JP7233113B2 - ApoA-1融合ポリペプチドならびに関連する組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年9月8日に出願された米国仮出願第62/215,256の利益を主張し、当該出願はその全体が本明細書において参考として援用される。
本願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、その全体を参照により本明細書に組み込む。2016年8月31日に作成された前記ASCIIコピーは、「TRP_0110PC_20160831_Seq_Listing_ST25」と命名され、サイズは161,132バイトである。
心血管疾患は、多くの国における死亡率の主因であり、世界中で毎年およそ1670万名の死亡を構成する。心血管疾患の最も一般的な帰結は、心筋梗塞および脳卒中であり、これらは、粥状動脈硬化に共通の根底にある病因を有する。
された2個のApoA-1分子を形成することができる。Phillips、上記参照。ApoA-1の立体構造適応性は、異なるサイズの円盤状粒子と共に球状HDL粒子を含むHDL粒子に安定性も付与する。同文献参照。これらの特徴は、ApoA-1が、細胞のリン脂質およびコレステロールの流出の媒介ならびに安定したHDL粒子の産生においてABCA1とパートナーを組むことを可能にする。Phillips、上記参照;Lund-KatzおよびPhillips、上記参照。
13年を参照されたい。ApoA-1は、ヒト血漿から精製され(再構成されたHDL)、臨床治験において検査された。組換えApoA-1も、細菌および哺乳動物発現系の両方において発現され、臨床治験において検査された。これらの研究は、リン脂質と共にプレβ HDLへと再構成されたApoA-1の注入が、小規模の(47~60名の患者)臨床治験後に血管内超音波(IVUS)によって測定される通り、プラーク体積の低下およびプラーク形態の改善を引き起こすことを示した。有望ではあるが、天然または組換えApoA-1の使用には、短いApoA-1半減期による毎週投与の必要性および高い製造コストを含む、いくつかの制約がある。
:681~688頁、2012年;Ryanら、Protein Expr. Purif.27巻:98~103頁、2003年を参照されたい。別の例では、IFNαが、3aa(Gly Ala Pro)リンカーを介してApoA-1のアミノ末端に取り付けられた。Fioravantiら、J. Immunol.188巻:3988~3992頁、2012年を参照されたい。この構築物におけるリンカーは、制限酵素の選択によって作製され、融合タンパク質は、アデノウイルス送達によって検査されて、肝臓へと標的化し、IFNα治療法の毒性を低下した。ApoA-1は、また、Fcドメインと融合され(ApoA-1-Ig)、Creative Biomart(cat.No.APOA-1-33H)およびLife Technologies(Cat#10686-HO2H-5)から市販された。しかし、このApoA-1-Ig分子は、非常に低い機能活性を有する(実施例1を参照)。
15-ApoA-1(Ochoaら、Cancer Res.73巻:139~149頁、2013年)、およびヒトテトラネクチン(tetranectin)の三量体形成ドメインの付加により作製された三量体ApoA-1融合タンパク質(Graversenら、J. Cardiovascular Pharmacol.51巻:170~77頁、2008年)を含む。これらの例では、融合は、ApoA-1のN末端で為された。
ペプチドミメティック
RNase
パラオキソナーゼ
49~58頁、2014年を参照されたい。
Thromb. Vasc. Biol.26巻:1545~50頁、2006年を参照されたい。
7頁、2011年を参照されたい。
10年を参照されたい。
されたい。
血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ
頁、2009年を参照されたい。アデノウイルス媒介性遺伝子送達を介したPAF-AHによる治療法は、ラットモデルにおいて蛋白尿および糸球体硬化症を寛解することが報告された。Iso-Oら、Molecular Therapy 13巻:118~126頁、2006年を参照
されたい。PAF-AHは、また、ラットにおいてパラセタモール中毒後の肝臓回復を増強し、PAFは、高用量のアセトアミノフェン由来の肝臓毒性に関連する。Grypiotiら、Dig. Dis. Sci.52巻:2580~2590頁、2007年;Grypiotiら、Dig. Dis.
Sci.53巻:1054~1062頁、2008年を参照されたい。機能喪失を引き起こすPAF-AHにおける突然変異は、日本人の4%に存在し、PAF-AHは、そのような個体における心血管疾患および脳卒中の独立リスク因子であることが見出された。Blankenbergら、J. Lipid Res.44巻:1381~1386頁、2003年を参照されたい。組換えPAF-AHは、第III相臨床治験において、急性呼吸促迫症候群(ARDS)患者および敗血症患者において検査された。Karabinaら、Biochim. Biophys. Acta 1761巻:1351~1358頁、2006年を参照されたい。
コレステリルエステル転送タンパク質
CETP阻害剤および心血管疾患の代替的な見解が出現した。例えば、Miller、F100Research 3巻:124頁、2014年を参照されたい。CETPの保護的役割に関しては証拠がますます増えている。例えば、ヒトにおける複数の研究は現在、心血管疾患が、CETPレベルと逆相関することを示す。加えて、肝臓分泌が低下したCETP対立遺伝子は、心筋梗塞のリスク増加に関連する。Miller、上記参照。CETP阻害剤が、HDLコレステロールレベルを増加させ、したがって、心血管疾患の低下において有益となるであろうという本来の考えは、正しくない可能性がある。HDLコレステロールは、その脂質輸送機能のため有益であり、HDLからLDLおよびVLDLへのコレステリルエステルのCETP媒介性転移が、この機能の重要な成分である可能性がある。
定義
含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、組換えにより産生され、例えば、新たな機能的核酸を作製するために配置された無関係の遺伝子に由来する2個またはそれを超える配列、例えば、ある供給源由来のプロモーターと、別の供給源由来のコード領域を有する。同様に、「異種」は、タンパク質の部分を参照して使用される場合、タンパク質が、自然において互いに同じ関係性では存在しない2個またはそれを超えるサブ配列(例えば、融合ポリペプチドの2個のセグメント)を含むことを示す。
Natl. Acad. Sci. USA 79巻:6661~6665頁、1982年;Senoら、Nuc. Acids Res.11巻:719~726頁、1983年;Riechmannら、Nature 332
巻:323~327頁、1988年;Amsterら、Nuc. Acids Res.8巻:2055~2
065頁、1980年;RusconiおよびKohler、Nature 314巻:330~334頁、
1985年;Bossら、Nuc. Acids Res.12巻:3791~3806頁、1984年;Bothwellら、Nature 298巻:380~382頁、1982年;van der Looら、Immunogenetics 42巻:333~341頁、1995年;Karlinら、J. Mol. Evol.22
巻:195~208頁、1985年;Kindsvogelら、DNA 1巻:335~343頁、1
982年;Breinerら、Gene 18巻:165~174頁、1982年;Kondoら、Eur. J. Immunol.23巻:245~249頁、1993年;ならびにGenBank受託番号J00228を参照されたい。免疫グロブリン構造および機能の総説については、Putnam、The Plasma Proteins、V巻、Academic Press, Inc.、49~140頁、1987
年;およびPadlan、Mol. Immunol.31巻:169~217頁、1994年を参照されたい。
本来はタンパク質分解性消化によって描写された別個のタンパク質断片により、免疫グロブリンタンパク質の全体的一般構造を定義することができる。文献において本来定義される通り、Fc断片は、ジスルフィド連結された重鎖ヒンジ領域、CH2およびCH3ドメインからなる。本明細書において使用される場合、この用語は、CH3、CH2、および第2のこのような鎖とのジスルフィド連結された二量体の形成に十分なヒンジの少なくとも部分からなる単鎖も指す。本明細書において使用される場合、用語Fc領域は、天然起源の配列のバリアントをさらに含み、このバリアントは、二量体を形成することができ、増加または減少したFc受容体結合または補体結合活性を有するようなバリアントを含むことができる。
頁、1992年を参照;または酵母GCN4ロイシンジッパードメイン);イソロイシンジッパードメイン;二量体形成細胞表面受容体(例えば、インターロイキン-8受容体(IL-8R);またはLFA-1もしくはGPIIIb/IIIa等のインテグリンヘテロ二量体)の二量体形成領域;分泌される二量体形成リガンド(例えば、神経増殖因子(NGF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、インターロイキン-8(IL-8)、血管内皮増殖因子(VEGF)または脳由来神経栄養因子(BDNF);例えば、Arakawaら、J. Biol. Chem.269巻:27833~27839頁、1994年およびRadziejewskiら、Biochem.32巻:1350頁、1993年を参照)の二量体形成領域;ならび
にポリペプチドと少なくとも1個のシステイン残基を含む第2のポリペプチド(以降「合成ヒンジ」)の間にジスルフィド結合(複数可)を形成することができるような、少なくとも1個のシステイン残基(例えば、約1、2または3~約10個のシステイン残基)を含むポリペプチドが挙げられる。本発明に従って好まれる二量体形成ドメインは、Fc領域である。
びPeruski、The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press, Inc.1997年);Wuら(編)、「Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins」、Methods
in Gene Biotechnologyの123~151頁(CRC Press, Inc.1997年);Bishop(編)、Guide to Human Genome Computing(第2版、Academic Press, Inc.1
998年)を参照)。2種のアミノ酸配列が、互いと比べて少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%配列同一性を有する場合、この2配列は、「実質的配列同一性」を有すると考慮される。
Natl. Acad. Sci. USA 89巻:10915頁、1992年を参照されたい。例え
ば、ギャップオープニングペナルティ10、ギャップエクステンションペナルティ1、および表1に示す(アミノ酸は、標準1文字コードによって示されている)HenikoffおよびHenikoff、上記参照の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを使用して、2種のアミノ酸配列を整列して、整列スコアを最適化することができる。続いて、次の通りにパーセント同一性が計算される:([同一マッチの総数]/[長い方の配列の長さプラス2配列を整列するために長い方の配列に導入されたギャップの数])(100)。
