JP2003528573A - 免疫応答を導き出す抗原を同定するための組成物および方法 - Google Patents

免疫応答を導き出す抗原を同定するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は発現ベクターに関し、ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原タンパク質もしくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成る。より具体的には、それは、発現ベクターを細胞中に導入すること、抗原が細胞から分泌される条件下で該ベクターを発現させて抗原を産生させること、分泌された抗原を細胞にエンドサイトーシスすること、抗原をプロセシングすること、およびフラグメントを受容体に提示してＴ細胞応答を導き出すこと、の段階を含んで成る、哺乳動物における抗原に対し向けられる免疫応答を導き出す方法に関する。加えて、本発明はワクチンおよび使用方法に関する。本発明はまた、ＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープの同定方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、哺乳動物における完全な免疫応答を導き出すための発現ベクターお
よびその使用に関する。より具体的には、それはＭＨＣ−ＩＩ上での提示のため
の外来抗原としての内在性抗原のプロセシングに関する。本発明は哺乳動物を免
疫感作する（ｉｍｍｕｎｉｚｅ）ためのワクチンおよびその使用方法にもまた関
する。
【０００２】 （発明の背景） ヒトにおける不十分な抗原提示は、ヒトの免疫系の、多くの病原性感染症およ
び悪性の細胞成長を制御かつ一掃することの失敗をもたらす。慢性感染症および
癌のための成功裏の治療用ワクチンおよび免疫療法は、攻撃的抗原を制御かつ一
掃することが可能である活発な免疫応答を誘導するための効率的な抗原提示への
新たなアプローチの開発に頼っている。
【０００３】 抗原を認識するＴ細胞の能力は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）もしくはクラ
スＩＩ（ＭＣＨ−ＩＩ）いずれかのタンパク質との抗原の会合に依存する。例え
ば、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉタンパク質と共同して抗原に応答する。従
って、ウイルスに感染した細胞を殺す細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞が適切なＭＨＣ
−Ｉタンパク質もまた発現しない場合には、同一のウイルスに感染した細胞を殺
すことができない。ヘルパーＴ細胞はＭＨＣ−ＩＩタンパク質を認識する。ヘル
パーＴ細胞の活性は、一般に、抗原提示細胞上の抗原の認識および「自己」ＭＨ
Ｃ−ＩＩタンパク質のこれらの細胞上での存在の双方に依存する。自己のＭＨＣ
タンパク質と共同して抗原を認識するためのこの要件はＭＨＣ拘束と呼ばれる。
ＭＨＣ−１タンパク質は、事実上全部の有核細胞の表面上で見出される。ＭＨＣ
−ＩＩタンパク質は、マクロファージ、Ｂ細胞、ならびに脾の樹状細胞および皮
膚のランゲルハンス細胞を包含するある種の細胞の表面上で見出される。
【０００４】 哺乳動物での免疫応答の装備における決定的に重要な一段階は、主要組織適合
遺伝子複合体（ＭＨＣ）−ＩＩに拘束される外来抗原を認識するＣＤ４＋ ヘル
パーＴ細胞の活性化である。これらの抗原は、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提
示細胞中の細胞のエンドソーム経路で捕捉かつプロセシングされる（Ｚａｊａｃ
ら、１９９８；Ｂｏｎａら、１９９８；Ｋａｌａｍｓら、１９９８；Ｍｅｌｌｍ
ａｎら、１９９８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８）。エンドソームおよび
リソゾームにおいて、抗原は小さな抗原性ペプチドにプロセシングされ、それら
がゴルジ区画中でＭＨＣ−ＩＩ上に提示されて抗原−ＭＨＣ−ＩＩ複合体を形成
する。この複合体が細胞表面上で発現され、この発現がＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性
化を誘導する。
【０００５】 動物での効果的な免疫応答の誘導における他の決定的に重要な事象は、ＣＤ８
＋ Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を必要とする。ＣＤ８＋細胞は、所望のタンパ
ク質がプロセシングされたタンパク質（ＭＨＣ−Ｉ抗原と複合体形成される）と
して細胞表面上に提示されるような様式で、細胞を通って送られる場合に活性化
される。Ｂ細胞は、ＭＨＣタンパク質の必要なしにそれらの表面免疫グロブリン
（ＩｇＭおよびＩｇＤ）を介して抗原と相互作用することができる。しかしなが
ら、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化は免疫系の全部の部門（ａｒｍ）を刺激する。活
性化に際して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）はインターロイキンを産生
する。これらのインターロイキンは、免疫系の他の部門を活性化するのを助ける
。例えば、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞が抗体を産生するのを助けるインターロイ
キン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ−５）；ＣＤ４＋およ
びＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化するインターロイキン−２（ＩＬ−２）；ならびに
マクロファージを活性化するγ−インターフェロンを産生する。
【０００６】 ＭＨＣ−ＩＩに拘束される抗原を認識するヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細
胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびＢ細胞の活性化およびクロー
ン拡張において中心的な役割を担っているため、抗原に応答してのヘルパーＴ細
胞の活性化の最初の事象は、その抗原に対し向けられる効果的な免疫応答の誘導
に決定的に重要である。リソゾームの膜貫通タンパク質由来の配列を使用してヘ
ルパーＴ細胞の活性化を刺激する試みが報告されている（Ｗｕ、１９９５）。し
かしながら、これらの試みは、試験されている哺乳動物のＣＤ８＋ Ｔ細胞およ
びＢ細胞に関して効果的な免疫応答の誘導をもたらさなかった。
【０００７】 従って、哺乳動物における疾患の治療のため免疫応答を導き出す効率的かつ指
向された手段に対する、当該技術分野で長く痛切に感じられる必要性が存在する
。本発明はこの必要性を満足する。
【０００８】 （発明の要約） 本発明の一態様は、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモー
ター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリ
ヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チドポリアデニル化配列を含んで成る発現ベクターである。
【０００９】 本発明の特定の態様において、ポリヌクレオチドプロモーター配列は、構成プ
ロモーター、誘導可能なプロモーターおよび組織特異的プロモーターより成る群
から選択される。
【００１０】 本発明の別の特定の態様において、シグナル配列をコードするポリヌクレオチ
ドは、Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原シグナル配列、免疫グロブリン重鎖リーダー配列
およびサイトカインリーダー配列より成る群から選択される。
【００１１】 本発明の一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチドが最低１種のエピトー
プのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで前記最低１
種のエピトープは哺乳動物におけるＢ細胞応答を誘導する。
【００１２】 本発明のさらなる一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチドが最低１種の
エピトープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで前
記最低１種のエピトープは哺乳動物におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００１３】 本発明の別の態様は、抗原をコードするポリヌクレオチドが最低１種のエピト
ープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで前記最低
１種のエピトープは哺乳動物におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００１４】 本発明の特定の一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチド配列が最低１種
のエピトープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで
前記最低１種のエピトープは、前記抗原が導入される哺乳動物におけるＢ細胞応
答、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００１５】 本発明のさらなる特定の一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチド配列が
複数のエピトープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、こ
こで前記複数のエピトープは、前記抗原が導入される哺乳動物におけるＢ細胞応
答、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００１６】 本発明のさらなる一態様は、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドが細
胞表面受容体に結合するリガンドのポリヌクレオチド配列である発現ベクターで
ある。特定の態様において、細胞結合要素配列は、Ｆｃフラグメント、トキシン
細胞結合ドメイン、サイトカイン、小ペプチドおよび抗体をコードするポリヌク
レオチド配列より成る群から選択される。特定の態様において、細胞結合要素を
コードするポリヌクレオチドは、同種のポリヌクレオチド配列もしくは異種のポ
リヌクレオチド配列である。
【００１７】 本発明の付加的な一態様は、発現ベクターを含んで成る形質転換された細胞で
あり、ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレ
オチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原を
コードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成る。
【００１８】 本発明の別の特定の態様は融合タンパク質であり、ここで、該融合タンパク質
は、シグナル配列、抗原および細胞結合要素を含んで成る。特定の態様において
、抗原提示細胞がインビトロで該融合タンパク質で形質導入されている。さらな
る態様において、融合タンパク質は哺乳動物に直接投与される。
【００１９】 本発明の特定の一態様は発現ベクターを含んで成るワクチンであり、ここで、
前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモー
ター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリ
ヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チドポリアデニル化配列を含んで成る。特定の態様において、ワクチンは抗原提
示細胞を含んで成り、ここで、前記抗原提示細胞は発現ベクターでインビトロで
形質導入される。さらなる態様において、ワクチンは抗原提示細胞を含んで成り
、ここで、前記抗原提示細胞は融合タンパク質でインビトロで形質導入される。
【００２０】 本発明の別の特定の態様は、少なくとも、シグナル配列をコードするポリヌク
レオチド、抗原をコードするポリヌクレオチドおよび細胞結合要素をコードする
ポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクターである。
【００２１】 本発明のさらなる一態様は：発現ベクターを細胞中に導入すること（ここで、
前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモー
ター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリ
ヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チドポリアデニル化配列を含んで成り）；ならびに抗原が細胞から分泌される条
件下で前記ベクターを発現させて前記抗原を産生させることであって；前記分泌
された抗原は細胞中にエンドサイトーシスされ；前記エンドサイトーシスされた
抗原が細胞の内側でプロセシングされ；そして前記プロセシングされた抗原が細
胞表面タンパク質に提示されて、Ｔ細胞に媒介される免疫応答を導き出す、の段
階を含んで成る、抗原に対し向けられる免疫応答を導き出す方法である。特定の
態様において、抗原は第一の細胞により分泌されかつ第二の細胞によりインター
ナリゼーションされ、ここで、第一および第二の細胞は抗原提示細胞である。さ
らなる態様において、第一の細胞は非抗原提示細胞でありかつ第二の細胞は抗原
提示細胞である。
【００２２】 本発明の別の特定の態様は、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可
能である最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコードするポリヌク
レオチド配列の同定方法であって、前記方法は：発現ベクターを抗原提示細胞中
に導入して、形質導入された抗原提示細胞を産生させること（ここで、前記発現
ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列
、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチドポリアデニル化配列を含んで成り）；前記形質導入された抗原提示細胞
を、処理を受けたことのない（ｎａｉｖｅ）もしくはプライミングされた（ｐｒ
ｉｍｅｄ）Ｔ細胞と接触させること；ならびに、いずれかの処理を受けたことの
ないＴ細胞もしくはプライミングされたＴ細胞が前記形質導入された抗原提示細
胞との接触に際して活性化されるかどうかを評価すること（ここで、前記Ｔ細胞
のいずれかの活性化が、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがＣＤ
４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメン
トであることを示す）の段階を含んで成る。特定の態様において、試験ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、寄生虫ゲ
ノムおよびヒトゲノムより成るｃＤＮＡライブラリーの群から選択される。
【００２３】 本発明の別の態様は、インビボで免疫応答を導き出すことが可能である、最低
１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコードするポリヌクレオチド配列
の同定方法であって、前記方法は：発現ベクターを抗原提示細胞中に導入して形
質導入された抗原提示細胞を産生させること（ここで、前記発現ベクターは、全
部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列
をコードするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリア
デニル化配列を含んで成り）；前記形質導入された抗原提示細胞を、非経口経路
を介して哺乳動物に投与すること；脾細胞からＴ細胞を収集すること、および樹
状細胞と共培養すること；ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ
細胞の前記活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ
４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメン
トであることを示す）、の段階を含んで成る。特定の態様において、試験ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、寄生虫
ゲノムおよびヒトゲノムより成るｃＤＮＡライブラリーの群から選択される。
【００２４】 本発明の特定の一態様は、インビボで免疫応答を導き出すことが可能である、
最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコードするポリヌクレオチド
配列の同定方法であって、前記方法は：非経口経路を介して発現ベクターを哺乳
動物に投与すること（ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結され
た、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレ
オチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコー
ドするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成
り）；前記形質導入された抗原提示細胞を、非経口経路を介して哺乳動物に投与
すること；脾細胞からＴ細胞を収集すること、および樹状細胞と共培養すること
；ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、試
験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を
活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメントであることを示す）、
の段階を含んで成る。特定の態様において、試験ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドは、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、寄生虫ゲノムおよびヒトゲノム
より成るｃＤＮＡライブラリーの群から選択される。
【００２５】 本発明の特定の一態様は、最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープを
コードする試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、抗
原提示細胞中への発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入して形質導入された抗
原提示細胞を産生させる条件下で同定され、ここで、前記発現ベクターは、全部
が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列を
コードするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデ
ニル化配列を含んで成り）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、
Ｔ細胞の前記活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、Ｃ
Ｄ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメ
ントであることを示し）；ならびに非経口経路を介して抗原提示細胞を哺乳動物
に投与すること（ここで、前記抗原提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入され
る）、の段階を含んで成る、癌の治療方法である。
【００２６】 本発明の別の特定の態様は、最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープ
をコードする試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、
抗原提示細胞中への発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入して形質導入された
抗原提示細胞を産生させる条件下で同定され、ここで、前記発現ベクターは、全
部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列
をコードするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリア
デニル化配列を含んで成り）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで
、Ｔ細胞の前記活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグ
メントであることを示し）；ならびに非経口経路を介して発現ベクターを哺乳動
物に投与すること（ここで、前記発現ベクターは、少なくとも、試験ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドおよび細胞結合要素をコードするポリヌクレオ
チドを含んで成り、前記抗原提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入される）の
段階を含んで成る、癌の治療方法である。
【００２７】 本発明のさらなる特定の一態様は、最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピ
トープをコードする試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチ
ドは、抗原提示細胞中への発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入して形質導入
された抗原提示細胞を産生させる条件下で同定され、ここで、前記発現ベクター
は、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナ
ル配列をコードするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド
ポリアデニル化配列を含んで成り）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（
ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはその
フラグメントであることを示し）；ならびに非経口経路を介して抗原提示細胞を
哺乳動物に投与すること（ここで、前記抗原提示細胞は試験ポリペプチドで形質
導入される）の段階を含んで成る、ウイルス感染症の治療方法である。
【００２８】 本発明の別の態様は、最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコー
ドする試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、抗原提
示細胞中への発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入して形質導入された抗原提
示細胞を産生させる条件下で同定され、ここで、前記発現ベクターは、全部が操
作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコー
ドするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細
胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル
化配列を含んで成り）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細
胞の前記活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４
＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメント
であることを示し）；ならびに非経口経路を介して発現ベクターを哺乳動物に投
与すること（ここで、前記発現ベクターは、少なくとも、試験ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドおよび細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドを
含んで成り、前記抗原提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入される）、の段階
を含んで成る、ウイルス感染症の治療方法である。
【００２９】 本発明の別の態様は、最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコー
ドする試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、抗原提
示細胞中への発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入して形質導入された抗原提
示細胞を産生させる条件下で同定され、ここで、前記発現ベクターは、全部が操
作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコー
ドするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細
胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル
化配列を含んで成り）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細
胞の前記活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４
＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメント
であることを示し）；ならびに非経口経路を介して哺乳動物に抗原提示細胞を投
与すること（ここで、前記抗原提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入される）
、の段階を含んで成る、自己免疫疾患の治療方法である。
【００３０】 本発明の特定の一態様は、最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープを
コードする試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、抗
原提示細胞中への発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入して形質導入された抗
原提示細胞を産生させる条件下で同定され、ここで、前記発現ベクターは、全部
が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列を
コードするポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデ
ニル化配列を含んで成り）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、
Ｔ細胞の前記活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、Ｃ
Ｄ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメ
ントであることを示し）；ならびに非経口経路を介して発現ベクターを哺乳動物
に投与すること（ここで、前記発現ベクターは、少なくとも、試験ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドおよび細胞結合要素をコードするポリヌクレオチ
ドを含んで成り、前記抗原提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入される）、の
段階を含んで成る、自己免疫疾患の治療方法である。
【００３１】 本発明のさらなる一態様は：細胞中に発現ベクターを導入することにより抗原
提示細胞を形質導入すること（ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可能に
連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポ
リヌクレオチド、抗原をコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードす
るポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）
；ならびに、抗原が細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記
抗原を産生させること、の段階を含んで成る、哺乳動物を免疫感作するためのワ
クチンの製造方法である。特定の態様において、抗原提示細胞は、哺乳動物に抗
原提示細胞を投与する前にインビトロもしくはエクスビボで抗原で形質導入され
る。
【００３２】 本発明の別の特定の態様は、サイトカイン発現ベクターおよびレトロゲン（ｒ
ｅｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターを哺乳動物に共投与すること（ここで、レトロゲ
ン発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモータ
ー配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリヌ
クレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチ
ドポリアデニル化配列を含んで成る）の段階を含んで成る、免疫応答の誘導方法
である。
【００３３】 本発明のさらなる一態様は、哺乳動物に１個の発現ベクターを共投与すること
（ここで、前記発現ベクターは、１個のプロモーターの転写制御下にサイトカイ
ンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列および融合タンパク質をコード
するポリヌクレオチド配列を含んで成り、ここで前記融合タンパク質は抗原およ
び細胞結合要素を含んで成る）の段階を含んで成る、免疫応答の誘導方法である
。特定の態様において、サイトカインタンパク質をコードするポリヌクレオチド
配列および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は別個の転写制御
下にあり、また、ここで、サイトカインタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド配列および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は１個の発現ベ
クター中で縦列にある。
【００３４】 本発明の別の態様は、哺乳動物に２種の異なるレトロゲン発現ベクターを共投
与すること（ここで、第一のレトロゲン発現ベクターは、全部が操作可能に連結
された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌ
クレオチド、第一の抗原をコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコード
するポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成り
；また、第二のレトロゲン発現ベクターは、全部が操作可能にポリヌクレオチド
プロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、第二の抗原を
コードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成る）の段階を含んで成る、免
疫応答の誘導方法である。
【００３５】 本発明の別の特定の態様は、哺乳動物に１種の発現ベクターを投与すること（
ここで、前記発現ベクターは、１個のプロモーターの転写制御下に第一の融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列および第二の融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド配列を含んで成り、ここで前記第一の融合タンパク質は
第一の抗原および第一の細胞結合要素を含んで成り、かつ、前記第二の融合タン
パク質は第二の抗原および第一の細胞結合要素を含んで成る）の段階を含んで成
る、免疫応答の誘導方法である。特定の態様において、第一および第二の抗原は
異なる抗原であり、かつ、細胞結合要素はＦｃフラグメントである。さらなる態
様において、第一および第二の抗原は異なる抗原であり、かつ、第一および第二
の細胞結合要素は異なる細胞結合要素である。付加的な一態様は、第一の融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列および第二の融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド配列が別個の転写制御下にあり、かつ、ここで、第一の
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列および第二の融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチド配列が１個の発現ベクター中で縦列にあることを
包含する。
【００３６】 本発明の特定の一態様は、融合タンパク質を投与すること（ここで、該タンパ
ク質は細胞結合要素に融合されたＭＨＣ−１およびＭＨＣ−ＩＩ双方のエピトー
プを含んで成る）の段階を含んで成る、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のＴ細胞の
同時誘導方法である。
【００３７】 本発明のさらなる一態様は、発現ベクターを細胞中に導入すること（ここで、
前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモー
ター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリ
ヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チドポリアデニル化配列を含んで成り）、ならびに、融合タンパク質が細胞から
分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記融合タンパク質を産生させる
こと、の段階を含んで成る、融合タンパク質の製造方法である。特定の態様にお
いて、抗原提示細胞はインビトロで融合タンパク質で形質導入される。
【００３８】 本発明の特定の一態様は、細胞中に発現ベクターを導入すること（ここで、前
記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモータ
ー配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、細胞内タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポ
リヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成る）、ならびに、融合タンパク質
が細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記融合タンパク質を
産生させること、の段階を含んで成る、細胞内タンパク質の分泌方法である。よ
り具体的には、該細胞内タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、分泌
の効率を増大させるよう短縮もしくは突然変異される。
【００３９】 本発明の別の特定の態様は、細胞に発現ベクターを導入すること（ここで、前
記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモータ
ー配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、膜タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌ
クレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）、ならびに、融合タンパク質が細
胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記融合タンパク質を産生
させること、の段階を含んで成る、膜タンパク質の分泌方法である。より具体的
には、膜タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、分泌の効率を増大さ
せるよう短縮もしくは突然変異される。
【００４０】 （詳細な記述） 本発明の範囲および技術思想から離れることなく本明細書に開示される本発明
に対し多様な態様および改変を作成してよいことが、当業者に容易に明らかであ
る。
【００４１】 本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原上の特定のエピト
ープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、
