MXPA01011250A

MXPA01011250A - Composiciones y metodos para identificar antigenos que producen una respuesta inmune.

Info

Publication number: MXPA01011250A
Application number: MXPA01011250A
Authority: MX
Inventors: Si-Yi Chen
Original assignee: Univ Wake Forest
Priority date: 1999-05-06
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2002-08-12
Also published as: HK1048590A1; JP2003528573A; AU4700100A; US7273752B2; KR20020013537A; CN101173295A; KR20070091692A; US6500641B1; WO2000067761A8; KR100947875B1; WO2000067761A9; KR20070091691A; KR100773109B1; WO2000067761A1; US6716623B2; US20040096426A1; BR0010322A; KR100922809B1; KR20070087692A; CN1368885A

Abstract

Esta invencion se refiere a un vector de expresion, en donde dicho vector de expresion comprende una secuencia de promotor de polinucleotido, un polinucleotido que codifica una secuencia de senal, un polinucleotido que codifica una proteina de antigeno o peptido, un polinucleotido que codifica un elemento de union de celula, y una secuencia de poliadenilacion de polinucleotido, todos operativamente enlazados. Mas particularmente, se refiere al metodo para producir una respuesta inmune dirigida contra un antigeno en un mamifero, que comprende los pasos de introducir un vector de expresion a una celula, expresar el vector para producir un antigeno bajo condiciones en donde el antigeno es secretado de la celula, endocitosar el antigeno secretado a la celula, procesar el antigeno y presentar fragmentos a un receptor para producir una celula de T. Ademas esta invencion se refiere a una vacuna y a un metodo de uso. La invencion tambien se refiere al metodo para identificar epitopos restringidos de MCH-II.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA IDENTIFICAR ANTIGENOS QUE PRODUCEN UNA RESPUESTA INMUNE CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a un vector de expresión y su uso para producir una respuesta inmune completa en un mamífero. Más particularmente, se refiere al procesamiento de un antígeno endógeno como un antígeno exógeno para la presentación sobre MCH-II. Esta invención también se refiere a una vacuna y su método de uso para inmunizar un mamífero.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presentación inadecuada de antígenos en seres humanos da como resultado la falla del sistema inmune humano para controlar y eliminar muchas infecciones patogénicas y crecimiento maligno de células. Las vacunas e inmunoterapias terapéuticas útiles para infección crónica y cáncer se basan en el desarrollo de nuevos aspectos para la presentación eficiente de antígenos para inducir una respuesta inmune vigorosa, la cual sea capaz de controlar y eliminar los antígenos ofensivos. La habilidad de las células T para reconocer un antígeno depende de la asociación del antígeno con proteínas ya sea de MHC Clase I (MHC-1) o de la Clase II (MCH-II). Por ejemplo, las células T citotóxicas responden a un antígeno en asociación con las proteínas MHC-I. De esta manera, una célula T citotóxica que aniquila una célula infectada con un virus no aniquilará una célula infectada con el mismo virus si la célula tampoco expresa la proteína MHC-I apropiada. Las células T auxiliares reconocen las proteínas MHC-II. La actividad de la célula T auxiliar depende en general tanto del reconocimiento del antígeno sobre las células de presentación de antígeno como de la presencia de estas células de proteínas "auto" MHC-II. Este requerimiento para reconocer un antígeno en asociación con una proteína auto-MHC se denomina restricción de MHC. Las proteínas MHC-I se encuentran sobre la superficie de virtualmente todas las células nucleadas. Las proteínas MHC-II se encuentran sobre la superficie de ciertas células, incluyendo macrófagos, células B y células dendríticas del bazo y células de Langerhans de la piel. Un paso crucial en el montaje de una respuesta inmune en mamíferos, es la activación de células T auxiliares CD4+ que reconocen los principales antígenos exógenos restringidos de (MHC)-II de complejos de histocompatibílidad. Estos antígenos son capturados y procesados en la trayectoria endosómica celular en células de presentación de antígeno, tales como células dendríticas (DCs) (Zajac y otros, 1998; Bona y otros, 1998; Kalams y otros, 1998; Mellman y otros, 1998; Banchereau y otros, 1998). En el endosoma y lisosoma, el antígeno es procesado a pequeños péptidos antigénicos que son presentados sobre la MHC-II en el compartimento de Golgi para formar un complejo de antígeno-MHC-ll. Este complejo es expresado sobre la superficie de la célula, cuya expresión induce la activación de células T CD4 + . Otros eventos cruciales en la inducción de una respuesta inmune efectiva en un animal involucran la activación de células T CD8+ y células B. Las células CD8+ son activadas cuando la proteína deseada es dirigida a través de la célula de tal manera que sea presentada sobre la superficie de la célula como proteínas procesadas, las cuales se forman en complejo con antígenos MHC-I. Las células B pueden interactuar con el antígeno a través de sus inmunoglobulinas de superficie (IgM y IgD) sin la necesidad de proteínas MHC. Sin embargo, la activación de las células T CD4 + estimula todos los brazos del sistema inmune. Después de la activación, las células T CD4+ (células T auxiliares) producen interleucinas. Estas interleucinas ayudan a activar los otros brazos del sistema inmune. Por ejemplo, las células T auxiliares producen interleucina-4 (IL-4) e ?nterleucina-5 (IL-5), las cuales ayudan a las células B a producir anticuerpos; interleucina-2 (IL-2), la cual activa las células T CD4+ y CD8 + ; y gama-interferón, que activa macrófagos. Ya que las células T auxiliares que reconocen antígenos restringidos de MHC-II juegan un papel central en la activación y expansión clonal de células T citotóxicas, macrófagos, células asesinas naturales y células B, el evento inicial para activar las células T auxiliares en respuesta a un antígeno es crucial para la •-*-" ~?.~*.A?t.??.. nfct.4 ?¡ ?á m?¿ß¡ßM inducción de una respuesta inmune efectiva dirigida contra ese antígeno. Se han reportado intentos para estimular la activación de célula T auxiliar utilizando una secuencia derivada de las proteínas de transmembrana lisosómicas (Wu, 1995). Sin embargo, estos intentos no dieron como resultado la inducción de respuestas inmunes efectivas con respecto a células T CD8+ y células B en los mamíferos que se trataron. De esta manera, existe la gran necesidad en la técnica de medios eficientes y dirigidos para producir una respuesta inmune 10 para el tratamiento de enfermedades en mamíferos. La presente invención satisface esta necesidad.

C O M P E N DIO DE LA I NVENCION 15 Una modalidad de la presente invención es un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un po'inucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de 20 poliadenilación de pohnucleótido, todos operativamente enlazados. En modalidades específicas de la presente invención, la secuencia promotora de polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor capaz de inducción y un promotor específico de tejido. 25 En otra modalidad específica de la presente invención, el polinucleótido que codifica una secuencia de señal se selecciona del grupo que consiste de una secuencia de señal de antígeno de hepatitis B de virus E, una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobulina y una secuencia líder de citocina. Una modalidad de la presente invención es un vector de expresión, en donde el polipéptido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido para por lo menos un epítopo, en donde dicho por lo menos un epítopo induce una respuesta de célula B en un mamífero. Una modalidad más de la presente invención es un vector de expresión, en donde el polinucleótido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido para por lo menos un epítopo, en donde dicho epítopo induce una respuesta de célula T CD4+ en un mamífero. Otra modalidad de la presente ¡nvención es un vector de expresión, en donde el polinucleótido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polínucleótido para por lo menos un epítopo, en donde por lo menos un epítopo induce una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero. Una modalidad específica de la presente invención es un vector de expresión, en donde la secuencia de polinucleótido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido para por lo menos un epítopo, en donde el epítopo induce una respuesta de célula B, una respuesta de célula T CD4+ y una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero en donde se introduce dicho antígeno. aMt,!,^» *-- -•"-i - 5S Una modalidad específica adicional de la presente invención es un vector de expresión, en donde la secuencia de polinucleótido que codifican un antígeno comprende la secuencia de polinucleótido para una pluralidad de epítopos, en donde dicha pluralidad ,de epítopos 5 induce una respuesta de célula B, una respuesta de célula T CD4+ y una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero en donde se introduce el antígeno. Una modalidad adicional de la presente invención es un vector de expresión, en donde el polinucleótido que codifica un elemento de 10 unión de célula es una secuencia de polinucleótido de un ligando que se une a un receptor de receptor de superficie celular. En modalidades especificas, la secuencia de elemento de unión de célula se selecciona del grupo que consiste de secuencias de polinucleótido, las cuales codifican un fragmento Fc, un dominio de 15 unión de célula de toxina, una citocina, un pequeño péptido y un anticuerpo. En modalidades específicas, el polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula es una secuencia de polinucleótido homologa o una secuencia de polinucleótido heteróloga. 20 Una modalidad adicional de la presente invención es una célula transformada que comprende un vector de expresión, en donde dicho vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un pohnucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polinucleótido 25 que codifica un elemento de unión de célula y una secuencia de i¡? É áMÉm¡^.^**lii?..A^*A.*. , ^,,^. . ,. t .. ,, ^_^ ^_t:1jJjjj poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados. Otra modalidad específica de la presente invención es una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de señal, un antígeno y un elemento de unión de célula. En modalidades específicas, las células de presentación de antígeno han sido transducidas con la proteína de fusión in vitro. En modalidades adicionales, la proteína de fusión es administrada directamente a un mamífero. Una modalidad específica de la presente invención es una vacuna que comprende un vector de expresión, en donde dicho vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifique una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todas operativamente enlazado. En modalidades específicas, una vacuna comprende células de presentación de antígeno, en donde dichas células de presentación de antígeno son transducidas in vitro con el vector de expresión. En modalidades adicionales, una vacuna comprende células de presentación de antígeno, en donde dichas células de presentación de antígeno son transducidas in vitro con la proteína de fusión. Otra modalidad específica de la presente ¡nvención es un vector de expresión que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno y un polinucleótido que codifica un elemento de unión de í k, &H *& **& célula. Una modalidad adicional de la presente ¡nvención es un método para producir una respuesta inmune dirigida contra un antígeno, que comprende los pasos de: introducir un vector de expresión en una célula, en donde dicho vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antigeno, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados; y expresar dicho vector para producir un antígeno bajo condiciones en donde el antígeno es secretado de la célula; dicho antígeno secretado es endocitosado a la célula; dicho antígeno endocitosado es procesado dentro de la célula; y el antígeno procesado es presentado a una proteína de superficie de célula, para producir una respuesta inmune mediada por célula T. En modalidades específicas, el antígeno es secretado por una primera célula e internalizado por una segunda célula, en donde las primera y segunda células son células de presentación de antígeno. En modalidades adicionales, la primera célula es- una célula de presentación que no es de antígeno y la segunda célula es una célula de presentación de antígeno. Otra modalidad específica de la presente ¡nvención es un método para identificar una secuencia de polinucleótido, la cual codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-II que es capaz de activar células T auxiliares CD4 + , el método comprendiendo los *<*•*-* * i- pasos de: introducir un vector de expresión a una célula de presentación de antígeno para producir una célula de presentación de antígeno transducida, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polínucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados; poner en contacto dicha célula de presentación de antígeno transducida con células T naturales o iniciadas; y determinar si cualquiera de las células T naturales o células T iniciadas son activadas después del contacto con dicha célula de presentación de antígeno transducida, en donde la activación de cualquier de las células T indica que el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activad células T auxiliares CD4 + . En modalidades específicas, el polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba se selecciona del grupo de colecciones de ADNc consistiendo de células virales, genomas bacterianos, genomas de parásito, y genomas humanos. Otra modalidad de la presente invención es un método para identificar una secuencia de polinucleótido que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-II que es capaz de producir una respuesta inmune in vivo, dicho método comprende los pasos de: introducir un vector de expresión a células de presentación de antígeno para producir células de presentación de antígeno ü,,. ^.?A.^M^..., ... .^-^m .teMuaitfj^^ transducidas, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un polipéptído de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados; administrar dichas células de presentación de antígeno transducidas a un mamífero a través de una ruta parenteral; recolectar células T a partir de esplenocitos y co-cultivar con células dendríticas; y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucleótido que codifica al polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar a células T auxiliares CD4 + . En modalidades específicas, el polinucieótido que codifica un polipéptido de prueba se selecciona del grupo de colecciones de ADNc que consiste de genomas virales, genomas bacterianos, genomas de parásitos y genomas humanos. Una modalidad específica de la presente invención es un método para identificar una secuencia de polinucleótido que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-II que es capaz de producir una respuesta inmune in vivo, el método comprende los pasos de: administrar a un mamífero, a través de ruta parenteral, un vector de expresión, en donde dicho vector de expresión comprende una secuencia de promotor de pohnucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de .., «....^.^ unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados; administrar dicha células de presentación de antígeno transducidas a un mamífero a través de una ruta parenteral; recolectar células T ,a partir de 5 esplenocitos y co-cultivar con células dendríticas; y determinar las células T, en donde dicha activación de células T indica que el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + . En modalidades específicas, el polinucleótido que codifica un 10 polipéptido de prueba se selecciona del grupo de colecciones de ADNc consistiendo de genomas virales, genomas bacterianos, genomas de parásito y genomas humanos. Una modalidad específica de la presente invención es un método para el tratamiento de cáncer que comprende los pasos de 15 identificar un polipéptido de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-II, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de transducción de células de presentación de antígeno con un vector de expresión a células de presentación de antígeno para producir células de presentación de 20 antígeno transducidas, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótído, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de 25 polinucleótido, todos operativamente enlazados y determinar la activación de células T, en donde dicha activación de células T indica que el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba es un genofragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar células de presentación de antígeno a un 5 mamífero a través de una ruta parenteral, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. Otra modalidad específica de la presente ¡nvención es un método para tratar cáncer, que comprende los pasos de, identificar un polipéptido de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-II, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de transducción de células de presentación de antígeno con un vector de expresión a células de presentación de antígeno para producir células de presentación de antígeno transducidas, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucleótído que codifica el polipéptido de prueba es un genofragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar a un mamífero, a través de ruta parenteral, un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende por Arn* ,., é ,r *.. .&? 1 lo menos el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba y un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, dichas células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. Una modalidad específica adicional de la presente invención es un método para tratar una infección viral que comprende los pasos de identificar un polipéptido de prueba, el codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-II, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de transducción de células de presentación de antígeno con un vector de expresión a células de presentación de antígeno para producir células de presentación de antígeno transducidas, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polínucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T. en donde la activación de células T indica que el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba es un genofragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares DD4 + ; y administrar células de presentación de antígeno a un mamífero a través de ruta parenteral, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. Otra modalidad de la presente invención es un método para tratar una infección viral que comprende los pasos de identificar un polipéptido de prueba, el cual codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-I I , en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de transducción de células de presentación de antígeno con un vector de expresión a células de presentación de antígeno para producir células de presentación de antígeno transducidas, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba es un genofragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar a un mamífero, a través de una ruta parenteral, un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende por lo menos el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba y un polinucleótído que codifica un elemento de unión de célula, dichas células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. Otra modalidad de la presente invención es un método para tratar una enfermedad autoinmune, q ue comprende los pasos de identificar un polipéptído de prueba, el cual codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-I I , en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de transducción de células de presentación de antígeno como un vector de expresión a células de presentación de antígeno para producir células de presentación de antígeno transducidas, en donde el vector de expresión comprende 5 una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados, y determinar la 10 activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba es un genofragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar células de presentación de antígeno a un mamífero a través de una ruta parenteral, en donde las células de 15 presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. Una modalidad específica de la presente invención es un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, que comprende los pasos de identificar un polipéptído de prueba que 20 codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de células de presentación de antígeno de transducción con un vector de expresión a células de presentación de antígeno para producir células de presentación de antígeno transducidas, en donde el vector de 25 expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba mes un genofragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar a un mamífero, a través de una ruta parenteral, un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende por lo menos un polinucleótido que codifica el polipéptido de prueba y un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, dichas células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptído de prueba. Una modalidad más de la presente invención es un método para producir una vacuna para inmunizar a un mamífero, que comprende los pasos de: transducir células de presentación de antígeno, introduciendo un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados; y expresar dicho vector para producir un antígeno bajo condiciones en donde el antígeno es secretado desde la célula. En modalidades específicas, las células de presentación de antígeno son transducidas con el antígeno in vitro o ex vivo antes de la administración de las células de presentación de antígeno al mamífero. Otra modalidad específica de la presente inve?ción es un método para inducir una respuesta inmune que comprende los pasos de co-administrar a un mamífero, un vector de expresión de citocina y un vector de expresión de retrogén, en donde el vector de expresión de retrogén comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia' de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados. Una modalidad más de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune que comprende los pasos de co- administrar a un mamífero un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un proteína de citocina y una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de fusión bajo control transcripcional de un promotor, en donde la proteína de fusión comprende un antígeno y un elemento de unión de célula. En modalidades específicas, la secuencia de polinucleótído que codifica la proteína de citocina y la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de fusión están bajo el control transcripcional separado, y en donde la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de citocina y la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de fusión están en tándem en el vector de expresión. Otra modalidad de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune, que comprende los pasos de, coadministrar a un mamífero dos diferentes vectores de expresión de retrogén, en donde un primer vector de retrogén comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un primer antígeno, un polínucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de políadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados; y un segundo vector de expresión de retrogén que comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótído que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un segundo antígeno, y un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados. Otra modalidad específica de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune, que comprende los pasos de administrar a un mamífero un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótído que codifica una primera proteína de fusión y una secuencia de polínucleótido que codifica una segunda proteína de fusión bajo el control transcripcional de un promotor, en donde la primera proteína de fusión comprende un primer antígeno y un primer elemento de unión de célula y la segunda proteína de fusión comprende un segundo antígeno y un primer elemento de unión de célula. En modalidades específicas, los primero y segundo antígenos diferentes y los elementos de unión de célula es un fragmento de Fc. En modalidades adicionales, los primero y segundo antígenos son diferentes antígenos y los primero y segundo elementos de unión de célula son diferentes elementos de unión de célula. Una modalidad adicional incluye que la secuencia de polinucleótido que codifica la primera proteína de fusión y la secuencia de polinucleótido que codifica la segunda proteína de fusión están bajo el control transcripcional separado, y en donde la secuencia de polinucleótido que codifica la primera proteína de fusión y la secuencia de polinucleótido que codifica la segunda proteína de fusión están en tándem en un vector de expresión. Una modalidad específica de la presente invención es un método para inducir simultáneamente células T tanto CD4+ como CD8 + , que comprende los pasos de administrar una proteína de fusión, en donde la proteína comprende tanto un epítopo de MHC-I como MHC-ll fusionado a un elemento de unión de célula. Una modalidad más de la presente ¡nvención, es un método para producir una proteína de fusión que comprende los pasos de introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de | l,.iií .t a* ii » s..t. -a ~— - --*-&-*- & poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados, y expresar dicho vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones en donde la proteína de fusión es secretada de la célula. En modalidades específicas, las células de presentación de antígeno son transducidas con la proteína de fusión in vitro. Una modalidad específica de la presente invención es un método para secretar una proteína intracelular, que comprende los pasos de introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica una proteína intracelular, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilacíón de polinucleótido, todos operativamente enlazados y expresar el vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones en donde la proteína de fusión es secretada de la célula. Más específicamente, la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína intracelular es truncada o mutada para incrementar la eficiencia de la secreción. Otra modalidad específica de la presente invención es un método para secretar una proteína de membrana, que comprende los pasos de introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica una proteína de membrana, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una *k.Jl.?.±.*J&~ia?~~...~ «4,«L4.. secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados, y expresar el vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones en donde la proteína de fusión es secretada de la célula. Más específicamente, la secuencia de polinu?leótido que codifica la proteína de membrana es truncada o mutada para incrementar la eficiencia de la secreción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A y la Figura 1B son diagramas que representan la estrategia de retrogén de la ¡nvención. El retrogén de la invención es producido en una célula, por ejemplo, una célula de músculo (Figura 1A), y después es tomada por una célula de presentación de antígeno (Figura 1B). El retrogén es procesado en la célula de presentación de antígeno y es expresado en la misma como un complejo MHC-I o MHC-ll, o presentado a receptores de célula B como se muestra en la Figura 1A y Figura 1B. La presentación de MHC-I del retrogén da como resultado la activación de células T CD8+ citotóxícas y la presentación de MHC-ll del retrogén da como resultado la activación de células T CD4 + . La Figura 2A, la Figura 2B y la Figura 2C son una serie de representaciones esquemáticas de los vectores de expresión. La Figura 2A ilustra un vector que comprende el fragmento HBeAg (de secreción), HBcAg (citosólico), o el fragmento Fc con una secuencia de señal (de secreción) construida generando un gen de fusión como I. ¡«¡a ;A . afc..¿a-.,l.. t ,.£ .v - - «* se muestra en el diagrama, y clonando el gen en el vector retroviral (LNC-NGFR) o el vector de expresión pRc/CMV. La Figura 2B y la Figura 2C ilustran vectores adicionales que fueron construidos. La Figura 3 es una imagen de una tinción Western ilustrando la expresión y secreción del retrogén HBe. Se transfectaron células COS con varios vectores de expresión. El medio de cultivo (M) y los lisatos de célula (C) después fueron precipitados con un anticuerpo anti-lgG o anti-HbeAg y se analizaron a través de SDS-PAGE. La Figura 4A, la Figura 4B y la Figura 4C son una serie de gráficas ilustrando la transducción de expresión del retrogén de células dendrítícas. Se transdujeron células de médula ósea de murino con varios vectores retrovirales recombinantes; las células fueron maduradas a células dendríticas en presencia de GM-CSF, TNF, y IL-4 y se tiñeron con el anti-MGFR. Estas se midieron a través de un ensayo citométrico de flujo. La Figura 4 muestra las células dendríticas no transducidas. La Figura 4D muestra las células dendrítícas transducidas. La Figura 4C es un control negativo. La Figura 5A, Figura 5B, Figura 5C, Figura 5D y Figura 5E son una serie de gráficas ilustrando la presencia de marcadores de superficie (MHC-I, MHC-ll, co-estimulación y moléculas de adhesión (CD11C, CD54, CD80 y CD86)) en células dendríticas según determinado a través de ensayos citométricos de flujo. La Figura 5A muestra la presencia del marcador de superficie CD con CC. La Figura 5B muestra la presencia del marcador de superficie CD 54. La í*..,A,^ .±A...,..** J*¡ ll¡.,.,.. .^.í»...

Figura 5C muestra la presencia del marcador de superficie CD 80. La Figura 5D muestra la presencia del marcador de superficie CD86. Y la Figura 5E muestra la presencia de MHC-ll. La Figura 6A y la Figura 6B ilustran dos gráficas de barra presentando la activación in vitro de células T CD4+ naturales a través de células dendríticas transducidas con retrogén. La Figura 6a muestra niveles de GM-CSF en el co-cultivo. La Figura 6B muestra los niveles de IFN-? en el medio de co-cultivo. La Figura 7A y la Figura 7B ilustran la activación independiente de MHC-ll. La Figura 7A muestra la concentración de citocina (IFN-?) a partir de células obtenidas de ratones C57BL/6 atacados con MHC- ll (KO) o de tipo silvestre (WT) transducidas con el retrogén HBe y co-cultívadas, y células T CD4+ naturales de ratones de tipo silvestre. La Figura 7B muestra la concentración de citocina de GM- CSF. La Figura 8 muestra respuestas de anticuerpo en los sueros de ratones inmunizados. La Figura 9A, la Figura 9B, La Figura 9C la Figura 9D, la Figura 9E y la Figura 9F muestran la construcción y expresión de proteínas de fusión s-MAGE-3-Fc. La Figura 9A muestra la representación esquemática de vectores retrovirales recombinantes (S: la secuencia de señal. IRES: secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno). La Figura 9B muestra la expresión de diferentes construcciones en células dendríticas según determinado a través de análisis de tinción Western con el conjugado de anti-MAGE-3 de ratón y un conjugado ?Ú. «JMi ,..~-?JB.A?- |Maaaaa|||a^|jHÍH|a|fB de HRP de IgG de anti-ratón. La Figura 9C muestra la intensidad de banda de proteína de la tinción Western de la Figura 9B, analizada a través de un aparato Phosphorlmager (Molecular Dynamics) con un software de Image-Quant. La Figura 9D, la Figura 9E y la Figura 9F 5 ilustran el análisis citométrico de flujo de células dendríticas transducidas, transducidas con cada construcción y teñidas para MHC-ll (Figura 9E) (M5/114.15.2), CD40 (Figura 9D) (HM40-3), y CD86/B7.2 (Figura 9F) (GL1) (PharMingen). La Figura 10A, Figura 10B, Figura 10C y Figura 10D muestran 10 la inducción in vivo de respuestas Th1 de CD4+ de ratones inmunizados con células dendríticas transducidos con diferentes vectores de los medios después de co-cultivo de células T CD4 + . La Figura 10A muestra las concentraciones de IFN-?. La Figura 10B muestra las concentraciones de I L-2. La Figura 10C muestra las 15 concentraciones de IFN-a. La Figura 10D muestra las concentraciones de IL-4. La Figura 11A y la Figura 11 B muestran los niveles de IFN-? en células T CD4+ aisladas de ratones inmunizados con células dendríticas s-MAGE-3-Fc co-cultivadas con células dendríticas s- 20 MAGE-3-Fc en presencia o ausencia de anticuerpos anti-CD4 o anti- CD8 (Figura 11A), o co-cultivadas con células dendríticas transducidas con HBcAg (Figura 11B). La Figura 12A, Figura 12B, Figura 12C y Figura 12D muestran los niveles de citocina en células T CD4+ aisladas de esplenocitos 25 combinados de ratones inmunizados con células dendríticas co- AS.??t t. cultivadas con células dendríticas aisladas de nodos linfáticos de drenaje (LN) de los mismos ratones inmunizados a una relación de 1000:1. La Figura 12A muestra las concentraciones de IFN-?. La Figura 12B muestra la concentración de IL-2. La Figura 1.2 C muestra 5 las concentraciones de TNF-a. La Figura 12 D muestra las concentraciones de IL-4. La Figura 13 muestra la inducción in vivo de respuestas de citotoxicidad a partir de esplenocitos aislados de ratones inmunizados, los cuales se volvieron a estimular (E) in vitro con 0 células EL-4-MAGE-3 irradiadas y se co-cultivaron con las células objetivo marcadas con 3H-timidina, EL4-MAGE-3o EL4-HBcAg (control) (T). La Figura 14 muestra la inducción de respuestas de anticuerpo 6 semanas después de inmunización de célula dendrítica. 5 La Figura 15 muestra la interacción mejorada de células T con células dendríticas s-MAGE-3-Fc midiendo los niveles de IL-12 en el co-cultivo en presencia o ausencia del anticuerpo anti-CD40L (MR1, PharMingen) medido a través de ELISA. La Figura 16A y la Figura 16B muestran la inmunidad 0 antitumoral de ratones que fueron inmunizados, a través de inyección i.v. con 1 x 105 células dendríticas transducidas con diferentes construcciones antes de ser inoculadas intradérmicamente en células tumorales EL4-MAGE-3 inoculadas. La Figura 16A muestra los volúmenes de tumor. La Figura 16B muestra el porcentaje de 5 supervivencia de ratones en cada grupo. t**** i „. ... A- ÍJS*.A . i A. ?O^^A . *aAüm.MM «M ^^ ^ La Figura 17 ¡lustra los residuos de aminoácido cargados de HPV 16E7, los cuales fueron eliminados para estabilizar la proteína y facilitar la secreción. La Figura 18 ilustra una representación esquemática de vectores de expresión. El gen de fusión HBe-Fc, el gen HBcAg (citosólico), el gen HBeAg (de secreción), o el fragmento de ADNc de Fc con una secuencia de señal (de secreción) fue clonado en el vector pRc/CMV bajo el control del promotor CMV, respectivamente. El cuadrado negro representa la secuencia de señal. La Figura 19A y la Figura 19B muestran la expresión de las construcciones HBe-Fc, HBcAg, H BeAg, y Fc. La Figura 19A muestra la expresión de las diferentes expresiones expresadas en células según determinado por análisis de tinción Western. La Figura 19B muestra la intensidad de banda de proteína de la tinción Western en la Figura 19A analizado a través de un aparato Phospholmager (molecular Dynamics), con un software de Image-Quant. La Figura 20 ilustra la inducción in vivo de respuesta de células T de ratones después de la inmunización de ADN con diferentes plásmidos o células T iniciadas que fueron sacrificados cuatro semanas después de la inmunización. Los esplenocitos se volvieron a estimular a través de proteínas recombinantes HBe/cAg durante 5 días. La Figura 21 A, Figura 21 B, Figura 21 C y Figura 21 D ilustran la inducción in vivo de respuestas de célula T CD4+ de ratones q ue fueron inmunizados con d iferentes plásmidos y fueron sacrificados 4 é . t .Í ? .i 4 >.. fc^.,¿ . t .. -,^ ,. ..4 . semanas después de la inmunización. La Figura 21A y la Figura 21B muestran células T CD4+ que fueron co-cultivadas por duplicado con células dendríticas pulsadas HBe/cAg. La Figura 21C y la Figura 21D muestran células T CD4+ de los ratones inmunizados , HBeFc que fueron co-cultivadas con células dendríticas pulsadas con HBe/cAg en presencia o ausencia de anticuerpos anti-CD4+ o anti-CD8 + . Las concentraciones de IFN-? e í L-2 en los medios fueron determinadas a través de ELISA después de 72 horas de co-cultivo. La Figura 22 ilustra la inducción in vivo de respuesta CTL en esplenocitos que fueron aislados de ratones inmunizados con ADN y reestimulados in vitro con células EL4-HBcAg irradiadas durante 5 días. Los esplenocitos 'eestimulados (E) fueron co-cultivados durante 4 horas con las células objetivo marcadas con 3H, EL4-HbcAg o EL4-MAGE3 (contrcl) (T). La Figura 23 muestra a inducción de respuestas de anticuerpo.

