JP2003514552A - 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態 - Google Patents

改善された性質を有するエリトロポエチンの形態

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｉｇ分子のＦｃ部分およびエリトロポエチン（ＥＰＯ）の生物学的活性を有する標的分子を含んでなる融合蛋白質などの、新規な改変されたＥＰＯの形態に関する。該エリトロポエチン部分ならびに免疫グロブリン部分のアミノ酸配列、およびエリトロポエチンのグリコシレーション・パターンを選択的に変えることにより、高められた生物学的活性を具える融合蛋白質を得ることができる。本発明は。ヒトまたは動物ＥＰＯとは相違するシステインまたはジスルフィド結合のパターンを有する新規な非融合ＥＰＯ分子にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、Ｉｇ分子のＦｃ部分およびエリトロポエチン（ＥＰＯ）の生物学的
活性を有する分子を含んでなる融合蛋白質などの、新規なエリトロポエチンの形
態に関する。該エリトロポエチン部分ならびに該免疫グロブリン部分のアミノ酸
配列および該エリトロポエチンのグリコシレーション・パターンを選択的に変更
することにより、改善された性質、例えば、高められた生物学的活性および安定
性を具えた融合蛋白質（Ｆｃ−ＥＰＯ）および非融合ＥＰＯを取得することがで
きる。さらに、エリトロポエチンおよび免疫グロブリン鎖の短縮された異形が用
いられている、融合蛋白質を提供することができる。本発明は、ヒトまたは動物
ＥＰＯとは異なるシステインならびにジスルフィド結合のパターンを有している
、新規な（非融合）ＥＰＯ分子にも関する。
【０００２】 （背景） エリスロポエシス、すなわち赤血球の生成は、細胞破壊の埋め合わせとして、
ヒトの生涯を通して、絶え間なく起きている。赤血球生成は、適正な組織への酸
素投与のための血液中の、利用可能な赤血球を十分な数ではあるが、血球が循環
を妨げるほどには多くならないことを可能とする、厳格に制御された生理学的メ
カニズムである。赤血球の成熟は、該ホルモン、エリトロポエチン（ＥＰＯ）の
制御下にある。
【０００３】 エリトロポエチンは、約３４，０００ダルトンの酸性糖蛋白質ホルモンである
。天然産のエリトロポエチンは、胎児期の間は肝臓によって、また低酸素症（貧
血による赤血球減少）に対する応答では腎臓によって産生され、そして、赤血球
の増殖、およびその同源の細胞性受容体細胞との相互作用を介した、赤血球への
分化を制御する。それは、成人の血流中の赤血球レベルを制御するために必要不
可欠であり、そして、骨髄中での赤血球の産生を刺激する。貧血は、腎臓のエリ
トロポエチン産生機能不全の帰結である。エリトロポエチンをコードする遺伝子
により形質転換された宿主細胞からの蛋白質産物の発現を含んでいる、遺伝子操
作技術によって生産された組換えエリトロポエチンは、慢性腎不全に因る貧血の
治療に使用する際、有効であることが見出されている。野生型、あるいは天然産
の、エリトロポエチンは、本明細書において、組換えエリトロポエチン（Ｊａｃ
ｏｂｓ，Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：８０６−８１３
（１９８５））、または血液（Ｍｉｙａｋｅ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５２：５５５８−５５６４ （１９７７））もし
くはヒツジ血漿（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ６８：６９７−６９８
（１９７１））から単離および精製がなされた天然産のエリトロポエチン、あ
るいは、当業者に周知の手法を用いて製造することができる、化学合成のエリト
ロポエチンを含むと定義される。ヒト・エリトロポエチンは、自然には単量体と
して存在する、１６６アミノ酸のポリペプチドである（Ｌｉｎ，Ｆ−Ｋ．， ｅ
ｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２
：７５８０−７５８４（１９８５））。単離蛋白質として、ならびにその受容体
との複合体中での、エリトロポエチンの３次構造が報告されている（Ｓｙｅｄ
ＲＳ，ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ［１９９８］ ３９５：５１１−６； Ｃ
ｈｅｅｔｈａｍ Ｊ．Ｃ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ［１９
９８］ ５：８６１−６）。エリトロポエチンをコードする遺伝子の同定、クロ
ーニング、および発現が、米国特許第４７０３００８号に記載されている。例え
ば、組換えエリトロポエチンプラスミドを含んでいる哺乳動物細胞の増殖を持続
させる細胞培地からの組換えエリトロポエチンの精製に関する記載が、米国特許
第４６６７０１６号に含まれている。組換えプラスミド上のエリトロポエチン遺
伝子を含んでいる哺乳動物細胞からの、生物学的に活性な組換えエリトロポエチ
ンの発現および回収は、エリトロポエチンの入手可能量を治療への応用に適する
もととした。加えて、該遺伝子配列ならびに、より多量の精製蛋白質の利用可能
性の知見は、この蛋白質の作用機作のより詳細な理解に繋がった。腎不全、ＨＩ
Ｖ感染、血液損失および慢性疾患に付随するものを含む、いくつかの型の貧血は
、この造血成長因子によって治療することができる。エリトロポエチンは、典型
的には、約２５〜１００Ｕ／ｋｇの用量で、週３回静脈内または皮下注射によっ
て投与される。
【０００４】 原核細胞由来の蛋白質とは異なり、真核細胞によって産生される、多くの細胞
表面および分泌蛋白質は、１つまたは複数のオリゴ糖基によって修飾されている
。この修飾は、グリコシル化と称され、蛋白質の医薬的性質に劇的な影響を及ぼ
すことがあり、また蛋白質の安定性、薬物動態、分泌、および細胞内局在におい
て重要でもありうる。適切なグリコシル化が、生物学的活性のために必須である
。実際、真核生物由来のいくつかの遺伝子は、蛋白質グリコシル化の細胞内過程
を欠いている細菌（例えば、大腸菌）内で発現した際には、グリコシル化の欠如
の結果、ほとんど、または全く活性を伴なわずに回収される蛋白質を産する。グ
リコシル化は、ポリペプチド主鎖の特定の位置で起こり、また、通常は二つの型
があり：Ｏ−結合型オリゴ糖は、セリンまたはトレオニン残基に結合するが、一
方、Ｎ−結合型オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（なおＸは、プロ
リンを除くいかなるアミノ酸であってもよい）の一部であるアスパラギン残基で
ある場合には、アスパラギン残基に結合する。Ｎ−結合型およびＯ−結合型オリ
ゴ糖の構造、ならびに各型で見出される糖残基は異なっている。双方で共通して
見出される、糖の型の１つは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以後、シアル酸と称
する）である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合型およびＯ−結合型オリゴ糖の両方
の末端残基であり、また、その負電荷に因って、糖蛋白質に酸性の性質を与える
こともある。（哺乳動物細胞中で発現された）ヒト組換えエリトロポエチンは、
それらを合わせると該糖蛋白質の全分子量の約４０％を構成している、３つのＮ
−結合型オリゴ糖と１つのＯ−結合型オリゴ糖を含んでいる。Ｎ−結合型グリコ
シル化は、２４、３８および８３位に位置するアスパラギン残基（Ａｓｎ）で起
こり、一方、Ｏ結合型グリコシル化は、１２６位に位置するセリン残基（Ｓｅｒ
）で起こる（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１
， ３１１６ （１９８６）；Ｂｒｏｕｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２６５， ３２９ （１９８８））。オリ
ゴ糖鎖は、末端のシアル酸で修飾されていることが判明されている。改変された
シアル酸パターンを有している、ＥＰＯイソフォームが、例えば、欧州特許第０
６６８３５１号または欧州特許第０４２８２６７号に開示されている。
【０００５】 酵素的に脱グリコシル化されたエリトロポエチンは、正規なグリコシル化され
た蛋白質のものと類似の活性を有することから、グリコシル化は、活性に対して
必要不可欠ではないようである。しかし、エリトロポエチン中のグリコシル化部
位を変異させて、グリコシル化を妨げた際には、蛋白質の正常な合成および放出
の強い阻害がある（Ｄｕｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
［１９８８］ ２６３；１７５１６）。特に、Ａｓｎ38におけるグリコシル化
の排除は、９９％の合成抑制を引き起こし、ならびに、Ａｓｎ83におけるグリコ
シル化の排除は、少なくとも９９．９９％の合成抑制を引き起こし、また、Ｓｅ
ｒ126におけるグリコシル化の排除は、９９．８％の合成抑制を起こさせる。
【０００６】 エリトロポエチン治療に伴う１つの問題は、極めて有効ではあるものの、この
治療形態は、非常に高価であるということである。注射可能な医薬品を用いる際
、薬剤の常用において遭遇するもう１つの問題は、血流中で、該化合物を治療的
な濃度レベルに維持するために、その注射をしなければならない頻度である。例
えば、エリトロポエチンは、比較的に短い血漿半減期しかなく（Ｓｐｉｖａｋ，
Ｊ．Ｌ． ａｎｄ Ｈｏｇａｎｓ，Ｂ．Ｂ． Ｂｌｏｏｄ ７３：９０ （１９
８９）；ＭｃＭａｈｏｎ，Ｆ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ７６：１７
１８ （１９９０））、したがって、治療的な血漿レベルは速やかに消失し、そ
して、反復して静脈内投与を行わなければならない。
【０００７】 かかる問題を回避するために、延長された循環半減期を有する、エリトロポエ
チンの利用可能性に富む誘導体を手にすることには有益である。加えて、哺乳動
物細胞以外の宿主細胞において、ＥＰＯを合成することが好ましいと考えられる
。残念ながら、細菌中での合成は、適切に折りたたまれた天然の立体配座に、該
蛋白質は産生されないため、問題となる。昆虫細胞または植物細胞中での合成も
、これらの細胞は、好ましくないグリコシレーション・パターンを呈するため、
問題となる。昆虫のパターンまたは植物のパターンに従ってグリコシル化されて
いる蛋白質は、動物に注射した際、一般には、特定の受容体に取り込まれ、そし
て、速やかに分解される。例えば、肝臓中のマクロファージは、非哺乳動物型の
グリコシレーション・パターンを具えた蛋白質を除去する、高マンノース受容体
およびアシアロ糖蛋白質受容体を有している。
【０００８】 （発明の概要） 本発明は、上述の課題を対象とする、驚くべき活性を具えている、改変された
新規なＥＰＯの形態、なかでも、融合蛋白質、ならびに、非融合ＥＰＯの改変を
も提供する。
【０００９】 融合蛋白質および特定の融合蛋白質の改変は、当技術分野において知られてい
る。例えば、融合蛋白質は、蛋白質分解酵素のその蛋白質主鎖自体との物理的接
触を効果的に妨げることもあり、そして、したがって分解を防止する。付加され
る利点には、特定の環境下では、特定の発現系における改善された収量、標的蛋
白質の正しいフォールディング、ならびに該治療用蛋白質の安定性、循環時間、
および生物学的活性の増進が含まれる。かかる改変の１つは、免疫グロブリンの
Ｆｃ領域の使用である。抗体は、２つの機能的に独立な部分；抗原と結合する「
Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、補体または食細胞などの、効果器機能
との連結をもたらす「Ｆｃ」として知られる定常部ドメインを含んでいる。単な
るＦａｂ断片は短寿命であるが、免疫グロブリンのＦｃ部分は、特に短い半減期
を有する特定の蛋白質に融合した際、長い血漿半減期を引き起こす、Ｃａｐｏｎ
，ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１（１９８９）。例え
ば、抗炎症および抗拒絶反応剤のＩＬ−１０が、該サイトカインの短い血流半減
期を延長するために、マウスのＦｃγ２ａのＮ末端に融合されている（Ｚｈｅｎ
ｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ， １５４：５５９０−５６００ （１９９５））。加えて、インターロイキ
ン２の短い半減期と、その全身性の毒性とを克服するために、インターロイキン
２のＮ末端は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分に融合されている（Ｈａｒｖ
ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １：９５−１
０５ （１９９５））。ＩＬ−１０およびＩＬ−２は、ＥＰＯとは異なり、腎臓
ろ過によって速やかに排出されるため、非常に短い血漿半減期を有する小蛋白質
である。
【００１０】 免疫グロブリンのＦｃ蛋白質中にすべて備わっている、Ｆｃ受容体結合、プロ
テインＡ結合、補体固定および胎盤通過などの機能を取り込むために、Ｆｃドメ
インを用いて、治療用融合蛋白質の構築もなされている。例えば、ホジキン病腫
瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞、および他の悪性細胞型上で発
現されるＣＤ３０受容体と結合する分子、ＣＤ３０−ＬのＮ末端にＩｇＧ１抗体
のＦｃ領域が融合されている（米国特許第５４８０９８１号）。さらに、１９９
６年には、特定の非変異の標的蛋白質の有効な発現および分泌は、免疫グロブリ
ンのＦｃ部分および前記標的蛋白質を含んでなる融合蛋白質の発現と、続く該標
的蛋白質の蛋白質分解的な切り出しによって、達成できることが報告されている
（国際公開公報第９６／０８５７０号、米国特許第５５４１０８７号）。
【００１１】 本発明は、動物中での赤血球産生を刺激する能力に関して、エリトロポエチン
様活性を有するが、高活性、グリコシル化を伴わずに合成が可能であること、お
よびより長い血漿半減期などの付加的な有益な性質を具えている、新規な蛋白質
を提供する。これらの新規な蛋白質には、他の蛋白質と融合していないＥＰＯの
改変異形、ＥＰＯの免疫グロブリン領域との融合蛋白質、変更されたグリコシル
化を有するＥＰＯの形態、改変、他の部分との融合、および／または変更された
グリコシル化を有用に組み合わせているＥＰＯの形態、末端切除されたアミノ酸
配列を有するＥＰＯの形態、それに伴い、例えば、Ｆｃ受容体に対する低下した
親和性を有する、修飾／改変がなされているＦｃ免疫グロブリン部分の形態、Ｆ
ｃの短縮または末端切除された形態、ならびに特定のリンカーを有するＦｃ−Ｅ
ＰＯ構築物が含まれる。Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質などの、上にならびに後に規定
する、本発明のＥＰＯの形態は、増強された生物学的活性および改善された安定
性などの、改善されている性質を示す。
【００１２】 （詳細な説明） 本発明の目的は、 改善された性質を有する改変されたエリトロポエチン（ＥＰＯ）の形態であって
、ヒトもしくは哺乳動物ＥＰＯのジスルフィド結合またはシステインのパターン
とは相違するシステインまたはジスルフィド結合のパターンを有している、非融
合のヒトもしくは哺乳動物改変ＥＰＯ、あるいは （ｉ）Ｆｃ−ＥＰＯ （ｉｉ）Ｆｃ−Ｌ−ＥＰＯ （ｉｉｉ）Ｆｃ−ＥＰＯdesial （ｉｖ）Ｆｃ−ＥＰＯm （ｖ）Ｆｃm−ＥＰＯ （ｖｉ）Ｆｃm−ＥＰＯm （ｖｉｉ）Ｆｃm−Ｌ−ＥＰＯ （ｖｉｉｉ）Ｆｃ−Ｌ−ＥＰＯm （ｉｘ）Ｆｃ−ＥＰＯtrunc （ｘ）Ｆｃ−Ｌ−ＥＰＯtrunc の群より選択される、Ｆｃ部分がそのＣ末端を介して、直接もしくは間接的に、
前記ＥＰＯ分子にそのＮ末端で、共有結合的に融合されており、また、前記Ｆｃ
部分ならびにＥＰＯ部分は、修飾もしくは改変がなされていてもよい、Ｉｇ分子
のＦｃ部分およびエリトロポエチン分子（ＥＰＯ）を含んでなる融合蛋白質のい
ずれかであることができる、前記ＥＰＯの形態を提供することである。
【００１３】 本明細書において、ＥＰＯは、哺乳動物、好ましくはヒト起源に由来の、天然
産のＥＰＯの意味を有し、そして、天然種から遺伝子操作がなされた組換えＥＰ
Ｏをも含んでいる。本発明にかかるＥＰＯは、前述および後述、ならびに先行技
術によって示されるとおり、グリコシル化されている、グリコシル化されていな
い、部分的にグリコシル化されている、またはそのグリコシレーション・パター
ンにおいてそれ以外の変更が施されている。特定の使用のために、ＥＰＯ部分は
正しく折りたたまれた構造を有する。本発明は、グリコシル化されていない、Ｅ
ＰＯの形態を合成するための新規な方法を開示する。既に、アスパラギンに結合
した糖基を除去する、Ｎ−グリコシダーゼで、グリコシル化されたＥＰＯを処理
することができることは知られていた。しかし、この酵素は、Ｓｅｒ126上に見
いだされる、別の糖修飾は除去しない。一般的な代替合成法としては、グリコシ
ル化が起こらない、細菌中でＥＰＯを発現させることも可能である。しかし、こ
の方法で合成された蛋白質は、一般に、封入体中の変性蛋白質として得られ、ま
た、ジスルフィド結合を持たない。したがって、該蛋白質を可溶状態に再構成す
るために、余分な労力が必要となる。最後に、ＥＰＯ中のグリコシル化部位の改
変は、哺乳動物細胞中では合成することができない蛋白質としてしまう（Ｄｕｂ
ｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ［１９８８］ ２６３；
１７５１６）。該変異蛋白質は、分泌がなされる前に分解されるようである。し
かし、本明細書に開示するとおり、Ｆｃ−非グリコシル化ＥＰＯをコードするＤ
ＮＡ構築物を、哺乳動物細胞系中に配する際、該Ｆｃ−非グリコシル化ＥＰＯは
、効果的に発現され、分泌され、培養上清中に可溶型で見いだされる。該Ｆｃ−
非グリコシル化ＥＰＯ融合蛋白質は、標準的な手法、例えば、プロテインＡカラ
ム上で精製することができる。例えば、該Ｆｃ−非グリコシル化ＥＰＯは、動物
に抗原として注射して、グリコシル化の不在によって表出される、新規エピトー
プを対象とする、抗体を創製することができる。加えて、グリコシル化部位にの
み変異を含むＦｃ−非グリコシル化ＥＰＯは、検出可能なＥＰＯ活性を有し、増
進された活性を有する、さらなる変異が施された形態の単離する際の出発点とし
て利用することができる。
【００１４】 ＥＰＯdesialは、通常、分泌されたグリコシル化されている蛋白質上で見いだ
されるシアル酸残基が、部分的にまたは実質的に存在しない、本発明にかかるグ
リコシル化ＥＰＯである。これは、シアル酸残基は実質的に除去されるように、
酵素での酵素的処理によって得ることができる。例えば、酵素ノイラミニダーゼ
で処理された蛋白質は、そのシアル酸の除去がなされている。かかる蛋白質は、
肝臓中のアシアロ糖蛋白質受容体によっても認識される。脱シアル酸は、この過
