JP2002507881A - 樹枝状細胞前駆体のインビトロ増殖の方法およびその免疫原製造への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 樹枝状細胞前駆体の増殖培養物の製造方法を提供する。また、増殖性樹枝細胞前駆体から培養で成熟した樹枝状細胞を製造する方法をも提供する。成熟した樹枝状細胞の培養は、樹枝状細胞変性された抗原または抗原でパルスされた樹枝状細胞を含む新規なＴ細胞依存性抗原を製造する効果的な手段を提供する。この抗原は抗原−活性化樹枝状細胞上に提示及び発現される。本発明の新規な抗原は、ワクチン類に対する又は病気の治療に対する免疫原として使用できる。これらの抗原は、また例えば若年型糖尿病や多発硬化症等の自己免疫疾患の治療にも使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 樹枝状細胞前駆体のインビトロ増殖の方法および その免疫原製造への使用 本発明は、国立保健研究所の支給するＮＩＨ交付金ＡＩ１３０１３による米国 政府の支援のもとに行われた。米国政府はこの発明にいくらかの権利を有する。 本発明の達成は、交付金ＮＢ４３７０（オーストリア国立銀行）およびＰ８５４ ９（オーストリア科学財団）を通じてオーストリア政府によっても支援された。 この出願は、１９９２年４月１日に出願された米国特許出願０７／８６１，６ １２の一部継続出願である１９９２年１１月２５日に出願された米国特許出願０ ７／９８１，３５７の一部継続出願である。 発明の技術分野 本発明は、免疫系の細胞の培養法に関する。更に詳しくは、樹枝状細胞前駆体 の培養および樹枝状細胞を成熟させるためのインビトロでのその成熟のための方 法が提供される。本発明は、Ｔ細胞依存株である樹枝状細胞で修飾された抗原、 その製造法およびその免疫原としての使用にも関する。本発明の成熟樹枝状細胞 を使用するワクチン、動物およびヒトの免疫法ならびに修飾された抗原も説明さ れる。 発明の背景 免疫系は、現存の抗原に特定され種々のＴ―依存性の免疫応答を開始する樹枝 状細胞の系を含む。樹枝状細胞は身体全部に種々の組織内に広く分布している。 樹枝状細胞の分布は文献（１）に概説されている。樹枝状細胞は皮膚や気道のよ うに身体表面に近いか、心臓や肝臓のような器官の細胞間部分にある非リンパ系 器官中に見出される。樹枝状細胞は、多分サイトカイン顆粒球マクロファージコ ロニー刺激因子（以下ＧＭ―ＣＳＦと略す）の支配下にあり、細胞の増殖を起こ さない成熟過程を受けることができる（２，３）。最初に、樹枝状細胞および十 中八九豊富な新しく合成されたＭＨＣクラスII分子にある現存の抗原、つぎに強 いアクセサリーおよび細胞―細胞間接着の機能が取得される（４―７）。樹枝状 細胞は血液およびリンパ液を経てリンパ系器官に移動できる（８―１０）。この 場合、多分Ｔ―領域の「絡み合い」細胞として、抗原は再循環性プール中でＴ細 胞に提供され得る（１４）。しかし、上記に概説した種々の区画内での樹枝状細 胞のプロジェニターについてはほとんど分かっていない。 強い免疫応答が続くような形での抗原の送出における樹枝状細胞の効力、即ち 「免疫原性」は広く知られているが、この細胞の使用はどの器官にも極めて少な いという事実によって妨げられる。例えば、ヒトの血液では白血球の約０．１％ が樹技状細胞であり（２５）、この時点まで成長に誘導されなかった。同様に、 以前の研究（２０，２１）は培養中での骨髄からの多数の樹枝状細胞の成育を報 告してはいない。ずっと最近の報告はＧＭ―ＣＳＦで補われた髄培養物中での樹 枝状細胞の成育を記載しているが、樹枝状細胞の起源または樹枝状細胞の濃厚な 源泉としての増殖凝集体の使用についての証拠は見られない。Ｓｃｈｅｉｃｈｅ ｒら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．１５４：２３−２６４（１９９２） 。樹枝状細胞は、外来の抗原を免疫学的に活性なＴ細胞が認識すべきペプチドに 加工できる（４，６，７，１４）、すなわち樹枝状細胞は「抗原提示」の現象を 達成するが、樹枝状細胞の少ないことが免疫原性ペプチドの同定へのその使用を 妨げている。 脾臓（１５）および求心性リンパ液（１６，１７）内の樹枝状細胞は、細胞周 期内にはないが、増殖前駆体から発生する。結局、樹枝状細胞は骨髄（１５，１ ６，１８，１９）から発生するが、その少量の発生を記載した二つの報告（２０ ，２１）を除いて、培養物中にこの細胞を発生させるのは困難であった。骨髄前 駆体細胞は報告されているが、培養物中でのその増殖を方向づける条件は報告さ れていない。Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．「樹枝状細胞およびその免疫原性における 役割」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：２７１−９６（１９９１）。 血液に比べて骨髄中で増殖する樹枝状細胞の同定は困難である。ＧＭ―ＣＳＦに 応答して発育する多数の顆粒球があり、それが未熟樹枝状細胞培養物に溢れて、 樹枝状細胞前駆体の成熟を阻害するからである。骨髄樹枝状細胞前駆体を豊富に するために細胞表面マーカーの使用が報告されているが、マーカーは多数の非樹 枝状骨髄細胞によっても表現されるので、中程度の増加しか得られなかった。Ｂ ｏｗｅｒｓ，Ｗ．Ｅ．およびＧｏｏｄｅｌｌ、「樹枝状細胞個体発生」Ｒｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：８８０−８８３（１９８９）。 比較的少数の樹枝状細胞が血液からも単離されている。Ｖａｋｋｉｌａ Ｊ． ら「ヒトの末梢血から誘導された樹枝状細胞はインターロイキン１α、インター ロイキン１βまたはインターロイキン６を産生しない」Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．３１：３４５−３５２（１９９０）：Ｖａｎ Ｖｏｏｒｈｉｓ Ｗ． Ｃ．ら「ヒトの樹枝状細胞」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１７２−１１８７（１９８ ２）。しかし、血液中の樹枝状細胞前駆体の存在は報告されていず、ごく最近１ ９８９年でも他の組織内での血液樹枝状細胞と成熟樹枝状細胞との関係は不確か である。さらに、樹枝状細胞は「希薄で単離が難しく、末梢組織中にＤＣ（樹枝 状細胞）を発生させることはまだ示されていないことが認められている。Ｍａｃ Ｐｈｅｒｓｏｎ．Ｇ．Ｇ．「リンパ系樹枝状細胞：その生涯と免疫応答におけ る役割」Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：８７７−９２６（１９８９）。 顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ―ＣＳＦ）は、樹枝状細胞の 成熟と機能を調節する因子である。Ｗｉｔｍｅｒ−Ｐａｃｋら、「顆粒球／マク ロファージコロニー刺激因子は、培養されたマウス上皮ランゲルハンス細胞の生 存と機能に必須である」。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１４８４−１４９８（ １９８７）。Ｈｅｕｆｌｅｒ Ｃ．ら、「顆粒球／マクロファージコロニー刺激 因子おおびインターロイキン１は、マウス上皮ランゲルハンス細胞の強力な免疫 促進性樹枝状細胞への成熟を起こさせる」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：７０ ０−７０５（１９８８）。樹技状細胞のインビトロでのＧＭ―ＣＳＦで刺激され た成熟は、樹枝状細胞の前駆体の培養物中のＧＭ―ＣＳＦの存在が免疫学的に活 性な細胞への成熟を起こさせることを示唆するが、強力な樹枝状細胞の成長とい う重要な目標はまだ解決されていない。 Ｔ−依存性の免疫応答は、Ｂ細胞による抗体の生産でのＴ―ヘルパー細胞の活 性化によって特徴づけられる。Ｔ−依存性の免疫応答がＴ―非依存性の免疫応答 より優れているところは、Ｔ−依存性の応答が記憶を持つこと、すなわち抗原が 存在しないときでも細胞は抗体を速やかに生産して抗原へ応答する用意があり、 従って免疫応答は「ブースト可能」であるということである。これに対し、Ｔ― 非依存性の免疫応答は、比較的子供には少なく、Ｔ―非依存性の抗原が繰り返し 投与された場合、ブースター応答を欠く。Ｔ細胞の免疫学的記憶は多分、免疫応 答の最初の「一次」または「感作」リムの二つの結果を反映する：（ａ）抗原保 有の樹枝状細胞に応答して成長する多数の抗原―特異性Ｔ細胞、および（ｂ）樹 枝状細胞のプライミングの後に起こる個々のＴ細胞の機能の増進〔Ｉｎａｂａら 、休止および感作Ｔリンパ球は成長とリンフォカイン放出のための明瞭な刺激（ 抗原提供細胞）の要件を示す；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：８６８−８７６（ １９８４）；ＩｎａｂａおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、「樹枝状細胞によって開始さ れる蛋白―特異性ヘルパーＴリンパ球の形成」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：４７５ −４７９（１９８５）；Ｉｎａｂａら、「混合白血球反応から単離された記憶Ｔ リンパ球の性質」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７６８６− ７６９０（１９８５）〕。 或る種類の抗原はＴ―細胞依存性の抗体応答を特徴的に誘発するが、他のもの はＴ―細胞非依存性の応答を誘発する。例えば、一般に多糖はＴ―細胞非依存性 の免疫応答を誘発する。記憶応答はなく、従って多糖類抗原によるその後の感染 に対する保護もない。しかし、蛋白質は幼児でのＴ―細胞依存性の応答を誘発す る。蛋白質に共有結合した多糖を含む接合ワクチンの成育は、多糖Ｔ―非依存性 の応答をＴ―依存性の応答に変換する。残念ながら、そのＴ―細胞依存性を与え る蛋白質の上の位置についてはほとんど分かっておらず、従ってもっと特異的な 抗原の設計を妨げている。 上記のように、樹枝状細胞はＴ―依存性の応答の開始に重要な役割を演ずる。 樹枝状細胞は、修飾された抗原が樹枝状細胞の表面に存在するときにＴ―細胞を 活性化して抗体の最終的生産に関与することができるかたちで抗原と結合しそれ を修飾する。例えば樹枝状細胞による抗原の修飾は、蛋白質を分断して特異的に Ｔ―細胞を活性化できる領域を持つペプチドを生産することを包含してもよい。 細胞が抗原を分断してペプチドにし、つぎにこのペプチドを主要組織適合複合 体（ＭＨＣ）の生成物と会合させる場合を、「抗原提示」という。ＭＨＣは、そ の生産物が種々の細胞の表面に表現される高度に多形性の遺伝子の領域である。 ＭＨＣ抗原は、移植片拒絶反応の主な決定因子である。二つの異なった種類のＭ ＨＣ遺伝子生成物、クラスＩおよびクラスIIのＭＨＣ分子、が同定されている。 Ｔ細胞は、唯一つの特定のクラスＩおよびクラスIIのＭＨＣ分子に結合した外来 の抗原を認識する。クラスＩおよびクラスIIのＭＨＣ分子との抗原会合のパター ンで、どちらのＴ細胞が刺激されるかが決まる。例えば、余分な細胞状蛋白質か ら誘導されたペプチド断片は普通クラスIIのＭＨＣ分子に結合し、樹枝状細胞に 内因的に転写された蛋白質は一般に新しく合成されたクラスＩのＭＨＣ分子と会 合する。その結果、外因的および内因的に合成された蛋白質は、典型的に別々の Ｔ細胞集団によって認識される。 樹枝状細胞は、全動物の免疫応答に細胞を提示する特殊化された抗原である（ １４，３１）。