天然の供給源もしくは組換え供給源由来の無傷の免疫グロブリンであることがで
き、また、無傷の免疫グロブリンの免疫活性の部分であることができる。抗体は
、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えばポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）2、なら
びに一本鎖抗体および人化抗体を包含する多様な形態で存在することができる（
Ｈａｒｌｏｗら、１９８８；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８；Ｂｉｒｄら、１９８
８）。
【００４２】 本明細書で使用されるところの「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす
分子と定義する。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫学的に能力の
ある細胞の活性化のいずれか、または双方を必要とすることができる。抗原は、
生物体、タンパク質／抗原のサブユニット、殺されたもしくは不活性化された全
細胞またはライセート由来であることができる。例示的生物体は、限定されるも
のでないがヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、カンピロバクター
属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
ｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、インフルエン
ザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ボレリア ブルグド
ルフェイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ）、プラスモディウム属（
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、単純疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピロー
マウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、麻疹ウイルス、ロタウイルス、シガエラ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）を
挙げることができる。従って、当業者は、事実上全部のタンパク質もしくはペプ
チドを包含するいかなる巨大分子も抗原として作用することができることを十分
に理解する。さらに、抗原は組換えもしくはゲノムＤＮＡ由来であることができ
る。当業者は、病原性のゲノムまたは免疫応答を導き出すタンパク質の遺伝子も
しくは遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列もしくは部分的ヌクレオチド配
列を含有するいかなるＤＮＡも、抗原の合成をもたらすことを十分に理解する。
さらに、当業者は、本発明が遺伝子もしくはゲノムの核酸配列全体の使用に限定
されないことを十分に理解する。本発明は、限定されるものではないが１種以上
の遺伝子もしくはゲノムの部分的核酸配列の使用を挙げることができること、お
よび、これらの核酸配列は所望の免疫応答を導き出すように多様な組み合わせで
配置されることが、容易に内在する。
【００４３】 本明細書で使用されるところの「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答
に由来する障害と定義する。自己免疫は自己抗原に対する不適切かつ過剰の応答
である。例は、限定されるものでないが、アジソン病、グレーヴズ病、Ｉ型糖尿
表、多発性硬化症、粘液水腫、悪性貧血、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデスおよび潰瘍性大腸炎を挙げることができる。
【００４４】 本明細書で使用されるところの「癌」という用語は、その独特の特質（正常な
制御の喪失）が無秩序な成長、分化の欠失、局所の組織浸潤および転移をもたら
す細胞の増殖を定義する。例は、限定されるものでないが乳癌、前立腺癌、卵巣
癌、子宮頸部癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌および肺癌を挙げることがで
きる。
【００４５】 本明細書で使用されるところの「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」と
いう用語は互換性に使用することができる。これらの用語の全部は、いずれかの
および全部のその後の世代であるそれらの子孫もまた包含する。全部の子孫は故
意のもしくは偶然の突然変異により同一でなくてもよいことが理解される。
【００４６】 本明細書で使用されるところの「細胞結合要素」という用語は、細胞膜上の受
容体に結合することが可能であるタンパク質の一部分と定義する。
【００４７】 本明細書で使用されるところの「ＤＮＡ」という用語はデオキシリボ核酸と定
義する。
【００４８】 本明細書で使用されるところの「樹状細胞」もしくは「ＤＣ」という用語は、
骨髄由来の抗原提示細胞の一例と定義する。
【００４９】 本明細書で使用されるところの「エピトープ」という用語は、抗体を導き出し
かつそれと反応することができる抗原分子上の小さな化学的群と定義する。抗原
は１種もしくはそれ以上のエピトープを有する可能性がある。大部分の抗原は多
くのエピトープを有する。すなわち、それらは多価である。一般に、１個のエピ
トープは大きさがおよそ５アミノ酸もしくは糖である。当業者は、一般に、分子
の特定の直線的配列よりはむしろ全体的な三次元構造が抗原特異性の主な基準で
あることを理解する。
【００５０】 本明細書で使用されるところの「発現」という用語は、そのプロモーターによ
り駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／もしくは翻訳と定義する。
【００５１】 本明細書で使用されるところの「発現ベクター」という用語は、転写されるこ
とが可能な遺伝子産物の少なくとも部分をコードする核酸配列を含有するベクタ
ーを指す。いくつかの場合においては、ＲＮＡ分子がその後タンパク質、ポリペ
プチドもしくはペプチドに翻訳される。他の場合、例えばアンチセンス分子もし
くはリボザイムの産生においては、これらの配列は翻訳されない。発現ベクター
は多様な制御配列を含有することができ、これは、特定の宿主生物体中での操作
可能に連結されたコーディング配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列
を指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する制御配列に
加え、同様に他の機能も提供する核酸配列を含有してよく、かつ下述される。
【００５２】 本明細書で使用されるところの「ヘルパーＴ細胞」という用語は、その主機能
が他のＢおよびＴリンパ球ならびにマクロファージの活性化および機能を促進す
ることであるエフェクターＴ細胞と定義する。大部分はＣＤ４ Ｔ細胞である。
【００５３】 本明細書で使用されるところの「異種」という用語は、異なる種由来であるＤ
ＮＡもしくはＲＮＡ配列またはタンパク質と定義する。
【００５４】 本明細書で使用されるところの「同種」という用語は、同一種由来であるＤＮ
ＡもしくはＲＮＡ配列またはタンパク質と定義する。
【００５５】 本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語は、異種核酸配列を発
現している細胞と定義する。
【００５６】 本明細書で使用されるところの「免疫グロブリン」もしくは「Ｉｇ」という用
語は、抗体として機能する一分類のタンパク質と定義する。この分類のタンパク
質に包含される５種のメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇ
Ｅである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳のような体分泌物、消化管分泌物ならびに
気道および尿生殖管の粘液分泌物中に存在する一次抗体として機能する。ＩｇＧ
は最も普遍的な循環抗体として機能する。ＩｇＭは一次応答において産生される
主要な免疫グロブリンである。それは、凝集反応、補体固定および他の抗体応答
において最も有効な免疫グロブリンであり、また、細菌およびウイルスに対する
防禦で重要である。ＩｇＤは既知の抗体機能を有しない免疫グロブリンであるが
、しかし抗原受容体として作用するかもしれない。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝
露に際して肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすこ
とにより即時の過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００５７】 本明細書で使用されるところの「主要組織適合遺伝子複合体」もしくは「ＭＨ
Ｃ」という用語は、その多くが組織適合性の最も重要な決定子のひとつである、
抗原提示に関与する進化的に関係した細胞表面タンパク質をコードする、遺伝子
の特定の一クラスターと定義する。クラスＩ ＭＨＣもしくはＭＨＣ−Ｉは、主
としてＣＤ８ Ｔリンパ球への抗原提示において機能する。クラスＩＩ ＭＨＣ
もしくはＭＨＣ−ＩＩは、主としてＣＤ４ Ｔリンパ球への抗原提示において機
能する。
【００５８】 本明細書で使用されるところの「ポリヌクレオチド」という用語はヌクレオチ
ドの鎖と定義する。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。従って、本
明細書で使用されるところの核酸およびポリヌクレオチドは互換性である。当業
者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それは単量体の「ヌクレオチド」に加水
分解することができるという一般的知識を有する。単量体のヌクレオチドはヌク
レオシドに加水分解することができる。本明細書で使用されるところのポリヌク
レオチドは、限定されるものでないが、組換え手段（すなわち通常のクローニン
グ技術およびＰＣＲ（商標）などを使用する組換えライブラリーもしくは細胞ゲ
ノムからの核酸配列のクローニング）を限定なしに包含する当該技術分野で利用
可能ないずれかの手段、ならびに合成手段により得られる全部の核酸配列を挙げ
ることができる。さらに、当業者は、ポリヌクレオチドが、限定されるものでな
いが当該技術分野で公知の方法によるヌクレオチドもしくはヌクレオシドの突然
変異を挙げることができるポリヌクレオチドの突然変異を、制限を伴い包含する
ことを認識している。
【００５９】 本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」という用語は、通常は定義さ
れた配列を有するアミノ酸残基の鎖と定義する。本明細書で使用されるところの
ポリペプチドという用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語を相
互に包含する。
【００６０】 本明細書で使用されるところの「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオ
チド配列の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構もしくは導
入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列と定義する。
【００６１】 本明細書で使用されるところの「レトロゲン」もしくは「レトロゲン融合タン
パク質」という用語は、本明細書に記述されるとおり発現かつプロセシングされ
る場合に、哺乳動物中で免疫応答を導き出すことが可能であるエピトープを有す
るポリペプチドを意味し、ここで、該ポリペプチドは細胞結合要素に融合される
。
【００６２】 本明細書で使用されるところの「レトロゲン発現ベクター」という用語は、シ
グナル配列、抗原および細胞結合要素をコードする最低１種のポリペプチド配列
を含んで成る発現ベクターを指す。
【００６３】 本明細書で使用されるところの「ＲＮＡ」という用語はリボ核酸と定義する。
【００６４】 本明細書で使用されるところの「組換えＤＮＡ」という用語は、異なる供給源
からのＤＮＡの片を結合することにより製造されるＤＮＡと定義する。
【００６５】 本明細書で使用されるところの「組換えポリペプチド」という用語は、組換え
ＤＮＡの方法を使用することにより産生されるハイブリッドタンパク質と定義す
る。
【００６６】 本明細書で使用されるところの「Ｔ細胞」という用語は、多様な細胞に媒介さ
れる免疫反応に参画する胸腺由来細胞と定義する。
【００６７】 本明細書で使用されるところの「トランスフェクションされた」もしくは「形
質転換された」もしくは「形質導入された」という用語は、それにより外来核酸
が宿主細胞中に移入もしくは導入される方法を指す。形質転換された細胞は一次
被験体細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｕｂｊｅｃｔ ｃｅｌｌ）およびその子孫を包
含する。
【００６８】 本明細書で使用されるところの「転写制御下」もしくは「操作可能に連結され
た」という句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始およびポリヌクレ
オチドの発現を制御するようにポリヌクレオチドに関して正しい位置および向き
にあることを意味する。
【００６９】 本明細書で使用されるところの「ワクチン」という用語は、哺乳動物への該物
質の投与後に免疫応答を引き起こしそして従って免疫を賦与するのに使用される
物質と定義する。
【００７０】 本明細書で使用されるところの「ウイルス」という用語は、全細胞内で複製し
かつ細胞から細胞へ広がることのみが可能である、外側の脂質エンベロープをも
つもしくはもたないタンパク質コート中に閉じ込められた核酸（ＲＮＡもしくは
ＤＮＡ）より成る粒子と定義する。
【００７１】 本発明の一態様は、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモー
ター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリ
ヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チドポリアデニル化配列を含んで成る発現ベクターである。
【００７２】 特定の態様において、融合タンパク質（抗原−細胞結合要素）をコードする核
酸配列がプロモーターの転写制御下にある。プロモーターがどのように構成され
るかについての見解の多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０
初期転写ユニットに関するものを包含する数種のウイルスプロモーターの分析か
ら生じる。より最近の業績により増大されるこれらの研究は、プロモーターが別
個の機能モジュールから構成され、それぞれがおよそ７〜２０ｂｐのＤＮＡより
成り、そして転写アクチベーターもしくはリプレッサータンパク質のための１個
もしくはそれ以上の認識部位を含有することを示した。
【００７３】 各プロモーター中の最低１個のモジュールが、ＲＮＡ合成のための開始部位の
位置を定めるよう機能する。これの最も良く知られた例はＴＡＴＡボックスであ
るが、しかし、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝
子のプロモーターおよびＳＶ４０遺伝子のプロモーターのようなＴＡＴＡボック
スを欠く数種のプロモーターにおいては、開始部位それ自身の上に横たわる別個
の要素が開始の場所を固定するのを助ける。
【００７４】 付加的なプロモーター要素（すなわちエンハンサー）が転写開始の頻度を調節
する。典型的には、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に配置され
るが、とは言え多数のプロモーターが開始部位の下流に同様に機能的要素を含有
することが最近示されている。プロモーター要素間の空間は頻繁に順応性があり
、その結果、要素が相互に関して逆転されるかもしくは動かされる場合にプロモ
ーター機能が保存される。ｔｋプロモーターにおいては、プロモーター要素間の
空間を、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れるまで増大させることができる。
プロモーターに依存して、個々の要素は転写を活性化するように協同してもしく
は独立にのいずれかで機能することができるようである。
【００７５】 プロモーターは、コーディングセグメントおよび／もしくはエキソンの上流に
配置される５’−非コーディング配列を単離することにより得ることができるよ
うな、遺伝子もしくはポリヌクレオチド配列と本来関連するものであることがで
きる。こうしたプロモーターは「内在性」と称することができる。同様に、エン
ハンサーは、その配列の下流もしくは上流のいずれかに配置されたポリヌクレオ
チド配列と本来関連するものであることができる。あるいは、組換えもしくは異
種のプロモーター（その天然の環境においてポリヌクレオチド配列と通常は関連
しないプロモーターを指す）の制御下にコーディングポリヌクレオチドセグメン
トを配置することにより、ある種の利点を得ることができる。組換えもしくは異
種のエンハンサーは、その天然の環境下でポリヌクレオチド配列と通常は関連し
ないエンハンサーもまた指す。こうしたプロモーターもしくはエンハンサーは、
他の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー、ならびにいずれかの他の原核
生物、ウイルスもしくは真核生物細胞から単離されたプロモーターもしくはエン
ハンサー、ならびに「天然に存在」（すなわち異なる転写調節領域の異なる要素
および／もしくは発現を変える突然変異を含有する）しないプロモーターもしく
はエンハンサーを包含することができる。プロモーターおよびエンハンサーの核
酸配列を合成的に製造することに加え、配列は、本明細書に開示される組成物と
ともに、組換えクローニングおよび／もしくはＰＣＲ（商標）を包含する核酸増
幅技術を使用して製造することができる（米国特許第４，６８３，２０２号、米
国特許第５，９２８，９０６号明細書）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体など
のような非核小器官内での配列の転写および／もしくは発現を指図する制御配列
を同様に使用することができることを企図している。
【００７６】 自ずから、発現のために選ばれた細胞型、小器官および生物体中でのＤＮＡセ
グメントの発現を効果的に指図するプロモーターおよび／もしくはエンハンサー
を使用することが重要であることができる。分子生物学の当業者は、タンパク質
発現のためにプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせをどのよう
に使用するかを一般に知っている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を
参照されたい。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導可能、な
らびに／または組換えタンパク質および／もしくはペプチドの大スケール製造で
有利であるもののような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指図す
るのに適切な条件下で有用であることができる。プロモーターは異種もしくは同
種であることができる。
【００７７】 本明細書に提示される実験例で例示されるプロモーター配列は、前初期サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、
それに操作可能に連結されたいかなるポリヌクレオチド配列の高レベル発現も駆
動することが可能な強力な構成プロモーター配列である。しかしながら、限定さ
れるものでないがＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、
モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイ
ン−バーウイル前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならび
に限定されるものでないがアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモ
グロビンプロモーターおよび筋クレアチンプロモーターのようなヒト遺伝子プロ
モーターを挙げることができる他の構成プロモーター配列もまた使用することが
できる。さらに、本発明は構成プロモーターの使用に限定されるべきでない。誘
導可能なプロモーターもまた本発明の一部として企図している。本発明における
誘導可能なプロモーターの使用は、こうした発現が所望される場合にそれが操作
可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現のスイッチを入れる、もしくは発
現が所望されない場合に発現のスイッチを切ることが可能な分子スイッチを提供
する。誘導可能なプロモーターの例は、限定されるものでないがメタロチオネイ
ンプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター
およびテトラサイクリンプロモーターを挙げることができる。さらに、本発明は
、組織特異的プロモーターの使用を包含し、そのプロモーターは所望の組織にお
いてのみ活性である。組織特異的プロモーターは当該技術分野で公知であり、か
つ、限定されるものでないがＨＥＲ−２プロモーターおよびＰＳＡ関連プロモー
ター配列を挙げることができる。
【００７８】 本発明の特定の態様においては、発現ベクターは、シグナル配列をコードする
ポリヌクレオチドを含んで成り、それは、タンパク質が細胞から分泌されるため
に、それによりコードされるタンパク質のプロセシングを適切な細胞の機構に向
かわせる。例示的シグナル配列は、限定されるものでないがＢ型肝炎ウイルスＥ
抗原シグナル配列、免疫グロブリン重鎖リーダー配列、サイトカインリーダー配
列などを挙げることができ、使用される。本質的には、細胞からのタンパク質の
分泌を指図するいかなるシグナル配列も、本発明の発現ベクターでの使用に適す
る。シグナル配列に加え、限定されるものでないがタンパク質の分泌を阻害する
配列の短縮もしくは欠失、タンパク質の分泌を阻害する配列の点突然変異、およ
びウイルス粒子中に集成されるべきウイルス遺伝子へのタンパク質の連結のよう
な分泌のための他の機構を使用してもよい。
【００７９】 本発明の一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチドが最低１種のエピトー
プのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで、前記最低
１種のエピトープは哺乳動物におけるＢ細胞応答を誘導する。
【００８０】 本発明のさらなる一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチドが最低１種の
エピトープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで、
前記最低１種のエピトープは哺乳動物におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導する
。
【００８１】 本発明の別の態様は、抗原をコードするポリヌクレオチドが最低１種のエピト
ープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで、前記最
低１種のエピトープは哺乳動物におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００８２】 本発明の特定の一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチド配列が最低１種
のエピトープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、ここで
前記最低１種のエピトープは、前記抗原が導入される哺乳動物におけるＢ細胞応
答、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００８３】 本発明のさらなる特定の一態様は、抗原をコードするポリヌクレオチド配列が
複数のエピトープのポリヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターであり、こ
こで前記複数のエピトープは、前記抗原が導入される哺乳動物におけるＢ細胞応
答、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００８４】 本発明の特定の態様において、発現ベクターは抗原をコードするポリヌクレオ
チド配列を含んで成る。抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、疾患に関連
する最低１種のポリヌクレオチド配列から選択され、ここで、前記疾患は、感染
性疾患、癌および自己免疫疾患より成る群から選択される。より具体的には、抗
原をコードするポリヌクレオチド配列は、ウイルス、細菌、真菌および原生動物
より成る感染性疾患を引き起こす病原性微生物の群から選択されるポリヌクレオ
チド配列である。既知のタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするこれ
らのＤＮＡ配列は、限定されるものでないがＢ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルス抗
原、限定されるものでないがｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇａｇタンパク質を
挙げることができるヒト免疫不全ウイルス抗原、限定されるものでないがＥ７お
よびＥ６タンパク質を挙げることができるパピローマウイルス抗原のようなウイ
ルス抗原を包含する。例えばエプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイル
ス、単純疱疹ウイルスタイプ１および２、ならびにヒトヘルペスウイルス６、７
および８によりコードされるタンパク質のようなヘルペスウイルスタンパク質も
また、有用なレトロゲン融合タンパク質として本発明で企図している。さらなる
態様において、抗原をコードするポリヌクレオチドは、乳癌、子宮頸部癌、黒色
腫、腎癌および前立腺癌より成る群から選択されるポリヌクレオチドである。加
えて、タンパク質は、それらの成長および複製を阻害するという目的上腫瘍細胞
に対し向けられる免疫応答の活性化を誘導するもの（すなわち、黒色腫において
メラノサイトに対する免疫応答を活性化するチロシナーゼ）であることができる
。他の腫瘍関連タンパク質は、限定されるものでないがＭＡＲＴ、ｔｒｐ、ＭＡ
ＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ１００、ＨＥＲ−２、ＰＳＡ、肺
癌に関連するＲａｓ抗原、およびいずれかの他の腫瘍特異的、組織特異的もしく
は腫瘍関連の抗原を挙げることができる。当業者は、腫瘍関連抗原をコードしな
らびに学術文献中に十分に報告されている既知のポリヌクレオチド配列を十分承
知しており、そしてこれまで未知のポリヌクレオチド配列が非常に迅速に発見さ
れている。さらなる一態様において、抗原をコードするポリヌクレオチド配列は
、限定されるものでないが慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性
硬化症、乾癬およびクローン病を挙げることができる自己免疫疾患から選択され
る。加えて、本発明は、免疫寛容が哺乳動物にとって有益である情況でこうした
寛容を誘導するために、自己抗原をコードするＤＮＡを包含すると解釈されるべ
きである。さらに、本発明は、全身性免疫応答が哺乳動物にとって有益である場
合に哺乳動物における全身性免疫応答を誘導することが可能である抗原をコード
するＤＮＡを包含すると解釈されるべきである。全身性免疫応答は、哺乳動物が
免疫抑制されている（すなわちＨＩＶ感染症、化学療法もしくは他の免疫抑制処
置の結果として）例で哺乳動物にとって有益であるはずである。こうした抗原は
、限定されるものでないがＦｃ抗体フラグメントを挙げることができ、これらは
抗原提示細胞上のＦｃ受容体に結合される場合にこれらの細胞による抗原提示を
アップレギュレートするよう作用する。加えて、限定されるものでないがインタ
ーロイキン５のようなインターロイキンを、全身性免疫応答の誘導が望ましい哺
乳動物において類似のアジュバント効果を生じさせるのに使用することができる
。従って、本発明は、本発明の発現ベクター中に包含される場合に、該ベクター
もしくはそれによりコードされる融合タンパク質が哺乳動物に導入される場合に
免疫応答を活性化することが可能である、いずれかの既知のもしくはこれまで未
知のポリヌクレオチド配列を包含すると解釈されるべきである。
【００８５】 当業者は、核酸配列が完全長のタンパク質をコードすることが必要でないこと
を認識している。発現されたタンパク質が、抗原提示細胞中でプロセシングされ
る場合に所望の免疫応答を導き出すエピトープを含んで成ることが単に必要であ
る。従って、この情報から、核酸配列は、発現ベクターが導入される動物におい
て免疫応答を導き出すことができるいずれかの抗原をコードすることができるこ
とが明らかである。従って、本発明は、発現ベクター内に含有される核酸配列の
型に決して限定されるべきでないが、しかし、通常のクローニング技術およびＰ
ＣＲ（商標）などを使用する組換えライブラリーもしくは細胞ゲノムからの核酸
配列のクローニングもまた限定なしに包含する組換え手段を限定なしに包含する
当該技術分野で利用可能ないずれかの手段、ならびに合成手段により得られるい
ずれかのおよび全部の核酸配列を包含するべきである。本発明は、また、核酸配
列はいかなる利用可能な供給源から得てもよいため、該核酸配列の供給源にいか
なる方法でも限定されると解釈されるべきでない。当業者は、核酸配列を得るた
めのプロトコルが当該技術分野で公知でありかつ例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１
９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７）に記述されることを十分承知して
いる。
【００８６】 本発明の特定の態様において、発現ベクターは、細胞結合要素をコードするポ
リヌクレオチド配列をさらに含んで成る。細胞結合要素は、細胞受容体へのタン
パク質の結合を助長するポリペプチドの一部分である。細胞受容体タンパク質に
結合するいかなるリガンドをコードするポリヌクレオチドも、本発明の発現ベク
ターで使用することができる。例示的細胞結合要素は、限定されるものでないが
免疫グロブリンＦｃフラグメント、例えばシュードモナス属の外毒素の細胞結合
ドメインのようなトキシン受容体タンパク質細胞結合ドメイン、サイトカイン（
例えばインターロイキン５およびインターロイキン６）、いずれかの型の抗体分
子などを挙げることができる。当業者は、いかなる抗体も、抗原／抗体複合体の
インターナリゼーションを開始する抗原提示細胞の表面上の細胞表面マーカーに
結合することが可能であることを認識している。従って、抗体もしくはそのフラ
グメントを、インターナリゼーションを開始するための細胞結合要素として使用
することができる。例示的抗体は、限定されるべきでないが抗ＣＤＣ１１、抗Ｃ
Ｄ５４、抗ＣＤ８０および抗ＣＤ８６を挙げることができる。さらに、当業者は
、細胞結合要素が同種もしくは異種であることができることを認識している。例
えば、Ｆｃフラグメントは同種もしくは異種であることができる。従って、本発
明は、通常のクローニング技術およびＰＣＲ（商標）などを使用する組換えライ
ブラリーもしくは細胞ゲノムからのＤＮＡのクローニングを限定なしに包含する
いずれかの利用可能な供給源から、および合成手段により、細胞結合要素の配列
を得ることができるため、細胞結合要素の供給源にいずれかの方法で限定される
と解釈されるべきでない。
【００８７】 当業者は、既知の結合要素の部分を使用することに加え、当該技術分野で公知
の典型的なスクリーニング手順を介して小ペプチドを同定することができること
を認識している。ＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡもしくはゲノム）をスクリーニ
ングして、抗原提示細胞に効率よく結合する小ペプチドを同定する。これらのペ
プチドが同定されれば、該ペプチドを配列決定し、そして本発明において細胞結
合要素として使用する。
【００８８】 発現においては、それは転写物の適正なポリアデニル化を達成するためにポリ
アデニル化配列を典型的に包含することができる。ポリアデニル化配列の性質は
本発明の成功裏の実務に決定的に重要であると考えられておらず、そして／もし
くはいかなるこうした配列を使用してもよい。好ましい態様は、便宜的かつ／も
しくは多様な標的細胞中で十分に機能することが既知のＳＶ４０ポリアデニル化
配列、ＬＴＲポリアデニル化配列、および／もしくはウシ成長ホルモンポリアデ
ニル化配列を包含する。発現ベクターの一要素として転写終止部位もまた企図し
ている。これらの要素は、メッセージのレベルを高めかつ／もしくは抗原および
細胞結合要素をコードする挿入されたポリヌクレオチド配列からベクターの他の
配列への通読（ｒｅａｄ ｔｈｒｏｕｇｈ）を最小限にするよう作用することが
できる。
【００８９】 特定の開始シグナルもまたコーディング配列の効率的な翻訳に必要とされるこ
とができる。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンもしくは隣接配列を包含する
。ＡＴＧ開始コドンを包含する外来の翻訳調節シグナルが提供されることが必要
であるかもしれない。当業者は、これを決定しかつ必要なシグナルを提供するこ
とが容易に可能であろう。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために
所望のコーディング配列の読み枠と「同じ読み枠で」なくてはならないことが公
知である。外来の翻訳調節シグナルおよび開始コドンは天然もしくは合成のいず
れかであることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素の包含に
より高めることができる。
【００９０】 宿主細胞中でベクターを繁殖させるために、それは、複製が開始される特定の
核酸配列である、１個もしくはそれ以上の複製開始点部位（しばしば「ｏｒｉ」
と称される）を含有することができる。あるいは、宿主細胞が酵母である場合は
自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。発現ベクターが細胞中で複製
することが有益である場合には、該ベクターは、ベクター中に存在する組込み配
列（すなわちレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）、アデノ随伴ウイルスＩＴ
Ｒ配列）によって細胞のゲノム中に組込むことができるか、あるいは、ベクター
は、ベクターがエピソームの形態を維持する一方で、ＤＮＡ複製開始点および細
胞中でのベクターの複製を助長する他の配列をそれ自身で含むことができる。例
えば、発現ベクターは、ベクターが導入される細胞中でベクターのエピソーム複
製が助長されるために、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のＤＮＡ複製開
始点およびＥＢＶ ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードする配列を場合によっては
含むことができる。例えば、ＥＢＶの起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コーディン
グを有するＤＮＡ構築物は、哺乳動物細胞中で高コピー数までの複製が可能であ
り、そして例えばインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニ
ア州サンディエゴ）から商業的に入手可能である。
【００９１】 本発明において、適正なタンパク質発現のために発現ベクターが宿主細胞のゲ
ノム中に組込まれることが必要でないことに注目することが重要である。むしろ
、発現ベクターは、エピソーム分子の形態でもまた所望の細胞中に存在すること
ができる。例えば、所望のタンパク質を発現するために発現ベクターが複製する
ことが必要でない、ある種の細胞型が存在する。これらの細胞は、筋細胞のよう
な通常は複製しないものであり、そしてなお遺伝子発現が十分に可能である。発
現ベクターを非分裂細胞中に導入し、そして発現ベクターの複製の非存在下でそ
れによりコードされるタンパク質を発現することができる。
【００９２】 本発明の核酸構築物を含有する細胞を同定するため、発現ベクター中にマーカ
ーを包含することにより、細胞をインビトロもしくはインビボで同定する。こう
したマーカーは、細胞に同定可能な変化を賦与し、発現ベクターを含有する細胞
の容易な同定を可能にする。一般に、選択可能なマーカーは、選択を見込む特性
を賦与するものである。陽性の選択可能なマーカーは、その中でマーカーの存在
がその選択を見込むものである一方、陰性の選択可能なマーカーはその中でその
存在がその選択を予防するものである。陽性の選択可能なマーカーの一例は薬剤
耐性マーカーである。
【００９３】 通常、薬剤選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングおよび同定にお
いて補助し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨ
ＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を賦与する遺伝子が
