Gly

Gin

Ala

115

120

125

•

cat

cag

CCC

agt

gtg

tat

gtc

ctg

ccg

cca

tcc

cgg

gag

gag

ttg

agc

432

His

Gin

Pro

Ser

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser

130

135

140

aag

aac

aca

gtc

agc

ttg

aca

tgc

ctg

atc

aaa

gac

ttc

ttc

cca

cct

480

Lys

Asn

Thr

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Ile

Lys

Asp

Phe

Phe

Pro

Pro

1 A C.

150

155

160

1U

gac

att

gat

gtg

gag

tgg

cag

agc

aat

gga

cag

cag

gag

cct

gag

agc

528

Asp

Ile

Asp

Val

Glu

Trp

Gin

Ser

Asn

Gly

Gin

Gin

Glu

Pro

Glu

Ser

165 170 175 aag tac cgc acg acc ccg ccc cag ctg gac gag gac ggg tcc tac ttc 576

Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gin Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe

1B0 185 190

Ctg Leu

tac agc aag ctc tct

gtg Val

gac aag agc cgc

tgg Trp

cag Gin 205

cgg Arg

gga Gly

gac Asp

624

Tyr Ser 195

Lys Leu

Ser

Asp 200

Lys

Ser

Arg

acc

ttc

ata

tgt

gcg

gtg

atg

cat

gaa

gct

eta

cac

aac

cac

tac

aca

672

Thr

Phe

Ile

Cys

Ala

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

210

215

220

cag aaa tcc ctc tcc cat tct ccg ggt aaa Gin Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 33 <211> 234 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 33

Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala

PL 202 057 B1

1

5

10

15

Pro

Glu

Met

Leu 20

Gly

Gly

Pro

Ser

Val 25

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 30

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 35

Leu

Leu

Ile

Ala

Arg 40

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 45

Cys

Val

Val

Val

Asp 50

Leu

Gly

Pro

Glu

Asp 55

Pro

Glu

val

Gin

Ile 60

Ser

Trp

Phe

Val

Asp 65

Gly

Lys

Gin

Met

Gin 70

Thr

Ala

Lys

Thr

Gin 75

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 80

Phe

Asn

Gly

Thr

Tyr 85

Arg

Val

Val

Ser

Val 90

Leu

Pro

Ile

Gly

His 95

Gin

-Asp

Trp

Leu

Lys 100

Gly

Lys

Gin

Phe

Thr 105

Cys

Lys

Val

Asn

Asn 110

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Pro

Ile

Glu

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Arg

Gly

Gin

Ala

115 120 125

His Gin Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser 130 135 140

Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro

145 150 155 160

Asp Ile Asp Val Glu Trp Gin Ser Asn Gly Gin Gin Glu Pro Glu Ser ‘ 165 ’ 170 175

Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gin Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe 180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Arg Gly Asp 195 200 205

Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 210 215 220

Gin Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 34 <211> 552 <212> DMA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(552) <22 3> Endostatyna <400> 34 cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg gtg gcc ctg aac 48

His Thr His Gin Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn

5 10 15

PL 202 057 B1

age

ccg

cag

ccg

ggc

ggc

atg

ega

ggc

atc

cgg

gga

gcg

gac

ttc

cag

96

Ser

Pro

Gin

Pro

Gly

Gly

Met

Arg

Gly

Ile.

Arg

Gly

Ala

Asp

Phe

Gin

20

25

30

tgc

ttc

cag

cag

gcg

cgc

gcc

gcg

ggg

ctg

gcc

ggc

acc

ttc

cgg

gcc

144

Cys

Phe

Gin

Gin

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

ttc

ctg

teg

teg

cgg

ctg

cag

gac

ctc

tac

age

atc

gtg

cgc

cgc

gcc

192

Phe

Leu

Ser

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Arg

Ala

55 60 gac cgc acc ggg gtg ccc gtc gtc aac. ctc agg gac gag gtg ctc ttc 240

Asp Arg Thr Gly Val Pro Val Val Asn Leu Arg Asp Glu Val Leu Phe

70 75 80 ccc age tgg gag gcc tta ttc teg ggc tcc gag ggc cag ctg aag ccc 288

Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Gin Leu Lys Pro

90 95 ggg gcc cgc atc ttc tct ttc gac ggc aga gat gtc ctg cag cac ccc 336

Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Gin His Pro

100 105 110 gcc tgg ccc cgg aag age gtg tgg cac ggc tcc gac ccc age ggg cgc 384

Ala Trp Pro Arg Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg

115 120 125 cgc ctg acc gac age tac tgc gag acg tgg cgg acg gag gcc ccg gcg 4 32

Arg Leu Thr Asp Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ala

130 135 140 ·» gcc acc ggg cag gcg teg teg ctg ctg gcg ggc agg ctg ctg gag cag

Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Leu Leu Ala Gly Arg Leu Leu Glu Gin