しかしここでも、免疫原ペプチドを同定し抽出するのに樹枝状細 胞を使用する能力は細胞を提示するこれらの特殊化された抗原の数が少ないこと によって妨げられる。 粒子の取り込みは単核および多形核の食細胞の特殊化された活性である。死滅 細胞、免疫複合体および微生物はすべて貪欲に取り込まれる。ヒドロラーゼの多 いリソソームとの融合の後、摂取された粒子は分解される（６０，６１）。この 分解は透過できるアミノ酸（６２，６３）および糖の水準でなければならず、さ もないと空胞化装置が不消化性の物質で膨潤する（６４，６５）。食細胞のその ようなクリアランスおよび消化の機能は、負傷の治療、組織の改造および宿主の 防御に貢献する。 エンドサイトーシスのもう一つの結果である抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗 原の処理は、食菌のスカベンジング作用とは多くの点で異なる。先ず、処理には 少なくとも８〜１８個のアミノ酸の長さのペプチドの生成が要り、スカベンジン グはアミノ酸への消化を伴う（６２，６３）。第二に、提示にはクラスIIのＭＨ Ｃ生成物へのペプチドの結合を要し（６，６８）、スカベンジングはＭＨＣ生成 物を必要としない。第三に、抗原提示は低容量で機能できる。若干のＴ―Ｔハイ ブリッド（６９，７０）および一次Ｔ細胞集団（７１）の刺激を成功させるには 、僅か数百分子のリガンドを発生させるだけでよいからである。スカベンジング の間、食細胞は一時間あたり数十万個の蛋白質分子を除去し破壊する（６３）。 最後に、抗原提示はクラスIIのＭＨＣに富むが食作用活性を少ししか示さない細 胞、およびリソソーム、すなわち樹枝状細胞およびＢ細胞によって一番よく行わ れ、食細胞（マクロファージおよび好中球）はしばしば低水準のクラスIIおよび 豊富なリソソームを有する。これらの知見は、樹枝状細胞およびＢ細胞のエンド サイトシス系内での抗原の特殊化の同定とともに、抗原提示のために必要な機械 がスカベンジングに必要なそれと、定量的にも定性的にも異なるという示唆に導 く（３１）。 樹枝状細胞の場合、これらのＡＰＣはその生涯の或る時点で食菌活性があると いう徴候がある。Ｐｕｇｈらはいくつかの求心性リンパ液樹枝状細胞においてフ ォイルゲン染色された封入を認め、他の細胞の食菌作用がリンパ液への侵入に先 立って起こったと示唆した（１６）。Ｆｏｓｓｕｍは同種白血球を拒絶している マウス中のＴ細胞領域の絡み合い樹枝状細胞中の食菌的包摂を記載している（７ １）。Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａら（７４）は、新しく単離した上皮ランゲルハ ンス細胞は、未熟であるが増殖しない樹枝状細胞であるが、少量の或る種の粒子 を取り込むことを見出した。しかし、粒子が増殖中の樹枝状細胞の培養物に投与 されたとき、食菌作用の発生を示しまたは示唆した報告はない。 リンパ腫に対する活性免疫応答を誘発させるための哺乳類への病原性リンパ球 でパルスされた樹枝状細胞の注入は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１３６３２の主 題である。さらに、ＦｒａｎｃｏｔｔｅおよびＵｒｂａｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ’１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８２：８１４９（１９８５）は、インビトロ でウイルスでパルスされマウスに注入し戻したマウスの樹枝状細胞がウイルスへ の一次応答および二次応答を増大させることを報告した。Ｆｒａｎｃｏｔｔｅお よびＵｒｂａｉｎの報告も特許出願ＷＯ９１／１３６３２も、免疫応答を活性化 するアジュバントとして樹枝状細胞を使用する実際的な方法を提示してはいない 。これらの方法はどちらも大抵の治療法や免疫法には実用的でない細胞源である 脾臓から得られた樹枝状細胞に頼っているからである。さらに、どちらの報告も 臨床的に使用するのに充分な量の樹枝状細胞を得る方法を提供していない。 発明の要約 本発明は、増殖している細胞培養物から樹枝状細胞の集団を製造する方法を提 供する。この方法は（ａ）樹枝状細胞前駆体から成る組織源を提供し、（ｂ）（ ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、インビトロ培 養に適した細胞集団を得、（ｃ）ＧＭ―ＣＳＦ、またはＧＭ―ＣＳＦの生物学的 に活性な誘導体から成る培養培地中の基体上でこの組織源を培養して、増殖する 非付着性細胞および細胞集合を得、（ｄ）この非付着性細胞および細胞集合を継 代培養して増殖する樹枝状細胞前駆体から成る細胞集合体を製造し、（ｅ）この 細胞集合体を一回以上順次継代培養して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させるこ とから成る。 本発明はまた、増殖している細胞培養物からインビトロで成熟樹枝状細胞を製 造する方法を提供する。この方法は（ａ）樹枝状細胞前駆体から成る組織源を提 供し、（ｂ）（ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ 、インビトロ培養に適した細胞集団を得、（ｃ）ＧＭ―ＣＳＦ、またはＧＭ―Ｃ ＳＦの生物学的に活性な誘導体から成る培養培地中の基体上でこの組織源を培養 して、非付着性細胞および細胞集合を得、（ｄ）この非付着性細胞および細胞集 合を継代培養して増殖する樹枝状細胞前駆体から成る細胞集合体を製造し、（ｅ ）この細胞集合体を一回以上順次継代培養して樹枝状細胞前駆体の比率を増加さ せ、（ｆ）この樹枝状細胞前駆体を成熟させて成熟樹枝状細胞にするのに充分な 期間、この樹枝状細胞前駆体の培養を継続することから成る。 非樹枝状前駆体の比率を減らすためには、非付着性細胞を得るために基体上で 組織源を培養する前に、または培養の初期の間に、組織源を前処理してもよい。 本発明の実施に好ましい組織源は、骨髄、特に血液である。 本発明はまた、増血を刺激する物質で個体を処理することによって組織源中に 存在する樹枝状細胞の比率を増加させる方法を提供する。 骨髄が組織源として使用される場合、前処理過程は補体から成る培地中で樹枝 状前駆体細胞に存在しない抗原に特異的な抗体と骨髄を接触させることによって 樹枝状前駆体細胞上で表現されない抗原を表現するキリング細胞から成る。好ま しくない非樹枝状細胞前駆体の除去は、好ましくない非樹枝状細胞またはその前 駆体細胞を固体の支持体上に吸着させることによっても達成される。 本発明はまた、治療に使用でき、新しい治療用抗原の製造にも使用できる量で 樹枝状細胞前駆体および樹枝状細胞を提供する。さらに、本発明の方法で調製さ れた樹枝状細胞前駆体および樹枝状細胞も提供される。 本発明の別の実施態様は、抗原で活性化された樹枝状細胞が抗原に露出されＴ 細胞への提示およびＴ細胞の活性化のために修飾された抗原を表現する本発明の 方法によって調製された抗原で活性化された樹枝状細胞である。 本発明はまた、非修飾または野性の抗原の免疫原断片であり活性Ｔ細胞を分断 する修飾抗原を生産するために樹枝状細胞で抗原が修飾される本発明の方法によ って調製された樹枝状細胞の培養物に抗原を露出させることによって製造される 新規な抗原を提供する。 この新しい抗原は、動物およびヒトを免疫して疾病を予防し治療するのに使用 できる。 本発明はまた、増殖可能な前駆体細胞の集団から前駆体樹枝状細胞を提供し、 樹枝状細胞前駆体が抗原を食菌して抗原を含む樹枝状細胞前駆体を得るのに充分 な時間だけ、前駆体細胞を抗原と接触させ、抗原が処理され樹枝状細胞前駆体に よって提示されるのに充分な条件と時間の間その抗原を含む樹枝状細胞前駆体を 培養することから成る樹枝状細胞前駆体からの抗原の調製法を提供する。 食菌作用の結果として樹枝状細胞前駆体で処理された抗原は、単独または樹枝 状細胞前駆体を含むアジュバントと組み合わせて、個体中での免疫応答を抗原に 誘発させるのに使用される。 また、それらの個体の血液中の骨髄性樹枝状プロジェニター細胞の数を増加さ せる組成物および方法も提供される。 別の実施態様では、樹枝状細胞前駆体の収量が、充分な量のＧＭ―ＣＳＦおよ び他のサイトカイン中で前駆体を培養して、樹枝状細胞前駆体の増殖を促進する ことによって増加される。他のサイトカインには、Ｇ―ＣＳＦ、Ｍ―ＣＳＦ、Ｔ ＮＦ―α、インターロイキン―３、およびインターロイキン―１α、インターロ イキン―１β、インターロイキン６および幹細胞因子も包含するが、それらに限 定されない。 別の実施態様では、本発明は個体が免疫応答をそれに発生させた蛋白質で本発 明の樹枝状細胞をパルスさせ、関係する自己ペプチドまたは自己抗原を抽出する ことによって製造される自己ペプチド抗原を提供する。 本発明はまた、自己蛋白質への体制を誘導するために本発明の方法によって製 造された自己ペプチドの治療上有効な量で個体を治療することによって自己免疫 疾患を治療する方法を提供する。 抗原が自己蛋白質であるか自己抗原であるような抗原で活性化された樹枝状細 胞を治療の必要性によって個体に投与することから成る自己免疫疾病の治療も提 供される。 若年性糖尿病、重症筋無力症、および多発性硬化症の群から選ばれる自己免疫 疾患を治療するための本発明の組成物および方法の使用も提供される。 本発明はまた、病原論がアトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎に存在するよう な異常肥大のＴ細胞伝達の免疫応答を含む炎症性疾患の治療を提供する。 本発明はまた、本発明の方法によって調製された樹枝状細胞の培養物に抗原を 露出させて、抗原で活性化された樹枝状細胞を製造し、ついで宿主をこの抗原で 活性化された樹枝状細胞で接種することから成る宿主への抗原の提供法を提供す る。 本発明はさらに、蛋白質、ウイルスおよび微生物の抗原を捕捉するためにその 場で 樹枝状細胞を増殖させ、つぎにインビトロまたはその場でＴ細胞に強力な方 法でこれらの抗原を提示することから成るＴ細胞の活性化の方法を提供する。 本発明はさらに、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII生成物を抗原ペプチドで提示 するための成熟および前駆体樹枝状細胞の使用から成る方法を提供する。 本発明はまた、個体のＭＨＣ生成物に特異的な抗原ペプチドを作り、それによ って個体内に免疫原応答を与えるのに使える特定の刺激性抗原を提示する細胞の 数を増加させる方法を提供する。 また、結核を含むミコバクテリア、バクテリアおよびウイルスによって起こる 疾病を含むがそれらに限定されない感染症を治療する組成物および方法も提供さ れる。 その場での能動免疫および免疫療法のための伝播体として樹枝状細胞または樹 枝状細胞前駆体を使用するための組成物および方法も提供される。 上記の抗原および抗原で活性化された樹枝状細胞のどれかから成るワクチンお よび本発明の組成物のどれかを投与することから成るヒトまたは動物の疾病を免 疫する方法も提供される。 本発明の一つの目的は、樹技状細胞が抗原と結合したときに免疫原またはアジ ュバントとしての使用に適する成熟樹枝状細胞に進化するように樹枝状細胞をイ ンビトロ で培養する方法を提供することである。 樹枝状細胞前駆体によって処理され提示されるべき抗原性物質を食菌できる樹 枝状細胞前駆体を提供することも本発明の一つの目的である。 本発明のもう一つの目的は、疾病の治療または予防に有用な樹枝状細胞および 樹枝状細胞前駆体の充分な量の便利で実用的な源泉を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、抗原に露出され、その表面に修飾された抗原を表 現する本発明の樹枝状細胞または樹技状細胞前駆体から成る新規な免疫原を提供 することである。 