2444頁、1988年ならびにPearson、Meth. Enzymol.183巻:63頁、1990年によって記載されている。簡潔に説明すると、FASTAは先ず、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、同一性の最高密度(ktup変数が1の場合)または同一性の対(ktup=2の場合)のいずれかを有する、問い合わせ配列(例えば、配列番号2の残基19~267または25~267)および被験配列によって共有される領域を同定することによって、配列類似性を特徴付ける。次に、同一性の最高密度を有する10個の領域が、アミノ酸置換マトリックスを使用して、対形成されたアミノ酸の全ての類似性を比較することにより再度スコアリングされ、領域の末端が、最高スコアに寄与する残基のみを含むように「トリミング」される。「カットオフ」値(配列の長さおよびktup値に基づく既定の式によって計算される)よりも大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、トリミングされた初期領域が試験されて、領域を連接して、ギャップを有するおよその整列を形成することができるか決定する。最後に、2種のアミノ酸配列の最高スコアリング領域が、アミノ酸挿入および欠失を可能にするNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.48巻:444頁、1970年;Sellers、SIAM J. Appl. Math.26巻:787
頁、1974年)の修正版を使用して整列される。FASTA解析のための説明目的のパラメータは:ktup=1、ギャップオープニングペナルティ=10、ギャップエクステンションペナルティ=1および置換マトリックス=BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson、Meth. Enzymol.183巻:63頁、1990年の付録2に説明される通り、スコアリングマトリックスファイル(「SMATRIX」)を修飾することによってFASTAプログラムに導入することができる。
本発明は、コレステロール流出活性を有し、ApoA1ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片、あるいはApoA-1ミメティックのいずれかである、第1のポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドに関する組成物および方法を提供する。一部の態様では、融合ポリペプチドは、二量体形成ドメインのアミノ末端側の末端とApoA-1ポリペプチド、バリアント、断片またはミメティックのカルボキシル末端側の末端との間のペプチドリンカーを有する二量体形成ドメインをさらに含み、これにより、融合ポリペプチドが、安定した二量体を形成することを可能にする。他の相互排他的でない態様では、融合ポリペプチドは、ApoA-1ポリペプチド、バリアント、断片またはミメティックに対しカルボキシル末端側にあり、第2の生物学的活性を付与する、第2のポリペプチドセグメントをさらに含む二重特異性構築物である。例示的な第2のポリペプチドは、RNase、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)、コレステロールエステル転送タンパク質(CETP)、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)、およびアミロイドベータに特異的に結合するポリペプチドを含み、これらのいずれも、天然起源のタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片となることができる。
年を参照されたい。データは、中枢神経系におけるApoA-1のプラスの神経保護効果をさらに示唆する。Gardnerら、Frontiers in Pharmacology:2015年11月20日、doi:10.3389/fphar.2015.00278を参照されたい。
156頁、2010年;McMahonら、Athritis Rheum.60巻:2428~2437頁、
2009年を参照されたい。ApoA-1に対する自己抗体は、多くのSLE患者に存在し、SLEDAIによって評価されるSLE疾患活動性およびSLICC/ACR損傷指標によって評価されるSLE疾患関連の臓器損傷は、抗ApoA-1抗体と正に相関する。Batuklaら、Ann. NY Acad. Sci.1108巻:137~146頁、2007年;Ahmedら、EXCLI Journal 12巻:719~732頁、2013年を参照されたい。さらに
、増加したApoA-1濃度は、ループス易発性SLE1、2、3マウスにおける自己免疫および糸球体腎炎を減弱した。Blackら、J. Immunol. 195巻:4685~469
8頁、2015年を参照されたい。
ら、Ann. Rheum. Dis.71巻:1157~1162頁、2012年を参照されたい。ApoA-1および再構成されたHDLによるLewisラットにおける関節炎の処置は、急性および慢性の関節炎症を低下させ、マクロファージTLR2発現および活性化を減少させた。Wuら、Arterioscler. Thromb. Basc. Biol.34巻:543~551頁、2014年を参照されたい。プラバスタチンと組み合わせたApoA-1ミメティックペプチドD-4Fによるラットにおけるコラーゲン誘導性関節炎の治療法は、疾患活動性を有意に低下させた。Charles-Schoemanら、Clin. Immunol.127巻:234~244頁、2
008年を参照されたい。
、2015年を参照されたい。
、J. Atherosclerosis and Thrombosis 19巻:923~36頁、2012年を参照されたい。ApoA-1は、脂質ラフトへのTRAF-6動員の減少、およびNF-kBの活性化の減少を引き起こすことも示された。同文献参照。別の研究は、ApoA-1またはApoA-1ミメティック4Fによるヒト単球およびマクロファージの処置が、LPSに対するそれらの応答を変更し、炎症性サイトカインMCP-1、MIP-1、RANTES、IL-6およびTNFαの産生減少をもたらしたが、IL-10の産生を増加させたことを示した。Smythiesら、Am. J. Physiol. Cell Physiol.298巻:C15
38~48頁、2010年.doi:1152/ajpcell.00467.2009を参照されたい。別の研究は、ApoA-1による処置が、THP-1細胞からのLPS誘導性MCP-1放出を有意に減少させ、CD11bおよびVCAM-1の発現を阻害したことを示した。Wangら、Cytokine 49巻:194~2000頁、2010年を参照されたい。よって、ApoA-1は、ヒト単球およびマクロファージの活性化および接着を阻害し、抗炎症性表現型への分化による著明な機能変化を誘導する。
では、特発性肺線維症患者は、対照と比較して(P<0.01)、細気管支洗浄液に低レベルのApoA-1を有した。Kimら、Am. J. Respir. Crit. Care Med.182巻:633~642頁、2010年を参照されたい。さらに、ブレオマイシンで処置したマウスにおけるApoA-1による鼻腔内処置は、肺における炎症性細胞の数およびコラーゲン沈着の低下において非常に有効であった。同文献参照。
のである。Barthら、Trends Cardiovasc. Med.11巻:26~31頁、2001年を参照されたい。本明細書に記載されているFc領域を含むApoA-1融合分子は、Fcドメインの存在によりFcRnを介してリサイクルされているため、この通常の様式における再取り込みの必要を迂回するであろう。
13年を参照されたい。一部の態様では、本発明のApoA-1融合分子は、例えば、抗がん免疫療法等、1種または複数の他の抗がん療法との組合せにおいて有用である。
-1が立体構造制約なしでこれらの位置を仮定するのに十分な長さのものである。
Respir. Crit. Care Med.178巻:1227~1237頁、2008年を参照されたい。酸素療法は、ARDSにおける主要な治療介入であるが、さらなる肺損傷およびウイルス感染に対する感受性に寄与する。酸素療法は、培養されたヒト上皮細胞における増加したTLR3発現および活性化のための主要な刺激であり、TLR3の非存在または遮断は、高酸素条件への曝露後の肺傷害および炎症からマウスを保護した。Murrayら、上記参照。別の研究は、細胞外RNAによるTLR3活性化が、急性低酸素に応答して起こり、RNaseAによるマウスにおける治療法が、急性低酸素後の肺炎症を縮小したことを示した。Biswasら、Eur. J. Immunol.45巻:3158~3173頁、2015年を参照されたい。本明細書に記載されているRNaseセグメントを含む二重特異性ApoA-1融合分子は、例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)等、例えば、自己免疫性疾患の処置に使用することもできる。研究は、例えば、SLE疾患病理発生におけるTLR7を含むRNA免疫複合体およびRNA受容体の役割、ならびにSLEのマウスモデルにおけるRNase過剰発現の保護効果を示す。例えば、Sunら、J. Immunol.190巻:
2536~2543頁、2013年を参照されたい。
は天然PON1とApoA-1融合分子とのインキュベートは、ApoA-1融合分子へのPON1の「負荷」に十分であろう。
巻:719~732頁、2013年を参照)。PON1活性は、SLE患者において有意に低下し、粥状動脈硬化のリスク因子である。Kissら、Ann. NY Acad. Sci.108巻
:83~91頁、2007年を参照されたい。加えて、他の研究は、炎症性肺疾患等、炎症性疾患の処置のためのパラオキソナーゼの使用を支持する。一研究は、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)および気管支拡張症を含む、硫黄マスタードガス(SM)に曝露してからかなり経った後の後期(late)肺疾患の患者が、細気管支洗浄液において有意に低下したレベルのPON1を有する(p<0.0001)ことを示した。Golmaneshら、Immunopharmacol. Immunotoxical.35巻:419~425頁、2013年を参照されたい
。別の研究は、20年前にSMに曝露したイラン人の退役軍人が依然として、PON1活性の有意に低い血清レベルを有し、低いPON1が、肺疾患重症度と相関したことを示した。Taravatiら、Immunopharmacol. Immunotoxicol.34巻:706~713頁、2012年を参照されたい。
されたい。Fcへの組換えヒトLCAT融合が報告されており(Spahrら、Protein Sci.22巻:1739~53頁、2013年を参照)、ApoA-1およびLCATの両方を含有する二重特異性分子は、どちらか単独の単一特異性タンパク質よりも効率的にRCTを改善することもできる。
6巻:e18296頁、2011年によって記載されている。このような実施形態では、Aβ結合ポリペプチドは、典型的に、ApoA-1に対しC末端に、または存在する場合は二量体形成ドメインに対しC末端に融合される。この二重特異性融合分子は、アルツハイマー病患者の治療法のための改善された特性を有する。
II.融合ポリペプチドおよび二量体タンパク質
(PON1)バリアントは、基質としてジエチルp-リン酸ニトロフェノール(パラオクソン)を使用してホスホトリエステラーゼ活性に関して、または基質として酢酸フェニルを使用してアリールエステラーゼ活性に関してアッセイすることができる。例えば、GravesおよびScott、Curr Chem Genomics 2巻:51~61頁、2008年を参照された
い。関連性のあるCETPおよびLCAT活性を評価するためのアッセイも公知である。例えば、LCATおよびCETP酵素活性を測定するためのアッセイは、市販されており、例えば、LCATについてはCell Biolabs Cat.No.STA-615、Sigma-Aldrich Cat.No.MAK107およびRoar Biomedical Cat.No.RB-LCAT、ならびにCETPについてはAbcam Cat.No.ab65383およびSigma-Aldrich Cat.No.MAK106を含む。