程を担う酵素が不足している変異細胞を用いることによってもなしとげることが
できる。例えば、ＣＨＯ細胞系の既知のＬｅｃ−２変異誘導株は、分泌蛋白質中
のＮ−結合型およびＯ−結合型糖鎖に対するシアル酸残基の付加に不備がある（
「アシアロ」）。その結果、かかる蛋白質上の露出されたガラクトース残基は肝
臓中のアシアロ糖蛋白質受容体によって認識され、細胞中への取り込みが可能で
あり、そして、通常は分解される。本発明にかかる融合蛋白質のＥＰＯ部分にお
ける脱シアル酸は、完全に排除される必要はない。
【００１５】 ＥＰＯtruncは、末端の切除を受けているものの、そのアミノ酸配列中に変異
はなされていない、本発明にかかるＥＰＯである。末端切断された形態は、本質
的には、完全な、または僅かな弱められたエリトロポエチンの生物学的活性を有
している蛋白質断片である。本発明にかかるＥＰＯの好ましい末端切断された形
態は、Ｃ末端が短縮され、Ｎ末端から算出して少なくとも６５アミノ酸を有する
ものである。好ましい末端切断されたＥＰＯの形態は、１５５〜１１６、１０８
、１０４、９８、９３、８８、８５または７８アミノ酸を有する。ＥＰＯの特に
好ましい形態は、Ｃ末端が１０８、１０４、９８、９３、８８、８５または７８
位のアミノ酸において、終端されている。
【００１６】 免疫グロブリンのＦｃ領域は、免疫グロブリンＨ鎖の定常領域のカルボキシル
末端部分のアミノ酸配列である。該Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの生物学的機能
を決定する上で特に重要であり、そして、これらの生物学的機能は効果器機能と
呼ばれる。周知のように、免疫グロブリンサブクラスのＨ鎖は、４つまたは５つ
のドメイン含んでおり、ＩｇＭおよびＩｇＥは、５つのＨ鎖ドメインを有し、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧは、４つのＨ鎖ドメインを有している。ＩｇＡ、Ｉｇ
ＤおよびＩｇＧのＦｃ領域は、ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3ドメインの２量体であり、
一方、ＩｇＭおよびＩｇＥにおいては、ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3−ＣＨ4ドメイン
の２量体である（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．， １９９３， Ｆｕｎｄａｍｅｎ
ｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ を参照）。
【００１７】 本明細書における用法では、「Ｉｇ分子のＦｃ部分」なる用語は、免疫グロブ
リンＨ鎖の定常領域のカルボキシル末端部分、またはその類縁体もしくは部分を
意味する。すなわち、例えば、Ｉｇ、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ
１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも、ヒンジ
領域の一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むことができる。好ま
しい実施態様では、Ｆｃ領域は、少なくとも、ヒンジ領域の一部およびＣＨ３ド
メインを含む。
【００１８】 ある状況では、Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質のＦｃ部分内の特定のアミノ酸を変異
することが有用である。例えば、非ヒト型グリコシル化パターンを生じる細胞型
の中で、Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質が発現される際には、Ｆｃ領域内のグリコシル
化部位を変異させ、そして、この部位でのグリコシル化を完全に排除することが
しばしば有用である。結果として、得られた蛋白質は、変更されたグリコシル化
パターンを認識する捕捉システムによって見分けられず、また分解されない。
【００１９】 したがって、Ｆｃmは、上に定義したように、そのアミノ酸配列において、変
異および／もしくは末端の切断がなされており、ならびに／またはそのグリコシ
ル化パターンが改変されている、Ｆｃ部分である。本発明によって、かかる改変
されたＦｃ部分は、改善された性質を具えたＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質に導くこと
が明らかにされている。この関係においては、Ｆｃmには、細胞上のＦｃ受容体
に対する、低下された親和性が有する、さらに改変または変異はなされたＦｃ部
分が含まれる。Ｆｃ受容体に対する、融合蛋白質の結合親和性は、細胞上のＦｃ
受容体に対して、本質的に減少した結合親和性を有しているＨ鎖アイソタイプを
融合パートナーとして用いることによって、低減させることができる。例えば、
ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、例えば、ＦｃＲγ１と高い親和性で結合し、また、
該結合部位は、ＣＨ２ドメイン中に位置していることが知られている。したがっ
て、Ｆｃ受容体結合を担うドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸に変異、欠失
または挿入を有している、延長されたインビボでの循環半減期を具えたＦｃ−Ｅ
ＰＯの提供が、本発明の一つの形態である。本発明の好ましい実施態様では、該
Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質は、該ＩｇＧ１の定常領域における変異、欠失、または
挿入は、Ｌｅｕ234、Ｌｅｕ235、Ｇｌｙ236、Ｇｌｙ237、Ａｓｎ297、およびＰ
ｒｏ331から選択されている、ＩｇＧ１のＦｃ部分を含んでいる。別の好ましい
実施態様では、該変異、欠失または挿入は、本発明にかかる融合蛋白質のＦｃ部
分のＩｇＧ１定常領域中、Ｌｅｕ281、Ｌｅｕ282、Ｇｌｙ283、Ｇｌｙ284、Ａｓ
ｎ344およびＰｒｏ378から選択される１つまたは複数のアミノ酸において導入さ
れる。低下したＦｃ受容体親和性を持つＦｃ部分を作製する方法は、例えば、Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９９／０３９６６に開示されている。
【００２０】 本発明は、その中のＥＰＯ部分が変更されている、Ｆｃ−ＥＰＯの有用な変異
体の形態を創製する方法も開示する。増進したＥＰＯ生物学的活性を持つＦｃ−
ＥＰＯの変異体は、下記の実施例に記載する、ならびに、当技術分野において公
知の手順によって創製することができる。
【００２１】 したがって、ＥＰＯmは、そのアミノ酸配列において、変異を有するが、末端
の切断はなされていない、本発明にかかるＥＰＯである。該変異の数は、限定は
されないが、該分子の生物学的活性の減損に対して制限される。好ましくは、１
〜１０アミノ酸の変異を用いる。驚くことに、その中のＥＰＯは、上述のとおり
に変異されている、本発明にかかるＦｃ融合蛋白質は、変異のないＥＰＯ部分を
有している、相当するＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質よりも、より高い比活性を有する
ことを示すことができた。したがって、その中のＥＰＯが変異されている、上な
らびに請求の範囲中に定義されている融合蛋白質の提供が、本発明の好ましい形
態の一つである。本発明の好ましい融合蛋白質は、ＥＰＯm部分中に、下記の変
換：Ａｓｎ24,38,83→Ｘｘｘ、Ｓｅｒ126→Ｘｘｘ、ただし、Ｘｘｘは異なるア
ミノ酸である、の少なくとも１つがなされているＥＰＯ分子を有する。本発明に
かかる、好ましい変換は、Ａｓｎ24,38,83→Ｇｌｎおよび／またはＳｅｒ126→
Ａｌａである。更なる好ましい変異は、Ｈｉｓ３２→Ｇｌｙおよび／またはＳｅ
ｒ３４→Ａｒｇおよび／またはＰｒｏ９０→Ａｌａである。本発明の１つの実施
態様において、上述の変異全てがなされている。
【００２２】 本発明にかかる、これらおよびその他の変異蛋白質は、ＥＰＯ受容体への結合
を強め、高めた安定性、正しい、活性な立体配座の高められた選択、高まった薬
物動態特性、増進された生合成、またはその他の有利な特徴を持つことができる
。Ｆｃ−ＥＰＯのＥＰＯ部分中の変異は、さらに増強された活性を有する蛋白質
を創製するために組み合わせることができる。実施例中に開示された、Ｆｃ−Ｅ
ＰＯの改善のための具体的な方法は、部位特異的な変異誘導法を用いる。広範な
部位特異的な変異誘導法が利用可能であり、また、同様の結果を達成するために
、代替法として使用できることを留意しておくことが重要である。これらの手法
中から選択する上での戦略は、分子生物学分野の当業者には周知である。同様に
、標的ＤＮＡのランダムなおよび半ばランダムな変異誘導を達成する上でも、広
範な手法がある。これらの手法も、分子生物学分野の当業者には周知である。
【００２３】 Ｆｃ−ＥＰＯの別な変異体の形態が、本発明に従って構築することができる。
該変異は、非グリコシル化Ｆｃ−ＥＰＯの活性を増大させる効果を有する。その
変異に応じて、ＥＰＯ受容体に対するＦｃ−ＥＰＯの親和性を増大する、適切に
折りたたまれたＦｃ−ＥＰＯの分画を増す、またはＦｃ−ＥＰＯの薬物動態特性
を改善するなどの、活性は、様々なメカニズムによって増進される。いくつかの
変異は、組み合わせた際、非グリコシル化Ｆｃ−ＥＰＯの活性に相加的または相
乗的な作用を有する。
【００２４】 本発明に従って、該Ｆｃ部分およびＥＰＯ蛋白質は、リンカー分子によって連
結することもでき、その際、化学的なまたはアミノ酸リンカーは様々な長さであ
る。化学的なリンカーは、当技術分野において周知である。ペプチド・リンカー
が好ましい。リンカー分子によって、Ｆｃ部分が標的蛋白質と連結されている融
合蛋白質は、改善された性質を持つことができる。かかるリンカー分子を有して
いる、本発明にかかるＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質は、増強された生物学的活性を示
す。本発明のリンカー（Ｌ）は、上にならびに後に述べるように、プロテアーゼ
切断部位を持していない、リンカー分子である。
【００２５】 該ペプチド・リンカーは、しばしば、例えばグリシンおよび／またはセリンな
どの一連のペプチドである。好ましくは、該ペプチド・リンカーは、約５〜２５
、好ましくは１０〜２０残基長の、グリシンおよびセリンの入り混じっている一
続きのペプチドである。好ましいアミノ酸リンカーＬが用いられ、下記の配列を
含むが、ただし、蛋白質分解酵素の切断部位を有するようなリンカーは除外され
る： １．ＡｌａＡｌａＡｌａ ２．ＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａ、 ３．ＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａ、 ４．Ｓｅｒ、 ５．ＳｅｒＳｅｒ、 ６．ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、 ７．ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、 ８．ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、 ９．ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、 １０．ＧｌｙＰｒｏＧｌｙ、 １１．ＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙ、 １２．ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ、および １３．前記１〜１２のサブパートの任意な組み合わせ。
【００２６】 好ましいアミノ酸リンカーは、（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ） x 、なおｘは１〜５である、である。他の適するリンカーは、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ；９５，５９２９に開示されている。
【００２７】 本明細書の用法では、「蛋白質分解切断部位」とは、蛋白質分解酵素または他
の蛋白質分解切断試薬によって優先的な切断がなされる、アミノ酸配列を意味す
る。蛋白質分解切断部位には、トリプシン、プラスミン、またはエンテロキナー
ゼＫなどの蛋白質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列が含まれる。多くの
切断部位／切断試薬のペアが知られている。該標的蛋白質配列がインターフェロ
ン−アルファまたはその活性変異体に対する前駆分子である場合、所望の蛋白質
産物は、エラスチンまたはプラスミンまたはウロキナーゼなどの内因性蛋白質分
解酵素による切断によって産生されてもよい。
【００２８】 上および下での用法では、エリトロポエチンおよびＥＰＯ融合蛋白質の生物学
的活性は、それぞれ、その同源の細胞受容体との相互作用を介して、赤血球の増
殖および分化を調節する能力、または、周知の実験的な技法を用いて決定される
、特異的な免疫反応を誘発する抗原性と定義される。例えば、生物学的に活性な
、または機能的に活性な、エリトロポエチンの断片（ＥＰＯtrunc）は、エリト
ロポエチンに特異的な抗体（抗エリトロポエチン抗体）を産生する免疫反応を誘
発することができる。
【００２９】 「機能的に」または「生物学的に活性」であるために、Ｆｃ−ＥＰＯなどのエ
リトロポエチン様分子は、典型的には、野生型、または天然産のエリトロポエチ
ンの対応する配列と、実質的な（アミノ酸）配列の類似性（例えば、少なくとも
約６５％、典型的には、少なくとも約８０％、および最も典型的には、約９０〜
９５％）を共有し、その野生型エリトロポエチンの機能の１つまたは複数を有す
る。
【００３０】 上で指摘したとおり、本発明の融合蛋白質は改善された性質を有する。したが
って、これらは、改善された生物学的活性を示し、延長された血漿半減期を有し
、なお、前記延長された血漿半減期は、１５時間よりも長く、好ましくは、２０
時間よりも長く、最も好ましくは、２５時間よりも長い。
【００３１】 本発明のもう１つの重要な形態は、改善されたＥＰＯの形態、好ましくはＦｃ
−ＥＰＯ融合蛋白質を得るために、システイン−システインのジスルフィド結合
の変更されたパターンを導入することが有益であるという知見である。したがっ
て、そのＥＰＯまたはＥＰＯm部分の、少なくとも１つ、好ましくは２〜４個の
システイン残基が遺伝子操作されている、Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質または非融合
ＥＰＯの提供が、本発明の形態の一つである。特には、該ＥＰＯまたはＥＰＯm
部分が、ヒトまたは哺乳動物のＥＰＯとは相違しているジスルフィド結合のパタ
ーンを有する、Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質または非融合ＥＰＯの提供が、本発明の
形態の一つである。本発明の１つの実施態様では、該ＥＰＯ部分は、下記のアミ
ノ酸変異：２９位は、Ｃｙｓではなく、３３位は、Ｃｙｓではなく、８８位は、
Ｃｙｓであり、ならびに１３９位は、Ｃｙｓである、の１つまたは複数を含む。
好ましいＣｙｓが遺伝子操作されている本発明の実施態様では、該ＥＰＯ部分は
、ヒトＥＰＯ由来であり、かつ、下記の変異：Ｈｉｓ３２→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ３４
→ＡｒｇならびにＰｒｏ９０→Ａｌａ、の少なくとも１つを有する。
【００３２】 変更されたジスルフィド結合を創製するため、１つのシステイン残基を、アラ
ニンまたはセリンなどの、構造的に対応しているアミノ酸に変異させ、そして、
三次元構造において近くにある、第２のアミノ酸をシステインに変異させる。し
たがって、ＥＰＯ分子またはＥＰＯm分子のシステイン残基の少なくとも１つが
、当技術分野において周知の手法で遺伝子操作されている、Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋
白質または非融合ＥＰＯの提供が、本発明のさらなる形態の一つである。１つの
実施態様は、Ｃｙｓ33が任意の他のアミノ酸で置換されている、Ｆｃ−ＥＰＯ融
合蛋白質である。別の実施態様では、アミノ酸Ｇｌｎ86、Ｐｒｏ87、Ｔｒｐ88、
Ｇｌｕ89、Ｌｅｕ91の１つがＣｙｓで置換されている、融合蛋白質が、該本発明
の形態である。好ましくは、Ｔｒｐ88が、Ｃｙｓで置換されている。例えば、３
３位のＣｙｓを欠失し、また、８８位にＣｙｓを含んでいる、ＥＰＯ部分を含む
融合蛋白質は、ヒトＥＰＯ中では見出されないジスルフィド結合を形成すること
になる。この結合は、Ｃｙｓ29とＣｙｓ33との間のジスルフィド結合を含んでい
るが、その他は類似の融合蛋白質に対して、優れており性質を有する融合蛋白質
をもたらす。例えば、該Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88融合蛋白質は、Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ33 融合蛋白質よりも高い活性を有する。加えて、該Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88融合蛋白質
は、該融合蛋白質のＥＰＯ部分中に他の変異は存在する際に、Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ 33 融合蛋白質に関係する活性に著しい増大を示す。また、ある場合には、Ｈｉｓ 32 を、任意の他のアミノ酸、好ましくはＧｌｙまたはＳｅｒへの変異、Ｓｅｒ34 をＡｒｇへの変異、およびＰｒｏ90をＡｌａへの変異を組み込むことも有用であ
る。
【００３３】 もう１つの有用な一連の変異には、本発明のＥＰＯのＣｙｓ29の任意の他のア
ミノ酸への変異、およびＡｒｇ139のＣｙｓへの変異が含まれる。これらの変異
を両方含むＥＰＯの形態は一般に、Ｃｙｓ33とＣｙｓ139との間のジスルフィド
結合を含むことになる。この結合の結果、Ｃｙｓ29とＣｙｓ33との間のジスルフ
ィド結合を含む、その他は類似の融合蛋白質に比べて優れた性質を有する融合蛋
白質が得られる。例えば、Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139融合蛋白質はＣｙｓ29−Ｃｙｓ3 3 融合蛋白質よりも高い活性を有する。加えて、Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139融合蛋白質
は、融合蛋白質のＥＰＯ部分における他の変異存在下で、Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ33融
合蛋白質に比べて著しい活性の増大を示す。さらなる別法として、２つのアミノ