本発明の別の目的は、樹枝状細胞前駆体または樹枝状細胞に露出されることに よって修飾され、修飾された抗原はＴ―細胞依存性の抗原として有効であるよう な抗原を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、疾病の予防および治療のためにＴ―細胞依存性の 抗原で個体を免疫する方法を提供することである。図面の凡例 図１ 樹枝状細胞「コロニー」を誘導するための工程図。 図２ 増殖する凝集物から放出される樹枝状細胞のＦＡＣＳ分析。樹枝状細胞前 駆体上で種々の細胞表面の決定基を認識する数種のｍＡｂ（２３，２４，２８） が示されている。ＭＨＣクラスＩおよびクラスII生成物を除き、放出された細胞 の表現型は均質である。一次ｍＡｂなしの染色はＲＢ６およびＲＡ３と同じであ る。図３ 増殖する凝集物のパスツール・ピペッティングによって除去できる樹 枝状細胞、および培養物中に自然に放出された樹枝状細胞のＦＡＣＳ分析。ｍＡ ｂは：Ｍ１／４２抗ＭＨＣクラスＩ〔ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ１２６〕；ＮＬＤＣ１４ ５抗―絡合細胞（１３）；Ｍ５／１１４抗―ＭＨＣクラスII〔ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ １２０〕；３３Ｄ１抗―樹枝状細胞〔ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ２２７〕；Ｂ５―５抗― Ｔｈｙ―１。抗―ＭＨＣ ｍＡｂによる染色は双峰であるが、樹枝状細胞の放出 細胞画分はＭＨＣクラスＩおよびクラスIIの表現において最も豊富である。 図４ ＧＭ―ＣＳＦで刺激されたマウスの血液培養物から単離された集団のＭＬ Ｒ刺激活性（本文参照）。 図５ ＧＭ―ＣＳＦの存在下に培養された骨髄内でのＭＬＲ刺激活性の進行性生 育。 Ｉａ―陰性の前駆体、ＢおよびＴ細胞―減少の髄細胞は２日毎に培地の３／４ を交換するＧＭ―ＣＳＦ中で培養された。各時点で、細胞は静かにピペッティン グして除去した。照射の後、等級分けした髄細胞の投与を、３×１０⁵個の同種 〔Ｃ５７ＢＬ／６、左〕または同系〔ＢＡＬＢ／Ｃ×ＤＢＡ／２ Ｆ１〕細胞に 行い、ＭＬＲ中で４日間培養した。３Ｈ―ＴｄＲの取り込みを８０〜９４時間目 に測定した〔数値は標準誤差バーを持つ３組の平均値である〕。 図６ ＧＭ―ＣＳＦを追加した骨髄培養物中に生育するＭＬＲ刺激細胞の物理的 性質（本文参照）。 Ａ． 図５のものと類似の培養物を非付着性〔白〕および緩付着性〔黒〕の画分 に分離した。後者は単分子層の上を静かにピペッティングすることによって除去 できる細胞である。４日目の分離のためには緩付着性の細胞〔主に顆粒球〕を２ 日目に洗い流し、６日目の分離のためには顆粒球を２日目および４日目に洗い流 した。細胞は照射され、図５におけるように同種Ｔ細胞に等級分けした投与で適 用された。 Ｂ． 示された時点において、遊離の細胞および細胞凝集物を基質単分子層から 除去し、１ｇ沈降で分離した。凝集物は１日間培養して放出細胞を得た。これら の細胞および１０ｍＭのＥＤＴＡの存在で除去された強付着性細胞は照射してＭ ＬＲ刺激物質として試験した〔白四角〕。 図７ ＧＮ―ＣＳＦを追加した骨髄培養物内の凝集物からのＩａ―陽性の細胞の 生育の細胞蛍光分析。 ＧＭ―ＣＳＦで刺激された骨髄培養物〔左、未画分〕を緩付着細胞凝集物〔中 央〕および一夜の培養のあと凝集物から細胞〔右〕と比較した。細胞は４日目お よび６日目に取り出され、放出された細胞は５日目および７日目に分析した。細 胞は非一次ｍＡｂ〔ｎｏ １ｒｙ〕またはｍＡｂで顆粒球〔ＲＢ−６〕またはＭ ＨＣクラスII生成物〔Ｂ２１―２〕に染色し、つぎにＦＩＴＣ―マウス抗―ラッ トＩｇを行った。 図８ 成長中の樹枝状細胞凝集物から放出されるＩａ―陽性の細胞の詳細な細胞 蛍光分析による表現型の解析。汚染性のＩａ―陰性の顆粒球は低い前方光散乱に 基づいてゲートアウトし、その結果図示のようにラットおよびハムスター抗−マ ウスｍＡｂ（７，１７）を使ってより大きい細胞上での多くの表面抗原の表現を 調べることができた。 図９ 樹技状細胞で制限された顆粒抗原２Ａ１およびＭ３４２を持つ生育中の細 胞の定量。 樹枝状細胞はＭ３４２および２Ａ１（３４）ｍＡｂのようなｍＡｂと反応する 細胞内顆粒を含む。マウスの髄からのＩａ―陰性の非リンパ球をＧＭ―ＣＳＦ中 で培養し、緩付着顆粒球を２日目および４日目に洗い流した。２日目および４日 目のデータはピペッティングで除去できた細胞を表し、３日目および５〜８日目 のデータは単分子層から放出された細胞であった。示された各時点において、調 製され染色されたサイトスピン中に少なくとも５００個の細胞が数えられた〔本 文参照〕。５×１０⁵個／ｃｍ²の細胞で開始し、２日毎に３／４容の新しい培地 を添加した場合、総細胞およびＩａ⁺細胞の収量は、２日目で１．０５×１０⁶お よび２．１×１０⁴、４日目で１．８１×１０⁶および２．１２×１０⁵、６日目 で１．５１×１０⁶および３．２１×１０⁵であった。 図１０ 成長している樹枝状細胞のプロジェニター―後代の関係。成長している 凝集物は４日目に骨髄培養物から分離し、０．１μＣｉ／ｍｌ、３×１０⁵個／ ウエルの細胞で、³Ｈ−ＴｄＲで１２時間パルスした。すべてのウエルは新しい 培地で置換し、１、２または３日の追跡で培養物に戻した。追跡中の放出細胞の 収量は、それぞれウエル当たり２．０、２．９および３．０×１０⁵であった。 Ｉａ⁺細胞の含有量は、パルスのあと２８％、１日目、２日目および３日目でそ れぞれ４７％、５５％および６２％であった。データは、放射能で標識された細 胞の百分率として表示され、線で埋めた部分は成熟樹枝状細胞の２Ａ１顆粒細胞 抗原を表現する細胞である。 図１１ ＧＭ―ＣＳＦを追加した骨髄培養物中での樹枝状細胞の成長の提案経路 図。増殖する凝集物は細胞ストローマに付着するか、それ自身付着性の前駆体か ら生成する。凝集物の周辺とそれから放出される細胞内で明白な樹枝状細胞の分 化の間に、細胞過程、ＭＨＣクラスII、ＮＬＤＣ―１４５表面抗原、およびＭ３ ４２および２Ａ１細胞内抗原〔本文参照〕の進行性増加およびプラスチックへの 付着の進行性減少がある。 図１２ ラテックスおよび炭素に露出された生育中の樹枝状細胞の差動―迅速染 色。 Ａ． ２μのラテックス球に２０時間露出したあとにサイトスピンされた生育中 の樹技状細胞の凝集物。凝集物中の多くの細胞は均一なラテックス粒子〔矢印〕 で標識されている。 Ｂ． Ａと同じ。ただし、培養物は１日追跡して成熟単一樹枝状細胞の製造を行 った。放出された樹枝状細胞の多くは、透明な切断された中心球のまわりに配置 された均一で半透明なラテックス球を含む〔矢印〕。 Ｃ． ＡおよびＢと同じ。ただし、凝集物はコロイド状炭素でパルスし、つぎに 炭素を含まない培地中で追跡した。凝集物から放出する成熟樹枝状細胞のいくつ かの中心球は、黒色の消化できない食菌トレーサー〔矢印〕の小さいが透明な切 断されたエンドサイティック顆粒を含む。 Ｄ． 成熟樹枝状細胞を増殖する凝集物から製造したあと、炭素に露出させた。 炭素の付着は明白ではない。 図１３ 抗酸菌および樹枝状細胞抗原のための二色標識を使用する生育中の樹枝 状細胞へのＢＣＧの取り込み。生育中の樹枝状細胞のクラスター〔ＧＭ―ＣＳＦ で誘導された６ｄ髄クラスター〕を、２時間ＢＣＧに露出した。単分子膜を洗浄 し、ＧＭ―ＣＳＦで２時間培地中で追跡した。細胞を解離し、ＦＩＴＣ―抗―Ｉ ―Ａ ｍＡｂで標識し、クラスIIに富んだ細胞を細胞選別で単離した〔培養物中 の細胞の大部分は前記のようにクラスIIに富んでいた（１６）〕。選別された細 胞はサイトスピンし、オーラミン―ローダミンで染色して細胞に会合したＢＣＧ が目で見えるようにし、種々のｍＡｂおよび免疫ペルオキシダーゼで二重標識し た。各一対の左および右のパネルはそれぞれ位相差および抗酸染色の像である。 左の矢印は右の桿菌の位置を示す。クラスIIの標識〔Ｉ―ＡおよびＩ−Ｅ、Ｍ５ ／１１４〕は、樹枝状細胞で制限されたＮＬＤＣ―１４５抗体よりも良く細胞過 程を概説する。 図１４ 樹枝状細胞中のＢＣＧの電子顕微鏡観察。 図２に示したように、ＧＭ―ＣＳＦで刺激した６日目の骨髄に１日間加えた。 洗浄してもう２日間培養したあと、放出された細胞を電子顕微鏡観察のために処 理した。 Ａ，Ｂ 多数の過程および僅かの食菌されたＢＣＧ〔矢印〕を持つ典型的な樹枝 状細胞を示す低電力写真。 Ｃ，Ｄ ＢＣＧに対する食胞膜、ならびにエンドサイティック空胞〔Ｅ〕、ゴル ジ装置〔ＧＡ〕、および密なコアを持った小さい小胞〔＊〕を含む樹枝状細胞の 中心球の細胞内器官を示す高電力写真。 図１５ ＣＦＡ感作／ＩＦＡ感作Ｔ細胞への抗原提示。 完全〔ＣＦＡ〕または不完全〔ＩＦＡ〕フロイントアジュバントで感作された 脚を排液するリンパ節から精製された。種々のＡＰＣが表示されている。成熟樹 枝状細胞は８日間の骨髄培養物であり、未熟樹枝状細胞は５〜６日間の培養物か らのものである。 図１６ その場での無垢なリンパ節Ｔ細胞への抗原提示。 骨髄樹枝状細胞の成長中の培養物を５〜６日目にＢＣＧでパルスし、直後また は２日間の追跡培養の後にＴ細胞の活性化に使用した。この集団を人口のアジュ バントなしに無垢のマウスの脚に注射した。５日後に、排出するリンパ節を採り ＰＰＤまたはＢＳＡの段階投与でインビトロで刺激し（樹枝状細胞はウシ胎仔血 清で成長した）、ＢＳＡは非粒子抗原として働いた。データは５匹のマウスの群 の平均値および標準誤差であり、それぞれ別々に検討された。ＢＣＧでパルスさ れた樹枝状細胞に露出されない対照のリンパ節は、ＰＰＤまたはＢＳＡに応答し なかった（＜２０００ｃｐｍ）。 図１７ その場での無垢な脾臓細胞への抗原提示。 骨髄樹技状細胞の成長中の培養物を５〜６日目（未成熟）、７〜８日目（成熟 ）または５〜６日目にＢＣＧでパルスし、つぎに２日間追跡した。各群の１０⁶ 個の細胞をマウスの群にｉ．ｖ．で注射した。５ないし１０日後、脾臓細胞を抗 原としてのＰＰＤまたはＢＳＡの段階投与でインビトロで培養した。樹枝状細胞 はＦＣＳ中で培養されたので、ＢＳＡの使用は、すべての樹枝状細胞集団がイン ビボ で比較的免疫原性であることを確保するコントロールとして働く。感作され ていない脾臓はＢＳＡにもＰＰＤにも応答しなかった。 図１８Ａ，ＢおよびＣ 実施例６に記載する方法によって製造されたヒト樹枝状 細胞の混合白血球反応（ＭＬＲ）分析。照射された細胞の段階投与（一連の３倍 希釈で３０ないし３０，０００）を、２×１０⁵個の補助細胞で排液されたＴ細 胞に添加した。サイトカイン不在（×）、またＧＭ―ＣＳＦ（○）、ＧＭ―ＣＳ Ｆ＋ＩＬ―１α（●）、ＧＭ―ＣＳＦ＋ＴＮＦ―α（□）、ＧＭ―ＣＳＦ＋ＴＮ Ｆ―α＋ＩＬ―１α（■）、ＧＭ―ＣＳＦ＋ＩＬ―３（△）、およびＧＭ―ＣＳ Ｆ＋ＩＬ―３ＩＬ―１（▲）の存在で培養された細胞のＴ細胞応答を５日目に³ Ｈ―チミジンの１６時間パルスで測定した。非樹枝状細胞の応答もＣに示す（◆ ）。三種の異なった実験を示す。実験ＡおよびＢのための細胞を提供する患者は 、Ｇ―ＣＳＦで前処理され、実験Ｃの患者はＧＭ―ＣＳＦで前処理された。サイ トカインは下記の濃度で使用した。ｒｈｕＧＭ―ＣＳＦ：４００または８００Ｕ ／ｍｌ；ｒｈｕＩＬ―１α、５０ＬＡＦ単位／ｍｌ（ＩＬ―１αは細胞の収集に 先立つ最後の２４時間の間だけ培養物中に存在する）；ｒｈｕＴＮＦ―α、５０ Ｕ／ｍｌ；およびｒｈｕＩＬ―３、１００Ｕ／ｍｌ。Ｘ軸上の数値は樹枝状細胞 の存在しないＸを除いて樹枝状細胞の数を表し、この数値は総細胞数に等しい。 ３回の培養物の標準偏差は平均値の１０％未満であり、表示されていない。 発明の詳細な説明 本発明は、インビトロで成熟する増殖中の樹枝状細胞前駆体の培養物を製造し て樹枝状細胞を成熟させる方法に関する。本発明の方法で製造される樹枝状細胞 および樹枝状細胞前駆体は、疾病の予防および治療のための種々の免疫学的介入 に適した量で製造できる。 樹技状細胞前駆体および成熟樹技状細胞の製造法のための出発物質は、本発明 の方法で処理した時、前駆体細胞が樹枝状細胞にインビトロで増殖および成熟で きる樹技状細胞前駆体から成る組織源である。そのような前駆体細胞は非付着性 であり、Ｉａ抗原、２Ａ１およびＭ３４２抗原（３４，４４）およびＮＬＤＣ１ ４５絡合細胞源抗原（１３）のような成熟樹枝状細胞に見られるｍＡｂマーカー では標識されない。好ましくは、そのような組織源は脾臓、求心性リンパ液、骨 髄および血液である。より好ましい組織源は骨髄および血液である。血液は入手 し易く比較的大量に得ることができるので、前駆体細胞の好ましい組織源である 。 ヒトを含む動物の樹枝状前駆体細胞の数を増加させるために、そのような個体 を造血を刺激する物質で処理するのが好ましい。そのような物質にはＧ―ＣＳＦ やＧＭ―ＣＳＦがあり、また造血を促進する他の因子も含まれる。投与すべき造 血因子の量は、その因子が投与される個体の細胞のディファレンシャルを監視す ることによって当業者が決定できる。典型的には、Ｇ―ＣＳＦおよびＧＭ―ＣＳ Ｆのような因子の投与量は、細胞毒性薬剤での治療から回復する個体の治療に使 う投与量に類似したものである。好ましくは、組織源の取り出しの前に標準投与 量で４ないし７日間投与して、樹枝状細胞前駆体の比率を増加させる（論説、Ｌ ａｎｃｅｔ 、３３９：３月１４日、１９９２、６４８〜６４９）。例えば、我々 は１日あたり３００マイクログラムのＧ―ＣＳＦの投与を５ないし１３日間、４ ００マイクログラムのＧＭ―ＣＳＦの投与を４ないし１９日間行うと、相当量の 樹枝状細胞が得られる結果になることを確認した。 胎仔血または請帯血は成長因子に富むが、前駆体樹枝状細胞を得るための血液 の好ましい源泉でもある。 本発明の方法によれは、他の細胞の種類に対して樹枝状前駆体細胞の比率を増 すように培養する前に、組織源を処理することができる。そのような前処理はま た、樹枝状前駆体細胞の増殖と競合するか、またはその増殖または生存を抑制す る細胞を除去できる。前処理は、インビトロの培養により適する組織源を作るの にも使用できる。処理の方法は、多分個々の組織源によって組織特異的である。 例えは、組織源として使用された場合、脾臓または骨髄は先ず単一細胞を得るよ うに処理され、つぎに適当な細胞分離方法で他の種類の細胞から白血球を分離す る。血液の処理は、毒性である赤血球（ＲＢＣ）を含む他の細胞から白血球を分 離する細胞分離技術を含む。ＲＢＣの除去は、当業者に公知の標準的な方法で達 成できる。さらに、ＲＢＣを結合する抗―赤めモノクローナルＶＩＥ―６４抗体 のような抗毒素も、パンニング法を使用する除去のための基体へのＲＢＣの結合 を促進するのに使用できる。 本発明の好ましい方法によれば、骨髄を組織源として使用するとき、Ｂ細胞は ＧＭ―ＣＳＦ中で骨髄を培養する前に除去される。Ｂ細胞およびプレＢ細胞はＧ Ｍ―ＣＳＦに応答して成長はしないけれども、それらは最初の髄の懸濁物の約５ ０％を表し、それによって樹枝状細胞を迅速に数え上げるための抗―Ｉａモノク ローナル抗体による染色の利用を妨げる。さらに、顆粒球はＧＭ―ＣＳＦ応答性 であり、ＧＭ―ＣＳＦの存在で容易に増殖する。そのようにして、Ｂ細胞および 顆粒球は樹枝状細胞前駆体の存在を隠蔽する。Ｂ細胞は、マクロファージおよび 顆粒球と樹枝状細胞を区別するのに有用なマーカーであるＭ３４２および２Ａ１ 顆粒抗原を表現できる。さらに、顆粒球は培養物を過剰成長させ、役に立つＧＭ ―ＣＳＦと競合する傾向がある。本発明の最も好ましい方法は、培養中の最初の ２〜４日の間に静かに洗浄することによって、骨髄培養物から非付着性の新しく 生成した顆粒球を除去することである。 好ましくは、前駆体の増殖に競合し隠蔽する細胞の前処理の一つの形として、 樹枝状細胞を殺す。そのような前処理は、補体を含む培地中の樹枝状前駆体細胞 上に存在せず抗原に特異的な抗体に骨髄を接触させることによって、樹枝状前駆 体細胞上で表現されない抗原を表現する細胞を殺すことから成る。本発明での使 用に適した好ましくない細胞の除去のための別の形の前処理は、好ましく内細胞 上に表現される抗原に特異的な抗体を使用して、固体の支持体上にその好ましく ない前駆体細胞またはその前駆体を吸着させることである。種々の種類の固体支 持体に細胞を吸着させるいくつかの方法が当業者に公知であり、本発明への使用 に適している。例えば、ペトリ皿のようなプラスチックの表面を使って「パニン グ」することで好ましくない細胞を除去できる。別の適切な方法としては、磁気 ヘッドの上に細胞を吸着させて磁力で分離させるか、または免疫ビーズの上に吸 着させて重力で分離させる方法がある。樹枝状細胞前駆体の増加した量を含む非 吸着細胞をつぎに、パニングを含む公知の方法で固体支持体から分離することが できる。これらの前処理工程は二つの目的がある：培養物中の非樹枝状細胞の前 駆体を破壊または復活させることと、培養物中でＧＭ―ＣＳＦと競合する樹枝状 細胞前駆体の比率を増加させることである。 さらに、Ｉａ―陽性の細胞、すなわちＢ細胞およびマクロファージは、好まし くは抗―Ｉａ抗体、好ましくはモノクローナル抗体、と補体の混合物の存在で細 胞を培養することによって殺す。骨髄中にも存在する成熟樹枝状細胞は、骨髄か らの細胞が抗―Ｉａ抗体の存在で培養された場合にも殺されるが、これらの成熟 樹枝状細胞は血液および骨髄中に、これらの成熟樹技状細胞の致死が樹枝状細胞 前駆体の増殖および産出を有意に行わないほど少ない量で存在し、かつそれほど 樹枝状細胞前駆体と違った抗原性マーカーを所有している。骨髄中にやはり存在 し得るＴおよびＢ細胞ならびに単球は、ＴおよびＢ細胞抗原および単球に対し指 向された抗体を包含させることによって殺すことができる。そのような抗原は、 ＣＤ３、ＣＤ４、Ｂ細胞抗原Ｂ２２０、ｔｈｙ―１、ＣＤ８および単球抗原を含 むが、それらに限定されない。骨髄からの残存生細胞はつぎに役５００〜１００ ０Ｕ／ｍｌのＧＭ―ＣＳＦを追加した培地中で培養し、下記のように培養する。 ＣＤ４およびＣＤ８は若い樹枝状細胞前駆体上に存在し得るので、これらの抗原 に指向された抗体は樹技状細胞前駆体の集団を壊滅させ得る。 血液を組織源として使用する場合、血液の白血球はその生存率を保つ従来法を 使って取得することができる。本発明の好ましい方法によれば、ヘパリン（約１ ００Ｕ／ｍｌ）または他の抗凝集剤を含む培地（好ましくはＲＰＭＩ）で血液を 希釈する。培地に対する血液の容積比は約１対１である。細胞はペレット化し、 ４℃で約１０００ｒｐｍ（１５０ｇ）で培地中で血液を遠心分離することによっ て洗浄する。血小板および赤血球は、培地および塩化アンモニウムの混合物に細 胞ペレットを懸濁させることによって壊滅させる。塩化アンモニウム（最終濃度 ０．８３９パーセント）に対する培地の混合比は、容積で約１：１が好ましい。 細胞は遠心分離でペレット化し、培地―塩化アンモニウム混合物中でもう２回、 または血小板および赤血球を実質的に含まない白血球の集団が得られるまで、洗 浄する。 通常組織培養に使用されるどんな等張液も、血小板および赤血球から血液の白 血球を分離するための培地として使用できる。そのような等張液の例は、燐酸で 緩衝された食塩液、ハンクス平衡塩類溶液、または例えばＲＰＭＩ１６４０を含 む完全増殖培地である。ＲＰＭＩ１６０が好ましい。 組織源の処理によって得られた細胞を培養して、ＧＭ―ＣＳＦまたはＧＭ―Ｃ ＳＦに典型的な生物学的活性を保持するアミノ酸配列を持ったＧＭ―ＣＳＦ誘導 体の蛋白質またはペプチドを追加した培養培地中の適切な基体上に一次培養物を 生成する。適切な基体は細胞が付着するどんな組織培養適合性の表面でもよい。 好ましくは、基体は組織培養に使用されるように処理した市販のプラスチックで ある。例としては、種々のフラスコ、ローラーボトル、ペトリ皿および組織培養 用につくられたマルチウエル・プレートがある。例えばコラーゲンまたはポリ― Ｌ―リジンのような物質、または細胞付着を促進する特定の細胞の種類に特異的 な抗体で処理された表面も、それが下記のように細胞の示差的付着を許すならば 使用することができる。細胞は好ましくは約７．５×１０⁵個／ｃｍ²の細胞の初 期細胞密度でプレートする。この分量では表面は完全には細胞で覆われないが、 大きい空白部（２〜３細胞径）はない。 非樹枝状細胞前駆体の比率を低下させるように処理された骨髄を培養する場合 は、増殖する樹枝状細胞前駆体から成る凝集物が生成する。樹枝状細胞前駆体か ら成るＩａ―陰性の髄非リンパ球は好ましくは約１０⁶個／ウエル（５×１０⁵個 細胞／ｃｍ²）という高い個数で培養される。樹枝状細胞前駆体の培養以外の目 的で作られる液状の髄培養物は典型的にはこの分量の１／１０で接種するが、生 育中の樹枝状細胞の集団を同定し単離するのは困難である。 本発明の各段階における細胞の増殖培地は、前駆体樹枝状細胞の生存および増 殖を許すものであるべきである。細胞培養に典型的に使用される増殖培地は、Ｇ Ｎ―ＣＳＦを追加した培地であればどんなものでも本発明の方法に従って使用で きる。好ましい培地には、樹枝状前駆体細胞の増殖を促進するために血清おあた は一定のホルモンの組み合わせの適当量を追加したアミノ酸およびビタミンを添 加したＲＰＤＩ、ＤＭＥＭおよびα―ＭＥＭがある。ホルモンを追加した無血清 培地も樹枝状細胞前駆体の培養に適する。５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および ＧＭ―ＣＳＦを追加したＲＰＭＩ１６４０が好ましい。細胞は、他の血清中で血 清の他の濃度において増殖するように選定され採用されてもよい。ヒトの組織か らの細胞も、ＦＣＳでなくヒトの血清を追加した培地で培養してもよい。培地は 培養物のバクテリア感染を最少にするために抗生物質を含んでもよい。ペニシリ ン、ストレプトマイシンまたはゲンタマイシンまたはそれらを含む組み合わせが 好ましい。細胞が培養される培地、または培地の一部は、ＧＭ―ＣＳＦを含む新 鮮な栄養物を与えるために、定期的に補給されねばならない。 驚くべきことに、ＧＭ―ＣＳＦは前駆体樹枝状細胞のインビトロの増殖を促進 することがわかった。細胞は、樹枝状細胞前駆体の生存と増殖を促進するのに充 分な濃度のＧＭ―ＣＳＦの存在で培養する。その分量は、ＧＭ―ＣＳＦに対する 他の細胞（特にマクロファージおよび顆粒球）からの競合の量または細胞集団中 のＧＭ―ＣＳＦの不活性化剤の存在に左右される。好ましくは、細胞は約１ない し１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ―ＣＳＦの存在で培養する。もっと好ましくは、血液 からの細胞は約３０ないし１００Ｕ／ｍｌの濃度のＧＭ―ＣＳＦの存在で培養さ れる。この分量はマウスの血液から得た細胞による最大の応答に必要にして充分 であることが分かった。最も好ましくは、細胞は約３０Ｕ／ｍｌの濃度のＧＭ― ＣＳＦの存在で培養する。約４００〜８００Ｕ／ｍｌの濃度のＧＭ―ＣＳＦは血 液からの増殖中のヒトの樹枝状細胞を培養するのに最適であることが分かった。 利用できるＧＭ―ＣＳＦと競合する多数の増殖中の顆粒球の存在のために、骨髄 からの細胞は高濃度のＧＭ―ＣＳＦを必要とし、そのため髄から得られる細胞の 培養には約５００〜１０００Ｕ／ｍｌの分量が好ましい。 マウスの骨髄の懸濁物をＧＭ―ＣＳＦの存在で培養する場合は、三種の骨髄細 胞の数が増加する。