Los anticuerpos IgG específicos de HBc/eAg de ratones a 4-6 semanas después de inmix^zación con ADN fueron determinados a través de ELISA. La Figura 24 ilustra catos del experimento de transferencia de célula dendrítica. Las célu as dendrítícas CD11c+ fueron aisladas de los esplenocitos de ratones donadores inmunizados con vacunas de ADN. Las células dendríticas iniciadas fueron inyectadas en la vena de la cola lateral de recexores naturales singénicos. Dos a Cuatro semanas después de la tra -sferencia adoptiva, se realizaron ensayos de proliferación de célula La Figura 25 ¡lustra una forma esquemática de vectores retrovirales para la construcción de colecciones de ADNc para identificar epítopos restringidos de MHC-ll. La Figura 26 ilustra una presentación esquemática ,del proceso para identificar epítopos restringidos de MHC-ll capaces de producir una respuesta de célula T auxiliar CD4 + .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Es fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varias modalidades y modificaciones a la invención descrita en esta solicitud sin apartarse del espíritu y alcance de la ¡nvención. El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de inmunoglobulina, la cual es capaz de específicamente unirse a un epítopo específico sobre un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes, y pueden ser porciones inmunoactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos de cadena individual y anticuerpos humanizados (Harlow y otros, 1988; Houston y otros, 1988; Bird y otros, 1988). El término "antígeno" como se utiliza en la presente, se define como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede involucrar ya sea la prqducción de anticuerpo, o la activación de células inmunológicamente competentes, específicas, o ambos. Un antígeno puede ser derivado de organismos, subunidades de proteínas/antígenos, células o lisatos aniquilados o enteros, inactivados. Los organismo ilustrativos incluye, pero no se limitan a, Helicobacters, Campylobacters, Clostridia, Corynebacterium díphtheriae, Bordetella pertussis, virus de influenza, virus de parainfluenza, virus sincitial respiratorio, Borrelia burgdorfei, Plasmodium, virus de herpes simple, virus de inmunodeficiencia humana, papilomavirus, Vibrio cholera, E. coli, virus de sarampión, rotavirus, shigella, Salmonella typhi, Neisseria gonorrhea. Por lo tanto, un experto en la técnica puede ver que cualquier macromolécula, incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden ser derivados de ADN recombinante o genómico. Un experto en la técnica puede ver que cualquier ADN, el cual contenga secuencias de nucleótido o secuencias de nucleótidos parciales de un genoma patogénico o un gen o un fragmento de un gen para una proteína que produce una respuesta inmune, da como resultado la síntesis de un antígeno. Además, un experto en la técnica puede ver que la presente invención no está limitada al uso de toda la secuencia de ácido nucleico de un gen o genoma. Es '-tr i imiMiitf ril ili M^ai^gaJ^lrt^^a ^^^^^j^^^a ^^^ fácilmente evidente que la presente invención incluya, pero no se limita a, el uso de secuencias de ácido nucleico parciales de más de un gen o genoma y que estas secuencias de ácido nucleico están dispuestas en varias combinaciones para producir la respuesta inmune deseada. El término "enfermedad autoinmune" como se utiliza en la presente, se define como un trastorno que resulta de respuestas inmunes. La autoinmunidad es una respuesta inapropiada y excesiva a auto-antígenos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addison, enfermedad de Graves, diabetes mellitus tipo I, esclerosis múltiple, Mixedema, anemia perniciosa, fiebre reumática, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, y colitis ulcerativa. El término "cáncer" como se utiliza en la presente, se define como una proliferación de células cuya pérdida de rasgo único de controles normales da como resultado el crecimiento no regulado, la falta de diferenciación, invasión de tejido local y metástasis. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer cervical, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer colorectal, cáncer renal y cáncer de pulmón. Los términos "célula", "línea de célula" y "cultivo de célula" como se utiliza en la presente, pueden ser usados intercambiablemente. Todos estos términos también incluyen su progenie, los cuales son cualesquiera y todas las generaciones subsecuentes. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. El término "elemento de unión de célula" como se utiliza en la presente, se define como una porción de una proteína, la cual es capaz de unirse a un receptor sobre una membrana de céfula. El término "ADN" como se utiliza en la presente, es definido como ácido desoxiribonucleico. El término "célula dendrítica" o "DC" como se utiliza en la presente, se define como un ejemplo de una célula de presentación de antígeno derivada de médula ósea. El término "epítopo" como se utiliza en la presente, se define como pequeños grupos químicos en la molécula de antígeno que pueden producir y reaccionar con un anticuerpo. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. La mayoría de los antígenos tienen muchos epítopos; es decir, son multivalentes. En general, un epítopo tiene un tamaño de aproximadamente 5 aminoácidos o azúcares. Un experto en la técnica entiende que generalmente las estructura tridimensional total, en lugar de la secuencia lineales específica de la molécula, es el criterio principal de carácter específico antigénico. El término " expresión" como se utiliza en la presente, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótido particular dirigida por su promotor. El término "vector de expresión" como se utiliza en la presente, se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos un producto de gen capaz de ser transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN después son traducidas a una proteína, pohpéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no son traducidas, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de secuencias de control, las cuales se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que sirven para otras funciones, también, y se describen infra. El término "célula T auxiliar" como se utiliza en la presente, está definido como células T efectoras, cuya función principal es promover la activación y funciones de otros línfocitos B y T y de macrófagos. La mayoría son células T CD4. El término "heterólogo", como se utiliza en la presente, está definido como secuencias de ADN o ARN o proteínas que se derivan de las diferentes especies. El término "homólogo" como se utiliza en la presente, está definido como secuencias de ADN o ARN o proteínas que se derivan de las mismas especies. El término "célula huésped" como se utiliza en la presente, se define como células que están expresando una secuencia de ácido nucleico heteróloga. El término "inmunoglobulina" o "Ig" como se utiliza en la f~*" -* • 'l " * a--: presente, se define como una clase de proteínas, la cual funciona como anticuerpos. Los 5 miembros incluidos en esta clase de proteínas son IgA, IgG, IgM, IgD, e IgE. La IgA funciona como el anticuerpo primario que está presente en secreciones del cuerpo, 5 tales como saliva, lágrimas, leche materna, secreciones gastrointestinales y secreciones de moco de los tractos respiratorio y genitourinario. La IgG funciona como el anticuerpo de circulación más común. La IgM es la ¡nmunoglobulina principal producida en la respuesta primaria. Es la inmunoglobulina más eficiente en la 10 aglutinación, fijación de complemento y otras respuestas de anticuerpo, y es importante en la defensa contra bacterias y virus. La IgD es la inmunoglobulina que no tiene ninguna función de anticuerpo conocida, pero puede servir como un receptor de antígeno. La IgE es la inmunoglobulina que media la 15 hipersensibilidad inmediata ocasionando la liberación de mediadores a partir de células cebadas y basófilos después de exposición a alérgeno. El término "complejo de histocompatibilidad principal" o "MHC" como se utiliza en la presente, se define como un racimo específico 20 de genes, muchos de los cuales codifican evolucionalmente proteínas de , superficie de células relacionadas involucradas en presentación de antígeno, las cuales se encuentran entre los determinantes más importantes de histocompatibilidad. El MHC de clase I, o MHC-I, funciona principalmente en la presentación de antígeno para 25 linfocitos T CD8. El MHC de la clase II, o MHC-ll, funciona principalmente en la presentación de antígeno a linfocítos T CD4. El término "polinucleótído" como se utiliza en la presente, se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. De esta manera, los ácidos 5 nucleicos y polinucleótidos como se utiliza en la presente son intercambiables. Un experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, los cuales pueden ser hidrolizados a "nucleótido" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos pueden ser hidrolizados a nucleósidos. Como se utiliza en la presente, los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácido nucleico que son obtenidas a través de cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico a partir de una colección recombinante o un genoma de célula, utilizando tecnología de clonación ordinaria y PCR™, y similares, y a través de medios sintéticos. Además, un experto en la técnica sabe que los polinucleótidos incluyen sin limitación mutaciones de los polinucleótidos, incluyendo, pero no limitándose a, mutación de los nucleótidos, o nucleósidos a través de métodos bien conocidos en la técnica. El término "polipéptido" como se utiliza en la presente, se define como una cadena de residuos de aminoácido, usualmente teniendo una secuencia definida. Como se utiliza en la presente, el término polipéptido es mutuamente inclusive de los términos "péptido" y "proteína".