145 150 155 160 gag gcc gcg age tgc cgc cac gcc ttc gtg gtg ctc tgc atc gag aac

Glu Ala Ala Ser Cys Arg His Ala Phe Val Val Leu Cys Ile Glu Asn

165 170 175

480

528 age gtc atg Ser Val Met acc tcc ttc Thr Ser Phe 180 tcc aag Ser Lys

552 <210> 35 <211> 184 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 35

His 1

Thr

His

Gin

Asp 5

Phe

Gin

Pro

Val

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

Leu 15

Asn

Ser

Pro

Gin

Pro 20

Gly

Gly

Met

Arg

Gly 25

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp 30

Phe

Gin

Cys

Phe

Gin

Gin

Ala

Arg

Ala

Ala

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

PL 202 057 B1

35

40

45

Phe

Leu

Ser

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Arg

Ala

50

55

60

Asp

Arg

Thr

Gly

Val

Pro

Val

Val

Asn

Leu

Arg

Asp

Glu

Val

Leu

Phe

65

70

75

80

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

Gin

Leu

Lys

Pro

65

90

95

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Arg

Asp

Val

Leu

Gin

His

Pro

100

105

110

Ala

Trp

Pro

Arg

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly

Arg

115

120

125

'5

Leu

Thr

Asp

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Ala

Pro

Ala

130

135

140

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Ser

Leu

Leu

Ala

Gly

Arg

Leu

Leu

Glu

Gin

145

150

155

160

Glu

Ala

Ala

Ser

Cys

Arg

His

Ala

Phe

Vał

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

Ser

val

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180

<210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Linker Hindlll I Orali): górny łańcuch <22O>

<221> CDS <222> (3)..(41) <4OO> 36 ag ctt cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg 41

Leu His Thr His Gin Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu

10 <2l0> 37 <211> 13 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna <400> 37

Leu His Thr His Gin Asp Phe Gin Pro Val Leu His Len 1 5 10

PL 202 057 B1 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <2ΐ3> . Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Linker Hindlll I Dralll: dolny łańcuch <400> 38 gtgcagcacc ggctggaagt cctggtgggt gtga 34 <210> 39 <211> 1077 ' <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(1077) <223> Angiostatyna <400> 39

ata Ile 1

tat Tyr

ctt Leu

tca Ser

gag Glu 5

tgc Cys

aag act Lys Thr

gga Gly

aat Asn 10

ggg Gly

aaa Lys

acc Thr

tac Tyr

agg Arg 15

ggg Gly

48

acc

atg

gcc

aaa

acg

aag

aat

gat

gtt

gcc

tgt

caa

aaa

tgg

agt

gac

96

Thr

Met

Ala

Lys

Thr

Lys

Asn

Asp

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Asp

20

25

30

aat

tct

ccg

cac

aaa

cct

aac

tat

acg

cct

gag

aag

cac

ccc

ttg

gag

144

Asn

Ser

Pro

His

Lys

Pro

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Lys

His

Pro

Leu

Glu

35

40

45

ggg

ctg

gag

gag

aac

tat

tgc

agg

aac.

cct

gac

aac

gac

gag

aac

ggg

192

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Asn

Gly

50

55

60

ccc

tgg

tgc

tac

acc

aca

aac

cca

gac

gtg

agg

ttc

gac

tac

tgc

aac

240

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asn

Pro

Asp

Val

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asn

65

70

7S

80

att

cca

gaa

tgt

gaa

gag

gaa

tgt

atg

cat

tgc

agt

ggg

gaa

aat

tat

288

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Glu

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

85

90

95

gag

ggc

aaa

att

tcc

aag

aca

aag

tct

gga

ctc

gag

tgc

caa

gcc

tgg

336

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

aac

tct

caa

acc

cca

cat

gct

cat

gga

tat

att

cct

tcc

aaa

ttt

cca

384

Asn

Ser

Gin

Thr

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125

agc

aag

aac

ttg

aag

atg

aat

tac

tgc

cgt

aac

cct

gat

ggg

gag

CCC

432

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

PL 202 057 B1 cgc cca tgg tgt ttc acc atg gat ccc aac aaa cgc tgg gaa ttc tgt 4 80

Arg Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Phe Cys

145 150 155 160 gac att ccc cgc tgt aca aca cca cca ccc cct tcg ggc cca acg tac 528

Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Ser Gly Pro Thr Tyr

165 170 175 cag tgt ctg aag ggc aga ggg gag agc tac ega ggg aag gtg tcc gtc 576

Gin Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Lys Val Ser Val

180 185 190 act gtc tet gga cat aca tgt cag cac tgg agt gaa cag acc cct cac 624

Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gin His Trp Ser Glu Gin Thr Pro His

195 200 205 aag cac aac agg acc cca gaa aac ttc cct tgc aaa aat ttg gat gaa 672

Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu

210 215 220 aac tac tgt cgc aac cct gat gga gaa aca get cca tgg tgc tac aca 720

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr

225 230 235 240 acc aac agt gag gtg agg tgg gaa cac tgc cag att ccg tcc tgt gag 768

Thr Asn Ser Glu Val Arg Trp Glu His Cys Gin Ile Pro Ser Cys Glu

245

250

255

tcc

tet

cca

ata

acc

aca

gaa

tat

ttg

gat

gcc

cca

get

tea

gtg

cca

816

Thr

Leu

Asp

Ti 1 —

TT, 1

Pro

ser

ser

rro

ne

rur

VsJ-U

±yr

M J

C2.UJ

Vfl±

260

265

270

cct

gaa

caa

act

cct

gtg

gtc

cag

gag

tgc

tac

cac

ggc

aat

ggg

cag

864

Pro

Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

His

Gly

Asn

Gly

Gin

275

280

285

agt

tat

ega

ggc

aca

tea

tcc

act

act

atc

aca

gga

aga

aaa

tgt

cag

912

Ser

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Ile

Thr

Gly

Arg

Lys

Cys

Gin

290

295

300

tet

tgg

tea

tet

atg

aca

cca

cac

ega

cat

gag

aag

acc

cca

gaa

cac

960

Ser

Trp

Ser

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Glu

His

305

310

315

320

ttc

ccg

gag

get

ggc

ctg

aca

atg

aac

tac

tgc

agg

aat

ccc

gac

gcc

1008

Phe

Pro

Glu

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

325

330

335

gac

aaa

agc

cct

tgg

tgt

tac

acc

acc

gac

ccc

tet

gtg

cgc

tgg

gag

1056

Asp

Lys

Ser

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

340

345

350

ttc

tgt

aac

ttg

aga

aaa

tgc

1077

Phe

Cys

Asn

Leu

Arg

Lys

Cys

355 <210> 40

PL 202 057 B1 <211> 359 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 40

Ile 1

Tyr

Leu

Ser

Glu 5

Cys

Lys

Thr

Gly

Asn 10

Gly

Lys

Thr

Tyr

Arg 15

Gly

Thr

Met

Ala

Lys 20

Thr

Lys

Asn

Asp

Val 25

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Ser

Asp

Asn

Ser

Pro 35

His

Lys

Pro

Asn

Tyr 40

Thr

Pro

Glu

Lys

His 45

Pro

Leu

Glu

Gly

Leu 50

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys 55

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn 60

Asp

Glu

Asn

Gly

Pro 65

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 70

Asn

Pro

Asp

Val

Arg 75

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asn 80

ile

Pro

Glu

Cys

Glu 85

Glu

Glu

Cys

Met

His 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn 95

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile 100

Ser

Lys

Thr

Lys

Set 105

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin 110

Ala

Trp

Asn

Ser

Gin 115

Thr

Pro

His

Ala

His 120

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser 125

Lys

Phe

Pro

Ser

Lys 130

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 135

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 140

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 145

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 150

Met

Asp

Pro

Asn

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys 160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 170

Pro

Ser

Gly

Pro

Thr 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly

Arg

Gly

Glu

Ser 185

Tyr

Arg

Gly

Lys

Val 190

Ser

Val

Thr

Val

Ser 195

Gly

His

Thr

Cys

Gin 200

His

Trp

Ser

Glu

Gin 205

Thr

Pro

His

Lys

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Asp

Glu

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 235

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 240

Thr

Asn

Ser

Glu

Val 245

Arg

Trp

Glu

His

Cys 250

Gin

Ile

Pro

Ser

Cys 255

Glu

Ser

Ser

Pro

Ile 260

Thr

Thr

Glu

Tyr

Leu 265

Asp

Ala

Pro

Ala

Ser 270

Val

Pro

Pro

Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

His

Gly

Asn

Gly

Gin

275 280 285

PL 202 057 B1

Ser

Tyr 290

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser 2 95

Thr

Thr

Ile

Thr

Gly 300

Arg

Lys

Cys

Gin

Ser 305

Trp

Ser

Ser

Met

Thr 310

Pro

His

Arg

His

GlU 315

Lys

Thr

Pro

Glu

His 320

Phe

Pro

Glu

Ala

Gly 325

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr 330

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp 335

Ala

Asp

Lys

Ser

Pro 340

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr 345

Asp

Pro

Ser

Val

Arg 350

Trp

Glu

Phe Cys Asn Leu Arg Lys Cys 355 <210> 41 <211> 12 <2l2> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: tinker palindromowy, w którym po kodonie stopowym TGA następuje pozycja Xhol <400> 41 tgactcgagt ca 12 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> 0pi_s sekwencji sztucznej: Primer mutageniczny dla mysiej angiostatyny <220>