（１）好中球が優勢であるが培養物の表面には付着しない。 好中球は独特の核構造を有し、ＲＢ―６抗原を表現し、ＭＨＣクラスII生成物を 欠く。（２）マクロファージは培養容器に強固に付着し、かなりの水準のＦ４／ ８０抗原を表現し、大部分はほとんどまたは全くＭＨＣクラスIIを表現しない〔 ただし、下記参照〕。 マウスまたヒトの血液の白血球を３０Ｕ／ｍｌまたは４００〜８００Ｕ／ｍｌ で、それぞれ培養する場合は、培養物は多数の凝集物または細胞球を発生し、こ れから典型的な樹枝状細胞が最後に放出される。ＧＭ、ＣＳＦが存在しない場合 は、コロニーは生育しない。特性的に大きい板状の突起または膜を伸ばす樹技状 細胞を最初に検出するのに細胞学的基準を使用してもよい（２５〜２７）。 ＧＭ―ＣＳＦは、天然の源泉から単離、組換えＤＮＡ技術で製造または化学合 成で調製できる。ここで使用されるＧＭ―ＣＳＦはいろんな方法でいろんな種か ら製造されるＧＭ―ＣＳＦを含む。「ＧＭ―ＣＳＦ」は、ここでは天然に存在す る（天然の）ＧＭ―ＣＳＦのすべての生物活性なアナログ、フラグメントまたは 誘導体として定義される。そのようなフラグメントまたは誘導体の形のＧＭ―Ｃ ＳＦは、樹枝状細胞前駆体の培養物中での増殖も促進しなければならない。さら に、生物学的活性を持つＧＭ―ＣＳＦペプチドは、適当な細胞の種類にＧＭ―Ｃ ＳＦレセプターを結合させる能力によって同定される。 さらに樹枝状細胞の収量を増加させるためには、ＧＭ―ＣＳＦのほかに培養培 地にさらにサイトカインを含ませるのが望ましい。そのようなサイトカインには 顆粒球コロニー―刺激因子（Ｇ―ＣＳＦ）、単球―マクロファージコロニー―刺 激因子（Ｍ―ＣＳＦ）、インターロイキン１αおよび１β、３および６（それぞ れＩＬ―１α、ＩＬ―１β、ＩＬ―３およびＩＬ―６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮ Ｆα）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）がある。サイトカインは、樹枝状細胞前駆 体の増殖または生存をよくすることによって培養物中に存在する樹枝状細胞の比 率を増加するのに有効な量で使用される。サイトカインは下記の濃度で存在する のが好ましい：IＬ―１αおよびβ、１ないし１００ＬＡＦ単位／ｍｌ；ＴＮＦ −α、５〜５００Ｕ／ｍｌ；ＩＬ―３、２５〜５００Ｕ／ｍｌ；Ｍ―ＣＳＦ、１ ００〜１０００Ｕ／ｍｌ；Ｇ―ＣＳＦ、２５〜３００Ｕ／ｍｌ；ＳＣＦ、１０〜 １００ｎｇ／ｍｌ；およびＩＬ−６、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ。サイトカインの さらに好ましい濃度は：ＩＬ―１α、５０ＬＡＦ単位／ｍｌ；ＴＮＦ−α、５０ Ｕ／ｍｌ、ＩＬ―３、１００Ｕ／ｍｌ；Ｍ―ＣＳＦ、３００Ｕ／ｍｌ；およびＧ −ＣＳＦ、１００Ｕ／ｍｌである。好ましいサイトカインは、ヒトの蛋白質であ る。最も好ましいサイトカインは、組換え技術（ｒｈｕ）を使ってヒトの遺伝子 から製造される。約１０〜５０Ｕ／ｍｌからの濃度の（ＴＮＦα）が、樹枝状細 胞の収量を数倍に増加させるのに使用できる。 組織源からの一次培養物は、湿度およびｐＨの標準組織培養条件で約３７℃で 非付着生の細胞の分離を許すのに充分な程度に、基体に細胞の集団が付着するま で培養される。血液中の樹技状細胞前駆体は、単球と違って最初はプラスチック に付着性がないので、前駆体は一夜の培養のあと分離できる。単球および線維芽 細胞は、付着性細胞の大部分をなすと考えられ、普通約６時間ないし約２時間以 内に基体に付着する。好ましくは、非付着性の細胞は約８ないし１６時間の間に 付着性の細胞から分離される。最も好ましくは、非付着性の細胞は約１２時間で 分離される。付着性の細胞のかなりの量を除去しないどんな方法でも、非付着性 の細胞からの付着性細胞の分離に使用できる。好ましくは、細胞は簡単な振盪ま たはピペッティングによって除去される。ピペッティングが最も好ましい。 この一次培養物からのヒトの血液から前駆体細胞を培養するために、樹枝状細 胞前駆体ではない細胞を排除した細胞を、好ましくは約５×１０⁵個細胞／ｃｍ² の密度で基体上で培養する。毎日フィードして５日後に、細胞の凝集物（「ボー ル」ともいう）が現れる。これらの凝集物は次に下記のように処理してもよい。 一次培養物からの非付着性の細胞は、細胞の生存を許し培養物表面または表面 上の強固に付着した細胞に緩く付着した増殖中の細胞のクラスターの時間的な増 殖をもたらすのに充分な密度でそれを新しい培養フラスコに移すことによって継 代培養する。これらのクラスターは、増殖する樹枝状細胞前駆体の病巣である。 ここで使用される「培養フラスコ」という用語は、細胞の培養に適した容器をい う。一次培養物からのすべての非付着性細胞は、約２×１０⁵個／ｃｍ²ないし約 ５×１０⁵個／ｃｍ²の細胞の密度で継代培養するのが望ましい。約２．５×１０⁵ 個／ｃｍ²が好ましい。細胞は、培養皿の表面が非付着性の細胞の凝集物の固定 されたマクロファージおよび線維芽細胞を含む強固に付着した細胞の単分子層で 覆われるのに充分な時間、培養する。この時点で、すべての非付着性細胞はウエ ルから除去され、細胞凝集物は継代培養から解除される。好ましくは、凝集物か らの細胞は約１０日後またはｃｍ²当たりの凝集細胞の数が約３ないし４×１０⁵ 個に達したときに継代培養される。 凝集細胞を連続的に継代培養するには、凝集細胞を付着性細胞から除去し、凝 集細胞を、好ましくは親培養物の表面積の約２ないし５倍の全表面上で継代培養 する。より好ましくは、細胞を親培養物の表面積の約３倍の表面積上で継代培養 する。樹枝状細胞に典型的な板状の突起を持つ細胞は、約４〜７日目に培養物中 に現れる。培養の約４日目ないし７日目の間に、一定の表面積から回収できる単 細胞の数は２倍になる。樹枝状細胞前駆体も成熟樹枝状細胞も凝集物中に存在す る。 骨髄から樹枝状細胞を製造するには、好ましくは増殖中の成熟度の低い樹枝状 細胞の特有の凝集物を培養の約４〜６日目より後にストローマから分離する。多 数の樹枝状細胞が放出され、成熟樹枝状細胞の基本的な特徴を表すのはこの放出 された集団である。骨髄は最初血液よりも高い比率の樹枝状細胞前駆体を含むの で、骨髄から得られた細胞の約４〜６日間の培養だけで、血液から得られる細胞 の約１０〜２５日間の培養で得られるのとほぼ同数の細胞を達成する。 樹枝状細胞の血液から誘導した集団をさらに増やすには、樹枝状細胞前駆体の 連続的な増殖を与える間隔で数回連続的に細胞凝集物を継代培養する。好ましく は凝集物は、樹枝状細胞の形態を持つ細胞の大部分を培地中に放出する前に、例 えば約３ないし３０日間継代培養する。より好ましくは、細胞凝集物は約１０な いし２５日間、最も好ましくは２０日間継代培養する。細胞を連続的に継代培養 する回数は、必要な細胞数、細胞の生存率、および樹枝状細胞を放出する細胞凝 集物を製造し続ける培養物の能力に左右される。好ましくは、細胞は約１ないし ２ケ月の間、連続的に継代培養でき、そのあと約１回ないし５回日付着性の細胞 が継代培養される。より好ましくは、２回ないし３回細胞を連続的に継代培養す る。最も好ましくは、細胞を２回継代培養する。 好ましい方法によれば、一次およびその後の培養物の細胞を連続的に継代培養 するには、増殖中の樹枝状細胞ならびに増殖中のマクロファージおよび線維芽細 胞の単分子層中の若干の細胞の凝集物の大部分をピペッティングすることによっ て細胞を除去する。ピペッティングは通常、凝集物、特に成熟度の高い凝集物の 周辺細胞を引き離す。培養期間中、例えば２週目に増殖中の樹枝状細胞の凝集物 はより安定になり、１ｇの沈降による分離のために凝集物を除去することが可能 である。 増殖中の培養物から成熟樹枝状細胞を単離するには別の方法が使える。一つは 非付着性の細胞を除去し、１ｇの沈降によって基体に付着した細胞および単細胞 から凝集物を分離するものである。つぎに、さらに１〜２日間の培養で凝集物か ら多数の樹枝状細胞を放出させ、一方文献記載の密なメトリザミド上での浮遊に よって他の単細胞から成熟樹枝状細胞を分離できる（Ｆｒｅｕｄｅｎｔａｌおよ びＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７ ６９８〜７７０２、１９９０）。もう一つの方法は、より簡単であるが本質的に 過程の増殖段階を終了させるものであって、凝集物が非常に大きい場合すべての 非付着性細胞を捕集し、細胞を約２０分間氷上に置き、ピペットで激しく再懸濁 させて凝集物を解凝集し、メトリザミドカラム上に成熟樹枝状細胞を浮遊させる ものである。 典型的には、５個の１６ｍｍのウエルの内容物を、１５ｍｌの円錐管内の５０ ％ＦＣＳ―ＲＰＭＩ１６４０の６ｍｌのカラムに供給する（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、 ６２．５５３．００２ＰＳ）。少なくとも２０分後、加えた培地およびカラムの 上部１ｍｌを除く。ＲＰＭＩを加え、凝集物を４°で５分間１０００ｒｐｍでペ レット化し、細胞を継代培養のために新しい培地に静かに懸濁させる。 培養物中に存在する細胞を同定するのには種々の方法が使える。この方法には 形態の解析、モノクローナル抗体による細胞の種類に特異的な光源の検出、トリ チウム標識チミジンオートラジオグラフィーを使用する増殖中の細胞の同定、混 合白血球反応の分析および樹枝状細胞ホーミングの表示がある。 樹枝状細胞は、その星形の形状で検出されるほか、モノクローナル抗体を使用 する特定の抗原の表現を検出することによっても同定できる。 一団のモノクローナル抗体が、ＧＭ―ＣＳＦで増大した培養物中の細胞を同定 し特徴づけるのに使用できる。このモノクローナル抗体は別の文献に概論されて いる（２３，２４参考として添付）。 成熟樹枝状細胞の同定に適した特定のモノクローナル抗体は：１）ＭＨＣクラ スＩ抗原に結合するもの（Ｍ１／４２抗―ＭＨＣクラスＩ〔ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ１ ２６〕）；２）ＭＨＣクラスII抗原に結合するもの（Ｂ２１−２抗―ＭＨＣクラ スII〔ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ２２９〕；Ｍ５／１１４抗―ＭＨＣクラスII〔ＡＴＣＣ ＃ＴＩＢ１２０〕）；３）熱安定性抗原に結合するもの（Ｍ１／６９抗―熱安定 性抗原〔ＨＳＡ、ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ１２５〕）；４）３３Ｄ１抗―樹枝状細胞抗 体〔ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ２２７〕；５）絡合細胞抗原に結合するもの（ＮＬＤＣ１ ４５抗―絡合細胞（１３）；および６）成熟樹技状細胞の核周部分の顆粒中の抗 原の結合するもの（モノクローナル抗体２Ａ１およびＭ３４２、（２３）Ａｇｇ ｅｒら）。本発明の樹枝状細胞で表現され、成熟樹枝状細胞の検出に使用できる 他の抗原は、ＣＤ４４（モノクローナル抗体２Ｄ２Ｃで同定）およびＣＤ１１ｂ （モノクローナル抗体Ｍ１／７０で同定）である。Ｍ１／６９、Ｍ１／７０、Ｍ １／４２モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体、ＮＹ、Ｐｌｅｎｕｍ１９ ８０、Ｒ．Ｋｅｎｎｅｔｔら編、１８５〜２１７頁に記載され、これは参考とし て添付してある。当業者は、成熟樹枝状細胞の同定に適した他の抗体も調製し特 徴づけ得ることを認めるであろう。同様に、樹枝状前駆体細胞の製造は、樹枝状 前駆体細胞に特異的な抗体の製造も促進する。 増殖中の細胞および後代を同定し表現するためには、培養物をトリチウム標識 チミジンで標識して有糸分裂のＳ期に細胞を同定することができる。