El término "promotor" como se utiliza en la presente, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótido. El término "retrogén" o "proteína de fusión de retrogén" como se utiliza en la presente, significa un polipéptido que tiene un epítopo que es capaz de producir una respuesta inmune en un mamífero cuando se expresa y procesa como se describió anteriormente, en donde el polipéptido es fusionado a un elemento de unión de célula. El término "vector de expresión de retrogén" como se utiliza en la presente, se refiere al vector de expresión que comprende por lo menos una secuencia de polípéptido que codifica una secuencia de señal, un antígeno y un elemento de unión de célula. El término "ARN" como se utiliza en la presente, se define como ácido ribonucleico. El término "ADN recombinante" como se utiliza en la presente, se define como ADN producido uniendo piezas de ADN a partir de diferentes fuentes. El término "polipéptido recombinante" como se utiliza en la presente, se define como una proteína híbrida producida utilizando métodos de ADN recombinantes". El término "célula T" como se utiliza en la presente, se define como una célula derivada de timo que participa en una variedad de reacciones inmunes mediadas por célula. El término "transfectado" o "transformado" o "transducido" como se utiliza en la presente, se refiere a un proceso a través del cual el ácido nucleico exógeno es transferido o introducido a la célula huésped. Una célula transformada incluye la célula primaria y su progenie. La frase "bajo el control transcripcional" o "operativamente enlazado" como se utiliza en la presente, significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas con relación a los polinucleótidos para controlar la iniciación de polimerasa de ARN y la expresión de los polinucleótidos. El término "vacuna" como se utiliza en la presente, se define como el material utilizado para provocar una respuesta inmune después de la administración de los materiales a un mamífero y de esta manera confiere inmunidad. El término "virus" como se utiliza en la presente, se define como una partícula que consiste de ácido nucleico "ARN o ADN" encerrado en una cubierta de proteína, con o sin un sobre de lípido externo, el cual solamente es capaz de replicarse dentro de una célula entera y extenderse de célula a célula. Una modalidad de la presente invención es un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polínucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de i i?. «.-. -i- . poliadenilación de polinucleótído, todos operativamente enlazados. En modalidades específicas, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión (elemento de unión de antígeno- célula) está bajo el control transcripcional de un promotor. Mucho del pensamiento con respecto a como se organizan los promotores se deriva de análisis de varios promotores virales, incluyendo aquellos para las unidades de transcripción temprana de timidina-cinasa, HSV (tk) y SV40. Estos estudios, aumentados por el trabajo más reciente, han mostrado que los promotores están compuestos de moléculas funcionales discretas, cada una consistiendo de aproximadamente 7- 20 bp de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para proteínas activadores o represoras transcripcionales. Por lo menos en un módulo en cada promotor funciona para colocar el sitio de partida para la síntesis de ARN. El mejor ejemplo conocido de esto es la caja de TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja de TATA, tales como el promotor para el gen de desoxinucleotiltransferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes de SV40, un elemento discreto que cubre el sito de inicio por sí mismo ayuda a fijar el lugar de iniciación. Los elementos promotores adicionales, es decir, mejoradores, regulan la frecuencia de iniciación transcripcional. Típicamente, í estos están localizados en la región de 300-110 bp corriente arriba del sitio de inicio, aunque un número de promotores recientemente ha mostrado contener elementos funcionales corriente abajo del sitio de inicio, también. El espacio entre los elementos promotores frecuentemente es flexible, de manera que la función del promotor es conservada cuando los elementos son invertidos o movidos con relación uno al otro. En el promotor tk, la separación o espacio entre los elementos promotores puede ser incrementada a 50 bp antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar ya sea cooperativamente o independientemente para activar la transcripción. Un promotor puede ser uno naturalmente asociado con un gen o secuencia de polinucleótido, como el que puede ser obtenido aislando las secuencias de no codificación 5' localizadas corriente arriba del segmento de codificación y/o exón. Dicho promotor puede ser denominado como "endógeno". Similarmente, un mejorador puede ser uno naturalmente asociado con una secuencia de polínucleótido, localizado ya sea corriente abajo o corriente arriba de esa secuencia. Alternativamente, se ganarán ciertas ventajas colocando el segmento de polinucleótido de codificación bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, el cual se refiere a un promotor que normalmente no está asociado como la secuencia de polinucleótido en su ambiente natural. Un mejorador recombinante o heterólogo se refiere también a un mejorador que normalmente no está asociado con una secuencia de polinucleótído en su ambiente natural. Tales promotores o mejoradores pueden incluir promotores o mejoradores de otros genes y promotores o mejoradores aislados de cualquier otra célula procariótica, viral o eucariótica, y promotores o mejoradores que no son de "existencia natural", es decir, que -4-taiÍ44t,iAt,?.i uriti-mutir T- - ***""- **>-•<- ¿¡jygjk ^y áíí? contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras transcripcionales, y/o mutaciones que alteran la expresión. Además de producir secuencias de ácidos nucleicos de promotores y mejoradores sintéticamente, las secuencias pueden ser producidas utilizando clonación recombinante y/o tecnología de amplificación de ácido nucleico, incluyendo PCR™, junto con las composiciones descritas en la presente (patente de E. U. A. 4,683,202; patente de E. U. A. 5,928,906. Además, se contempla que las secuencias de control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de organelos no nucleares tales como mitocondrias, cloroplastos, y similares, también pueden ser empleadas. Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o mejorador que efectivamente dirija la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula, organelo, y organismo seleccionado para la expresión. Aquellos expertos en la técnica de biología molecular generalmente saben como utilizar los promotores, mejoradores y combinaciones de tipo de célula para la expresión de proteína, por ejemplo, ver Sambrook y otros, (1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos en tejido, inducibles, y/o útiles bajo las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, ya que es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas recombinantes y/o péptidos. El promotor puede ser heterólogo o endógeno. Una secuencia de promotor ilustrada en los ejemplos experimentales presentados aquí es la secuencia de promotor de citomegalovirus temprana inmediata (CMV). Esta secuencia de promotor es una secuencia de promotor constitutiva fuerte capaz de dirigir altos niveles de expresión de cualquier secuencia de polinucleótído operativamente enlazada a la misma. Sin embargo, también se pueden utilizar otras secuencias de promotor constitutivas, incluyendo, pero no limitándose a, al promotor temprano del virus de simio 40 (SV40), virus de tumor mamario de ratón (MMTV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), promotor de repetición terminal largo (LTR), promotor de virus de Moloney, promotor de virus de leucemia de ave, promotor temprano inmediato de virus de Epstein-Barr, promotor de virus de sarcoma de Rous, así como promotores de gen humano tales como, por ejemplo, pero no limitándose a, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina, y el promotor de creatina de músculo. Además, la invención no debe ser limitada al uso de promotores constitutivos. También se contemplan promotores inducibles como parte de la invención. El uso de un promotor inducible en la invención proporciona un conmutador molecular capaz de activar la expresión de la secuencia de polinucleótido, la cual está operativamente enlazada cuando dicha expresión es deseada, o de apagar la expresión cuando la expresión no es deseada. Ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a un promotor de melationina, un promotor de glucocorticoide, un promotor de progesterona, y un promotor de tetraciclina. Además, la ¡nvención incluye el uso de un promotor específico en tumor, este promotor es Í AÍ?JÍ ?ut^??ut?^uA^. activo solamente en un tejido deseado. Los promotores específicos en tejido son bien conocidos en la técnica e incluye, pero no se limitan a, el promotor de HER-2 y las secuencias de promotor asociadas PSA. El modalidad específicas de la presente invención, el vector de expresión comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, la cual dirige el procesamiento de la proteína codificada por el mismo a la maquinaria celular apropiada con el fin de que la proteína sea secretada desde la célula. Las secuencias de señal ilustrativas incluye, pero no se limitan a, secuencia de señal de antígeno E de virus de hepatitis B, secuencias líderes de cadena pesada de inmunoglobulina, secuencias líderes de citocina, y similares, pueden ser utilizadas. Esencialmente, cualquier secuencia de señal que dirige a la secreción de una proteína a partir de una célula es adecuada para utilizarse en el vector de expresión de la ¡nvención. Además de las secuencias de señal, se pueden emplear otros mecanismos para la secreción, tales como, pero no limitándose a, el truncamiento o eliminación de secuencias que inhiben la secreción de proteína, mutaciones de punto de secuencias que inhiben la secreción de proteína, y enlazamíento de la proteína a un gen viral que será ensamblado en partículas virales. Una modalidad de la presente ¡nvención es un vector de expresión, en donde el polinucleótido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido por lo menos para un epítopo, en donde por lo menos este epítopo induce una respuesta •»-•>'• *?.i-****<A, de célula B en mamífero. Una modalidad adicional de la presente invención es un vector de expresión, en donde el polinucleótido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido para por lo menos un epítopo, en donde por lo menos este epítopo induce una respuesta de célula T CD4+ en un mamífero Otra modalidad de la presente invención es un vector de expresión, en donde el polinucleótido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido para por lo menos un epítopo, en donde por lo menos este epítopo induce una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero. Una modalidad específica de la presente invención es un vector de expresión, en donde la secuencia de polinucleótído que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido para por lo menos un epítopo, en donde dicho epítopo induce una respuesta de célula B, una respuesta de célula T CD4+ y una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero en donde el antígeno es introducido. Una modalidad específica adicional de la presente invención es un vector de expresión, en donde la secuencia de polinucleótido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucleótido para una pluralidad de epítopos, en donde la pluralidad de epítopos induce una respuesta de célula B, una respuesta de célula T CD4+ y una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero en donde se introduce dicho antígeno. En modalidades específicas de la presente ¡nvención, el vector -am.j.4- 4»„4 . ..a». .?« .»a.,^-te .^.a.^fa. ^ j ^ ¿AJi A de expresión comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un antígeno. Las secuencias de polinucleótido que codifican un antígeno se seleccionan de por lo menos una secuencia de polinucleótido asociada con una enfermedad, en donde dicha 5 enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades infecciosas, cáncer y enfermedades autoinmunes. Más particularmente, la secuencia de polinucleótido que codifica el antígeno es una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo de microorganismos patogénicos que ocasionan enfermedades 10 infecciosas que consiste de virus, bacteria, hongos y protozoarios. Estas secuencias de ADN que codifican proteínas conocidas o sus fragmentos incluyen antígenos virales tales como, pero no limitándose a, antígenos de virus de hepatitis B y hepatitis C, antígenos de virus de inmunodeficiencia humana, incluyendo, pero no 15 limitándose a, proteínas gp160, gp120 y gag, antígenos de papilomavirus, incluyendo pero no limitándose a las proteínas E7 y E6. Las proteínas de virus de herpes tales como, por ejemplo, proteínas codificadas por el virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus de herpes simple tipos 1 y 2, y virus de herpes humano 6, 7 y 20 8, también están contemplados en la ¡nvención como proteínas de fusión de retrogén útiles. En modalidades adicionales, el polinucleótido que codifica un antígeno es un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer cervical, melanoma, cáncer renal y cáncer de próstata. Además, la 25 proteína puede ser una que induce la activación de una respuesta inmune dirigida contra células tumorales con el propósito de inhibir su crecimiento y replicación, es decir, tirosinasa que activa una respuesta inmune contra melanocitos en melanoma. Otras proteínas asociadas con tumor incluye, pero no se limitan, MART, trp, MAGE-1, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, gp100, HER-2, PSA, El antígeno Ras asociado con cáncer de pulmón y otros antígenos de tumor específico, de tejido específico o asociados con tumor. Un experto en la técnica está conciente de cómo las secuencias de polinucleótido, que codifican antígeno asociados con tumor, también, están bien documentadas en la literatura científica y hasta ahora las secuencias de polinucleótido desconocidas están siendo descubiertas con gran rapidez. En una modalidad adicional, la secuencia de polinucleótido que codifica un antígeno se selecciona de una enfermedad autoinmune incluyendo, pero no limitándose a, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis y enfermedad de Crohn. Además, la invención debe ser construida para incluir ADN que codifica un auto-antígeno con el fin de inducir tolerancia inmune en situaciones en donde dicha tolerancia es de beneficio para el mamífero. Además, la invención debe ser construida para incluir ADN que codifica un antígeno, el cual es capaz de inducir una respuesta inmune generalizada en una mamífero, en donde una respuesta inmune generalizada es de beneficio para el mamífero. Una respuesta inmune generalizada puede ser de beneficio para el mamífero en casos en donde el mamífero sea inmunocomprometido, es decir, como resultado de una infección por VIH, quimioterapia, u otros procedimientos inmunosupresores. Dichos antígenos puede incluir, pero no se limitan a, fragmentos de anticuerpo de Fc, los cuales cuando se unen a receptores de Fc en células de presentación de antígeno sirven para regular en forma superior la presentación de antígeno a través de estas células. Además, se pueden utilizar interleucinas tales como, pero no limitándose a, interleucina 5, para generar un efecto auxiliar similar en mamíferos en donde se desea la inducción de una respuesta inmune generalizada. La presente invención, por lo tanto, debe ser construida para incluir cualquier secuencia de polinucleótido conocida o hasta ahora desconocida, la cual cuando sea incluida en el vector de expresión de la invención sea capaz de activar la respuesta inmune cuando el vector, o la proteína de fusión codificada por el mismo, es introducido, en un mamífero. Un experto en la técnica está conciente de que no es necesario que la secuencia de ácido nucleico codifique una proteína de longitud completa. Simplemente es necesario que la proteína expresada comprenda un epítopo, el cual produce la respuesta inmune deseada cuando se procesa en células de presentación de antígeno. De esta manera, es evidente a partir de esta información que la secuencia de ácido nucleico puede codificar cualquier antígeno que pueda producir una respuesta inmune en el animal en donde se introduce el vector de expresión. De esta manera, la ¡nvención de ninguna manera debe ser limitada al tipo de secuencias de ácido nucleico contenidas dentro del vector de expresión, sino U4.I ÍA?AÍ.?I? ? que más bien debe incluir cualquiera y todas las secuencias de ácido nucleico que se obtengan a través de cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, incluyendo también sin limitación, la clonación de secuencias de ácido nucleico a partir de una colección recombinante o un genoma de célula, utilizando tecnología de clonación ordinaria y PCR™, y similares, y a través de medios sintéticos. La invención tampoco debe ser construida como limitante en ninguna forma a la fuente de la secuencia de ácido nucleico, ya que la secuencia de ácido nucleico puede ser obtenida a partir de cualquier fuente disponible. Un experto en la técnica está conciente de que los protocolos para obtener una secuencia de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook y otros, (1989), y en Ausubel y otros, (1997). En modalidades específicas de la presente ¡nvención, el vector de expresión además comprende una secuencia de polinucleótído que codifica un elemento de unión de célula. El elemento de unión de célula es una porción de un polipéptido, que facilita la unión de una proteína a un receptor de célula. Un polinucleótido que codifica cualquier ligando que se une a una proteína de receptor de célula puede ser utilizado en el vector de expresión de la invención. Los elementos de unión de célula ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, el fragmento Fc de inmunoglobulina, dominios de unión de célula de proteína de receptor de toxina, tales como, por ejemplo, el dominio de unión de célula de exotoxina de pseudomonas, una .* > . « & f?t citocina, por ejemplo, interleucina 5 e interleucina 6, cualquier tipo de una molécula de anticuerpo, y similares. Un experto en la técnica está conciente de que cualquier anticuerpo es capaz de unirse a marcadores de superficie celular sobre la superficie de células de 5 presentación de antígeno iniciando la internalización del complejo de antígeno/antícuerpo. De esta manera, se puede utilizar un anticuerpo o un fragmento del mismo como un elemento de unión de célula para iniciar la internalización. Los anticuerpos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, antiCDH, antiCD54, antiCDdO, y antiCD86. Además, 10 un experto en la técnica está conciente de que el elemento de unión de célula puede ser homólogo o heterólogo. Por ejemplo, el fragmento Fc puede ser homólogo o heterólogo. De esta manera, la invención no debe ser construida como limitante de ninguna manera a la fuente del elemento de unión de célula, ya que la secuencia para 15 un elemento de unión de célula puede ser obtenida a partir de cualquier fuente disponible, incluyendo, sin limitación, la clonación del ADN a partir de una colección recombinante o un genoma de célula, utilizando tecnología de clonación ordinaria y PCR™, y similares, y a través de medios sintéticos. 20 Además de utilizar porciones de elementos de unión conocidos, un experto en la técnica está conciente de que se pueden identificar pequeños péptidos a través de un procedimiento de clasificación típico bien conocido en la técnica. Una colección de ADN (ADNc o genómico) es clasificada para identificar pequeños péptidos que se 25 unen eficientemente a células de presentación de antígeno. Una vez que estos péptidos son identificados, el péptido es secuencia d y utilizado como un elemento de unión de célula en la presente invención. En la expresión, típicamente se incluirá una secuencia de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada de la transcripción. La naturaleza de la secuencia de poliadenilación se cree que no es crucial a la práctica exitosa de la invención, y/o se puede emplear cualquier secuencia. Las modalidades preferidas incluyen la secuencia de poliadenilación de SV40, secuencia de poliadenilación LTR, y/o la secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino, conveniente y/o que se sabe que funciona bien en varias células objetivo. También se contempla como un elemento para el vector de expresión un sitio de terminación transcripcional. Estos elementos pueden ser servir para mejorar niveles de mensaje y/o reducir al mínimo la lectura de las secuencias de polinucleótido insertadas que codifican el antígeno y los elementos de unión de célula a otras secuencias del vector. Una señal de iniciación específica también puede ser requerida para una traducción deficiente de las secuencias de codificación. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATG. Un experto en la técnica fácilmente puede ser capaz de determinar esto y proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de iniciación debe estar "en marco" con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegura la traducción de todo el inserto. Las señales de control de traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser ya sea naturales o sintéticos. La eficiencia de expresión puede ser mejorada a través de la inclusión de elementos mejoradores de transcripción apropiados. Con el fin de propagar un vector en una célula huésped, este puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (por lo general denominados como "ori"), que es una secuencia de ácido nucleico específica en donde se inicia la replicación. Alternativamente, se puede emplear una secuencia autónomamente de replicación (ARS) si la célula huésped es levadura. En casos en donde es benéfico que el vector de expresión se replique en una célula, el vector puede integrarse en el genoma de la célula a través de secuencias de integración, es decir, secuencias de repetición terminales largas de retrovírus (LTRs), secuencias ITR de virus adeno-asociado, las cuales están presentes en el vector, o alternativamente, el vector por sí mismo puede comprender un origen de replícacíón de ADN y otra secuencia que facilita la replicacíón del vector en la célula, mientras que el vector permanece en forma episómíca. Por ejemplo, el vector de expresión opcionalmente puede cornprender un virus de Epstein-Barr (EBV) de replicación de ADN y secuencias que codifican la proteína EBV EBNA-1 con el fin de que se facilite la replicación episómíca del vector en una célula en donde se introduce el vector. Por ejemplo, las construcciones de ADN que tienen el origen EBV y la codificación EBNA-1 de antígeno nuclear -w-.* -^ ~ á»*.J &. son capaces de replicación a un alto número de copias en células de mamífero y están comercialmente disponibles de, por ejemplo, (San Diego, CA). Es importante observar que en la presente invención no es necesario que el vector de expresión quede integrado al genoma de la célula huésped para una expresión apropiada de la proteína. Más bien, el vector de expresión también puede estar presente en una célula deseada en la forma de una molécula episómica. Por ejemplo, existen ciertos tipos de célula en donde no es necesario que el vector de expresión se replique con el fin de expresar la proteína deseada. Estas células son aquellas que no se replican en forma normal, tales como células de músculos, y más aún son totalmente capaces de expresión de gen. Un vector de expresión puede ser introducido en células que no se dividen y expresar la proteína codificada por las mismas en ausencia de replicación del vector de expresión. Para identificar células que contienen las construcciones de ácido nucleico de la presente invención, las células son identificadas in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Tales marcadores confieren un cambio inidentificable a la célula permitiendo la fácil identificación de células que contienen el vector de expresión. En general, un marcador seleccionable es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es uno, en donde la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es uno en donde su presencia evita su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármaco. Usualmente, la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Además de los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes basándose en la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores incluyendo marcadores seleccionables tales como GFP, cuya base es análisis calorimétrico. Alternativamente, se pueden utilizar enzimas seleccionables tales como timidina-cinasa (tk) de virus de herpes simple o acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT). Un experto en la técnica también puede saber como emplear los marcadores inmunológicos junto con el análisis de FACS. Por ejemplo, el NGFR (receptor de factor de crecimiento de nervios) es incluido en el vector de expresión para facilitar la selección de células comprendiendo el vector utilizando un ensayo citométrico de flujo que detecta la expresión del receptor NGFR sobre la superficie de célula. No se cree que sea importante el marcador utilizado, ya que este es capaz de ser expresado simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto de gen. Otros ejemplos de marcadores seleccionables y clasificables son bien conocidos por ..^1 i-, a-. aquellos expertos en la técnica. El vector de expresión también puede comprender un origen procariótico de replicación de ADN y un gen que codifica un marcador detectable para la selección de células procarióticas comprendiendo el vector de expresión, por ejemplo, un gen de resistencia a antibiótico, tal como, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina. Además, el vector de expresión puede ser provisto a la célula en la forma de ARN en lugar de ADN. Los componentes de núcleo del vector son iguales a aquellos descritos en la presente para un vector de ADN, y además, se pueden agregar otros componentes que sirven para estabilizar el ARN en fluidos del cuerpo y tejidos y células. Los métodos actuales para ligar conjuntamente los varios componentes descritos en la presente para general el vector de expresión de la invención son bien conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook y otros, (1989), Ausubel y otros, (1994), y en Gerhardt y otros, (1994). En modalidades específicas, el vector de expresión es seleccionado del grupo que consiste de vectores virales, vectores bacterianos y vectores de mamífero. Existen numerosos sistemas de vectores de expresión que comprenden por lo menos una parte o todas las composiciones discutidas anteriormente. Se pueden emplear sistemas basados en procariote y/o eucariote-vector para utilizarse con la presente invención para producir secuencias de ácido nucleico o sus polipéptidos proteínas y péptidos semejantes. i tá ,1 A* .,í¡?*A.íÍiA. tfe Muchos de estos sistemas están comercial y ampliamente disponibles. El sistema de célula de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de proteína de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en la patente de E. U. A. No. 5,871,986; 4,879,236 y pueden ser comprados, por ejemplo, bajo el nombre comercial de MaxBac® 2.0 de Invitrogen® y BacPack™ Baculovirus Expression System de Clontech®. Otros ejemplos de sistemas de vector de expresión incluyen Strategene®'s Complete Control™ Inducible Mammalian Expresión System, que involucran un receptor inducible por ecdisona sintético, o su sistema de expresión pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible de Invitrogen®, el cual lleva el sistema T-Rex™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamífero inducible que utiliza el promotor de CMV de longitud completa. Invitrogen® también proporciona un sistema de expresión de levadura denominado el sistema de expresión de Pichia methanolica, el cual está diseñado para la producción de alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia Methanolica. Un experto en la técnica podría saber como expresar un vector, tal como una construcción de expresión para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptído análogo. Una célula transformada que comprende un vector de expresión es generada introduciendo a la célula el vector de expresión. La íáÁá üá. . faa.,1.. tj. ¿Ü^. introducción de ADN a una célula o célula huésped es una tecnología bien conocida en el campo de biología molecular y se describe en, por ejemplo, Sambrook y otros, (1989), Ausubel y otros, (1994), y en Gerhardt y otros, (1994). Los métodos para la transfección de células incluyen precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por liposoma, transfeccíón mediada por DEAE dextrana, electroporación, similares. Alternativamente, las células pueden ser simplemente transducidas con el vector de expresión de retrogén de la invención utilizando tecnología ordinaria descrita en las referencias y ejemplos provistos aquí. La célula huésped incluye una célula procariótica o eucariótica, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula huésped puede, y ha sido utilizada como un receptor para vectores. Las células huésped pueden ser derivadas de procariotes o eucariotes, dependiendo de que si el resultado deseado es la replicación del vector o expresión de parte o todas las secuencias de ácido nucleico codificadas por el vector. Numerosas líneas de célula y cultivos están disponibles para utilizarse como una célula huésped, y estos pueden ser obtenidos a través de la Colección de Cultivo de Tipo Americano, American Type Culture Collection (ATCC), que es una organización que sirve como un archivo para cultivos vivientes y materiales genéticos (www.atcc.org). Está dentro de la experiencia y conocimiento de algún experto en la técnica determinar un huésped apropiado. Generalmente, este se basa en la estructura de base del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede ser introducido en una célula huésped procariote para replicación de muchos vectores. Las células bacterianas utilizadas como células huésped para la replicación y/o expresión de vector incluyen DH5a, JM109, y KC8, así como un número de huéspedes bacterianos comercialmente disponibles tales como SURE® Competent Cells and Solopack™ Gold Cells (Stratagene®, La Jolla, CA). Alternativamente, las células bacterianas tales como E. coli LE392 pueden ser utilizadas como células huésped para virus del fago. Las células eucarióticas que pueden ser utilizadas como células huésped incluyen, pero no se limitan a, levadura, insectos y mamíferos. Ejemplos de células huésped eucarióticas de mamífero para la replicación y/o expresión de un vector incluyen, pero no se limitan a, HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, y PC12. Ejemplos de cepas de levadura incluye, pero no se limitan a, YPH499, YPH500 y YPH501. Muchas células huésped de varios tipos de célula y organismos están disponibles y pueden ser conocidos para algún experto en la técnica. Similarmente, se puede utilizar un vector viral junto con ya sea una célula huésped eucariótíca o procariótica, particularmente una que sea permitida para la replicación o expresión del vector. Además, el vector de expresión puede ser provisto a una célula en la forma de un vector viral. La tecnología de vector viral es bien conocida en la técnica y se describe en, por ejemplo Sambrook y otros, (1989), y Ausubel y otros, (1994), y en otros manuales de biología molecular y virología. Los virus, los cuales son útiles como vectores incluye, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados virus de herpes y lentivirus. Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que permiten que éstos sean replicados y/o expresados tanto en células procarióticas como eucariótícas. Un experto en la técnica además puede entender las condiciones bajo las cuales se incuban todas las células huésped descritas para mantenerlas y permitir la replicación de un vector. También se entiende y se sabe que existen técnicas y condiciones que pueden permitir la producción a gran escala de vectores, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por vectores y sus polipéptidos, proteínas o péptidos análogos. Una modalidad específica de la presente invención es una proteína de fusión que comprende una secuencia de señal, un antígeno y un elemento de unión de célula. La invención también incluye el uso de la proteína de la proteína de retrogén o proteína de fusión como una vacuna. La proteína de retrogén puede ser obtenida expresando la proteína de retrogén en cualquier célula que comprenda el vector de expresión y separar la proteína de retrogén de la célula, desperdicio de célula y medio de célula. Los procedimientos de purificación de columna de afinidad pueden ser especialmente útiles para la purificación del retrogén de la invención, ya que el retrogén, por definición, comprende un elemento de unión de célula. Una columna de afinidad que comprende el receptor celular coincidente, o una proteína genérica tal como la »LíéiiLA»Á~*-*a¿ . i.í proteína A o proteína G, puede ser usada para separar el retrogén de los componentes celulares. Otra modalidad es una vacuna que comprende células de presentación de antígeno que son transducidas in vitro con la proteína de fusión. En modalidades adicionales, una vacuna comprende el vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia de promotor, una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia de señal de secreción, un polinucleótido que codifica un antígeno, un polínucleótido que codifica un elemento de unión de célula, un polinucleótido que codifica una secuencia de poliadenilacíón, todos operativamente enlazados. La vacuna que comprende el vector de expresión es administrada directamente al mamífero en sitios en donde existen células en donde las secuencias contenidas dentro del vector pueden ser introducidas, expresadas, y se puede producir una respuesta inmune contra la proteína deseada. En este caso el vector de expresion es administrado en un vehículo farmacéutico y en una formulación de manera que el ADN sea capaz de entrar a la células, y ser expresado ahí. La proteína expresada después puede entrar a células de presentación de antígeno para procesamiento y presentación de MHC, como se describe aquí. Un experto en la técnica puede observar que el ADN puede ser dado en una variedad de formas y, dependiendo de la ruta de inyección, la composición del ADN puede necesitar ser manipulada. Rutas ilustrativas de inyecciones parenterales incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intradérmica. Además, no es necesario que el ADN del vector de expresión sea introducido a las células del mamífero a través de inyección directa del mismo a los tejidos del mamífero. Más bien, se pueden utilizar otros medios de introducción del vector de expresión en el mamífero, incluyendo, pero no limitándose a, inyección a presión no invasiva, nasal, oral, etc. La cantidad de ADN que va a ser introducido en el mamífero es una cantidad suficiente para la expresión suficiente del ADN en la célula, de manera que una cantidad suficiente de la proteína es expresada y secretada de la misma, en donde la proteína después es absorbida por células de presentación de antígeno y expresada sobre las mismas como un complejo de MHC. Dicha cantidad de ADN es denominada en la presente como una "cantidad terapéutica" de ADN. La concentración precisa de ADN que constituye una cantidad terapéutica puede ser fácilmente determinada por algún experto en la técnica de administración de tales compuestos a mamíferos, y, por supuesto, variará dependiendo de los componentes contenidos ahí, y otros factores que incluyen, pero no se limitan a, el tejido en donde el ADN está siendo introducido y la edad y salud del mamífero. Otra modalidad específica de la presente invención es una vacuna que comprende células que son transducidas con el vector de expresión. Estas células transducidas están en la forma de una composición farmacéutica para administrarse a un mamífero con el propósito de producir una respuesta inmune en el mismo. La expresión de la proteína de retrogén en las células da como resultado la secreción de la proteína de retrogén a partir de la célula. La proteína de retrogén secretada después puede ser absorbida por células de presentación de antígeno en el mamífero para procesamiento ahí y expresión de las mismas como un complejo MHC-I o MHC-ll. Cuando la célula eucariótica es una célula de presentación de antígeno, la proteína de retrogén puede ser expresada ahí, secretada de la misma y puede volver a entrar a la célula para procesamiento y presentación de MHC antigénico. Cuando la célula eucariótica no es una célula de presentación de antígeno, la célula expresa y secreta la proteína de retrogén, la cual subsecuentemente es absorbida por una célula de presentación de antígeno para presentación antigénica de MHC. Las células de presentación que no son de antígeno útiles en la invención incluyen cualquier célula que no procese antígenos para la presentación de MHC, es decir, las células de músculo. Las células de presentación de antígeno incluyen células dendríticas (DC), macrófagos, monocitos y similares. Las células tumorales, las cuales también están incluidas, pueden ser células que son o no capaces de procesar antígenos para la presentación de MHC. El vector de expresión también puede ser introducido en í células del vastago de un mamífero, ya sea directamente in vivo en el mamífero, o muy preferiblemente, ex vivo en células que son removidas del mamífero y se vuelven a introducir al mamífero después de introducción del vector a la célula. El vector de u i i i.í -J, ? expresión también puede ser introducido en otras células en el mamífero en un aspecto ex vivo. Cuando el vector es introducido en células en el mamífero, no es necesario que el vector exprese la proteína codificada por el mismo inmediatamente, ya que, puede ser más deseable que la proteína sea expresada en las células en un tiempo posterior. En este caso, el vector de expresión preferiblemente comprende un promotor inducible, el cual es activado después de la administración del inductor apropiado para el mamífero o para las células del mamífero. La tecnología ex vivo es bien conocida en la técnica y se describe en, por ejemplo, la patente de E. U. A. No. 5,399,346. Una modalidad adicional es un vector de expresión que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica un antígeno y un polinucleótido que codifica un dominio de unión de célula. Otra modalidad de la presente invención es un método para producir una respuesta inmune dirigida contra un antígeno. Más particularmente, este método utiliza el vector de expresión de la presente invención para manipular células para producir antígenos endógenos como si fueran antígenos exógenos. Esta estrategia de presentación de antígeno novedosa involucra transducir células con un vector de expresión recombinante novedoso para producir y secretar una proteína de fusión consistiendo de un antígeno y un elemento de unión de célula. La proteína de fusión secretada es endocitada o "retrogradualmente" transportada a células de presentación de antígeno a través de endocitosis mediada por receptor (Daeron, 1997; Serré y otros, 1998; Ravetch y otros, 1993). Como resultado, la proteína de fusión, o "retrogén" según denominado en la presente solicitud debido a su transporte 5 retrógrada después de la secreción, es procesada en la trayectoria endosómica y es presentada sobre la superficie celular de las células de presentación de antígeno como fragmentos antigénicos exógenos restringidos por MHC-ll, aunque ha sido producido endógenamente. Los fragmentos antigénicos unidos a MHC-ll del antígeno sobre la 10 superficie de las células de presentación de antígeno activan células T CD4+ que a su vez estimulan células T CD8+ y macrófagos, así como células B para inducir tanto inmunidad celular como humoral. También se ha descubierto en la presente invención que la proteína de retrogén también puede ser procesada en la trayectoria 15 citosólica durante la síntesis, secreción y endocitosís de proteína de fusión y queda asociada con MHC-I sobre la superficie de las células de presentación de antígeno para activar directamente células T CD8 + . La activación de células T CD8+ a través de antígenos internalizados se describe en la técnica y, por ejemplo, por 20 Kovacsovics-Bankowskí y otros, 1995. Además, como se observó anteriormente y se describe con mayor detalle en la presente, las células B pueden ser activadas a través del retrogén secretado. De esta manera, la activación de la célula B es mejorada marcadamente en el sistema de la presente ya que las células CD4+ también activan 25 células B. De esta manera, esta estrategia utiliza un mecanismo de ^-'m s . '.tiÍ&A AAÍ> --á.--* -i -*• **J ?*.Í?Í. ^¿Ss .. ....... ? .i «ÜttÉ unificación para activar todos los brazos del sistema inmune. En modalidades específicas, el vector de expresión es introducido en una célula para producir una célula transducida. La expresión de la proteína de retrogén en las células da como resultado la secreción de la proteína de retrogén a partir de la células. La proteína de retrogén secretada después puede ser absorbida por células de presentación de antígeno en el mamífero para procesarse en el mismo y expresión del mismo como un complejo de MHC-I o MHC-ll. De esta manera, un experto en la técnica puede observar que la célula transducida o la primera célula secreta el antígeno y el antígeno secretado es internalizado en una célula, una segunda célula, ya sea la misma célula o una célula diferente. Cuando la célula eucariótica es una célula de presentación de antígeno, la proteína de retrogén puede ser expresada en la misma, secretada de la misma y puede volver a entrar a la célula para procesamiento y presentación de MHC antigénico. Cuando la célula eucariótica no es una célula de presentación de antígeno, la célula expresa y secreta la proteína de retrogén, que subsecuentemente es absorbida por una célula de presentación de antígeno para presentación de MHC antigénico. Las células de presentación que no son de antígeno útiles en la invención incluyen cualquier célula que no procese antígenos para la presentación de MHC, es decir, células de músculo. Las células de presentación de antígeno incluyen células dendríticas (DC), macrófagos, monocitos y similares. Las células tumorales, las cuales también son incluidas. pueden ser células que son o no capaces de procesar antígenos para la presentación de MHC. Una modalidad adicional de la presente invención es un método para producir una respuesta inmune dirigida contra un antígeno, que comprende el paso de administrar el vector de expresión directamente a un mamífero. La invención también incluye un método para clasificar o identificar una secuencia de polinucleótido que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll que es capaz de producir una respuesta inmune en un mamífero. Preferiblemente, el polipéptído, el cual es identificado, es uno que produce una respuesta inmune que es benéfica para el mamífero. El método comprende obtener una población de moléculas de ADN aisladas y clasificar para aquellas moléculas de ADN aisladas que codifican por lo menos un epítopo restringido por MHC-ll que es capaz de activar células T auxiliares CD4 + . Las moléculas de ADN son denominadas en la presente como "ADN de prueba" o "secuencia de polinucleótido de prueba". Las secuencias de polinucleótido de prueba son clonadas al vector de expresión de la presente invención, en el vector que está colocado entre la secuencia de señal y el elemento de unión celular como se ilustra, por ejemplo, en la Figura 25. En el método, las células de presentación de antígeno son transducidas introduciendo el vector que comprende la secuencia de polinucleótido de prueba a las células de presentación de antígeno, las células de presentación de antígeno transducidas se ponen en contacto con células T naturales 1 o células T iniciadas y la capacidad de las células transducidas para activar células T CD4+ naturales in vitro, es determinada determinando si cualquiera de las células T naturales o células T iniciadas son activadas después del contacto con células de presentación de antígeno transducidas. La activación de células T a través de células de presentación de antígeno transducidas es una indicación de que las secuencias de polinucleótido de prueba contenida en las mismas es una secuencia de polinucleótido, o genofragmento del mismo que codifica por lo menos un epítopo capaz de activar células T auxiliares CD4+ para producir una respuesta inmune en un mamífero. Los controles adecuados que pueden ser utilizados en el ensayo incluyen células que son transducidas con un vector de expresión comprendiendo una secuencia de polinucleótido aislada que se sabe que no activa la respuesta inmune en un mamífero (control negativo), y células que son transducidas con un vector de expresión comprendiendo una secuencia de polinucléotido aislada que se sabe que activa la respuesta inmune en un mamífero (control positivo). Un experto en la técnica está conciente de que este procedimiento de clasificación puede ser utilizado para clasificar el genoma humano para identificar ge?es que codifican proteínas o epítopos que son reconocidos por células T CD4+ que pueden ser utilizadas para inmunoterapia para cáncer o enfermedad autoinmune o para terapia de gen. Además, otros genomas pueden ser clasificados, incluyendo, bacterianos, virales o de parásito.