酸をシステインに変異させることにより、まったく新しいジスルフィド結合を蛋
白質に追加する。
【００３４】 ヒト以外の動物により合成されたエリトロポエチンは一般に、ヒトエリトロポ
エチンとは異なるパターンのシステイン残基を含むことが、当技術分野において
知られている（Ｗｅｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ｈｉｇ
ｈ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｍｏｎｇ
ｍａｍｍａｌｓ Ｂｌｏｏｄ ８２、１５０７−１５１６［１９９３］；Ｆｕ，
Ｐ．，ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ ｓｈｅｅｐ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｇ
ｅｎｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ
ａｎｄ ｒｅｎａｌ／ｌｉｖｅｒ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｉｎ ａｄｕ
ｌｔ ｓｈｅｅｐ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９３、１０７−
１１６［１９９３］；Ｌｉｎ，Ｆ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｎｋｅｙ ｅｒｙ
ｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｇｅｎｅ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒ
ｏｐｏｉｅｔｉｎ ｇｅｎｅ Ｇｅｎｅ ４４，２０１−２０９［１９８６］；
Ｓｕｌｉｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃＤＮ
Ａ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｏｖｉｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｎｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅ
ｌｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ Ｇｅｎｅ １７１、２７５−２８０（１９９６
）；ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｄ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａ
ｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓ
ｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｇｅｎｅ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
６、８４２−８４８［１９８６］；Ｎａｇａｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉ
ｎ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７１（１）、９９−１０
２［１９９２］）。しかし、マカク、ブタ、イヌ、ネコ、ウシおよびヒツジなど
のこれらの動物のほとんどによって通常産生されるエリトロポエチンは、５つの
システインを含む。マウスおよびラットなどのげっ歯類は４つのシステインを含
むが、その２つは２９位と１３９位である。ヒトＥＰＯの三次元構造に基づき、
げっ歯類ＥＰＯの２９位と１３９位のシステインは、お互いまたは他のいかなる
システインともジスルフィド結合を形成することができない。一般に、分泌され
た細胞外蛋白質は対になっていないシステインを含むことはない。細胞外空間の
比較的酸化性の環境において、非対システインは酸化されて、例えばシステイン
酸となりうる。その結果、蛋白質の活性は低下すると考えられる。理論に縛られ
ようとすることなく、ヒト以外の動物のＥＰＯにおけるシステインの酸化は、Ｅ
ＰＯ活性をダウンレギュレートするはたらきをし、赤血球生成が必要とされない
ときには、高酸素状態でＥＰＯ蛋白質を不活化する。
【００３５】 いずれにせよ、本発明は、同じ数のシステインを有し、システインはすべてジ
スルフィド結合を形成することができる、知られている動物由来のＥＰＯの形態
とは異なるＥＰＯ部分を提供する。新規ジスルフィド結合パターンを含むこれら
のＥＰＯ部分は、Ｆｃ融合体として、アルブミンなどの他の蛋白質への融合体と
して、または非融合単離部分として有用でありうる。
【００３６】 本発明のもう１つの特徴は、２９、３３、３８、および１３９位にシステイン
を有するＥＰＯの形態である。この一連のシステインが７および１６１位に通常
のシステインを含むＥＰＯ中に存在するとき、得られるＥＰＯは２つではなく３
つのジスルフィド結合を含む。得られる分子は、通常のＥＰＯ蛋白質を不安定化
する他の変異存在下であっても、非常に安定である。例えば、ＥＰＯ（Ｃｙｓ29 −Ｃｙｓ88、Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）は通常のヒトＥＰＯに比べて非常に安定で
ある。同様に、ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88、Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）へのＦｃ
融合体などの融合蛋白質は、通常のヒトＥＰＯまたはヒト以外の動物由来の通常
のＥＰＯへの対応する融合体に比べてより安定である。
【００３７】 したがって、本発明は、ヒトおよび動物ＥＰＯとは異なるシステイン残基およ
びジスルフィド結合のパターンを有する、新規なＥＰＯ、ならびに他の部分、好
ましくはＦｃ部分と融合されているＥＰＯの形態を提供する。これらの新規なＥ
ＰＯの形態は、対応するＥＰＯの天然の形態よりも、著しい利点を有する。例え
ば、変更されたジスルフィド結合パターンを持つＥＰＯの形態は、より高い比活
性、増進された安定性、ＥＰＯを不安定化させる他の変異が存在する際には、劇
的に増進されている安定性、および改善された薬物動態を有する。下記の実施例
のいくつかは、これらの点を例示している。例えば、ＥＰＯの酵素的脱グリコシ
ル化は、ＥＰＯ活性に対して不安定化する作用を有する。変更されたジスルフィ
ド結合のパターンを持つＥＰＯの形態は、通常のジスルフィド結合パターンを有
する、対応するＥＰＯの形態よりも、脱グリコシル化に際し、より安定である。
加えて、変更されたジスルフィド結合のパターンを持つＥＰＯの形態は、通常の
ジスルフィド・パターンを有する、対応するＥＰＯの形態よりも高い比活性を有
する。
【００３８】 したがって、ヒトまたは動物／哺乳動物ＥＰＯのジスルフィド結合パターンと
は異なるジスルフィド結合のパターンを有する、新規な組換えヒト、または動物
、好ましくは哺乳動物の（非Ｆｃ融合）エリトロポエチン（ＥＰＯ）の提供が、
本発明の形態の一つでもある。本発明にかかる動物または哺乳動物ＥＰＯは、マ
ウス、マカク、ラット、イヌ、ブタ、ウシまたはヒツジ由来であってもよい。
【００３９】 さらに、本発明の目的は、該Ｆｃ融合蛋白質内のＥＰＯおよびＥＰＯm部分が
２量体化されている、上で、および請求の範囲に定義されている、融合蛋白質の
提供が、本発明の形態の一つもある。
【００４０】 「２量体（の）」なる用語は、２つの蛋白質サブユニットが、共有結合または
非共有結合的な相互作用を介して安定に会合している、特定の多量体分子を意味
する。本明細書中の用法では、「多量体（の）」なる用語は、２つまたはそれ以
上の蛋白質サブユニットの、共有結合的な相互作用によって、例えば、ジスルフ
ィド結合により、または、非共有結合的な相互作用によった、安定な会合を意味
する。
【００４１】 Ｆｃ断片自体は、典型的には、少なくとも、ヒンジ領域の一部、ＣＨ2ドメイ
ンおよびＣＨ3ドメインを含むＨ鎖断片の２量体であることを理解しておくべき
である。しかし、多くの蛋白質リガンドは、２量体として、その受容体に結合す
ることが知られている。蛋白質リガンドＸが、天然において２量体化する場合、
該２量体化の過程は、濃度依存的であるため、Ｆｃ−Ｘ分子中のＸ部分は、はる
かに高い程度で、２量体化することになる。Ｆｃによって連結されている２つの
Ｘ部分の、物理的な近接は、２量体化を分子内プロセスとなし、その平衡を２量
体の方に大きく傾け、そして、その受容体への結合を促進する。
【００４２】 全体の、または完全なＩｇ分子が利用されている、ＥＰＯ融合蛋白質の構築が
、本明細のもう１つの形態である。かかる融合蛋白質は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖
の可変領域と、特定の抗原に対するエピトープ結合部を含む。例えば、エリトロ
ポエチンを、その可変領域は、ヒト集団の多くまたは全てが曝露されている抗原
を対象としている、抗体内の抗体Ｈ鎖のＣ末端に融合する。かかる抗体は、本開
示においては「ユニバーサル抗体」と称する。抗体融合蛋白質の構築における、
「ユニバーサル」抗体の使用は、エリトロポエチン以外の他の蛋白質部分との融
合分子に対して、一般化が可能であることに留意することが重要である。「ユニ
バーサル」抗体とは、ヒト集団などの、哺乳動物集団の多く、ほとんど、または
全ておいて見出される、特異性を具える抗体を意味する。例えば、破傷風トキソ
イドを対象とする可変領域は、ヒトゲノム中にコードされ、対応する蛋白質は、
一般に、体細胞の変異を経ることなく、血漿中に表出される。したがって、本発
明に従い、エリトロポエチンは、破傷風トキソイドを対象とする抗体のＨ鎖のＣ
末端に融合させる。かかる抗体−エリトロポエチン融合体の利点は、該抗体可変
領域は、哺乳動物自己抗原と強く結合しないことである。第２の利点は、抗イデ
ィオタイプ抗体は、特徴づけられていない可変領域を有する抗体に比べて、かか
る抗体に対して、新たに創製されにくいことである。
【００４３】 全抗体融合蛋白質をコードするＤＮＡ構築物は、以前に記載されているとおり
に、構築することができる（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ［１９９１］
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １０：３４７−３５６）。
【００４４】 本発明は、上に開示されたおよび請求の範囲に記載されている、いずれかの融
合蛋白質をコードするＤＮＡ分子にも関する。
【００４５】 好ましい実施態様として、上で、ならびに請求の範囲に定義されている、融合
蛋白質をコードし、 （ａ）シグナル／リーダー配列と、 （ｂ）Ｉｇ分子のＦｃ領域と、 （ｃ）ＥＰＯの生物学的活性を有する標的蛋白質配列とを含んでなる、ＤＮＡ
分子が開示される。
【００４６】 上述の該本発明のシグナル配列は、小胞体の膜を通過しての蛋白質の輸送を起
こさせるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明において有
用であるシグナル配列には、抗体のＬ鎖シグナル配列、例えば抗体１４．１８［
Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊｏｕｒ． ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．， １２５：１９ １］、抗体のＨ鎖シグナル配列、例えば
ＭＯＰＣ１４１抗体のＨ鎖シグナル配列［Ｓａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．， （１
９８０） Ｎａｔｕｒｅ， ２８６：５７７４］、および当技術分野において既
知である任意の他のシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎ， １９８４， Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：５１４５を参照）が含まれ
る。これらの各参照文献は、参照として本明細書に組み込まれる。シグナル配列
は、当技術分野においてよく特徴付けられており、典型的には、１６〜３０個の
アミノ酸を含むことが知られており、また、それよりも多いまたは少ないアミノ
酸残基を含むこともある。典型的なシグナル・ペプチドは、３つの領域：塩基性
のＮ末端領域、中心の疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域からなる。該中
心の疎水性領域は、初期のポリペプチドの輸送中に、膜脂質二重層を貫通して、
シグナル・ペプチドを固定する、４〜１２個の疎水性残基を含む。開始に続き、
該シグナルペプチドは、通常、小胞体の内腔において、シグナル・ペプチダーゼ
として知られている細胞酵素によって切断される。該シグナル・ペプチドの可能
性がある切断部位は、一般に「（−３、−１）ルール」に従う。したがって、典
型的なシグナル・ペプチドは、−１および−３位に小さい中性アミノ酸残基を有
し、この領域にプロリン残基を含まない。シグナル・ペプチダーゼは、かかるシ
グナル・ペプチドを−１および＋１アミノ酸の間で切断する。したがって、シグ
ナル配列をコードするＤＮＡの部分は、分泌中にＦｃ融合蛋白質のアミノ末端か
ら切断される可能性がある。この結果、Ｆｃ領域および標的蛋白質からなるＦｃ
融合蛋白質が分泌される。シグナル・ペプチド配列の詳細な説明は、ｖｏｎ Ｈ
ｅｉｉｎｅ （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４：
４６８３によって提供されている。当業者には明らかであるとおり、分泌カセッ
ト中の使用に対する、特定のシグナル配列の適合には、いくつかの型どおりの実
験を要することがある。シグナル配列は、「シグナル・ペプチド」、「リーダー
配列」または「リーダー・ペプチド」とも呼ばれ、また、シグナル配列と同義の
意味を有するこれらの各用語を本明細書において用いることもある。
【００４７】 本発明は、標的蛋白質、すなわちＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質の発現を促進する、
前記ＤＮＡ分子を含んでなる発現ベクターにも関する。本明細書中の用法では、
「ベクター」とは、宿主細胞に取り込まれ、そして、それで組換えられ、宿主細
胞のゲノム中に統合される、あるいは、エピソームとして自律複製するために、
適している塩基配列を含んでなる、いかなる核酸をも意味する。かかるベクター
には、線形の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウ
イルスベクターなどが含まれる。ウイルスベクターの非限定的例には、レトロウ
イルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスが含まれる。本明細書中での
用法では、「標的蛋白質の発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳
、ならびに、正しい活性な立体配座に折りたたまれた蛋白質産物の分泌を意味す
ると理解される。
【００４８】 本発明に従って、本出願において定義されている融合蛋白質の発現に適してい
る、真核動物、好ましくは哺乳動物の宿主細胞を用いる。かかる宿主細胞を前記
ベクターでトランスフェクトし、本発明の融合蛋白質を発現、精製および単離す
る方法は、当技術分野において周知である。したがって、本発明にかかる方法は
、 （ｉ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、分泌のためのリーダー配列、Ｆｃ部分およ
び、ＥＰＯ、ＥＰＯmまたはＥＰＯtruncを含んでなる、前駆蛋白質をコードする
ＤＮＡを構築することと、 （ｉｉ）前記融合ＤＮＡを適切な発現ベクター中に配置することと、 （ｉｉｉ）前記融合蛋白質を真核細胞中で発現させることと、 （ｉｖ）前記分泌融合蛋白質を精製することとを含んでなる。
【００４９】 最後に、本発明は、上にならびに後に定義される、ＥＰＯの形態の少なくとも
１つ、好ましくはＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質を、製薬学的に許容される担体、希釈
剤、ならびに賦形剤と共に含んでなる、医薬組成物にも関する。これらの医薬組
成物は、場合によっては、ＥＰＯ欠乏疾患の併用治療に有用な他の薬剤または医
薬品を含んでいてもよい。
【００５０】 かかる医薬組成物は、非経口投与、または経口、肺、鼻腔内、経皮もしくは他
の投与の形態用であってもよい。一般に、本発明の蛋白質または誘導体産物の有
効な量を、製薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤お
よび／または担体と共に含んでなる医薬組成物が、本発明に包含される。かかる
組成物には、様々な緩衝成分（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐ
Ｈおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤などの添加剤（例えば
、トゥイーン８０、ポリソルベート８０）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸
、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロソル、ベンジルアルコー
ル）、および充填物質（例えば、乳糖、マンニトール）が含まれる。
【００５１】 上で、ならびに後に述べる、「非経口」なる用語には、皮下、静脈内、関節内
および気管内注射および注入法が含まれる。非経口投与が好ましい。
【００５２】 本明細書中の用法では、「製薬学的に許容される担体または賦形剤」なる用語
は、該活性化合物または患者と有害な反応を起こさない、不活性で非毒性の液体
充填剤、希釈剤、溶媒または溶液を意味する。適当な液体担体は、滅菌水、食塩
水、デキストロース水溶液、糖溶液、エタノール、グリコール、および石油、動
物、植物、または合成起源のものを含む油など、当技術分野においてはよく知ら
れている。該調合物は、非経口投与にとって典型的な補助剤または媒体も含むこ
とができる。
【００５３】 前記の適切な調合物に関して、本発明の融合蛋白質は、最終的に、変化された
溶解性を示す、非毒性の有機または無機酸と、製薬学的に許容される塩を形成す
ることもできることは指摘すべきである。無機酸は、例えば、塩酸、硫酸または
リン酸ならびにオルトリン酸１水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸
性金属塩である。有機酸の例は、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロ
ン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコ
ルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸および
スルホン酸などの、モノ、ジおよびトリカルボン酸である。カルボキシ末端アミ
ノ酸部分の塩には、任意の適当な無機または有機塩基と形成された非毒性のカル
ボン酸塩が含まれる。これらの塩には、例えば、ナトリウムおよびカリウムなど
のアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属、なら
びにトリアルキルアミンなどの有機の１級、２級および３級アミンが含まれる。
【００５４】 好ましくは、本発明にかかる医薬組成物の用量は、約１０ｎｇ／ｋｇ／日と約
１０μｇ／ｋｇ／日の間のように、所望の治療効果がもたらすようなものとでき
る。該有効用量は、先行技術において知られている診断ツールを用いて決定して
もい。一般に、前述の範囲内での、所与の患者に対する、最適な治療上許容され
る用量および投与速度は、用いる具体的な活性物質の活性、年齢、体重、全身の
健康状態、性別、食事、投与の時間および経路、排出速度または治療の目的など
の、様々な要素に依存する。当業者であれば、投与すること、および所望の治療
効果を観察することによって、有効な用量を確認することができるであろう。該
用量は、治療の経過中に変動することもあり、最初は治療上の利益が見られるま
で比較的高用量を用い、そして、治療上の利益を維持するためにより低い用量を
用いる。
【００５５】 （配列情報） 本発明においては、下記のＤＮＡおよびアミノ酸配列が使用された。
【００５６】 翻訳を最適化するために改変コドンを用い、Ｓｍａｌ部位を含む５’末端の塩
基を含む、成熟型ＥＰＯのコーディング配列を配列番号：１に示す。
【００５７】 配列番号：１ （小文字は、発現を増大させるものの、蛋白質配列は変えないと予測される、
ヒトＥＰＯコーディング配列との塩基の相違を示す。） ＣＣＣＧＧＧｔＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ
ＧＡＧＴｇＣＴＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧ
ＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＣＧＡＣｃＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＣＡ
ＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡｃＡＴＣＡＣｃＧＴｇＣＣｔＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧ
ＴｇＡＡＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＴｔＧＧｃＣ
ＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＡＧＡＡＧＴｇＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣ
ＴＧＴＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧ
ＴＣＡＡＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＡａＣＴＧＣ
ＡＴＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＧＴｇＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡ
ＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧｇＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧ
ＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣｃＣ
ＴＣＣＧｃＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＴ
ＴＣＣＧＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡ
ＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴｇｃＣＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡ
ＧＡＴＧＡｃｔｃｇａｇ 配列番号：２ 成熟ＥＰＯ蛋白質配列（１文字コード） ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫＥＡＥＮＩＴＴＧＣＡＥＨＣＳＬ
ＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳ
ＥＡＶＬＲＧＱＡＬＬＶＮＳＳＱＰＷＥＰＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳＧＬＲＳＬＴＴ
ＬＬＲＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫＬＦＲ
ＶＹＳＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ Ｆｃ−領域のＣ末端への正常にグリコシル化されたＥＰＯの融合体を構築する
ために用いたオリゴヌクレオチド。
【００５８】 配列番号：３ オリゴ１ ＣＣＧＧＧｔＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧ
ＡＧＴｇＣＴＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＣ 配列番号：４ オリゴ２ ＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＣＧＡＣｃ
ＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡ 配列番号：５ オリゴ３ ＣＴＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡｃＡＴＣＡＣｃＧＴｇＣＣｔＧＡＣＡ
ＣＣＡＡＡＧＴｇＡＡＴＴＴＣＴＡＴ 配列番号：６ オリゴ４ ＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＴｔＧＧｃＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴ
ＡＧＡＡＧＴｇＴＧＧＣＡＧ 配列番号：７ オリゴ５ ＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＧ
ＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣ 配列番号：８ オリゴ６ ＡＡＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＡａＣＴＧＣＡ
ＴＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＧ 配列番号：９ オリゴ７ ＴｇＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＧ
ＧＣＴＣＴＧｇＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡ 配列番号：１０ オリゴ８ ＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧ
ＣＴＣＣｃＣＴＣＣＧｃＡＣ 配列番号：１１ オリゴ９ ＡＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＣＧＡＧ
ＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣ 配列番号：１２ オリゴ１０ ＧＧＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴｇｃ
ＣＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡｃｔｃｇａｇ グルコシル化部位の変異誘発： 配列番号：１３ オリゴ１１（オリゴ２’） ｔｃ ｔｔｇｇａｇｇｃｃａ ａｇｇａｇｇｃｃｇａ ｇｃａｇａｔｃａｃｇ
ａｃｇｇｇｃｔｇｔｇ ｃｔｇａａｃａ ＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＧＡＣｃ
ＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡ 配列番号：１４ オリゴ１２（オリゴ３’） ＣＴＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣｃＧＴｇＣＣｔＧＡＣＡ
ＣＣＡＡＡＧＴｇＡＡＴＴＴＣＴＡＴ 配列番号：１５ オリゴ１３（オリゴ６’） ＣＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＡａＣＴＧＣＡ
ＴＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＧ 配列番号：１６ オリゴ１４（オリゴ８’） ＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧ
ＣＴＣＣｃＣＴＣＣＧｃＡＣ 配列番号：１７： ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域−成熟型蛋白質コーディング配列 ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ
ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮ
ＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫ
ＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭ
ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ
ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ
ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ 配列番号：１８： ヒトＩｇＧ２定常領域−成熟型蛋白質コーディング配列（ＣＨ１、ヒンジ、Ｃ
Ｈ２、およびＣＨ３領域） ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹ
ＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ ＹＳＬ
ＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＴＶ
ＥＲ ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ Ｍ
ＩＳＲＴＰＥＶＴＣ ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ ＶＥＶＨ
ＮＡＫＴＫＰ ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ ＤＷＬＮＧＫＥＹ
ＫＣ ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ
ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ ＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷ ＥＳＮＧ
ＱＰＥＮＮＹ ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ ＶＤＫＳＲＷＱ
ＱＧＮ ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ ＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬ ＳＬＳＰＧＫ 下記の実施例は本発明をより詳細に説明するが、これを限定することはない。
【００５９】 実施例１． ヒトＦｃ−ＥＰＯの発現 エリトロポエチンの成熟型をコードする配列を、オリゴヌクレオチドから標準
的手法により完全合成した。前述および配列表に示したオリゴヌクレオチドは、
ＥＰＯ蛋白質をコードするＤＮＡの「トップ」鎖を示している。「ボトム」鎖オ
リゴヌクレオチドは、該トップ鎖と対になり、かつ全ＥＰＯコーディング配列が
該オリゴヌクレオチドのリン酸化後に互いにライゲートできるように、４から５
塩基の５’末端の突出を生じるように設計した。該配列は、高レベル発現のため
に最適なコドン使用がなされている、高Ｇ／Ｃ含有率を有するように設計した。
【００６０】 配列番号：２の蛋白質は、成熟蛋白質のＮ末端リシン残基を持たない。合成し
たＤＮＡは、５’末端には、Ｘｍａｌに適合する１本鎖部分、および３’末端に
は、Ｘｈｏｌに適合する１本鎖部分を持つように遺伝子操作した。次の４つのＥ
ＰＯグルコシル化部位中の変異を有する別の配列を構築した：Ａｓｎ24→Ｇｌｎ
、Ａｓｎ38→Ｇｌｎ、Ａｓｎ83→Ｇｌｎ、およびＳｅｒ126→Ａｌａ。該５００
塩基対のＤＮＡをクローニングし、配列分析により、それは、付加的な望ましく
ない変異を伴わず、成熟型ヒトＥＰＯをコードすることを確認した。発現ベクタ
ーｐｄＣｓ−Ｆｃ−ＥＰＯを、下記のとおりに構築した。Ｌｏ ｅｔ ａｌ．［
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （１９９８） １１：４９５］に従
い、ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡを含むＸｍａｌ−Ｘｈｏｌ制限酵素断片を、ｐｄＣｓ
−ＦｃベクターのＸｍａｌ−Ｘｈｏｌ断片とライゲートした。得られたベクター
、ｐｄＣｓ−Ｆｃ−ＥＰＯを用いて、Ｆｃ−ＥＰＯの発現のために哺乳動物細胞
をトランスフェクトした。このベクターは、ヒト免疫グロブリン ガンマ１鎖の
Ｆｃ領域を発現する。該ガンマ１鎖のＦｃ領域をヒトガンマ２由来のＦｃ領域で
置き換えられている、２組目のＦｃ−ＥＰＯベクターを構築した。該Ｆｃ蛋白質
部分は、通常、グルコシル化部位も含む。この部位は、場合によっては、標準的
手段によって非グリコシル化配列に変えてもよい。
【００６１】 実施例２． トランスフェクションとＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質の発現 一過性トランスフェクションのために、ＢＨＫ細胞に該プラスミドを導入した
。細胞は、リン酸カルシウムによるプラスミドＤＮＡの沈降［Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
、ＮＹ］あるいは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、供給元のプ
ロトコルに従ったリポフェクションによって、トランスフェクトした。安定な細
胞系を得るために、ＮＳ／０細胞を、一過性トランスフェクションおよび安定細
胞系の生成の両方に用いた。正常なシアル酸修飾を欠く蛋白質を発現するために
、ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞（ＡＴＣＣナンバー：ＣＲＬ−１７３６）。この細胞は
ＣＭＰ−シアル酸のゴルジ区画への輸送の激しい低下を示し、蛋白質の機能にお
けるシアル酸の寄与を調べるために有用である。
【００６２】 安定にトランスフェクトされたクローンを得るために、プラスミドＤＮＡを電
気穿孔により細胞内に導入した。約５×１０6細胞をＰＢＳで一回洗浄し、０．
５ｍｌのＰＢＳに再度懸濁した。次いで、１０μｇの線形化されたプラスミドＤ
ＮＡを細胞と共にＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（０．４ｃｍ電極ギ
ャップ、ＢｉｏＲａｄ）内で、氷上、１０分間インキュベートした。電気穿孔を
Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用い、０
．２５Ｖおよび５００マイクロＦの設定で行った。細胞を氷上で１０分間回復さ
せ、その後、増殖培地に再度懸濁し、次いで２つの９６穴プレートに播種した。
安定にトランスフェクトされたクローンを、トランスフェクションの２日後に導
入した、１００ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）存在下の増殖によって選択した
。細胞に、３日ごとにさらに２〜３回栄養供給し、そして、ＭＴＸ耐性クローン
が２〜３週間以内に現れた。クローンからの上清を、抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡでアッ
セイして、高産生体を同定した。高生産クローンを単離し、１００ｎＭ ＭＴＸ
を含む増殖培地中で増殖させた。
【００６３】 ＢＨＫ細胞およびＮＳ／０細胞は、１０％ウシ胎仔血漿、２ｍＭグルタミンお
よびペニシリン／ストレプトマイシンを補足した、ダルベッコ改変イーグル培地
中で増殖させた。ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞は、１０％ウシ胎仔血漿およびペニシリ
ン／ストレプトマイシンを補足したアルファ培地中で増殖させた。ゲル電気泳動
による通常的な評価のために、該制限培地中のＦｃ融合蛋白質を、プロテインＡ
セファロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上に捕集し、次
いで、２−メルカプトエタノールを含む、または含まない蛋白質サンプル緩衝液
中で煮沸することによって溶出した。ＳＤＳゲル上での電気泳動後、蛋白質バン
ドをクーマシー染色によって可視化した。Ｆｃ−ＥＰＯは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おいて見かけ分子量約６４ｋＤを有していた。
【００６４】 精製のために、プロテインＡセファロース上に結合した融合蛋白質を、リン酸
ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ３、および１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）中で溶出した。次いで、溶出物は、０．１容量の２Ｍトリス−塩酸、ｐ
Ｈ８で直ちに中和した。
【００６５】 実施例３． 酵素処理による、脱シアリル化および脱グリコシル化されたＥＰＯおよびＦｃ
−ＥＰＯ蛋白質の合成 シアル酸残基を、ノイラミニダーゼ処理によりＥＰＯおよびＦｃ−ＥＰＯから