有糸分裂標 識で細胞を標識するのに加えて、細胞は、成熟樹枝状細胞を伴ったマーカーが表 現される場合に、モノクローナル抗体で共標識することもできる。樹枝状細胞前 駆体の特有の表現型は安定であり、そのため例えばマクロファージコロニー刺激 因子（Ｍ―ＣＳＦ）中に保持された場合にでも、樹枝状細胞の後代はマクロファ ージにならない。 樹枝状細胞の成熟度のもう一つの指標は、混合白血球反応（ＭＬＲ）中のＴ細 胞の増殖を刺激する成熟樹枝状細胞の能力である。リンパ節に移行する樹枝状細 胞の能力、すなわち樹枝状細胞のホーミングは、樹枝状細胞の成熟度のもう一つ の指標であり、培養物中の細胞の成熟度を評価するのに使用できる。 本発明により樹枝状前駆体細胞を同定するのに明白になった基準は、他の器官 内での樹枝状細胞の増殖中のプロジェニターの同定を可能にする。増殖中の前駆 体が脾臓（１５）および求心性リンパ液（１６）中の樹枝状細胞の集団の急激な 移動を生じさせることは公知である。〔Ｔ細胞以外の〕白血球の増殖が骨髄内で 起こるが、樹技状細胞にとっては、髄が血液および他の組織をプロジェニターで シードし、それがつぎにここに示すように強力に増殖する。本発明の方法によっ てさもなくば痕跡の樹枝状細胞を多数調製できるこよによって、樹枝状細胞の機 能の以前は未検討であった他の領域がいまや解決できる。特に、増殖中の樹枝状 細胞は、免疫源的形態に抗原を捕獲し保持し、インビボでの免疫性の発生のため のアジュバントとして働く能力を含めて、これらのＡＰＣの作用の機構II関する 分子的および臨床的研究を促進するであろう。 複雑な微生物および細胞の抗原へのＴ細胞の応答をその場で修飾するための構 成蛋白質およびペプチドの使用への関心が増加している。典型的には、明礬のよ うな人工のアジュバントが最大の免疫源的効果を得るのに必要である。樹枝状細 胞とともに、ただし追加のアジュバントなしに投与した場合、免疫源性であるこ とが公知のいくつかの抗原がある（１）。その場での樹枝状細胞の免疫源性は、 例えば接触アレルゲン（４５）、移植抗原（４６〜４９）、およびさらに最近は 外来蛋白質（３１，５０，５１）で示される。他の種類の抗原は微生物、腫瘍お よびウイルスの抗原を含むが、これらに限定されない。感作されたＴ細胞は宿主 ＡＰＣでなく免疫樹枝状細胞の特定のＭＨＣの種で提示される抗原だけを認識す るように限定されるので、樹枝状細胞は直接ＡＰＣとしてその場で作用する（１ ４，３１，５０，５１）。これらの知見は、樹枝状細胞が免疫源性の形でその場 で 蛋白質抗原を捕捉するときに有効であるというデータ（５２〜５４）と組み合 わせて、これらのＡＰＣが「自然界のアジュバント」であると考えることを可能 にする。従って、本発明は臨床および治療の実践において可能性を示すその独特 の抗原を活用するために、充分な量の樹枝状細胞前駆体を提供するのに適した補 法および組成物を開示することによって樹枝状細胞の利用を可能にする。 樹枝状細胞は、複合抗原を処理して自己ＭＨＣ生成物で提示されるそのペプチ ドにすることができる。我々の発明の好ましい実施態様の一つは、増殖中のプロ ジェニターからの生育における初期の段階で樹枝状細胞前駆体が粒子を嵌入させ る樹枝状細胞の使用法である。我々は、骨髄懸濁物のＧＭ―ＣＳＦによる刺激が 増殖する樹枝状細胞前駆体のクラスターの生産をもたらすことを立証した。クラ スター内で³Ｈ―チミジンでの標識をパルスする細胞は、樹枝状細胞の特徴的な マーカー、すなわちＮＬＤＣ―１４５抗原および高水準のＭＨＣクラスIIのよう な星形および抗原的な特徴を欠く。パルス追跡実験では、樹枝状細胞の特徴のす べてを持った³Ｈ―チミジン標識の後代が放出される。我々は凝集物内の細胞も 食菌性であり、類似のパルス追跡プロトコルにおいて後代樹枝状細胞は食菌的な 食事で明瞭に標識されることを見出した。粒子が結核を起こすようなＢＣＧ微生 物である場合、樹枝状細胞を伴うミコバクテリア抗原はインビトロかつその場で 強力にＴ細胞に提示される。 外来および自己抗原は、本発明の樹枝状細胞によって処理されてその免疫源的 形態を保持する。抗原の免疫源的形態は、分断による抗原の処理を含み、Ｔ細胞 によって認識されてそれを刺激することのできる抗原の形態を作る。個お増し は、そのような外来または自己抗原は、樹枝状細胞によってペプチドに処理され る蛋白質である。樹枝状細胞にょって生産される関係のペプチドは免疫源として の使用のため抽出および精製してもよい。 樹枝状細胞で処理されたペプチドは、樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体で処 理された蛋白質に寛容性を導入するための寛容源としても使用できる。好ましく は、寛容源として使用する場合、樹枝状細胞上に存在するＢ７のような補助分子 をブロックすることによってその補助機能を抑制することによって免疫応答を誘 発する能力を低下させるように処理された樹枝状細胞上にその処理されたペプチ ドは存在する。 本発明の抗原で活性化された樹枝状細胞は、本発明の方法で調製された樹枝状 細胞に、インビトロで、抗原を露出させることによって製造される。 樹枝状細胞は培養皿内にプレートされ、樹枝状細胞に抗原を結合させるのに充 分な時間、充分な量の抗原に露出させる。樹枝状細胞に抗原を結合させるのに仏 用な量および時間は、免疫アッセイまたは結合アッセイによって決定できる。当 業者に公知の他の方法も樹枝状細胞上の抗原の存在を検出し、つぎにそれを抗原 に露出させるのに使用できる。 理論に拘束されずに、現在の情報は樹枝状細胞の生育は下記の経路で進むこと を示唆する〔図１１〕。血液および髄の両方の樹枝状細胞前駆体は、ＭＨＣクラ スII抗原ならびにＢおよびＴ細胞および単球マーカー〔Ｂ２２０、ＣＤ３、ｔｈ ｙ―１、ＣＤ４／８〕を欠き、前駆体は非付着性である。前駆体はストローマに 付着し、クラスIIの陽性細胞の凝集物を生じる。多分、成長中の凝集物は遅い時 期にも強固に付着した単分子層中に見出される強くクラスII―陽性の細胞のサブ セットから発生する。しかし、これらの強固に付着したクラスIIに富む細胞は樹 枝状細胞のＭＬＲ刺激活性を欠き、かなりの水準のＦｃγレセプターおよびＦ４ ／８０抗原を表現できる。生育の最終段階は、緩やかに付着した凝集物が成熟し た非増殖性の樹枝状細胞を放出するときである。後者は高水準のＭＨＣクラスII 〔図２〜３〕を持ち、脾臓から放出された多くの樹枝状細胞と全く同様にプラス チックに一時的に付着できる（２５）。生育は凝集物内で起こるので、Ｆｃγレ セプターおよびＦ４／８０抗原のための細胞質染色の水準の低下、および樹枝状 細胞に特徴的な顆粒〔Ｍ３４２、２Ａ１〕および表面抗原〔３３Ｄ１、ＮＬＤＣ １４５〕の増加があるようである。最後に、一次Ｔ―依存性免疫応答のための補 助機能は、生育中の凝集物から細胞が放出されるに従って増加する。 成熟樹枝状細胞は、Ｔ細胞を種々の抗原に感作するのに有効であるが、食菌活 性をほとんどまたは全く示さない。エンドサイトーシスが抗原の処理および提示 に要求される程度において、どのように樹枝状細胞が粒子に付随するペプチドを 提示するかは前もって明白ではなかった。我々の研究によれば、本発明の提供す る樹枝状細胞に対するプロジェニターは、処理および提示のためのそのような粒 子を嵌入できることが今や明白である。食菌によって嵌入できる粒子の種類は、 バクテリア、ウイルス、ミコバクテリアまたは疾病を起こし得る他の感染剤を含 む。従って、本発明の樹枝状細胞前駆体によって嵌入され処理されるすべての抗 原性粒子は、本発明の一部として記載されている種々の免疫源、寛容源およびワ クチンの製造にも適する。樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体による抗原の処理 はつぎに提示されるフラグメントへの抗原の分断を含む。 樹枝状細胞前駆体による粒状物の食菌は、細胞が抗原を食菌、処理および提示 するのに充分な時間、粒状物の存在で樹枝状細胞前駆体を培養することによって 達成できる。好ましくは、粒子の存在における細胞の培養は、１ないし４８時間 行わねばならない。もっと好ましくは、粒状物の存在での細胞の培養は約２０時 間である。当業者は細胞が粒子を食菌するのに必要な時間が細胞の種類と食菌さ れる粒子の性質に左右されることを認めるであろう。そのような食菌の程度を監 視する方法は、当業者に公知である。 細胞は、細胞表面に抗原が嵌入され提示されるのに充分な時間抗原に露出され るべきである。細胞が処理された抗原を嵌入し提示するのに必要な時間は、抗原 への露出についで洗浄時期があるパルス―追跡のプロトコールを使って決定され る。一度細胞がその表面で処理された抗原を表現するのに必要な最短時間が決定 されると、パルス―追跡プロトコールは免疫応答を誘発するために細胞と抗原を 調製するのに使用できる。 食菌性の樹枝状前駆体細胞は、樹枝状前駆体細胞から成る細胞培養物をＧＭ― ＣＳＦで刺激して、増殖中の樹技状細胞の凝集物を誘導することによって得られ る。これらの樹枝状前駆体細胞は上記の樹技状細胞前駆体を含むどの源泉組織か らも得ることができる。好ましくは、源泉組織は骨髄または血液培養物である。 これらの凝集物内の細胞は明らかに食菌性である。生育中の培養物が粒子に露出 され、洗浄され、２日間「追跡」されるとき、ＭＨＣクラスIIに富む樹枝状細胞 は実質的に増加し、少なくとも５０％はＢＣＧミコバクテリアまたはラテックス 粒子のような嵌入された粒子を含む。ミコバクテリアを含み、新しく生育した樹 枝状細胞は、微生物のパルスに露出された成熟樹枝状細胞の相当する培養物より も、感作されたＴ細胞に抗原を提示することにおいてもっと強力である。 ＢＣＧを含む樹枝状細胞を無垢なマウスの肉趾または血流に注射した場合、同 様の状況が付随する。微生物を食菌したそれらの樹枝状細胞は、リンパ節および 脾臓を排出することにおいてミコバクテリア抗原に最も強いＴＹ細胞応答を誘発 する。ＧＭ―ＣＳＦで誘発された生育中の樹枝状細胞は、―抗原の取り込みおよ び細胞数の両方を増すことによって―その場での活性免疫へのこれらのＡＰＣの 使用を促進するであろう。樹枝状細胞による抗原の提示によるそのような強い免 疫源性の応答の産出は、この細胞やこの系を固体内の免疫源性応答を産出するの に有用なアジュバントとして特に望ましいものとする。提示された抗原へのその ような免疫源性応答および抗体の生育は、ワクチンによるような進行中の感染の 治療や将来の感染の予防に使用できる。固体内で治療的または予防的な免疫応答 を作るための樹枝状細胞の使用は、例えば結核を起こすＢＣＧミコバクテリアの ような耐薬品性の微生物による感染の治療または予防に特に有用である。 摂取された粒子の免疫源性は、ＢＣＧミコバクテリアによって得られる（図１ ２〜１３）。ＢＣＧワクチンのどの接種物にも、生きた桿菌〔桿菌の約５０％は コロニー生成単位として働く〕、死亡桿菌および多数のミコバクテリア蛋白質が ある。ＢＣＧの食菌プールは樹枝状細胞によってＴ細胞に提示される。これはミ コバクテリア抗原を、樹枝状細胞の生育する血清の一成分であるウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）と比較すれば明白である。すべてのＡＰＣ集団はＢＳＡの提示に おいて類似点があったが、ほとんどのＢＣＧを食菌した樹枝状細胞はミコバクテ リアのための最も有効なＡＰＣであった（図１２および１３、◆）。従って、Ｂ ＣＧ粒子の取り込みは樹枝状細胞前駆体によるミコバクテリアの感作の大部分の 原因となる。 