Methods 145巻:229~240頁、1991年)ならびにCunninghamおよびWells(J. Mol. Biol.234巻:554~563頁、1993年)によって開示されている
。Aβ結合ポリペプチドは、本技術分野で公知の他のアッセイ系内で使用することもできる。そのような系は、結合親和性の決定のためのScatchard解析(Scatchard、Ann. NY Acad. Sci.51巻:660~672頁、1949年を参照)および熱量測定アッセイ(Cunninghamら、Science 253巻:545~548頁、1991年;Cunninghamら、Science 254巻:821~825頁、1991年を参照)を含む。
インA(Nilssonら、EMBO J.4巻:1075頁、1985年;Nilssonら、Methods Enzymol.198巻:3頁、1991年)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(SmithおよびJohnson、Gene 67巻:31頁、1988年)、もしくは他の抗原性エピトープもしく
は結合ドメイン等、精製を容易にする小型の伸長(親和性タグ)である(全般的には、Fordら、Protein Expression and Purification 2巻:95~107頁、1991年を参照)。親和性タグをコードするDNAは、商業的供給業者(例えば、Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)から入手することができる。保存的置換は、次から選択することもできる:1)アラニン、グリシン;2)アスパラギン酸、グルタミン酸;3)アスパラギン、グルタミン;4)アルギニン、リシン;5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン;6)フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン;7)セリン、スレオニン;および8)システイン、メチオニン(例えば、Creighton
、Proteins(1984年)を参照されたい)。
vitro使用に好まれることがある。よって、本発明の使用のためのポリペプチドセグメントは、限定することなく、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ類および鳥類ポリペプチドならびにこれらのバリアントとなることができる。
、2009年を参照)。ApoA-1ミメティックは、一般に、本技術分野で公知であり、Reddyら、Curr. Opin. Lipidol.25巻:304~308頁、2014年に総説が記
載されている。
、1989年;Alfthanら、Protein Eng.8巻、725~731頁、1995年;RobinsonおよびSauer、Biochemistry 35巻、109~116頁、1996年;Khandekarら、J. Biol. Chem.272巻、32190~32197頁、1997年;Faresら、Endocrinology 139巻、2459~2464頁、1998年;Smallshawら、Protein Eng.12巻、623~630頁、1999年;米国特許第5,856,456号を参照されたい。
ら、J Med Chem 56巻:3943~58頁、2013年を参照;MPOの高度かつ選択的な阻害(IC50=18nM)を有する化合物を含む、選択的かつ高度に強力なミエロペルオキシダーゼ阻害剤としての3-アルキルインドール誘導体の研究について記載);3-(アミノアルキル)-5-フルオロインドールに基づく阻害剤(Soubhyeら、J Med Chem 53巻:8747~8759頁、2010年を参照);2H-インダゾールお
よび1H-インダゾロンに基づく阻害剤(Rothら、Bioorg Med Chem 22巻:642
2~6429頁、2014年を参照;2H-インダゾールおよび1H-インダゾロンの評定ならびにIC50値<1μMを有する化合物の同定について記載);ならびに安息香酸ヒドラジド含有化合物(Huangら、Arch Biochem Biophys 570巻:14~22頁、
2015年を参照;エステル結合の切断によってより大型の重鎖からMPOの軽鎖サブユニットが取り除かれる、安息香酸ヒドラジド含有化合物によるMPOの不活性化を示す)を含む。
III.ポリペプチド融合体および二量体タンパク質を作製するための材料および方法
8~1412頁、1972年)の方法を使用して、全RNAから調製される。相補的DNAは、公知の方法を使用してポリ(A)+RNAから調製される。代替法において、ゲノムDNAを単離することができる。cDNAおよびゲノムクローンを同定および単離するための方法は、周知かつ当業者のレベルの範囲内にあり、ライブラリーをプローブ探索またはプライマー探索するための本明細書に開示されている配列またはその一部の使用を含む。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」、Mullis、米国特許第4,683,202号)によって同定および単離される。目的のポリペプチドに対する抗体、受容体断片または他の特異的結合パートナーにより、発現ライブラリーをプローブ探索することができる。
びPasternak、Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA、ASM Press、Washington, D.C.、1994年;Itakuraら、Ann. Rev. Biochem.53巻:323~356頁、1984年;ならびにClimieら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87巻:633~637頁、1990年を参照されたい。
Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989年およびAusubelら編、Current Protocols in Molecular
Biology、Green and Wiley and Sons、NY、1993年によって開示されている。
456頁、1973年)、エレクトロポレーション(Neumannら、EMBO J.1巻:841
~845頁、1982年)、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション(Ausubelら、上記参照)およびリポソーム媒介性トランスフェクション(Hawley-Nelsonら、Focus 15巻:73頁、1993年;Ciccaroneら、Focus 15巻:80頁、1993年
)を含む。培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、Levinsonら、米国特許第4,713,339号;Hagenら、米国特許第4,784,950号;Palmiterら、米国特許第4,579,821号;およびRingold、米国特許第4,656,134号によって開示されている。適した培養哺乳動物細胞は、COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573;Grahamら、J. Gen. Virol.36巻:59~72頁、1977年)およびチャイニーズハムスター卵巣(例えば、CHO-K1、ATCC No.CCL 61;CHO-DG44、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77巻:4216~4220頁、1980年)細胞株を含む。追加的な適した細胞株は、本技術分野で公知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Manassas、Virginia等の公共の寄託機関から入手できる。SV-40、サイトメガロウイルスまたは骨髄増殖性肉腫ウイルス由来のプロモーター等、強い転写プロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第4,956,288号および米国特許出願公開第20030103986号を参照されたい。他の適したプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター(米国特許第4,579,821号および同第4,601,978号)およびアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターは、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、10801 University Blvd.、Manassas、VA USAにそれぞれ受託番号98669、98668およびPTA-5266で寄託された、pZP-1、pZP-9およびpZMP21、ならびにこれらのベクターの誘導体を含む。
5年を参照されたい。本技術分野で公知の技法を使用して、ポリペプチド融合体をコードする移入ベクターをE.coli宿主細胞へと形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミドに関して細胞をスクリーニングする。共通技法を使用して、組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドDNAを単離し、Sf9細胞等、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクトに使用する。ポリペプチド融合体を発現する組換えウイルスがその後に産生される。本技術分野で一般的に使用される方法によって、組換えウイルスストックを作製する。
、1986年;Cregg、米国特許第4,882,279号;およびRaymondら、Yeast 1
4巻:11~23頁、1998年を参照されたい。Aspergillus細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用することができる。Acremonium chrysogenumを形質転換するための方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号によって開示されている。Neurosporaを形質転換するための方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号によって開示されてい
る。Pichia methanolicaにおける組換えタンパク質の産生は、米国特許第5,716,808号;同第5,736,383号;同第5,854,039号;および同第5,888,768号に開示されている。
年を参照されたい。
びScopes、Protein Purification: Principles and Practice、Springer-Verlag、New York、1994年を参照されたい。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを含むタンパ
ク質は、固定化されたプロテインAにおける親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ゲル濾過等、追加的な精製ステップを使用して、所望のレベルの純度を得ることができる、または脱塩、バッファー交換その他をもたらすことができる。