有用な選択可能なマーカーである。条件の成就に基づく形質転換体の区別を見込
む表現型を賦与するマーカーに加え、その基礎が比色分析であるＧＦＰのような
スクリーニング可能なマーカーを包含する他の型のマーカーもまた企図している
。あるいは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、もしくはクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような、スクリーニング可
能な酵素を利用することができる。当業者は、ＦＡＣＳ分析とともに免疫学的マ
ーカーを使用する方法もまた知っているであろう。例えば、ＮＧＦＲ（神経成長
因子受容体）は、細胞表面上でのＮＧＦＲ発現を検出するフローサイトメトリー
アッセイを使用することによるベクターを含んで成る細胞の選択を助長するため
に、発現ベクター中に包含される。使用されるマーカーは、それが遺伝子産物を
コードする核酸と同時に発現されることが可能である限りは、重要であると考え
られない。選択可能なおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業
者に公知である。
【００９４】 発現ベクターは、原核生物のＤＮＡ複製開始点、および発現ベクターを含んで
成る原核生物細胞の選択のための検出可能なマーカーをコードする遺伝子（例え
ば、例えばアンピシリン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子）もまた含むこ
とができる。
【００９５】 加えて、該発現ベクターは、ＤＮＡの代わりにＲＮＡの形態で細胞に提供して
もよい。該ベクターの中心的構成要素はＤＮＡベクターについて本明細書に記述
されるものと同一であり、そして、加えて、体液ならびに組織および細胞中でＲ
ＮＡを安定化するよう作用する他の成分を添加することができる。
【００９６】 本明細書に記述される多様な成分を一緒に連結して本発明の発現ベクターを生
じさせる実際の方法は当該技術分野で公知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏ
ｋら（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）およびＧｅｒｈａｒｄｔら（
１９９４）に記述される。
【００９７】 特定の態様において、発現ベクターはウイルスベクター、細菌ベクターおよび
哺乳動物ベクターより成る群から選択される。上で論考された組成の少なくとも
一部もしくは全部を含んで成る多数の発現ベクターが存在する。核酸配列もしく
はそれらのコグネイトのポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生するた
めに、原核生物および／もしくは真核生物ベクターに基づく系を本発明での使用
に使用することができる。多くのこうした系は商業的にかつ広範に入手可能であ
る。
【００９８】 米国特許第５，８７１，９８６号、同第４，８７９，２３６号明細書に記述さ
れるような昆虫細胞／バキュロウイルス系は、異種核酸セグメントの高レベルの
タンパク質発現を生じさせることができ、そして例えばインヴィトロジェン［Ｉ
ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ］（商標）からのマックスバック［ＭＡＸＢＡＣ］（商標）
２．０、およびクロンテック［ＣＬＯＮＴＥＣＨ］（商標）からのバックパック
［ＢＡＣＰＡＣＫ］（商標）バキュロウイルス発現系という名で買うことができ
る。
【００９９】 発現ベクター系の他の例は、合成のエクダイソンで誘導可能な受容体を必要と
するストラタジーン［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ］（商標）のコンプリート コント
ロール［ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ］（商標）誘導可能な哺乳動物発現
系、もしくはそのｐＥＴ発現系（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系）を包含する。
誘導可能な発現系の別の例は、インヴィトロジェン［ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ］（
商標）から入手可能であり、これは完全長のＣＭＶプロモーターを使用する誘導
可能な哺乳動物発現系、Ｔ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリンに調節される発
現）系をもつ。インヴィトロジェン［ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ］（商標）は、ピキ
ア メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現系と呼ばれる酵
母発現系もまた提供し、これは、メチロトローフの酵母ピキア メタノリカ（Ｐ
ｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）中での組換えタンパク質の高レベル産生
のため設計されている。当業者は、核酸配列またはそのコグネイトのポリペプチ
ド、タンパク質もしくはペプチドを産生するために発現ベクターのようなベクタ
ーを発現する方法を知っているであろう。
【０１００】 発現ベクターを含んで成る形質転換された細胞は、細胞中に発現ベクターを導
入することにより生成する。細胞もしくは宿主細胞中へのＤＮＡの導入は分子生
物学の分野で公知の技術であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）
、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）およびＧｅｒｈａｒｄｔら（１９９４）に記述
される。細胞のトランスフェクションの方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポ
ソーム媒介性のトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性のトランス
フェクション、電気穿孔法などを包含する。あるいは、細胞は、本明細書に提供
される参考文献および実施例に記述される通常の技術を使用して、本発明のレト
ロゲン発現ベクターを用いて単に形質導入してもよい。宿主細胞は原核生物もし
くは真核生物細胞を包含し、そしてそれはベクターを複製しそして／もしくはベ
クターによりコードされる異種遺伝子を発現することが可能であるいかなる形質
転換可能な生物体も包含する。宿主細胞はベクターのレシピエントとして使用す
ることができ、そして使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果がベクターの複
製であるかまたはベクターにコードされる核酸配列の一部もしくは全部の発現で
あるかどちらかに依存して、原核生物もしくは真核生物に由来してよい。多数の
細胞系および培養物が宿主細胞としての使用に利用可能であり、そしてそれらは
アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（生存する培養物およ
び遺伝物質の保管所として任務を果たす組織である（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ
））により得ることができる。適切な宿主を決定することは当業者の知識および
熟練内に十分にある。一般に、これはベクターのバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎ
ｅ）および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドもしくはコスミドを、多く
のベクターの複製のために原核生物宿主細胞に導入することができる。ベクター
の複製および／もしくは発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞は、Ｄ
Ｈ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにＳＵＲＥ（商標）コンピテント細胞
およびソロパック［ＳＯＬＯＰＡＣＫ］（商標）ゴールド細胞（Ｇｏｌｄ Ｃｅ
ｌｌｓ）（ストラタジーン［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ］（商標）、カリフォルニア
州ラホヤ）のような多数の商業的に入手可能な細菌宿主を包含する。あるいは、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２のような細菌細胞をファージウイルスの宿主
細胞として使用することができる。宿主細胞として使用することができる真核生
物細胞は、限定されるものでないが酵母、昆虫および哺乳動物を挙げることがで
きる。ベクターの複製および／もしくは発現のための哺乳動物の真核生物宿主細
胞の例は、限定されるものでないがＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２
９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２を挙げることができる。酵母株
の例は、限定されるものでないがＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０
１を挙げることができる。多様な細胞型および生物体からの多くの宿主細胞が利
用可能であり、かつ、当業者に既知であろう。同様に、ウイルスベクター、とり
わけベクターの複製もしくは発現に対し許容性であるものを、真核生物もしくは
原核生物のいずれかの宿主細胞とともに使用することができる。
【０１０１】 さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に提供することができ
る。ウイルスベクターの技術は当該技術分野で公知であり、そして、例えばＳａ
ｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４）、ならびに他
のウイルス学および分子生物学の手引書に記述される。ベクターとして有用であ
るウイルスは、限定されるものでないがレトロウイルス、アデノウイルス、アデ
ノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを挙げることができる
。
【０１０２】 数種のベクターは、それを原核生物および真核生物双方の細胞中で複製および
／もしくは発現させる制御配列を使用することができる。当業者は、記述された
宿主細胞の全部をインキュベートしてそれらを維持しかつベクターの複製を可能
にする条件をさらに理解するであろう。ベクターの大スケール産生、ならびにベ
クターによりコードされる核酸およびそれらのコグネイトのポリペプチド、タン
パク質もしくはペプチドの産生を可能にするとみられる技術および条件もまた理
解されかつ既知である。
【０１０３】 本発明の特定の一態様は、シグナル配列、抗原および細胞結合要素を含んで成
る融合タンパク質である。本発明は、ワクチンとしてのレトロゲンタンパク質も
しくは融合タンパク質の使用もまた包含する。レトロゲンタンパク質は、発現ベ
クターを含んで成るいずれかの細胞中でレトロゲンタンパク質を発現させること
、ならびに細胞、細胞破片および細胞培地からレトロゲンタンパク質を分離する
ことにより得ることができる。レトロゲンは定義により細胞結合要素を含んで成
るため、本発明のレトロゲンの精製にアフィニティーカラム精製手順がとりわけ
有用であることができる。合致する細胞受容体、またはプロテインＡもしくはプ
ロテインＧのような包括的タンパク質を含んで成るアフィニティーカラムを、細
胞成分からレトロゲンを分離するのに使用することができる。別の態様は、融合
タンパク質でインビトロで形質導入される抗原提示細胞を含んで成るワクチンで
ある。
【０１０４】 さらなる態様において、ワクチンは発現ベクターを含んで成り、ここで、前記
発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、プロモーター配列をコードする
ポリヌクレオチド配列、分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列、
抗原をコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチ
ドおよびポリアデニル化配列をコードするポリヌクレオチドを含んで成る。発現
ベクターを含んで成るワクチンは、ベクター内に含有される配列が導入され、発
現されることができそして所望のタンパク質に対する免疫応答を導き出すことが
できる細胞が存在する部位に、哺乳動物に直接投与する。この例では、発現ベク
ターは、ＤＮＡが細胞に進入しかつその中で発現されることが可能であるような
製薬学的担体および製剤中で投与される。その後、発現されたタンパク質は、本
明細書に記述されるとおり、プロセシングおよびＭＨＣ提示のため抗原提示細胞
に進入することができる。当業者は、ＤＮＡを多様な方法で与えることができる
こと、および、注入の経路に依存して、ＤＮＡの組成が操作される必要があるか
もしれないことを十分に理解する。非経口注入の例示的経路は、限定されるもの
でないが筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および皮内を挙げることができる。さら
に、発現ベクターのＤＮＡを、哺乳動物の組織中へのそれの直接注入により哺乳
動物の細胞中に導入することは必要でない。むしろ、限定されるものでないが非
侵襲的圧注入、鼻、経口などを挙げることができる、哺乳動物への発現ベクター
の導入の他の手段を使用してよい。
【０１０５】 哺乳動物に導入されるべきであるＤＮＡの量は、細胞中でのＤＮＡの効率的な
発現に十分な量であり、その結果、十分な量のタンパク質が発現されかつそれか
ら分泌され、このタンパク質はその後抗原提示細胞により取り上げられそしてＭ
ＨＣ複合体としてその上に発現される。こうした量のＤＮＡは本明細書で「治療
量」のＤＮＡと称される。治療量を構成するＤＮＡの正確な濃度は、こうした化
合物の哺乳動物への投与の当業者により容易に決定されることができ、そしても
ちろんその中に含有される成分、ならびに限定されるものでないがＤＮＡが導入
されている組織ならびに哺乳動物の年齢および健康状態を挙げることができる他
の因子に依存して変動することができる。
【０１０６】 本発明の別の特定の態様は発現ベクターで形質導入される細胞を含んで成るワ
クチンである。これらの形質導入された細胞は、その中での免疫応答を導き出す
という目的上、哺乳動物への投与のための製薬学的組成物の形態にある。細胞中
でのレトロゲンタンパク質の発現は細胞からのレトロゲンタンパク質の分泌をも
たらす。その後、分泌されたレトロゲンタンパク質はその中でのプロセシングお
よびＭＨＣ−ＩもしくはＭＨＣ−ＩＩ複合体としてのそれからの発現のため、哺
乳動物中で抗原提示細胞により取り上げられることができる。真核生物細胞が抗
原提示細胞である場合には、レトロゲンタンパク質はその中で発現されることが
でき、それから分泌されることができ、そしてプロセシングおよび抗原のＭＨＣ
提示のため細胞に再進入することができる。真核生物細胞が抗原提示細胞でない
場合には、細胞はレトロゲンタンパク質を発現かつ分泌し、それはその後抗原の
ＭＨＣ提示のため抗原提示細胞により取り上げられる。本発明で有用な非抗原提
示細胞は、ＭＨＣ提示のため抗原をプロセシングしないいずれかの細胞、すなわ
ち筋細胞を包含する。抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、単
球などを包含する。また包含される腫瘍細胞は、ＭＨＣ提示のため抗原をプロセ
シングすることが可能であるかもしくは可能でない細胞であることができる。
【０１０７】 発現ベクターはまた、哺乳動物中でインビボで直接、もしくは、より好ましく
は、哺乳動物から取り出されそして細胞中へのベクターの導入後に哺乳動物中に
再導入される細胞中でエクスビボでのいずれかで、哺乳動物の幹細胞中に導入す
ることもできる。発現ベクターはまた、エクスビボのアプローチで哺乳動物の他
の細胞中に導入してもよい。ベクターを哺乳動物の細胞に導入する場合、タンパ
ク質がいくらか後の時点で細胞中で発現されることがより望ましいことができる
ため、ベクターはそれによりコードされるタンパク質を即座に発現することが必
要でない。この例において、発現ベクターは、好ましくは、哺乳動物もしくは哺
乳動物の細胞への適切な誘導物質の投与に際して活性化される誘導可能なプロモ
ーターを含んで成る。エクスビボの技術は当該技術分野で公知でありかつ例えば
米国特許第５，３９９，３４６号明細書に記述される。
【０１０８】 さらなる一態様は、少なくとも、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド
、抗原をコードするポリヌクレオチドおよび細胞結合ドメインをコードするポリ
ヌクレオチドを含んで成る発現ベクターである。
【０１０９】 本発明の別の態様は、抗原に対し向けられる免疫応答を導き出す方法である。
より具体的には、本方法は、本発明の発現ベクターを利用して、それらが外来抗
原であるかのように内在性抗原を産生するよう細胞を操作する。この新規抗原提
示戦略は、抗原および細胞結合要素より成る融合タンパク質を産生かつ分泌する
ように新規組換え発現ベクターで細胞を形質導入することを必要とする。分泌さ
れた融合タンパク質は、受容体に媒介されるエンドサイトーシスを介して、抗原
提示細胞中にエンドサイトーシスされるかもしくは「逆行性に」輸送される（Ｄ
ａｅｒｏｎ、１９９７；Ｓｅｒｒｅら、１９９８；Ｒａｖｅｔｃｈら、１９９３
）。結果として、融合タンパク質、もしくは本開示で称されるところの「レトロ
ゲン」は、分泌後のその逆行性輸送のため、エンドソーム経路中でプロセシング
され、そしてそれが内因性に産生されたとしてもＭＨＣ−ＩＩに拘束される外来
抗原フラグメントとして抗原提示細胞の細胞表面上に提示される。抗原提示細胞
の表面上の抗原のＭＨＣ−ＩＩに結合された抗原性フラグメントはＣＤ４＋−Ｔ
細胞を活性化し、それは順にＣＤ８＋ Ｔ細胞およびマクロファージならびにＢ
細胞を刺激して細胞性および体液性双方の免疫を誘導する。
【０１１０】 レトロゲンタンパク質はまた、融合タンパク質の合成、分泌およびエンドサイ
トーシスの間に細胞質の経路中でもプロセシングされ、そして抗原提示細胞の表
面上でＭＨＣ−Ｉと会合されたようになってＣＤ８＋ Ｔ細胞を直接活性化する
こともできることもまた、本発明で発見されている。インターナリゼーションさ
れた抗原によるＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化は、当該技術分野、および例えばＫｏ
ｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉら、１９９５に記述される。加えて、
上に示されかつ本明細書の別の場所により詳細に記述されるとおり、Ｂ細胞は分
泌されたレトロゲンにより活性化されることができる。従って、Ｂ細胞の活性化
は、ＣＤ４＋細胞もまたＢ細胞を活性化するため、本系において顕著に高められ
る。従って、本戦略は統一する機構を使用して、免疫系の部門の全部を活性化す
る。
【０１１１】 特定の態様において、形質導入された細胞を産生するために、発現ベクターを
細胞に導入する。該細胞中でのレトロゲンタンパク質の発現は、細胞からのレト
ロゲンタンパク質の分泌をもたらす。分泌されたレトロゲンタンパク質は、その
後、その中でのプロセシングおよびＭＨＣ−ＩもしくはＭＨＣ−ＩＩ複合体とし
てのそれからの発現のために、哺乳動物の抗原提示細胞により取り上げられるこ
とができる。従って、当業者は、形質導入された細胞もしくは第一の細胞が抗原
を分泌し、そして分泌された抗原が、細胞すなわち第二の細胞（同一の細胞もし
くは異なる細胞のいずれか）中にインターナリゼーションされることを十分に理
解する。真核生物細胞が抗原提示細胞である場合には、レトロゲンタンパク質が
その中で発現されることができ、それから分泌されることができ、そしてプロセ
シングおよび抗原のＭＨＣ提示のため細胞に再進入することができる。真核生物
細胞が抗原提示細胞でない場合には、細胞はレトロゲンタンパク質を発現かつ分
泌し、それはその後抗原のＭＨＣ提示のため抗原提示細胞により取り上げられる
。本発明で有用な非抗原提示細胞は、ＭＨＣ提示のため抗原をプロセシングしな
いいずれかの細胞、すなわち筋細胞を包含する。抗原提示細胞は、樹状細胞（Ｄ
Ｃ）、マクロファージ、単球などを包含する。また包含される腫瘍細胞は、ＭＨ
Ｃ提示のため抗原をプロセシングすることが可能であるかもしくは可能でない細
胞であることができる。
【０１１２】 本発明のさらなる一態様は、発現ベクターを哺乳動物に直接投与する段階を含
んで成る、抗原に対し向けられる免疫応答を導き出す方法である。
【０１１３】 本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を導き出すことが可能である最低１
種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の
スクリーニングもしくは同定方法も包含する。好ましくは、同定されるポリペプ
チドは、哺乳動物に有益である免疫応答を導き出すものである。該方法は、単離
されたＤＮＡ分子の集団を得ること、およびＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化
することが可能である最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコード
する単離されたＤＮＡ分子についてスクリーニングすることを含んで成る。該Ｄ
ＮＡ分子は、本明細書で「試験ＤＮＡ」もしくは「試験ポリヌクレオチド配列」
と称される。試験ポリヌクレオチド配列を本発明の発現ベクター中にクローン化
し、該ベクター中でそれは例えば図２５に描かれるとおりシグナル配列と細胞結
合要素との間に配置される。該方法においては、試験ポリヌクレオチド配列を含
んで成るベクターを抗原提示細胞中に導入することにより抗原提示細胞を形質導
入し、形質導入された抗原提示細胞を、処理を受けたことのないＴ細胞もしくは
プライミングされたＴ細胞と接触させ、そして、いずれかの処理を受けたことの
ないＴ細胞もしくはプライミングされたＴ細胞が前記形質導入された抗原提示細
胞との接触に際して活性化されるかどうかを評価することにより、処理を受けた
ことのないＣＤ４＋ Ｔ細胞をインビトロで活性化する形質導入された細胞の能
力を評価する。形質導入された抗原提示細胞によるＴ細胞の活性化は、その中に
含有される試験ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物中で免疫応答を導き出すよう
にＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な最低１種のエピトープを
コードするポリヌクレオチド配列、または遺伝子もしくはそのフラグメントであ
ることの表示である。該アッセイで使用することができる適する対照は、哺乳動
物中で免疫応答を活性化しないことが既知である単離されたポリヌクレオチド配
列を含んで成る発現ベクターで形質導入される細胞（陰性対照）、および哺乳動
物中で免疫応答を活性化することが既知である単離されたポリヌクレオチド配列
を含んで成る発現ベクターで形質導入される細胞（陽性対照）を包含する。当業
者は、癌もしくは自己免疫疾患の免疫療法または遺伝子治療に使用することがで
きるＣＤ４＋ Ｔ細胞により認識されるタンパク質もしくはエピトープをコード
する遺伝子を同定するためにヒトゲノムをスクリーニングするのに、本スクリー
ニング手順を利用することができることを認識している。さらに、細菌、ウイル
スもしくは寄生虫を包含する他のゲノムをスクリーニングすることができる。
【０１１４】 インビトロＴ細胞活性化アッセイは、多くの異なる試験ポリヌクレオチド配列
の試験を一時に助長するために、高スループットの自動化アッセイとなるように
適合させることができる。当業者は、多様な可能なエピトープ配列を含有する発
現ベクターで細胞を形質導入するように本発明を操作することができることを明
確に理解する。形質導入された細胞を、処理を受けたことのないＴ細胞を含有す
る９６穴プレート中に入れることができ、そして、Ｔ細胞の活性化を、臨床免疫
学で容易に利用可能な技術を使用して、Ｔ細胞のＤＮＡへの放射活性の取込みの
自動化された評価により評価することができる。
【０１１５】 さらなる態様において、試験ポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパ
ク質産物を、哺乳動物中における免疫応答の活性化をインビボで評価するために
さらに評価することができる。本アッセイは、試験ポリヌクレオチド配列を含ん
で成る発現ベクターを導入することにより形質導入された、形質導入された抗原
提示細胞を、非経口経路を介して哺乳動物に投与することを除き、インビトロア
ッセイと同一である。特定の態様において、試験ポリヌクレオチド配列を含んで
成る発現ベクターを哺乳動物に直接投与する。Ｔ細胞を脾細胞から収集し、そし
て樹状細胞と共培養する。Ｔ細胞の活性化を評価して、試験ポリペプチドをコー
ドする試験ポリヌクレオチドがＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可
能であるかどうかを決定する。さらに、当業者は、本スクリーニング手順を利用
して、癌、ウイルス感染症および自己免疫疾患を治療するのに使用することがで
きるＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープを同定することができることを認識し
ている。
【０１１６】 本明細書に示されるとおり、試験ポリヌクレオチド配列は分子生物学の当該技
術分野で普遍的ないずれかの通常の手段により得ることができる。例えば、試験
ポリヌクレオチド配列は発現ライブラリーから得ることができ、このライブラリ
ーはその機能が未知であるタンパク質を発現することができる。試験ポリヌクレ
オチド配列はまた、既知の機能のタンパク質を発現するがしかし哺乳動物の免疫
系の活性化の特性を所有することがこれまで既知でなかった発現ライブラリーか
らも得ることができる。例示的発現ｃＤＮＡライブラリーは、限定されるもので
ないが腫瘍細胞、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、寄生虫ゲノムおよびヒトゲノム
を挙げることができる。試験ポリヌクレオチド配列はまたコンビナトリアルの方
法論を使用しても得ることができ、ここで、該ポリヌクレオチド配列がタンパク
質をコードするかどうかは最初に知られておらず、そして、さらに、該ポリヌク
レオチド配列が免疫応答を活性化することが可能であるタンパク質をコードする
かどうかは既知でない。試験ポリヌクレオチド配列はまた合成の方法によっても
得ることができ、ここではポリヌクレオチド配列を自動合成機で合成し、別個の
長さのフラグメントを発現ベクターにクローン化し、そして本明細書に記述され
るとおり試験する。
【０１１７】 免疫応答が保護的であることが常に必要であるわけではないが、しかし単にそ
れが宿主哺乳動物にとって有益であることが必要である。例えば、抗原に対する
免疫応答が哺乳動物に対し有害である情況で、例えば慢性関節リウマチ、全身性
エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、クローン病などのようなある種の自己
免疫疾患において、免疫寛容を誘導することが哺乳動物にとって有益であること
ができ、免疫応答の減少が望ましく、それは攻撃的抗原に対する免疫寛容を誘導
することにより達成することができる。この例では、ＤＮＡは攻撃的抗原をコー
ドするＤＮＡを含んで成り、それがその後哺乳動物の細胞中で発現され、そして
その後、抗原に対し哺乳動物において免疫寛容を誘導するために、ＭＨＣ−Ｉお
よび／もしくはＭＨＣ−ＩＩ複合体としてその表面上で発現されるように、抗原
提示細胞中でプロセシングされる。
【０１１８】 さらなる態様においては、同定されたポリヌクレオチド配列を、癌、ウイルス
感染症もしくは自己免疫疾患の治療方法として使用する。より具体的には、試験
ポリペプチドをコードする同定されたポリヌクレオチドを抗原提示細胞中に形質
導入し、そして形質導入された抗原提示細胞を、非経口経路を介して哺乳動物に
直接投与して、癌、ウイルス感染症もしくは自己免疫疾患を治療する。さらに、
試験ポリペプチドおよび細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドを少なくと
も含有する発現ベクターを、非経口経路を介して哺乳動物に直接投与して、癌、
ウイルス感染症もしくは自己免疫疾患を治療する。
【０１１９】 本発明のさらなる一態様は：本発明の発現ベクターを細胞中に導入することに
より抗原提示細胞を形質導入すること、および抗原が細胞から分泌される条件下
で前記ベクターを発現させて前記抗原を産生させること、の段階を含んで成る、
哺乳動物を免疫感作するワクチンの製造方法である。特定の態様において、抗原
提示細胞は、哺乳動物に抗原提示細胞を投与する前にインビトロもしくはエクス
ビボで抗原で形質導入される。本発明のワクチンの全部は非経口で投与すること
ができる。
【０１２０】 特定の態様において、免疫応答の誘導方法は、該発現ベクターおよびサイトカ
イン発現ベクターを生物体に共投与する段階を含んで成る。サイトカインを発現
するプラスミドの共投与により、個々のプラスミドに対する応答を高めることが
できることを、多数の研究が示している。発現ベクターから局所で合成された、
ピコグラムないしナノグラム量のサイトカインは、哺乳動物全体に対し全身性の
効果を有するには少なすぎるが、しかし、局所のサイトカイン環境、および従っ
て投与された抗原に対する免疫応答になお強く影響することができることが注目
されるべきである。サイトカインの例は、限定されるものでないがＧＭ−ＣＳＦ
およびＩＬ−２を挙げることができる。当業者は、サイトカインのポリヌクレオ
チド配列および抗原のポリヌクレオチド配列を１個の発現ベクターに組込むこと
ができ；そうして２個の別個のベクターの使用を除外することを容易に明確に理
解する。サイトカインに加え、メチル化されないＣｐＧ配列を含有するプラスミ
ドが細胞に媒介される（Ｔｈ１）応答を高める（Ｃａｒｓｏｎら、１９９７）。
ＣｐＧ配列モチーフは、限定されるものでないがＲＲＣｐＧＹＹを挙げることが
できる。従って、当業者は、本発明における発現ベクターでのサイトカインの補
充もしくはＣｐＧ配列モチーフの付加が免疫応答の増強をもたらすであろうこと
を十分に理解する。
【０１２１】 本発明のある種の態様においては、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素
の使用を、多重遺伝子もしくはポリシストロン性のメッセージを創製させるのに
使用する。ＩＲＥＳ要素は、５’のメチル化されたＣａｐに依存する翻訳のリボ
ソーム走査モデルを迂回し、かつ、内部部位で翻訳を開始することが可能である
（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒとＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコルナウイルスフ
ァミリーの２種のメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）からのＩＲＥＳ要素（Ｐｅ
ｌｌｅｔｉｅｒとＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）、ならびに哺乳動物のメッセ
ージからのＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋとＳａｒｎｏｗ、１９９１）が記述されて
いる。ＩＲＥＳ要素は異種の読取り枠に連結することができる。複数の読取り枠
を一緒に転写することができ；それぞれはＩＲＥＳにより分離され、ポリシスト
ロン性のメッセージを創製させる。ＩＲＥＳ要素のおかげで、各読取り枠は効率
的な翻訳のためリボソームに接近可能である。単一のメッセージを転写する単一
のプロモーター／エンハンサーを使用して、複数の核酸配列を効率よく発現する
ことができる（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９
号明細書）。さらに、当業者は、遺伝子の核酸配列全体を使用する必要がないこ
とを認識している。代わりに、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩに拘束されるエピトー
プの部分的核酸配列を一緒に融合することができ、１個のプロモーターにより転
写されるキメラ融合遺伝子をもたらす。例えば、本発明の特定の一態様は、融合
タンパク質（ここで、該タンパク質は細胞結合要素に融合されたＭＨＣ−Ｉおよ
びＭＨＣ−ＩＩ双方のエピトープを含んで成る）を投与する段階を含んで成る、
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のＴ細胞の同時誘導方法である。従って、当業者は
、複数の抗原配列の使用が１種のワクチンの投与での多様な疾患の治療をもたら
すことを明確に理解する。
【０１２２】 本発明の別の特定の態様は、哺乳動物に１種の発現ベクターを投与する段階を
含んで成る、免疫応答の誘導方法であり、ここで、前記発現ベクターは、１個の
プロモーターの転写制御下に第一の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド配列および第二の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで
成り、ここで、前記第一の融合タンパク質は第一のシグナル配列、第一の抗原お
よび第一の細胞結合要素を含んで成り、また、前記第二の融合タンパク質は第二
のシグナル配列、第二の抗原および第一の細胞結合要素を含んで成る。特定の態
様において、第一および第二のシグナル配列は同一のシグナル配列であり、第一
および第二の抗原は異なる抗原であり、そして細胞結合要素はＦｃフラグメント
である。さらなる態様において、第一および第二のシグナル配列は同一であり、
第一および第二の抗原は異なる抗原であり、そして第一および第二の細胞結合要
素は同一の細胞結合要素である。さらなる態様は、第一および第二のシグナル配
列が異なり、第一および第二の抗原が異なる抗原であり、そして第一および第二
の細胞結合要素が同一の細胞結合要素であるか、もしくは、第一および第二のシ
グナル配列が同一であり、第一および第二の抗原が異なる抗原であり、そして第
一および第二の細胞結合要素が異なる細胞結合要素である、を包含する。付加的
な一態様は、第一の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列および第
二の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が別個の転写制御下にあ
ることを包含し、そしてここで第一の融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チド配列および第二の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が１個
の発現ベクター中で縦列にある。
【０１２３】 当業者は、各核酸配列が別個の実体であるような複数の核酸配列を縦列でベク
ター中にクローン化することができることを認識している。各実体は、１個のベ
クターからの別個の抗原の発現をもたらす個々の核酸配列の発現を駆動する１個
のプロモーターを含有する。この技術は、個々のメッセージを転写するのに複数
のプロモーターを使用して、核酸配列を効率よく発現する。
【０１２４】 本発明のさらなる一態様は、本発明の発現ベクターを細胞中に導入すること、
および融合タンパク質が細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて
前記融合タンパク質を産生させること、の段階を含んで成る、融合タンパク質の
製造方法である。特定の態様において、抗原提示細胞はインビトロで融合タンパ
ク質で形質導入される。より具体的には、融合タンパク質は非経口で哺乳動物に
投与される。
【０１２５】 本発明の特定の一態様は、発現ベクターを細胞中に導入すること（ここで、前
記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモータ
ー配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、細胞内タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポ
リヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）、ならびに、融合タンパク質
が細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記融合タンパク質を
産生させること、の段階を含んで成る、細胞内タンパク質の分泌方法である。よ
り具体的には、細胞内タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、分泌の
効率を増大させるように短縮もしくは突然変異される。特定の態様において、細
胞内タンパク質はＨＰＶ １６ Ｅ７である。
【０１２６】 本発明の別の特定の態様は、発現ベクターを細胞中に導入すること（ここで、
前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモー
ター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、膜タンパク質をコード
するポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリ
ヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）、ならびに、融合タンパク質が
細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記融合タンパク質を産