El ensayo de activación de célula T in vitro puede ser adaptado para ser un ensayo automático de alta producción con el fin de facilitar la prueba de muchas diferentes secuencias de polinucleótido de prueba a la vez. Un experto en la técnica reconoce que la presente invención puede ser manipulada para transducir células con vectores de expresión conteniendo una variedad de posibles secuencias de epítopos. Las células transducidas pueden ser colocadas en placas de 96 cavidades, conteniendo células T naturales, y la activación de las células T puede ser determinada a través de una determinación automática de incorporación de radioactividad al ADN de las células T, utilizando tecnología fácilmente disponible en inmunología clínica. En otras modalidades, el producto de proteína codificado por las secuencias de polinucleótido de prueba además puede ser evaluado para determinar la activación de la respuesta inmune en un mamífero in vivo. Este ensayo es igual como el ensayo in vitro excepto que, las células de presentación de antígeno transducidas que fueron transducidas introduciendo el vector de expresión comprendiendo las secuencias de polinucle?tido de prueba son administradas a un mamífero a través de una ruta parenteral. En modalidades específicas, el vector de expresión que comprenden las secuencias de polinucleótido de prueba es administrado directamente a un mamífero. Las células T son recolectadas de esplenocitos y co-cultivadas con células dendríticas. La activación de células T es determinada para determinar si el polinucleótido de prueba que 4Í44lt¿¿ tí — - JJjitJUfa - á métodos sintéticos, en donde una secuencia de polinucleótido es sintetizada en un sintetizador automático, fragmentos de longitudes discretas son clonadas en el vector de expresión y son probadas como se describe en la presente. No siempre es necesario que la respuesta inmune sea protectora, sino que meramente sea benéfica para el mamífero huésped. Por ejemplo, puede ser benéfico para un mamífero inducir tolerancia inmune en situaciones en donde una respuesta inmune a un antígeno es peligrosa para el mamífero, por ejemplo, en ciertas enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, lupus sistémíco eritematoso, psoriasis, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, etc., una disminución en la respuesta inmune se deriva que puede ser lograda induciendo tolerancia inmune contra el antígeno ofensivo. En este caso, el ADN comprende el ADN que codifica el antígeno ofensivo, el cual después es expresado en células del mamífero y subsecuentemente procesado en células de presentación de antígeno, con el fin de ser expresado en su superficie como un complejo de MHC-I y MHC-ll, con el fin de inducir tolerancia inmune en el mamífero contra el antígeno. En una modalidad adicional, se utiliza una secuencia de po\inucleótido identificado como un método para tratar cáncer, infecciones virales o una enfermedad autoinmune. Más particularmente, el polinucleótido identificado que codifica un polipéptído de prueba es transducido a células de presentación de antígeno y las células de presentación de antígeno transducidas son SÍ.S, A í j. J codifica al polipéptido de prueba es capas de activar células T auxiliares CD4 + . Además, un experto en la técnica está conciente de que este procedimiento de clasificación puede ser utilizado para identificar epítopos restringidos por MHC-ll que pueden ser utilizados para tratar cáncer, infecciones virales y enfermedad autoinmune. Como se observa en la presente, las secuencias de polinucleótido de prueba pueden ser obtenidas a través de medios ordinarios comunes en la técnica de biología molecular. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido de prueba pueden ser obtenidas a través de una colección de expresión, dicha colección puede expresar proteínas cuya función es desconocida. Las secuencias de polínucleótido de prueba también pueden ser obtenidas a partir de una colección de expresión que expresa proteínas de función conocida, pero las cuales, hasta ahora, no se ha sabido que posean la propiedad de activación del sistema inmune en un mamífero. Las colecciones de ADNc de expresión ilustrativas incluye, pero no se limitan a, células tumorales, genomas virales, genomas bacterianos, genomas parásitos, y genomas humanos. Las secuencias de polinucleótido de prueba también pueden ser obtenidas utilizando metodología de combinación, en donde no se sabe o conoce al principio si la secuencia de polinucleótido codifica una proteína, y además, se desconoce sí la secuencia de polinucleótido codifica una proteína que sea capaz de activar la respuesta inmune. También se pueden obtener secuencias de polinucleótido de prueba a través de administradas directamente a un mamífero a través de una ruta parenteral para tratar cáncer, una infección viral o una enfermedad autoinmune. Además, el vector de expresión que contiene por lo menos el polinucleótido que codifica un polipéptido de prueba y un elemento de unión de célula es administrado directamente a un mamífero a través de una ruta parenteral para tratar cáncer, una infección viral o una enfermedad autoinmune. Una modalidad adicional de la presente invención es un método para producir una vacuna para inmunizar a un mamífero, que comprende los pasos de: transducir una célula de presentación de antígeno introduciendo el vector de expresión de la presente invención a una célula y expresando dicho vector para producir un antígeno bajo condiciones, en donde el antígeno es secretado de las células. En modalidades específicas, las células de presentación de antígeno son transducidas con el antígeno in vitro o ex vivo antes de administrar las células de presentación de antígeno al mamífero. Todas las vacunas de la presente ¡nvención pueden ser administradas parenteralmente. En modalidades específicas, el método para inducir una respuesta inmune comprende el paso de co-administrar a un organismo el vector de expresión y un vector de expresión de citocina. Un número de estudios ha mostrado que las respuestas a plásmidos individuales pueden ser mejoradas a través de la coadministración de un plásmido de expresión de citocina. Se debe observar que cantidades de picogramo a nanogramo de citocina localmente sintetizada a partir del vector de expresión son demasiado bajas para tener efectos sistémicos en todo el mamífero, pero pueden seguir influenciando fuertemente el ambiente de atocina local y de esta manera la respuesta inmune al antígeno administrado. Ejemplos de citocinas incluyen, pero no se limitan a, GM-CSF e IL-2. Un experto en la técnica fácilmente reconoce que las secuencias de polinucleótido para una citocina y las secuencias de polinucleótido para el antígeno pueden ser incorporadas en un vector de expresión; eliminando así el uso de dos vectores separados. Además de las citocinas, los plásmidos que contienen secuencias CpG no metiladas mejoran la respuesta mediada por la célula (Th1) (Carsorr y otros, 1997). Los motivos de la secuencia de CpG incluyen, pero no se limitan a, RRCpGYY. De esta manera, un experto en la técnica puede realizar que la suplementación de una citocina con el vector de expresión o adición de un motivo de secuencia CpG en la presente invención puede dar como resultado la mejora de la respuesta'inmune. En ciertas modalidades de la invención, el uso de elementos sitios de entrada de ribosoma internos (IRES) son utilizados para crear mensajes de genes múltiples o policistrónicos. Los elementos de IRE-S son capaces de derivar el modelo de exploración de ribosoma de traducción dependiente de Cap metilado 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Los elementos de IRES de dos miembros de la familia de piconavirus (polio y encéfalomiocarditis) han sido descritos (Pelletier y Sonenberg, 1991), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos de IRES pueden ser enlazados a marcos de lectura abiertos heterólogos. Los marcos de lectura abiertos múltiples pueden ser transcritos conjuntamente; 5 cada uno separado a través de un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a ribosoma para traducción eficiente. Las secuencias de ácido nucleico múltiples pueden ser eficientemente expresadas utilizando un promotor/mejorador individual para 0 transcribir un solo mensaje (patentes de E. U. A. 5,925,565 y 5,935,819). Además, un experto en la técnica está conciente de que toda la secuencia de ácido nucleico de un gen no tiene que seF utilizada. Más bien, las secuencias de ácido nucleico parciales de epítopos restringidos de MHC de clase I y II pueden ser fusionadas 5 conjuntamente, dando como resultado un gen de fusión quimérico transcrito por otro promotor. Por ejemplo, una modalidad específica de la presente invención es un método para inducir simultáneamente tanto células T CD4+ como CD8 + , que comprende los pasos de administrar una proteína de fusión, en donde la proteína comprende 0 tanto un epítopo de MHC-I como de MHC-ll a un elemento de unión de células. De esta manera, un experto en la técnica reconoce que el uso de secuencias antigénicas múltiples da como resultado el tratamiento de una variedad de enfermedades con la administración de una vacuna. 5 Otra modalidad específica de la presente ¡nvención es un i t,ii¿A..¿aÍ4-«,A4., ..i método para inducir una respuesta inmune , que comprende los pasos de administrar a un mamífero un vector de expresión, en donde dicho vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una primera proteína de fusión y una secuencia de polinucleótido que codifica una segunda proteína de fusión bajo el control transcripcional de un promotor, en donde la primera proteína de fusión comprende una primera secuencia de señal, un primer antígeno y un primer elemento de unión de célula y dicha segunda proteína de fusión comprende una segunda secuencia de señal, un segundo antígeno y un primer elemento de unión de célula. En modalidades específicas, las primera y segunda secuencias de señal son la misma secuencia de señal, los primero y segundo antígenos son antígenos diferentes y los elementos de unión de célula es un fragmento Fc. En modalidades adicionales , las primera y segunda secuencias de señal son iguales, los primero y segundo antígenos son antígenos diferentes y los primero y segundo elementos de unión de célula son los mismos elementos de unión de célula. Otras modalidades incluyen, las primera y segunda secuencias de señal son diferentes, los primero y segundo antígenos son antígenos diferentes y los primero y segundo elementos de unión de célula son los mismos elementos de unión de célula con las primera y segunda secuencias de señal son iguales, los primero y segundo antígenos son antígenos diferentes y los primero y segundo elementos de unión de célula son diferentes elementos de unión de célula. Una modalidad adiciona l incluye q ue la secuencia de polinucleótido que codifica la primera proteína de fusión y la secuencia de polinucleótido que codifica la segunda proteína de fusión están bajo el control transcripcional, y en donde la secuencia de polinucleótido que codifica la primera proteína de fusión y la secuencia de polinucleótido que codifica la segunda proteína de fusión están en tándem en un vector de expresión. Un experto en la técnica está conciente de que múltiples secuencias de ácido nucleico pueden ser clonadas al vector en tándem, de manera que cada secuencia de ácido nucleico es una entidad separada. Cada entidad contiene un promotor que dirige la expresión de la célula de ácido nucleico individual dando como resultado la expresión de antígenos separados de un vector. Esta técnica eficientemente expresa secuencias de ácido nucleico que utilizan promotores múltiples para transcribir los mensajes individuales. Una modalidad adicional de la presente invención es un método para producir una proteína de fusión, que comprende los pasos de producir el vector de expresión de la presente invención en una célula y expresar el vector para producir una proteína de fusión bajo 0 condiciones en donde la proteína de fusión es secretada de la célula. En modalidades específicas, las células de presentación de antígeno son transducídas con la proteína de fusión in vitro. Más particularmente, la proteína de fusión es administrada parenteralmente a un mamífero. Una modalidad específica de la presente invención es un í.i*t¿.¿.áí *ÍUíx?*i......A.A- ,., método para secretar una proteína intracelular, que comprende los pasos de introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica una proteína ¡ntracelular, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados y expresando dicho vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones en donde la proteína de fusión es secretada de la célula. Más específicamente, la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína ¡ntracelular es truncada o mutada para incrementar la eficiencia de secreción. En modalidades específicas, La proteína intracelular es HPV 16 E7. Otra modalidad específica de la presente invención es un método para secretar una proteína de membrana, que comprende tos pasos de introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucleótido, un polinucleótido que codifica una secuencia de señal, un polinucleótido que codifica una proteína de membrana, un polinucleótido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucleótido, todos operativamente enlazados y expresando dicho vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones en donde dicha proteína de fusión es secretada de la célula. Más específicamente, la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de membrana es truncada o mutada para incrementar la eficiencia de secreción. En modalidades específicas, la proteína de membrana es el antígeno nuclear 1 EBV. La invención también incluye un equipo que comprende la composición de la invención y un material de instrucciones que describe la administración en forma de adviento la composición a una célula o un tejido de un mamífero. En otra modalidad, este equipo comprende un solvente (preferiblemente estéril) adecuado para disolver o suspender la composición de la invención antes de administrar el compuesto al mamífero. 10 Dosis y Formulación Los vectores de expresión, células transducidas y proteínas de fusión (ingredientes activos) de esta invención pueden ser formulados y administrados para tratar una variedad de estados de 15 enfermedad a través de medios que producen contacto del ingrediente activo con el sitio de acción del agente en el cuerpo del organismo. Estos pueden ser administrados a través de cualquier medio convencional disponible para utilizarse junto con productos farmacéuticos, ya sea como ingredientes activos terapéuticos 20 individuales o en una combinación de ingredientes activos terapéuticos. Estos pueden ser administrados solos, pero en general son administrados con un vehículo farmacéutico seleccionado con base en la rut de administración seleccionada y práctica farmacéutica estándar. 25 El ingrediente activo puede ser administrado oralmente en formas de dosis sólidas tales como cápsulas, tabletas y polvos, o en formas dosis líquidas tales como elíxires, jarabes, emulsiones y suspensiones. El ingrediente activo también puede ser formulado para administración parenteral a través de inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea o absorción dérmica. El agente puede ser administrado intramuscularmente, intravenosamente, o como un supositorio. Las cápsulas de gelatina contienen el ingrediente activo y vehículos en polvo tales como lactosa, sacarosa, manitol, almidón, derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, y similares. Se pueden utilizar diluyentes similares para hacer tabletas comprimidas. Tanto tabletas como cápsulas pueden ser fabricadas; como productos de liberación sostenida para proporcionar una liberación continua del medicamento durante un período de horas. Las tabletas comprimidas pueden ser cubiertas con azúcar o cubiertas con una película para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger a la tableta de la atmósfera, o con una cubierta entérica para desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosis líquidas para administración oral pueden contener agentes de coloración y saborizantes para incrementar la aceptación del paciente. En general, el agua, aceite adecuado, salina, dextrosa acuosa (glucosa), y soluciones de azúcar relacionadas y glicoles tales como glicol propilénico o glicoles polietilénicos son vehículos adecuados para soluciones parenterales. Las soluciones para administración parenteral contienen el ingrediente activo, agentes de estabilización adecuados y, si se es necesario, substancias reguladoras de pH. Los agentes antioxidantes tales como bisulfato de sodio, sulfito de sodio 5 o ácido ascórbico, ya sea solos o combinados, son agentes de estabilización adecuados. También se utilizan ácido cítrico y sus sales y ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sodio. Además, las soluciones parenterales pueden contener conservadores tales como cloruro de benzalconio, metil o propil-paraben y clorobutanol. Los 0 vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, una referencia estándar en este campo. Los ingredientes activos de la invención pueden ser formulados para ser suspendidos en una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para utilizarse en mamíferos y en particular, en 5 seres humanos. Tales formulaciones incluyen el uso de auxiliares tales como derivados de dipéptido de muramilo (MDP) o análogos que se describen en las patentes de E.U.A. No. 4,082,735; 4,082,736; 4,101,536; 4,185,089; 4,235,771; y 4,406,890. Otros auxiliares que son útiles, incluyen alumbre (Pierce Chemical Co.), 0 lípído A, dímicolato de trehalosa y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), auxiliar de Freund e IL-12. Otros componentes pueden incluir un polímero de bloque de polioxipropileno-polioxietileno (Pluronic®), un agente tensoactivo no iónico, y un aceite metabolizable tal como escualeno (patente de 5 E.U.A. No. 4,606,918). i^t.^^ .A.*^*tMAAAiArtfcA3fe^ Además, se pueden emplear métodos farmacéuticos estándares para controlar la duración de acción. Estos son bien conocidos en la técnica e incluyen preparaciones de liberación de control y pueden incluir macromoléculas apropiadas, por ejemplo, polímeros, 5 poliéteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolídona, acetato de etilen- vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina. La concentración de macromoléculas así como los métodos de incorporación pueden ser ajustados con el fin de controlar la liberación. Además, el agente puede ser incorporado a partículas de 0 materiales polimérícos tales como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de etíleno-acetato de vinilo. Además de ser incorporados, estos agentes también pueden ser usados para atrapar el compuesto en microcápsulas. Las formas de dosis farmacéuticas útiles para la administración 5 de los compuestos de esta invención pueden ser ilustrados como sigue. Cápsulas: Las cápsulas se preparan llenando cápsulas de gelatina dura de dos piezas estándares, cada una con 100 miligramos de ingrediente activo en polvo, 175 miligramos de 0 lactosa, 24 miligramos de talco y 6 miligramos de estearato de magnesio. Cápsulas de gelatina suave: Una mezcla de ingrediente activo en aceite de soya, se prepara e inyecta a través de una bomba de desplazamiento positivo en gelatina para formar cápsulas de gelatina 5 suave conteniendo 100 miligramos de ingrediente activo. Las l,¿,.t.,A.¿.ÁíAiA .*A ..i,,.¿ cápsulas después son lavadas y secadas. Tabletas: Las tabletas son preparas a través de procedimientos convencionales, de manera que la unidad de dosis es de 100 miligramos de ingrediente activo. 0.2 miligramos de dióxido de silicio 5 coloidal, 5 miligramos de estearato de magnesio, 275 miligramos de celulosa microcristalina, 11 miligramos de almidón de maíz y 98.8 miligramos de lactosa. Se pueden aplicar cubiertas apropiadas para incrementar el sabor o retrazar la absorción. Productos inyectables: Una composición parenteral adecuada 0 para administrarse a través de inyección se prepara agitando 1.5% en peso de ingredientes activos en 10% en peso de glicol propilénico y agua. La solución se hace ¡sotónica con cloruro de sodio y se esteriliza. Suspensión: Se prepara una suspensión acuosa para 5 administración oral de manera que cada 5 mililitros contienen 100 miligramos del ingrediente activo finamente dividido, 200 miligramos de carboximetilcelulosa de sodio, 5 miligramos de benzoato de sodio, 1.0 gramos de sorbitol, solución U. S. P., y 0.025 mililitros de vainilla. 0 Por consiguiente, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser suministrada a través de varias rutas y a varios sitios en el cuerpo del mamífero para lograr un efecto particular (ver, por ejemplo, Rosenfeld y otros, 1991; Rosenfeld y otros, 1991a; Jaffe y otros, supra; Berker, supra). Un experto en la técnica reconocerá 5 que aunque más de una ruta puede ser utilizada para administración, tu.., AiÍ4 una ruta particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. El suministro local o sistémico puede ser logrado a través de la administración que comprende aplicación o vídades del cuerpo, inhalación instilación de la formulación en las ca través de introducción parenteral , o insuflación de un aerosol , o a comprendiendo administración i ntramuscular, intravenosa, peritoneal , subcutánea , intradérmica, así como tópica. Los ingredientes activos de la presente invención pueden ser provistos en una forma de dosis unitaria, en donde cada unidad de dosis, por ejemplo, una cucharada , tableta, solución o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición , sola o en combinación apropiada con otros agentes activos. El término "forma de dosis unitaria) como se utiliza en la presente , se refiere a nte d iscretas adecuadas como dosis unitarias para unid ades físicame da unidad conteniendo una cantidad seres humanos y mam íferos, ca nes de la presente invención , sola predeterminada de las composicio n combinación con otros agentes activos, calculada en una o e cantidad suficiente para producir el efecto deseado, en asociación con un dil uyente , vehículo o portador, farmacéuticamente aceptable , en donde sea apropiado. Las especificaciones para las formas de dosis un itaria de la presente invención dependen del efecto particular q ue será log rado y la farmacodinámica particular asociada con la composición farmacéutica en el huésped particular. Estos métodos descritos aqu í son de ninguna manera todos 5 inclusivos , y otros métodos para mejorar la solicitud específica serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Además, la cantidad efectiva de las composiciones puede ser aproximada a través de la analogía para los compuestos con los que se sabe que ejercen el efecto deseado.

Formulación y/o Nanocápsulas de Lípido En ciertas modalidades, el uso de formulaciones y/o nanocápsulas de lípido se contempla para la introducción del vector 0 de expresión, a células huésped. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos en una forma estable y/o reproducible. Para evitar efectos laterales debido a la sobrecarga polímérica intracelular, se deben diseñar partículas ultrafinas (tamaño de alrededor de 0.1 µm) utilizando 15 polímeros que sean capaces de degradación in vivo. Las nanopartículas de polialquilcianoacrilato biodegradables que satisfacen estos requerimientos son contempladas para utilizarse en la presente invención, y/o tales partículas pueden hacerse fácilmente. 0 En una modalidad específica de la invención, el vector de expresión puede ser asociado con un lípido. El vector de expresión asociado con un lípido puede ser encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, interseparada dentro de la capa doble de lípido de un liposoma, unida a un liposoma a través de una molécula de 5 enlazamiento que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, en complejo con un liposoma, dispersado en una solución conteniendo un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como un suspensión en un lípido, contenido o en complejo con una micela, o de otra manera asociado con un lípido. Las composiciones adecuadas con lípido o lípido/vector de expresión de la presente invención no están limitadas a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de doble capa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También simplemente pueden ser intercaladas en una solución, posiblemente formando agregados que no son de un tamaño o forma uniforme. Los lípidos son substancias grasas que pueden ser lípidos de existencia natural o sintéticos. Por ejemplo, los lípídos incluyen las gotas grasas de existencia natural en el citoplasma así como la clase de compuestos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, los cuales contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes, y aldehidos. Se pueden utilizar fosfolípidos para preparar los liposomas de acuerdo con la presente invención y puede llevar una carga positiva, negativa o neutra neta. Se puede emplear fosfato de diacetilo para conferir una carga negativa sobre los liposomas, y se puede utilizar estearilamina para conferir una carga positiva sobre los liposomas. Los líposomas pueden hacerse de uno o más fosfolípidos.

Un lípido neutralmente cargado puede comprender un lípido sin carga, un lípido substancialmente no cargado, o una mezcla de lípído con un número igual de cargas positivas y negativas. Los fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilcolinas y otros que son bien conocidos 5 por aquellos expertos en la técnica. Los lípidos adecuados para utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden ser obtenidos a partir de fuentes comerciales. Por ejemplo, se puede obtener dimiristil fosfatilcolina ("DMPC") de Sigma Chemical Co., dicetil fosfato ("DCP") se puede 10 obtener de K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Chol") se obtiene de Calbiochem-Behring; el dimiristil fosfatidilclicerol ("DMPT") y/ otros lípidos pueden ser obtenidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Las soluciones de abastecimiento de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden ser almacenadas 15 a aproximadamente -20°C. De preferencia, el cloroformo es utilizado como el solvente, ya que evapora más fácilmente que el metanol. Los fosfolípidos de fuentes naturales tales como fosfatidil colina de huevo o soya, ha sido fosfatídico de cerebro, fosfatidil inositol de cerebro o planta, cardiolípina de corazón y 20 fosfatídiletanolamina de plantas o bacterias preferiblemente no son utilizados, como la fosfatina primaria, es decir, constituyendo 50% más de la composición total de fosfatina, debido a la inestabilidad y falta de liposomas resultantes. "Liposoma" es un térmico genérico que abarca una variedad de 25 vehículos de lípido individuales o multilaminares formados a través ? TÜnr ifffn * *!**». * -*• de la generación de capas dobles de lípido encerradas o agregados. Los liposomas pueden ser caracterizados por tener estructuras vesiculares con una membrana de doble capa de fosfolípido y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples 5 capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman simultáneamente cuando los fosfolípidos son suspendidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes de lípído experimentan la autoredisposición antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las capas dobles de lípido 0 (Ghosh y Bachhawat, 1991 ). Sin embargo, la presente invención también abarca composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o meramente existir como agregados no uniformes de moléculas de lípido. También se 5 contemplan complejos de lipofectamina-ácido nucleico. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras diferentes a los liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la relación molar de lípido a agua. A bajas relaciones el liposoma es la estructura preferida. Las características 0 físicas de los liposomas dependen del pH , resistencia iónica y/o presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a substancias iónicas y/o polares, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que marcadamente altera su permeabilidad . La transición de fase involucra un cambio de 5 una estructura ordenada, estrechamente empacada, conocida como estado de gel, a una estructura menos ordenada, empacada en forma suelta, conocida como el estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fase característica y/o da como resultado un incremento en la permeabilidad para iones, azúcares 5 y/o fármacos. Los liposomas interactúan con células a través de cuatro mecanismos diferentes: la endocitosis a través de células fagocíticas del sistema reticuloendotelíal tales como macrófagos y/o neutrófilos; adsorción a la superficie de célula, ya sea a través de fuerzas. 10 hidrofóbicas y/o electrostáticas débiles no específicas, y/o a través de interacciones específicas con componentes de superficie de célula; fusión con la membrana de célula de plasma a través de la inserción de la capa doble de lípido del líposoma a la membrana de plasma, con liberación simultánea de contenidos liposómicos ai 15 citoplasma; y/o a través de transferencia de lípidos liposómicos a membranas celulares y/o subcelulares, y/o viceversa, sin ninguna asociación de los contenidos de liposoma. La variación de la formulación del liposoma puede alterarse, este mecanismo es operativo, aunque más de uno puede operar al mismo tiempo. 20 El suministro de oligonucleótido mediado por liposoma en la expresión de ADN extraño in vitro ha sido muy exitoso. Wong y otros (1980) demostraron la confiabilidad del suministro mediado por liposoma y la expresión de ADN extraño en embriones de pollos cultivados, células HeLa y de hepatoma. Nicolau y otros, (1987) 25 lograron una transferencia exitosa de gen mediada por liposoma en — ,»* *- T| r-.r t ^ ^ ,fc^ l? &?_^ ^ , , , .. ratas después de inyección intravenosa. En ciertas modalidades de la ¡nvención, el lípído puede ser asociado con un virus de hemaglutinación (HVJ). Esto ha mostrado facilitar la fusión con la membrana de célula y promueve la entrada de la célula del ADN encapsulado en liposoma (Kaneda y otros, 1989). En otras modalidades, el lípido puede ser formado en complejo o empleado junto con proteínas cromosómicas que no so de histona, nucleares (HMG-1) (Kato y otros, 1991). En otras modalidades más, el lípído puede ser formado en complejo o empleado junto con HVJ y HMG-1. Ya que dichos vectores de expresión han sido exitosamente empleados en la transferencia y expresión de un oligonucleótido in vitro o in vivo, entonces estos son aplicables para la presente invención. Cuando se emplea un promotor bacteriano en la construcción de ADN, también será deseable incluir dentro del liposoma una polimerasa bacteriana apropiada. Los liposomas utilizados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse a través de diferentes métodos. El tamaño de los liposomas varía dependiendo del método de síntesis. Un liposoma suspendido en una solución acuosa generalmente está en la forma de una vesícula esférica, teniendo una o más capas concéntricas de moléculas de doble capa de lípidos. Cada capa consiste de una disposición paralela de moléculas representadas por la fórmula XY, en donde X es una porción hidrofílica e Y es una porción hidrofóbica. En una suspensión acuosa, las capas concéntricas están dispuestas *<**.<* A -f- -*-tl#fj|- -fe.'!!..-* j .:.: de manera que las porciones hidrofílicas tienden a permanecer en contacto con una fase acuosa y las regiones hidrofóbícas tienden a autoasociarse. Por ejemplo, cuando las fases acuosas están presentes dentro y sin el liposoma, las moléculas de lípido pueden formar una capa doble, conocida como una laminilla, de la disposición XY-YX. Los agregados de lípidos pueden formarse cuando las partes hidrofílicas e hidrofóbicas de más de una molécula de lípido quedan asociadas entre sí. El tamaño y forma de estos agregados dependerá de muchas diferentes variables, tales como la naturaleza del solvente y la presencia de otros compuestos en la solución. Los liposomas dentro del alcance de la presente invención! pueden ser preparados de acuerdo con técnicas de laboratorio- conocidas. En una modalidad preferida, los liposomas son preparados mezclando lípidos liposómicos, en un solvente en un recipiente, por ejemplo, un matras de vidrio, con forma de pera. El recipiente debe tener un volumen 10 veces mayor que el volumen de la suspensión de liposomas esperada. Al utilizar un evaporador giratorio, el solvente es removido aproximadamente 40°C bajo presión negativa. El solvente normalmente es removido en 5 minutos a 2 horas, dependiendo del volumen deseado de los liposomas. La composición puede ser secada adicionalmente en un desecador bajo vacío. Los lípidos secos generalmente son desechados después de aproximadamente una semana, debido a que tienden a deteriorarse con el tiempo. ,¿4.4 «j. AJ- *- *-4*«t t L. .

Los lípidos secos pueden ser hidratados a aproximadamente 25-50 mM de fosfolípido en agua libre de hidrógeno, estéril agitando hasta que toda la película de lípido se vuelve a suspender. Los liposomas acuosos después pueden ser separados en alícuotas, cada una colocada en un frasco, liof ¡fizada y sellada bajo vacío. En un alternativa, se pueden preparar liposomas de acuerdo con otros procedimientos conocidos de laboratorio: el método de Bangham y otros (1965), los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia; el método de Gregoriadis como se describe en DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadís ed. (1979) pág. 287-341), los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia; el método de Deamer y Uster, 1983, los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia; y el método de evaporación de fase inversa como se describe por Szoka y Papahadjopoulos, 1978. Los métodos anteriormente mencionados difieren en sus habilidades respectivas para atrapar material acuoso y sus relaciones de espacio a lípido acuosos respectivos. Los lípidos o liposomas liofilizados preparados como se describió anteriormente, pueden ser deshidratados y reconstituidos en una solución de péptido inhibidor y diluidos a una concentración apropiada con un solvente adecuado, por ejemplo, DPBS. La mezcla después se agita vigorosamente en un mezclador de remolino. El ácido nucleico que no está encapsulado es removido a través de centrifugación a 29,000 x g y las pellas liposómicas se lavaron. Los liposomas lavados se volvieron a suspender a una concentración ia^.M>4tt? total apropiada de fosfolípido, por ejemplo, aproximadamente 50-200 mM. La cantidad de ácido nucleico encapsulado puede ser determinada de acuerdo con métodos estándares. Después de la determinación de la cantidad de ácido nucleico encapsulado en la preparación líposómica, los liposomas pueden ser diluidos a concentraciones apropiadas y almacenados a 4°C hasta usarse. Una composición farmacéutica comprendiendo los liposomas usualmente incluirán un vehículo diluyente farmacéuticamente aceptable, estéril, tal como agua o solución salina.