除去した。５００マイクログラム／ｍｌのＦｃ−エリトロポエチン蛋白質を、５
０ｍＭ酢酸ナトリウム、４ｍＭ塩化カルシウム、１００マイクログラム／ｍｌウ
シ血漿アルブミンを含む緩衝液（ｐＨ５．５）中、０．１ユニット／ｍｌの酵素
（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と共に３７℃で様々な時間処理した。
【００６６】 図２のデータは、ノイラミニダーゼで処理したヒトＩｇＧ２ Ｆｃ−ＥＰＯは
、高められた活性を有することを示している。例えば、ノイラミニダーゼで２２
時間処理されたＦｃ−ＥＰＯは、正常にシアリル化されたＦｃ−ＥＰＯ対照蛋白
質の約２〜５倍に相当する活性を有する。
【００６７】 Ｎ−結合型糖部分を完全に除去するために、Ｎ−グリコシダーゼ処理を用いた
。５００マイクログラム／ｍｌのＦｃ−エリトロポエチン蛋白質を、５０ｍＭリ
ン酸塩を含む緩衝液（ｐＨ７．８）中、０．０２ユニット／ｍｌの酵素（Ｒｏｃ
ｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と３７℃で様々な時間処理した。あるいは、５
０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．８、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１
％β−メルカプトエタノール、および０．１％ＳＤＳを含む緩衝液を用いる。
【００６８】 実施例４． Ｆｃ−ＥＰＯおよび脱グリコシル化されたＦｃ−ＥＰＯの解析 酵素処理または変異細胞系での発現により生成された、Ｆｃ−ＥＰＯの脱グリ
コシル化形態を解析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動実験を
実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるとおり、Ｎ−グリコシダーゼ処
理によって脱グリコシル化されたＦｃ−ＥＰＯ蛋白質は、著しく速い移動度を示
した（図１）。
【００６９】 該Ｆｃ−ＥＰＯ蛋白質は、各サブユニットに４つのＮ−グリコシル化部位と１
つのＯ−グリコシル化部位、合計１０のグリコシル化部位および３６のシアル酸
残基を持つ２量体である。これらの部位のそれぞれ１つは不完全に修飾されてい
るため、Ｆｃ−ＥＰＯは、ＩＥＦにより分析すると多くの型を有する。Ｆｃ−Ｅ
ＰＯをノイラミニダーゼで処理した際には、この酵素によるシアル酸除去に一致
して、特定のＩＥＦバンドが消失し、他のバンドが現れる。同様に、ＣＨＯ−ｌ
ｅｃ２細胞により産生されたＦｃ−ＥＰＯは、より少数の酸性度の低い型を有す
る。
【００７０】 実施例５． ＥＬＩＳＡ法 ＭＴＸ耐性クローンの上清および他の試験サンプル中の蛋白質産物濃度を定量
するためにＥＬＩＳＡを用いた。ヒトＦｃおよびマウスＦｃ含有蛋白質の量を、
それぞれ、抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよび抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡにより定量し
た。
【００７１】 ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇ
ｏａｔ ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、
ＰＡ）を用い、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ Ｍａｘ
ｉｓｏｒｐ）中１００μｌ／ウェルでコーティングした。コーティングしたプレ
ートをカバーし、４℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中
０．０５％トゥイーン（トゥイーン２０）で４回洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ／
１％ヤギ血漿２００μｌ／ウェルでブロックした。該ブロッキング緩衝液により
３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％トゥイー
ンで４回洗浄し、ペーパータオル上で軽くたたいて乾燥した。
【００７２】 コーティングしたプレートを、適当な濃度に希釈した試験サンプルと共にイン
キュベートした。サンプル緩衝液は、ＰＢＳ中に１％ＢＳＡ、１％ヤギ血漿、お
よび０．０５％トゥイーンを含む。標準曲線は、濃度が知られている（ヒトＦｃ
を具えている）キメラ抗体により作成した。標準曲線を作成するために、サンプ
ル緩衝液中で連続希釈を行い、１２５ｎｇ／ｍＬ〜３．９ｎｇ／ｍＬの範囲の標
準曲線を得た。希釈サンプルおよび標準を、１００μｌ／ウェルでプレートに加
え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プ
レートをＰＢＳ中０．０５％トゥイーンで８回洗浄した。次いで各ウェルに、製
造元の指示に従って、サンプル緩衝液中で希釈した１００μｌの２次抗体、ホー
スラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を加えた。３７℃で２時間のインキュベーション後
、プレートをＰＢＳ中０．０５％トゥイーンで８回洗浄した。基質溶液を１００
μｌ／ウェルでプレートに加えた。該基質溶液は、３０ｍｇのＯＰＤ（ｏ−フェ
ニレンジアミン・２塩酸塩、１錠）を、新しく加えたＨ2Ｏ2を０．０３％含む、
１５ｍＬの０．０２５Ｍクエン酸／０．０５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ５）
に溶解することにより調製した。室温、暗所で３０分間、発色させた。発色時間
は、コーティングしたプレート、２次抗体などのロット間偏差に応じて変化する
ことがある。反応をいつ停止させるかを決めるために、標準曲線における発色を
観察する。反応は、１００μｌ／ウェルの４Ｎ Ｈ2ＳＯ4を加えることによって
停止させた。該プレートを、４９０および６５０ｎｍの両方に設定し、６５０ｎ
ｍでのバックグラウンドＯＤを４９０ｎｍのＯＤから差し引くようにプログラム
された、プレート・リーダーで読み取った。
【００７３】 抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡのための方法は、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中５μ
ｇ／ｍＬのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｕｒｉｎｅ ＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、１
００μｇ／ウェルでコーティングしたこと、および２次抗体がホースラディッシ
ュ・ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ｍｕＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）であったことを
除き、同様である。
【００７４】 実施例６． ヒトＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質のインビトロ活性 下記の方法は、一過性および安定発現によって産生されるヒトＦｃ−ＥＰＯ蛋
白質の活性を試験するために用いたし、また、用いる。細胞培養上清中の各融合
蛋白質の量を、まずＥＬＩＳＡにより定量し、用量反応曲線を設定するために用
いた。該活性は、Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質で見いだされ、また、上で述べた活性
に密接に対応していた。
【００７５】 具体的には、ヒトＦｃ−ＥＰＯおよびアシアロ−ヒトＦｃ−ＥＰＯ分子のＥＰ
Ｏ活性は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイと、続いて分子免疫学の分野の技術者には
知られている標準的手順によって試験した（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ
．， ［１９９６］ Ｊ ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ １４：１４５５−１４６９； Ｋｉｔａｍｕ
ｒａ ｅｔ ａｌ．， ［１９８９］ Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ． １４０：３２３−３３４）。ヒトＴＦ−１細胞系は、ＥＰＯまたは他のサ
イトカインおよび成長因子に反応して増殖する。活発な対数期増殖期中のＴＦ−
１細胞を、ＥＰＯを含まない培地で２回洗浄し、マイクロ・タイター・ウェルに
シアル酸と共に、またはシアル酸なしで、様々な量の市販のＥＰＯまたはＦｃ−
ＥＰＯ融合蛋白質存在下、約１×１０4細胞／ウェルで播種した。細胞を様々な
試験蛋白質存在下で４８時間インキュベートし、放射能取り込みレベル定量の１
０時間前に、０．３マイクロキュリーの3Ｈ−チミジンを加えた。様々なＥＰＯ
およびＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質は、3Ｈ−チミジンの細胞への取り込みを用量依
存的に刺激し、また、モルあたりの3Ｈ−チミジン取り込み刺激においてほぼ等
量的に有効であった。
【００７６】 これらの結果は、Ｆｃ−ＥＰＯのインビトロ生物学的活性は、ノイラミニダー
ゼによる脱シアリル化により増大することを示した。該結果はまた、シアリル化
された、またはされていないＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質は、ヒトＥＰＯと同様の活
性を有することも示した。具体的には、図１は、正常にシアリル化されたヒトＩ
ｇＧ２ Ｆｃ−ＥＰＯの生物学的活性は、酵素により脱シアリル化されたヒトＩ
ｇＧ２ Ｆｃ−ＥＰＯのそれに比べて約２分の１〜５分の１でしかなく、また、
これらのＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質の活性は、モルあたりでＮＩＢＳＣ ＥＰＯと
同様であったことを示している。
【００７７】 実施例７． 非グリコシル化ＥＰＯの部位特異的変異誘発 非グリコシル化ＥＰＯの活性を増大させる変異を、下記のとおりにＦｃ−非グ
リコシル化ＥＰＯ融合蛋白質に導入する。非グリコシル化ＥＰＯをコードするＤ
ＮＡ配列を、１対のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のアミノ酸が変更さ
れたＥＰＯの一部をコードする、対応するオリゴヌクレオチド対で置き換えられ
ていること以外は、実施例１に記載のとおりに構築する。例えば、Ａｓｎ１４７
Ａｌａの変換を導入するために、オリゴ９（配列番号：１１）の代わりに、オリ
ゴヌクレオチド ＡＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣ
ＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＡＴＴＣＣＴＣＣを、対応するように変更
された逆相補オリゴヌクレオチドと共に用いる。この方法によって、下記の変異
：Ｇｌｙ101Ａｌａ、Ａｒｇ143Ａｌａ、Ｓｅｒ146Ａｌａ、およびＡｓｎ147Ａｌ
ａを導入する。これらの変異は、そのＥＰＯ受容体に対する親和性を高めること
により、Ｆｃ−ＥＰＯの活性を増大させる効果を有するようである。別の例とし
て、Ｇｌｎ65を、より小さくかつ／またはより疎水性の側鎖を有するアミノ酸に
変異させる。この変異の効果は、活性なＦｃ−ＥＰＯの画分を増加させることで
ある。この効果は、アミノ酸１１４〜１３０の領域における変異も存在する際に
、顕著である。
【００７８】 他の変異では、実施例１３に記載のとおり、システイン残基を、置換により挿
入および除去する。得られる蛋白質は、特に前述の変異と組み合わせる際に、よ
り安定で、より効率的に発現される。
【００７９】 実施例８． 活性に対する部位特異的変異の試験 Ｆｃ−非グリコシル化ＥＰＯの変異体形態を速やかに試験するために、下記の
戦略を用いた。各変異体形態をコードするプラスミドを、ＢＨＫ細胞などの哺乳
動物細胞にトランスフェクトする。組織培養上清を取り出し、そして、ＥＬＩＳ
ＡによりヒトＦｃ、ヒトＥＰＯについて、およびＴＦ１細胞増殖アッセイにおけ
る活性について、定量した。各上清の４つの希釈液を、二重法で試験した。希釈
液中のＦｃ−非グリコシル化ＥＰＯ濃度は、約０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎ
Ｍ、および１０ｎＭであった。
【００８０】 実施例９． Ｆｃ−ＥＰＯのランダム変異誘発 予め選択がなされていないＦｃ−非グリコシル化ＥＰＯの変異体形態を創製す
るために、下記の方法の１つを用いる。例えば、成熟型非グリコシル化ＥＰＯの
コード配列を、１０の別々のプールを生成する以外は、実施例１に記載のとおり
に合成する。第１のプールでは、オリゴ１およびその逆相補鎖を、オリゴヌクレ
オチド前駆体の混合物を用いて、各ヌクレオチドが変異する確率３％を有するよ
うに合成する。その結果、平均して、各オリゴヌクレオチドは１から２個のアミ
ノ酸置換を有することになる。同様に、第２のプールにおいても、オリゴ２とそ
の逆相補鎖を、オリゴヌクレオチド前駆体の混合物を用いて、各ヌクレオチドが
変異する確率３％を有するように合成する、等々。
【００８１】 ライゲーションおよび大腸菌への形質転換後、各プールについて、約２０コロ
ニーを取り出す。２０の形質転換体それぞれからＤＮＡを作製し、次いで、別々
にＢＨＫ細胞などの哺乳動物細胞系に導入する。次いで、一過性にトランスフェ
クトした各細胞群の上清のＥＰＯ活性を、実施例８に記載のとおりに試験する。
【００８２】 特定のトランスフェクトしたＢＨＫ系が、より強い比活性を有するＥＰＯを産
生することが判明した。変異体コード領域の対応するＤＮＡ配列を決定する。こ
れらの変異および上述の実施例において特定された変異に基づき、多重変異体コ
ード配列を構築する。対応する多重変異体蛋白質が発現され、特定の形態は、個
々の変異体「親」形態よりもさらに強い比活性を有することが判明した。
【００８３】 実施例１０． 薬物動態データ 現在のところ、エリトロポエチンは、通常、１週間に３回患者に投与する（Ｐ
ｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ［１９９６］「ＥＰＯｇ
ｅｎ：ＥＰＯｅｔｉｎ Ａｌｆａ」、ｐ．４８９−４９６）。静脈内投与したエ
リトロポエチンの血漿半減期は、約４〜１３時間である。エリトロポエチンの皮
下投与後、血漿レベルは、５〜２４時間以内に最大に達する。赤血球産生を刺激
し、また、エリトロポエチンよりも長い血漿半減期を具える蛋白質を手にするこ
とは有益であり、投与をより少ない頻度とできる。
【００８４】 実施例１１． Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質の薬物動態 ヒトＥＰＯ蛋白質および特定の人Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質を、Ｂａｌｂ／ｃマ
ウスに静脈内注射した後の薬物動態について試験した。マウスから眼窩後出血に
より採血し、エッペンドルフ・マイクロ遠心チューブ中４℃で保存した。ＥＬＩ
ＳＡ法を用いて、様々な時点で血中に残存する、ヒトＦｃ領域などのヒト抗体関
連蛋白質の量を定量した。ヒト抗体を定量するＥＬＩＳＡでは、捕捉のためにヒ
トＨおよびＬ鎖に対する抗体を、検出のために抗ヒトＦｃ抗体を用いた。ウェス
タンブロットを用いて、Ｆｃ−エリトロポエチン融合蛋白質が正しいサイズを保
持し、分解されていないことを検証した。そのままのＦｃ−エリトロポエチン融
合蛋白質部分を検出するための別法として、改良ＥＬＩＳＡ法を用いた。この融
合蛋白質特異的アッセイは、同じ第１の捕捉ステップを用いるが、検出には抗ヒ
トＥＰＯ抗体を用いる。ＥＰＯ自体を検出するために、捕捉抗体および検出抗体
の両方がヒトＥＰＯに特異的である。例えば、ヒトＥＰＯ検出キットを用いる。
これらの実験において、該Ｆｃ−ＥＰＯ融合体は、約２〜４時間の血漿半減期を
有していた。これに対して、特定のより入念に遺伝子操作されたＦｃ−ＥＰＯ融
合体の血漿半減期は、試験したところ、はるかに長いことが判明した。例えば、
抗体全体−ＥＰＯ融合体を試験したところ、約１０〜２０時間またはさらに長い
マウスでの血漿半減期を有している。
【００８５】 そのままのアシアロ−ＥＰＯの血漿半減期は、非常に短いことが測定されてい
る。プローブとして、ヒトＩｇＧに対する抗体を用いるウェスタンブロッティン
グにより測定されたとおり、アシアロ−Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質のエリトロポエ
チン部分は、速やかに分解されるが、Ｆｃ部分は比較的安定で、血漿中で保持さ
れる。これらの結果は、特定のＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質だけが長い血漿半減期を
有し、また、Ｆｃ部分は、蛋白質の血漿半減期を延長する上で、普遍的に十分で
あるわけではないことを示している。
【００８６】 実施例１２． Ｆｃ−ＥＰＯ融合蛋白質のインビボ活性 ヒトＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質のインビボ活性を試験し、そのままのヒトＥＰＯ
と比較した。投与後の短い期間内の赤血球産生刺激を測定するアッセイを用い、
モルあたりで、Ｆｃ−エリトロポエチンの活性は、そのままのヒトＥＰＯのそれ
とほぼ同等である。
【００８７】 正常赤血球血マウスアッセイにおいて、ヒトＥＰＯおよびＩｇＧ２ Ｆｃ−Ｅ
ＰＯの活性をアッセイした。該アッセイ手順の開始の１週間前に、Ｂ６Ｄ２Ｆ１
系の８週齡の雄マウスを、ケージ当たり６匹ずつケージに入れた。各ケージ群内
で、各マウスに濃度１０、２０または４０マイクログラム／ｍｌのエリトロポエ
チンまたはＦｃ−ＥＰＯを０．５ｍｌ注射した、なお、Ｆｃ−ＥＰＯの用量は、
ＥＬＩＳＡにより決定した、ＥＰＯ単量体の量の計算により測定した。各実験で
は、各用量群に８匹のマウスを用いた。
【００８８】 注射の４日後、血液サンプルを採取し、赤血球３０，０００個あたりの網状赤
血球の数を下記のとおりに求めた。１マイクロリットルの全血を、１ミリリット
ルの０．１５マイクロモルのアクリジンオレンジに加えた。３〜１０分間の染色
後、赤色蛍光ヒストグラムの分析により、網状赤血球数をフローサイトメトリー
計測器において微蛍光測定法により定量した。下記のデータが得られた。
【００８９】
【表１】 このアッセイの変形において、マウスに、エリトロポエチン、Ｆｃ−エリトロ
ポエチン、Ｉｇ−エリトロポエチン、および変異、切断、または変更されたグリ
コシレーション・パターンを含む様々な他のＦｃ−ＥＰＯの形態を投与する。網
状赤血球を、試験蛋白質の注射後第４日、５日、６日、および７日に採血する以
外は前述のとおりに測定する。この様式で実験を行うことにより、試験蛋白質の