、使用した金属イオンに応じて異なる親和性でこのマトリックスに吸着され、競合的溶出、pHの低下または強いキレート剤の使用によって溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を含む(例えば、M. Deutscher(編)、Meth. Enzymol.182巻:529頁、1990年を参照)。本発明の追加的な実施形態内で、目的のポリペプチドおよび親和性タグ(例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン)の融合体を構築して、精製を容易にすることができる。さらに、融合ポリペプチドまたはその二量体の受容体またはリガンド結合特性は、精製に活用することができる。例えば、Aβ結合ポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドは、親和性クロマトグラフィーを使用することにより単離することができ、それによると、標準クロマトグラフィー方法を使用して、アミロイドベータ(Aβ)ペプチドがカラムに結合され、融合ポリペプチドが結合され、その後に溶出される。
IV.使用方法および医薬組成物
MS)および再発寛解型MS(RRMS)を含む)等、炎症性疾患である。
膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリリウム症および特発性肺線維症から選択される。一部の変種では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、乾癬、シェーグレン症候群、1型糖尿病、抗リン脂質症候群および自己免疫性血管炎から選択される。
口唇または唾液腺のがん);肺がん(例えば、非小細胞肺がん、小細胞癌または中皮腫(mesothelimia));胃腸管がん(例えば、結腸直腸がん、胃がん、食道がんまたは肛門がん);消化管間質腫瘍(GIST);膵臓腺癌;膵腺房細胞癌;小腸のがん;肝臓または胆樹のがん(例えば、肝臓細胞腺腫、肝細胞癌、血管肉腫、肝外または肝内胆管肉腫(cholangiosarcoma)、ファーター膨大部のがん、または胆嚢がん);乳がん(例えば、転移性乳がんまたは炎症性乳がん);婦人科がん(例えば、子宮頸部がん、卵巣がん、卵管がん、腹膜癌、腟がん、外陰部がん、妊娠性トロホブラスト腫瘍、または子宮内膜がんもしくは子宮肉腫を含む子宮がん);尿路のがん(例えば、前立腺がん;膀胱がん;陰茎がん;尿道がん、または例えば、腎細胞癌もしくは移行細胞癌等の腎臓がん、これは腎盂および尿管を含む);精巣がん;頭蓋内腫瘍(例えば、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、退形成乏突起膠腫、上衣腫、原発性CNSリンパ腫、髄芽腫、胚細胞腫瘍、松果体新生物、髄膜腫、下垂体腫瘍、神経鞘の腫瘍(例えば、シュワン腫)、脊索腫、頭蓋咽頭腫、脈絡叢(chloroid plexus)腫瘍(例えば、脈絡叢癌);または神経細胞もしくはグリア起源の他の頭蓋内腫瘍)または脊髄の腫瘍(例えば、シュワン腫、髄膜腫)等、中枢神経系(CNS)のがん;内分泌新生物(例えば、甲状腺癌、髄様がんもしくは甲状腺リンパ腫等、例えば、甲状腺がん;例えば、インスリノーマもしくはグルカゴノーマ等、膵内分泌腫瘍;例えば、褐色細胞腫等、副腎癌;カルチノイド腫瘍;または副甲状腺癌);皮膚がん(例えば、扁平上皮癌;基底細胞癌;カポジ肉腫;または例えば、眼球内メラノーマ等の悪性メラノーマ);骨がん(例えば、骨肉腫、骨軟骨腫またはユーイング肉腫等、例えば、骨の肉腫);多発性骨髄腫;緑色腫;軟部組織肉腫(例えば、線維性腫瘍または線維組織球腫瘍);平滑筋または骨格筋の腫瘍;血管またはリンパ管の管周囲腫瘍(例えば、カポジ肉腫);滑膜腫瘍;中皮腫瘍;神経腫瘍;傍神経節腫瘍;骨外性軟骨性または骨様腫瘍;および多能性間葉系腫瘍。一部のこのような実施形態では、本明細書に記載されているApoA-1融合分子は、例えば、非ApoA1媒介性免疫調節療法(例えば、免疫チェックポイント阻害剤を含む治療法)、放射線療法または化学療法を含む併用療法等、併用療法の別個の治療法の1つとして、がん患者に投与される。
む。
、第19版、1995年)を参照されたい。製剤は、1種または複数の賦形剤、保存料、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面におけるタンパク質損失を予防するためのアルブミン等をさらに含むことができる。
Vasc Biol 34巻:543~551頁、2014年。
16年を参照されたい。B16メラノーマモデルは、チェックポイント阻害剤の抗CTLA-4、抗PD-1およびこれらの組合せにより大規模に研究された。抗CTLA-4単独は、GM-CSF形質導入腫瘍ワクチンと組み合わせたまたは抗PD-1と組み合わせた場合においてのみ、このモデルにおいて強力な治療効果を有する。Weber、Semin. Oncol.37巻:430~439頁、2010年;Aiら、Cancer Immunol. Immunother.64巻:885~92頁、2015年;Haanenら、Prog. Tumor Res.42巻:55~66頁、2015年を参照されたい。悪性メラノーマの処置のためのApoA-1融合分子の有効性は、例えば、触知できる皮下腫瘍小結節を形成したB16メラノーママウスへの投与後に、遅くなった腫瘍成長によって示される。ApoA-1融合分子の有効性は、単独で、あるいは、別の抗がん治療法(例えば、腫瘍ワクチンありもしくはなし、または抗PD-1/PD-L1ありもしくはなしの、抗CTLA-4)と組み合わせて、B16メラノーママウスにおいて評定することができる。例えば、腫瘍ワクチンの非存在下における、本明細書に記載されているApoA-1融合分子および抗CTLA-4の組合せを使用した、B16メラノーママウスにおける腫瘍拒絶は、ApoA-1治療法を使用した、抗CTLA-4に対する応答増強を実証する。マウスにおいて機能的に活性を有するが、これらのモデルにおいて免疫原性であることが予想される(これにより、7~10日後に中和抗体の形成をもたらす可能性がある)、ヒトタンパク質配列を含むApoA-1融合分子を評定するための例示的な研究において、マウスに、本発明の融合分子を短い期間(例えば、1週間、例えば、3日間あけた2用量の約40mg/kgで投与される)投与することができ、次に、典型的には、融合分子による注射後2~3週間、腫瘍成長をモニターすることができる。
995年);Bremerら「Protein Delivery with Infusion Pumps」Protein Delivery: Physical Systems内239~254頁(SandersおよびHendren編、Plenum Press 1997年);Yeweyら「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」、Protein Delivery: Physical Systems内93~117頁(SandersおよびHendren編、Plenum Press 1997年)を参照されたい。他の固体形態は、クリーム、ペースト、他の位相幾何学的適用その他を含む。
(RanadeおよびHollinger編、CRC Press 1995年);RoskosおよびMaskiewicz「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」、Protein Delivery: Physical Systems内45~92頁(SandersおよびHendren編、Plenum Press 1997年);Bartusら、Science 281巻:1161頁、1998年;PutneyおよびBurke、Nature Biotechnology 16巻:153頁、1998年;Putney、Curr. Opin. Chem. Biol.2巻:548頁、1998年を参照されたい。ポリエチレングリコール(PEG)コーティングされたナノスフェアは、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体を提供することもできる。例えば、Grefら、Pharm. Biotechnol.10巻:167
頁、1997年を参照されたい。
分子設計および調製:2種のApoA-1-Fc cDNA構築物を設計し、合成し、COS7細胞の一過的トランスフェクションによって発現させ、次に、発現されたタンパク質をプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。一方の構築物は、配列番号1に示すヌクレオチド配列を有し、配列番号2の融合ポリペプチドをコードし、本明細書において、ApoA-1(26)FcまたはTHER4とも称される。この構築物は、ヒトApoA-1(配列番号2の残基1~267)のC末端側の末端とヒトγ1 Fcバリアント(配列番号2の残基294~525)の間に、26アミノ酸リンカー(配列番号2の残基268~293)をコードするDNAセグメントを含有した。哺乳動物細胞における発現および分泌性シグナルペプチド(残基1~18)の切断、およびプロペプチド(残基19~24)の任意の潜在的な切断後に、この融合ポリペプチドは、配列番号2の残基19~525、19~524、25~525もしくは25~524(Fc領域のC末端リシンは、Fc含有タンパク質の産生において高頻度で切断されることが公知である)に対応する予測されるアミノ酸配列を有した。他方の構築物は、ApoA-1(26)Fc構築物と同一のApoA-1およびFc領域を含有したが、ヒトApoA-1とFc領域の間に(gly4ser)リンカーを欠いた;この構築物は、本明細書において、ApoA-1(2)Fc(Theripion)またはTHER0((gly4ser)反復単位なしのため)とも称される。この構築物は、ApoA-1領域とヒトIgG1のヒンジ領域の間の重複する制限部位の挿入により、2アミノ酸リンカーを含有した。
itroコレステロール流出アッセイを行った。処理24時間前に、細胞コレステロールを標識するためにH3-コレステロールを成長培地に添加し、10nMミフェプリストンを16~20時間使用して、ABCA1が誘導される。融合タンパク質ありまたはなしで細胞を2時間37℃でインキュベートし、氷上で冷却し、培地および細胞を分離して、放射標識されたコレステロールを測定することにより、コレステロール流出を測定した。野生型ヒトApoA-1タンパク質を陽性対照として使用した。ApoA-1とFc領域の間にいかなるリンカーも含まずFcへと直接的に連結された、市販のApoA-1-Fcタンパク質(APOA1組換えヒトタンパク質、hIgG1-Fcタグ;Sino Biological,Inc.)も検査し、これは本明細書において、ApoA-1(0)Fc(Sino Biol)と称される。このアッセイの結果を図1に示す。コレステロール流出は、2アミノ酸リンカーを有するApoA-1-Fc(ApoA-1(2)Fc(Theripion))またはリンカーなしのApoA-1-Fc(ApoA-1(0)Fc(Sino Biol))のいずれかと比較して、26アミノ酸リンカーを有するApoA-1-Fc(ApoA-1(26)Fc)を含有する培養物において増加した。ApoA-1(26)Fcは、また、野生型ヒトApoA-1(対照ApoA-1)と同様の活性を有した。
(実施例2)
融合構築物の生成および配列検証
pdgF-2:5’-ggttttggcagtacatcaatgg-3’(配列番号16);
pdgR-2:5’-ctattgtcttcccaatcctccc-3’(配列番号17);
higgras:5’-accttgcacttgtactcctt-3’(配列番号18)。
(実施例3)
一過的HEK 293Tトランスフェクション系における融合タンパク質の発現