Administración de Terapia de Gen Un experto en la técnica reconoce que el vector de expresión de la presente ¡nvención puede ser utilizado para terapia de gen. Para terapia de gen, un experto en la técnica podría estar conciente que el vector que será utilizado debe contener el gen de interés operativamente enlazado a un promotor. Para terapia de gen antisentido, la secuencia antisentido del gen de interés puede ser operativamente enlazada a un promotor. Un experto en la técnica reconoce que en ciertos casos, otras secuencias tales como las secuencias reguladores UTR 3' son útiles para expresar el gen de interés. Cuando es apropiado, los vectores de terapia de gen pueden ser formulados a preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas en las formas conocidas en la técnica para su ruta de administración respectiva. Se pueden utilizar medios conocidos en la técnica para evitar la liberación y absorción de la composición hasta que alcanza el órgano objetivo o para asegurar una liberación controlada en tiempo de la composición. Se debe emplear una forma farmacéuticamente aceptable, la cual no sea inútil a las composiciones de la presente ¡nvención. En formas de dosis farmacéuticas, las composiciones pueden ser usadas solas o en asociación apropiada, así como en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos. Una cantidad suficiente de vector conteniendo la secuencia de ácido nucleico terapéutica debe ser administrada para proporcionar una dosis farmacológicamente efectiva del producto de gen. Un experto en la técnica reconoce que se pueden utilizar diferentes métodos de suministro para administrar un vector a una célula. Los ejemplos incluyen: (1) métodos que utilizan medios físicos, tales como electroporación (electricidad), una pistola de gen (fuerza física), o aplicar grandes volúmenes de un líquido (presión); y (2) métodos en donde dicho vector es formado en complejo con otra entidad, tal como un liposoma, proteína agregada o molécula de transporte. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para transferir un gen terapéutico o un huésped, el cual comprende administrar el vector de la presente invención, preferiblemente como parte de una composición, utilizando cualquiera de las rutas de administración antes mencionadas o rutas alternativas conocidas por aquellos expertos en la técnica y apropiadas para una aplicación particular. La transferencia efectiva del gen de un vector a una célula huésped de acuerdo con la presente invención a una célula huésped puede ser verificada en términos de un efecto terapéutico (por ejemplo, mitigación de algún síntoma asociado con la enfermedad particular que se está tratando) o, además, a través de la evidencia del gen transferido o expresión del gen dentro del huésped (por ejemplo, utilizando la reacción de cadena de polimerasa con secuenciación, hibridaciones Northern o Southern, o ensayos de transcripción para detectar el ácido nucleico en células huésped, o utilizando análisis de inmunotinción, detección mediada por anticuerpo, estudios de vida media de ARNm de proteína, o ensayos particulares para detectar una proteína o polipéptido codificado por el ácido nucleico transferido, o que tienen impacto en el nivel o función debido a dicha transferencia). Estos métodos descritos aquí por ningún medio son todos inclusivos, y otros métodos para adecuar la presente solicitud serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Además, la cantidad efectiva de las composiciones puede ser además aproximada a través de analogía a compuesto que se sabe que ejercen el efecto deseado. Además, las dosis actuales y el programa pueden variar dependiendo de que si las composiciones son administradas en combinación con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de diferencias entre individuos en farmacocinética, disposición de fármaco y metabolismo. Similarmente, las cantidades pueden variar i .,?.¿.£A..l..iá.*¿~±~t--?ff*'-r ...... * a-4-4~.4ai,-..4.,,|1|ji41||j||a»„, «i~A..?. ...,4,.. ...... en aplicaciones in vitro dependiendo de la línea de célula particular utilizada (por ejemplo, con base en el número de receptores de vector presente sobre la superficie de célula, o la habilidad del vector particular empleado para la transferencia de gen para replicarse en esa línea de célula). Además, la cantidad de vector que será agregado por célula probablemente variará con la longitud y estabilidad del gen terapéutico insertado en el vector, así como también por la naturaleza de la secuencia, y es particularmente un parámetro que necesita ser determinado en forma empírica, y puede ser alterado debido a factores no inherentes a los métodos de la presente invención (por ejemplo, el costo asociado con síntesis). Un experto en la técnica fácilmente puede hacer cualquier ajuste necesario de acuerdo con las exigencias de la situación particular. Es posible que las células que contienen el gen terapéutico también contengan un gen suicida (es decir, un gen que codifica un producto que puede ser usado para destruir la célula, tal como cinasa de timídina de virus de herpes simple). En muchas situaciones de terapia de gen, es deseable poder expresar un gen para propósitos terapéuticos en una célula huésped, pero también tener la capacidad de destruir la célula huésped una vez que la terapia queda completa, se vuelve incontrolable o no conduce a un resultado de pronóstico o deseable. De esta manera, la expresión del gen terapéutico en una célula huésped puede ser dirigida a través de un promotor, aunque el producto de dicho gen suicida permanezca inocuo en ausencia de un fármaco. Una vez que la terapia se L.?.IA. ,14-i. '.¿i-;, i-.,? ?,í,:.Si¡, completa o ya no se desea o es necesaria, la administración de un producto hace que el producto de gen suicida sea letal a la célula. Ejemplos de combinaciones de gen suicida/profármaco pueden ser utilizadas son virus simple de herpes-cinasa de timidina (HSV-tk) y 5 ganciclovir, aciclovir o FIAU; oxidoreductasa y cicioheximida; diaminasa de citocina y 5-fluorocitocina; cinasa de timidilato de cinasa de timidina (Tdk::Tmk) y AZT; y cinasa de desoxicitídina y arabínosida de citocína. Los siguientes ejemplos ofrecen a manera de ejemplo, y no 10 pretender limitar el alcance de la invención en ninguna manera.

EJEMPLO 1 Construcción y Expresión del Antígeno HBe en un Vector Retroviral 15 Aunque las proteínas HBcAg y HBeAg son codificadas por el gen pre-CC HBV, la proteína HBeAg de secreción es iniciada en un codón de inicio, 29 residuos corriente abajo del codón de inicio para HBeAg. El gen HBeAg obtenido de Colección de Cultivo de Tipo 20 Americano, American Type Culture Collection (Rockville, MD), fue reparado para corregir dos mutaciones. Se encontró que las dos mutaciones ocurren a partir de una sola eliminación de pares de base que ocasionó un desplazamiento de marco en el codón 74, dando como resultado dos codones de detención consecutivos en 84 25 y 85. Estas mutaciones fueron corregidas insertando la base MMBHHMMÍLllllÍlHIÍÍlÍ-ftfÉÍtll IrMÉlttl i ^*~-- ... ,_... » 4.. ^.....e...**.*,.^. ll]flj^l?r^...^..!á^.^A^....?,l.i..í. eliminada utilizando mutagénesis de PCR. La secuencia C'-termina, rica en arginina, de HBeAg (aa 150-185) la cual se disocia durante la infección viral fue eliminada. El gen HBeAg truncado después fue fusionado en marco con un fragmento de Fc de IgG. El gen de fusión del retrogén HBe (retrogén HBe) fue clonado al vector retroviral (LNC-NGFR), o al vector de expresión pRc/CMV. Los vectores que comprenden un HBcAg (citosólico) y HBeAg (secreción) fueron construidos utilizando tecnología disponible en el campo y se describen en, por ejemplo, Sambrook y otros (1989) y en Ausubel y otros (1997). El gen del fragmento Fc de IgG se fusionó con una secuencia líder de señal de IgG y se clonó a los vectores de expresión como se muestra en la Figura 2A. De esta manera, una serie de vectores retrovirales de control conteniendo el gen HBeAg (de secreción), el gen del fragmento Fc con una secuencia líder de señal (de secreción), o el gen HBeAg (citosólico) fueron construidos como se representa en la Figura 2A. Para determinar la expresión y secreción de, la proteína de fusión HBe-Fc se transfectaron células COS con varios vectores de expresión y 48 horas después las células fueron radiomarcadas. Como se muestra en la Figura 3, una banda de proteína correspondiendo a la proteína de fusión HBeAg-Fc, fue detectada tanto en los lisatos de célula como en el medio de cultivo, ya sea cuando se precipitó con un anticuerpo IgG antihumano o un anticuerpo anti-HBeAg (Sigma Chemical Co. San Louis, MO). La tinción inmunofluorescente de células transfectadas también 94 exhibió un patrón típico de proteína de secreción. Las proteínas de HBcAg solamente fueron observadas en los lisatos de célula obtenidos de las células transfectadas y las proteínas HBeAg y del fragmento Fc fueron observadas tanto en el medio de cultivo como en los lisatos de célula. Estos resultados indican que las proteínas de HBeAg-Fc (retrogén de HBe) son eficientemente producidas y secretadas a partir de células.

EJEMPLO 2 10 Transducción y Expresión del Retrogén HBe en células Dendríticas (DCs) Para determinar la estrategia del "retrogén" en células dendríticas, los vectores retrovirales conteniendo el retrogén HBe o 15 varios genes de control incluyendo un marcador NGFR (Figura 2A), fueron producidos a partir de células de empaque PA317 utilizando la transfección pasajera. Se obtuvieron células de médula espinal de Murino a partir de ratones C57BL/B6. Las células fueron estimuladas en un medio de cultivo suplementado con el factor de célula del 20 vastago de Murino (SCF) e IL-6, y fueron transducidas con los vectores retrovirales como se describe infra y otros.

Transducción de Células Dendríticas Se cultivaron células de empaque PA317 obtenidas de la 25 Colección de Cultivo de Tipo Americano, American Type Cultura -Iffl^-^^& *^^.^* *Ú*ái,& -JL *'¿¡ Collection (Rockville, MD) a una confluencia de aproximadamente 40% en cajas de cultivo de 100 mm con un Medio Tagle Modificado con Dulbecco (DMEM) conteniendo 10% de suero de bovino fetal (FBS). Las células fueron transfectadas con un filtro de 10-15 µm. La médula espinal de Murino se quitó de los huesos de fas extremidades de los ratones, se hizo pasar a través de una malla de nylon y se le quitaron los glóbulos rojos con cloruro de amonio. Después de un lavado extenso con RPMI-1640 las células fueron incubadas con complemento de conejo y un grupo del cóctel de anticuerpos monoclonales, anti-CD4+ anti-CD8 + , células anti-B y células positivas de clase anti-MHC en RPMI-1640 a 37°C durante 40-60 minutos. Después de un lavado extenso con RPMI-1640, se suspendieron 5 x 105 células/ml en RMPI-1640 suplementado con 6% de FBS, 80 ng de mSCF/ml y 20 U rm de IL-6/ml. Las células se colocaron en placas de cultivo de 12 cavidades (3m/cavidad), se incubaron a 37°C y 5% de CO2 durante la noche y después se remplazaron con el medio fresco comprendiendo los medios ingredientes. Después de una incubación de 48 horas, la células fueron recogidas a través de centrifugación, se volvieron a suspender en 1.5 ml de los sobrenadantes de retrovirus, y se colocaron sobre placas de cultivo de 24 cavidades, las cuales se cubrieron con Retronectin a una concentración de 10 mg/ml. Las células fueron centrifugadas a 2,500 rpm a 37CC durante 90-120 minutos, y después se incubaron a 37°C y 5% de CO2 durante 3-4 horas adicionales para la transducción retroviral. Los sobrenadantes l * A...*?*. _...Atfaí?m? ..........^...AlLAtAL de retrovirus después se colocaron con 2.5 ml de RPMI-1640 suplementado con 5% de FBS, 10 ng de mSCF/ml, 60 ng de mGM-CSF/ml y 100 U mlL-4/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante la noche. El procedimiento de transducción después se repitió 2-3 veces. Después de la transducción las células fueron lavadas y cultivadas en Opti-MEM (GIBCO, Grand Island, NY) conteniendo mGM-CSF y mlL-4 durante varios días con el fin de madurar más las células dendríticas antes de la cosecha (Banchereau y otros, 1998; Inaba y otros, 1992).

Evaluación de Transducción (Medición de Expresión} Después de varios días en cultivo, las células exhibieron una morfología típica de célula dendrítica y altos niveles del complejo MHC, adhesión y se expresaron moléculas de co-estimulación (CD11, CD54, CDE80 y CD86) en las células dendríticas derivadas de médula espinal (figuras 4A-4C y 5A-5E). Aproximadamente de 20 a 30% de las células en el cultivo fueron transducidas, según determinado a través de tinción anti-NGFR. La transcripción del gen del retrogén HBe en las células dendríticas se demostró en un ensayo de RT-PCR. El ensayo de RT-PCR se realizó como sigue: Se extrajo ARN celular a partir de las células dendríticas utilizando Trizoal (Gibco-BRL Grand Island, NY) y se trató con ADNSE libre de ARNSE a 37°C durante 30 minutos. Después de la transcripción inversa, los ADNcs fueron utilizados como plantillas para una reacción de PCR utilizando 4.4 ^ja^nj un par de iniciadores que corresponden al gen HBeAg. Los productos de PCR fueron analizados a través de electroforesis mediante agarosa. En conjunto, estos resultados indican que el gen de fusión del retrogén HBe fue eficientemente transducido a células de médula ósea y fue expresado en células dendríticas derivadas de célula ósea. En forma interesante, la expresión de superficie de MHC-ll y la coestimulación de moléculas en células dendríticas comprendiendo el retrogén HBe transducido fueron significativamente más altas que la expresión de las moléculas en células dendríticas transducidas con HBeAg o HBcAg. Esta observación sugiere que la unión del Fc al receptor activó las células dendríticas.

EJEMPLO 3 Asociación In Vitro de Células T CD4+ Naturales Para evaluar si las células dendríticas transducidas son capaces de iniciar células T CD4+ naturales en un cultivo de célula, las células T CD4+ naturales aisladas de las células del bazo de ratones C57BL/B6 fueron co-cultivadas con células dendríticas de Murino transducidas con los vectores retrovirales del ejemplo 1 a una relación de 1:20 (células dendríticasxélulas T). Las células T cd4 + fueron aisladas de la suspensión de bazos de ratón utilizando una columna rica en células T CD4+ (R&D System, Minneapolis, MN). Las células T CD8+ fueron aisladas de la suspensión de bazos de ratón, utilizando una columna rica en células T CD8+ (R&D System, Mínneapolis, MN). Las células T CD4+ o CD8+ purificadas fueron cultivadas en RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS a 37°C y 5% de CO2. Cuando las células T CD4+ naturales fueron co-cultivadas con las células dendríticas transducidas ya sea con HBcAg o HBeAg o el gen del fragmento Fc, solamente se detectaron niveles bajos o anteriores del factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) e interferón (IFN)-?, a través de ELISA en el medio de cultivo. Además, no se observó ninguna proliferación aparente de células T cuando se verificaron los números de célula o la velocidad de incorporación de 3H-timidina. En contraste, cuando las células T CD4+ naturales fueron co-cultivadas con la células dendríticas transducidas con el retrogén HBe durante 5 días, las células T activamente se proliferaron y se detectaron altos niveles de GM-CSF y IFN-? en el medio de cultivo (Figuras 6A y 6B). Estos resultado sugieren que el HBeAg de secreción o el HBcAg citosólico no pueden ser procesados y presentados eficientemente a MHC-ll por células dendríticas. En contraste, los retrogenes HBe de secreción pueden ser eficientemente procesados siguiendo la internalización mediada por el receptor Fc y presentación a MHC-ll en células dendríticas, conduciendo la activación in vitro de células T CD4+ naturales. No se detectó ninguna activación de célula T CD8+ natural, aparente en el co-cultivo con las células dendrítícas transducidas. La .t,ltJ^M.J - 4 -..ri^. rmM ^ nf - Tmr ir fttl IftÉ .4.-44».. ....4..4 .1 falla para detectar la activación de célula T CD8+ natural en el cultivo de célula puede deberse al hecho de que existe solamente un epítopo conocido restringido de MHC-I en H BeAg , y que se requieren células T CD4+ para una activación eficiente de células T CD8 + (Ridge y otros , 1 998). Para demostrar adicionalmente la presentación de antígeno restringida por MCH-I I utilizando la estrategia de retrogén , se utilizaron ratones C57BL/6 de ataque con MHC-l l (KO) , en donde se abolió la presentación del antígeno MHC-l l a través de las células dendríticas, (Charles River, NY). Las células dendríticas derivadas de ratones de tipo silvestre (WT) o de KO de MHC-tl¡ fueron transducidas con el retrogén HBe y d espués eo-cultivadas eón células T CD4+ obtenidas de ratones de tipo silvestre a una relación de 1 : 20. Como se muestra en las figuras 7A y 7 B , solamente se detectaron bajos niveles de G M-CS F y I F N-? y el med io del co-cultivo conteniendo las células dendríticas de KO transducidas y no se observó ninguna proliferación aparente de célula T. En contraste cuando las células T CD4+ fueron co-cultivadas con las células dendríticas de tipo silvestre durante 5 d ías, las células T 0 activamente proliferaron y se detectaron altos niveles de G M-CSF y I F N-? en el medio de cultivo (Figuras 7A y 7B). 25 EJEMPLO 4 Inducción In Vivo de Célula T Auxiliar y Citotóxica y Respuesta I nmune de Célula B Se evaluó el potencial de estrategia de presentación del antígeno de retrogén in vivo. Los ratones (C57BL/6) fueron divididos en 4 grupos (de 4 a 6 ratones/grupo) y a cada ratón se le administró aproximadamente medio millón de células dendríticas que fueron transdueidas con HBcAg, HBeAg, Fc o el retrogén HBe en 0.2 ml de PBS conteniendo 50,000 U IL-2 (Chiron Corp. Emmeryville, CA) a través de inyección peritoneal, CA) a diferentes tiempos después de la administración final, los ratones fueron sacrificados y se tomaron muestras de sangre periférica, los bazos y otros órganos. Las células T fueron aisladas para análisis utilizando columnas ricas en célula 1 CD4+ o CD8+ (R&D System, Minneapolis, MN). Tres meses después de la primera inyección los ratones fueron sacrificados y se tomaron muestras de sangre periférica, los bazos y otras muestras de tejido; a partir de un examen groso, los nodos linfáticos en la cavidad peritoneal fueron significativamente agrandados en los ratones que tomaron las células dendrítícas transducidas con el retrogén HBe, mientras que en ratones normales y ratones administrados con otras construcciones, los nodos linfáticos demasiado pequeños para ser vistos. El examen histológico también reveló una proliferación activa de células T y células B en los nodos linfáticos peritoneales de ratones que tomaron las células dendríticas de retrogén HBe.

EJEMPLO 5 Inducción de Células T Auxiliares TH1 y TH2 Se utilizaron ratones inmunizados como se hizo en el ejemplo 4 para determinar la inducción de células T auxiliares, TH1 y TH2. Los expertos en la técnica están concientes de la importancia de determinar la inducción de células TH 1 y TH2. Es bien sabido que las 10 células T CD4+ realizan las siguientes funciones: 1 ) ayudan a las células B a desarrollarse en células de plasma de producción de a nticuerpo; 2) ayudan a las células T CD8+ a convertirse en células T citotóxicas activadas; y 3) efectúan hipersensibilidad retrasada. Estas funciones son realizadas a través de dos subpoblaciones de 15 células CD4 + . Las células TH1 median la hipersensíbilidad retrasada y producen principalmente I L-2 y ?-interfefón (I FN-?), mientras que las células TH2 realizan la función auxiliar de célula B y principalmente producen IL-4 e IL-5. Se aislaron células T CD4+ de los bazos de los ratones 20 inmunizados utilizando una columna anti-CD4 (R&D System, Minneapolis, MN) y estas células fueron co-cultivadas con células dendríticas de ratones que fueron pulsadas con una proteína recombinante de HBeAg . Solo después de 2 d ías en el co-cultivo de las células teniendo una relación de células T:células dendríticas de 25 1 000: 1 , las células T CD4+ de los ratones a quienes se les liií?. ,f. g ^^d^ |i |^ ^ administró células dendríticas y retrogén de HBe activamente se proliferaron. Se detectaron altos niveles de GM-CSF y IFN-? (estimulación de macrófagos y células T CD8 + ) así como IL-4 e IL-5 (estimulada por células B), en el medio de co-cultivo. Los anticuerpos anti-CD4 pero no los anticuerpos anti-CD8 dramáticamente bloquearon la producción de citocina en estas células T co-cultivadas. En contraste, cuando las células T CD4 + obtenidas de ratones inmunizados con HBeAg-, HBcAg- o Fc-DCs( fueron co-cultivadas con HBeAg-DCs, solamente se detectaron bajos niveles de GM-CSF y IFN-?, IL-4 e IL-5, en el medio de co-cultivo, y no observó ninguna proliferación de célula T activa. Ya que IL-4 e IL-5 principalmente son producidas por TH2 y GM-CSF y IFN-? por células TH1 , los resultados demuestran que las células dendrítícas transducidas con el retrogén HBe efectivamente activan células T tanto TH como TH2.

EJEMPLO 6 Indu cción de Altas Titu laciones de Anticuerpos Anti-HBeAg Los ratones fueron inmunizados como se hizo en el ejemplo 4 para determinar el nivel de anticuerpo. La i nmunización de ratones con células dendríticas transducidas con el retrogén HBe indujeron en ratones respuestas de anticuerpo anti-HBe/cAg de larga du ración , de alta titu lación . Como se muestra en la F ig u ra 8, se detectaron titulaciones sig n ificativamente más altas de anticuerpos anti-HBeAg en los sueros de los ratones a quienes se les administró las células dendríticas transducidas con el retrogén HBe que en los ratones a quienes se les administraron células dendríticas transducidas con HBeAg. Los niveles de los anticuerpos anti-HBeAg en los sueros de ratones inmunizados fueron analizados utilizando un ensayo de ELI SA. En resumen, se incubaron placas de microtitulación cubiertas con proteínas recombinantes HBcAg (50 ng/cavídad) con sueros diluidos en serie en un regulador de pH de bloque a 4°C durante 2 horas. Se eliminó el anticuerpo unido después de la incubación con anticuerpos conjugados con peroxidasa al IgG de ratón diluido en regulador de pH de bloqueo. Un anticuerpo anti-HBeAg policlonaf obtenido de Chiron Corp. (Emmergyville, CA) se utilizó como un control positivo y los sueros normales de ratón se utilizaron como un) control negativo. La titulación del anticuerpo se definió como la dilución más alta teniendo un valor de OD450 el cual fue dos veces mayor que el nivel negativo. El incremento de la producción del anticuerpo observado puede deberse a la activación más fuerte de células T auxiliares CD4 + . Los niveles significativamente más bajos de anticuerpos anti-HBe/cAg en los sueros de los ratones inmunizados con células dendríticas transd ucidas con H BcAg puede deberse a la localización citosólica de HBcAg y a la falta de activación de células T CD4 + . De esta manera, el retrogén HBe es significativamente superior a las otras construcciones de H BeAg y HBcAg para la inducción de una respuesta de anticuerpo en mamífero inmunizado con lo mismo. En ^ l* i1M l " ' ' íi pnt mi??iiáíi m conjunto, los resultados del estudio de modelo de ratón demuestran que las células dendrítícas transducidas con el retrogén HBe indujeron una vigorosa activación de célula T CD4+ y CD8 + , así como activación de célula B.