機能的薬物動態が示される。そのままのＩｇ−ＥＰＯなどの特定のＦｃ−ＥＰＯ
の形態は通常のＥＰＯよりも長い期間機能的活性を示すことが明らかにされてい
る。ＥＰＯ活性を測定するための別法として、ヒトＥＰＯおよびＦｃ−ＥＰＯ蛋
白質のインビボ活性を、絶食ラットアッセイ（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ Ｅ．ａｎ
ｄ Ｇｒｏｓｓ Ｍ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ａｓｓａｙ ａｎｄ ｓ
ｔｕｄｙ ｏｆ ｉｔｓ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．［１９７５］３７ Ｐｔ Ｂ：１０９−２１）により試験する。
約２１５から２５０グラム（約９週齡）の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙレー
トを第１日に絶食させる。次いで、第２および第３日にこれらのラットに２ｍｌ
の試験物質を静脈内注射する。ラットを５匹ずつの群に分ける。標準曲線を作成
するために、１群には生理食塩水を、他の４群には１匹あたり１．０、１．５、
２．０または３．０ユニットのエリトロポエチンを注射する（１．２４６ユニッ
トが１ナノグラム（＝２６．７フェントモル；確認されたい）の糖蛋白質に相当
する）。第４日に、２回目の注射から２８時間後、クエン酸塩で緩衝化した生理
食塩水中１．０マイクロキュリーの59Ｆｅ3+を腹腔内注射する。59Ｆｅ3+注射の
１６から１８時間後、ラットを麻酔し、ヘパリン加シリンジを用いて心臓穿刺に
より採血する。放射性標識を計数するために１ｍｌの血液を採取し、ミクロヘマ
トクリット管にも血液を充填する。動物を秤量する。血液は動物の体重の５％を
構成すると仮定して、注射した59Ｆｅ3+の全赤血球量に取り込まれたパーセント
を計算する。ヘマトクリットを記録し、ヘマトクリットが５０未満のラットから
のデータは廃棄する。各試験群の平均値から食塩対照群の平均値を差し引いて、
ＥＰＯまたはＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質により刺激された取り込みパーセントを求
めることにより、データを評価する。もう１つの代替法として、ヒトＥＰＯおよ
びＦｃ−ＥＰＯ蛋白質のインビボ活性を多血症マウスアッセイアッセイアッセイ
（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ Ｅ．ａｎｄＧｒｏｓｓ Ｍ．同上）によって試験する
。このアッセイでは、赤血球生成を抑制するよう、マウスに過剰の赤血球を投与
する。赤血球多血症を作製する方法は、低圧（約０．５気圧）への曝露、正常圧
での低酸素への曝露、低レベルの一酸化炭素への曝露、またはＯ2分圧の漸減へ
の曝露を含む。マウスがヘモグロビン合成増大のために十分な鉄を確実に有する
ようにするため、低酸素ストレスに曝露する前に、マウスに２．５ｍｇの鉄−デ
キストランを皮下注射してもよい。第１日にマウスを正常な酸素環境に戻し、第
８日に59Ｆｅ3+を注射する。あるいは、マウス赤血球をマウスに注射する。例え
ば、１ｍｌの同種の濃縮洗浄赤血球を第１および第３日に腹腔内注射する。試験
サンプルは食塩対照および１匹あたり０．０５、０．１０および０．２０ユニッ
トの標準用量を含む。これらを第５および第６日に注射し、第７日に59Ｆｅ3+を
注射し、第１０日にマウスから採血する。１ｍｌの血液を計数する。ヘマトクリ
ットに血液の一部を用いる。マウスを秤量する。体重の血液に相当するパーセン
トは８％と仮定される。ヘマトクリットが５５未満の場合、そのマウスのデータ
は用いない。これらの方法の変形、ならびに他の方法も、様々なＥＰＯ蛋白質型
のインビボ活性を調べるために用いることができる。
【００９０】 実施例１３． 変更されたジスルフィド結合パターンを含むＦｃ−ＥＰＯ変異体の構築と発現 Ｆｃ−ＥＰＯ内のＥＰＯ部分のジスルフィド結合パターンを変更する変異を下
記のとおりに導入した。Ｈｉｓ32Ｇｌｙ、Ｃｙｓ33Ｐｒｏ、Ｔｒｐ88Ｃｙｓおよ
びＰｒｏ90Ａｌａの変更を、標準的部位特異的変異誘発技法によってヒトＦｃ−
ＥＰＯに導入した。この蛋白質はＦｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）と命名さ
れた。Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）を先の実施例に記載のものと類似の
方法により、哺乳動物細胞で発現させた。Ｆｃ−ＥＰＯおよびＦｃ−ＥＰＯ（Ｃ
ｙｓ29−Ｃｙｓ88）蛋白質を、Ｓｔａｐｈ Ａ蛋白質カラムを用いて実施例２に
記載のとおりに精製した。
【００９１】 Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）はＴＦ−１細胞の増殖を測定する細胞に
基づくアッセイにおいて、Ｆｃ−ＥＰＯに比べて１．５から２倍活性が高いこと
が判明した。Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）がＦｃ−ＥＰＯよりも活性が
高い理由を調査するために、各精製蛋白質をＨＰＬＣで調べた。図４および５に
典型的な結果を示す。Ｆｃ−ＥＰＯ蛋白質の約１／３から１／２は見かけ分子量
約１００，０００ダルトンでカラムを移動し、これは２量体Ｆｃ−ＥＰＯの推定
分子量であるが、残りの１／２から２／３のＦｃ−ＥＰＯ蛋白質ははるかに高い
分子量で移動し、Ｆｃ−ＥＰＯが凝集状態であることを示していた（例えば、図
４のとおり）。変性および還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、この高
分子量物質は他の蛋白質の混入によるものではないことが示された。これに対し
て、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）蛋白質の約９５％は見かけ分子量約１
００，０００ダルトンでＨＰＬＣカラムを移動し、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃ
ｙｓ88）の約５％だけが明らかに凝集状態であった（例えば、図５）。標準的Ｈ
ＰＬＣ条件を用いた。
【００９２】 Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）の増強された安定性をさらに調べるため
に、Ｆｃ−ＥＰＯおよびＦｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）の両方を、エリト
ロポエチンから３つのＮ−結合型オリゴ糖を除去するＮ−グリカナーゼで処理し
た。製造元の指示に従い、標準的消化条件を用いた。これらの条件下で、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより調べたところ、Ｎ−結合型オリゴ糖はＦｃ−ＥＰＯおよびＦｃ
−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）から１時間以内に完全に除去された。１時間よ
りも長時間インキュベーションしてもＦｃ−ＥＰＯ蛋白質の移動度に影響はなか
ったが、Ｎ−グリカナーゼによる消化条件下でさらにインキュベートすると、前
述のとおり、Ｆｃ−ＥＰＯの生物学的活性が速やかに失われることになるが、Ｆ
ｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）では活性は消失しないことが明らかとなった
。
【００９３】 Ｆｃ−ＥＰＯまたはＦｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）をＮ−グリカナーゼ
存在下で様々な時間インキュベートした後、−２０℃で凍結することにより反応
を停止し、処理Ｆｃ−ＥＰＯの様々な希釈液と共にＴＦ−１細胞をインキュベー
トした。3Ｈ−チミジン取り込みの刺激を測定し、ＮＩＢＳＣエリトロポエチン
標準と比較した。下記の表に示すとおりの結果が得られた。
【００９４】
【表２】 これらの結果より、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）はＦｃ−ＥＰＯに比
べ、Ｎ−グリカナーゼ処理に対してはるかに安定であることが示された。理論に
しばられようとすることなく、Ｎ−グリカナーゼの緩衝液条件、すなわちリン酸
緩衝化食塩水がＦｃ−ＥＰＯ内の脱グリコシル化ＥＰＯ部分を不安定化している
か、またはＮ−グリカナーゼにＥＰＯ部分を不活化するプロテアーゼが混入して
いる可能性がある。Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）への変異の導入は、Ｅ
ＰＯのＣｙｓ29およびＣｙｓ88の間のジスルフィド結合形成を可能にする。同様
に、そのままの非融合ヒトＥＰＯへの類似の変異の導入は、Ｃｙｓ29およびＣｙ
ｓ88の間のジスルフィド結合形成を引き起こす。ジスルフィド結合は、非還元条
件下でトリプシンなどの部位特異的エンドプロテアーゼにより切断した後、得ら
れたペプチドを質量分析またはＨＰＬＣ分析を用いて分析することにより、特定
する。
【００９５】 例えば、対照を用いて下記の一連の実験を行う。ヒトＦｃ−ＥＰＯ、ヒトＦｃ
−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）、ヒトＥＰＯ、およびヒトＥＰＯ（Ｃｙｓ29−
Ｃｙｓ88）を、還元および非還元の両方の条件下、トリプシンで切断する。これ
ら８つのサンプルを質量分析により分析する。トリプシン処理した非還元ヒトＦ
ｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）およびヒトＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）は
それぞれ、２つのＮ−結合型グリコシレーションを有するＥＡＥＮＩＴＴＧＣＡ
ＥＧＰＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫ＋ＧＱＡＬＬＶＮＳＳＱＰＣＥＰＬＱＬＨＶＤ
Ｋに対応する高分子量のピークを示す。サイズが大きく、２つのＮ−グリコシレ
ーションによって不均質になっているため、このピークは他のピークから容易に
識別される。このピークは還元サンプルまたは非変異体ヒトＥＰＯもしくは非変
異体ヒトＦｃ−ＥＰＯ由来のサンプルでは認められない。Ｎ−グリカナーゼ処理
したサンプルでは、ＥＡＥＮＩＴＴＧＣＡＥＧＰＳＬＮＥＮＩＴＶＰＤＴＫ（配
列番号：２、２１〜４５位）＋ＧＱＡＬＬＶＮＳＳＱＰＣＥＰＬＱＬＨＶＤＫ（
配列番号：２、７７〜９７位）に対応するピークはアミノ酸単独の分子量により
推定されるサイズにシフトする。
【００９６】 他の方法でＦｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）をさらに試験し、これが有利
であることが判明した。例えば、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）はマウス
、ヒト、または他の哺乳動物で試験すると、優れた薬物動態特性を有している。
Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）およびＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）の凍
結乾燥型は、対応するＦｃ−ＥＰＯおよびＥＰＯ蛋白質よりも安定である。高温
での長時間インキュベーション後の残存生物学的活性試験などの長期安定性試験
では、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）およびＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88 ）は対応するＦｃ−ＥＰＯおよびＥＰＯ蛋白質よりも安定である。Ｆｃ−ＥＰＯ
（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）およびＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）は対応するＦｃ−
ＥＰＯおよびＥＰＯ蛋白質よりもプロテアーゼ抵抗性である。
【００９７】 加えて、特定の態様において有利であるが、同時にＥＰＯ部分の安定性を低下
させる変異を、ＥＰＯ部分に導入することが有用であることもある。そのような
場合には、Ｃｙｓ29およびＣｙｓ88の間にジスルフィド結合を形成させる１つま
たは複数の変異を導入することも有用である。追加のジスルフィド結合の効果は
変異したＥＰＯの安定性を増大させることである。例えば、Ｇｌｙ101→Ａｌａ
、Ａｒｇ143→Ａｌａ、Ｓｅｒ146→Ａｌａ、およびＡｓｎ147→Ａｌａの変異は
、ＥＰＯのシグナリング活性を増大させる。このタイプの変異はＥＰＯの特定の
性質に関して有利であるが、医薬品開発のためには蛋白質を不安定化する。
【００９８】 ＥＰＯのＣｙｓ29およびＣｙｓ88の間のジスルフィド結合を形成させる１つま
たは複数の変異の有利な性質は、Ｆｃ部分が結合されていないそのままのＥＰＯ
でも観察され、また、ＥＰＯの他の部分への融合蛋白質、グリコシレーションレ
ベルが低下、増大、または質的に変更されたＥＰＯの形態などの他のＥＰＯの形
態でも観察される。
【００９９】 同様の一連の実験において、Ａｒｇ139→ＣｙｓおよびＣｙｓ29からＡｌａ、
Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅなどの他のアミノ酸への変異を含むヒトＦｃ−ＥＰ
Ｏ蛋白質をコードする発現プラスミドを、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）
の構築と同様に構築する。プロテアーゼ処理および質量分析による分析から、こ
の蛋白質はＣｙｓ33およびＣｙｓ139の間のジスルフィド結合を含むことが示さ
れ、したがってＦｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）と命名されている。Ａｒ
ｇ139→Ｃｙｓおよびｃｙｓ29からＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅなどの
他のアミノ酸への変異を含むヒトＥＰＯをコードする類似の発現プラスミドも構
築する。Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）はいくつかの有利な性質を有し
ている。例えば、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）は主として通常の２量
体型であり、ヒトＦｃ−ＥＰＯに比べて凝集型が少ない。例えば、精製したＦｃ
−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）をＨＰＬＣで分析すると、物質のほとんどは
見かけ分子量約１００ｋＤで移動する。もう１つの有利な性質はＦｃ−ＥＰＯ（
Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）がヒトＦｃ−ＥＰＯよりも活性が高いことである。理論
にしばられようとすることなく、Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）および
ヒトＦｃ−ＥＰＯ両方の１００ｋＤ型が活性型であり、ＨＰＬＣで求めた見かけ
の分子量が高い型はほとんど、またはまったく活性がないようである。Ｆｃ−Ｅ
ＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）およびＦｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88）は活
性が２５％から１００％に増大しているが、これらの蛋白質は製造が高価で、貧
血患者の大集団を治療するために大量に用いられるため、この活性の改善は経済
的に重要である。
【０１００】 Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）はヒトＦｃ−ＥＰＯに比べて薬物動態
も改善されている。Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）はヒトＦｃ−ＥＰＯ
に比べて溶液および凍結乾燥型での長期安定性改善も示す。
【０１０１】 Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）は、ヒトＦｃ−ＥＰＯを不安定化する
追加の変更または変異存在下で、著しく安定性が増大しているという有利な性質
も有する。
【０１０２】 Ｆｃ−ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）の有利な性質は、Ｆｃ部分のないＥＰ
Ｏ（Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ139）でも観察される。例えば、ＥＰＯ（Ｃｙｓ33−Ｃｙ
ｓ139）は安定性増大、活性改善、優れた薬物動態、長期安定性改善、および追
加の不安定化する変更存在下での著しい安定性増大を示す。
【０１０３】 ヒトＦｃ−ＥＰＯおよびヒトＥＰＯの他の有用な型は、Ｃｙｓ29およびＣｙｓ 88 、ならびにＣｙｓ33およびＣｙｓ139の間にジスルフィド結合を有する多重変
異体蛋白質を含む。例えば、ＥＰＯ（Ｃｙｓ29−Ｃｙｓ88＋Ｃｙｓ33−Ｃｙｓ13 9 ）は安定性増大、活性改善、優れた薬物動態、長期安定性改善、および追加の
不安定化する変異存在下での著しい安定性増大を示す。ヒトＦｃ−ＥＰＯおよび
ヒトＥＰＯは他のジスルフィド結合導入により有利な性質を持つよう操作される
。そのようなジスルフィド結合の設計は、Ｘ線結晶学およびＮＭＲを用いて決定
されたヒトＥＰＯの知られている構造を指標とすることができる。例えば、ヒト
ＥＰＯまたはヒトＦｃ−ＥＰＯのＡｌａ22およびＰｈｅ142をそれぞれシステイ
ンで置換し、これらの新しいシステインの間でジスルフィド結合が形成される。
Ｐｈｅ142をそれよりも小さいシステインで置換したことによる、ＥＰＯ部分の
疎水性中心内の空き容積を補うために、疎水性中心内の別の近接アミノ酸側鎖を
大きい側鎖で最適に置換する。例えば、Ｖａｌ74をＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｉ
ｌｅ、またはＭｅｔで置換する。得られる、追加のジスルフィドを有する蛋白質
は、安定性増大、活性改善、優れた薬物動態、長期安定性改善、および追加の不
安定化する変異存在下での著しい安定性増大を示す。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｎ−グリコシダーゼで処理したＦｃ−エリトロポエチンを示す図である。Ｎ−
ＳＤＳゲルは、グリコシダーゼＦ処理の前後のＦｃ−エリトロポエチンを示して
おり、レーン１は分子量サイズ標準、レーン２はブランク、レーン３は正常にグ
リコシル化されたＦｃ−ＥＰＯ、レーン４は脱グリコシル化緩衝液中でのインキ