従って、本発明のもう一つの実施態様は、例えばＢＣＧ抗原を含むミコバクテ リア結核バクテリア抗原で樹枝状細胞前駆体をパルスして、耐薬品性の品種を含 む結核用のより良い予防接種および治療用プロトコルの開発へのニ−ドを与える 重要な事柄であるミコバクテリアへの耐性を宿主に導入するものである（７８） 。 実際には、我々の発明によって微生物で生育中の樹枝状細胞を満たすことがで きるパルスおよび追跡プロトコルは、その後に起こる免疫刺激の二つの広い構成 要素を可能にする。この要素はａ）抗原の捕捉と提示、この場合粒子の捕捉は未 熟樹枝状細胞による、およびｂ）追跡器官中の強力アクセサリーまたは免疫刺激 機能の発達である。この状況は、上皮ランゲルハンス細胞による可溶性蛋白質（ ４，６）および粒子（７４）の取扱いに見られるものと類似している。ＡＰＣ機 能のこの二つの広い要素の各々は多くの下位要素を伴う。例えば、未熟樹枝状細 胞はより食菌性であるだけでなく、豊富なＭＨＣクラスII分子および不変の鎖（ ６，７）および多数の酸性エンドサイトーシス的空胞（３６）の活性生合成のよ うな抗原提示に必要な他の特長も示す。 パルス追跡プロトコルを使用する抗原でのＡＰＣチャージの能力は、樹枝状細 胞の際立った特長である。マクロファージおよびＢ細胞についての以前の研究は Ｔ細胞のエピトープが短命であることを示唆していた（７５）。ここと別の報告 （６，１４，７１）に述べる結果は、免疫源性ペプチドが樹枝状細胞上でマウス に注射する前に少なくとも２日間生存することを示す。この存続能力によって樹 枝状細胞が数日間にわたって排出するリンパ系組織中で移動しＴ細胞を感作する ことができるようになる（１４，５０，５１）。 本発明の樹枝状細胞の重要な特長は、クラスＩおよびクラスIIの生成物上に微 生物系その他の抗原を効率的に提示する能力である。ＢＣＧの場合、感作された 細胞の大部分は、多分抗原の負荷がエンドサイトーシス的経路およびＭＨＣクラ スII生成物によって取り扱われるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞である（７６）。インフ ルエンザの場合は、ＣＤ８＋細胞障害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を導入するクラスＩ の経路が細胞質への抗原（感染ウイルス）の適当な送入を要求し、一方純粋にエ ンドサイトーシス的な経路はＣＤ４＋ヘルパーだけへの提示のための非感染性ビ リオンを送入する（７７）。細胞の増殖が適用すべき遺伝子挿入（レトロウイル スベクトルによるような）の種々の方法を可能にするので、生育中の樹枝状細胞 の培養物は、ペプチドでＭＨＣクラスＩ生成物をチャージする機会を提供する。 本発明のこの別の実施態様によれば、増殖中の樹枝状細胞をベクトルとともに 注射でき、これで樹枝状細胞による特定の蛋白質の表現が可能になる。これらの 樹枝状細胞で表現されるウイルス系蛋白質はつぎにＭＨＣクラスＩレセプターの 細胞表面上で処理され、提示される。ウイルス抗原を提示する細胞または処理さ れたウイルス抗原自体はつぎにベクトルでコード付けされる蛋白質への免役源性 応答を作るための免疫源として使用できる。 ベクトルは、免役応答が望まれる蛋白質に遺伝子をコードし表現する特定のＤ ＮＡ配列を含ませるように調製できる。好ましくは、樹枝状細胞を感染させるた めに、レトロウイルスベクトルが使用される。宿主細胞を感染させるためにレト ロウイルスベクトルを使用することは、当業者に公知であり、１９９２年５月１ ４非に公告されたＷＯ９２／０７９４３およびＲｉｃｈａｒｄ Ｃ．Ｍｕｌｌｉ ｇａｎ、「遺伝子伝達および遺伝子療法：原理、展望および見通し」、ＤＮＡレ ベルでのヒトの疾病のエノロジー 、第１２章、Ｊ．ＬｉｎｓｔｅｎおよびＡ．Ｐ ｅｔｅｒｓｏｎ、Ｒｏｖｅｒ Ｐｒｅｓｓ編、１９９１に記載されており、療法 ともここに参照として添付されている。 生育中の樹枝状細胞をＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスII生成物のチャー ジに使用することによって、その場でのＴ細胞修飾のいくつかの望ましい要素が 達成できる。未熟プロジェニトールによる抗原の取込みおよび提示は、個体のＭ ＨＣ生成物に適切なペプチドをＡＰＣが仕立てることを可能にし、特定の刺激性 ＡＰＣの数を増加させる。これらの樹枝状細胞プロジェニター集団の性質は、そ の場での 活性免役および免役療法のための伝播体として細胞を使うことへの要求 の多くに適合する。 本発明は抗原で活性化さた樹枝状細胞で動物またはヒトを治療または免疫する のに使用するのに充分な量の樹枝状細胞を得る方法を初めて提供する。さらに、 樹枝状細胞は、Ｔ細胞依存性の抗原として抗原をもっと有効にする形で抗原を修 飾するのに充分な量で樹枝状細胞を得ることができる。 抗原で活性化した樹枝状細胞を治療剤または免疫源として使用するには、抗原 で活性化した樹枝状細胞を、同系の動物またはヒトに免疫応答を誘発させるどん な方法ででも注射する。好ましくは、源泉組織を得たその同じ動物またはヒトに 樹枝状細胞を注射し戻す。注射部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内または静脈 内でもよい。動物またはヒトに注射し戻した抗原で活性化した樹枝状細胞の津量 のために必要な数は、とりわけ個体の抗原および大きさに依存して変化する。そ の場での 樹枝状細胞の機能の主な特長は、リンパ系組織のＴ―依存領域へ移動ま たはホーミングする能力であり、ここで樹枝状細胞は、循環する不活性のリンパ 球のプールから必要な抗原―反応性Ｔ細胞を選別する最適の位置にあることにな る。 個体内で免疫応答を刺激する好ましい方法によれば、その個体からの組織源は 樹枝状細胞前駆体を提供するために同定される。血液を組織源として使用する場 合は、好ましくは個体を先ずサイトカインで処理して造血を刺激する。樹枝状細 胞前駆体集団の単離および拡大の後、細胞を抗原に接触させる。好ましくは、抗 原との接触はインビトロで行う。細胞がその表面で抗原を処理し提示するのに充 分な時間が経った後、細胞―抗原複合体を、免疫応答を誘発するのに充分な量、 個体にもどす。好ましくは、１×１０⁶ないし１０×１０⁶個の細胞提示抗原を個 体に注射し戻す。 本発明の新規な抗原は、本発明の方法によって調製された樹枝状細胞と、修飾 されるべき物質または他の抗原を結合させることによって調製される。樹枝状細 胞は、知りまたは修飾された抗原によるＴ細胞の刺激を促進する形で抗原を処理 し修飾する。そのような樹枝状細胞で修飾された抗原は、より特異的であり、修 飾されたＴ―依存性の抗原よりも少ない好ましくないエピトープを持っているの で、有利である。樹枝状細胞で修飾された抗原は標準の生化学的方法で精製する ことができる。例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の精製物に抗体を使用し て、ＭＨＣ―抗原性ペプチド複合体を選別し、つぎに処理された必要なペプチド を酸で溶出することが公知である〔Ｒｕｄｅｎｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ３５３： ６２２〜７（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：１２６１〜３９ ９２）、これらは参照としてここに添付している〕。 抗原で活性化された樹枝状細胞および樹枝状細胞で修飾された抗原は、いずれ も抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用できる。活性化された樹枝状細胞ま たは修飾された抗原は、将来の感染を防ぐワクチンとして使用でき、または免疫 系を活性化して進行中の疾病を治療することもできる。活性化された樹枝状細胞 または修飾された抗原は、生理食塩水その他の注射できる液体とともにワクチン または医薬組成物として使うために配合することができる。本発明の修飾された 抗原または抗原で活性化された樹枝状細胞から成るこのワクチンまたは医薬組成 物は、免疫応答を誘発するのに充分な量投与される。好ましくは、約１ないし１ ００マイクログラムの修飾された抗原、または樹枝状細胞に結合された場合その 相当量を１回当たり投与しなければならない。 本発明はまた、自己免疫疾患の治療のための方法および組成物を提供する。そ のような自己免疫疾患には、若年性糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症および アトピー性皮膚炎があるが、これらに限定されない。理論に拘束されることなし に、自己免疫疾患は「自己蛋白質」すなわち個体中に存在または内因する自己抗 原に向けられた免疫応答から来るものであると考えられる。自己免疫応答におい て、これらの「自己蛋白質」はＴ細胞に提示され、Ｔ細胞を「自己反応性」にす る。本発明の方法によれは、樹技状細胞は内因性の抗原によってパルスされて関 係の「自己ペプチド」を作る。関係の自己ペプチドは各個体によって異なる。Ｍ ＨＣが非常に多形性であり、個々のＭＨＣ分子が種々のペプチド画分を結合でき るからである。「自己ペプチド」はつぎに競合のペプチドを設計するか、治療の 必要のために個体の中の自己蛋白質に寛容性を誘発させるのに使用できる。 樹枝状細胞は今やここに同定された方法および原理によって前駆体から生育で き、また樹技状細胞は抗原を修飾してキラーＴ細胞を生産できるので、本発明の 組成物はキラーＴ細胞が耐性を付与するウイルスおよび腫瘍細胞に対するワクチ ンとして特に有用である。 実施例 実施例１ 血液からの樹枝状細胞前駆体を増殖することによるインビトロでの マウス樹枝状細胞の製造 材料 Ａ．マウス：ＢＡＬＢ／Ｃ、ＢＡＬＢ／Ｃ ｘ ＤＢＡ／２ Ｆ１、ＢＡＬＢ／ Ｃｘ Ｃ５７ＢＬ／６ Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６ ｘ ＤＢＡ／２ Ｆ１、及びＣ ５７ＢＬ／６の雄と雌で、生まれて６〜８週間のものを、Ｊａｐａｎ ＳＬＣ Ｉｎｃ〔静岡、日本〕、Ｔｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ〔Ｓａｒａｎａｃ Ｌａｋｅ、ＮＹ〕、及びＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｗｉｇａ〔Ｓｕｌｚｂ ｅｒｇ、ＦＲＧ〕から購入した。ｒＧＭ―ＣＳＦの４つの試料は、樹枝状細胞の 収量が３０〜１００Ｕ／ｍｌであるプラトーになるまでという同様の結果で評価 された。これらの試料は、Ｓ．Ｇｉｌｌｉｓ博士、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ、 シアトル ＷＡ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ〔ｍＧＭ−ＣＳＦを用 いて形質移入されたＣＯＳ細胞からの上澄；３０Ｕ／ｍｌ以上で使用〕；及びＴ ．Ｓｕｄｏ博士〔発現ベクターを用いて形質移入されたＣＨＯ細胞からの上澄； ｐＨＳｍＧＭ−ＣＳＦ（２２）、及びＥ．Ｃｏｌｉ発現材料〕からのものであっ た。 Ｂ．血液調製：血液は、心臓穿刺によって得るか、あるいは頸動脈から得た。こ の血液は、１００Ｕ／ｍｌのヘパリンを有するＲＰＭＩ−１６４０に希釈するか 、あるいは、この中に滴下させた〔約２ｍｌ／マウス〕。血液細胞を４°にて１ ０００ｒｐｍでペレット化し、ＲＰＭＩ １６４０で再懸濁させ、再び沈澱させ た。このペレットを、１匹のマウスあたり１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０中にて懸 濁させ、蒸留水中の１．６６％塩化アンモニウムの等体積と混合し、赤血球と した。室温で２分間後、この懸濁液を４°にて１０００ｒｐｍで回転させた。