EJEMPLO 7 Construcción de Vector de un Antígeno de Tumor Intracelular MAGE-3 es una proteína citosólica y nuclear carente de una secuencia objetivo para la trayectoria de presentación de MHC-H endógeno, que hace difícil o improbable su presentación en MHC-fl. Ya que no existe ningún homólogo de ratón, un gen MAGE-3 humano fue enlazado a una secuencia líder de señal derivada de un gem RANTES de quimícina humano para permitir la secreción de MAGE-3. U n plásmido q ue codifica el gen MAGE-3 de longitud completa fue utilizado como una plantilla para amplificar el ADN del MAGE-3 con un par de in iciadores: 5' iniciador (A): (SEC. ID. No: 1 ) 5'- ACGCGTCGACATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAG-3', que corresponde a la secuencia de polinucléotido 1 a 24 del gen MAGE-3 con un sitio de restricción adicional Sal I , y el 3'-iniciador (B): (SEC I D. No. 2) 5'-CCGCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCTCAAAAC-3\ que corresponde a la secuencia de polinucléotido 921 a 945 del MAGE-3 con un sitio Xho I . La adición de la secuencia líder de señal derivada del gen RANTES humano fue generada a través de amplificación de PCR con un par de iniciadores: 5'-iníciador (C): (SEC. ID. No: 3) 5'- ,tA*A*,iritM trr ?t?ito <r *«• • 105 ^ ACGCGTCGACATGAAGGTCTCCGCGGCAGCCCTCGCTGTCATCCTCA TTGCTACTGCCCTCTGCGCTCCTGCATCTGCCATGCCTCTTCAGCAGA GGAGTCAG-3', que corresponde a la secuencia líder se señal de RANTES y a la secuencia de polinucléotido I a 24 del gen MAGE-3 5 con un sitio Sal I, y el 3' iniciador-B. El fragmento de señal MAGE-3 (s-MAGE-3) sin el codón de detención fue generado a través de PCR con el 5'-iníciador-C y 3-iniciador (D): (SEC. ID. No: 4) 5'- ATAAGAATGCGGCCGCTCTCTTCCCCCTCTCTCAAAA-3", que corresponde a la secuencia de polinucléotido 921 a 942 del MAGE-3 10 con un sitio Not I. Las células dendríticas, las células APCs más potentes, expresan receptores de IgG Fc (FCYRS), que medían una ruta de internalización de antígeno privilegiada para MHC-H suficiente así como para el antígeno restringido en MHC-I. Por lo tanto, un ADNc de fragmento Fc derivado de un lgG1 humano ue 15 puede unirse eficientemente a receptores de Fc sobre células dendríticas de Murino se fusionó en marco con el gen MAGE-3 modificado para mediar la internalización de MAGE-3 a través de células dendríticas (Figura 9A). El gen de fusión de MAGE-3 de secreción (s-MAGE-3-Fc) después se clonó a un vector retroviral de 20 Murino pFB-Neo (Stratagene) (Figura 9A). El fragmento de Fc de ADNc de IgG humano se generó a través de amplificación de PCR con el plásmido pEE6/CLL-1 conteniendo el ADNc de cadena pesada de IgGla humano, como una plantilla. El par de iniciadores para la reacción de PCR son: 5'-iniciador (E), (SEC. ID. No. 5) 5'~ 25 ATAAGCGGCCGCTAAAACTCACACATGCCCA-3', que corresponde a ? f 106 la secuencia de polinucléotido 785 a 802 de la cadena pesada con un sitio Not I adicional, y 3'-¡niciador (F), (SEC. ID. No. 6) 5'- CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3', que corresponde a la secuencia de polinucléotido 1447 a 1468 de la cadena pesada 5 con un sitio Xho I . Un vector retroviral de Murino, pFB-Neo (Stratagene), se utilizó para este estudio. El vector retroviral, s- MAGE-3-Fc fue construido a través de una ligación de tres piezas del fragmento s-MAGE-3 sin el codón de detención, Fc, y Sal l/Xho l-cut pFB-Neo. El vector retroviral s-MAGE-3 o MAGE-3 se construyó 10 insertando el gen s-MAGE-3 o MAGE-3 al Sal l/Xho l-cut- pFB-Neo, respectivamente . Para construir el vector de expresión de fgG F© el fragmento de ADNc de Fc de IgG humano se enlazó con una secuencia líder de señal de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) a través de dos reacciones de PCR. En la primera reacción de PCR, 15 se utilizó el ADNc de IgG Fc como una plantilla para la amplificación- con un par de iniciadores: 5'-iniciador, (SEC. I D. No. 7) 5'GCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCAAAACTCACACATTGCCCACCG TGCCCAGCAC-3', que corresponde a la secuencia de polinucléotido 785 a 81 5 de la cadena pesada y una secuencia líder de VH parcial, 20 y 3'-¡niciador F, (SEC. ID. No. 6). La segunda PCR utilizando el producto de la primera PCR como una plantilla se realizó con un par de iniciadores: 5'-iniciador, (SEC. ID. No. 8) 5'- ACGC.GTCGACATGGGAACATCTGHTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCA GCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3', que corresponde a la secuencia de 25 polinucléotido N-terminal de la secuencia líder de señal de VH- A??JjL»?AA*m ?Aáaá áA?Mim «' w r f 107 secreción con un sitio adicional de Sal I, y 3'-¡niciador F (SEC. ID. No. 6). El ADNc de Fc con una secuencia líder de señal después se clonó al vector retroviral. El vector de expresión pcDNA3.1 -MAGE-3 se construyó insertando el MAGE-3 al Xhol/Xbal-cut pcDNA3.1 (Invitrogen). Varios vectores retrovirales de control expresando un fragmento de MAGE-3, de s-MAGE-3 de secreción, o de Fc de secreción intracelular, nativo, también fueron construidos (Figura 9A). Cada vector resultante se identificó a través de análisis de enzima de restricción y se confirmó mediante secuenciación de ADN. 10 EJEMPLO 8 Producción de Retrovirus y Transducción de Células Dendríticas Derivadas de Médula Ósea 15 Se produjeron vectores retrovirales a través de transfecelór* pasajera. Se cultivaron células de empaque (PA317) en placas de cultivo de 100 mm con DMEM conteniendo 10% de FBS inactivado con calor (Gibco-BRL) y transfectadas con 10-15 µg de plásmidos de vector retroviral (del ejemplo 7, es decir, MAGE-3 intracelular, s- 20 MAGE-3 de secreción o fragmento de Fc de secreción) que se prepararon utilizando equipos de QIAGEN libres de endotoxína a través de Lipofectina (Gibco-BRL). Después de incubar durante la noche, el medio se remplazó con DMEM conteniendo 5% de FBS. Después de 48 horas, el medio de cultivo conteniendo los retrovirus 25 recombinantes se cosechó y se filtró (0.22 µm) como se describió f» « * 1 08 previamente (Chen y otros, 1997). Para generar células dendríticas, de separaron células de médula ósea de los huesos de las extremidades de ratón, se hicieron pasar a través de una malla de nylon, y se les quitaron los glóbulos rojos con cloruro de amonio. 5 Después de un lavado extenso con RPMI-1640 las células se incubaron con complementos de conejo (Calbiochem) y un cóctel de anticuerpos monoclonales consistiendo de anti-CD4, anti-CD8, anti- CD45R/B220., y anti-MCH-l l (PharMingen y BioSource International) en RPM I- 1640 a 37°C durante 40-60 minutos. Después un lavado 10 extenso con RPMI- 1640, las células (5 x 105 células/ml) en RPMf- 1640 suplementado con 6% de FBS, 80 ng de mSCF/ml ((R&D Systems), y 20 unidades de (U) mlL-6/ml (BioSource International) se colocaron en placas en una placa de cultivo de 12 cavidades 2.$ ml/cavidad), se incubaron a 37°C, 5% de CO2 durante la noche, y 15 después se volvieron a alimentar con medio fresco. Después de una incubación de 48 horas, las células se separaron, se volvieron a suspender en 1 .5 ml de los sobrenadantes de retrovirus, se colocaron sobre placas de cultivo de 24 cavidades cubiertas con Retronectin (Pa nVera) a una concentración de 10-20 ng/ml, y se 20 incubaron a 37°C, 5% de CO2 durante 3-4 horas. Los sobrenadantes después se colocaron con 1 .5 ml de RPMI- 1640 suplementado con 5% de FBS, 10 ng de factor de célula de vastago de Murino (mSCF)/ml, 60 ng de mGM. CSF/ml (BioSource International) y 100 U de mlL_4/ml (R&D Systems) durante la noche. El procedimiento de 25 transd ucción se repitió 2-3 veces y aproxi madamente 30% de las ÍJJ^^J?J^^^» HMM Éi^M células BM usualmente fueron transducidas a través de este procedimiento. Después de la transducción final, las células se lavaron y se cultivaron en Opti-MEM (Gibco, BRL) conteniendo mGM- CSF y mlL_4 durante varios días para permitir una diferenciación 5 adicional de las células dendríticas. Las células dendríticas además estuvieron enriquecidas con un procedimiento de sedimentación de 50% de FCS-RPMI-1640, como se describió anteriormente (Inaba y otros, 1992). Después de varios días de cultivo, una fracción substancial de 0 las células mostró u na morfología distinta de células dendríticas . El gen s-MAGE-3-Fc, s-MAGE-3, MAGE-3 o Fc en las células dendríticas transducidas fue transcrito, como se demostró a través de ensayos de transcripción inversa (RT)-PCR. Se utiliza el a álisis de tinción Western cuantitativo para demostrar la expresión dé 5 proteína y la secreción a través de las construcciones en células dendríticas transducidas. En resumen, las células dendríticas transducidas fueron usadas con un regulador de pH (Boehringer Mannheim) ( 10 mM Tris 1 50 mM NaCI (pH 7.4), 1 % TX-1 00 (Sigma), 0.5 mM PMSF, y tabletas de cóctel de inhibidor de proteasa) sobre 0 hielo durante 10 minutos. Los lisatos de célula y los medios de cultivo después se precipitaron con anticuerpo policlonal de conejo contra MAGE-3, seguido por incubación con al proteína A-sefarosa (Sigma). Los precipitados después se volvieron a suspender en 20 µl de regulador de pH de carga. Las muestras de proteína (20 µl) de 5 cargaron sobre 10% de un gel de SDS-PAGE y se transfirieron a una -^ 1 10 membrana de Hybond PVDF (Amersham Pharmacial Biotech), el cual se bloqueó a través de incubación nocturna en PBS (pH 7.5) conteniendo 5% de leche seca sin grasas (Carnation) y 0.1 % (v/v) de Tween-20 (Fisher Scientific) a 4°C. Después de lavar con un 5 regulador de pH (PBS conteniendo 0.1 % (v/v) de Tween-20), la membrana se incubó con un anticuerpo monoclonal de ratón contra MAGE-3, diluido en un regulador de pH de PBS conteniendo 2.5 % de leche desgrasada y 0.1 % de Tween-20 (1 :400) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, la membrana después se 10 incubó con un IgG de antiratón marcado con peroxidasa de rábano (HRP) (Amersham Pharmacia Biotech) en el regulador de pH (1 : 10,000) a temperatura ambiente durante una hora. Después de un lavado final, la membrana se visualizó con equipo de detección quimioluminiscente ECL-Plus (Amersham Pharmacia Biotech) y se 15 expuso sobre una película Kodak. La intensidad de banda de proteína de la tinción Western sobre la película se determinó y se analizó a través de Phosphorlmager (Molecular Dynamics) con el software Image-Quant versión 1.2. Se encontró que las proteínas s- MAGE-3-Fc fueron eficientemente producidas y secretadas a partir 20 de células dendríticas, mientras q ue MAGE-3 fue retenido intracelularmente (figuras 9B y 9C). Se expresaron niveles comparables de las proteínas s-MAGE-3-Fc y s-MAGE-3 en tas células dendríticas transducidas. 25 EJEMPLO 9 Interacción de Fc en Células Dendríticas La interacción de Fc con FcvRs sobre células dendríticas activa la activación de células, ocasionando la sobre regulación de moléculas de superficie de células involucradas en la presentación de antígeno. Los marcadores de superficie fueron examinados para evaluar si la expresión de s-MAGE-3 en las células dendríticas transducidas puede inducir la activación de la célula dendrítica. Los marcadores de superficie de células dendríticas transducidos con s-MAGE-3-Fc, s-MAGE-3, o vector, fueron medidos a través de ensayos citométricos de flujo. En resumen, las células dendríticas fueron pre-i ncubadas con un anticuerpo anti-CD 16/CD32 (2.4G2, PahrMingen.) para bloq uear FcyRs a 4°C durante 30-60 minutos. Las células dendríticas después fueron incubadas con anticuerpos primarios a 4°C durante 30 minutos, seguidos por incubación con un conjugado de IgG-FITC de antiratón o anticonejo. Después de lavar extensivamente, las células dendríticas fueron analizadas a través del software FACScan (Becton Dickinson) con CelIQuest . Como se muestra en las figuras 9D, 9E y 9F, se expresaron niveles más altos de MHC clase I I , CD40 y CD86 en las células dendrítícas derivadas de células BM transducidas con s-MAGE-3-Fc y en células dendríticas en presencia de LPS que en células dendríticas transducidas con s-MAGE-3 o el vector de control. Estos resultados sugieren que la secreción y la subsecuente interacción de la proteína ^« A ~m*~—-rt tm»»ii ?i?¡ i_i-i ^^_^^^JJ^ * 1 12 de fusión Fc con FcyRs activa las células dendríticas.

EJEMPLO 10 Inducción de TH1 potente In Vivo 5 Para evaluar si la secreción y subsecuente internalizacíón de MAGE-3 puede mejor la inmunogenicidad de este antígeno in vivo, se transdujeron células dendríticas con s-MAGE-3-Fc, s-MAGE-3, MAGE-3 o Fc a través de vectores retrovirales, y después se 0 administraron i. v. , una vez a ratones C57BL/6 (0.5- 1 x 105 células dendríticas en 30 µl de PBS conteniendo 50,000 U IL2(chiron) por ratón. De 4 a 6 semanas después de la inmunización, los ratones fueron sacrificados y se tomaron muestra de sangre periférica de bazos y de otros tejidos. Los nodos linfático substancialmente fueron 15 agrandados en los ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs, reminiscentes de infección de patógeno , pero en los ratones a tos que se le administró células dendríticas transducidas con s-MAGE-3, MAGE-3, o Fc. Para determinar si la inmunización con células dendríticas 0 transducidas puede inducir respuestas de célula T auxiliar CD4 + , las células T CD4+ de esplenocitos de ratones in munizados fueron aisladas y después co-cultivadas con células dendríticas derivadas de médula ósea (VM) transducidas con s-MAGE-3-Fc. En resumen las células T CD4+ o CD8+ fueron aisladas de suspensiones de bazo con 5 columnas ricas en células T CD4+ o CD8+ (R&D Systems) y después '\%átá&,i . «,*.., . - ^^^^^.^a,^^ se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS durante 24 a 48 horas antes de análisis adicional. Los nodos linfáticos de drenaje de ratones inmunizados fueron digeridos con un cóctel de 0.1 % DNase (fracción IX, Sigma) y 1 mg/ml de colagenasa (Roche Molecular Biochemicals) a 37°C durante 40-60 minutos. Las células dendríticas fueron positivamente aisladas de las suspensiones de célula de nodos linfáticos o bazos con microperlas anti-CD1 1c (N418) (Milteny bistec Ine) para otro estudio. Durante 2 semanas de co-cultivo con diferentes relaciones de células T CD4+ contra células dendríticas, las células T CD4+ de ratones inmunizados con s-MAGE- 3-Fc, s-MAGE-3-DCs o Fc-DCs no proliferaron activamente, y solamente se detectaron bajos niveles de I L-2, I FN-?, TNF-a, y IL-4 en el medio de co-cultivo (figuras 10A, 10B, 10C y 10D). Las células T CD4+ de ratones inmunizadas fueron co-cultivadas con células dendríticas a un régimen de 1000: 1 (cél ula T:célula dendrítica, 2x105:2x102) para varios tiempos. Los sobrenadantes del los co- cultivos fueron cosechados y subsecuentemente analizados para concentraciones de citocina a través de ELISA (PharMingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PharMingen). En contraste, en los co-cultivos con células T CD4+ de ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs, se detectaron altos niveles de I L-2 y I FN-? en el medio de co-cultivo sólo después de 48 horas de co-cultivo a u na relación de 1 : 1000 (célula dendrítica: célula T). Los I anticuerpos anti-CD4, pero no los anticuerpos anti-CD8 , bloquearon la producción de citocina a través de las células co-cultivadas l AA^t-t ^ (Figura 11 A). Experimentos repetidos mostrando resultados similares. Para determinar el carácter específico de las respuestas de célula T, las células dendríticas de/ivadas de médula ósea transducídas con un vector retroviral expresando un antígeno de núcleo de virus de hepatitis B irrelevante (HBcAg) fueron co-cultivadas con células T CD4+ a partir de ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs. Solamente se detectaron niveles bajos de IFN-? y otras citosinas en el medio de co-cultivo (Figura 11B). Además, las células dendríticas de los nodos linfáticos de ratones con 6 semanas de edad después de inmunización, fueron aisladas con microperlas de anti-CD11c (Miltenyi Bistec, Inc.) y co-cultivadas con células T CD4+ a partir de los mismos ratones inmunizados. Como se muestra en las figuras 12A, 12B, 12C y 12D, solamente se detectaron alf©$ niveles de I L-2, IFN-? y TNF-a en los co-cultivos de las células de los ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs. Estos resultados indican que las células dendríticas transducidas con s-MAGE-3-Fe pueden alojarse en órganos o tejidos linfoides, y activar respuestas Th1 más eficientemente que lo hacen las células dendríticas transducidas con MAGE-3 o s-MAGE-3.

EJEMPLO 11 Inducción de CTLs in vivo Se realizó el método de JAM o "justo otro método" para determinar si la inmunización con s-MAGE-3-Fc-DCs puede inducir MU i. -H.iiiÉ.i ,, ,m i itiii» i.mtftMn ,ltií, ái¡Ma * á?i <a ¿^ i ^ ?l A^ fuertes respuestas de CTL. La prueba de JAM se utilizó para medir actividades citotóxicas. En resumen, los ratones fueron sacrificados a diferentes tiempos después de la inmunización y se cultivó una suspensión de célula individual de esplenocitos en RPMI-1640, 10% de FBS. Se estimuló un total de 4x106 esplenocitos con 8x104 células EL4-MAGE-3 singénicas y irradiadas con Y (10,000 radianes) o células EL4-HBcAg/2ml en placas de 24 cavidades (Costar) durante 4-6 días en 5% de CO2 a 37°C, se combinaron y se volvieron a suspender a 1x107 células/ml. Para marcar las células objetivo, se agregó 3H-timídina a 5x105/ml de células EL4-MAGE-3 o EL4-HBcAg a una concentración final de 2 µCi/ml. Después de 6 horas de incubación, las células se lavaron moderadamente una vez con PBS y se volvieron a suspender en el medio de cultivo (1x10s células/'rttf). Después, diferentes números de células efectoras fueron G€h cultivadas con un número constante de células objetivo (1 x104/cavidad) en placas de fondo redondo de 96 cavidades (200 µl/cavidad) durante 4 horas a 37°C, después de lo cual las células y sus medio se aspiraron después sobre filtros de fibra de vidrio (Fitter Mate Harvester, Packard) que después se lavaron extensivamente con agua. Después de que los filtros se secaron y se colocaron sobre placas de 96 cavidades, se agregaron a cada cavidad 25 µl MicroScint 20 (Packard). Las placas se contaron en un contador de cintilación y luminiscencia de microplaca TopCount NXT (Packard). En algunos experimentos, las poblaciones de células efectoras reestimuladas se incubaron con los anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8 (30 µl/cavidad, PharMingen) durante 30-60 minutos para agotar las células T CD4+ o CD8+ antes de ensayos de citotoxicidad . Se definió el porcentaje de aniquilación específica como: (ADN de célula objetivo retenido en ausencia de células (espontáneas-ADN de célula objetivo retenido en presencia de células T)/ADN espontáneo retenido x 100. El valor de la incorporación total de 3H-f?midina por lo general es similar a la retención espontánea . Los esplenocitos de ratones inmu nizados fueron reestimulados in vitro en RPMI-1640 10% de FBS con células singénicas EL4-MAGE-3 y después se co-cultivaron con células EL4-MAGE-3 marcadas con 3H-timidina a varias relaciones de efectora/objetívo para medir la aniquilación específica. Las células EL4-MAGE-3 fueron establecidas a través de transfección con el vector de expresión MAGE-3 pcDN¡A3.1 -MAGE-3 y la selección de Zeocina (Invitrogen), y mostraron expresar MAGH-2 a través de PCR y ensayos de inmunoprecipitación. Los esplenocitos de ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs aniquilaron células objetivo mucho más eficientemente que aquellos de ratones inmunizados con MAGE-3 o Fc (Figura 13). El carácter específico de aniquilación o asesinato se demostró además a través de la incapacidad de los esplenocitos de ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs para aniquilar células EL4-HBcAg que expresan el HBcAg irrelevante (Figura 13), y a través de la inhibición de la aniquilación con el anticuerpo anti-CD8, pero no el anticuerpo anti-CD4. De esta manera, estos resultados demuestran la habilidad superior de s-MAGE-3-Fc-DCs para inducir respuestas CTL, u ^^ debido a la TH1 mejorada y a la iniciación cruzada de la internalización de antígeno mediada por receptor.

EJEMPLO 12 Inducción del Anticuerpo Ya que los anticuerpos también juegan un papel importante en la inmunidad antitumoral, las titulaciones del anticuerpo anti-MAGE-3 en los sueros de ratones inmunizados (similar al ejemplo 10) fueran medidas a través de ELISA. Los anticuerpos de anti-MAGE-3 en tos sueros de ratones inmunizados fueron detectados a través de ELISA. En resumen, las placas de microtitulación (Dynatech) cubiertas con proteínas recombinantes de MAGE-3 (50 ng cada uno/cavidad) fueron) incubadas con sueros diluidos en serie en un regulador de pH d© bloqueo (KPL, Gaithersburg, MD) a temperatura ambiente durante 2 horas. Se detectó el anticuerpo unido después de la incubación con un anticuerpo conjugado con peroxidasa contra IgG de ratón (Sigma) diluido en un regulador de pH de bloqueo. Un anticuerpo monoclonal contra MAGE-3 fue utilizado como un control positivo y el suero de un ratón normal como un control negativo. La titulación de anticuerpos se definió como la dilución más alta con un ODA4so mayor que 0.2. El valor de ODA45o anterior de suero de ratón normal fue menor que 0.1. Los anticuerpos de anti-MAGE-3 fueron inducidos 2 semanas después de la inmunización de células dendríticas y alcanzó el pico en 4-6 semanas después de la inmunización.

Como se muestra en la Figura 14, se detectaron titulaciones significativamente más altas de anticuerpos anti-MAGE-3 en los sueros de ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DC que los ratones inmunizados con s-MAGE-3-DCs o MAGE-3DCs. El carácter específico de las respuestas de anticuerpos se demostró a través de la falta de anticuerpo contra el HBcAg irrelevante en los ratones inmunizados. En conjunto, los hallazgos indican que s-MAGE-3-Fc-DCs, son superiores a MAGE-3-DCs o s-MAGE-3-DCs para inducir CD4+Th, CD8 + CTL, así como respuestas de célula B.

EJEMPLO 13 Interacción Mejorada de Células T Auxiliares Las células TH CD4+ iniciadas que reconocen sus pépt?dog específicos en el contexto de MC-lt en células dendrít?cas enormemente incrementan su interacción con células dendríticas condicionadas. Esta interacción a través de CD40-CD40L puede activar la producción de células dendríticas de IL-12 y es crítico para generar células T auxiliares para respuesta CTL. Para probar si este aspecto puede mejorar la interacción de TH CD4+ con s-MAGE-3-Fc- DCs, se midió la producción de IL- 12 a través de células dendríticas transducidas en co-cultivo con células T CD4+ iniciadas. Las células T CD4+ iniciadas fueron aisladas de ratones inmunizados con s- MAGE-3-Fc-DCs y después co-cultivadas con células dendríticas derivadas de médula ósea, transducidas con s-MAGE-3-Fc, s-MAGE- 3, MAGE-3 y Fc. Como se muestra en la Figura 15, se observó un incremento significante en la producción de IL-12 en el co-cultivo de células T CD4+ con s-MAGE-3-Fc-DCs pero no en los co-cultivos con s-MAGE-3-DCs, o MAGE-3-DCs. La producción de IL-12 a través de s-MAGE-3-Fc-DCs se inhibió bloqueando con CD40L sobre tas células T CD4+ iniciadas. La expresión de Fc en células dendríticas también mejoró no específicamente la producción de IL- 12 a un grado menor. Estos resultados, junto con los resultados in vivo de los datos de los ejemplos, 10, 1 1 y 12, indican que la secreción y subsecuente internalización mediada por FCYRS de MAGE-3 conducen a la presentación cruzada de MAGE-3 en células dendríticas para la producción de TH1 y respuestas CTL.

EJEMPLO 14 Inmunidad Protectora Inducida por s-MAGE-3-Fe-DCs Para examinar si las respuestas inmunes anti-MAGE-3 mejoradas pueden conducir a una inmunidad antitumoral efectiva, se realizaron experimentos de ataque. La línea de célula EL4-MAGE-3 se derivó de la línea EL-4 de tumor parental que crece rápidamente en ratones singénicos y se utiliza para experimentos de ataque . Cuando se implantó intradérmícamente en ratones C57BL/6 singénicos, las células EL4-MAGE-3 (0.5 a 1 x106 células) mostró un crecimiento agresivo del tumor similar a aquel de la células EL-4 parental, produciendo tumores visibles en ratones solamente a 3-5 días después de la inoculación y dando como resultado la muerte del ratón usualmente en un mes después de la inoculación. Para probar la habilidad de s-MAGE-3-Fc-DCs para inhibir el crecimiento de tumor de EL4-MAGE-3, los ratones fueron inmunizados i. v. dos veces (intervalo de 7 días) con 1 x105 células dendríticas transducidas con s-MAGE-3-Fc, s-MAGE-3, MAGE-3 o Fc, seguido por ataque con células EL4-MAGE-3 (1 x106). Los ratones C57BL/6 fueron inmunizados a través de inyección, i. v. con 1 x105 células dendríticas transducidas en el día 0 y el día 7, y después ¡ntradérmicamente atacados con 1 x106 células de EL4-MAGE-3 o EL4-HBcAg exponencialmente en crecimiento, u na semana después de la) segunda inmunización. Se midieron los tamaños del tumor cada o# a tres días, con los volúmenes de tumor calculados comes sigila» (diámetro más grande) x (diámetro más corto)2. Como se muestra en la Figura 16A, el crecimiento de tumor fu© inhibido a u n grado mucho mayor en ratones inmunizados con s- MAGE-3-Fc-DCs, aunque la inmunización con s-MAGE-3-DCs, MATE- 3-DCs o aún con Fc-DCs (un estimulante inmune no específico) confirió algún grado de protección. La potencia de la actividad antitumoral mostrada por estas construcciones se correlacionó con s us habilidades para inducir reexpuestas inmunes, Consistentemente, los ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs sobrevivieron considerablemente más que los ratones inmunizados con otra células dendríticas transducidas con vector (Figura 16B). La actividad a ntitumoral inducida por s-MAGE-3-Fc-DCs fue específica, i A¿,iUb Ai*AA£ .4...-, tlttt| ^ gij| ..... ,.. ,, «»'"°^i||t|1-f ffiB||Mji|a ya que los ratones inmunizados con s-MAGE-3-Fc-DCs y atacados con células de tipo silvestre EL4 o EL4-HBcAg también desarrollaron tumores letales y murieron en un mes. Las S-MAGE-3-Fc-DCs también parcialmente inhibieron el crecimiento de tumores de EL4- 5 MAGE-3 establecido en ratones, aunque el sistema inmune puede no tener un tiempo suficiente de respuesta para controlar efectiva y rápidamente el crecimiento de tumor letal en este modelo.