生させること、の段階を含んで成る、膜タンパク質の分泌方法である。より具体
的には、膜タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、分泌の効率を増大
させるように短縮もしくは突然変異される。特定の態様において、膜タンパク質
はＥＢＶ核抗原１である。
【０１２７】 本発明は、本発明の組成物、および哺乳動物の細胞もしくは組織に該組成物を
外膜に投与することを記述する説明書を含んで成るキットもまた包含する。別の
態様において、本キットは、哺乳動物への化合物の投与に先立ち、本発明の組成
物を溶解もしくは懸濁するのに適する（好ましくは滅菌の）溶媒を含んで成る。 投薬量および製剤 本発明の発現ベクター、形質導入された細胞および融合タンパク質（有効成分
）は、生物体の体内での作用物質の作用部位と有効成分の接触を生じさせるいず
れかの手段により、多様な疾患状態を治療するために処方かつ投与することがで
きる。それらは別個の治療的有効成分として、もしくは治療的有効成分の組み合
わせ剤でのいずれかで、医薬に関連する使用に利用可能ないずれかの慣習的手段
により投与することができる。それらは単独で投与することができるが、しかし
、一般に、選ばれた投与経路および標準的製薬学的実務に基づいて選択される製
薬学的担体とともに投与する。
【０１２８】 有効成分は、カプセル剤、錠剤および散剤のような固体の投薬形態で、もしく
はエリキシル剤、シロップ剤、乳剤および懸濁剤のような液体の投薬形態で、経
口で投与することができる。有効成分はまた、注入（ｉｎｊｅｃｔｉｎ）、迅速
注入（ｒａｐｉｄ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、鼻咽頭吸収もしくは皮膚吸収により非
経口で投与のため処方することもできる。作用物質は筋肉内で、静脈内でもしく
は坐剤として投与してよい。
【０１２９】 ゼラチンカプセルは、有効成分、および乳糖、ショ糖、マンニトール、デンプ
ン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などのような
粉末にされた担体を含有する。圧縮錠剤を作成するのに類似の希釈剤を使用する
ことができる。錠剤およびカプセル剤の双方とも、数時間の期間にわたる医薬の
連続的放出を提供するために持続性放出生成物として製造することができる。圧
縮錠剤は、いかなる不快な味も遮蔽しかつ雰囲気から錠剤を保護するために糖衣
もしくはフィルムコーティングすることができるか、または消化管中での選択的
崩壊のため腸溶コーティングすることができる。
【０１３０】 経口投与のための液体の投薬形態は、患者の受容性を増大させるために着色料
および矯味矯臭剤を含有することができる。
【０１３１】 一般に、水、適する油、生理的食塩水、水性ブドウ糖（グルコース）および関
係する糖溶液、ならびにプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール
のようなグリコールが、非経口溶液のための適する担体である。非経口投与のた
めの溶液は、有効成分、適する安定剤、および必要な場合は緩衝物質を含有する
。単独もしくは組み合わせられたのいずれかの、重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナト
リウムもしくはアスコルビン酸のような抗酸化剤は適する安定剤である。クエン
酸およびその塩、ならびにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ナトリウムもま
た使用される。加えて、非経口溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチルもしくは
プロピルパラベンおよびクロロブタノールのような保存剤を含有することができ
る。適する製薬学的担体は、この分野の標準的参照教科書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記述される。
【０１３２】 本発明の有効成分は、哺乳動物およびとりわけヒトでの使用に適する製薬学的
に許容できる組成物中に懸濁されるように処方することができる。こうした製剤
は、ムラミルジペプチド誘導体（ＭＤＰ）、もしくは米国特許第４，０８２，７
３５号；同第４，０８２，７３６号；同第４，１０１，５３６号；同第４，１８
５，０８９号；同第４，２３５，７７１号；および同第４，４０６，８９０号明
細書に記述される類似物のようなアジュバントの使用を包含する。有用である他
のアジュバントは、アルム（ピアース ケミカル カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、リピドＡ、二ミコール酸トレハロースおよび臭化
ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、フロイントのアジュバントお
よびＩＬ−１２を包含する。他の成分は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエ
チレンブロックポリマー（プルロニック［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ］（商標））、非イ
オン性界面活性剤、およびスクアレンのような代謝可能な油（米国特許第４，６
０６，９１８号明細書）を包含してよい。
【０１３３】 加えて、作用の持続期間を制御するために標準的製薬学的方法を使用すること
ができる。これらは当該技術分野で公知であり、そして制御放出製剤を包含し、
また、適切な巨大分子、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビ
ニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロースもしくはプロタミン硫酸を包含することができる。巨大分子の濃
度ならびに組込みの方法は、放出を制御するために調節することができる。加え
て、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）もしくはエチレン
ビニルアセテートコポリマーのようなポリマー性材料の粒子中に作用物質を組込
むことができる。組込まれることに加えて、これらの作用物質は、化合物をマイ
クロカプセル中に捕捉するためにもまた使用することができる。
【０１３４】 本発明の化合物の投与に有用な製薬学的投薬形態を以下のとおり具体的に説明
することができる。
【０１３５】 カプセル剤：カプセル剤は、１００ミリグラムの粉末にされた有効成分、１７
５ミリグラムの乳糖、２４ミリグラムのタルクおよび６ミリグラムのステアリン
酸マグネシウムで標準的な二片の硬ゼラチンカプセルそれぞれを充填することに
より製造する。
【０１３６】 軟ゼラチンカプセル剤：ダイズ油中の有効成分の混合物を調製し、そして正の
置換ポンプ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｕｍｐ）によっ
てゼラチン中に注入して、１００ミリグラムの有効成分を含有する軟ゼラチンカ
プセル剤を形成する。その後、カプセルを洗浄かつ乾燥する。
【０１３７】 錠剤：錠剤は、投薬量単位が、１００ミリグラムの有効成分、０．２ミリグラ
ムのコロイド状二酸化ケイ素、５ミリグラムのステアリン酸マグネシウム、２７
５ミリグラムの微晶質セルロース、１１ミリグラムのトウモロコシデンプンおよ
び９８．８ミリグラムの乳糖であるように慣習的手順により調製する。嗜好性を
増大させるかもしくは吸収を遅延させるために適切なコーティングを適用しても
よい。
【０１３８】 注入可能：注入による投与に適する非経口組成物は、１．５重量％の有効成分
を１０容積％のプロピレングリコールおよび水中で攪拌することにより調製する
。溶液を塩化ナトリウムで等張にし、そして滅菌する。
【０１３９】 懸濁剤：水性懸濁剤は、各５ミリリットルが１００ミリグラムの微細に分割さ
れた有効成分、２００ミリグラムのカルボキシメチルセルロースナトリウム、５
ミリグラムの安息香酸ナトリウム、１．０グラムの米国薬局方ソルビトール溶液
および０．０２５ミリグラムのバニリンを含有するように、経口投与のため調製
する。
【０１４０】 従って、本発明の製薬学的組成物は、特定の効果を達成するために、多様な経
路を介して、および哺乳動物体内の多様な部位に送達することができる（例えば
、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１ａ；Ｊａ
ｆｆｅら、上記；Ｂｅｒｋｎｅｒ、上記を参照されたい）。当業者は、投与に１
種以上の経路を使用することができるとは言え、特定の一経路が別の経路よりも
より即座のかつより有効な反応を提供することができることを明確に理解するで
あろう。局所もしくは全身の送達は、体腔中への製剤の適用もしくは点滴注入を
含んで成る投与、エアゾルの吸入もしくは通気法、または筋肉内、静脈内、腹腔
、皮下、皮内、ならびに局所投与を包んで成る非経口導入により達成することが
できる。
【０１４１】 本発明の有効成分は単位投与剤形で提供することができ、そこでは、各投薬単
位（例えば茶さじ１杯、錠剤、溶液、もしくは坐剤）は、単独でもしくは他の有
効成分との適切な組み合わせで、予め決められた量の組成物を含有する。本明細
書で使用されるところの「単位投与剤形」という用語は、ヒトおよび哺乳動物の
被験体のための単位投薬量として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、
適切な場合は製薬学的に許容できる希釈剤、担体もしくはベヒクルと共同して、
所望の効果を生じるのに十分な量で計算された、単独もしくは他の有効成分と組
み合わせでの予め決められた量の本発明の組成物を含有する。本発明の単位投与
剤形の明細は、達成されるべき特定の効果、および特定の宿主における該製薬学
的組成物と関連する特定の薬力学に依存する。
【０１４２】 本明細書に記述されるこれらの方法は決して包括的でなく、また、特定の応用
にかなうさらなる方法が当業者に明らかであろう。さらに、組成物の有効量は、
所望の効果を発揮することが既知の化合物への類推によりさらに近づけることが
できる。 脂質製剤および／もしくはナノカプセル剤 ある種の態様において、宿主細胞中への発現ベクターの導入に、脂質製剤およ
び／もしくはナノカプセル剤の使用を企図している。
【０１４３】 ナノカプセル剤は、一般に、安定なかつ／もしくは再現可能な方法で化合物を
捕捉することができる。細胞内のポリマー過剰負荷による副作用を回避するため
に、インビボで崩壊されることが可能なポリマーを使用して、こうした超微細粒
子（約０．１μｍの大きさにされた）を設計すべきである。これらの要件に合致
する生物分解性のポリアルキルシアノアクリレートのナノ粒子を、本発明での使
用に企図しており、そして／もしくはこうした粒子は容易に作成することができ
る。
【０１４４】 本発明の特定の一態様において、発現ベクターは脂質と会合することができる
。脂質と会合された発現ベクターは、リポソームの水性の内側中で被包化される
か、リポソームの脂質二重層内に散在されるか、リポソームおよびオリゴヌクレ
オチドの双方と会合される連結分子を介してリポソームに結合されるか、リポソ
ーム中に捕捉されるか、リポソームと複合体形成されるか、脂質を含有する溶液
中に分散されるか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わせられるか、脂質中の
懸濁物として含有されるか、ミセルを含有するかもしくはそれと複合体形成され
るか、そうでなければ脂質と会合されることができる。本発明の脂質もしくは脂
質／発現ベクター会合組成物は溶液中のいずれかの特定の構造に限定されない。
例えば、それらはミセルのような二重層構造に存在することができるか、もしく
は「崩壊された」構造をもつことができる。それらはまた、単に溶液中に散在さ
れて、おそらく大きさもしくは形状のいずれかが均一でない凝集物を形成するこ
ともできる。
【０１４５】 脂質は、天然に存在するかもしくは合成の脂質であることができる脂肪性物質
である。例えば、脂質は細胞質中に天然に存在する脂肪の小滴、ならびに長鎖脂
肪族炭化水素ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびア
ルデヒドのようなそれらの誘導体を含有する当業者に公知である化合物の分類を
包含する。
【０１４６】 本発明のリポソームを調製するのにリン脂質を使用することができ、そしてリ
ン脂質は正味の正、負もしくは中性の荷電を運搬することができる。リポソーム
に負の電荷を賦与するためにジアセチルホスフェートを使用することができ、ま
た、リポソームに正の電荷を賦与するためにステアリルアミンを使用することが
できる。リポソームは１種もしくはそれ以上のリン脂質より作成することができ
る。
【０１４７】 中性に荷電した脂質は、荷電をもたない脂質、実質的に荷電していない脂質、
もしくは等しい数の正および負の電荷をもつ脂質混合物を含むことができる。適
するリン脂質はホスファチジルコリンおよび当業者に公知である他者を包含する
。
【０１４８】 本発明の使用に適する脂質は商業的供給源から得ることができる。例えば、ジ
ミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はシグマ ケミカル カンパ
ニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から得ることができ、ジセチル
ホスフェート（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋラボラトリーズ（Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）（ニューヨーク州プレーンビュー）から得られ；コレステロー
ル（「Ｃｈｏｌ」）はカルバイオケム−ベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂ
ｅｈｒｉｎｇ）から得られ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭ
ＰＧ」）および他の脂質はアヴァンティ ポーラー リピッズ インク（Ａｖａ
ｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）（アラバマ州バーミンガム）か
ら得ることができる。クロロホルムもしくはクロロホルム／メタノール中の脂質
のストック溶液は約−２０℃で保存することができる。好ましくは、クロロホル
ムを唯一の溶媒として使用する。なぜなら、それはメタノールより容易に蒸発さ
れるからである。
【０１４９】 卵もしくはダイズのホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳もしくは
植物のホスファチジルイノシトール、心カルジオリピンおよび植物もしくは細菌
のホスファチジルエタノールアミンのような天然の供給源からのリン脂質は、好
ましくは、生じるリポソームの不安定性および漏出性のため、主ホスファチド（
すなわち全ホスファチド組成の５０％もしくはそれ以上を構成する）として使用
されない。
【０１５０】 「リポソーム」は、閉じ込められた脂質二重層もしくは凝集物の生成により形
成される多様な単層および多層状の脂質小胞を包含する包括的用語である。リポ
ソームは、リン脂質二重層膜および内的水性媒体をもつ小胞構造を有することを
特徴とすることができる。多層状リポソームは水性媒体により分離される複数の
脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液中に懸濁される場合に自
発的に生じる。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己の再配列を受け、そして水
を捕捉しかつ脂質二重層の間に溶質を溶解する（ＧｈｏｓｈとＢａｃｈｈａｗａ
ｔ、１９９１）。しかしながら、本発明は、通常の小胞構造と異なる溶液中の構
造を有する組成物もまた包含する。例えば、脂質はミセル構造をとってよいか、
もしくは単に脂質分子の不均質な凝集物として存在する。リポフェクタミン−核
酸複合体もまた企図している。
【０１５１】 リン脂質は、水中に分散される場合に、水に対する脂質のモル比に依存して、
リポソーム以外の多様な構造を形成することができる。低い比では、リポソーム
は好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および／
もしくは二価陽イオンの存在に依存する。リポソームはイオン性および／もしく
は極性物質に対する低い浸透性を示すことができるが、しかし、上昇された温度
では相転移を受け、それはそれらの浸透性を顕著に変える。相転移は、ゲル状態
として知られる緊密に充填された規則正しい構造から、流動状態として知られる
緩く充填されたより少なく規則正しい構造への変化を必要とする。これは特徴的
な相転移温度で発生し、そして／またはイオン、糖および／もしくは薬物への浸
透性の増大をもたらす。
【０１５２】 リポソームは４つの異なる機構を介して細胞と相互作用する。すなわち、マク
ロファージおよび／もしくは好中球のような網内系の食細胞によるエンドサイト
ーシス；非特異的な弱い疎水性および／もしくは静電的な力、ならびに／または
細胞表面の成分との特異的相互作用のいずれかによる細胞表面への吸着；細胞質
へのリポソームの内容物の同時の放出を伴う、原形質膜中へのリポソームの脂質
二重層の挿入による形質細胞膜との融合；ならびに／あるいは、リポソームの内
容物のいかなる会合も伴わない、細胞膜および／もしくは亜細胞膜へのリポソー
ム脂質の移入、ならびに／または逆もまた同じ。リポソームの処方を変えること
は、どの機構が効果をもたらすかを変える可能性があるが、とは言え同時に１つ
以上が機能することができる。
【０１５３】 外来ＤＮＡのインビトロでのリポソーム媒介性のオリゴヌクレオチドの送達お
よび発現は非常に成功裏であった。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養されたニワ
トリ胚、ＨｅＬａおよび肝癌細胞中での外来ＤＮＡのリポソーム媒介性の送達お
よび発現の実行可能性を立証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内注
入後にラットでの成功裏のリポソーム媒介性の遺伝子移入を達成した。
【０１５４】 本発明のある態様においては、脂質は赤血球凝集を起こさせるウイルス（ＨＶ
Ｊ）と会合することができる。これは、細胞膜との融合を助長しかつリポソーム
に被包化されたＤＮＡの細胞進入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ
ら、１９８９）。他の態様において、脂質は核の非ヒストン染色体タンパク質（
ＨＭＧ−１）と複合体形成するか、もしくはそれらとともに使用することができ
る（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる態様において、脂質はＨＪＶおよび
ＨＭＧ−１双方と複合体形成するか、もしくはそれらとともに使用することがで
きる。こうした発現ベクターは、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオ
チドの移入および発現で成功裏に使用されているため、それらは本発明に応用可
能である。細菌のプロモーターをＤＮＡ構築物中で使用する場合、リポソーム内
に適切な細菌のポリメラーゼを包含することもまた望ましいことができる。
【０１５５】 本発明に従って使用されるリポソームは多様な方法により作成することができ
る。リポソームの大きさは合成の方法に依存して変動する。水性溶液中に懸濁さ
れたリポソームは、一般に脂質二重層分子の１個もしくはそれ以上の同心円の層
を有する球形の小胞の形状にある。各層は式ＸＹにより表される分子の平行な配
列より成り、ここでＸは親水性部分であり、そしてＹは疎水性部分である。水性
懸濁液中では、親水性部分が水相と接触したままである傾向がありかつ疎水性領
域が自己会合する傾向があるような、同心円の層が配置される。例えば、水層が
リポソーム内およびリポソーム外の双方で存在する場合、脂質分子は配置ＸＹ−
ＹＸのラメラとして知られる二重層を形成することができる。１個以上の脂質分
子の親水性および疎水性の部分が相互と会合されたようになる場合に、脂質の凝
集物が形成することができる。これらの凝集物の大きさおよび形状は、溶媒の性
質および溶液中の他の化合物の存在のような多くの多様な変数に依存することが
できる。
【０１５６】 本発明の範囲内のリポソームは既知の実験室の技術に従って調製することがで
きる。好ましい一態様において、リポソームは容器（例えばガラス性のなす型フ
ラスコ）中の溶媒中でリポソーム脂質を混合することにより調製する。容器はリ
ポソームの期待される懸濁液の容積より１０倍より大きい容積を有するべきであ
る。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を陰圧下およそ４０℃で除去す
る。溶媒は通常、リポソームの所望の容積に依存して、約５分ないし２時間以内
に除去される。組成物を真空下にデシケーター中でさらに乾燥することができる
。乾燥された脂質は、一般に、時間とともに劣化する傾向のため、約１週間後に
廃棄する。
【０１５７】 乾燥された脂質は、全部の脂質薄膜が再懸濁されるまで振とうすることにより
、滅菌の発熱物質を含まない水中で、およそ２５〜５０ｍＭのリン脂質で水和す
ることができる。その後、水性リポソームをアリコートに分離し、それぞれをバ
イアルに入れ、凍結乾燥しそして真空下に封止する。
【０１５８】 代替において、リポソームは他の既知の実験室の手順に従って調製することが
できる。すなわち、Ｂａｎｇｈａｍら（１９９５）の方法（その内容は引用によ
り本明細書に組み込まれる）；ＧＲＵＧ ＣＡＲＲＩＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＬＯ
ＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（１９７９）
ｐｐ．２８７−３４１に記述されるようなＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの方法（その
内容は引用により本明細書に組み込まれる）；ＤｅａｍｅｒとＵｓｔｅｒ、１９
８３の方法（その内容は引用により組み込まれる）；およびＳｚｏｋａとＰａｐ
ａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９７８により記述されるような逆相蒸発法。前述
の方法は、水性物質を捕捉するそれらのそれぞれの能力、およびそれらのそれぞ
れの水性空間対脂質比において異なる。
【０１５９】 上述されたとおり調製された、乾燥された脂質もしくは凍結乾燥されたリポソ
ームは、阻害性ペプチドの溶液中で脱水かつ再構成し、そして適する溶媒（例え
ばＤＰＢＳ）を用いて適切な濃度に希釈することができる。その後、混合物をボ
ルテックス混合機で激しく振とうする。被包化されない核酸を２９，０００×ｇ
での遠心分離により除去し、そしてリポソームペレットを洗浄する。洗浄された
リポソームは、適切な総リン脂質濃度（例えば約５０〜２００ｍＭ）で再懸濁す
る。被包化された核酸の量は標準的方法に従って測定することができる。リポソ
ーム調製物中に被包化された核酸の量の測定後、リポソームを適切な濃度に希釈
しそして使用まで４℃で保存することができる。
【０１６０】 リポソームを含んで成る製薬学的組成物は、通常、水もしくは生理的食塩水溶
液のような、滅菌の製薬学的に許容できる担体もしくは希釈剤を包含することが
できる。 遺伝子治療の投与 当業者は、本発明の発現ベクターを遺伝子治療に利用することができることを
明確に理解する。遺伝子治療のためには、当業者は利用されるべきベクターがプ
ロモーターに操作可能に連結された目的の遺伝子を含有しなければならないこと
を認識しているであろう。アンチセンス遺伝子治療のためには、目的の遺伝子の
アンチセンス配列をプロモーターに操作可能に連結することができる。当業者は
、ある種の例においては、３’ＵＴＲ調節配列のような他の配列が目的の遺伝子
の発現において有用であることを明確に理解する。適切な場合は、遺伝子治療ベ
クターは、それらのそれぞれの投与経路について当該技術分野で既知の方法で固
体、半固体、液体もしくは気体の形態の製剤に処方することができる。それが標
的器官に到達するまで組成物の放出および吸収を予防するか、もしくは組成物の
時宜を得た放出を確実にするために、当該技術分野で既知の手段を利用すること
ができる。本発明の組成物の効力をなくさない製薬学的に許容できる形態を使用
するべきである。製薬学的投薬形態においては、組成物は単独で、もしくは他の
製薬学的有効成分と適切な会合でならびに組み合わせで使用することができる。
薬理学的に有効な用量の遺伝子産物を提供するために、治療的核酸配列を含有す
る十分な量のベクターを投与しなければならない。
【０１６１】 当業者は、ベクターを細胞に投与するために多様な送達方法を利用することが
できることを明確に理解する。例は：（１）電気穿孔法（電気）、ジーンガン（
物理的力）もしくは大容積の液体を適用すること（圧）のような物理的手段を利
用する方法；および（２）前記ベクターをリポソーム、凝集されたタンパク質も
しくは輸送体分子のような別の実体と複合体形成させる方法を包含する。
【０１６２】 従って、本発明は宿主への治療的遺伝子の移入方法を提供し、それは、前述の
投与経路もしくは当業者に既知かつ特定の応用に適切な代替経路のいずれかを使
用して、本発明のベクターを好ましくは組成物の一部として投与することを含ん
で成る。本発明の宿主細胞へのベクターの宿主細胞への効果的な遺伝子移入は、
治療効果（例えば、治療されている特定の疾患に関連するなんらかの症状の緩和
）によって、または、さらに、移入された遺伝子の証拠もしくは宿主内の該遺伝
子の発現（例えば、配列決定とともにのポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンもしく
はサザンハイブリダイゼーション、または宿主細胞中の核酸を検出する転写アッ
セイを使用して、あるいはイムノブロット分析、抗体に媒介される検出、ｍＲＮ
Ａもしくはタンパク質の半減期の研究、または移入された核酸によりコードされ
るタンパク質もしくはポリペプチドを検出する特化されたアッセイ、またはこう
した移入によるレベルもしくは機能に有害な影響を与えられたを使用して）によ
りモニターすることができる。
【０１６３】 本明細書に記述されるこれらの方法は決して包括的でなく、そして特定の応用
にかなうさらなる方法が当業者に明らかであろう。さらに、有効量の組成物は、
所望の効果を発揮することが既知の化合物への類推によりさらに近づけることが
できる。
【０１６４】 さらに、実際の用量およびスケジュールは、該組成物が他の製薬学的組成物と
組み合わせで投与されるかどうかに依存して、もしくは薬物動態、薬物の配置（
ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）および代謝における個体間の差異に依存して変動する
ことができる。同様に、量は、インビトロの応用で、利用される特定の細胞系に
依存して（例えば、細胞表面上に存在するベクター受容体の数、もしくは遺伝子
移入に使用された特定のベクターの、その細胞系中で複製する能力に基づいて）
変動することができる。さらに、細胞あたりに添加されるべきベクターの量は、
ベクター中に挿入された治療的遺伝子の長さおよび安定性、ならびにまた配列の
性質とともに変動することがありそうであることができ、そして、とりわけ、経
験的に決定される必要があるパラメータであり、また、本発明の方法に固有でな
い因子（例えば合成に伴う費用）により変えることができる。当業者は、特定の
情況の緊急性に従っていかなる必要な調節も容易に行うことができる。
【０１６５】 治療的遺伝子を含有する細胞はまた自殺遺伝子（すなわち、単純疱疹ウイルス
チミジンキナーゼのような、細胞を破壊するのに使用することができる産物をコ
ードする遺伝子）も含有することができることが可能である。多くの遺伝子治療
の情況において、宿主細胞中で治療の目的上遺伝子を発現すること、しかしまた
治療が完了するか、制御不能になるか、または予測可能なもしくは望ましい結果
につながらなければ、該宿主細胞を破壊する能力を有することが可能であること
が望ましい。従って、宿主細胞中での治療的遺伝子の発現はプロモーターにより
駆動することができるが、とは言え前記自殺遺伝子の産物はプロドラッグの非存
在下で無害のままである。治療が完了するか、またはもはや望ましくないもしく
は必要とされなければ、プロドラッグの投与は自殺遺伝子産物を細胞に対し致死
的にさせる。使用することができる自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例
は、単純疱疹ウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）およびガンシクロビ
ル、アシクロビルもしくはＦＩＡＵ；酸化還元酵素およびシクロヘキシミド；シ
トシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレー
トキナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）およびＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナ
ーゼおよびシトシンアラビノシドである。
【０１６６】 以下の実施例は例として提供され、そしていかなる様式でも本発明の範囲を限
定することを意図していない。 実施例１ レトロウイルスベクター中でのＨＢｅ抗原の構築および発現 ＨＢｃＡｇおよびＨＢｅＡｇ双方のタンパク質はＨＢＶのプレＣＣ遺伝子によ
りコードされるが、分泌性のＨＢｅＡｇタンパク質はＨＢｃＡｇの開始コドンの
２９残基上流の開始コドンで開始する。アメリカン タイプ カルチャー コレ
クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）（メリーランド州ロックビル）から得られたＨＢｅＡｇ遺伝子を、２個の突
然変異を修正するよう修復した。２個の突然変異が単一塩基対の欠失から発生し
ていることが見出され、これはコドン７４でフレームシフトを引き起こし、８４
および８５に２個の連続的な終止コドンをもたらした。これらの突然変異を、Ｐ
ＣＲ突然変異誘発を使用して、欠失された塩基を挿入することにより修正した。
ウイルス感染の間に切断される、ＨＢｅＡｇのアルギニン豊富なＣ末端配列（ａ
ａ １５０−１８５）を欠失させた。その後、短縮されたＨＢｅＡｇ遺伝子をＩ
ｇＧのＦｃフラグメントと同じ読み枠で融合した。ＨＢｅ−レトロゲン融合遺伝
子（ＨＢｅ−レトロゲン）を、レトロウイスルベクター（ＬＮＣ−ＮＧＦＲ）も
しくは発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化した。ＨＢｃＡｇ（細胞質性）
およびＨＢｅＡｇ（分泌性）を含んで成るベクターは、当該技術分野で利用可能
でありかつ例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１
９９７）に記述される技術を使用して構築した。ＩｇＧのＦｃフラグメント遺伝
子を、図２Ａに示されるとおり、ＩｇＧのシグナルリーダー配列と融合させ、そ
して発現ベクターにクローン化した。この様式で、ＨＢｅＡｇ遺伝子（分泌性）
、シグナルリーダー配列を伴うＦｃフラグメント遺伝子（分泌性）もしくはＨＢ
ｃＡｇ遺伝子（細胞質性）を含有する一連の対照レトロウイルスベクターを、図
２Ａに表されるとおり構築した。
【０１６７】 ＨＢｅ−Ｆｃ融合タンパク質の発現および分泌を評価するため、多様な発現ベ
クターでＣＯＳ細胞をトランスフェクションし、そして４８時間後に細胞を放射
標識した。図３に示されるとおり、ＨＢｅＡｇ−Ｆｃ融合タンパク質に対応する
タンパク質のバンドが、いずれかを抗ヒトＩｇＧもしくは抗ＨＢｅＡｇ抗体（シ
グマ ケミカル カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ミズ
ーリ州セントルイス）で沈降させた場合に、細胞ライセートおよび培地の双方で
検出された。
【０１６８】 トランスフェクションされた細胞の免疫蛍光染色もまた、典型的な分泌性タン
パク質のパターンを表した。ＨＢｃＡｇタンパク質はトランスフェクションされ
た細胞から得られた細胞ライセート中でのみ観察され、また、ＨＢｅＡｇおよび
Ｆｃフラグメントタンパク質は培地および細胞ライセートの双方で観察された。
これらの結果は、ＨＢｅＡｇ−Ｆｃタンパク質（ＨＢｅ−レトロゲン）が効率よ
く産生されかつ細胞から分泌されることを示す。 実施例２ 樹状細胞（ＤＣ）におけるＨＢｅ−レトロゲンの形質導入および発現 ＤＣにおける「レトロゲン」戦略を評価するため、ＮＧＦＲマーカーを包含す
る、ＨＢｅ−レトロゲンもしくは多様な対照遺伝子を含有するレトロウイルスベ
クター（図２Ａ）を、一過性トランスフェクションを使用してＰＡ３１７パッケ
ージング細胞から産生させた。マウス骨髄細胞をＣ５７ＢＬ／Ｂ６マウスから得
た。細胞を、マウス幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＩＬ−６を補充された培地中で
刺激し、そして下などに記述されるとおりレトロウイルスベクターで形質導入し
た。 ＤＣの形質導入 およそ４０％コンフルエントでアメリカン タイプ カルチャー コレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（
メリーランド州ロックビル）から得られたＰＡ３１７パッケージング細胞を、１
０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）を用いて１００ｍｍ培養皿中で培養した。１０〜１５μｍのフィルターを用
いて細胞をトランスフェクションした。
【０１６９】 マウス骨髄をマウス肋骨の骨から水で洗い流し、ナイロンメッシュを通過させ
、そして塩化アンモニウムで赤血球を枯渇させた。ＲＰＭＩ−１６４０での徹底
的な洗浄の後に、ウサギ補体ならびに一組のモノクローナル抗体のカクテル（抗
ＣＤ４＋、抗ＣＤ８＋、抗Ｂ細胞および抗ＭＨＣクラス陽性細胞）とともに、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０中３７℃で４０〜６０分間、細胞をインキュベートした。ＲＰ
ＭＩ−１６４０での徹底的な洗浄の後に、６％ＦＢＳ、８０ｎｇ ｍＳＣＦ／ｍ
ｌおよび２０Ｕ ｒｍＩＬ−６／ｍｌを補充されたＲＰＭＩ−１６４０中に、１
ｍｌあたり５×１０5個の細胞を懸濁した。細胞を１２穴培養プレート（３ｍｌ
／ウェル）中でプレート培養し、３７℃かつ５％ ＣＯ2で一夜インキュベート
し、そしてその後同一の成分を含んで成る新鮮な培地で置き換えた。４８時間の
インキュベーション後、細胞を遠心分離により収集し、１．５ｍｌのレトロウイ
ルス上清に再懸濁し、そして２４穴培養プレート上におき、これを１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度のレトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）で被覆した。細胞を２，
５００ｒｐｍで３７℃で９０〜１２０分間遠心分離し、そしてその後、レトロウ
イルスの形質導入のため追加の３〜４時間、３７℃かつ５％ ＣＯ2でインキュ
ベートした。その後、レトロウイルス上清を、５％ ＦＢＳ、１０ｎｇ ｍＳＣ
Ｆ／ｍｌ、６０ｎｇ ｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍｌおよび１００Ｕ ｍＩＬ−４／ｍｌ
（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス）
を補充された２．５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０で一夜置き換えた。その後、形質
導入手順を２〜３回反復した。形質導入後、細胞を洗浄し、そして、収穫前にＤ
Ｃをさらに成熟させるために、ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｍＩＬ−４を含有するＯｐ
ｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、ニューヨーク州グランドアイランド）中
で数日間培養した（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８；Ｉｎａｂａら、１９９
２）。 形質導入の評価（発現の測定） 培養物中で数日後、典型的なＤＣの形態学的特徴、ならびに高レベルのＭＨＣ
、接着および副刺激分子（ＣＤ１１、ＣＤ５４、ＣＤ８０およびＣＤ８６）を表
された細胞が、骨髄由来ＤＣ上で発現された（図４Ａ−４Ｃおよび５Ａ−５Ｅ）
。抗ＮＧＦＲ染色により決定されるとおり、培養物中の細胞の約２０ないし３０
％が形質導入された。ＤＣにおけるＨＢｅ−レトロゲン遺伝子の転写をＲＴ−Ｐ
ＣＲアッセイで立証した。
【０１７０】 ＲＴ−ＰＣＲアッセイは以下のとおり実施した。すなわち、細胞ＲＮＡを、ト
ライゾアル（Ｔｒｉｚｏａｌ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ、ニューヨーク
州グランドアイランド）を使用してＤＣから抽出し、そしてＲＮアーゼを含まな
いＤＮアーゼで３７℃で３０分間処理した。逆転写後、ＨＢｅＡｇ遺伝子に対応
する一対のプライマーを使用するＰＣＲ反応の鋳型として該ｃＤＮＡを使用した
。アガロースを通す電気泳動によりＰＣＲ産物を分析した。
【０１７１】 これらの結果は、一緒にすれば、ＨＢｅ−レトロゲン融合遺伝子がマウス骨髄
細胞中に効率よく形質導入され、そして骨髄由来のＤＣ中で発現されたことを示
す。興味深いことに、形質導入されたＨＢｅ−レトロゲンを含んで成るＤＣ上で
のＭＨＣ−ＩＩおよび副刺激分子の表面発現は、ＨＢｅＡｇもしくはＨＢｃＡｇ
で形質導入されたＤＣ上の該分子の発現よりも有意により高かった。この観察結
果は、Ｆｃの受容体への結合がＤＣを活性化したことを示唆する。 実施例３ 処理を受けたことのないＣＤ４＋−Ｔ細胞のインビトロ活性化 形質導入されたＤＣが細胞培養物中の処理を受けたことのないＣＤ４＋−Ｔ細
胞をプライミングすることが可能であったかどうかを評価するため、Ｃ５７ＢＬ