<221> CDS <222> (1)..(21) <400> 42 ggg cct tgg age tac act aca 21

Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr

5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 43

Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr

5

PL 202 057 B1 <210 44 <211> 34 <212> DNA <2ΐ3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer użyty do wprowadzenia Hindlll do mysiej angiostatyny <220>

<221> CDS <222> (9)..(32) <400> 44 gcggatce aag ctt agt aca cat ccc aat gag gg 34

Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu

5 <210 45 <211> 8 <212> PRT <213> -Sekwencja sztuczna <400 45

Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu 1 5 <210 46 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Linker BspHI / BamHI: górny łańcuch <220>

<221> CDS <222> (2).,(58) <400 46 c atg acc tet ttc tcc aaa tcg age ggg ggc age ggg ggc gga ggc age 49 Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

10 15 ggc ggg ggc g 59

Gly Gly Gly <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Sekwenqa sztuczna <400 47

Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

PL 202 057 B1

Gly Gly Gly <210> 48 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<22 3> _Opjs sekwencji _sztuCznej: Linker BspHI / BamHI: dolny łańcuch <400> 48 gatccgcccc cgccgctgcc tccgcccccg ctgcccccgc tcgatttgga gaaagaggt 59 <21 D> 49 <211> 12 <212> DNA <2i3> Sekwencja sztuczna <220>

^<223> Opis sekwencji sztucznej: Linker BamHI / Hindlll: górny łańcuch <220>

<221> CDS <222> (3) . . (11) <400> 49 ga tcc tea ggc c 12

Ser Ser Gly '

<210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Qp_)S sekwencji sztucznej: Linker BamHI i Hindlll: dolny łańcuch <400> 50 agctggcctg ag 12 <210> 51 <211> 10 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opjs sekwencji sztucznej: Linker Afill i Hindlll: górny łańcuch

PL 202 057 B1 <220>

<221> CDS <222> (1).-(9) <400> 51 tta agc ggc c Leu Ser Gly <210> 52 <211> 10 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna .

<220>

<223> Q_pis sekwencji sztucznej; Linker Aflll / Hindlll: dolny łańcuch

<400> 52 agctgggcgc	10
<210> 53 <211> 11 <212> DNA <2i3> Sekwencja sztuczna <220> <223> opis sekwencji sztucznej: Linker Xhol / Aflll: górny łańcuch <220> <221> CDS <222> (3)..(11) <400> 53 tc gac tcc ggc	11
Asp Ser Gly

i <210> 54 <211> 11 <212> DNA <2i3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Linker Xhol / Aflll: dolny łańcuch <400> 54 ttaagccgga g

Claims (7)

1. Homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, zawierające obszar Fc immunoglobuliny oraz białko docelowe, znamienne tym, że region Fc obejmuje region zawiasowy, domenę CH2 i domenę CH3, a białko docelowe jest sprzężone z końcem C obszaru Fc i jest wybrane z grupy obejmującej: endostatynę, angiostatynę i endostatynę-polilinker-angiostatynę, gidzie angiostatyna jest angiostatyną o pełnej długości lub regionami kringle 1, 2 lub 3, lub stanowi ich kombinacje.

2. Homodimeryczne białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że białko docelowe jest endostatyną.

3. Homodimeryczne białko fuzyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że białko docelowe zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako ekwencja nr 4.

4. Homodimeryczne białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że immunoglobuliną jest lgG1.

5. Cząsteczka DNA kodująca sekwencję sygnałową i białko fuzjne określone w zastrz. 1

6. Wektor ekspresyjny do transfekowania komórki ssaczej obejmujący DNA określone w zastrz. 5.

7. Sposób otrzymywania homodimerycznego białka fuzyjnego określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których tansfekuje się komórkę ssaczą wektorem niosącym gen kodujący białko fuzyjne określone w zastrz. 1, następnie prowadzi się hodowlę tak uzyskanych komórek ssaczych aby wytworzyć białko fuzyjne, po czym uzyskuje się z komórek białko fuzyjne.