EJEMPLO 15 10 Construcción de un Antígeno HBe en un Vector de Expresión de Mamífero Un plásmido que codifica el genoma HBV de longitud completa (subtipo adw) se obtuvo de la Colección de Cultivo de Tipo 15 Americano , American Type Cultura Collection (ATCC). Se encontró que el gen de prenúcleo/núcleo de HBV contiene una sola eliminación de pares de base, lo cual ocasiona un desplazamiento de marco en el codón 79, dando como resultado dos de codones de detención consecutivos en 84 y 85. Este gen se reparó insertando la 20 base eliminada utilizando mutagénesis de PCR y se confirmó a través de clasificación de ADN . El gen HBeAg de longitud completa fue generado a través de amplificación de PCR del genoma de HBV reparado con un par de iniciadores (5'-iniciador (P-A): (SEC. ID . No. 9) 5'-TTAAGCTTATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATC-3', que 25 corresponde a la secuencia de polinucléotido 1904 a 2020 del lA tk,A ?lí,¡»?*A , 1*A. - . + mlLXAjAS?**~*Slt .ai?.JL.»AA. *. .-aaaate» ?A*.A genoma HBV con un sitio de restricción Hind II I , y el 3'- iniciador (P- B): (SEC. ID. No. 10) 5'- TTTCTAGAATCGATTAACATTGAGATTCCCGAGA-S1, que corresponde a la secuencia de polinucléotido 2437 a 2457 del genoma HBV con los sitios adicionales de Xba I y Cía I). El gen HBeAg truncado con la eliminación de la secuencia C'-termina rica en arginina de HBeAg (aa 1 50-185) es decir, disociado durante infección viral, se generó a través de amplificación de PCR con un par de iniciadores (5'- iniciador: P-A (SEC. ID. No. 9) y 3'-iniciador (SEC. ID. No. 11 ) 5'- GTGCGGCCGC TCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGT-3', que corresponde a la secuencia de polínucléotido 2324 a 2350 del genoma HBV con un sitio de restricción adicional Not t). El gen HBcÁg de longitud completa fue generado a través de amplificación, de PCR con un par de iniciadores (d'-iniciador: (SEC. ID. No. 12) 5'- TTAAGCTTATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGC-3', que corresponde a la secuencia de polinucléotido 1901 a 1932 del genoma HBV con u n sitio de restricción adicional Hind II I , y el iniciador P-B (SEC. I D. No. 10)). El fragmento de Fc de ADN de IgG se generó a través de amplificación de PCR con el plásmido pEE6/CLL-1 conteniendo el ADNc de cadena pesada de IgG humano como plantilla. El par de iniciadores para la reacción de PCR son: 5*- iniciador (SEC. ID. No . 13) 5'- ATTAGCGGCCGCTAAAACTCACACATGCCCA-3', que corresponde a ta secuencia de polinucléotido 785 a 802 de la cadena pesada con un sitio adicional Not I, y 3'-in?c?ador (P-C) (SEC. ID. No. 14) 5'- ¡M?ááiißiabmi t i iá üxiMffl t-m?* fflf iiíf p m+mimuhátíli^M^at? TATTCTAGATCGATCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3', que corresponde a la secuencia de polinucléotido 1447 a 1468 de la cadena pesada con un sitio Cía I . Para este estudio se utilizó el vector pRc/CMV (Invitrogen). El vector de expresión , HBe-Fc, el cual expresa la proteína de fusión de HBe-Fc de secreción consistiendo de HBeAg truncada fusionada en marco a IgG Fc, se construyó a través de una ligación de tres piezas del fragmento HBe truncado, IgG Fc, y el vector Hind l l l/Cla l-cut pRc/CMV. El vector de expresión HBeAg , et cual expresa una proteína H BeAg de secreción se construyó insertando el gen HBeAg al vector Hind l l l/Cla l-cut pRc/CMV . El vector de expresión H BcAg el cual expresa una proteína HBcAg citosótica, fue construido insertando el gen HBcAg al vector Hind l l l/Cla l-cut pRc/CMV . Para construir el vector de expresión IgG Fc, el fragmento de ADNc de Fc ?gG humano se enlazó con una secuencia líder de señal VH de ratón a través de dos reacciones de PCR. En la primera reacción de PCR se utilizó el ADNc de Fc IgG como una plantilla para la amplificación con un par de iniciadores (5'-inicíador (SEC. ID. No. 15), 5'-GCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCAAAACTCACACATGCCCACCGTG CCCAGCAC-3', que corresponde a la secuencia de polinucléotido 785 a 815 de cadena pesada y una secuencia líder de VH parcial y el 3'-miciador P-C (SEC. ID. No. 14). La segunda PCR utilizando el producto de la primera PCR como plantilla se realizó con un par de iniciadores (5'-iniciador, (SEC. I D . No. 16) 5'-TTAAGCTTCATATGGGAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCA ,^ ^ ^ ...irr mm iMmmi ámtm^m^ GCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3', que corresponde a la secuencia de polinucléotido N-terminal de la secuencia líder VH con sitios adicionales Hindlll y Ndel y el 3'-iniciador P-C (SEC. ID No. 16)). El ADNc Fc con una secuencia líder se clonó en el vector Hind lll/Cla I- cut pRc/CMV. Estos vectores resultantes fueron identificados a través de análisis de enzima de restricción y confirmados a través de secuenciación de ADN. Los plásmidos fueron transformados a la cepa de E. coli (XL-1azul) y se desarrolló a partir de una sola colonia durante 16-20 horas a 37°C en presencia de 50 ug/ml de ampicilina. El ADN se aisló utilizando un equipo de purificación libre de endotoxina (Qiagen) de acuerdo con el protocolo estándar. Et ADN se volvió en suspender en PBS libre de endotoxina (Sigma) a una concentración final de 1 mg/ml. La relación de OD260/280 varió de 1.8 a 2.0. El ADN se almacenó a -200°C y se analizó a través de 5 digestión de restricción antes del día de la inmunización. El fragmento Fc derivado de IgG 1 humano se utilizó como un elemento de unión de célula para mejorar la ¡nternalización de la proteína de nucleocapsida de HBV de modelo, ya que las células dendríticas expresan receptores de IgG Fc (FcyRs), los cuales 0 median una ruta de internalización de antígeno privilegiada para MHC-ll eficiente así como para presentación de antígeno I- restringida. Aunque HBcAg y HBeAg son codificados por el gen pre- C/C de HBV la proteína HBeAg de secreción es iniciada en un codón inicio 29 residuos corriente arriba del codón de inicio para HBcAg. 5 Se fusionó HBeAg en marco con un gen de ADNc del fragmento Fc de IgGl a humano y después se clonó en el vector pRc/CMV. El fragmento Fc de IgG humano eficientemente puede unirse a los receptores de Fc en APCs de ratón. Los vectores de control conteniendo en gen HBeAg (de secreción), el gen de fragmento Fc con una secuencia líder de señal de secreción (de secreción), o el gen HBcAg (citosólico) fueron construidos (Figura 18). Se generaron células dendríticas derivadas de médula ósea de murino. En resumen , se cultivaron células de vastago de médula ósea en RPMl- 1640 suplementado con 6% de FBS, 60 ng de mG M-CSF/m, y 100 U de mlL-4/ml durante 4 días. Las células dendríticas después se cultivaron en un medio conteniendo una mezcla de las células recombinantes HBeAg (100 µg/ml) y HBcAg (100 µg/ml) (American) Research Products, Boston, MA) durante 4 días más. Se lavaron las células dendríticas pulsadas (PDCs) dos veces con 1 xPBS a 1000 rpm durante 5 minutos y se volvieron a suspender en RPM I-1 T40 para análisis adicional. Al utilizar la radiomarcación y la ¡nmunoprecipitación/análisis de SDS-gel de poliacrilamida (PAGE), se encontró q ue las proteínas H BeAg-Fc y (H Be-Fc) fueron eficientemente producidas y secretadas de células transfectadas (Figura 19A). Tanto HBe-Fc intracelular como secretado fueron directamente precipitados a través de perlas de proteína A, indicando que la proteína de fusión retiene su habilidad de unión a la proteína A, EJEMPLO 16 Inducción de Células T Auxiliares, TH1 a través de Vacunas de ADN de HBe-Fc In vivo Se inmunizaron ratones para evaluar esta estrategia in vivo. Los ratones C57BL/6 se dividieron en 4 grupos y cada ratón fue inmunizado con una inyección i.m. de 100 ug (25-50 µg(µl) por cuadríceps) de ADN de HBeAg, HBeAg, Fc o HBe-Fc. Después de 2-4 semanas de inmunización, los ratones fueron sacrificados y se tomaron muestras de sangre periférica, de bazos y otras muestras de tejido. Primero, los esplenocítos de los ratones de 2-4 semanas después de la inmunización con vacunas de ADN fueron reestimulados con las proteínas HBe/cAg recombinantes durante 5 días. Las células T fueron aisladas de esptenocitos reestimulados, y después se analizaron utilizando el ensayo de incorporación de 3H- timidina. Como se muestra en la Figura 20, las células T de los ratones inmunizados con la construcción de ADN de HBe-Fc o con células T iniciadas con la vacuna de ADN de HBc-Fc activamente se proliferaron. En contraste las células T de los ratones inmunizados con la vacuna de ADN HBeAg, HBcAg, o Fc o la vacuna de ADN HBeAg, HBcAg, y Fc, las células T iniciadas no se proliferaron activamente. Las células T CD4+ de los ratones inmunizados fueron co- cultivadas con células dendríticas que fueron pulsadas con HBeAg y HBcAg recombinantes, similar al ejemplo 5. Durante los 6 días del co-cultivo con diferentes relaciones de células T contra células dendríticas, las células T CD4+ de los ratones inmunizados con la construcción HBeAg, HBcAg, o Fc no proliferaron activamente, y 5 solamente bajos niveles de IL-2 y IFN-? fueron detectados en el medio de co-cultivo (Figura 21A y Figura 21B). En contraste, en los co-cultivos con las células T CD4+ de los ratones inmunizados con la construcción HBe-Fc, las células T CD4+ activamente proliferaron solo después de 48 horas de co-cultivo a una relación de 1:1000 0 (células dendríticas:células T). Además, los niveles de IL-2 y IFM-?/ en el medio de co-cultivo fueron significativamente más altos u© aquellos en los co-cultivos con las células T CD4+ de tos ratones á los que se les administró la construcción HBeAg o HBcAg (Flgtl?É 21A y Figura 21B). Los anticuerpos antí-CD4 pero no los anticuerpos 5 anti-CD8 dramáticamente bloquearon la producción de esl jS citosinas a través del las células co-cultivadas (Figura 21C y Figura 21D). Además, se utilizó un antígeno ¡rrelevante, ta proteina recombinante HBsAg (American Research Product, Boston, MA), para pulsar células dendríticas en paralelo con HBe/Ag. Las células 0 dendríticas pulsadas con HBsAg fueron incapaces de estimular las células T CD4+ de ratones inmunizados con la construcción HBe-Fc en el ensayo descrito, demostrando el carácter especifico de respuestas de la célula T auxiliar 1 CD4+ inducidas por inmunización de la construcción HBe-Fc. Estos resultados indican que la 5 construcción HBe-Fc puede activar más eficientemente TH1 que lo Í i?.?A,,AA* ... .4„.il^44i4,„j4a¿.Aa,<at-afcj_^- J^Mjt.jbáAÍiÍ t¿ puede hacer las construcciones de HBeAg o HBcAg. No se detectaron niveles importantes de IL-4 en ninguno de los experimentos. Más bien, IL-2 y IFN-? se produjeron principalmente por células TH1. Estos resultados indican que la construcción de HBe-Fc induce la respuesta de TH1.

EJEMPLO 17 Inducción de CTLs in vivo Para determinar si la inmunización con la construcción HBe-Fc puede inducir respuestas CTL, se realizó una prueba de JAM, similar al ejemplo 11. Se volvieron a estimular esplenocitos de diferentes ratones inmunizados in vitro durante 4-6 días en un medio conteniendo HBcAg13-27 de péptido sintético y después se cs- cultivaron con péptído marcado con 3H, (HBcAgl 3-27)-células objetivo pulsadas EL-4 (H-2b) y p815 (H-2d) a relaciones variadas de efector/objetivo para medir la aniquilación de célula objetivo. Como se muestra en la Figura 22, los esplenocitos de ratones inmunizados con la construcción HBe-Fc demostró una aniquilación de célula objetivo significativamente más alta que aquellos de ratones inmunizados con HBeAg y HBcAg. El carácter especifico de la aniquilación se demostró a través de la incapacidad de los esplenocitos para aniquilar células objetivo p815 pulsadas con HBcAg con un antecedente de H-2d, y la inhibición de la aniquilación por el anticuerpo anti-CD8, pero no el anticuerpo anti-Cd4. Además, también se utilizó HBsAg para volver a estimular esplenocitos de ratones inmunizados con la construcción HBe-Fc, y no se observó ninguna aniquilación importante para las células objetivo pulsadas con HBcAg a través de esplenocítos estimulados con HBsAg. La repuesta de cítotoxicidad superior inducida por la construcción HBe- Fc se debió a la células T auxiliar 1 mejorada y la presentación directa de MHC de clase I de la proteína de fusión HBe-Fc internalizada a través de células dendríticas.

EJEMPLO 18 Inducción de Anticuerpo Para determinar si la inmunización con HBe-Fe-Dc pu^íjej inducir respuestas de anticuerpo, se midieron tas titulaciones del anticuerpo anti-HBe/Ag en el suero combinado de ratones inmunizados con diferentes vectores, similar al ejemplo 6. Como se muestra en la Figura 23, se detectaron anticuerpos anti-HBe/Ag en los sueros de ratones inmunizados con la construcción HBe-Fc. El carácter específico de las respuestas de anticuerpo se demostró a través de la falta de anticuerpo contra HBsAg en los ratones inmunizados. En contraste, se detectaron titulaciones de anticuerpo significativamente más bajas en ratones inmunizados con la construcción HBeAg o HBcAg (Figura 23). En conjunto, el ADN de HBe-Fc es significativamente superior a los ADNs que expresan HBeAg o HBcAg nativo para inducir célula T auxiliar 1 CD4+ y célula y^^j^ ^j^ g^ i Tin » iiÉriitntiiftii T citotóxica CD8 + , así como respuestas de célula B.

EJEMPLO 19 Activación Sistémica de Células Dendríticas a través de Vacunación de ADN de HBe-Fc Para evaluar la posibilidad de las proteínas HBe-Fc o HBeAg siendo secretadas de las células transducidas y que circulan a través del cuerpo para realizar presentación de antígeno, se realizó un experimento de transferencia de célula dendrítica. Se aislaron células dendríticas de ratones inmunizados y se transfirieron a ratones naturales para determinar sf las células dendrlt?oá^ transferidas pueden iniciar células T CD4+ y CD8+ naturales. S^ sacrificaron ratones inmunizados con la vacuna de ADN H e g-^O* PEA-HBe o control un mes después. Se utilizaron microperlas de ratón CD11c (N418) (Miltenyi Biotec) para aislar células dendríticas de bazos de ratón. Se inyectaron células dendríticas CD11c+ (IP o IV) a ratones naturales (aproximadamente 1-5 x 105/ratón). De dos a cuatro semanas después de la transferencia de célula dendrítica tos ratones fueron sacrificados y se verificaron las respuestas de célula T CD4+ y CD8+ de antígeno específico de diferentes ratones. Como se muestra en la Figura 24, las células dendríticas de esplenocitos de ratones inmunizados con HBe-Fc eficientemente activaron las respuestas de célula T natural, mientras que las células dendríticas de esplenocitos de ratones inmunizados con HBe o HBc fallaron para activar las células T en ratones naturales. Este resultado, junto con los resultados de la PCR y ensayos de internalizacíón, indican que la presentación de antígeno de célula dendrítica se ve mejorada a través de endocitosis de antígeno mediada por Fo?R.

EJEMPLO 20 Secreción de Proteínas de Membrana e Intracelulares Alteradas Las proteínas de membrana y proteínas ¡ntracelulares, las cuales contienen una secuencia para evitar la translocación de membrana de proteína y secreción o falta de una secuencia de señal para secreción, pueden ser utilizadas para la estrategia de la presente invención sin modificación adicional. Se puede ver que la) eliminación o mutación de la secuencia que bloquea una proteína a partir de la secreción da como resultado la secreción de proteína. Las proteínas de membrana por lo general contienen una alta porción de aminoácidos hidrofóbicos, alterando así el carácter hidrofóbico de estas proteínas que les permite que sean activadas para la secreción. Un experto en la técnica reconoce que la estrategia de retrogén también puede ser usada para mejorar la inumogenicidad de estas proteínas. Dos ejemplos para la eliminación o mutación de proteínas de membrana son las proteínas HPV E7 y EBV. E7 es una proteína citosólica. La presencia de una tira de residuos cargados obstaculiza la secreción de la proteína. La eliminación de estos residuos facilita la secreción de proteína y i l, .¿. A,?L.A UiÍ2Á~i t -4¿3i_ -, a, ,. ,-* ? M....ttj?.?.t.^i estabiliza la proteína (Figura 17). Por consiguiente, la tira de residuos cargados de las proteínas HPV 16 E7 se eliminó en la presente construcción (caja sólida) a través de dos reacciones de PCR. Como resultado, la secreción de las proteínas E7 truncadas después del enlace con una secuencia líder (I L-2) se mejoró dramáticamente. El antígeno 1 nuclear de EBV es una proteína nuclear, la cual contiene un estiramiento de residuos de aminoácidos hidrofóbico, et cual puede interferir con la translocación de membrana de proteína y la secreción. En un estudio, se eliminó el estiramiento de residuos de aminoácido hidrofóbico en la proteína EBNA1. Como resultado, ta proteína EBNA1 truncada fue eficientemente secretada de células después del enlace con una secuencia de señal líder. Además de la eliminación o truncamiento de la secuencia, uní experto en la técnica reconoce que la secuencia también puede ser mutada para reducir el carácter hidrofóbico de la proteína. La mutagénesis dirigida al sitio proporciona la preparación y prueba de variantes de secuencia introduciendo uno o más cambios de secuencia de polinucléotido a un ADN seleccionado. En general, primero se obtiene un vector de estructura de cadena individual, o fusiona dos estructuras de cadena de un vector de estructura de cadena doble, que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica la proteína deseada o elemento genético. Un iniciador de oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada, sintéticamente preparada, después es fijada con la preparación de ADN de estructura de cadena individual, tomando en cuenta el grado de desigualacíón cuando se seleccionan condiciones de hibridación. El producto hibrídizado es sometido a enzimas de polimerización de ADN tales como polimerasa I de £. coli (fragmento 5 Klenow) con el fin de completar la síntesis de la estructura de cadena que lleva la mutación. De esta manera, se forma un heterodúplex, en donde una estructura de cadena codifica la secuencia original no mutada, y la segunda estructura de cadena lleva la mutación deseada. Este vector de heterodúplex después es 10 utilizado para transformar células huésped apropiadas, tales como células E. coli y se seleccionan clones que incluyan vectores recombinantes que lleven la disposición de secuencia mutada. La mutagénesis dirigida al sitio se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,220,007; 5,284,760; 5,534,670; 5,366,878; 5,389,514; 15 5,635,377 y 5,789,166. Además de las proteínas de membrana, las proteínas intracelulares son modificadas, dando como resultado la secreción. Una modificación es meramente la adición de una secuencia líder de señal. Por ejemplo, MAGE es una proteína ¡ntracelular que carece de 20 una secuencia de señal para secreción. En el ejemplo 7, se agregó una secuencia de señal a MAGE utilizando técnicas de PCR. La adición de la secuencia de señal a MAGE permitió que esta proteína intracelular fuera secretada. Otra modificación de una proteína intracelular es alterar el precursor el cual típicamente es una 25 proteína intracelular, de manera que es secretada en forma similar a rm^tWfÉI'FaM~--,^^¿>¿*»*¿~*. la proteína madura. Por ejemplo, la proteína de precursor beta de IL- 1 es citosólica, pero la proteína madura es secretada. De esta manera, Siders y Mizel (J. Biol. Chem. 1995) trucaron residuos de aminoácido en la proteína de precursor. Estos ilustraron que la eliminación de algunos aminoácidos entre 100 y 104 incrementó el nivel de secreción de la proteína truncada al nivel de las IL-1 betas maduras. De esta manera, un experto en la técnica puede ser capaz de utilizar esta información para alterar otras proteínas intracelulares. Una modificación adicional incluye el uso de partículas virales, las cuales son liberadas de las células. De esta manera, el retrogén es fusionado a un gen viral y ensamblado a partículas virales para liberación. Una partícula de virus consiste de un genoma de ácido) nucleico rodeado por una protección de proteína. El empaque de partículas virales se realiza a través de cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo.

EJEMPLO 21 Glicosilación de Proteína La glicosilación de lgG-Fc es bien conocida en la técnica como esencial para la activación óptima de células efectoras a través de reconocimiento de Fc?R. De esta manera, se deben generar proteínas de fusión recombinantes conteniendo la porción Fc en un sistema capaz de glicosilación si la unión a Fc?R es esencial para su utilidad potencial. El sistema baculovirus-célula insecto es comúnmente utilizado para generar una proteína recombínante de alto rendimiento. La habilidad de este sistema para agregar un oligosacárido de núcleo y residuos de azúcar de brazos externos a glicoproteínas es bien conocida por aquellos expertos en la técnica y lo hace un sistema adecuado para la expresión y purificación de la proteína de fusión HBe-Fc. El fragmento de HBeFc de 1230 bp contenido en el plásmido tHBeAgFc, el cual expresa la proteína HBe-Fc de secreción consistiendo de la proteína HBeAg truncada fusionada en marco a IgG Fc, fue construido. En resumen, se generó el baculovirus recombinante HBe-Fc utilizando el sistema pFastBac (Gibco BRL) con el plásmido donador pFB1. El fragmento HBe-Fc fue primero) amplificado mediante PCR a partir de la plantilla tHBeAgFo, utilizando el iniciador 5' (SEC. ID. No. 17) 5'- GATCGAATTCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3' y el iniciador 3" (SEC. ID. No.18) 5'-GATCAAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3" para introducir los sitios de restricción EcoRI y Hindlll en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este producto de PCR fue purificado mediante gel, digerido y ligado al plásmido donador EcoRI/Hindltl cut pFBI. El vector resultante (pFBI-HbeFc) fue identificado a través de análisis de enzima de restricción y confirmado a través de secuenciación de ADN. La transposición de sitio específico del cásete de expresión Hbe-Fc del plásmido donador al genoma de baculovirus se realizó transformando E. coli de DHIOBac con el plásmido donador pFBI- HBeFc. Se identificaron baculovirus recombinantes a través de selección de X-gal, ya que la transposición al bacmid fragmenta la expresión del péptido 1acZa. El ADN de bacmid recombinante se aisló a través de una minipreparación y se utilizó para transfectar células de insecto Sf9 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El material de abastecimiento viral obtenido de la transfección inicial fue amplificado infectando un cultivo de suspensión de 50 ml de células Sf9 a 2 x 10 células/ml con 0.5 ml de material de abastecimiento viral, y recolectando el sobrenadante después de 48 horas. Este material de abastecimiento después fue sometido a dos rondas adicionales de amplificación, en ese momento >90% de células fueron HBe-Fc recombinantes según verificado a través de tinción inmunofluorescente de células infectadas. El material de abastecimiento amplificado después de utilizó para infectar cuatro cultivos de 100 ml de células Sf9 durante 72-90 horas. Los sobrenadantes se cosecharon y se aclararon a través de centrifugación durante 20 minutos a 14,000 rpm, 4°C. El sobrenadante aclarado después se hizo pasar dos veces sobre una columna de gel de absorbedor de detergente de 5 ml (Boehringer Mannheím) para remover pluronic que puede interferir con la recuperación de proteína. La proteína HBe-Fc recombínante después se purificó del sobrenadante a través del paso sobre una columna de proteína G (Pharmacia) a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. La columna se lavó secuencialmente con 10 volúmenes de 100 mM de IAA?I?ÉÍ?*&AI .

Tris, pH 6.0 y 10 mM de Tris, pH 6.0 y la proteína de eluyó en fracciones de 1 ml con 10 volúmenes de 100 mM de Glicina, pH 2.7. El pH de todas las fracciones fue inmediatamente ajustado a neutro a través de la adición de un volumen de 1/10 de 1 M de tris, pH 8.0. Se determinaron las fracciones que contienen proteína a través de A2ßo y se separaron a través de 12% de SDS-PAGE para determinar la pureza. Las fracciones purificadas después se sometieron a tinción Western. En resumen, 15 µg de la proteína principal conteniendo la fracción eluída se separó en 12% de SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (R) o de no reducción (NR), se transfirieron a nitrocelulosa, se tiñeron, y se revelaron utilizando reactivos de detección de tinción Western ECL. Anticuerpo primario, anti-HBc de conejo; anticuerpo secundario, conjugado de peroxidasa de anff- conejo de ratón.

EJEMPLO 22 Identificaciones de Antígenos Restringidos de MHC-lt La presente invención se utiliza para identificar antígenos virales restringidos de MHC-ll, VIH, HCV, EBV, antígenos bacterianos, otros antígenos de patógeno, antígenos de tumor y autoantígenos relacionados con enfermedades autoinmunes. El vector de expresión en la presente invención ha sido modificado para incluir polinucléotidos de "prueba". Las secuencias de polinucléotidos no se sabe que produzcan una respuesta inmune. tJ . ÍÁ.? '. J-¿***i. -l*A- JMfc»...4.... M ^ A ¡t^ .A.?.i.??,^ Esta estrategia de la presente invención identifica nuevos antígenos y epítopos que son utilizados para desarrollar nuevas vacunas. En primer lugar, se construyó una colección de ADNc utilizando ARNm de células seleccionadas, es decir, células de tumor. Cuando se preparó ADNc a partir de células o tejido que expresa las secuencias de polinucléotido de interés a niveles extremadamente altos, la mayor parte de los clones de ADNc que contienen la secuencia de polinucléotido pueden ser seleccionados con esfuerzo mínimo. Para las secuencias de polinucléotido menos abundantemente transcritas, se pueden utilizar varios métodos para enriquecer ARNms particulares antes de hacer la colección. Se utilizaron retrovirus como un vector para la colección. Las colecciones retrovirales proporcionan la forma ideal para suministrar una colección de alta complejidad a virtualmente cualquier tipo de células mitótícamente activa para la clonación de expresión. Ya que las partículas virales se infectan con alta eficiencia, estas suministran una colección más compleja que los métodos a base de transfección. Un experto en la técnica se puede dar cuenta que cualquier vector puede ser utilizado para la colección. Se construye una colección de ADNc utilizando métodos bien conocidos en la técnica. En resumen, se establecen líneas de célula de tumor de muestras tumorales. Las células T CD4+ de la misma sangre periférica de mamífero se expanden a través de co-cultivo con las células dendríticas pulsadas con el lisato de tumor de mamífero derivadas de monocitos/macrófagos. Las células de tumor que son lZt*i.?.?.A-t »iA. L.!t...~ ¿i **.* . reconocidas por células T Cd4+ antologas expandidas son identificadas. Después, las líneas de células son colocadas en placas de 96 cavidades. Se agregaron células T CD4+ antologas expandidas a las 96 cavidades, y se verificaron las concentraciones de IFN-? o GM-CSF en los co-cultivos de 96 cavidades. El siguiente paso fue cultivar y extraer el ARNm de las células tumorales positivas. El ARNm aislado es convertido al ADNc e insertado en un vector, por ejemplo, el vector lentiviral con un marcador GFP o los ADNcs de prueba son clonados al vector de expresión de la presente invención. Los ADNcs de prueba son clonados al vector entre las secuencias de señal y el elemento de unión celular como se ilustra en, por ejemplo, la Figura 25. Una vez que la colección de ADNc es construida, los vectores vírales son transfectados a células de empaque. Después, las células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos del mamífero con el mismo genotipo MHC-II son transducidas con los vectores recombinantes y se determina la eficiencia. Las células dendríticas transducidas son co-cultivadas con células T CD4+ antologas expandidas. Se identificaron clones positivos a través de ELISA (GM-CSF) o expresión de superficie de I L-2 a través de disposición citométrica de flujo. El clon positivo es amplificado mediante PCR y secuenciado para determinar la proteína (Figura 26). El genoma humano es clasificado para identificar las secuencias de polinucléotido que codifican proteínas y epítopos que son reconocidos por células T CD4 + . Estos productos de ^..^l .,-,. .44. ..-..y,. -^^-4*^**^1^^ polinucléotido son utilizados para terapia de cáncer o para inducir tolerancia inmune para terapia de enfermedad autoinmune, o terapia de gen. Este procedimiento de clasificación básico proporciona la identificación de epítopos para diseñar moléculas terapéuticas pequeñas. De esta manera, un experto en la técnica está conciente de que este procedimiento de clasificación es modificado para clasificar una variedad de genomas, es decir, humanos, vírales, bacterianos o de parásito. La construcción de colecciones de ADNc es bien conocida en la técnica. De esta manera, un experto en la técnica es capaz de utilizar esta información para alterar la presente invención para identificar antígenos. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en las especificaciones son indicativas de los niveles de aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece la invención. Todas la patentes y publicaciones en la presente están incorporadas aquí por referencia al mismo grado como si cada publicación individual fuera específica e individualmente indicada como incorporada aquí por referencia.

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Un experto en la técnica fácilmente aprecia que la preséwf irov/erieldn está bien adaptada para realizar los objetos y obfeneF |0¡f fines y ventajas mencionados así como aquellos inherentes a la misma. Las vacunas, vectores, métodos, procedimientos, y técnicas aquí descritos actualmente son representativos de las modalidades preferidas y están destinados a ser ilustrativos y no pretenden ser limitaciones del alcance . Aq uellos expertos en las técnicas se les pueden ocurrir cambios en la misma y otros usos, los cuales quedan abarcados dentro del espíritu de la invención o definidos por el alcance de las reivindicaciones anexas .