Technologies/ThermoFisher、Grand Island、NY)を使用して、タンパク質をニトロセルロースに30ボルトで1時間転写した。5%脱脂乳を含有するPBSにおいてブロットを一晩4℃でブロッキングした。西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch、カタログ#109-036-098、Lot#122301)の1:250,000×希釈物と共にブロットをインキュベートした。ブロットを30分間に3回、それぞれPBS/0.05% Tween 20において洗浄し、ThermoScientific ECL試薬(カタログ#32106)において1分間発色させた。ブロットをオートラジオグラフフィルムに、ブロットに応じて30秒間~2分間露光させた。図3は、代表的293T一過的トランスフェクション由来の培養上清のウエスタンブロット解析を示す。陽性および陰性対照(それぞれCD40IgGおよび偽トランスフェクション/DNAなし)を各トランスフェクションシリーズに含めた。トランスフェクトされた試料は、図3に示されている通りである;左から右に、レーンは次の通りである:レーン#1 - 偽トランスフェクション;レーン#2 - CD40IgG;レーン#3 - MWマーカー;レーン#4 - THER0;レーン#5 - THER2;レーン#6
- THER4;レーン#7 - THER6;レーン#8 - MWマーカー;レーン#9 - THER4RNA2。
(実施例4)
安定したCHO細胞株におけるTHERmthIgGおよびマルチサブユニットIg融合構築物および融合タンパク質の発現
融合タンパク質を発現する安定した細胞株のトランスフェクションおよび選択
Technologies、Grand Island、NY)を含有した。キャパシタンスエクステンダを備えるBioRad(Hercules、CA)GENEPULSER(登録商標)エレクトロポレーションユニットを使用して、280ボルト、950マイクロファラッドでエレクトロポレーションを行った。0.4cmギャップ無菌使い捨てキュベットにおいてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、培養物をT75フラスコ内の非選択的EX-CELL 302完全培地に移す前に、エレクトロポレーションされた細胞を5分間インキュベートした。
、その後、1ml培地を含有する24ウェルディッシュへとクローンを増大させた。24ウェルプレートにおいて細胞を移し増大させる前に、本来の96ウェルプレート由来の培養上清のアリコートを第2の96ウェルプレートに採取した。IgG濃度を推定するためのELISA解析まで、この第2のプレートを凍結した。
組換え融合タンパク質の産生レベルに関する培養上清のスクリーニング
F(ab’2)ヤギ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch、West Grove、PA;カタログ#109-006-098)で4℃にて一晩コーティングした。プレートをPBS/3%BSAにおいてブロッキングし、培養上清の系列希釈物を室温で2~3時間または一晩4℃でインキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween 20において3回洗浄し、PBS/0.5% BSAにおける1:7500~1:10,000の西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートF(ab’2)ヤギ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch、West Grove、PA、カタログ#109-036-098)と共に1~2時間、室温でインキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween 20において5回洗浄し、SUREBLUE RESERVE(商標)TMB基質(KPL Labs、Gaithersburg、MD;カタログ#53-00-02)により結合を検出した。等容量の1N HClの添加により反応を停止し、各プレートにおけるウェル当たりの吸光度を、SYNERGY(商標)HTプレートリーダー(Biotek、Winooski、VT)において450nMで読み取った。培養上清の希釈物のOD450を、公知標準である、THERクローンと同一のIg尾部を有するプロテインA精製されたヒトIgG融合タンパク質の系列希釈を使用して作成された検量線と比較することにより、濃度を推定した。データを収集し、GEN5(商標)ソフトウェア(Biotek、Winooski、VT)およびMicrosoft Office EXCEL(登録商標)表計算ソフトウェアを使用して解析した。
302完全培地は、増加した濃度のメトトレキセートを含有した。選択的増幅下でのトランスフェクションのための培地は、達成された増幅の程度に応じて、50nM~1μMに及ぶ変動レベルのメトトレキセート(Sigma-Aldrich)を選択的薬剤として含有した。
培養上清からの融合タンパク質の精製
V)(カタログ#G2006、Associates of Cape Cod、East Falmouth、MA)を使用して、内毒素混入に関してアリコートを検査した。VECTOR NTI(登録商標)バージョン11.5ソフトウェアパッケージ(Informax、North Bethesda、MD)内のタンパク質解析ツールおよびオンラインExPASyタンパク質解析ツール由来の予測される切断部位を使用して、THER4融合タンパク質の1mg/ml溶液の予測されるOD280は、1.19(シグナルペプチドまたは6アミノ酸プロペプチドのいずれかを含まない成熟タンパク質)または1.27(6アミノ酸プロペプチドを含む)と決定された。CHO細胞から分泌される融合タンパク質が、組換え分子からのプロペプチドの完全切断に関して均一であるかは不明である。これらのツールを使用して、精製された融合タンパク質毎のOD280を補正した。
apo A-1 Ig融合タンパク質の還元および非還元SDS-PAGE解析
THER0;レーン#3 - THER2;レーン#4 - THER4;レーン#5
- THER6;レーン#6 - THER4RNA2;レーン#7 - KALEIDOSCOPE着色済みMWマーカー。およその分子量を図面に示す。
apo A-1 IgG融合タンパク質のネイティブゲル電気泳動
(実施例5)
THER Apo A-1融合タンパク質の結合を評価するためのIgG/Apo A-1サンドイッチELISAの使用
(実施例6)
RNase二機能性酵素脂質輸送融合分子の発現および検査
(実施例7)
融合タンパク質アクセプターへのコレステロール流出の測定
巻:2332~2340頁、2011年)およびZhangら(ASSAY and Drug Development Technologies:136~146頁、2011年)に概要を述べる手順からプロトコールを適応させた。細胞を採取し、33ng/ml PMAを含有する100μl RPMI培地において2×106細胞/mlまたは2×105細胞/ウェルとなるよう96ウェル平底組織培養プレートに蒔いた。細胞を培養に36~48時間維持して、アッセイに先立ち分化を起こさせた。培養培地を吸引し、プレートを1×PBSにおいて洗浄した。次の成分(培地サプリメントを含有するフェノールレッド不含RPMI、0.2% FBSとACAT阻害剤2μg/ml、Sandoz 58-035(Sigma-Aldrich、St.Louis MO)、LXRアゴニストTO-901317、2.5μM(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、35ng/ml PMA(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)および1.25mMメチルベータ-シクロデキストリン(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、50uMコレステロール(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)および25μM TOPFLUORコレステロール(Avanti Polar Lipids、Alabaster、AL))からなる標識培地を100μl/ウェルの容量で添加し、37℃、5%CO2にて10~12時間インキュベートした。平衡化培地、RPMI完全と10%FBS、33ng/ml PMA(100ul/ウェル)を各ウェルに添加し、8時間インキュベートし、その後、アクセプターとのインキュベーションを行った。標識/平衡化培地をプレートから吸引し、プレートを200μl/ウェルPBS+0.15%
BSAで2回洗浄した。流出アクセプター試薬を流出バッファー中、個々のウェルに添加し、アッセイに先立ち2時間インキュベートした。アクセプターを、アッセイに応じて100nM~500nMに及ぶ濃度で流出バッファーに添加した。流出バッファーは、成長サプリメントおよび0.15% BSAを含有するフェノールレッド不含RPMIであった。試料を条件/アクセプター当たり6~12のセットにおいて実行し、最小で5回の複製を統計解析に使用した。APO A-1を陽性対照として実行し、流出培地単独をバックグラウンド陰性対照(ベースライン流出)として使用した。流出反応を2時間進め、その後、培養培地を黒色平底96ウェルプレート(培地読み取り値)に採取した。流出プレートの各ウェルへの100ulの0.1N NaOHの添加と、4℃のプレート振盪機における15分間インキュベーションによって、細胞ライセートを調製した。細胞ライセートを黒色96ウェルプレート(ライセート読み取り値)に移し、励起485nmおよび発光528nmによるSYNERGY(商標)HTプレートリーダーを使用して、培地およびライセート試料の蛍光を測定した。蛍光測定値の比として流出を計算した:(培地/(培地+ライセート)×100)。被験アクセプター毎に、総流出/試料からアクセプターが存在しない試料のベースライン読み取り値を減算することにより、特異的流出を計算した。GraphPad Prism v4.0ソフトウェア(San Diego、CA)を使用して、データ解析を行った。アッセイ結果を図11に示す。
頁、2004年)によって記載されているコレステロールの放射性誘導体である[3H]-コレステロールを使用して、コレステロール逆転送(RCT)を評価した。簡潔に説明すると、5% FBS、ACAT阻害剤Sandoz 58-035(2μg/ml)および4μCi/mlの[3H]-コレステロールを補充した0.25mlのRPMI培地において、J774細胞(24ウェルプレートにおけるウェル当たり3.5×105個)を24時間インキュベートした。ACAT阻害剤は、アッセイにおいて全時点で存在した。アクセプターとのインキュベーションに先立ち、cAMP(0.3mM)ありまたはなしの培地において細胞を16~24時間平衡化した。cAMPの存在は、ABCA1分子を上方調節する。標識された細胞を、1% BSAを含有する培地において洗浄し、続いてアクセプター分子をMEM-HEPES培地において50、100および200nMで添加し、測定に先立ち4時間インキュベートした。全処理を3回行った。次に、100μlの培地における[3H]コレステロールを液体シンチレーションカウントによって測定した。パーセンテージ流出は、流出インキュベーション前の細胞(t0試料)に存在する総[3H]コレステロールに基づいた。細胞に存在する[3H]コレステロールを測定するために、イソプロパノール中で細胞単層を一晩インキュベートすることにより、細胞脂質を抽出した。脂質抽出後に、脂質抽出物中に存在する総[3H]コレステロールを液体シンチレーションカウントによって測定した。GraphPad Prismソフトウェア4.0(San Diego、CA)を使用してデータ解析を行った。アッセイ結果を図12に示す。
(実施例8)
PON1二機能性酵素脂質輸送融合分子の構築