／Ｂ６マウス脾細胞から単離された処理を受けたことのないＣＤ４＋−Ｔ細胞を
、実施例１のレトロウイルスベクターで形質導入されたマウスＤＣと１：２０（
ＤＣ：Ｔ細胞）の比で共培養した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮
カラム（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポ
リス）を使用してマウス脾の懸濁物から単離した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ８
＋ Ｔ細胞濃縮カラム（Ｒ＆Ｄ システム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、ミネソタ
州ミネアポリス）を使用してマウス脾の懸濁物から単離した。精製されたＣＤ４
＋もしくはＣＤ８＋ Ｔ細胞は、１０％ ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ−１６４
０中で、３７℃かつ５％ ＣＯ2で培養した。
【０１７２】 処理を受けたことのないＣＤ４＋−Ｔ細胞を、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇもしく
はＦｃフラグメントのいずれかの遺伝子で形質導入されたＤＣと共培養した場合
、培地中で、低もしくはバックグラウンドレベルのみの顆粒球−マクロファージ
コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γがＥ
ＬＩＳＡにより検出された。さらに、細胞数もしくは3Ｈ−チミジンの取込み率
のいずれかをモニターした場合、明らかなＴ細胞の増殖は観察されなかった。対
照的に、処理を受けたことのないＣＤ４＋ Ｔ細胞をＨＢｅ−レトロゲンで形質
導入されたＤＣと５日間共培養した場合、Ｔ細胞が活発に増殖し、また、高レベ
ルのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γが培地中で検出された（図６Ａおよび６Ｂ）
。これらの結果は、分泌性のＨＢｅＡｇもしくは細胞質性のＨＢｃＡｇがＤＣに
より効率よくプロセシングされかつＭＨＣ−ＩＩに提示されることができなかっ
たことを示唆する。対照的に、分泌性のＨＢｅ−レトロゲンは、ＤＣ中でのＦｃ
受容体に媒介されるインターナリゼーションおよびＭＨＣ−ＩＩへの提示の後に
効率よくプロセシングされることができ、処理を受けたことのないＣＤ４＋ Ｔ
細胞のビトロの活性化につながった。
【０１７３】 明らかな、処理を受けたことのないＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化は、形質導入さ
れたＤＣとの共培養で検出されなかった。細胞培養物中での処理を受けたことの
ないＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を検出することの失敗は、ＨＢｅ Ａｇ中に唯一
の既知のＭＨＣ−Ｉに拘束されるエピトープが存在する、また、ＣＤ４＋−Ｔ細
胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞の効率的な活性化に必要とされる（Ｒｉｄｇｅら、１９９
８）という事実によるのかもしれない。
【０１７４】 レトロゲン戦略を使用してＭＨＣ−ＩＩに拘束される抗原提示をさらに立証す
るため、ＤＣによるＭＨＣ−ＩＩ抗原提示が廃止されたＭＨＣ−ＩＩノックアウ
ト（ＫＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、ニューヨーク州）。野性型（ＷＴ）もしくはＭＨＣ−ＩＩ
ＫＯマウス由来のＤＣをＨＢｅ−レトロゲンで形質導入し、そしてその後、Ｗ
Ｔマウスから得られたＣＤ４＋ Ｔ細胞と１：２０の比で共培養した。図７Ａお
よび７Ｂに示されるとおり、形質導入されたＫＯ−ＤＣを含有する共培養物の培
地中で低レベルのみのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γが検出され、また、明らか
なＴ細胞の増殖は観察されなかった。対照的に、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、形質導入
されたＷＴのＤＣと５日間共培養した場合、Ｔ細胞は活発に増殖し、そして培地
中の高レベルのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γが検出された（図７Ａおよび７Ｂ
）。 実施例４ ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞ならびにＢ細胞の免疫応答のインビボ誘導 レトロゲン抗原提示戦略の潜在能力をインビボで評価した。マウス（Ｃ５７Ｂ
Ｌ／Ｂ６）を４群（１群あたりマウス４ないし６匹）に分割し、そして５０，０
００ＵのＩＬ−２（カイロン コープ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）、カリフォ
ルニア州エメリービル）を含有する０．２ｍｌのＰＢＳ中の、ＨＢｃＡｇ、ＨＢ
ｅＡｇ、ＦｃもしくはＨＢｅ−レトロゲンで形質導入された約１００万の半分の
ＤＣを、各マウスに腹腔内注入により投与した。最終投与後の異なる時点でマウ
スを殺し、そして末梢血、脾および他の器官を収集した。ＣＤ４もしくはＣＤ８
＋ Ｔ細胞濃縮カラム（Ｒ＆Ｄ システム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、ミネソタ
州ミネアポリス）を使用して、分析のため、Ｔ細胞を単離した。
【０１７５】 最初の注入の３ヶ月後にマウスを殺し、そして末梢血、脾および他の組織サン
プルを収集した。全体検査から、ＨＢｅ−レトロゲンで形質導入されたＤＣを投
与されたマウスで腹腔のリンパ節が有意に拡大していた一方、正常マウスおよび
他の構築物を投与されたマウスにおいては、リンパ節は可視的であるには小さす
ぎた。組織学的検査もまた、ＨＢｅ−レトロゲン−ＤＣを投与されたマウスの末
梢リンパ節中でのＴ細胞およびＢ細胞の活発な増殖を示した。 実施例５ ＴH１およびＴH２ヘルパーＴ細胞の誘導 実施例４でのとおり免疫化されたマウスを使用して、ＴH１およびＴH２ヘルパ
ーＴ細胞の誘導を決定した。当業者は、ＴH１およびＴH２細胞の誘導の決定の重
要性を認識している。ＣＤ４＋−Ｔ細胞が以下の機能を実施することが公知であ
る。すなわち１）それらはＢ細胞が抗体産生プラズマ細胞に発達するのを助ける
；２）それらはＣＤ８＋−Ｔ細胞が活性化された細胞傷害性Ｔ細胞になるのを助
ける；および３）それらは遅延型過敏症を達成する。これらの機能はＣＤ４細胞
の２種の亜集団により実施される。すなわち、ＴH１細胞は遅延型過敏症を媒介
しかつ主としてＩＬ−２およびγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）を産生する
一方、ＴH２細胞はＢ細胞のヘルパー機能を実施しかつ主としてＩＬ−４および
ＩＬ−５を産生する。
【０１７６】 ＣＤ４＋−Ｔ細胞は、抗ＣＤ４カラム（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、免疫化されたマウスの脾か
ら単離し、そしてその後、これらの細胞を、組換えＨＢｅＡｇタンパク質を適用
された（ｐｕｌｓｅｄ）マウスのＤＣと共培養した。１０００：１のＴ細胞：Ｄ
Ｃの比を有する細胞の共培養物中でわずか２日後に、ＨＢｅ−レトロゲン−ＤＣ
Ｓを投与されたマウスからのＣＤ４＋−Ｔ細胞が活発に増殖した。高レベルのＧ
Ｍ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ（マクロファージおよびＣＤ８＋−Ｔ細胞を刺激す
る）ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５（Ｂ細胞を刺激する）が共培養物の培地中
で検出された。抗ＣＤ４抗体はこれらの共培養されたＴ細胞中でのサイトカイン
産生を劇的に封鎖したが、しかし抗ＣＤ８抗体はしなかった。対照的に、ＨＢｅ
Ａｇ−、ＨＢｃＡｇ−もしくはＦｃ−ＤＣで免疫化されたマウスから得られたＣ
Ｄ４＋−Ｔ細胞をＨＢｅＡｇ−ＤＣと共培養した場合、低レベルのＧＭ−ＣＳＦ
、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５のみが共培養物の培地中で検出され、ま
た、活発なＴ細胞増殖は観察されなかった。ＩＬ−４およびＩＬ−５は主として
ＴH２により、また、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γはＴH１細胞により産生され
るため、この結果は、ＨＢｅ−レトロゲンで形質導入されたＤＣがＴH１および
ＴH２双方のＴ細胞を効果的に活性化することを立証する。 実施例６ 高力価の抗ＨＢｅＡｇ抗体の誘導 マウスを実施例４でのとおり免疫化して抗体のレベルを測定した。ＨＢｅ−レ
トロゲンで形質導入されたＤＣでのマウスの免疫感作は、マウスで高力価の長く
持続する抗ＨＢｅ／ｃＡｇ抗体応答を誘導した。図８に示されるとおり、ＨＢｅ
Ａｇで形質導入されたＤＣを投与されたマウスでよりも、ＨＢｅ−レトロゲンで
形質導入されたＤＣを投与されたマウスの血清中で、有意により高い力価の抗Ｈ
ＢｅＡｇ抗体が検出された。免疫化されたマウスの血清中での抗ＨＢｃＡｇ抗体
のレベルを、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。簡潔には、ＨＢｃＡｇ組換え体タ
ンパク質（５０ｎｇ／ウェル）で被覆されたマイクロタイタープレートを、ブロ
ッキング緩衝液で連続的に希釈された血清とともに４℃で２時間インキュベート
した。ブロッキング緩衝液で希釈された、マウスＩｇＧに対するペルオキシダー
ゼ結合抗体とのインキュベーション後に、結合された抗体を検出した。カイロン
コープ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）（カリフォルニア州エマージービル）か
ら得られたポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体を陽性対照として使用し、そして正
常マウス血清を陰性対照として使用した。抗体力価は、陰性レベルの２倍上であ
ったＯＤ450値を有する最高の希釈物と定義した。
【０１７７】 観察された抗体産生の増大倍数は、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞のより強い活性
化によることができる。ＨＢｃＡｇで形質導入されたＤＣで免疫化されたマウス
の血清中の有意により低いレベルの抗ＨＢｅ／ｃＡｇ抗体は、ＨＢｃＡｇの細胞
質での所在およびＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化の欠如によることができる。従って、
ＨＢｅ−レトロゲンは、それで免疫化された哺乳動物における抗体応答の誘導に
関して、他のＨＢｅＡｇおよびＨＢｃＡｇ構築物より有意に優れている。一緒に
すれば、マウスモデル研究の結果は、ＨＢｅ−レトロゲンで形質導入されたＤＣ
が、活発なＣＤ４＋およびＣＤ８＋−Ｔ細胞活性化ならびにＢ細胞活性化を誘導
したことを立証する。 実施例７ 細胞内腫瘍抗原のベクター構築物 ＭＡＧＥ−３は内在性のＭＨＣ−ＩＩ提示経路のためのターゲッティング配列
を欠く細胞質および核タンパク質であり、ＭＨＣ−ＩＩ上でのその提示をありそ
うもないかもしくは困難にする。マウス相同物が存在しないため、ヒトＭＡＧＥ
−３遺伝子をヒトケモカインＲＡＮＴＥＳ遺伝子由来のシグナルリーダー配列に
連結して、ＭＡＧＥ−３の分泌を可能にした。完全長のＭＡＧＥ−３遺伝子をコ
ードするプラスミドを鋳型として使用し、一対のプライマー、すなわち５’−プ
ライマー（Ａ）：（配列番号１）５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＴＣＴ
ＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧ−３’（１個の付加的なＳａｌ Ｉ制限部位
を伴うＭＡＧＥ−３遺伝子のポリヌクレオチド配列１ないし２４に対応する）、
および３’−プライマー（Ｂ）：（配列番号２）５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣ
ＡＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＣ−３’（１個のＸｈｏＩ部位を
伴うＭＡＧＥ−３のポリヌクレオチド配列９２１ないし９４５に対応する）を用
いてＭＡＧＥ−３ ＤＮＡを増幅した。ヒトＲＡＮＴＥＳ遺伝子由来のシグナル
リーダー配列の付加は、一対のプライマー、すなわち５’−プライマー（Ｃ）：
（配列番号３）５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧ
ＣＡＧＣＣＣＴＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＣＴＣＴ
ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡ
ＧＴＣＡＧ−３’（ＲＡＮＴＥＳのシグナルリーダー配列および１個のＳａｌ
Ｉ部位を伴うＭＡＧＥ−３遺伝子のポリヌクレオチド配列１ないし２４に対応す
る）、ならびに３’−プライマー−Ｂを用いるＰＣＲ増幅により生成させた。終
止コドンを伴わないシグナル−ＭＡＧＥ−３フラグメント（ｓ−ＭＡＧＥ−３）
は、５’−プライマー−Ｃおよび３’−プライマー（Ｄ）：（配列番号４）５’
−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＡＡ
ＡＡＣ−３’（１個のＮｏｔ Ｉ部位を伴うＭＡＧＥ−３のポリヌクレオチド配
列９２１ないし９４２に対応する）を用いるＰＣＲにより生成させた。最も強力
なＡＰＣであるＤＣはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）を発現し、これは有効な
ＭＨＣ−ＩＩならびにＭＨＣ−Ｉに拘束される抗原のための特権のある抗原のイ
ンターナリゼーション経路を媒介する。これゆえに、マウスＤＣ上のＦｃ受容体
に効率よく結合することができるヒトＩｇＧ１ａ由来のＦｃフラグメントのｃＤ
ＮＡを、ＤＣによるＭＡＧＥ−３のインターナリゼーションを媒介するように、
改変されたＭＡＧＥ−３遺伝子と同じ読み枠で融合した（図９Ａ）。その後、分
泌性のＭＡＧＥ−３融合遺伝子（ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ）をマウスレトロウイ
ルスベクターｐＦＢ−Ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にク
ローン化した（図９Ａ）。ヒトＩｇＧ ｃＤＮＡのＦｃフラグメントは、鋳型と
してヒトＩｇＧ１ａ重鎖ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＥ６／ＣＬＬ−１を
用いるＰＣＲ増幅により生成させた。該ＰＣＲ反応のためのプライマー対は：５
’−プライマー（Ｅ）、（配列番号５）５’−ＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡ
ＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡ−３’（１個の付加的なＮｏｔ Ｉ部位を伴
う重鎖のポリヌクレオチド配列７８５ないし８０２に対応する）および３’−プ
ライマー（Ｆ）、（配列番号６）５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴ ＴＴＡＣ
ＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’（１個のＸｈｏ Ｉ部位を伴う重鎖の
ポリヌクレオチド配列１４４７ないし１４６８に対応する）である。マウスレト
ロウイルスベクターｐＦＢ−Ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
）をこの研究に使用した。レトロウイスルベクターｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃは、
終止コドンを含まないｓ−ＭＡＧＥ−３フラグメント、ＦｃおよびＳａｌ Ｉ／
Ｘｈｏ Ｉ切断されたｐＦＢ−Ｎｅｏの３片の連結により構築した。レトロウイ
ルスベクターｓ−ＭＡＧＥ−３もしくはＭＡＧＥ−３は、Ｓａｌ Ｉ／Ｘｈｏ
Ｉ切断されたｐＦＢ−Ｎｅｏにそれぞれｓ−ＭＡＧＥ−３もしくはＭＡＧＥ−３
遺伝子を挿入することにより構築した。ＩｇＧ Ｆｃの発現ベクターを構築する
ために、ヒトＩｇＧ ＦｃのｃＤＮＡフラグメントを、２回のＰＣＲ反応により
免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）シグナルリーダー配列と連結した。第一のＰＣＲ反
応において、一対のプライマー、すなわち５’プライマー、（配列番号７）５’
ＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡ
ＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’（重鎖のポリヌクレオチド配列
７８５ないし８１５および部分的ＶＨリーダー配列に対応する）、ならびに３’
−プライマーＦ（配列番号６）を用いる増幅のための鋳型として、ＩｇＧ Ｆｃ
のｃＤＮＡを使用した。鋳型として第一のＰＣＲの産物を利用する第二のＰＣＲ
は、一対のプライマー、すなわち５’プライマー、（配列番号８）５’−ＡＣＧ
ＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣ
ＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣ−３’（１個の
付加的なＳａｌ Ｉ部位を伴うＶＨ分泌シグナルリーダー配列のＮ末端のポリヌ
クレオチド配列に対応する）および３’−プライマーＦ（配列番号６）を用いて
実施した。その後、シグナルリーダー配列を伴うＦｃのｃＤＮＡをレトロウイル
スベクターにクローン化した。発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＭＡＧＥ−３は
、ＭＡＧＥ−３をＸｈｏＩ／ＸｂａＩ切断されたｐｃＤＮＡ３．１（インヴィト
ロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入することにより構築した。天然の細
胞内ＭＡＧＥ−３、分泌性のｓ−ＭＡＧＥ−３もしくは分泌性のＦｃフラグメン
トを発現する数種の対照レトロウイルスベクターもまた構築した（図９Ａ）。各
結果として生じるベクターを、制限酵素分析により同定しかつＤＮＡ配列決定に
より確認した。 実施例８ レトロウイルスの産生および骨髄由来ＤＣの形質導入 レトロウイスルベクターは一過性トランスフェクションにより産生した。パッ
ケージング細胞（ＰＡ３１７）を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃ
ｏ）−ＢＲＬ）を含有するＤＭＥＭを用いて１００ｍｍ培養皿で培養し、そして
リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）に
より、エンドトキシンを含まないキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）キットを使用するこ
とにより調製したレトロウイスルベクタープラスミド（実施例７から、すなわち
細胞内ＭＡＧＥ−３、分泌性のｓ−ＭＡＧＥ−３もしくは分泌性のＦｃフラグメ
ント）１０〜１５μｇでトランスフェクションした。一夜インキュベーションの
後に、培地を、５％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで置き換えた。４８時間後、組
換えレトロウイルスを含有する培地を、既に記述された（Ｃｈｅｎら、１９９７
）とおり収穫しかつ濾過（０．２２μｍ）した。ＤＣを生じさせるため、骨髄細
胞をマウス肋骨の骨から水で洗い流し、ナイロンメッシュを通過させ、そして塩
化アンモニウムで赤血球を枯渇させた。ＲＰＭＩ−１６４０での徹底的な洗浄の
後、細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０中、ウサギ補体（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍ））ならびに抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０および抗
ＭＨＣ−ＩＩ（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）およびバイオソース
インターナショナル（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））よ
り成るモノクローナル抗体のカクテルとともに３７℃で４０〜６０分間インキュ
ベートした。ＲＰＭＩ−１６４０での徹底的な洗浄の後、６％ ＦＢＳ、８０ｎ
ｇ ｍＳＣＦ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））および
２０単位（Ｕ）ｍＩＬ−６／ｍｌ（バイオソース インターナショナル（Ｂｉｏ
Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を補充されたＲＰＭＩ−１６４
０中の細胞（１ｍｌあたり細胞５×１０5個）を１２穴培養プレート中でプレー
ト培養し（２．５ｍｌ／ウェル）、３７℃、５％ ＣＯ2で一夜インキュベート
し、そしてその後新鮮な培地を再供給した。４８時間のインキュベーション後に
細胞を回転して落とし（ｓｐｕｎ ｄｏｗｎ）、１．５ｍｌのレトロウイルス上
清に再懸濁し、１０〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のレトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅ
ｃｔｉｎ）（パン ヴェラ（Ｐａｎ Ｖｅｒａ））で被覆された２４穴培養プレ
ート上に置き、そして３７℃、５％ ＣＯ2で３〜４時間インキュベートした。
その後、上清を、５％ ＦＢＳ、１０ｎｇマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）／ｍｌ
、６０ｎｇ ｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍｌ（バイオソース インターナショナル（Ｂｉ
ｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））および１００Ｕ ｍＩＬ−４
／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を補充された１．５
ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０で一夜置き換えた。形質導入手順を２〜３回反復し、
そして通常この処置により約３０％のＢＭ細胞が形質導入された。最後の形質導
入後、細胞を洗浄し、そしてｍＧＭ−ＣＳＦおよびｍＩＬ−４を含有するＯｐｔ
ｉ−ＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）中で数日間培養して、さらなるＤ
Ｃの分化を可能にした。ＤＣは、既に記述された（Ｉｎａｂａら、１９９２）と
おり、５０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−１６４０沈降処置を用いてさらに濃縮した。
【０１７８】 数日の培養後、細胞の実質的な画分が明確なＤＣの形態学的特徴を示した。逆
転写（ＲＴ）−ＰＣＲアッセイにより立証されるとおり、形質導入されたＤＣ中
でｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ、ｓ−ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−３もしくはＦｃ遺伝
子が転写された。定量的ウェスタンブロッティング分析を使用して、形質導入さ
れたＤＣ中の構築物によるタンパク質の発現および分泌を立証した。簡潔には、
形質導入されたＤＣを、緩衝液（ベーリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））（１０ｍＭトリス １５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．４）、１％ ＴＸ−１００（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、０．５ｍＭ ＰＭＳ
Ｆおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠）を用いて氷上で１０分間溶解した。そ
の後、細胞ライセートおよび培地を、ＭＡＧＥ−３に対するウサギポリクローナ
ル抗体で沈降させ、次いでプロテインＡ−セファロース（シグマ（Ｓｉｇｍａ）
）とともにインキュベートした。その後、沈降物を２０μｌの負荷緩衝液に再懸
濁した。タンパク質サンプル（２０μｌ）を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負
荷し、そしてハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）ＰＶＤＦメンブレン（アマーシャム
ファルマシアル バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａｌ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ））に転写し、これを、５％脱脂粉乳（カーネーション（Ｃａｒｎ
ａｔｉｏｎ））および０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（フ
ィッシャー サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））
を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．５）中４℃での一夜インキュベーションによりブロ
ッキングした。メンブレンを、緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン（Ｔｗｅ
ｅｎ）−２０を含有するＰＢＳ）で洗浄した後、２．５％脱脂乳および０．１％
トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するＰＢＳで希釈された（１：４００）
ＭＡＧＥ−３に対するマウスモノクローナル抗体とともに室温で１時間インキュ
ベートした。洗浄した後、メンブレンをその後緩衝液中のワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ（アマーシャム ファルマシア バイオテック
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））（１：１０，０
００）とともに室温で１時間インキュベートした。最後の洗浄後、メンブレンを
ＥＣＬ−プラス（ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ）化学発光検出キット（アマーシャム ファ
ルマシア バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ））を用いて可視化し、そしてコダック（Ｋｏｄａｋ）のフィルムに曝露し
た。フィルム上のウェスタンブロットのタンパク質のバンドの強度を測定し、そ
して、イメージクヮント（Ｉｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔ）ソフトウェア１．２バージ
ョンを用いてホスホルイメジャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（モレキュ
ラー ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））により分析
した。ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃおよびｓ−ＭＡＧＥ−３タンパク質が効率よく産
生されかつＤＣから分泌された一方、ＭＡＧＥ−３は細胞内に保持された（図９
Ｂおよび９Ｃ）ことが見出された。匹敵するレベルのｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ、
ｓ−ＭＡＧＥ−３およびＭＡＧＥ−３タンパク質が、形質導入されたＤＣ中で発
現された。 実施例９ ＤＣ上でのＦｃの相互作用 ＤＣ上のＦｃγＲとのＦｃの相互作用は細胞の活性化を誘発し、抗原提示に関
与する細胞表面分子のアップレギュレーションを引き起こす。表面マーカーを検
査して、形質導入されたＤＣ中のｓ−ＭＡＧＥ３−Ｆｃの発現がＤＣの活性化を
誘導することができるかどうかを評価した。ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ、ｓ−ＭＡ
ＧＥ−３もしくはベクターで形質導入されたＤＣの表面マーカーをフローサイト
メトリーアッセイにより測定した。簡潔には、ＦｃγＲを封鎖するため、ＤＣを
抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅ
ｎ））とともに４℃で３０〜６０分間前インキュベートした。その後、ＤＣを一
次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートし、次いで抗マウスもしくは抗ウ
サギＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体とともにインキュベートした。徹底的な洗浄の後、
セルクェスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェアを用いるＦＡＣＳｃａｎ（ベ
クトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））によりＤＣを
分析した。図９Ｄ、９Ｅおよび９Ｆに示されるとおり、ｓ−ＭＡＧＥ−３もしく
はベクター対照で形質導入されたＤＣ上でよりも、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃで形
質導入されたＢＭ細胞由来のＤＣおよびＬＰＳの存在下でのＤＣ上で、より高レ
ベルのＭＨＣクラス−ＩＩ、ＣＤ４０およびＣＤ８６が発現された。これらの結
果は、分泌およびＦｃγＲとの融合タンパク質Ｆｃのその後の相互作用がＤＣを
活性化することを示唆する。 実施例１０ インビボでの強力なＴH１の誘導 ＭＡＧＥ−３の分泌およびその後のインターナリゼーションがインビボでのこ
の抗原の免疫原性を高めることができるかどうかを評価するため、ＤＣをレトロ
ウイルスベクターによりｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ、ｓ−ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ
−３もしくはＦｃで形質導入し、そしてその後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１回ｉ
．ｖ．投与した（マウスあたり５０，０００Ｕ ＩＬ２（カイロン（ｃｈｉｒｏ
ｎ））を含有する３０μｌのＰＢＳ中０．５〜１×１０5個のＤＣ）。免疫感作
４ないし６週間後にマウスを殺し、そして末梢血、脾および他の組織サンプルを
収集した。ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されたマウスにおいてはリン
パ節が実質的に拡大した（病原体感染の記憶）が、しかし、ｓ−ＭＡＧＥ−３、
ＭＡＧＥ−３もしくはＦｃで形質導入されたＤＣを投与されたマウスではしなか
った。
【０１７９】 形質導入されたＤＣでの免疫感作がＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞応答を誘導する
ことができるかどうかを決定するため、免疫化されたマウスの脾細胞からのＣＤ
４＋ Ｔ細胞を単離し、そしてその後、それらをｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃで形質
導入された骨髄（ＢＭ）由来ＤＣと共培養した。簡潔には、ＣＤ４＋もしくはＣ
Ｄ８＋ Ｔ細胞濃縮カラム（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））
を用いて脾懸濁物からＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離し、そしてその
後、さらなる分析前に２４ないし４８時間、１０％ ＦＢＳを補充されたＲＰＭ
Ｉ−１６４０中で培養した。免疫化されたマウスからの排出リンパ節を、０．１
％ ＤＮアーゼＩ（画分ＩＸ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））および１ｍｇ／ｍｌコラ
ゲナーゼ（ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））のカクテルを用い、３７℃で４０〜６
０分間消化した。さらなる研究のため、抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）マイクロビー
ズ（Ｍｉｃｒｏ−Ｂｅａｄｓ）（ミルテニイ バイオテック インク（Ｍｉｌｔ
ｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ））を用いて、ＤＣをリンパ節もしくは脾の細
胞懸濁物から正に単離した。異なる比のＣＤ４＋ Ｔ細胞対ＤＣでの２週間の共
培養の間に、ｓ−ＭＡＧＥ−３−ＤＣ、ＭＡＧＥ−３−ＤＣもしくはＦｃ−ＤＣ
で免疫化されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞は活発に増殖せず、また、低レベ
ルのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−４のみが共培養物の培地中
で検出された（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄ）。免疫化されたマウス
からのＣＤ４＋ Ｔ細胞を、多様な時間の間、１０００：１（Ｔ細胞：ＤＣ、２
×１０5個：２×１０2個）の比でＤＣと共培養した。共培養物の上清を収穫し、
そしてその後、製造元の説明書（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））に
従ってＥＬＩＳＡ（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））によりサイトカ
イン濃度についてアッセイした。対照的に、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免
疫化されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞との共培養物において、高レベルのＩ
Ｌ−２およびＩＦＮ−γが、１：１０００（ＤＣ：Ｔ細胞）の比でさえ、わずか
４８時間の共培養後に共培養物の培地中で検出された。抗ＣＤ４抗体は、共培養
された細胞によるサイトカイン産生を封鎖したが、しかし抗ＣＤ８抗体はしなか
った（図１１Ａ）。反復された実験は類似の結果を示した。Ｔ細胞応答の特異性
をさらに決定するため、関連性のないＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）
を発現するレトロウイルスベクターで形質導入された、ＢＭ由来のＤＣを、ｓ−
ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培
養した。低レベルのＩＦＮ−γおよび他のサイトカインのみが共培養物の培地中
で検出された（図１１Ｂ）。さらに、免疫感作後６週間のマウスのリンパ節から
のＤＣを、抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（ミルテニイ バイオテック インク（
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．））を用いて単離し、そして同一の
免疫化されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養した。図１２Ａ、１２Ｂ、
１２Ｃおよび１２Ｄに示されるとおり、高レベルのＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよび
ＴＮＦ−αは、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されたマウスからの細胞
の共培養物中でのみ検出された。これらの結果は、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃで形
質導入されたＤＣがリンパ様器官もしくは組織に帰ることができ、そして、天然
のＭＡＧＥ−３もしくはｓ−ＭＡＧＥ−３で形質導入されたＤＣがするよりも効
率よくＴｈ１応答を活性化することを示す。 実施例１１ インビボでのＣＴＬの誘導 ＪＡＭ、もしくは「ただもうひとつの方法（ｊｕｓｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｍｅ
ｔｈｏｄ）」試験を実施して、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣでの免疫感作が強
いＣＴＬ応答を誘導することができるかどうかを決定した。ＪＡＭ試験を使用し
て細胞傷害活性を測定した。簡潔には、マウスを免疫感作後多様な時点で殺し、
そして脾細胞の単一細胞懸濁物をＲＰＭＩ １６４０ １０％ ＦＢＳ中で培養
した。全体で４×１０6個の脾細胞を、２４穴プレート（コスター（Ｃｏｓｔａ
ｒ））中２ｍｌあたり８×１０4個のγ線照射された（１０，０００ラド）共通
遺伝子のＥＬ４−ＭＡＧＥ−３細胞もしくはＥＬ４−ＨＢｃＡｇ細胞で、５％
ＣＯ2中３７℃で４〜６日間再刺激し、プールし、そしてその後１ｍｌあたり１