-^"^XHTIÉÍÍ ir • ?? <210> 2 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 ccgctcgagt cactcttccc cctctctcaa aac 33 <210> 3 <211 >103 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 acgcgtcgac atgaaggtct ccgcggcagc cctcgctgtc atcctcattg ctaetgcce? 103 ctgcgctcct gcatctgcca tgcctcttga gcagaggagt cag <210> 4 <211> 38 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 ataagaatgc ggccgctctc ttccccctct ctcaaaac 38 <210> 5 <211> 31 .i aíiiíi i, -¿ '.-A»*.. <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 ataagcggcc gctaaaactc acacatgccc a 31 <210> 6 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 ccgctcgagt catttacccg gagacaggga gag 33 5 <210> 7 <211> 55 <212> ADN <213> Homo sapiens 0 <400> 7 gcagctccca gatgggtcct gtccaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcac 55 <210> 8 <211> 68 5 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 tA4a.frfcttN-i.- .Ai ^,.,,,,..,,^,,,^ _ ^^A.,^.*„^.^?* ,„„^„,^ AA<t , acgcgtcgac atgggaacat ctgtggttct tccttctcct ggtggcagct cccagatggg 60 tcctgtcc 68 <210> 9 <211> 35 <212> ADN <213> virus de Hepatitis B <400> 9 ttaagcttat gcaacttttt cacctctgcc taatc 35 <210>10 <211> 34 <212> ADN <213> virus de Hepatitis B <400> 10 tttctagaat cgattaacat tgagattccc gaga 34 <210>11 <211>37 <212> ADN <213> virus de Hepatitis B <400>11 gtgcggccgc tctaacaaca gtagtttccg gaagtgt 37 <210>12 ? k. .AJuJk ?/ÚlkHíi' ,«-a-4i...~- JJtJ-tf » <211> 40 <212> ADN <213> virus de Hepatitis B 5 <400> 12 ttaagcttat ggacattgac ccttataaag aatttggagc 40 <210> 13 <211> 31 10 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 ataagcggcc getaaaactc acacatgccc a 31 15 <210> 14 <211>36 <212> ADN <213> Homo sapiens 20 <400>14 tattctagat cgatcactca tttacccgga gacagg 36 <210> 15 <211> 55 25 <212> ADN <213> Homo sapiens (primeros 30)/Murino (últimos 25) <400> 15 gcagctccca gatgggtcct gtccaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcac 55 <210> 16 <211> 69 <212> ADN <213> Murino <400> 16 ttaagcttca tatgggaaca tctgtggttc ttccttctcc tggtggcagc tcccagatgg 60 gtcctgtcc 69 <210> 17 <211> 31 <212> ADN <213> virus de Hepatitis B <400> 17 gatcgaattc atgcaacttt ttcacctctg c 31 <210> 18 <211> 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 18 gatcaagctt tcatttaccc ggagacaggg a 31 <210> 19 <211> 98 <212> PRT <213> Papilomavirus humano de tipo E7 <400> 19 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu lie Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn lie Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp lie Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly lie Val Cys Pro lie Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucléotído, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados. 2. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en la secuencia de promotor de polinucléotido se selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible y un promotor específico en tejido. 3. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el vector constitutivo se selecciona del grupo que consiste de un promotor temprano de virus de simio 40 (SV40), un promotor de virus de tumor de mama de ratón, un promotor de repetición de terminal larga de virus de inmunodeficiencia humana, un promotor de virus de Moloney, un promotor de virus de leucemia de ave, un promotor temprano inmediato de virus de Epstein-Barr, un promotor de virus de sarcoma de Rous, un promotor de acción humana, un promotor de míosina humana, un promotor de hemoglobina humana, un promotor de citomegalovirus (CMV) y un promotor de creatina de músculo humano. 4. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el promotor inducible se seleccionan del grupo que consiste i^ .i.laj J ,...«¡y., 4^,^ 444. .4.-4., , ,. ,»», A^A,,.^^ ,„ .&,,¿HiiahA „ ,-..^^^ ......I., 4. j de un promotor de metalotíonina, un promotor, de glucocorticoíde, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina. 5. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el promotor específico en tejido se seleccionan del grupo que 5 consiste del promotor HER-2 y un promotor asociado a PSA. 6. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el polinucléotido que codifica una secuencia de señal se selecciona del g rupo que consiste de una secuencia de señal de antígeno de virus E de hepatitis B , una secuencia líder de cadena 0 pesada de inmunoglobulina y una secuencia líder de citocina. 7. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el polinucléotido q ue codifica un antígeno comprenden una secuencia de polinucléotido para por lo menos un epítopo, en donde por lo menos un epítopo incluye una respuesta de célula B en un 5 mamífero. 8. El vector de expresión de acuerdo con la reivind icación 1 , en donde el polinucléotído que cod ifica un antígeno una secuencia de polinucléotido para por lo menos un epítopo, en donde por lo menos un epítopo induce una respuesta de célula T CD4+ en un mamífero. 0 9. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el polinucléotido que codifica un antígeno una secuencia de polinucléotido para por lo menos un epítopo, en donde por lo menos un epítopo i nd uce una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero. 1 0. El vector de expresión de acuerdo con la reivi ndicación 1 , 5 en donde el polinucléotido q ue codifica u n antígeno comprende una tiA?.?á iA,elJí*kAt¡. A. .Í * .- -^¡lí*. ja»A.JMfea4 -.jfc|4¿a ¿JAI secuencia de polinucléotido para por lo menos un epítopo, en donde ese epítopo induce una respuesta de célula B, una respuesta de célula T CD4 + , y una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero en donde se introduce el antígeno. 11. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucléotido que codifica un antígeno comprende una secuencia de polinucléotido para una pluralidad de epítopos, en donde la pluralidad de epítopos incluye una respuesta de célula B, una respuesta de célula T CD4 + , y una respuesta de célula T CD8+ en un mamífero en donde se introduce el antígeno. 12. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucléotido que codifica un antígeno es una secuencia de polinucléotido seleccionada de por lo menos una secuencia de polinucléotido asociada con una enfermedad, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedad infecciosa, cáncer y enfermedad autoinmune. 13. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucléotido que codifica un antígeno es una secuencia de polinucléotido seleccionada de por lo menos una secuencia de polinucléotido de una enfermedad infecciosa, en donde la enfermedad infecciosa es causada por microorganismo patogénico seleccionado de un grupo que consiste de un virus, bacteria, hongo y protozoario. 14. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el polinucléotido que codifica un antígeno es una secuencia de polinucléotido seleccionada de por lo menos una secuencia de polinucléotído de un gen viral, en donde el gen viral se selecciona del grupo que consiste de virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana, papilomavirus y virus de herpes. 15. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el virus de hepatitis B es el antígeno e del virus de hepatitis B o el antígeno de núcleo de virus de hepatitis B. 16. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el virus de inmunodeficiencia humana es gp160 o gp120. 17. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el papilomavirus es el papilomavirus E7 o papilomavirus E6. 18. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el virus de herpes se selecciona del grupo que consiste de virus de herpes simple tipo 1, virus de herpes simple tipo 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus de herpes 6 humano, virus de herpes 7 humano y virus de herpes 8 humano. 19. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer cervical, melanoma, cáncer renal y cáncer de próstata. 20. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucléotído que codifica una secuencia para un antígeno es una secuencia de polinucléotido seleccionada del grupo que consiste de secuencias de polmucléotido que codifican tirosinasa, MART, trp, MAGE-1 , MAGE-2, MAGE-3, gp100, HER-2, Ras y PSA. 21 . El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de 5 artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis y enfermedad de Crohn. 22. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el polinucléotido que codifica un antígeno codifica un fragmento de anticuerpo Fc o una interleucina. 0 23. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la secuencia de polinucléotido codifica interleucina 5. 24. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula es una secuencia de polinucléotido de un ligando que se une a 5 un receptor de superficie de célula. 25. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la secuencia de polinucléotido de un ligando se selecciona del grupo que consiste de secuencias de polinucléotido que codifican fragmento Fc, un dominio de unión de célula de toxina, una citocina, 0 un péptido pequeño y un anticuerpo. 26. El vector de expresión de acuerdo con la reivind icación 25, en donde la secuencia de polinucléotido cod ifica un dominio de unión de célula de exotoxina de, pseudomonas. 27. El vector de expresión de acuerdo con la reivind icación 25, 5 en donde la secuencia de nucleótido codifica interleucina 5 o interleucina 6. 28. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucléotído que codifica un elemento de unión de célula es una secuencia de polinucléotido homologa o una secuencia 5 de polinucléotido heteróloga. 29. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula es un fragmento Fc homólogo. 30. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 28, 0 en donde el polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula es un fragmento Fc heterólogo. 31. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector de expresión además comprende una secuencia de señal de integración que facilita la integración del vector de 5 expresión al genoma de la célula. 32. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la secuencia de señal de integración en una secuencia de repetición de terminal larga viral o una secuencia de ITR de virus adeno-asociado. 0 33. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector se selecciona del grupo que consiste de vector viral, vector bacteriano y vector de mamífero. 34. Una célula transformada que comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una 5 secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados. 35. La célula de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la célula es procariótica o eucariótica. 36. La célula de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la célula eucariótíca se selecciona del grupo de células eucarióticas que consisten de levadura, insectos o mamíferos. 37. Una proteína de fusión que comprende una secuencia de señal, un antígeno y un elemento de unión de célula. 38. Una vacuna que comprende una secuencia de promotor de polinucléotído, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados. 39. Una vacuna que comprende células de presentación de antígeno, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas in vitro con la proteína de fusión de la reivindicación 37. 40. Una vacuna que comprende células de presentación de antígeno, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas in vitro con el vector de expresión de la reivindicación 1. 41. Una vacuna que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 37. 42. Un vector de expresión que comprende por lo menos un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un antígeno y un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula. 43. Un método para producir una respuesta inmune dirigida contra un antígeno, que comprende los pasos de: introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotído, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados; y expresar el vector para producir el antígeno bajo condiciones, en donde el antígeno se secreta de la célula; el antígeno secretado es endocitado a la célula; el antígeno endocitado es procesado dentro de la célula; y el antígeno procesado es presentado a una proteína de superficie de célula, para producir una respuesta inmune- mediada por células T. 44. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el antígeno procesado es presentado a una proteína de superficie de célula selecciona del grupo que consiste de MHC-I , MHC-ll o receptores de célula B. 45. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el antígeno es secretado por una primera célula e internalizado por una segunda célula. i.i Á.?.A^í .A.^^ 46. El método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la primera célula y la segunda célula son células de presentación de antígeno. 47. El método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la primera célula es una célula de presentación que no es antígeno y la segunda célula es una célula de presentación de antígeno. 48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la primera célula es una célula de músculo. 49. Un método para producir una respuesta inmune dirigida contra un antígeno q ue comprende el paso de administrar el vector de expresión de la reivindicación 1 directamente a un mamífero a través de una ruta parenteral. 50. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde la secuencia de promotor de polinucléotido se selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor ind ucible, y un promotor específico en tejido. 51 . El método de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el vector constitutivo se selecciona del g rupo que consiste de un promotor temprano de virus de simio 40 (SV40), un promotor de virus de tumor de mama de ratón, un promotor de repetición de terminal larga de virus de inmunodeficiencía humana, un promotor de virus de Moloney, un promotor de virus de leucemia de ave, un promotor temprano inmediato de virus de Epstein-Barr, u n promotor de virus de sarcoma de Rous , un promotor de acción h umana, un promotor de miosina humana, un promotor de hemoglobina humana, un promotor de citomegalovirus (CMV) y un promotor de creatina de músculo humano. 52. El método de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el promotor inducible se seleccionan del grupo que consiste de un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoide, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina. 53. El método de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el promotor específico en tejido se seleccionan del grupo que consiste del promotor HER-2 y un promotor asociado a PSA. 54. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el polinucléotido que codifica una secuencia de señal se seleccionan del grupo que consiste de una secuencia de señal de antígeno de virus E de hepatitis B, una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobulina y una secuencia líder de citocina. 55. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el polinucléotido que codifica un antígeno es una secuencia de polinucléotido seleccionada de por lo menos una secuencia de polinucléotido asociada con una enfermedad, en donde la enfermedad se seleccionan del grupo que consiste de enfermedad infecciosa, cáncer y enfermedad autoinmune. 56. El método de acuerdo con la reivindicación 55, en donde el polinucléotido que codifica un antígeno es una secuencia de polinucléotido seleccionada de por lo menos una secuencia de polinucléotido de una enfermedad infecciosa, en donde la enfermedad infecciosa es causada por microorganismo patogénico A??.ÍÍ At&£ áM¡ít.. seleccionado de un grupo que consiste de un virus, bacteria, hongo y protozoarío. 57. El método de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el polinucléotído que codifica un antígeno es una secuencia de polinucléotido seleccionada de por lo menos una secuencia de polinucléotido de un gen viral, en donde el gen viral se selecciona del grupo que consiste de virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de inmunodefíciencia humana, papilomavírus y virus de herpes. 58. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde el virus de hepatitis B es el antígeno e del virus de hepatitis B o el antígeno de núcleo de virus de hepatitis B. 59. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde el virus de inmunodeficiencía humana es gp160 o gp120. 60. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde el papilomavirus es el papilomavirus E7 o papilomavirus E6. 61. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde el virus de herpes se selecciona del grupo que consiste de virus de herpes simple tipo 1, virus de herpes simple tipo 2, virus de Epstein- Barr, cítomegalovirus, virus de herpes 6 humano, virus de herpes 7 humano y virus de herpes 8 humano. 62. El método de acuerdo con la reivindicación 55, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer cervical, melanoma, cáncer renal y cáncer de próstata. 63. El método de acuerdo con la reivindicación 55, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, esclerosis múltiple» psoriasis y enfermedad de Crohn. 64. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el polinucléotido que codifica un antígeno codifica un fragmento de anticuerpo Fc o una interleucina. 65. El método de acuerdo con la reivindicación 64, en donde la secuencia de polinucléotido codifica interleucina 5. 66. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula es una secuencia de polinucléotido de un ligando que se une a un receptor de superficie de célula. 67. El método de acuerdo con la reivindicación 66, en donde ía secuencia de polinucléotido de un ligando se selecciona del grupo que consiste de secuencias de polinucléotido que codifican fragmento Fc, un dominio de unión de célula de toxina, una citocina, un péptido pequeño y un anticuerpo. 68. El método de acuerdo con la reivindicación 67, en donde la secuencia de polinucléotido codifica un dominio de unión de célula de exotoxina de pseudomonas. 69. El método de acuerdo con la reivindicación 67, en donde la secuencia de nucleótido codifica interleucina 5 o interleucina 6. 70. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el polinucléotido que codifica un elemento de unión de ?élula es una secuencia de polinucléotido homologa o una secuencia de polinucléotido heteróloga. "f= *...hrr- . , .,^f,«Mr * -A* ~ ......4^.- | rt 71 . El método de acuerdo con la reivindicación 70, en donde el polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula es un fragmento Fc homólogo 72. El método de acuerdo con la reivindicación 70, en donde el polinucléotído q ue codifica un elemento de unión de célula es un fragmento Fc heterólogo. 73. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el vector de expresión además comprende una secuencia de señal de integración que facilita la integración del vector de expresión al genoma de la célula. 74. El método de acuerdo con la reivindicación 73, en dond© la secuencia de señal de integración en una secuencia de repetición des terminal larga viral o una secuencia de ITR de virus adeno-asociado). 75. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el vector se selecciona del grupo que consiste de vector viral, vectof bacteriano y vector de mamífero. 76. Un método para identificar una secuencia de polinucléotido que codifica por lo menos un epítopo restringido de MCH-ll que es capaz de activar células T auxiliares CD4 + , el método comprende los pasos de: introducir un vector de expresión a una célula de presentación de antígeno para producir una célula de presentación de antígeno transducida, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que cod ifica una secuencia de señal, un polmucléotido que codifica un , ^AMA*A¿S,t*.A.Af*fí,.^..^~? polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemente- ie unión de célula y una secuencia de polinadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados; poner en contacto la célula de presentación de antígeno transducida con células T naturales o células T iniciadas; y determinar si cualquiera de las células T naturales o las células T iniciadas son activadas después del contacto con la célula de presentación de antígeno transducída, en donde la activación de las células T indica q ue el polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + . 77. El método de acuerdo con la reivindicación 76 , en donde el polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba es una colección de AD Nc aislada de l íneas de células tumorales . 78. El método de acuerdo con la reivindicación 76 , en donde el polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba se selecciona del g rupo de colecciones de ADNc q ue consisten de genomas vírales, genomas bacterianos, genomas de parásito y genomas h umanos. 79. Un método para identificar una secuencia de polinucléotido que codifica por lo menos un epítopo restringido de MCH-II que es capaz de producir una respuesta inmune in vivo, el método comprende los pasos de: introducir un vector de expresión a una célula de presentación de antígeno para producir células de presentación de antígeno transducidas , en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula y una secuencia de polinadenilación de 5 polinucléotido, todos operativamente enlazados; administrar las células de presentación de antígeno transducidas a un mamífero a través de una ruta parenteral; recoger células T de esplenocitos y co-cultivar con células dendríticas; y 0 determinar la activación de células T en donde la activación de células T indica que el polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba es una secuencia de polinucléotido o fragmento de la misma capaz de activar células T auxiliares CD4 + . 80. El método de acuerdo con la reivindicación 79, en donde el 5 polinucléotido que codifica un polipéptído de prueba es una colección de ADNc aislado de líneas de células tumorales. 81. El método de acuerdo con la reivindicación 79, en donde el polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba se selecciona del grupo de colecciones de ADNc que consiste de genomas virales, 0 genomas bacterianos, genomas de parásito y genomas humanos. 82. Un método para identificar una secuencia de polinucléotido que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll que es capaz de producir una respuesta inmune in vivo, el método comprende los pasos de : 5 administrar a un mamífero, a través de una ruta parenteral, un vector de expresión, en donde dicho vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotído que codifica un polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados; recoger células T de esplenocitos y co-cultívar con células dendríticas; y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba es una secuencia de polinucléotido o fragmento de la misma) capaz de activar células T auxiliares CD4 + . 83. El método de acuerdo con la reivindicación 82, en donde el polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba es una colección 5 de ADNc aislado de líneas de células tumorales. 84. El método de acuerdo con la reivindicación 82, en donde el polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba se selecciona del grupo de colecciones de ADNc que consiste de genomas virales, genomas bacterianos, genomas de parásito y genomas humanos. 0 85. Un método para el tratamiento de cáncer, que comprende los pasos de: identificar un polipéptido de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de células de presentación de 5 antígeno de transducción con un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotído que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un polipéptído de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotido, 5 todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucléotído que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar las células de presentación de antígeno 0 transducidas a un mamífero a través de una ruta parenteral, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. 86. Un método para el tratamiento de cáncer, que comprende los pasos de: 5 identificar un polipéptido de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de células de presentación de antígeno de transducción con un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que 0 codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el 5 polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar a un mamífero a través de una ruta parenteral, un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende por lo menos el polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba y un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula. 87. Un método para el tratamiento de una infección viral, que comprende los pasos de: identificar un polipéptido de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de células de presentación de antígeno de transducción con un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que) codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica ?tn polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenílación de polinucléotidc*. todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar las células de presentación de antígeno transducidas a un mamífero a través de una ruta parenteral, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. , 88. Un método para el tratamiento de una infección viral, que comprende los pasos de: identificar un polipéptído de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de células de presentación de antígeno de transducción con un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que et polinucléotído que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar a un mamífero a través de una Futa parenteral, un¡ vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende por lo menos el polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba y un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula. 89. Un método para el tratamiento de un enfermedad autoinmune, que comprende los pasos de: Un método para el tratamiento de cáncer, que comprende los pasos de: identificar un polipéptido de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de células de presentación de antígeno de transducción con un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucléotído, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucléotido que codifica el polipéptído de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y administrar las células de presentación de antígeno transducidas a un mamífero a través de una ruta parenteral, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas con el polipéptido de prueba. 90. Un método para el tratamiento de una enferrrte íadl autoinmune que comprende los pasos de: identificar un polipéptido de prueba que codifica por lo menos un epítopo restringido de MHC-ll, en donde el polipéptido es identificado bajo las condiciones de células de presentación de antígeno de transducción con un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un polipéptido de prueba, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados, y determinar la activación de células T, en donde la activación de células T indica que el polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba es un gen o fragmento del mismo capaz de activar células T auxiliares CD4 + ; y Mjataaferifei***»-.*- ,. administrar a un mamífero a través de una ruta parenteral, un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende por lo menos una secuencia de polinucléotido que codifica el polipéptido de prueba y un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula. 91. Un método para producir una vacuna para inmunizar un mamífero, que comprende los pasos de: transducir células de presentación de antígeno introduciendo un vector de expresión a las células de presentación de antígeno para producir una célula de presentación de antígeno transducida, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un antígeno, un polinucléotída que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilacíón de polinucléotído, todos operativamente enlazados, y expresar dicho vector para producir un antígeno bajo condiciones en donde el antígeno es secretado de la célula. 92. Un método para administrar la vacuna de la reivindicación 41, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas con la vacuna in vitro antes de administrarse a un mamífero. 93. Un método para administrar la vacuna de la reivindicación 38,(en donde la vacuna se administra parenteralmente. 94. Un método para administrar la vacuna de la reivindicación 41, en donde las células de presentación de antígeno son transducidas con la vacuna ex vivo antes de administrarse a un mamífero. 95. Un método para inducir una respuesta inmune que comprende los pasos de co-administrar a un mamífero un vector de expresión de citocina y un vector de expresión de retrogén, en donde el vector de expresión de retrogén comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilacíón de polinucléotido, todos operativamente enlazados. 96. El método de acuerdo con la reivindicación 95, en donde el vector de expresión de citocina contiene la secuencia para GM-CSF. 97. El método de acuerdo con la reivindicación 95, en donde el vector de expresión de cítocina contiene la secuencia para IL-2. 98. Un método para inducir una respuesta inmune, que comprende los pasos de administrar a un mamífero un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de polinucléotido que codifica una proteína de citocina y una secuencia de polinucléotido que codifica una proteína de fusión bajo el control transcripcional de un promotor, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de señal, un antígeno y un elemento de unión de célula. 99. El método de acuerdo con la reivindicación 98, en donde la secuencia de polínucléotido que codifica la proteína de citocina y la secuencia de polinucléotido que codifica la proteína de fusión están bajo el control transcripcional separado, y en donde la secuencia de polinucléotido que codifica la proteína de citocina y la secuencia de polinucléotido que codifica la proteína de fusión están en tándem en un vector de expresión. 100. Un método para inducir una respuesta inmune, que comprende los pasos de co-administrar a un mamífero dos diferentes vectores de expresión de retrogén, en donde el primer vector de expresión de retrogén comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un primer antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotído, todos operativamente enlazados; y un segundo vector de expresión de retrogén comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un segundo antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados. 101. Un método para inducir una respuesta inmune, que comprende los pasos de administrar a un mamífero un vector de expresión, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de polinucléotido que codifica una primera proteína de fusión y una secuencia de polinucléotido que codifica una segunda proteína de fusión bajo el control transcripcional de un promotor, en donde la t jAAA^"^H? n iWHífiíifí . ?¿ ¡ . i primera proteína de fusión comprende una primera secuencia de señal , un primer antígeno y un primer elemento de unión de célula, y la segunda proteína de fusión comprende una segunda secuencia de señal, un segundo antígeno y un segundo elemento de unión de célula. 1 02. El método de acuerdo con la reivi nd icación 1 01 , en donde las primera y segunda secuencias de señal son la misma secuencia de señal , los primero y segundo antígenos son diferentes antígenos y los primero y segundo elementos de unión de célula son un fragmento Fc. 1 03. El método de acuerdo con la reivindicación 101 , en donde las primera y segunda secuencias de señal son la misma secuencia de señal , los primero y seg u ndo antígenos son diferentes aníígenos y los primero y segu ndo elementos de unión de célula son el mismo elemento de unión de célula. 104. El método de acuerdo con la reivindicación 1 01 , en donde las primera y segunda secuencias de señal son diferentes secuencias de señal, los primero y segundo antígenos son diferentes antígenos y los primero y seg undo elementos de unión de célula son el mismo elemento de unión de célula. 105. El método de acuerdo con la reivi ndicación 101 , en donde las primera y segunda secuencias de señal son la misma secuencia de señal , los primero y segundo antígenos sop diferentes antígenos y los primero y segundo elementos de un ión de célula son elementos d e unión de cél u la d iferentes. J^ ¡^ ^^-^u, - - t^** ^ **** ** -^ ~ , Inji-f 11 106. El método de acuerdo con la reivindicación 101, en donde las primera y segunda secuencias de señal son diferentes secuencias de señal, los primero y segundo antígenos son diferentes antígenos y los primero y segundo elementos de unión de célula son diferentes elementos de unión de célula. 107. El método de acuerdo con la reivindicación 101, en donde la secuencia de polinucléotido que codifica la primera proteína de fusión y ta secuencia de polinucléotído que codifica la segunda proteína de fusión están bajo el control transcripcional separado, y en donde la secuencia de polinucléotido que codifica la primera proteína de fusión y la secuencia de polinucléotido que codifica la segunda proteína de fusión están en tándem- en urt v/ßefdf -sjif expresión. 108. Un método para inducir simultáneamente células T tanto CD4+ como CD8 + , que comprende los pasos de adminislraf uftás proteína de fusión, en donde la proteína comprende un epítopo de MHC-I y MCH-II fusionado a un elemento de unión de célula. 109. Un método para producir una proteína de fusión, que comprende los pasos de: transducir una célula de presentación de antígeno introduciendo un vector de expresión a la célula de presentación de antígeno para producir una célula de presentación de antígeno transducída, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica un ¡^^feü antígeno, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados; y expresar el vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones, en donde la proteína de fusión es secretada de ta célula. 110. Un método para administrar una proteína de fusión, que comprende administrar células de presentación de antígeno transducídas con la proteína de fusión in vitro antes de administrarse a un mamífero. 111. Un método para administrar una proteína de fusión, que comprende administrar la proteína de fusión parenteralmente a un mamífero. 112. Un método para secretar una proteína intracelular, que comprende tos pasos de: introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polinucléotido que codifica una secuencia de señal, un polinucléotido que codifica una proteína intracelular, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados; y expresar el vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones en donde la proteína de fusión es secretada de la célula. 113. El método de acuerdo con la reivindicación 112, en donde una región del polinucléotido que codifica una proteína intracelular es truncada para incrementar la eficiencia de secreción. 114. El método de acuerdo con la reivindicación 112, en donde una región del polinucléotido que codifica una proteína intracelular es mutada para incrementar la eficiencia de secreción. 115. El método de acuerdo con la reivindicación 112, en donde el polinucléotido que codifica una proteína intracelular es HPV 16 E7. 116. Un método para secretar una proteína de membrana que comprende los pasos de: introducir un vector de expresión a una célula, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de promotor de polinucléotido, un polínucléotido que codifica una secuencia de, señal, un polinucléotido que codifica una proteína de membrana, un polinucléotido que codifica un elemento de unión de célula, y una secuencia de poliadenilación de polinucléotido, todos operativamente enlazados; y expresar el vector para producir una proteína de fusión bajo condiciones en donde la proteína de fusión es secretada de la célula. 117. El método de acuerdo con la reivindicación 116, en donde una región de dicho polinucléotido que codifica una proteína de membrana es truncada para incrementar la eficiencia de secreción. 118. El método de acuerdo con la reivindicación 116, en donde una región del polinucléotido que codifica una proteína de membrana es mutada para incrementar la eficiencia de secreción. 119. El método de acuerdo con la reivindicación 116, en donde el polinucléotido que codifica una proteína de membrana es el antígeno nuclear 1 de EBV. A A.. U?AAtatt? ... ...AAI^^AA?At