ュベーション後の正常にグリコシル化されたＦｃ−ＥＰＯを示し、また、レーン
５、６、および７は、それぞれ０．５ｍｌ中２０ユニットのＮ−グリコシダーゼ
Ｆ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とともに、３時間、６時間、ま
たは１８時間のインキュベートを行った、正常にグリコシル化されたＦｃ−ＥＰ
Ｏを示す。
【図２】 ＮＩＢＳＣ ＥＰＯ（黒菱形）、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ−ＥＰＯ（白四角）、変
異したグリコシル化部位を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ−ＥＰＯ（白丸）、および
ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞で発現されたヒトＩｇＧ２ Ｆｃ−ＥＰＯ（白菱形）の生
物学的活性を示す折れ線グラフを示す図である。様々な蛋白質中のＥＰＯ部分の
活性は、ＥＰＯ依存性３Ｈ−チミジンのＴＦ−１細胞への取り込みによってアッ
セイした。Ｘ軸は、ＥＬＩＳＡで求めたＥＰＯの当量（ｎｇ／ｍｌ）を示し、Ｙ
軸は、依存的な3Ｈ−チミジンの取り込みをカウント／分の単位で示している。
【図３】 様々な時間、ノイラミニダーゼで処理したヒトＩｇＧ２ Ｆｃ−ＥＰＯの生物
学的活性を示す折れ線グラフを示す図である。Ｆｃ−ＥＰＯを、緩衝液単独（黒
丸）、０．１ユニットのノイラミニダーゼで１５分間（白四角）、１時間（白菱
形）、３．５時間（白三角）、または２２時間（白丸）処理した。様々な蛋白質
中のＥＰＯ部分の活性は、ＥＰＯ依存性３Ｈ−チミジンのＴＦ−１細胞への取り
込みによってアッセイした。Ｘ軸は、ＥＬＩＳＡで求めたＥＰＯの当量（ｎｇ／
ｍｌ）を示し、Ｙ軸は、依存的な3Ｈ−チミジンの取り込みをカウント／分の単
位で示している。
【図４】 次の変更：Ｈｉｓ32→Ｇｌｙ、Ｃｙｓ33→Ｐｒｏ、Ｔｒｐ88→Ｃｙｓ、および
Ｐｒｏ90→Ａｌａを除き、ＥＰＯ部分はヒトＥＰＯの配列を有する、精製Ｆｃ−
ＥＰＯのＨＰＬＣ特性を示す図である：。７．０６４のピークは、（Ｆｃ−ＥＰ
Ｏ）2を表し、５．３０２のピークは、分子量が少なくとも８００，０００ダル
トンの凝集物質を表している。７．０６４のピークは、検出された物質の９３．
２％に相当するが、５．３０２のピークは、ロードした物質の６．８％に相当す
る。
【図５】 ＥＰＯ部分はヒトＥＰＯの配列を有する、精製Ｆｃ−ＥＰＯのＨＰＬＣ特性を
示す図である。７．２５４のピークは、（Ｆｃ−ＥＰＯ）2を表し、６．０７９
のピークは、（Ｆｃ−ＥＰＯ）2のオリゴマー凝集物を表し、５．３３０のピー
クは、分子量が少なくとも８００，０００ダルトンの凝集物質を表している。７
．２５４のピークは、検出された物質の４３．４％に相当するが、６．０７９お
よび５．３３０のピークは、それぞれロードした物質の３０．５％および２５．
２％に相当する。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月１２日（２００１．１０．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/505 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250， Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 ハルトマン、 アルノ ドイツ連邦共和国 64354 ラインハイム ウェストリング ６ (72)発明者 ブラント、 シルケ ドイツ連邦共和国 64283 ダルムシュタ ット アーデラングシュトラーセ 35 (72)発明者 リーケ、 エルヴィン ドイツ連邦共和国 64342 シーハイム ヘルマンシュトラーセ 12 (72)発明者 ソーベル、 コーネリアス ドイツ連邦共和国 99130 マインツ ア ン デル キルシェ ４ (72)発明者 ロー、 キン‐ミン アメリカ合衆国 02420 マサチューセッ ツ州 レクシントン キャロル レイン ６ (72)発明者 ウェイ、 ジェフリー、 シー． アメリカ合衆国 02140 マサチューセッ ツ州 ケンブリッジ エイヴォン プレイ ス 12 (72)発明者 ジリース、 ステファン アメリカ合衆国 01741 マサチューセッ ツ州 カーライル サンセット ロード 159 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA03 BA61 CA04 CA05 CA07 DA02 DA06 DA11 EA04 GA11 HA08 4B064 AG18 AG26 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CC24 DA03 4B065 AA01X AA26X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA07 BA44 DB56 NA05 ZA55 ZB21 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 BA41 CA40 DA31 DA75 EA24 FA72 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 改善された性質を有するエリトロポエチン（ＥＰＯ）の形態
    であって、 （ａ）Ｆｃ部分が、直接または間接的に、そのＣ末端を介して、前記ＥＰＯ分
    子に共有結合的に融合されており、また、該Ｆｃ部分ならびにＥＰＯ部分は、修
    飾または改変を受けていてもよい、下記の群より選択される、Ｉｇ分子のＦｃ部
    分およびＥＰＯ分子を含んでなる融合蛋白質（Ｆｃ−ＥＰＯ）： （ｉ）Ｆｃ−ＥＰＯ （ｉｉ）Ｆｃ−Ｌ−ＥＰＯ （ｉｉｉ）Ｆｃ−ＥＰＯdesial （ｉｖ）Ｆｃ−ＥＰＯm （ｖ）Ｆｃm−ＥＰＯ （ｖｉ）Ｆｃm−ＥＰＯm （ｖｉｉ）Ｆｃm−Ｌ−ＥＰＯ （ｖｉｉｉ）Ｆｃ−Ｌ−ＥＰＯm （ｉｘ）Ｆｃ−ＥＰＯtrunc （ｘ）Ｆｃ−Ｌ−ＥＰＯtrunc ただし、 ＥＰＯは、グリコシル化されている、グリコシル化されていない、部分的にグ
    リコシル化されている、あるいは、そのグリコシレーション・パターンに、それ
    以外の変更を施されているかであり； ＥＰＯdesialは、部分的にシアリル化されているか、またはシアリル化されて
    いないＥＰＯであり； ＥＰＯmは、そのアミノ酸配列に改変がなされているが、末端の切断を受けて
    いないＥＰＯであり； ＥＰＯtruncは、そのアミノ酸配列は、末端の切断を受けているが、改変はな
    されていないＥＰＯであり； Ｆｃmは、そのアミノ酸配列は、改変および／または末端の切断を受けている
    か、かつ／または、そのグリコシレーション・パターンに変更が施されているか
    のＦｃ部分であり、および Ｌは、プロテアーゼ切断部位を持たないリンカー分子である、 あるいは （ｂ）融合していない、ヒトもしくは哺乳動物ＥＰＯ、あるいはヒトもしくは
    哺乳動物ＥＰＯのシステインもしくはジスルフィド結合のパターンとは相違する
    、システインもしくはジスルフィド結合のパターンを有するＥＰＯm のいずれかであるＥＰＯの形態。
  2. 【請求項２】 改善された生物学的活性を示す、請求項１に記載のＥＰＯの
    形態。
  3. 【請求項３】 延長された血漿中半減期を有する、請求項２に記載のＥＰＯ
    の形態。
  4. 【請求項４】 前記の延長された血漿中半減期が２０時間よりも長い、請求
    項３に記載のＥＰＯの形態。
  5. 【請求項５】 前記融合蛋白質は、改変を受けていないＥＰＯ分子を有する
    類似するＦｃ−ＥＰＯ融合蛋白質よりも高い比活性を有する、請求項１に記載の
    融合蛋白質（ｉｖ）、（ｖｉ）または（ｖｉｉｉ）。
  6. 【請求項６】 ＥＰＯm部分において、下記の変換： Ａｓｎ24、38、83→Ｇｌｎ、Ｓｅｒ126→Ａｌａ、Ｈｉｓ32→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ34→
    Ａｒｇ、Ｐｒｏ90→Ａｌａの少なくとも１つがなされている、請求項５に記載の
    融合蛋白質。
  7. 【請求項７】 ＥＰＯtruncは、そのＣ末端がＥＰＯまたはＥＰＯmの１０８
    、９８、９３、８８、８５または７７位のアミノ酸で終端しているアミノ酸配列
    を有している、請求項１に記載の融合蛋白質（ｉｘ）および（ｘ）。
  8. 【請求項８】 該Ｆｃm部分の改変は、Ｆｃ受容体への親和性低下を引き起
    こしている、請求項１に記載の融合蛋白質。
  9. 【請求項９】 該リンカーＬは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）x（ｘ＝１〜４）である
    、請求項１に記載の融合蛋白質。
  10. 【請求項１０】 該ＥＰＯ分子またはＥＰＯm分子のシステイン残基の少な
    くとも１つが、遺伝子操作されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融
    合蛋白質。
  11. 【請求項１１】 該ＥＰＯ部分は、ヒトまたは哺乳動物エリトロポエチンと
    は異なるジスルフィド結合パターンを有している、請求項１０に記載の融合蛋白
    質。
  12. 【請求項１２】 ＥＰＯは、下記のアミノ酸変異： ２９位は、Ｃｙｓではなく、３３位は、Ｃｙｓではなく、８８位は、Ｃｙｓであ
    り、１３９位は、Ｃｙｓであることの少なくとも１つを含む、請求項１０または
    １１に記載の融合蛋白質あるいは請求項１に記載の非融合ＥＰＯ。
  13. 【請求項１３】 前記遺伝子操作されたシステイン残基は、ジスルフィド結
    合を形成している、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質または
    非融合ＥＰＯ。
  14. 【請求項１４】 該ＥＰＯは、ヒトＥＰＯ由来であり、下記の改変： Ｈｉｓ32→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ34→ＡｒｇおよびＰｒｏ90→Ａｌａの少なくとも１つ
    を有している、請求項１２または１３に記載の融合蛋白質あるいは非融合ＥＰＯ
    。
  15. 【請求項１５】 該Ｆｃ融合蛋白質内のＥＰＯ部分またはＥＰＯm部分は、
    ２量体化している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  16. 【請求項１６】 前記融合蛋白質は、Ｉｇ分子全体である、請求項１〜１５
    のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  17. 【請求項１７】 該Ｉｇ分子およびＥＰＯ分子は、哺乳動物起源である、請
    求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  18. 【請求項１８】 該Ｉｇ分子は、ヒトＩｇＧである、請求項１７に記載の融
    合蛋白質。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜１８に記載のＥＰＯの形態のいずれかをコード
    するＤＮＡ配列。
  20. 【請求項２０】 （ａ）シグナル／リーダー配列と （ｂ）Ｉｇ分子のＦｃ領域と （ｃ）エリトロポエチンの生物学的活性を有する標的蛋白質配列とを含んでな
    る、請求項１に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡ分子。
  21. 【請求項２１】 請求項１９または２０に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベ
    クター。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載のベクターを含んでなる、請求項１に記
    載のＥＰＯの形態の発現に適合する宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 請求項１に記載の融合蛋白質を生産する方法であって、 （ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、分泌のためのリーダー配列、該Ｆｃ部分およ
    び該ＥＰＯ、ＥＰＯmまたはＥＰＯtruncを含んでなる前駆蛋白質をコードするＤ
    ＮＡを構築することと、 （ｉｉ）前記融合ＤＮＡを適切な発現ベクター中に配置することと、 （ｉｉｉ）前記融合蛋白質を真核細胞中で発現させることと、 および （ｉｖ）前記分泌された融合蛋白質を精製すること を含んでなる方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＥＰＯの形態と、
    製薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
  25. 【請求項２５】 少なくとも１つの付加的な薬理的に有効な薬剤および／ま
    たは補助薬を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008504008A (ja) * 2003-12-31 2008-02-14 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 改良された薬物動態を有するＦｃ−エリスロポエチン融合タンパク質
JP2009509564A (ja) * 2005-10-03 2009-03-12 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 血漿中半減期が調節された融合タンパク質
JP2015525216A (ja) * 2012-06-08 2015-09-03 アルカーメス，インコーポレイテッド ムチン−ドメインポリペプチドリンカーを含む融合ポリペプチド
JP2016513733A (ja) * 2013-03-14 2016-05-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アペリン融合タンパク質およびその使用

Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US20050181482A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Meade Harry M. Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk
ES2273497T3 (es) * 1998-06-15 2007-05-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. Proteina de fusion de la albumina serica humana de eritropoyetina analoga.
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
WO2001058957A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AU2002248571B2 (en) * 2001-03-07 2007-01-18 Merck Patent Gmbh Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
EP1383785B1 (en) * 2001-05-03 2011-03-16 Merck Patent GmbH Recombinant tumor specific antibody and use thereof
KR100467750B1 (ko) * 2001-11-29 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
KR100467751B1 (ko) 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
AU2002357784B2 (en) 2001-12-04 2008-07-31 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
DE10160248A1 (de) * 2001-12-07 2003-06-26 Alexander Cherkasky Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen
WO2003060071A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
SI1624891T2 (sl) 2003-05-06 2013-09-30 Biogen Idec Hemophilia Inc. Strjevalni faktor-FC himerni proteini za zdravljenje hemofilije
PT1699822E (pt) 2003-12-30 2008-07-30 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusão de il-7
AU2005203962C1 (en) 2004-01-05 2012-11-08 Antisoma Research Limited Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US20080194475A1 (en) * 2004-04-23 2008-08-14 Andrew Buchanan Erythropoietin Protein Variants
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US9345745B2 (en) 2005-04-29 2016-05-24 Bo Wang Methods for treating inflammatory disorders and traumatic brain injury using stabilized non-hematopoietic EPO short peptides
US8653028B2 (en) * 2005-04-29 2014-02-18 Rui Rong Yuan Erythropoietin-derived short peptide and its mimics as immuno/inflammatory modulators
US9585932B2 (en) 2005-04-29 2017-03-07 Peter C. Dowling Use of EPO-derived peptide fragments for the treatment of neurodegenerative disorders
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