PON1)に対応するセグメントを含有する。このアリールエステラーゼ酵素は、高密度リポタンパク質(HDL)と排他的に会合して、ヒト血清中に存在し、低密度リポタンパク質分子の酸化を阻害する。このような酸化からの保護は、血管性および冠血管疾患の発症も阻害する。PON1の成熟タンパク質型は、分泌後にそのアミノ末端シグナルペプチド(配列番号11のヌクレオチド残基1~45によってコードされる、配列番号12のアミノ酸残基1~15)を保持するという点において特有である。切断可能アミノ末端を有するPON1の突然変異体型の発現は、PON1が、先ずApoA-1に結合するのではなく直接的にリン脂質に結合することにより、そのアミノ末端を介してリポタンパク質と会合することを実証した。Sorensonら、Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 19巻:2214~2225頁、1999年を参照されたい。シグナル配列の除去は、リン脂質、プロテオリポソームおよび血清リポタンパク質へのPON1部分の結合を排除することが見出された。その上、リン脂質の非存在下において、野生型PON1は、ApoA-1に直接的に結合しない。Sorensonら、上記参照。このようなPON1シグナル配列突然変異体は、おそらく、最適なリン脂質基質に結合することができないことから、低下した酵素活性を示した。そうであるにもかかわらず、このシグナル配列を失っている、組換え活性型のヒトPON1が細菌において発現された。Stevensら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105巻:12780~12784頁、2008年を参照さ
れたい。ApoA-1の存在は、酵素のアリールエステラーゼ活性を安定化するものと思われる。
:1037~1043頁、2008年;Boadoら、Biotechnology and Bioengineering
108巻:186~196頁、2011年を参照);しかし、アミノ末端シグナルペプチドは、この融合タンパク質に含まれた。本明細書に記載されている融合遺伝子およびタンパク質は、apo A-1ドメインへのトランケートされた酵素の直接的物理的カップリングによりシグナルペプチドの必要性を排除し、これにより、PON1の結合機能およびアリールエステラーゼ活性の両方を保存および安定化する、PON1融合タンパク質発現の新規方法を提供する。
(実施例9)
PAFAHまたはCETP二機能性酵素脂質輸送融合分子の構築
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ApoA1-L1-Dを含む融合ポリペプチドであって、
ApoA1が、配列番号2のアミノ酸残基19~267または25~267と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む第1のポリペプチドセグメントであり、前記第1のポリペプチドセグメントが、コレステロール流出活性を有し、
L1が、第1のポリペプチドリンカーであり、
Dが、二量体形成ドメインである、
融合ポリペプチド。
(項目2)
L1が、少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、項目1に記載の融合ポリペプチド。
(項目3)
L1が、少なくとも16個のアミノ酸残基を含む、項目1に記載の融合ポリペプチド。(項目4)
L1が、2~60個のアミノ酸残基からなる、項目1に記載の融合ポリペプチド。
(項目5)
L1が、5~40個のアミノ酸残基からなる、項目1に記載の融合ポリペプチド。
(項目6)
L1が、15~40個のアミノ酸残基からなる、項目1に記載の融合ポリペプチド。
(項目7)
L1が、16~36個のアミノ酸残基からなる、項目1に記載の融合ポリペプチド。
(項目8)
L1が、16個のアミノ酸残基、21個のアミノ酸残基、26個のアミノ酸残基、31個のアミノ酸残基または36個のアミノ酸残基からなる、項目1に記載の融合ポリペプチド。
(項目9)
L1が、配列番号22の残基268~283、配列番号26の残基268~288、配列番号2の残基268~293、配列番号54、または配列番号24の残基268~303に示すアミノ酸配列を有する、項目8に記載の融合ポリペプチド。
(項目10)
前記第1のポリペプチドセグメントが、配列番号2の残基19~267または25~267に示すアミノ酸配列を有する、項目1~9のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目11)
Dが、免疫グロブリン重鎖定常領域である、項目1~10のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目12)
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンFc領域である、項目11に記載の融合ポリペプチド。
(項目13)
前記Fc領域が、ヒトFc領域である、項目12に記載の融合ポリペプチド。
(項目14)
前記ヒトFc領域が、野生型ヒト配列と比べて1個または複数のアミノ酸置換を含むFcバリアントである、項目13に記載の融合ポリペプチド。
(項目15)
前記Fc領域が、ヒトγ1 Fc領域またはヒトγ3 Fc領域である、項目13または14に記載の融合ポリペプチド。
(項目16)
前記Fc領域が、Eu残基C220がセリンによって置き換えられた、ヒトγ1 Fcバリアントである、項目14に記載の融合ポリペプチド。
(項目17)
Eu残基C226およびC229がそれぞれ、セリンによって置き換えられた、項目16に記載の融合ポリペプチド。
(項目18)
Eu残基P238が、セリンによって置き換えられた、項目17に記載の融合ポリペプチド。
(項目19)
前記Fc領域が、Eu残基P331がセリンによって置き換えられた、ヒトγ1 Fcバリアントである、項目15に記載の融合ポリペプチド。
(項目20)
Eu残基P331が、セリンによって置き換えられた、項目16~18のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目21)
前記Fcバリアントが、野生型ヒト配列と比べてグリコシル化を低下させるアミノ酸置換を含む、項目14および16~20のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目22)
Eu残基N297が、別のアミノ酸により置き換えられた、項目21に記載の融合ポリペプチド。
(項目23)
前記Fcバリアントが、Fc受容体に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、項目14および16~22のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目24)
前記Fcバリアントが、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIのうち少なくとも1種に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、項目23に記載の融合ポリペプチド。
(項目25)
Fcバリアントが、新生児Fc受容体(FcRn)に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、項目23または24に記載の融合ポリペプチド。
(項目26)
前記Fc領域が、(i)配列番号2の残基294~525もしくは294~524または(ii)配列番号13の残基294~525もしくは294~524に示すアミノ酸配列を有する、項目12に記載の融合ポリペプチド。
(項目27)
(i)配列番号2の残基19~525、19~524、25~525もしくは25~524、
(ii)配列番号13の残基19~525、19~524、25~525もしくは25~524、
(iii)配列番号20の残基19~501、19~500、25~501もしくは25~501、
(iv)配列番号22の残基19~515、19~514、25~515もしくは25~514、
(v)配列番号26の残基19~520、19~519、25~520もしくは25~519、または
(vi)配列番号24の残基19~535、19~534、25~535もしくは25~534
と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載の融合ポリペプチド。
(項目28)
(i)配列番号2の残基19~525、19~524、25~525もしくは25~524、
(ii)配列番号13の残基19~525、19~524、25~525もしくは25~524、
(iii)配列番号20の残基19~501、19~500、25~501もしくは25~501、
(iv)配列番号22の残基19~515、19~514、25~515もしくは25~514、
(v)配列番号26の残基19~520、19~519、25~520もしくは25~519、または
(vi)配列番号24の残基19~535、19~534、25~535もしくは25~534
に示すアミノ酸配列を含む、項目27に記載の融合ポリペプチド。
(項目29)
前記二量体形成ドメインに対しカルボキシル末端側に位置する第2のポリペプチドセグメントをさらに含む融合ポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドセグメントが、RNase、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびコレステロールエステル転送タンパク質からなる群から選択される、項目1~27のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目30)
アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ApoA1-L1-D-L2-Pを含む融合ポリペプチドであって、
ApoA1が、配列番号2のアミノ酸残基19~267または25~267と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む第1のポリペプチドセグメントであり、前記第1のポリペプチドセグメントが、コレステロール流出活性を有し、
L1が、第1のポリペプチドリンカーであり、
Dが、二量体形成ドメインであり、
L2が、第2のポリペプチドリンカーであり、L2が、任意選択で存在し、
Pが、RNase、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびコレステロールエステル転送タンパク質からなる群から選択される第2のポリペプチドセグメントである、
融合ポリペプチド。
(項目31)
L1が、少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、項目30に記載の融合ポリペプチド。(項目32)
L1が、少なくとも16個のアミノ酸残基を含む、項目30に記載の融合ポリペプチド。
(項目33)
L1が、2~60個のアミノ酸残基からなる、項目30に記載の融合ポリペプチド。
(項目34)
L1が、5~40個のアミノ酸残基からなる、項目30に記載の融合ポリペプチド。
(項目35)
L1が、15~40個のアミノ酸残基からなる、項目30に記載の融合ポリペプチド。
(項目36)
L1が、16~36個のアミノ酸残基からなる、項目30に記載の融合ポリペプチド。(項目37)
L1が、16個のアミノ酸残基、21個のアミノ酸残基、26個のアミノ酸残基、31個のアミノ酸残基または36個のアミノ酸残基からなる、項目30に記載の融合ポリペプチド。
(項目38)
L1が、配列番号22の残基268~283、配列番号26の残基268~288、配列番号2の残基268~293、配列番号54、または配列番号24の残基268~303に示すアミノ酸配列を有する、項目37に記載の融合ポリペプチド。
(項目39)
前記第1のポリペプチドセグメントが、配列番号2のアミノ酸残基19~267または25~267と少なくとも95%同一性を有する、項目30~38のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目40)
Dが、免疫グロブリン重鎖定常領域である、項目39に記載の融合ポリペプチド。
(項目41)
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンFc領域である、項目40に記載の融合ポリペプチド。
(項目42)
前記Fc領域が、ヒトFc領域である、項目41に記載の融合ポリペプチド。