×１０7個に再懸濁した。標的細胞を標識するため、3Ｈ−チミジンを２μＣｉ／
ｍｌの最終濃度で１ｍｌあたり５×１０5個のＥＬ４−ＭＡＧＥ−３もしくはＥ
Ｌ４−ＨＢｃＡｇ細胞に添加した。６時間のインキュベーション後、細胞をＰＢ
Ｓで１回穏やかに洗浄し、そして培地に再懸濁した（１ｍｌあたり細胞１×１０5 個）。その後、異なる数のエフェクター細胞を９６穴丸底プレート（２００μ
ｌ／ウェル）中で一定数の標的細胞（ウェルあたり１×１０4個）と３７℃で４
時間共培養し、その後、細胞およびそれらの培地をその後ガラス繊維フィルター
（フィルター メイト ハーベスター（Ｆｉｌｔｅｒ Ｍａｔｅ Ｈａｒｖｅｓ
ｔｅｒ）、パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ））上に吸引し、それをその後水で徹底
的に洗浄した。フィルターを乾燥しかつ９６穴プレート上に置いた後に、２５μ
ｌのマイクロシント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ）２０（パッカード（Ｐａｃｋａｒ
ｄ））を各ウェルに添加した。プレートを、トップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ
）ＮＸＴマイクロプレートシンチレーションおよび発光計数器（Ｍｉｃｒｏｐｌ
ａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃ
ｏｕｎｔｅｒ）（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ））で計数した。いくつかの実験
においては、再刺激されたエフェクター細胞集団を、抗ＣＤ４もしくは抗ＣＤ８
抗体（ウェルあたり３０μｌ、ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））とと
もに３０〜６０分間インキュベートして、細胞傷害性アッセイの前にＣＤ４＋も
しくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を枯渇させた。特異的殺傷のパーセントを：（Ｔ細胞の
非存在下に保持される標的細胞ＤＮＡ（自発的）−Ｔ細胞の存在下に保持される
標的細胞ＤＮＡ）／保持される自発的ＤＮＡ×１００と定義した。総3Ｈ−チミ
ジン取込みの値は、しばしば、自発的保持に類似である。免疫化されたマウスか
らの脾細胞を、インビトロで、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ ＦＢＳ中、共通遺
伝子細胞ＥＬ４−ＭＡＧＥ−３で再刺激し、そしてその後、3Ｈ−チミジン標識
されたＥＬ４−ＭＡＧＥ−３細胞と多様なエフェクター／標的比で共培養して、
特異的殺傷を測定した。ＥＬ４−ＭＡＧＥ−３細胞は、ＭＡＧＥ−３発現ベクタ
ー（ｐｃＤＮＡ３．１−ＭＡＧＥ−３）でのトランスフェクションおよびゼオシ
ン（Ｚｅｏｃｉｎ）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））選択によ
り樹立し、そしてＰＣＲおよび免疫沈降アッセイによりＭＡＧＥ−３を発現する
ことが示された。
【０１８０】 ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されたマウスからの脾細胞は、ｓ−Ｍ
ＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−３もしくはＦｃで免疫化されたマウスからのものよりも
ずっとより効率よく標的細胞を殺した（図１３）。殺傷の特異性は、ｓ−ＭＡＧ
Ｅ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されたマウスの脾細胞の、関連性のないＨＢｃＡｇ
を発現するＥＬ４−ＨＢｃＡｇ細胞を殺すことの不可能性（図１３）、および抗
ＣＤ８抗体（しかし抗ＣＤ４抗体でない）での殺傷の阻害により、さらに立証さ
れた。従って、これらの結果は、高められたＴH１および受容体に媒介される抗
原のインターナリゼーションの交差プライミングによりＣＴＬ応答を誘導するｓ
−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣの優れた能力を立証する。 実施例１２ 抗体の誘導 抗体は抗腫瘍免疫においてもまたある役割を担う可能性があるため、（実施例
１０に類似に）免疫化されたマウスの血清中の抗ＭＡＧＥ−３抗体力価をＥＬＩ
ＳＡにより測定した。免疫化されたマウスの血清中の抗ＭＡＧＥ−３抗体をＥＬ
ＩＳＡにより検出した。簡潔には、組換えＭＡＧＥ−３タンパク質（ウェルあた
り各５０ｎｇ）で被覆されたマイクロタイタープレート（ダイナテック（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ））を、ブロッキング緩衝液（ＫＰＬ、メリーランド州ゲイタースバ
ーグ）で連続的に希釈された血清とともに室温で２時間インキュベートした。ブ
ロッキング緩衝液で希釈されたマウスＩｇＧに対するペルオキシダーゼ結合抗体
（シグマ（Ｓｉｇｍａ））とのインキュベーション後に、結合された抗体を検出
した。ＭＡＧＥ−３に対するモノクローナル抗体を陽性対照として、また、正常
マウス血清を陰性対照として使用した。抗体力価は、０．２より大きいＯＤA450 をもつ最高の希釈物と定義した。正常マウス血清のバックグラウンドのＯＤA450 は０．１未満であった。抗ＭＡＧＥ−３抗体はＤＣ免疫感作２週間後に誘導され
、そして免疫感作４〜６週間後にピークに達した。
【０１８１】 図１４に示されるとおり、ｓ−ＭＡＧＥ−３−ＤＣもしくはＭＡＧＥ−３−Ｄ
Ｃで免疫化されたマウスでよりも、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化され
たマウスの血清中で、抗ＭＡＧＥ−３抗体の有意により高い力価が検出された。
抗体応答の特異性は、免疫化されたマウスにおける関連性のないＨＢｃＡｇに対
する抗体の欠如により立証された。これらの知見は、一緒にすれば、ｓ−ＭＡＧ
Ｅ−３−Ｆｃ−ＤＣが、ＣＤ４＋ Ｔｈ、ＣＤ８＋ ＣＴＬ、ならびにＢ細胞応
答の誘導においてＭＡＧＥ−３−ＤＣもしくはｓ−ＭＡＧＥ−３−ＤＣより優れ
ていることを示す。 実施例１３ ヘルパーＴ細胞の高められた相互作用 ＤＣ上のＭＨＣ−ＩＩの情況においてそれらの特異的ペプチドを認識するプラ
イミングされたＣＤ４＋ ＴH細胞は、馴化されたＤＣとのそれらの相互作用を
大きく増大させる。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌを介するこの相互作用はＩＬ−１２の
ＤＣでの産生を誘発することができ、そしてＣＴＬ応答のためのＴ細胞ヘルパー
を生じさせるために決定的に重要である。このアプローチが、ｓ−ＭＡＧＥ−３
−Ｆｃ−ＤＣとのＣＤ４＋ ＴHの相互作用を高めることができるかどうかを試
験するために、プライミングされたＣＤ４＋ Ｔ細胞との共培養物中での形質導
入されたＤＣによるＩＬ−１２産生を測定した。プライミングされたＣＤ４＋
Ｔ細胞をｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されたマウスから単離し、そし
てその後、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ、ｓ−ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−３もしくは
Ｆｃで形質導入されたＢＭ由来のＤＣと共培養した。図１５に示されるとおり、
ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣとのＣＤ４＋ Ｔ細胞の共培養物中でＩＬ−１２
産生の有意の増大が観察されたが、しかし、ｓ−ＭＡＧＥ−３−ＤＣもしくはＭ
ＡＧＥ−３−ＤＣとの共培養物中ではされなかった。ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−
ＤＣによるＩＬ−１２産生は、プライミングされたＣＤ４＋ Ｔ細胞上でＣＤ４
０Ｌで封鎖することにより阻害された。ＤＣにおけるＦｃの発現もまた、より小
さい程度まで、ＩＬ−１２産生を非特異的に高めた。これらの結果は、実施例１
０、１１および１２のデータのインビボの結果と一緒に、ＭＡＧＥ−３の分泌お
よびその後のＦｃγＲに媒介されるインターナリゼーションが、ＴH１およびＣ
ＴＬ応答の誘導のためのＤＣ上でのＭＡＧＥ−３の交差提示につながることを示
す。 実施例１４ ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣにより誘導される保護的免疫 高められた抗ＭＡＧＥ−３免疫応答が効果的な抗腫瘍免疫につながることがで
きるかどうかを検査するため、攻撃実験を実施した。ＥＬ４−ＭＡＧＥ−３細胞
系を、共通遺伝子のマウス中で迅速に成長する親腫瘍ＥＬ−４系統から生じさせ
、そして攻撃実験に使用した。共通遺伝子のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮内に埋植
される場合、ＥＬ４−ＭＡＧＥ−３細胞（細胞０．５ないし１×１０6個）は、
親のＥＬ−４細胞のものに類似の攻撃的な腫瘍の成長を示し、接種後わずか３〜
５日までにマウスで目に見える腫瘍を生じさせ、そして通常は接種後１ヶ月以内
にマウスの死をもたらした。ＥＬ４−ＭＡＧＥ−３腫瘍の成長を阻害するｓ−Ｍ
ＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣの能力を試験するため、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ、ｓ−
ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−３もしくはＦｃで形質導入された１×１０5個のＤＣ
でｉ．ｖ．で２回（７日間隔）、マウスを免疫化し、次いでＥＬ４−ＭＡＧＥ−
３細胞（１×１０6個）で攻撃した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、第０日および第
７日に、１×１０5個の形質導入されたＤＣを用いるｉ．ｖ．注入により免疫化
し、そしてその後、第二の免疫感作の１週間後に、１×１０6個の指数的に成長
するＥＬ４−ＭＡＧＥ−３もしくはＥＬ４−ＨＢｃＡｇ細胞で皮内で攻撃した。
２ないし３日ごとに腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の容積を以下、すなわち（最長
直径）×（最短直径）2のとおり計算した。
【０１８２】 図１６Ａに示されるとおり、腫瘍の成長はｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免
疫化されたマウスでずっとより大きな程度まで阻害されたが、とは言えｓ−ＭＡ
ＧＥ−３−ＤＣ、ＭＡＧＥ−３−ＤＣもしくはＦｃ−ＤＣ（非特異的免疫刺激物
質）さえでの免疫感作は若干の程度の保護を賦与した。これらの構築物により示
された抗腫瘍活性の効力は、免疫応答を誘導するそれらの能力と相互に関連した
。一貫して、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されたマウスは、他のベク
ターで形質導入されたＤＣで免疫化されたマウスよりかなりより長く生存した（
図１６Ｂ）。ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣにより誘導される抗腫瘍活性は特異
的であった。なぜなら、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣで免疫化されかつ野性型
ＥＬ４もしくはＥＬ４−ＨＢｃＡｇ細胞で攻撃されたマウスもまた致死的な腫瘍
を発生しそして１ヶ月以内に死んだためである。このモデルでは、免疫系は致死
的な腫瘍の成長を迅速に効果的に制御するのに十分な応答時間を有しなかったか
もしれないのであるが、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ−ＤＣはまた、マウスにおける
樹立されたＥＬ４−ＭＡＧＥ−３腫瘍の成長も部分的に阻害した。 実施例１５ 哺乳動物発現ベクターにおけるＨＢｅ抗原の構築 完全長のＨＢＶ（ａｄｗサブタイプ）ゲノムをコードするプラスミドをアメリ
カン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から得た。ＨＢＶのプレコア
／コア遺伝子は１個の単一塩基対欠失を含有することが見出され、これはコドン
７９でフレームシフトを引き起こし、８４および８５で２個の連続する終止コド
ンをもたらす。ＰＣＲ突然変異誘発を使用して、欠失された塩基を挿入すること
により、この遺伝子を修復し、そしてＤＮＡ配列決定により確認した。完全長の
ＨＢｅＡｇ遺伝子は、一対のプライマー（５’−プライマー（Ｐ−Ａ）：（配列
番号９）５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ
ＣＴＡＡＴＣ−３’（１個の付加的なＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を伴うＨＢＶゲノ
ムのポリヌクレオチド配列１９０４ないし２０２０に対応する）、および３’−
プライマー（Ｐ−Ｂ）：（配列番号１０）５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＴ
ＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡ−３’（付加的なＸｂａ Ｉおよび
Ｃｌａ Ｉ部位を伴うＨＢＶゲノムのポリヌクレオチド配列２４３７ないし２４
５７に対応する））を用いる修復されたＨＢＶゲノムのＰＣＲ増幅により生じさ
せた。ウイルス感染の間に切断されるＨＢｅＡｇのアルギニン豊富なＣ末端配列
（ａａ １５０−１８５）の欠失を伴う短縮されたＨＢｅＡｇ遺伝子は、一対の
プライマー（５’−プライマー：Ｐ−Ａ（配列番号９）および３’−プライマー
（配列番号１１）５’−ＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ ＴＣＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧ
ＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＴ−３’（１個の付加的なＮｏｔ Ｉ制限部位を伴う
ＨＢＶゲノムのポリヌクレオチド配列２３２４ないし２３５０に対応する））を
用いるＰＣＲ増幅により生じさせた。完全長のＨＢｃＡｇ遺伝子は、一対のプラ
イマー（５’−プライマー：（配列番号１２）５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧ
ＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＧＣ−３’（１個の付
加的なＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を伴うＨＢＶゲノムのポリヌクレオチド配列１９
０１ないし１９３２に対応する）およびプライマーＰ−Ｂ（配列番号１０））を
用いるＰＣＲ増幅により生じさせた。ヒトＩｇＧ ｃＤＮＡのＦｃフラグメント
は、鋳型としてヒトＩｇＧの重鎖ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＥ６／ＣＬ
Ｌ−１を用いるＰＣＲ増幅により生じさせた。該ＰＣＲ反応のためのプライマー
対は：５’−プライマー（配列番号１３）５’−ＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡ
ＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡ−３’（１個の付加的なＮｏｔ Ｉ部位を
伴う重鎖のポリヌクレオチド配列７８５ないし８０２に対応する）および３’−
プライマー（Ｐ−Ｃ）（配列番号１４）５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＴＣ
ＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ−３’（１個のＣｌａ Ｉ部位を
伴う重鎖のポリヌクレオチド配列１４４７ないし１４６８に対応する）である。
ｐＲｃ／ＣＭＶベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をこ
の研究に使用した。ＩｇＧ Ｆｃに同じ読み枠で融合された短縮されたＨＢｅＡ
ｇより成る分泌性のＨＢｅ−Ｆｃ融合タンパク質を発現する発現ベクターＨＢｅ
−Ｆｃは、短縮されたＨＢｅフラグメント、ＩｇＧ ＦｃおよびＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ／Ｃｌａ Ｉ切断されたｐＲｃ／ＣＭＶベクターの３片の連結により構築した
。分泌性ＨＢｅＡｇタンパク質を発現する発現ベクターＨＢｅＡｇは、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ／ＣｌａＩ切断されたｐＲｃ／ＣＭＶベクター中にＨＢｅＡｇ遺伝子を挿
入することにより構築した。細胞質のＨＢｃＡｇタンパク質を発現する発現ベク
ターＨＢｃＡｇは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ切断されたｐＲｃ／ＣＭＶベクタ
ー中にＨＢｃＡｇ遺伝子を挿入することにより構築した。ＩｇＧ Ｆｃ発現ベク
ターを構築するために、ヒトＩｇＧ ＦｃのｃＤＮＡフラグメントを、２回のＰ
ＣＲ反応によりマウスＶＨシグナルリーダー配列と連結した。第一のＰＣＲ反応
において、ＩｇＧ ＦｃのｃＤＮＡを、一対のプライマー（５’プライマー（配
列番号１５）、５’−ＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡ
ＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’（重鎖の
ポリヌクレオチド配列７８５ないし８１５および部分的ＶＨリーダー配列に対応
する）、ならびに３’−プライマーＰ−Ｃ（配列番号１４））を用いる増幅のた
めの鋳型として使用した。鋳型として第一のＰＣＲの産物を利用する第二のＰＣ
Ｒは、一対のプライマー（５’プライマー、（配列番号１６）５’−ＴＴＡＡＧ
ＣＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴ
ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣ−３’（付加的な
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ部位を伴うＶＨリーダー配列のＮ末端のポリヌク
レオチド配列に対応する）、ならびに３’プライマーＰ−Ｃ（配列番号１４））
を用いて実施した。リーダー配列を伴うＦｃのｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃ
ｌａＩ切断されたｐＲｃ／ＣＭＶベクターにクローン化した。これらの結果とし
て生じるベクターは、制限酵素分析により同定しかつＤＮＡ配列決定により確認
した。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＸＬ−１ ｂｌｕｅ）に形質転
換し、そして単一コロニーから５０μｇ／ｍｌアンピシリンの存在下に３７℃で
１６〜２０時間成長させた。標準的プロトコルに従い、エンドトキシンを含まな
い精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してＤＮＡを単離した。ＤＮ
Ａは、エンドトキシンを含まないＰＢＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に１ｍｇ／ｍ
ｌの最終濃度で再懸濁した。ＯＤ２６０／２８０の比は１．８から２．０までの
範囲にわたった。ＤＮＡを−２００℃で保存し、そして免疫感作の日の前に制限
消化により分析した。
【０１８３】 ヒトＩｇＧ１ａ由来のＦｃフラグメントを、モデルのＨＢＶヌクレオキャプシ
ドタンパク質のインターナリゼーションを高めるための細胞結合要素として使用
した。なぜなら、ＤＣはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）を発現し、これは効率
的なＭＨＣ−ＩＩならびにＩに拘束される抗原の提示のための特権のある抗原の
インターナリゼーション経路を媒介するからである。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｅＡ
ｇの双方がＨＢＶのプレＣ／Ｃ遺伝子によりコードされるとは言え、分泌性ＨＢ
ｅＡｇタンパク質はＨｂｃＡｇの開始コドンの２９残基上流の開始コドンで開始
する。ＨＢｅＡｇをヒトＩｇＧ１ａのＦｃフラグメントのｃＤＮＡ遺伝子と同じ
読み枠で融合し、そしてその後ｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化した。ヒトＩｇＧの
ＦｃフラグメントはマウスＡＰＣ上のＦｃ受容体に効率よく結合することができ
る。ＨＢｅＡｇ遺伝子（分泌性）、分泌シグナルリーダー配列を伴うＦｃフラグ
メント遺伝子（分泌性）もしくはＨＢｃＡｇ遺伝子（細胞質性）を含有する対照
ベクターを構築した（図１８）。マウス骨髄由来ＤＣを生成させた。簡潔には、
骨髄幹細胞を、６％のＦＢＳ、６０ｎｇ ｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍｌおよび１００Ｕ
ｍＩＬ−４／ｍｌを補充されたＲＰＭＩ−１６４０中で４日間培養した。その
後、ＤＣを、組換えＨＢｅＡｇ（１００μｇ／ｍｌ）およびＨＢｃＡｇ（１００
μｇ／ｍｌ）タンパク質（アメリカン リサーチ プロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、マサチューセッツ州ボストン）の
混合物を含有する培地中で追加の４日間培養した。適用されたＤＣ（ＰＤＣ）を
１×ＰＢＳで１０００ｒｐｍで５分間２回洗浄し、そしてさらなる分析のためＲ
ＰＭＩ １６４０に再懸濁した。放射標識および免疫沈降／ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル分析（ＰＡＧＥ）を使用することにより、ＨＢｅＡｇ−Ｆｃタンパ
ク質（ＨＢｅ−Ｆｃ）が効率よく産生されかつトランスフェクションされた細胞
から分泌されたことが見出された（図１９Ａ）。細胞内および分泌された双方の
ＨＢｅ−ＦｃはプロテインＡビーズにより直接沈降され、該融合タンパク質がプ
ロテインＡに対するその結合能力を保持していることを示した。 実施例１６ インビボでのＨＢｅ−Ｆｃ ＤＮＡワクチンによるＴH１、ヘルパーＴ細胞の誘
導 この戦略をインビボで評価するためにマウスを免疫化した。Ｃ５７ＢＬ／６も
しくはＢＡＬＢ／ｃマウスを４群に分割し、そして各マウスを１００μｇ（四頭
筋あたり２５〜５０μｇ（μｌ））のＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＦｃもしくはＨ
Ｂｅ−Ｆｃ ＤＮＡの１回のｉ．ｍ．注入で免疫化した。免疫感作２〜４週間後
にマウスを殺し、そして末梢血、脾および他の組織サンプルを収集した。
【０１８４】 最初に、ＤＮＡワクチンで免疫感作２〜４週間後のマウスからの脾細胞を、組
換えＨＢｅ／ｃＡｇタンパク質で５日間再刺激した。再刺激された脾細胞からＴ
細胞を単離し、そしてその後、3Ｈ−チミジン取込みアッセイを使用することに
より評価した。図２０に示されるとおり、ＨＢｅ−Ｆｃ ＤＮＡ構築物で免疫化
されたマウスからのＴ細胞、もしくはＨＢｅ−Ｆｃ ＤＮＡワクチンでプライミ
ングされたＴ細胞は、活発に増殖した。対照的に、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇもし
くはＦｃ ＤＮＡワクチンで免疫化されたマウスからのＴ細胞、またはＨＢｅＡ
ｇ、ＨＢｃＡｇおよびＦｃ ＤＮＡワクチンでプライミングされたＴ細胞は、活
発に増殖しなかった。
【０１８５】 免疫化されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞を、実施例５に類似に組換えＨＢ
ｅＡｇおよびＨＢｃＡｇを適用されたＤＣと共培養した。多様な比のＴ細胞対Ｄ
Ｃを用いる共培養の６日の間、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇもしくはＦｃ構築物で免
疫化されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞は活発に増殖せず、そして低レベルの
ＩＬ−２およびＩＦＮ−γのみが共培養物の培地中で検出された（図２１Ａおよ
び図２１Ｂ）。対照的に、ＨＢｅ−Ｆｃ構築物で免疫化されたマウスからのＣＤ
４＋ Ｔ細胞との共培養物においては、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は１：１０００（ＤＣ
：Ｔ細胞）の比でさえ、わずか４８時間の共培養後に活発に増殖した。さらに、
共培養物の培地中のＩＬ−２およびＩＦＮ−γのレベルは、ＨＢｅＡｇもしくは
ＨＢｃＡｇ構築物を投与されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞との共培養物中の
ものより有意により高かった（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。抗ＣＤ４抗体は、共
培養された細胞によるこれらのサイトカインの産生を劇的に封鎖したが、しかし
抗ＣＤ８抗体はしなかった（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）。加えて、関連性のない
抗原、組換えＨＢｓＡｇタンパク質（アメリカン リサーチ プロダクト（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ）、マサチューセッツ州ボス
トン）を使用して、ＨＢｅ／ｃＡｇと平行してＤＣに適用した。ＨＢｓＡｇを適
用されたＤＣは、記述されたアッセイで、ＨＢｅ−Ｆｃ構築物で免疫化されたマ
ウスのＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激することが不可能であり、ＨＢｅ−Ｆｃ構築物免
疫感作により誘導されるＣＤ４＋ Ｔ ヘルパー１細胞応答の特異性を立証した
。これらの結果は、ＨＢｅ−Ｆｃ構築物が、ＨＢｅＡｇもしくはＨＢｃＡｇ構築
物が可能であるよりもより効率よくＴH１を活性化することができることを示す
。有意のレベルのＩＬ−４は実験のいずれでも検出されなかった。なぜならＩＬ
−２およびＩＦＮ−γが主としてＴH１細胞により産生されるからである。この
結果は、ＨＢｅ−Ｆｃ構築物がＴH１応答を誘導することを示す。 実施例１７ インビボでのＣＴＬの誘導 ＨＢｅ−Ｆｃ構築物での免疫感作がＣＴＬ応答を誘導することができるかどう
かを決定するため、実施例１１に類似にＪＡＭ試験を実施した。異なる免疫化さ
れたマウスからの脾細胞を、合成ペプチドＨＢｃＡｇ１３−２７を含有する培地
中で４〜６日間インビトロで再刺激し、そしてその後、3Ｈ標識されたペプチド
（ＨＢｃＡｇ１３−２７）を適用された標的細胞ＥＬ−４（Ｈ−２b）およびｐ
８１５（Ｈ−２d）と変動されるエフェクター／標識比で共培養して、標的細胞
の殺傷を測定した。図２２に示されるとおり、ＨＢｅ−Ｆｃ構築物で免疫化され
たマウスからの脾細胞は、ＨＢｅＡｇもしくはＨＢｃＡｇで免疫化されたマウス
からのものよりも有意により多い標的細胞の殺傷を立証した。殺傷の特異性は、
脾細胞の、ＨＢｃＡｇを適用されたＨ−２dの背景をもつｐ８１５標的細胞を殺
すことの不可能性、および抗ＣＤ８抗体（しかし抗ＣＤ４抗体でない）による殺
傷の阻害により立証された。さらに、ＨＢｓＡｇもまた使用してＨＢｅ−Ｆｃ構
築物で免疫化されたマウスからの脾細胞を再刺激し、そしてＨＢｃＡｇを適用さ
れた標的細胞に対する有意の殺傷は、ＨＢｓＡｇで再刺激された脾細胞により観
察されなかった。ＨＢｅ−Ｆｃ構築物により誘導された優れた細胞傷害性の応答
は、高められたＴヘルパー１、およびＤＣによるインターナリゼーションされた
ＨＢｅ−Ｆｃ融合タンパク質の直接のＭＨＣクラスＩ提示による。 実施例１８ 抗体の誘導 ＨＢｅ−Ｆｃ−Ｄｃ免疫感作が抗体応答を誘導することができるかどうかを決
定するため、実施例６に類似に、多様なベクターで免疫化されたマウスのプール
された血清中で抗ＨＢｅ／ｃＡｇ抗体力価を測定した。図２３に示されるとおり
、抗ＨＢｅ／ｃＡｇ抗体が、ＨＢｅ−Ｆｃ構築物でのマウス免疫感作の血清中で
検出された。抗体応答の特異性は、免疫化されたマウスにおけるＨＢｓＡｇに対
する抗体の欠如により立証された。対照してみると、ＨＢｅＡｇもしくはＨＢｃ
Ａｇ構築物で免疫化されたマウス中で有意により低い抗体力価が検出された（図
２３）。一緒にすれば、ＨＢｅ−Ｆｃ ＤＮＡは、ＣＤ４＋ Ｔ ヘルパー１お
よびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ならびにＢ細胞応答の誘導において、天然のＨ
ＢｅＡｇもしくはＨＢｃＡｇを発現するＤＮＡより有意に優れている。 実施例１９ ＨＢｅ−Ｆｃ ＤＮＡのワクチン接種によるＤＣの全身的活性化。
【０１８６】 形質導入された細胞から分泌されそして身体中を循環しているＨＢｅ−Ｆｃも
しくはＨＢｅＡｇタンパク質の抗原提示を実施する可能性を評価するため、ＤＣ
移入実験を実施した。免疫化されたマウスからＤＣを単離し、そして処理を受け
たことのないマウスに移入して、移入されたＤＣが、処理を受けたことのないＣ
Ｄ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞をプライミングすることができるかどうかを評価
した。ＨＢｅＡｇ−Ｆｃ、ＰＥＡ−ＨＢｅもしくは対照ＤＮＡワクチンで免疫化
されたマウスを１ヶ月後に殺した。マウスＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）マイクロビー
ズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）（ミルテニイ バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ））を使用してマウス脾からＤＣを単離した。ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣ
を、処理を受けたことのないマウスに注入（ＩＰもしくはＩＶ）した（マウスあ
たり約１〜５×１０5個）。ＤＣ移入の２ないし４週間後にマウスを殺し、そし
て異なるマウスの抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をモニターし
た。図２４に示されるとおり、ＨＢｅ−Ｆｃで免疫化されたマウスの脾細胞から
のＤＣは、処理を受けたことのないＴ細胞の応答を効率よく活性化する一方、Ｈ
ＢｅもしくはＨＢｃで免疫化されたマウスの脾細胞からのＤＣは、処理を受けた
ことのないマウスのＴ細胞を活性化することに失敗した。この結果は、ＰＣＲお
よびインターナリゼーションアッセイの結果と一緒に、ＤＣ抗原提示がＦｃγＲ
に媒介される抗原のエンドサイトーシスにより高められることを示す。 実施例２０ 変えられた膜および細胞内タンパク質の分泌 タンパク質の膜移動（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）およ
び分泌を予防する配列を含有するかもしくは分泌のためのシグナル配列を欠く、
膜タンパク質および細胞内タンパク質を、さらなる改変なしに本発明の戦略に使
用することができる。タンパク質を分泌から封鎖する配列の欠失もしくは突然変
異は、タンパク質の分泌をもたらすことが想像される。膜タンパク質はしばしば
高比率の疎水性アミノ酸を含有し、従って、これらのタンパク質の疎水性を変え
ることは、それらが分泌に標的を定められることを可能にする。当業者は、レト
ロゲン戦略をこれらのタンパク質の免疫原性を高めるのにもまた使用することが
できることを明確に理解する。膜タンパク質の欠失もしくは突然変異の２つの例
はＨＰＶ Ｅ７およびＥＢＶタンパク質である。
【０１８７】 Ｅ７は細胞質性タンパク質である。ひとつながりの荷電した残基の存在はタン
パク質の分泌を妨げる。これらの残基の排除はタンパク質の分泌を助長しかつタ
ンパク質を安定化する（図１７）。従って、ＨＰＶ １６ Ｅ７タンパク質の荷
電した残基のつながりを、２回のＰＣＲ反応により現在の構築物（黒四角）中で
欠失させた。結果として、リーダーシグナル（ＩＬ−２）と連結した後の短縮さ
れたＥ７タンパク質の分泌が劇的に高められた。
【０１８８】 ＥＢＶ核抗原１は核タンパク質であり、これは、タンパク質の膜移動および分
泌を妨害するとみられる疎水性アミノ酸残基の広がりを含有する。ある研究にお
いて、ＥＢＮＡ１タンパク質中の疎水性アミノ酸残基の広がりを欠失させた。結
果として、短縮されたＥＢＮＡ１タンパク質は、リーダーシグナル配列と連結し
た後に細胞から効率よく分泌された。
【０１８９】 当業者は、配列の欠失もしくは短縮に加え、タンパク質の疎水性を低下させる
ように配列を突然変異させることもまたできることを明確に理解する。部位特異
的突然変異誘発は、選択されたＤＮＡ中に１個もしくはそれ以上のポリヌクレオ
チド配列の変化を導入することにより、配列の変異体の調製物および試験を提供
する。
【０１９０】 一般に、最初に、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列もしくは遺伝子要
素をその配列内に包含する、一本鎖ベクターを得るか、もしくは二本鎖ベクター
の２本の鎖を融解させる（ｍｅｌｔ）。その後、合成で調製された、所望の突然
変異された配列を担持するオリゴヌクレオチドプライマーを、ハイブリダイゼー
ション条件を選択する場合の不適合の程度を考慮に入れ、一本鎖ＤＮＡ調製物と
アニーリングさせる。突然変異を担持する鎖の合成を完了させるために、ハイブ
リダイズされた産物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩ（クレノウフラ
グメント）のようなＤＮＡを重合させる酵素にさらす。従って、ヘテロ二重鎖が
形成され、ここで１本の鎖は元の突然変異されない配列をコードし、そして第二
の鎖は所望の突然変異を担持する。その後、このヘテロ二重鎖ベクターを使用し
て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような適切な宿主細胞を形質転換し、そして
突然変異された配列の配置を担持する組換えベクターを包含するクローンを選択
する。
【０１９１】 部位特異的突然変異誘発は、米国特許第５，２２０，００７号；同第５，２８
４，７６０号；同第５，３５４，６７０号；同第５，３６６，８７８号；同第５
，３８９，５１４号；同第５，６３５，３７７号；および同第５，７８９，１６
６号明細書に開示される。
【０１９２】 膜タンパク質に加え、細胞内タンパク質が改変され、分泌をもたらす。１つの
こうした改変は、単に、シグナルリーダー配列の付加である。例えば、ＭＡＧＥ
は分泌のためのシグナル配列を欠く細胞内タンパク質である。実施例７において
、ＰＣＲ技術を使用することにより、シグナル配列をＭＡＧＥに付加した。ＭＡ
ＧＥへのシグナル配列の付加は、この細胞内タンパク質が分泌されることを可能
にした。細胞内タンパク質の別の改変は前駆体（典型的に細胞内タンパク質であ
る）を変えることであり、その結果それは成熟タンパク質に類似に分泌される。
例えば、ＩＬ−１β前駆体タンパク質は細胞質性であるが、しかし成熟タンパク
質は分泌される。従って、ＳｉｄｅｒｓとＭｉｚｅｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．、１９９５）は前駆体タンパク質中のアミノ酸残基を短縮した。彼らは、１０
０と１０４との間の数個のアミノ酸の欠失が、短縮されたタンパク質の分泌レベ
ルを成熟ＩＬ−１βのレベルまで増大させたことを具体的に説明した。従って、
当業者は、他の細胞内タンパク質を変えるのにこの情報を利用することが可能で
あるとみられる。
【０１９３】 さらなる改変は、細胞から放出されるウイルス粒子の使用を包含する。従って
、レトロゲンがウイルス遺伝子に融合され、そして放出のためウイルス粒子中に
集成される。ウイルス粒子は、タンパク質の殻により取り囲まれる核酸ゲノムよ
り成る。ウイルス粒子の充填（ｐａｃｋｉｎｇ）は当該技術分野で公知の方法の
いずれかにより実施する。 実施例２１ タンパク質のグリコシル化 ＩｇＧ−Ｆcのグリコシル化は、ＦcγＲ認識を介するエフェクター細胞の至適
の活性化に不可欠であることが当該技術分野で既知である。従って、Ｆｃ部分を
含有する組換え融合タンパク質は、ＦｃγＲへの結合がその潜在的利用性に不可
欠である場合には、グリコシル化が可能な系中で生成されなければならない。高
収量の組換えタンパク質を生成させるのにバキュロウイルス−昆虫細胞系を普遍
的に使用する。糖タンパク質にコアオリゴ糖および外側部門の糖残基を付加する
この系の能力は当業者により公知であり、そしてそれをＨＢｅ−Ｆｃ融合タンパ
ク質の発現および精製に適する系とする。
【０１９４】 ＩｇＧ Ｆｃに同じ読み枠で融合された短縮されたＨＢｅＡｇより成る分泌性
ＨＢｅ−Ｆｃタンパク質を発現するｔＨＢｅＡｇＦｃプラスミド中に含有される
１２３０ｂｐのＨＢｅＦｃフラグメントを構築した。簡潔には、ｐＦＢ１ドナー
プラスミドとともにｐＦａｓｔＢａｃ系（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を使用
して、組換えＨＢｅ−Ｆｃバキュロウイルスを生成させた。ＨＢｅ−Ｆｃフラグ
メントは、最初に、５’および３’端にそれぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限部位を導入するために５’プライマー（配列番号１７）５’−ＧＡＴＣＧ
ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ−３’および３’プラ
イマー（配列番号１８）５’−ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧ
ＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’を使用してｔＨＢｅＡｇＦｃ鋳型からＰＣＲ増幅した
。このＰＣＲ産物をゲル精製し、消化し、そしてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切
断されたｐＦＢ１ドナープラスミドに連結した。結果として生じるベクター（ｐ
ＦＢ１−ＨＢｅＦｃ）を制限酵素分析により同定しかつＤＮＡ配列決定により確
認した。ドナープラスミドからバキュロウイルスゲノム中へのＨＢｅ−Ｆｃ発現
カセットの部位特異的転位は、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をｐＦＢ
１−ＨＢｅＦｃドナープラスミドで形質転換することにより実施した。組換えバ
キュロウイルスは、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）への転位がｌａｃＺαペプチドの
発現を混乱させるため、Ｘ−ｇａｌ選択により同定した。組換えバクミドＤＮＡ
をミニプレップにより単離し、そして製造元の説明書に従ってＳｆ９昆虫細胞を
トランスフェクションするのに使用した。
【０１９５】 最初のトランスフェクションから得られたウイルスストックを、細胞２×１０6 個／ｍｌのＳｆ９細胞の５０ｍｌの懸濁培養物を０．５ｍｌのウイルスストッ
クに感染させることにより増幅し、そして４８時間後に上清を収集した。その後
、このストックを２回の追加の増幅にかけ、その時点で、感染した細胞の免疫蛍
光染色によりモニターされるように、＞９０％の細胞が組換えＨＢｅ−Ｆｃを産
生していた。その後、増幅されたストックを使用して、Ｓｆ９細胞の４個の１０
０ｍｌ培養物を７２〜９０時間感染させた。上清を収穫し、そして１４，０００
ＲＰＭ、４℃で２０分間の遠心分離により澄明にした。その後、澄明にされた上
清は、５ｍｌの洗剤吸収体（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ａｂｓｏｒｂｅｒ）ゲルカラ
ム（ベーリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））
を２回通して、タンパク質の回収を妨害する可能性のあるプルロニックを除去し
た。その後、１ｍｌ／分の流速でのプロテインＧカラム（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ））の通過により、上清から組換えＨＢｅ−Ｆｃタンパク質を精製
した。カラムを１０体積の１００ｍＭトリスｐＨ６．０および１０ｍＭトリスｐ
Ｈ６．０で連続して洗浄し、そして１０体積の１００ｍＭグリシンｐＨ２．７を
用いて１ｍｌの画分にタンパク質を溶出した。全部の画分のｐＨは、１／１０体
積の１ＭトリスｐＨ８．０の添加により即座に中性に調節した。タンパク質を含
有する画分をＡ280により決定し、そして１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
して純度を決定した。その後、精製された画分をウェスタンブロットにかけた。
簡潔には、１５μｇの主要タンパク質を含有する溶出された画分を還元（Ｒ）も
しくは非還元（ＮＲ）条件下で１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロ
セルロースに転写し、ブロッティングし、そしてＥＣＬウェスタンブロッティン
グ検出試薬を使用して発色させた。一次抗体、ウサギ抗ＨＢｃ；二次抗体、マウ
ス抗ウサギペルオキシダーゼ複合体。 実施例２２ ＭＨＣ−ＩＩに拘束される抗原の同定 本発明は、ＭＨＣ−ＩＩに拘束されるウイルス抗原、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ
、細菌抗原、他の病原体の抗原、腫瘍抗原、および自己免疫疾患に関係する自己
抗原を同定するのに使用される。本発明の発現ベクターは「試験」ポリヌクレオ
チドを包含するよう改変されている。免疫応答を導き出すことが既知でないポリ
ヌクレオチド配列。本発明の本戦略は、新たなワクチンを開発するのに使用され
る新たな抗原／エピトープを同定する。
【０１９６】 最初に、選択された細胞、すなわち腫瘍細胞からのｍＲＮＡを使用してｃＤＮ
Ａライブラリーを構築する。目的のポリヌクレオチド配列を極めて高レベルで発
現する細胞もしくは組織からｃＤＮＡを調製する場合、該ポリヌクレオチド配列
を含有するｃＤＮＡクローンの大多数、それは最小限の努力で選択することがで
きる。より少なく豊富に転写されるポリヌクレオチド配列については、多様な方
法を使用して、ライブラリーを作成する前に特定のｍＲＮＡについて濃縮するこ
とができる。ライブラリーのためのベクターとしてレトロウイルスを使用する。
レトロウイルスライブラリーは、発現クローニングのための事実上いかなる有糸
分裂的に活性の細胞型にも高度の複雑さのライブラリーを送達させる理想的な方
法を提供する。ウイルス粒子は高効率で感染させるため、それらはトランスフェ
クションに基づく方法よりもより複雑なライブラリーを送達させる。当業者は、
いかなるベクターも該ライブラリーに使用することができることを十分に理解す
る。ｃＤＮＡライブラリーは当該技術分野で公知の方法を使用することにより構
築する。簡潔には、腫瘍サンプルから腫瘍細胞系を樹立する。同一の哺乳動物の
末梢血からのＣＤ４＋ Ｔ細胞を、単球／マクロファージ由来の哺乳動物腫瘍ラ
イセートを適用されたＤＣとの共培養により拡張する。拡張された自己のＣＤ４
＋ Ｔ細胞により認識されるこれらの腫瘍細胞を同定する。次に、細胞系を９６
個のウェル中でプレート培養する。拡張された自己のＣＤ４＋ Ｔ細胞を９６個
のウェルに添加し、そして９６個のウェルの共培養物中のＩＦＮ−γもしくはＧ
Ｍ−ＣＳＦ濃度をモニターする。次の段階は、陽性の腫瘍細胞を培養しかつそれ
からｍＲＮＡを抽出することである。単離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡに転化し、
そしてベクター、例えばＧＦＰマーカーをもつレンチウイルスベクターに挿入す
るか、もしくは試験ｃＤＮＡを本発明の発現ベクターにクローン化する。試験ｃ
ＤＮＡは、例えば図２５に描かれるとおり、シグナル配列と細胞結合要素との間
でベクター中にクローン化する。ｃＤＮＡライブラリーが構築されれば、ウイル
スベクターをパッケージング細胞にトランスフェクションする。次に、同一のＭ
ＨＣ−ＩＩ遺伝子型をもつ哺乳動物からの単球由来の未熟なＤＣを組換えベクタ
ーで形質導入し、そして効率を決定する。形質導入されたＤＣを、拡張された自
己のＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養する。ＥＬＩＳＡ（ＧＭ−ＣＳＦ）もしくはフロ
ーサイトメトリーアレイによるＩＬ２の表面発現により陽性のクローンを同定す
る。陽性のクローンをＰＣＲ増幅し、そして配列決定してタンパク質を決定する
（図２６）。
【０１９７】 ＣＤ４＋ Ｔ細胞により認識されるタンパク質およびエピトープをコードする
ポリヌクレオチド配列を同定するために、ヒトゲノムをスクリーニングする。こ
れらのポリヌクレオチド産物は、癌治療もしくは自己免疫疾患の治療のため免疫
寛容を誘導するため、もしくは遺伝子治療に使用する。この基本的スクリーニン
グ手順は、小型の治療的分子を設計するためのエピトープの同定を提供する。
【０１９８】 従って、当業者は、このスクリーニング手順が多様なゲノム（すなわちヒト、
ウイルス、細菌もしくは寄生虫）をスクリーニングするよう改変されることを認
識している。ｃＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で公知である。従って
、当業者は、抗原を同定するために本発明を変えるのにこの情報を利用すること
が可能である。
【０１９９】 該明細中で挙げられる全部の特許および刊行物は、本発明が関する当業者の水
準を暗示する。全部の特許および刊行物は、各個々の刊行物が引用により組み込
まれることをとりわけかつ個々に示されるかのように、同一の程度まで引用によ
り本明細書に組み込まれる。
【０２００】
【表１】
【０２０１】
【表２】
【０２０２】
【表３】
【０２０３】
【表４】
【０２０４】
【表５】
【０２０５】
【表６】
【０２０６】 当業者は、本発明が目的を実施しかつ挙げられた結果および利点ならびにその
中に固有のものを得るよう十分に適合されることを容易に真価を認める。本明細
書に記述されるワクチン、ベクター、方法、手順および技術は現在のところ好ま
しい態様を表し、かつ、例示的であることを意図しており、そして範囲の制限と
して意図されない。本発明の技術思想内に包含されるか、もしくは未決定の請求
の範囲の範囲により定義される、その中の変更および他の用途が当業者に思い浮
かぶであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび図１Ｂ】 発明にかかる、本発明のレトロゲン戦略を表す図である。本発明のレトロゲン
は細胞（例えば筋細胞）中で産生され（図１Ａ）、そしてその後抗原提示細胞に
より取り上げられる（図１Ｂ）。レトロゲンは抗原提示細胞中でプロセシングさ
れ、そして図１Ａおよび図１Ｂ中に示されるとおり、その上にＭＨＣ−Ｉもしく
はＭＨＣ−ＩＩ複合体として発現されるか、またはＢ細胞受容体に提示される。
レトロゲンのＭＨＣ−Ｉ提示は細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化をもたらし
、また、レトロゲンのＭＨＣ−ＩＩ提示はＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化をもたらす
。
【図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃ】 発明にかかる、発現ベクターの一連の図解である。図２Ａは、図に示されるよ
うな融合遺伝子を生成させること、および該遺伝子をレトロウイルスベクター（
ＬＮＣ−ＮＧＦＲ）もしくは発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化すること
により構築された、ＨＢｅＡｇ（分泌性）、ＨＢｃＡｇ（細胞質性）もしくはシ
グナル配列を伴うＦｃフラグメント（分泌性）を含んで成るベクターを具体的に
説明する。図２Ｂおよび図２Ｃは構築された付加的ベクターを具体的に説明する
。
【図３】 発明にかかる、ＨＢｅ−レトロゲンの発現および分泌を描くウェスタンブロッ
トの像である。ＣＯＳ細胞を多様な発現ベクターでトランスフェクションした。
その後、培地（Ｍ）および細胞ライセート（Ｃ）を抗ＩｇＧもしくは抗ＨｂｅＡ
ｇ抗体で沈降させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ】 発明にかかる、樹状細胞におけるレトロゲンの形質導入および発現を描く一連
のグラフである。マウス骨髄細胞を多様な組換えレトロウイルスベクターで形質
導入し；細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦおよびＩＬ−４の存在下で樹状細胞に成熟
させ、そして抗ＮＧＦＲで染色した。それらをフローサイトメトリーアッセイに
より測定する。図４Ａは形質導入されない樹状細胞を示す。図４Ｂは形質導入さ
れた樹状細胞を示す。図４Ｃは陰性対照である。
【図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅ】 発明にかかる、フローサイトメトリーアッセイにより測定されるような樹状細
胞上の表面マーカー（ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、副刺激および接着分子（ＣＤ
１１Ｃ、ＣＤ５４、ＣＤ８０およびＣＤ８６））の存在を描く一連のグラフであ
る。図５ＡはＣＤ１１Ｃ表面マーカーの存在を示す。図５ＢはＣＤ５４表面マー
カーの存在を示す。図５ＣはＣＤ８０表面マーカーの存在を示す。図５ＤはＣＤ
８６表面マーカーの存在を示す。そして図５ＥはＭＨＣ−ＩＩの存在を示す。
【図６Ａおよび６Ｂ】 発明にかかる、レトロゲンで形質導入された樹状細胞による処理を受けたこと
のないＣＤ４＋ Ｔ細胞のインビトロの活性化を描く２個の棒グラフを具体的に
説明する。図６Ａは共培養物中のＧＭ−ＣＳＦのレベルを示す。図６Ｂは共培養
物の培地中のＩＦＮ−γのレベルを示す。
【図７Ａおよび７Ｂ】 発明にかかる、ＭＨＣ−ＩＩ依存性の活性化を具体的に説明する。図７Ａは、
ＨＢｅ−レトロゲンで形質導入されたＭＨＣ−ＩＩノックアウト（ＫＯ）もしく
は野性型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られかつ共培養された細胞、およ
び野性型マウスからの処理を受けたことのないＣＤ４＋ Ｔ細胞からのサイトカ
イン濃度（ＩＦＮ−γ）を示す。図７ＢはＧＭ−ＣＳＦサイトカイン濃度を示す
。
【図８】 発明にかかる、免疫化されたマウスの血清中の抗体応答を示す。
【図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅおよび図９Ｆ】 発明にかかる、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ融合タンパク質の構築および発現を示
す。図９Ａは組換えレトロウイルスベクターの図解を示す。（Ｓ：シグナル配列
。ＩＲＥＳ：内部リボソーム進入部位配列。）図９Ｂは、マウス抗ＭＡＧＥ−３
および抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ複合体で染色されたウェスタンブロット分析によ
り決定されるような、樹状細胞における多様な構築物の発現を示す。図９Ｃは、
イメージクヮント（Ｉｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔ）ソフトウェアを用いるホスホルイ
メジャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（モレキュラー ダイナミックス（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））により分析された図９Ｂのウェスタ
ンブロットのタンパク質のバンドの強度を示す。図９Ｄ、図９Ｅおよび図９Ｆは
、各構築物で形質導入されかつＭＨＣ−ＩＩ（図９Ｅ）（Ｍ５／１１４．１５．
２）、ＣＤ４０（図９Ｄ）（ＨＭ４０−３）およびＣＤ８６／Ｂ７．２（図９Ｆ
）（ＧＬ１）（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））について染色された
、形質導入された樹状細胞のフローサイトメトリー分析を具体的に説明する。
【図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃおよび図１０Ｄ】 発明にかかる、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の共培養後の培地中で多様なベクターで形質
導入された樹状細胞で免疫化されたマウスのＣＤ４＋ Ｔｈ１応答のインビボ誘
導を示す。図１０ＡはＩＦＮ−γの濃度を示す。図１０ＢはＩＬ−２の濃度を示
す。図１０ＣはＴＮＦ−αの濃度を示す。図１０ＤはＩＬ−４の濃度を示す。
【図１１Ａおよび図１１Ｂ】 発明にかかる、抗ＣＤ４もしくは抗ＣＤ８抗体の存在もしくは非存在下でｓ−
ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ樹状細胞と共培養された（図１１Ａ）、またはＨＢｃＡｇで
形質導入された樹状細胞と共培養された（図１１Ｂ）、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ
樹状細胞で免疫化されたマウスから単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞中のＩＦＮ−γ
のレベルを示す。
【図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃおよび図１２Ｄ】 発明にかかる、同一の免疫化されたマウスの排出リンパ節（ＬＮ）から単離さ
れた樹状細胞と１０００：１の比で共培養された樹状細胞で免疫化されたマウス
のプールされた脾細胞から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞中のサイトカインのレベ
ルを示す。図１２ＡはＩＦＮ−γの濃度を示す。図１２ＢはＩＬ−２の濃度を示
す。図１２ＣはＴＮＦ−αの濃度を示す。図１２ＤはＩＬ−４の濃度を示す。
【図１３】 発明にかかる、照射されたＥＬ４−ＭＡＧＥ−３細胞でインビトロで再刺激さ
れ（Ｅ）かつ3Ｈ−チミジン標識された標的細胞、ＥＬ４−ＭＡＧＥ−３もしく
はＥＬ４−ＨＢｃＡｇ（対照）（Ｔ）と共培養された、免疫化されたマウスから
単離された脾細胞からの細胞傷害性応答のインビボ誘導を示す。
【図１４】 発明にかかる、樹状細胞免疫感作６週間後の抗体応答の誘導を示す。
【図１５】 発明にかかる、ＥＬＩＳＡにより測定された、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（ＭＲ１、フ
ァーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））の存在もしくは非存在下での共培養物
中のＩＬ−１２のレベルを測定することによる、ｓ−ＭＡＧＥ−３−Ｆｃ樹状細
胞とのＴ細胞の高められた相互作用を示す。
【図１６Ａおよび図１６Ｂ】 発明にかかる、接種されたＥＬ４−ＭＡＧＥ−３腫瘍細胞を皮内で接種する前
に多様な構築物で形質導入された１×１０5個の樹状細胞でのｉ．ｖ．注入によ
り免疫化されたマウスの抗腫瘍免疫を示す。図１６Ａは腫瘍の容積を示す。図１
６Ｂは各群での生存するマウスのパーセンテージを示す。
【図１７】 発明にかかる、ＨＰＶ １６Ｅ７の荷電したアミノ酸残基を具体的に説明する
。これらはタンパク質を安定化させかつ分泌を助長するために欠失された。
【図１８】 発明にかかる、発現ベクターの図解を具体的に説明する。ＨＢｅ−Ｆｃ融合遺
伝子、ＨＢｃＡｇ（細胞質性）遺伝子、ＨＢｅＡｇ（分泌性）遺伝子もしくはシ
グナル配列を伴うＦｃのｃＤＮＡフラグメント（分泌性）を、それぞれＣＭＶプ
ロモーターの制御下にｐＲｃ／ＣＭＶベクター中にクローン化した。黒四角はシ
グナル配列を表す。
【図１９Ａおよび図１９Ｂ】 発明にかかる、ＨＢｅ−Ｆｃ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＦｃ構築物の発
現を示す。図１９Ａは、ウェスタンブロット分析により測定されるような、細胞
中で発現された多様な構築物の発現を示す。図１９Ｂは、イメージクヮント（Ｉ
ｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔ）ソフトウェアを用いてホスホイメジャー（Ｐｈｏｓｐｈ
ｏＩｍａｇｅｒ）（モレキュラー ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙ
ｎａｍｉｃｓ））により分析された、図１９Ａのウェスタンブロットのタンパク
質のバンドの強度を示す。
【図２０】 発明にかかる、免疫感作４週間後に殺した、多様なプラスミドもしくはプライ
ミングされたＴ細胞でのＤＮＡ免疫感作後のマウスのＴ細胞応答のインビボ誘導
を具体的に説明する。脾細胞は５日間、ＨＢｅ／ｃＡｇ組換えタンパク質により
再刺激した。
【図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃおよび図２１Ｄ】 発明にかかる、多様なプラスミドで免疫化しかつ免疫感作４週間後に殺したマ
ウスのＣＤ４＋ Ｔ細胞応答のインビボ誘導を具体的に説明する。図２１Ａおよ
び図２１Ｂは、ＨＢｅ／ｃＡｇを適用された樹状細胞と二重で共培養したＣＤ４
＋ Ｔ細胞を示す。図２１Ｃおよび図２１Ｄは、抗ＣＤ４＋もしくは抗ＣＤ８＋
抗体の存在もしくは非存在下でＨＢｅ／ｃＡｇを適用された樹状細胞と共培養し
た、ＨＢｅＦｃで免疫化されたマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞を示す。培地中の
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の濃度は、共培養の７２時間後にＥＬＩＳＡにより測
定した。
【図２２】 発明にかかる、ＤＮＡで免疫化されたマウスから単離しかつ照射されたＥＬ４
−ＨＢｃＡｇ細胞で５日間インビトロで再刺激した脾細胞中でのＣＴＬ応答のイ
ンビボ誘導を具体的に説明する。再刺激された脾細胞（Ｅ）を、3Ｈ標識された
標的細胞、ＥＬ４−ＨｂｃＡｇもしくはＥＬ４−ＭＡＧＥ３（対照）（Ｔ）と４
時間共培養した。
【図２３】 発明にかかる、抗体応答の誘導を示す。ＤＮＡ免疫感作後４〜６週間のマウス
からのＨＢｃ／ｅＡｇ特異的ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図２４】 発明にかかる、樹状細胞移入実験からのデータを具体的に説明する。ＣＤ１１
ｃ＋樹状細胞は、ＤＮＡワクチンで免疫化されたドナーマウスの脾細胞から単離
した。プライミングされた樹状細胞を、共通遺伝子の処理を受けたことのないレ
シピエントの側方尾静脈中に注入した。養子移入の２ないし４週間後、Ｔ細胞増
殖アッセイを実施した。
【図２５】 発明にかかる、ＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープを同定するためのｃＤＮ
Ａライブラリーの構築のためのレトロウイルスベクターの図解を具体的に説明す
る。
【図２６】 発明にかかる、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞応答を導き出すことが可能なＭＨＣ
−ＩＩに拘束されるエピトープを同定するための方法の図解を具体的に説明する
。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 19/02 ４Ｃ０８７ 19/02 25/00 ４Ｈ０４５ 25/00 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/04 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/005 Ｃ０７Ｋ 14/005 14/195 14/195 14/54 14/54 14/73 14/73 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA26 BA31 BA40 CA04 CA07 DA02 EA02 EA04 FA02 FA18 GA11 HA17 4B063 QA01 QA20 QQ43 QR08 QR32 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA01X AA57X AA72X AA91X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA45 CA46 4C084 AA13 MA55 NA14 ZA012 ZA552 ZA682 ZA892 ZA962 ZB082 ZB152 ZB262 ZB332 ZB352 ZC352 ZC552 4C085 AA03 CC03 CC04 CC05 CC22 DD63 4C087 BC83 CA12 CA16 CA20 MA55 NA14 ZA01 ZA55 ZA68 ZA89 ZA96 ZB08 ZB15 ZB26 ZB33 ZB35 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA41 CA01 CA02 CA03 CA05 CA40 DA01 DA86 EA22 EA50 FA74

Claims (119)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモータ
    ー配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリヌ
    クレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチ
    ドポリアデニル化配列を含んで成る発現ベクター。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドプロモーター配列が、構成プロモータ
    ー、誘導可能なプロモーターおよび組織特異的プロモーターより成る群から選択
    される、請求項１記載の発現ベクター。
  3. 【請求項３】 前記構成プロモーターが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウ
    ス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス末端反復配列プロモー
    ター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプ
    スタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター
    、ヒトアクチンプロモーター、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプ
    ロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒト筋クレア
    チンプロモーターより成る群から選択される、請求項２記載の発現ベクター。
  4. 【請求項４】 前記誘導可能なプロモーターが、メタロチオネインプロモー
    ター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテト
    ラサイクリンプロモーターより成る群から選択される、請求項２記載の発現ベク
    ター。
  5. 【請求項５】 前記組織特異的プロモーターが、ＨＥＲ−２プロモーターお
    よびＰＳＡ関連プロモーターより成る群から選択される、請求項２記載の発現ベ
    クター。
  6. 【請求項６】 シグナル配列をコードする前記ポリヌクレオチドが、Ｂ型肝
    炎ウイルスＥ抗原シグナル配列、免疫グロブリン重鎖リーダー配列およびサイト
    カインリーダー配列より成る群から選択される、請求項１記載の発現ベクター。
  7. 【請求項７】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが最低１個のエピト
    ープのポリヌクレオチド配列を含んで成り、前記最低１個のエピトープが哺乳動
    物におけるＢ細胞応答を誘導する、請求項１記載の発現ベクター。
  8. 【請求項８】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが最低１個のエピト
    ープのポリヌクレオチド配列を含んで成り、前記最低１個のエピトープが哺乳動
    物におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導する、請求項１記載の発現ベクター。
  9. 【請求項９】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが最低１個のエピト
    ープのポリヌクレオチド配列を含んで成り、前記最低１個のエピトープが哺乳動
    物におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する、請求項１記載の発現ベクター。
  10. 【請求項１０】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが最低１個のエピ
    トープのポリヌクレオチド配列を含んで成り、前記最低１個のエピトープが、前
    記抗原が導入される哺乳動物におけるＢ細胞応答、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答および
    ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する、請求項１記載の発現ベクター。
  11. 【請求項１１】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが複数のエピトー
    プのポリヌクレオチド配列を含んで成り、前記複数のエピトープが、前記抗原が
    誘導される哺乳動物におけるＢ細胞応答、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋
    Ｔ細胞応答を誘導する、請求項１記載の発現ベクター。
  12. 【請求項１２】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、疾患と関連す
    る最低１種のポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列であり
    、前記疾患が感染性疾患、癌および自己免疫疾患より成る群から選択される、請
    求項１記載の発現ベクター。
  13. 【請求項１３】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、感染性疾患か
    らの最低１種のポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列であ
    り、前記感染性疾患が、ウイルス、細菌、真菌および原生動物より成る群から選
    択される病原性微生物により引き起こされる、請求項１２記載の発現ベクター。
  14. 【請求項１４】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、ウイルス遺伝
    子からの最低１種のポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列
    であり、前記ウイルス遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免
    疫不全ウイルス、パピローマウイルスおよびヘルペスウイルスより成る群から選
    択される、請求項１３記載の発現ベクター。
  15. 【請求項１５】 前記Ｂ型肝炎ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原もしく
    はＢ型肝炎ウイルスコア抗原である、請求項１４記載の発現ベクター。
  16. 【請求項１６】 前記ヒト免疫不全ウイルスがｇｐ１６０もしくはｇｐ１２
    ０である、請求項１４記載の発現ベクター。
  17. 【請求項１７】 前記パピローマウイルスがパピローマウイルスＥ７もしく
    はパピローマウイルスＥ６である、請求項１４記載の発現ベクター。
  18. 【請求項１８】 前記ヘルペスウイルスが、単純疱疹ウイルスタイプ１、単
    純疱疹ウイルスタイプ２、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス
    、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７およびヒトヘルペスウイル
    ス８より成る群から選択される、請求項１４記載の発現ベクター。
  19. 【請求項１９】 疾患が、乳癌、子宮頸部癌、黒色腫、腎癌および前立腺癌
    より成る群から選択される、請求項１２記載の発現ベクター。
  20. 【請求項２０】 抗原の配列をコードする前記ポリヌクレオチドが、チロシ
    ナーゼ、ＭＡＲＴ、ｔｒｐ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ
    １００、ＨＥＲ−２、ＲａｓおよびＰＳＡをコードするポリヌクレオチド配列よ
    り成る群から選択されるポリヌクレオチド配列である、請求項１記載の発現ベク
    ター。
  21. 【請求項２１】 疾患が、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多
    発性硬化症、乾癬およびクローン病より成る群から選択される、請求項１２記載
    の発現ベクター。
  22. 【請求項２２】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、Ｆｃ抗体フラ
    グメントもしくはインターロイキンをコードする、請求項１記載の発現ベクター
    。
  23. 【請求項２３】 ポリヌクレオチド配列がインターロイキン５をコードする
    、請求項２２記載の発現ベクター。
  24. 【請求項２４】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが、細胞
    表面受容体に結合するリガンドのポリヌクレオチド配列である、請求項１記載の
    発現ベクター。
  25. 【請求項２５】 リガンドの前記ポリヌクレオチド配列が、Ｆｃフラグメン
    ト、トキシン細胞結合ドメイン、サイトカイン、小ペプチドおよび抗体をコード
    するポリヌクレオチド配列より成る群から選択される、請求項２４記載の発現ベ
    クター。
  26. 【請求項２６】 前記ポリヌクレオチド配列がシュードモナス属の外毒素の
    細胞結合ドメインをコードする、請求項２５記載の発現ベクター。
  27. 【請求項２７】 前記ポリヌクレオチド配列がインターロイキン５もしくは
    インターロイキン６をコードする、請求項２５記載の発現ベクター。
  28. 【請求項２８】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが、同種
    ポリヌクレオチド配列もしくは異種ポリヌクレオチド配列である、請求項１記載
    の発現ベクター。
  29. 【請求項２９】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが同種の
    Ｆｃフラグメントである、請求項２８記載の発現ベクター。
  30. 【請求項３０】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが異種の
    Ｆｃフラグメントである、請求項２８記載の発現ベクター。
  31. 【請求項３１】 前記発現ベクターが、細胞のゲノム中への前記発現ベクタ
    ーの組込みを助長する組込みシグナル配列をさらに含んで成る、請求項１記載の
    発現ベクター。
  32. 【請求項３２】 組込みシグナル配列が、ウイルスの末端反復配列もしくは
    アデノ随伴ウイルスのＩＴＲ配列である、請求項３１記載の発現ベクター。
  33. 【請求項３３】 ベクターが、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳
    動物ベクターより成る群から選択される、請求項１記載の発現ベクター。
  34. 【請求項３４】 発現ベクターが、全部が操作可能に連結された、ポリヌク
    レオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原
    をコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドお
    よびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成る、前記発現ベクターを含
    んで成る形質転換された細胞。
  35. 【請求項３５】 前記細胞が原核生物もしくは真核生物である、請求項３４
    記載の細胞。
  36. 【請求項３６】 前記真核生物細胞が、酵母、昆虫および哺乳動物より成る
    真核生物細胞の群から選択される、請求項３５記載の細胞。
  37. 【請求項３７】 シグナル配列、抗原および細胞結合要素を含んで成る融合
    タンパク質。
  38. 【請求項３８】 発現ベクターが、プロモーター配列をコードするポリヌク
    レオチド、分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードする
    ポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリアデ
    ニル化配列をコードするポリヌクレオチドを含んで成り、前記配列が操作可能に
    連結される、前記発現ベクターを含んで成るワクチン。
  39. 【請求項３９】 抗原提示細胞が、請求項３７記載の融合タンパク質でイン
    ビトロで形質導入される、前記抗原提示細胞を含んで成るワクチン。
  40. 【請求項４０】 抗原提示細胞が、請求項１記載の発現ベクターでインビト
    ロで形質導入される、前記抗原提示細胞を含んで成るワクチン。
  41. 【請求項４１】 請求項３７記載の融合タンパク質を含んで成るワクチン。
  42. 【請求項４２】 少なくとも、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド
    、抗原をコードするポリヌクレオチドおよび細胞結合要素をコードするポリヌク
    レオチドを含んで成る発現ベクター。
  43. 【請求項４３】 発現ベクターを細胞中に導入すること（ここで、前記発現
    ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列
    、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、前記抗原をコードするポリヌク
    レオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド
    ポリアデニル化配列を含んで成り）；ならびに 前記抗原が細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記抗原を産
    生させることであって；前記分泌された抗原は細胞中にエンドサイトーシスされ
    ；前記エンドサイトーシスされた抗原が細胞の内側でプロセシングされ；そして
    前記プロセシングされた抗原が細胞表面タンパク質に提示されて、Ｔ細胞に媒介
    される免疫応答を導き出す、 の段階を含んで成る、抗原に対し向けられる免疫応答を導き出す方法。
  44. 【請求項４４】 プロセシングされた抗原が、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩも
    しくはＢ細胞受容体より成る群から選択される細胞表面タンパク質に提示される
    、請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 抗原が第一の細胞により分泌されかつ第二の細胞によりイ
    ンターナリゼーションされる、請求項４３記載の方法。
  46. 【請求項４６】 第一の細胞および第二の細胞が抗原提示細胞である、請求
    項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 第一の細胞が非抗原提示細胞でありかつ第二の細胞が抗原
    提示細胞である、請求項４５記載の方法。
  48. 【請求項４８】 第一の細胞が筋細胞である、請求項４７記載の方法。
  49. 【請求項４９】 請求項１記載の発現ベクターを、非経口経路を介して哺乳
    動物に直接投与する段階を含んで成る、抗原に対し向けられる免疫応答を導き出
    す方法。
  50. 【請求項５０】 前記ポリヌクレオチドプロモーター配列が、構成プロモー
    ター、誘導可能なプロモーターおよび組織特異的プロモーターより成る群から選
    択される、請求項４３記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記構成プロモーターが、ＳＶ４０初期プロモーター、マ
    ウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス末端反復配列プロモ
    ーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エ
    プスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモータ
    ー、ヒトアクチンプロモーター、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビン
    プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒト筋クレ
    アチンプロモーターより成る群から選択される、請求項５０記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記誘導可能なプロモーターが、メタロチオネインプロモ
    ーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテ
    トラサイクリンプロモーターより成る群から選択される、請求項５０記載の方法
    。
  53. 【請求項５３】 前記組織特異的プロモーターが、ＨＥＲ−２プロモーター
    およびＰＳＡ関連プロモーターより成る群から選択される、請求項５０記載の方
    法。
  54. 【請求項５４】 シグナル配列をコードする前記ポリヌクレオチドが、Ｂ型
    肝炎ウイルスｅ抗原シグナル配列、免疫グロブリン重鎖リーダー配列およびサイ
    トカインリーダー配列より成る群から選択される、請求項４３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、疾患と関連す
    る最低１種のポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列であり
    、前記疾患が感染性疾患、癌および自己免疫疾患より成る群から選択される、請
    求項４３記載の方法。
  56. 【請求項５６】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、感染性疾患か
    らの最低１種のポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列であ
    り、前記感染性疾患が、ウイルス、細菌、真菌および原生動物より成る群から選
    択される病原性微生物により引き起こされる、請求項５５記載の方法。
  57. 【請求項５７】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、ウイルス遺伝
    子からの最低１種のポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列
    であり、前記ウイルス遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免
    疫不全ウイルス、パピローマウイルスおよびヘルペスウイルスより成る群から選
    択される、請求項５６記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記Ｂ型肝炎ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原もしく
    はＢ型肝炎ウイルスコア抗原である、請求項５７記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記ヒト免疫不全ウイルスがｇｐ１６０もしくはｇｐ１２
    ０である、請求項５７記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記パピローマウイルスがパピローマウイルスＥ７もしく
    はパピローマウイルスＥ６である、請求項５７記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記ヘルペスウイルスが、単純疱疹ウイルスタイプ１、単
    純疱疹ウイルスタイプ２、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス
    、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７およびヒトヘルペスウイル
    ス８より成る群から選択される、請求項５７記載の方法。
  62. 【請求項６２】 疾患が、乳癌、子宮頸部癌、黒色腫、腎癌および前立腺癌
    より成る群から選択される、請求項５５記載の方法。
  63. 【請求項６３】 疾患が、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多
    発性硬化症、乾癬およびクローン病より成る群から選択される、請求項５５記載
    の方法。
  64. 【請求項６４】 抗原をコードする前記ポリヌクレオチドが、Ｆｃ抗体フラ
    グメントもしくはインターロイキンをコードする、請求項４３記載の方法。
  65. 【請求項６５】 ポリヌクレオチド配列がインターロイキン５をコードする
    、請求項６４記載の方法。
  66. 【請求項６６】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが、細胞
    表面受容体に結合するリガンドのポリヌクレオチド配列である、請求項４３記載
    の方法。
  67. 【請求項６７】 リガンドの前記ポリヌクレオチド配列が、Ｆｃフラグメン
    ト、トキシン細胞結合ドメイン、サイトカイン、小ペプチドおよび抗体をコード
    するポリヌクレオチド配列より成る群から選択される、請求項６６記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記ポリヌクレオチド配列がシュードモナス属の外毒素の
    細胞結合ドメインをコードする、請求項６７記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記ポリヌクレオチド配列がインターロイキン５もしくは
    インターロイキン６をコードする、請求項６７記載の方法。
  70. 【請求項７０】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが、同種
    ポリヌクレオチド配列もしくは異種ポリヌクレオチド配列である、請求項４３記
    載の方法。
  71. 【請求項７１】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが同種の
    Ｆｃフラグメントである、請求項７０記載の方法。
  72. 【請求項７２】 細胞結合要素をコードする前記ポリヌクレオチドが異種の
    Ｆｃフラグメントである、請求項７０記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記発現ベクターが、細胞のゲノム中への前記発現ベクタ
    ーの組込みを助長する組込みシグナル配列をさらに含んで成る、請求項４３記載
    の方法。
  74. 【請求項７４】 組込みシグナル配列が、ウイルスの末端反復配列もしくは
    アデノ随伴ウイルスのＩＴＲ配列である、請求項７３記載の方法。
  75. 【請求項７５】 ベクターが、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳
    動物ベクターより成る群から選択される、請求項４３記載の方法。
  76. 【請求項７６】 発現ベクターを抗原提示細胞中に導入して、形質導入され
    た抗原提示細胞を産生させること（ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可
    能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードす
    るポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞結
    合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配
    列を含んで成り）； 前記形質導入された抗原提示細胞を、処理を受けたことのないＴ細胞もしくはプ
    ライミングされたＴ細胞と接触させること；ならびに いずれかの処理を受けたことのないＴ細胞もしくはプライミングされたＴ細胞が
    前記形質導入された抗原提示細胞との接触に際して活性化されるかどうかを評価
    すること（ここで、前記Ｔ細胞の活性化は、試験ポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能な遺伝子も
    しくはそのフラグメントであることを示す）、 の段階を含んで成る、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能である
    最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコードするポリヌクレオチド
    配列の同定方法。
  77. 【請求項７７】 試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが腫瘍細
    胞系から単離されたｃＤＮＡライブラリーである、請求項７６記載の方法。
  78. 【請求項７８】 試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ウイ
    ルスゲノム、細菌ゲノム、寄生虫ゲノムおよびヒトゲノムより成るｃＤＮＡライ
    ブラリーの群から選択される、請求項７６記載の方法。
  79. 【請求項７９】 発現ベクターを抗原提示細胞中に導入して、形質導入され
    た抗原提示細胞を産生させること（ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可
    能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードす
    るポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞結
    合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配
    列を含んで成り）； 前記形質導入された抗原提示細胞を、非経口経路を介して哺乳動物に投与するこ
    と； 脾細胞からＴ細胞を収集すること、および樹状細胞と共培養すること；ならびに
    Ｔ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、試験ポリペプ
    チドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化する
    ことが可能なポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントであることを示す
    ）、 の段階を含んで成る、インビボで免疫応答を導き出すことが可能である最低１種
    のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の同
    定方法。
  80. 【請求項８０】 試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが腫瘍細
    胞系から単離されたｃＤＮＡライブラリーである、請求項７９記載の方法。
  81. 【請求項８１】 試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ウイ
    ルスゲノム、細菌ゲノム、寄生虫ゲノムおよびヒトゲノムより成るｃＤＮＡライ
    ブラリーの群から選択される、請求項７９記載の方法。
  82. 【請求項８２】 非経口経路を介して発現ベクターを哺乳動物に投与するこ
    と（ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオ
    チドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、試験ポリ
    ペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレ
    オチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）； 脾細胞からＴ細胞を収集すること、および樹状細胞と共培養すること；ならびに
    Ｔ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、試験ポリペプ
    チドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞を活性化する
    ことが可能なポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントであることを示す
    ）、 の段階を含んで成る、インビボで免疫応答を導き出すことが可能である最低１種
    のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の同
    定方法。
  83. 【請求項８３】 試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが腫瘍細
    胞系から単離されたｃＤＮＡライブラリーである、請求項８２記載の方法。
  84. 【請求項８４】 試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ウイ
    ルスゲノム、細菌ゲノム、寄生虫ゲノムおよびヒトゲノムより成るｃＤＮＡライ
    ブラリーの群から選択される、請求項８２記載の方法。
  85. 【請求項８５】 最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコード
    する試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、全部が操
    作可能に連結されたポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコード
    するポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞
    結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化
    配列を含んで成る発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入する条件下で同定され
    ）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、
    試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞
    を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメントであることを示し）
    ；ならびに 非経口経路を介して抗原提示細胞を哺乳動物に投与すること（ここで、前記抗原
    提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入される）、 の段階を含んで成る、癌の治療方法。
  86. 【請求項８６】 最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコード
    する試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、全部が操
    作可能に連結されたポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコード
    するポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞
    結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化
    配列を含んで成る発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入する条件下で同定され
    ）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、
    試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞
    を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメントであることを示し）
    ；ならびに 非経口経路を介して発現ベクターを哺乳動物に投与すること（ここで、前記発現
    ベクターは、少なくとも、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよ
    び細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドを含んで成る） の段階を含んで成る、癌の治療方法。
  87. 【請求項８７】 最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコード
    する試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、全部が操
    作可能に連結されたポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコード
    するポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞
    結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化
    配列を含んで成る発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入する条件下で同定され
    ）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、
    試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞
    を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメントであることを示し）
    ；ならびに 非経口経路を介して抗原提示細胞を哺乳動物に投与すること（ここで、前記抗原
    提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入される） の段階を含んで成る、ウイルス感染症の治療方法。
  88. 【請求項８８】 最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコード
    する試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、全部が操
    作可能に連結されたポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコード
    するポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞
    結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化
    配列を含んで成る発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入する条件下で同定され
    ）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、
    試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞
    を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメントであることを示し）
    ；ならびに 非経口経路を介して発現ベクターを哺乳動物に投与すること（ここで、前記発現
    ベクターは、少なくとも、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよ
    び細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドを含んで成る）、 の段階を含んで成る、ウイルス感染症の治療方法。
  89. 【請求項８９】 最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコード
    する試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、全部が操
    作可能に連結されたポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコード
    するポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞
    結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化
    配列を含んで成る発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入する条件下で同定され
    ）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、
    試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞
    を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメントであることを示し）
    ；ならびに 非経口経路を介して抗原提示細胞を哺乳動物に投与すること（ここで、前記抗原
    提示細胞は試験ポリペプチドで形質導入される）、 の段階を含んで成る、自己免疫疾患の治療方法。
  90. 【請求項９０】 最低１種のＭＨＣ−ＩＩに拘束されるエピトープをコード
    する試験ポリペプチドを同定すること（ここで、前記ポリペプチドは、全部が操
    作可能に連結されたポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコード
    するポリヌクレオチド、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞
    結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化
    配列を含んで成る発現ベクターで抗原提示細胞を形質導入する条件下で同定され
    ）、ならびにＴ細胞の活性化を評価すること（ここで、Ｔ細胞の前記活性化は、
    試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞
    を活性化することが可能な遺伝子もしくはそのフラグメントであることを示し）
    ；ならびに 非経口経路を介して発現ベクターを哺乳動物に投与すること（ここで、前記発現
    ベクターは、少なくとも、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
    および細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドを含んで成る）、 の段階を含んで成る、自己免疫疾患の治療方法。
  91. 【請求項９１】 抗原提示細胞中に発現ベクターを導入して形質導入された
    抗原提示細胞を産生させることにより前記抗原提示細胞を形質導入すること（こ
    こで、前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプ
    ロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードす
    るポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌ
    クレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）；ならびに 抗原が細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記抗原を産生さ
    せること、 の段階を含んで成る、哺乳動物を免疫感作するためのワクチンの製造方法。
  92. 【請求項９２】 抗原提示細胞が、哺乳動物に投与する前にインビトロでワ
    クチンで形質導入される、請求項４１記載のワクチンの投与方法。
  93. 【請求項９３】 ワクチンが非経口で投与される、請求項３８記載のワクチ
    ンの投与方法。
  94. 【請求項９４】 抗原提示細胞が、哺乳動物に投与する前にエクスビボでワ
    クチンで形質導入される、請求項４１記載のワクチンの投与方法。
  95. 【請求項９５】 サイトカイン発現ベクターおよびレトロゲン発現ベクター
    を哺乳動物に共投与すること（ここで、レトロゲン発現ベクターは、全部が操作
    可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコード
    するポリヌクレオチド、抗原をコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコ
    ードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで
    成る）の段階を含んで成る、免疫応答の誘導方法。
  96. 【請求項９６】 サイトカイン発現ベクターがＧＭ−ＣＳＦの配列を含有す
    る、請求項９５記載の方法。
  97. 【請求項９７】 サイトカイン発現ベクターがＩＬ−２の配列を含有する、
    請求項９５記載の方法。
  98. 【請求項９８】 哺乳動物に１種の発現ベクターを投与すること（ここで、
    前記発現ベクターは、１個のプロモーターの転写制御下に、サイトカインタンパ
    ク質をコードするポリヌクレオチド配列および融合タンパク質をコードするポリ
    ヌクレオチド配列を含んで成り、前記融合タンパク質はシグナル配列、抗原およ
    び細胞結合要素を含んで成る）の段階を含んで成る、免疫応答の誘導方法。
  99. 【請求項９９】 サイトカインタンパク質をコードするポリヌクレオチド配
    列および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が別個の転写制御下
    にあり、また、サイトカインタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列およ
    び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が１個の発現ベクター中で
    縦列にある、請求項９８記載の方法。
  100. 【請求項１００】 哺乳動物に２種の異なるレトロゲン発現ベクターを共投
    与すること（ここで、第一のレトロゲン発現ベクターは、全部が操作可能に連結
    された、ポリヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌ
    クレオチド、第一の抗原をコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコード
    するポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成り
    ；また、第二のレトロゲン発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリ
    ヌクレオチドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、
    第二の抗原をコードするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌク
    レオチドおよびポリヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成る）の段階を含
    んで成る、免疫応答の誘導方法。
  101. 【請求項１０１】 哺乳動物に１種の発現ベクターを投与すること（ここで
    、前記発現ベクターは、１個のプロモーターの転写制御下に第一の融合タンパク
    質をコードするポリヌクレオチド配列および第二の融合タンパク質をコードする
    ポリヌクレオチド配列を含んで成り、前記第一の融合タンパク質は、第一のシグ
    ナル配列、第一の抗原および第一の細胞結合要素を含んで成り、かつ、前記第二
    の融合タンパク質は、第二のシグナル配列、第二の抗原および第二の細胞結合要
    素を含んで成る）の段階を含んで成る、免疫応答の誘導方法。
  102. 【請求項１０２】 前記第一および第二のシグナル配列が同一のシグナル配
    列であり、第一および第二の抗原が異なる抗原であり、そして前記第一および第
    二の細胞結合要素がＦｃフラグメントである、請求項１０１記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 前記第一および第二のシグナル配列が同一のシグナル配
    列であり、第一および第二の抗原が異なる抗原であり、そして前記第一および第
    二の細胞結合要素が同一の細胞結合要素である、請求項１０１記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 前記第一および第二のシグナル配列が異なるシグナル配
    列であり、第一および第二の抗原が異なる抗原であり、そして前記第一および第
    二の細胞結合要素が同一の細胞結合要素である、請求項１０１記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 前記第一および第二のシグナル配列が同一のシグナル配
    列であり、第一および第二の抗原が異なる抗原であり、そして前記第一および第
    二の細胞結合要素が異なる細胞結合要素である、請求項１０１記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 前記第一および第二のシグナル配列が異なるシグナル配
    列であり、第一および第二の抗原が異なる抗原であり、そして前記第一および第
    二の細胞結合要素が異なる細胞結合要素である、請求項１０１記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 第一の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配
    列および第二の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が別個の転写
    制御下にあり、また、第一の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
    および第二の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が１個の発現ベ
    クター中で縦列にある、請求項１０１記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 融合タンパク質を投与すること（ここで、該タンパク質
    は細胞結合要素に融合されたＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩエピトープの双方を
    含んで成る）の段階を含んで成る、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のＴ細胞の同時
    誘導方法。
  109. 【請求項１０９】 発現ベクターを抗原提示細胞中に導入して形質導入され
    た抗原提示細胞を産生させることにより、前記抗原提示細胞を形質導入すること
    （ここで、前記発現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチ
    ドプロモーター配列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、抗原をコー
    ドするポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポ
    リヌクレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）；ならびに 融合タンパク質が細胞から分泌される条件下で前記ベクターを発現させて前記融
    合タンパク質を産生させること、 の段階を含んで成る、融合タンパク質の製造方法。
  110. 【請求項１１０】 哺乳動物に投与する前にインビトロで融合タンパク質で
    形質導入された抗原提示細胞を投与することを含んで成る、融合タンパク質の投
    与方法。
  111. 【請求項１１１】 哺乳動物に融合タンパク質を非経口で投与することを含
    んで成る、融合タンパク質の投与方法。
  112. 【請求項１１２】 細胞中に発現ベクターを導入すること（ここで、前記発
    現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配
    列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、細胞内タンパク質をコードす
    るポリヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌ
    クレオチドポリアデニル化配列を含んで成り）；ならびに 融合タンパク質が細胞から分泌される条件下で、前記ベクターを発現させて前記
    融合タンパク質を産生させること、 の段階を含んで成る、細胞内タンパク質の分泌方法。
  113. 【請求項１１３】 細胞内タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの
    一領域が、分泌の効率を増大させるよう短縮される、請求項１１２記載の方法。
  114. 【請求項１１４】 細胞内タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの
    一領域が、分泌の効率を増大させるよう突然変異される、請求項１１２記載の方
    法。
  115. 【請求項１１５】 細胞内タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが
    ＨＰＶ １６ Ｅ７である、請求項１１２記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 発現ベクターを細胞中に導入すること（ここで、前記発
    現ベクターは、全部が操作可能に連結された、ポリヌクレオチドプロモーター配
    列、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、膜タンパク質をコードするポ
    リヌクレオチド、細胞結合要素をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレ
    オチドポリアデニル化配列を含んで成り）；ならびに 融合タンパク質が細胞から分泌される条件下で、前記ベクターを発現させて前記
    融合タンパク質を産生させること、 の段階を含んで成る、膜タンパク質の分泌方法。
  117. 【請求項１１７】 膜タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの一領
    域が、分泌の効率を増大させるよう短縮される、請求項１１６記載の方法。
  118. 【請求項１１８】 膜タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの一領
    域が、分泌の効率を増大させるよう突然変異される、請求項１１６記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 膜タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドがＥＢ
    Ｖ核抗原１である、請求項１１６記載の方法。
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