CN100436482C (zh) * 2006-04-14 2008-11-26 东莞太力生物工程有限公司 长效人促红细胞生成素融合蛋白及其制备和纯化方法
WO2009012600A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins
ES2750254T3 (es) 2007-09-27 2020-03-25 Amgen Inc Formulaciones farmacéuticas
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
ES2500066T3 (es) 2008-01-25 2014-09-30 Amgen, Inc Anticuerpos frente a ferroportina y métodos de uso
AU2009246946B2 (en) 2008-05-01 2013-09-26 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
ES2766257T3 (es) 2008-11-13 2020-06-12 Massachusetts Gen Hospital Métodos y composiciones para regular la homeostasis del hierro mediante la modulación de bmp-6
MX2011011044A (es) 2009-04-22 2011-11-04 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de anticuerpos con sitios de enlace de receptor fc neonatal (fcrn) modificados.
EP2446034A4 (en) * 2009-06-22 2013-11-27 Ipca Lab Ltd NOVEL POLYNUCLEOTIDE MOLECULES FOR IMPROVED GENE EXPRESSION
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
BR112012031121B1 (pt) 2010-06-07 2022-09-27 Amgen Inc Dispositivo de distribuição de drogas, kit e método de operar um dispositivo de distribuição de droga utilizável
WO2012135315A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Amgen Inc. Vial adapter and system
AU2012245231B2 (en) 2011-04-20 2016-10-13 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
AU2011377617B2 (en) 2011-09-23 2018-03-08 Bluebird Bio, Inc. Improved gene therapy methods
SI3045189T1 (en) 2011-10-14 2018-07-31 Amgen Inc. Injector and mode of composition
US20150290390A1 (en) 2012-11-21 2015-10-15 Amgen Inc. Drug delivery device
CN110041427B (zh) 2013-03-15 2023-05-23 本质生命科学有限公司 抗铁调素抗体及其用途
TWI639453B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
TWI580451B (zh) 2013-03-15 2017-05-01 安美基公司 用於注射器之匣盒及使用具有自動注射器及匣盒之自動注射器設備之方法
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015061386A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
US10155811B2 (en) 2013-11-20 2018-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. APLNR modulators and uses thereof
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
WO2015171777A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CA2948005C (en) 2014-06-03 2023-07-18 Amgen Inc. Systems and methods for remotely processing data collected by a drug delivery device
US10323088B2 (en) 2014-09-22 2019-06-18 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3233163B1 (en) 2014-12-19 2021-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
EP3455142B1 (en) 2016-05-13 2023-08-09 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2018136398A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
MX2019010543A (es) 2017-03-07 2019-10-21 Amgen Inc Insercion de agujas por sobrepresion.
KR20240005194A (ko) 2017-03-09 2024-01-11 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
WO2018172219A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
KR20240042212A (ko) 2017-03-28 2024-04-01 암겐 인코포레이티드 플런저 로드 및 주사기 조립 시스템 및 방법
WO2018226565A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
CA3061982A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
MX2019015479A (es) 2017-06-23 2020-02-20 Amgen Inc Dispositivo electronico de administracion de farmacos con tapa accionada por un conjunto de conmutador.
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
IL271173B2 (en) 2017-07-21 2024-04-01 Amgen Inc Gas permeable sealing element for drug container and methods of assembly
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
AU2018358749B2 (en) 2017-11-06 2024-02-29 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
CA3084486A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
CN112351804A (zh) 2018-07-24 2021-02-09 安进公司 用于施用药物的输送装置
US20210369982A1 (en) 2018-07-24 2021-12-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US20210228797A1 (en) 2018-07-31 2021-07-29 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
CA3106452A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CA3110529A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US20210338936A1 (en) 2018-10-05 2021-11-04 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
EA202191037A1 (ru) 2018-10-15 2021-08-05 Эмджен Инк. Устройство доставки лекарственного средства, имеющее демпферный механизм
AU2019359801A1 (en) 2018-10-15 2021-03-18 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MA54066A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction d'aiguille partielle
EP3873566A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
CN117069825A (zh) * 2022-05-17 2023-11-17 广州汉腾生物科技有限公司 重组促红细胞生成素及其应用

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4966843A (en) 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4732683A (en) 1986-12-02 1988-03-22 Biospectrum, Inc. Purification method for alpha interferon
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
EP0406857B1 (en) 1989-07-07 1995-05-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteins and production thereof
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
GB9206422D0 (en) * 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
CA2133409C (en) 1992-04-01 2011-05-24 Ralph M. Steinman Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
JP4204642B2 (ja) 1992-11-05 2009-01-07 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ 前立腺に特異的な膜抗原
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
DE69435010T2 (de) 1993-04-20 2008-04-30 Hipler Partners Llp Verfahren und stoffe für die behandlung von individuen, die infiziert sind mit intrazellulär infektiösen agentien
AU6709794A (en) * 1993-04-21 1994-11-08 Brigham And Women's Hospital Erythropoietin muteins with enhanced activity
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
HUT73876A (en) * 1993-04-29 1996-10-28 Abbott Lab Erythropoietin analog compositions and methods
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
IL192290A0 (en) * 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
ATE355379T1 (de) 1994-04-26 2006-03-15 Childrens Medical Center Angiostatin und verfahren zu seiner nutzung zur vermeidung der angiogenese
CU22615A1 (es) 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
MX9706827A (es) 1995-03-10 1997-11-29 Genentech Inc Activacion de receptor por gas6.
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
EA199800104A1 (ru) 1995-06-30 1998-10-29 Эли Лилли Энд Компани Способ лечения диабета
US6406689B1 (en) 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5935824A (en) * 1996-01-31 1999-08-10 Technologene, Inc. Protein expression system
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
CA2205757C (en) 1996-05-30 2006-01-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyridazinone derivatives and their use as inhibitors of prostaglandin g/h synthase i and ii(cox i and ii)
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
PT973550E (pt) 1997-04-11 2003-01-31 Searle & Co Anticorpos antagonistas anti-integrina avb3
WO1999002709A1 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
AU751898B2 (en) * 1997-07-14 2002-08-29 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
WO1999054484A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
ES2273497T3 (es) * 1998-06-15 2007-05-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. Proteina de fusion de la albumina serica humana de eritropoyetina analoga.
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
MXPA01011250A (es) 1999-05-06 2002-08-12 Univ Wake Forest Composiciones y metodos para identificar antigenos que producen una respuesta inmune.
MXPA01011264A (es) * 1999-05-07 2002-07-02 Genentech Inc Nuevos polipeptidos de eritropoyetina de chimpance (chepo) y aciodos nucleicos que codifican los mismos.
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008504008A (ja) * 2003-12-31 2008-02-14 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 改良された薬物動態を有するＦｃ−エリスロポエチン融合タンパク質
JP2012107042A (ja) * 2003-12-31 2012-06-07 Merck Patent Gmbh 改良された薬物動態を有するＦｃ−エリスロポエチン融合タンパク質
JP2009509564A (ja) * 2005-10-03 2009-03-12 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 血漿中半減期が調節された融合タンパク質
JP2015525216A (ja) * 2012-06-08 2015-09-03 アルカーメス，インコーポレイテッド ムチン−ドメインポリペプチドリンカーを含む融合ポリペプチド
US10183979B2 (en) 2012-06-08 2019-01-22 Alkermes, Inc. Fusion polypeptides comprising mucin-domain polypeptide linkers
US10407481B2 (en) 2012-06-08 2019-09-10 Alkermes Pharma Ireland Limited Ligands modified by circular permutation as agonists and antagonists
JP2016513733A (ja) * 2013-03-14 2016-05-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アペリン融合タンパク質およびその使用

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