(項目43)
前記ヒトFc領域が、野生型ヒト配列と比べて1個または複数のアミノ酸置換を含むFcバリアントである、項目42に記載の融合ポリペプチド。
(項目44)
前記Fc領域が、ヒトγ1 Fc領域またはヒトγ3 Fc領域である、項目42または43に記載の融合ポリペプチド。
(項目45)
前記Fc領域が、Eu残基C220がセリンによって置き換えられた、ヒトγ1 Fcバリアントである、項目43に記載の融合ポリペプチド。
(項目46)
Eu残基C226およびC229がそれぞれ、セリンによって置き換えられた、項目45に記載の融合ポリペプチド。
(項目47)
Eu残基P238が、セリンによって置き換えられた、項目46に記載の融合ポリペプチド。
(項目48)
前記Fc領域が、Eu残基P331がセリンによって置き換えられた、ヒトγ1 Fcバリアントである、項目44に記載の融合ポリペプチド。
(項目49)
Eu残基P331が、セリンによって置き換えられた、項目45~47のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目50)
前記Fcバリアントが、野生型ヒト配列と比べてグリコシル化を低下させるアミノ酸置換を含む、項目41および43~49のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目51)
Eu残基N297が、別のアミノ酸により置き換えられた、項目50に記載の融合ポリペプチド。
(項目52)
前記Fcバリアントが、Fc受容体に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、項目41および43~51のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目53)
前記Fcバリアントが、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIのうち少なくとも1種に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、項目52に記載の融合ポリペプチド。
(項目54)
Fcバリアントが、新生児Fc受容体(FcRn)に対する結合親和性を増加または低下させるアミノ酸置換を含む、項目52または53に記載の融合ポリペプチド。
(項目55)
前記Fc領域が、配列番号2の残基294~525または配列番号13の残基294~525に示すアミノ酸配列を有する、項目41に記載の融合ポリペプチド。
(項目56)
L2が、存在し、配列番号4の残基526~541に示すアミノ酸配列を有する、項目30~55のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目57)
配列番号2のアミノ酸残基19~267または25~267と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む第1のポリペプチドセグメントであって、コレステロール流出活性を有する第1のポリペプチドセグメントと、
前記第1のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置する第2のポリペプチドセグメントであって、RNase、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびコレステロールエステル転送タンパク質からなる群から選択される第2のポリペプチドセグメントと
を含む融合ポリペプチド。
(項目58)
前記第1のポリペプチドセグメントが、配列番号2の残基19~267または25~267に示すアミノ酸配列を有する、項目57に記載の融合ポリペプチド。
(項目59)
前記第1のポリペプチドセグメントに対しカルボキシル末端側に位置し、前記第2のポリペプチドセグメントに対しアミノ末端側に位置するリンカーポリペプチドをさらに含む、項目57または58に記載の融合ポリペプチド。
(項目60)
前記第2のポリペプチドセグメントが、RNaseである、項目29~59のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目61)
前記RNaseが、配列番号4のアミノ酸残基542~675と少なくとも95%同一性を有する、項目60に記載の融合ポリペプチド。
(項目62)
前記RNaseが、配列番号4の残基542~675に示すアミノ酸配列を有する、項目61に記載の融合ポリペプチド。
(項目63)
(i)配列番号4の残基19~675もしくは25~675、または
(ii)配列番号14の残基19~675もしくは25~675
と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目60に記載の融合ポリペプチド。
(項目64)
(i)配列番号4の残基19~675もしくは25~675、または
(ii)配列番号14の残基19~675もしくは25~675
に示すアミノ酸配列を含む、項目63に記載の融合ポリペプチド。
(項目65)
前記第2のポリペプチドセグメントが、パラオキソナーゼ(paraxonase)である、項目29~59のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目66)
前記パラオキソナーゼが、配列番号12のアミノ酸残基16~355、配列番号42のアミノ酸残基16~355または配列番号44のアミノ酸残基16~355と少なくとも95%同一性を有する、項目65に記載の融合ポリペプチド。
(項目67)
前記パラオキソナーゼが、配列番号12の残基16~355、配列番号42の残基16~355または配列番号44の残基16~355に示すアミノ酸配列を有する、項目66に記載の融合ポリペプチド。
(項目68)
(i)配列番号28の残基19~883もしくは25~883、
(ii)配列番号38の残基19~873もしくは25~873、
(iii)配列番号46の残基19~883もしくは25~883、または
(iv)配列番号48の残基19~883もしくは25~883
と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目65に記載の融合ポリペプチド。
(項目69)
(i)配列番号28の残基19~883もしくは25~883、
(ii)配列番号38の残基19~873もしくは25~873、
(iii)配列番号46の残基19~883もしくは25~883、または
(iv)配列番号48の残基19~883もしくは25~883
に示すアミノ酸配列を含む、項目68に記載の融合ポリペプチド。
(項目70)
前記第2のポリペプチドセグメントが、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼである、項目29~59のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目71)
前記血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼが、配列番号32のアミノ酸残基22~441と少なくとも95%同一性を有する、項目70に記載の融合ポリペプチド。
(項目72)
前記血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼが、配列番号32の残基22~441に示すアミノ酸配列を有する、項目71に記載の融合ポリペプチド。
(項目73)
配列番号34の残基19~963または25~963と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目70に記載の融合ポリペプチド。
(項目74)
配列番号34の残基19~963または25~963に示すアミノ酸配列を含む、項目73に記載の融合ポリペプチド。
(項目75)
前記第2のポリペプチドセグメントが、コレステロールエステル転送タンパク質である、項目29~59のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目76)
前記コレステロールエステル転送タンパク質が、配列番号30のアミノ酸残基18~493と少なくとも95%同一性を有する、項目75に記載の融合ポリペプチド。
(項目77)
前記コレステロールエステル転送タンパク質が、配列番号30の残基18~493に示すアミノ酸配列を有する、項目76に記載の融合ポリペプチド。
(項目78)
配列番号40の残基19~1019または25~1019と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目75に記載の融合ポリペプチド。
(項目79)
配列番号40の残基19~1019または25~1019に示すアミノ酸配列を含む、項目78に記載の融合ポリペプチド。
(項目80)
二量体形成ドメインをさらに含む、項目57~62、65~67、70~72および75~77のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目81)
ミエロペルオキシダーゼ(MPO)阻害剤に連結された、項目1~80のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目82)
ミエロペルオキシダーゼ(MPO)阻害剤に連結された、項目1~56、63、64および80のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目83)
第1の融合ポリペプチドおよび第2の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、前記第1および第2の融合ポリペプチドのそれぞれが、項目1~56、63、64および80のいずれか一項に規定されている融合ポリペプチドである、二量体タンパク質。
(項目84)
第1の融合ポリペプチドおよび第2の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、前記第1および第2の融合ポリペプチドのそれぞれが、項目82に規定されている融合ポリペプチドである、二量体タンパク質。
(項目85)
項目1~80のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(項目86)
次に挙げる作動可能に連結されたエレメント、
転写プロモーター、
項目1~80のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするDNAセグメント、および
転写ターミネーター
を含む発現ベクター。
(項目87)
項目86に記載の発現ベクターが導入された培養細胞であって、前記DNAセグメントを発現する細胞。
(項目88)
融合ポリペプチドを作製する方法であって、
項目86に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が、前記DNAセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが、産生されるステップと、
前記融合ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。
(項目89)
二量体タンパク質を作製する方法であって、
項目86に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が、前記DNAセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが、二量体タンパク質として産生されるステップと、
前記二量体タンパク質を回収するステップと
を含む方法。
(項目90)
項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。
(項目91)
項目83または84に記載の二量体タンパク質と、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。
(項目92)
粥状動脈硬化によって特徴付けられる心血管疾患を処置するための方法であって、
前記心血管疾患を有する対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目93)
前記心血管疾患が、冠動脈心疾患および脳卒中からなる群から選択される、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記冠動脈心疾患が、急性冠症候群によって特徴付けられる、項目93に記載の方法。(項目95)
神経変性疾患を処置するための方法であって、
前記神経変性疾患を有する対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目96)
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病および多発性硬化症からなる群から選択される、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記神経変性疾患が、認知症によって特徴付けられる、項目95に記載の方法。
(項目98)
アミロイド沈着物によって特徴付けられる疾患を処置するための方法であって、
アミロイド沈着物によって特徴付けられる前記疾患を有する対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目99)
前記疾患が、アルツハイマー病である、項目95、97および98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
自己免疫性疾患を処置するための方法であって、
前記自己免疫性疾患を有する対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目101)
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および1型糖尿病からなる群から選択される、項目100に記載の方法。
(項目102)
炎症性疾患を処置するための方法であって、
前記炎症性疾患を有する対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目103)
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、1型糖尿病、2型糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎、冠動脈心疾患および脳卒中からなる群から選択される、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記炎症性疾患が、炎症性肺疾患である、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記炎症性肺疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気管支拡張症、特発性肺線維症、過酸素症、低酸素症および急性呼吸促迫症候群からなる群から選択される、項目104に記載の方法。
(項目106)
感染性疾患を処置するための方法であって、
前記感染性疾患を有する対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目107)
前記感染性疾患が、細菌感染によって特徴付けられる、項目106に記載の方法。
(項目108)
硫黄マスタードガスまたは有機リン酸エステルへの曝露を処置するための方法であって、
前記硫黄マスタードガスまたは前記有機リン酸エステルに曝露された対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目109)
がんを処置するための方法であって、
がんを有する対象に、項目1~82のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは項目83もしくは84に記載の二量体融合タンパク質の有効量を投与するステップ
を含む方法。
(項目110)
前記がんが、悪性メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺がん、膀胱がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記がん処置が、併用療法である、項目109または110に記載の方法。
(項目112)
前記併用療法が、非ApoA1媒介性免疫調節療法を含む、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記非ApoA1媒介性免疫調節療法が、抗PD-1/PD-L1治療法、抗CTLA-4治療法またはその両方を含む、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記併用療法が、放射線療法を含む、項目111に記載の方法。
(項目115)
前記併用療法が、化学療法を含む、項目111に記載の方法。
(項目116)
前記併用療法が、標的化療法を含む、項目111に記載の方法。
Claims (21)
- アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、ApoA1-L1-Dを含む融合ポリペプチドであって、
ApoA1が、配列番号2のアミノ酸残基25~267と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む第1のポリペプチドセグメントであり、前記第1のポリペプチドセグメントが、コレステロール流出活性を有し、
L1が、10~36個のアミノ酸残基からなる第1のポリペプチドリンカーであり、
Dが、免疫グロブリンFc領域であり、前記Fc領域が、ヒトIgG重鎖定常領域のためのEUナンバリングにしたがってC220、C226、及びC229がそれぞれセリンによって置き換えられたヒトγ1 Fc領域であり、
前記融合ポリペプチドが、L1が2つのアミノ酸残基からなるリンカーであるApoA1-L1-D融合ポリペプチド、またはL1が存在しないApoA1-L1-D融合ポリペプチドと比較して増加したコレステロール流出活性を有し、
L1が10~36個のアミノ酸残基からなる第1のポリペプチドリンカーである前記融合ポリペプチドが、RNaseおよびパラオキソナーゼからなる群から選択される第2のポリペプチドセグメントを含まない、
融合ポリペプチド。 - L1が、16~36個のアミノ酸残基からなる、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- L1が、配列[配列番号15]nを含み、nが2~6の正の整数である、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- L1が、16個のアミノ酸残基、21個のアミノ酸残基、26個のアミノ酸残基、31個のアミノ酸残基、または36個のアミノ酸残基からなる、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- L1が、配列番号22の残基268~283、配列番号26の残基268~288、配列番号2の残基268~293、配列番号54、または配列番号24の残基268~303に示すアミノ酸配列を有する、請求項4に記載の融合ポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチドセグメントが、配列番号2の残基25~267に示すアミノ酸配列を有する、請求項1~5のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- ヒトIgG重鎖定常領域のためのEUナンバリングにしたがって残基P238が、セリンによって置き換えられた、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- ヒトIgG重鎖定常領域のためのEUナンバリングにしたがって残基P331がセリンによって置き換えられた、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- ヒトIgG重鎖定常領域のためのEUナンバリングにしたがって残基P331が、セリンによって置き換えられた、請求項7に記載の融合ポリペプチド。
- 前記Fc領域が、(i)配列番号2の残基294~525もしくは294~524、または(ii)配列番号13の残基294~525もしくは294~524に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 前記融合ポリペプチドが、
(i)配列番号2の残基25~525もしくは25~524
(ii)配列番号13の残基25~525もしくは25~524、
(iii)配列番号22の残基25~515もしくは25~514、
(iv)配列番号26の残基25~520もしくは25~519、または
(v)配列番号24の残基25~535もしくは25~534
と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合ポリペプチド。 - 前記融合ポリペプチドが、
(i)配列番号2の残基25~525もしくは25~524
(ii)配列番号13の残基25~525もしくは25~524、
(iii)配列番号22の残基25~515もしくは25~514、
(iv)配列番号26の残基25~520もしくは25~519、または
(v)配列番号24の残基25~535もしくは25~534
に示すアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の融合ポリペプチド。 - ミエロペルオキシダーゼ(MPO)阻害剤に連結された、請求項1~12のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 第1の融合ポリペプチドおよび第2の融合ポリペプチドを含む二量体タンパク質であって、前記第1および第2の融合ポリペプチドのそれぞれが、請求項1~13のいずれか一項に規定されている融合ポリペプチドである、二量体タンパク質。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 次に挙げる作動可能に連結されたエレメント、
転写プロモーター、
請求項1~12のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするDNAセグメント、および
転写ターミネーター
を含む発現ベクター。 - 請求項16に記載の発現ベクターが導入された培養細胞であって、前記DNAセグメントを発現する細胞。
- 融合ポリペプチドを作製する方法であって、
請求項16に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が前記DNAセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが産生されるステップと、
前記融合ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。 - 二量体タンパク質を作製する方法であって、
請求項16に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が前記DNAセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが二量体タンパク質として産生されるステップと、
前記二量体タンパク質を回収するステップと
を含む方法。 - 請求項1~13のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。 - 請求項14に記載の二量体タンパク質と、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。
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