ま だ赤血球を含有しているこのペレットを、０．５ｍｌのＲＰＭＩ及び０．５ｍｌ のＮＨ₄Ｃｌ中で２分間再び懸濁させ、ＲＰＭＩ中に希釈して、再び沈澱させた 。更に２回洗浄した後、大部分の血小板及び赤血球が除去されて、白血球の集団 が得られた。 Ｃ．ＧＭ−ＣＳＦを用いて補足された血液からの樹枝状細胞の増殖凝集体 一般にＣｘＤ２ Ｆ１マウスからの白血球は、１６ｍｍの組織培地ウエル〔２ ４個のウエル皿、Ｃｏｓｔａｒ、＃２５８２０〕内で、３０Ｕ／ｍｌで、しかも １．５ｘ１０⁶細胞／ウエルのＧＭ−ＣＳＦを用いて補足された培地（ウエルあ たり１ｍｌ）において培養された。この培地は、５％のウシ胎児血清〔ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＡ〕、５０ｕＭの２−ＭＥ、２０ｕ ｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及び組換マウスＧＭ―ＣＳＦを用いて補足されたＲ ＰＭＩ １６４０であった。一晩の培養後、多くの単核細胞が付着し、非付着細 胞を新たな１６ｍｍのウエルに移し替えた。この付着細胞は、樹枝状細胞コロニ ーには発育しなかったが、次の週の間には、この非付着集団は３つの変化を示し た。第１には、リンパ球及び顆粒球のほとんどが死に、洗浄によって除去するこ とができた。第２に、このウエルの表面は、マクロファージ及び線維芽細胞を含 む、しっかりとした付着細胞の単層で覆われるようになった。第３に、この単層 上の散乱部位に付加され、そこに小さな細胞凝集体が発育した。この培養物には 、０．５〜０．７５ｍｌの培地を吸引し、ＧＭ−ＣＳＦを含む等体積の新たな培 地を戻して添加することによって、ＧＭ−ＣＳＦ（３０ｕ／ｍｌ）を６〜７日間 、その後は３日ごとに与えた。この凝集体は、全体で大きく広がり続けた。約１ ０日目には、細胞は、継代培養される準備ができた。残余の疎性細胞はいずれも 、新たな培地及びＧＭ−ＣＳＦの中に凝集体を移転させる前に洗い流すことがで きた。元のウエルについて約０．８〜１百万の移転された細胞は、３つの継代培 養ウエルの中に分割された。 この凝集体のほとんどが、この最初の継代培養の間に分解される一方、残った 付着単層のバルクは、元のウエルに付着した。転位により、この移転された凝集 体における細胞のほとんどは、単一の細胞として、新しい培養ウエルに付着する が、２〜３日間すると再び凝集体が現れた。この凝集体は再び、付着間質細胞に 付加したが、これらの付着細胞は、元の培養における密な単層よりも数が少なか った。次の４〜７日に渡って凝集体がウエルを満たした。これらのコロニーは、 しばしば、元のウエルのものより大きいことがあり、樹枝状細胞を象徴する多く のシート状の突起で覆われていた。この時点では細胞の数を数えることはかなり 困難であった。これは、この凝集体の多くが、しっかりと関連した細胞の核を含 んでいるからであった。しかしながら、ウエルを再度覆うことが可能な数多くの 単一細胞は、１０日と１７日の間の培養で約２倍に広がった。 この培養が過成長をもたらた場合には、樹枝状細胞の形態学を有した細胞のい くつかが放出された。より典型的には、この細胞が、過成長させることはなく、 この凝集体を移転して、約２０日間再び継代培養した。継代培養する前に、この 凝集体は、１ｇ沈澱によってフリーな細胞から精製することができた。このよう な分離は、長期間の培養を用いてより容易に実施されてきており、即ち、そのま まの凝集体を単離することが、３対２対１週間の培養で、より容易であった。付 加的な継代培養によれば、ウエルについて生産された凝集体の数は、次第に減少 した。しかしながら、３Ｈ−ＴｄＲラベリング及びオートラジオグラフ法〔以下 〕により確認されたように、成長細胞のコロニーが１〜２か月間に、継代培養に おいて生成した。引き続いての２〜３週間の継代培養により、典型的な単一の樹 枝状細胞が、ここで培地中に放出された。ビデオ記録を用いた直接観察により、 これらの放出された細胞は、樹枝状細胞の活性運動性を有しており、大きなベー ル又はシート状の突起を連続して伸びたり縮んだりさせる。連続したＧＭ−ＣＳ Ｆの存在下では、フリーな樹枝状細胞、並びに広がったコロニーの両方が観察さ れた。ＧＭ−ＣＳＦが存在しない場合には、フリーな樹枝状細胞しか放出されず 、凝集体は本質的には分離沈降して、培地中に再生成されず、凝集体のコロニー は生成しなかった。継代培養についてのフリーな樹枝状細胞の収量は０．３〜２ ．５ｘ１０⁵の範囲であった。 要するに、１．５ｘ１０⁶細胞という最初の血液単核培養から、その樹枝状細 胞を検出することは困難であったが、我々は、少なくとも３〜１０ｘ１０⁴の放 出された樹技状細胞を用いて３週間で５〜１０の継代培養ごとに平均して得ると 同時に、更に増殖可能な多くの凝集体も得た。それゆえ、成長細胞の凝集体が、 ＧＭ−ＣＳＦを用いて補足されたマウス血液中において生成し、しかも、これら の凝集体が樹枝状細胞によって覆われており、その多くが、培地内で自然に放出 可能であった。 Ｄ．細胞凝集体の表現型及びそこから放出される樹枝状細胞 サイトスピン試料は、３〜１０ｘ１０⁴細胞を用いてＳｈａｎｄｏｎ細胞遠心 分離機内で製造された。このスライドは、アセトン内での固定化及び、ｍＡｂを 用いて染色させる前に乾燥剤と共に貯蔵され、引き続いてパーオキシダーゼマウ ス 抗−ラット Ｉｇ〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ、＃６０５〜５４５〕又は、ラビット 抗−ハムスターＩｇ〔Ａ ｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ、＃ ＪＺＹ−０３６−００３〕を用いた。これらの試料を、ギムザを用いて染色し、 明視野分析のためのパーマウントに取り付けた。細胞フルオログラフィー〔ＦＡ ＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ〕のために、細胞のアリコット を、最初のラット又はハムスターｍＡｂを用いて染色し、引き続いてＦＩＴＣマ ウス 抗−ラット Ｉｇ〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、＃６０５〜５４０〕又はバイ オチン ラビット 抗−ハムスターＩｇ〔Ａｃｃｕｒａｔｅ、ＪＺＹ−０６６− ００３〕及びＦＩＴＣ−アビジンを用いた。 ２〜３週間培養のサイトスピン試料を、ｍＡｂのパネル及び免疫パーオキシダ ーゼ法を用いて試験した。放出された細胞、及びこの凝集体の周囲から移転する ことが可能な細胞の多くは、それらの星状形状及び表現型において類似していた 。これらの細胞のほとんどは、ｍＡｂを用いて強く染色され、ＭＨＣクラスII、 ＣＤ４５白血球の通常の抗原、ＣＲ３レセプターＣＤ１１ｂ、及び熱安定性抗原 （ＨＳＡ）、及びＣＤ４４となった。ｍＡｂｓを用いたＦｃレセプター〔２．４ Ｇ２〕及びマクロファージＦ４／８０抗原（ＭＡＣ）への染色は、９５％以上の 細胞においては弱いか、あるいは検出することができなかった。これらの培養物 は、稀なＢ細胞〔Ｂ２２０ｍＡｂ、ＲＡ−３〕、Ｔ細胞〔ｔｈｙ−１ｍＡｂＮＢ ５−５〕、又は顆粒球〔ＧＲＡＮ、ｍＡｂ ＲＢ−６〕しか含んでいない。この 凝集体の周囲にある細胞のいくつか、及びこの凝集体から放出された細胞の多く が、大きく樹枝状細胞に限定される２つのマーカーを用いて染色された。この指 状突起細胞抗原〔ｍＡｂ ＮＬＤＣ １４５（１３）、ＩＤＣ〕は、胸腺上皮に も結合しているものであって、樹枝状プロファイルの多くを染色したが、その全 てを染色しなかった。実際に、全ての樹枝状プロファイルは、リンパ組織にＴ領 域を通った部分での、成熟した樹枝状細胞、Ｂリンパ球、並びに指状突起細胞の 核周囲領域において、ｍＡｂｓ ２Ａ１及びＭ３４２染色顆粒により染色された 。多くの部位からのマクロファージ〔血液単細胞；腹腔マクロファージ；リンパ 腺、胸腺、牌の部分におけるマクロファージ〕は、２Ａ１又はＭ３４２−反応性 顆粒を含まない。 細胞フルオログラフィーは、細胞表面での抗原の表現についての準定量的な情 報を得るために使用された。ｍＡｂのパネルは、２つの集団に適用された。即ち 、パスツールピペッティングによる凝集体から移転することができた細胞と、こ の凝集体を１日間継代培養された際に自然に放出された細胞である。これらの「 移転された」及び「放出された」集団は、それらの樹枝状形態及び表現型におい て同一であるが、以下に考慮されるいくつかの例外がある。この放出された細胞 の表現型が図２に示されており、しかも、凝集された細胞と放出された細胞の間 におけるいくつかの違いが図３に示されている。実際に、この凝集体中において 及びこの凝集体から生成した樹枝状細胞の全ては、白血球の通常の〔ｃｄ４５、 ｍＡｂ Ｍ１／９．３〕及び熱安定性のある〔ｍＡｂｓ Ｍ１／６９及びＪ１１ ｄ〕抗原の高いレベルを示すと同様に、ＣＤ４４及びＣＤ１１ｂ〔ｍＡｂ Ｍ１ ／７０〕の高しルベルをも示した。以下の抗原の低いレベルが、細胞表面上で検 出された。樹枝状細胞抗原３３Ｄ１、マクロファージマーカーＦ４／８０、Ｆｃ γレセプター抗原２．４Ｇ２、ｐ５５ ＩＬ−２レセプターＣＤ２５抗原３Ｃ７ 、及びＣＤ１１ｃインテグリンＮ４１８〔図２〕。これらの抗原は、Ｆ４／８０ 及び２．４Ｇ２のような抗原の多くが、免疫パーオキシダーゼ法を用いることに より弱いか、あるいは細胞質内に存在していなくても、ＦＡＣＳによって全ての 細胞について示された。いくつかの抗原は存在していなかった。ＲＢ６顆粒球、 ＲＡ３ Ｂ細胞、Ｂ５−５ ｔｈｙ−１、ＧＫ １．５ ＣＤ４、及びＳＥＲ− ４ 周縁ゾーンマクロファージ〔図２〕。 これらの培養における樹枝状細胞によるクラスＩ及びＩＩ ＭＨＣ生成物の発 現は非常に高かったが、それにもかかわらず二頂であった〔図２及び図３〕。こ の凝集体から移転された樹枝状細胞のほとんどは、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩのい くらか低いレベルを有している一方、この凝集体から放出された樹枝状細胞は、 非常に高いレベルのＭＨＣ生成物を有していた。放出されて緩く付着した樹枝状 細胞とは違った他のマーカーは、放出された集団においてより高いＮＬＤＣ １ ４５であった〔図３、一番上のパネル〕。我々は、増殖凝集体から生じる細胞の 表現型は、Ｍ１／７０ ＣＤ１１ｂマーカーがより強化されるという例外を除き 、皮膚、脾臓及び胸腺（２４、２８）からの培養された樹枝状細胞において見ら れるものと非常に良く似ていると結論付けている。 Ｅ．樹枝状細胞前駆体の成長を確認するための３Ｈ−ＴｄＲ オートラジオグラ フィー 液体培養で２及び３週間後には、ウエルは、細胞の数多く広がった凝集体を含 んでおり、しかも、いくつかの場合においては、既に非付着樹枝状細胞を多量に 放出していた。培養物は、増殖細胞及びそれらの後代の表現型を同定するために ３Ｈ−チミジンを用いてラベルされた。パルスラベルのために、３Ｈ−ＴｄＲを 培養物に添加した〔６Ｃｉ／ｍＭ、１ｕＣｉ／ｍｌ 最終〕。２時間後、この培 地を３Ｈ−ＴｄＲを含まない培地に置き換え、この培養物を、サイトスピン試料 についての試験〔Ｓｈａｎｄｏｎ Ｉｎｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ、＃５ ９９００１０２〕のために、非付着性放出細胞と残余の付着凝集体に分離した。 このサイトスピン細胞は、前述のようにｍＡｂ及び免疫パーオキシダーゼを用い て特定の抗原に対して染色された。そして、これらのスライドを、発色、ギムザ を用いた染色、及びパーマウントに載せる前に、照射〔５日間〕のためにフォト グラフィック乳化液〔コダック オートラジオグラフィー乳化液タイプ ＮＴＢ ２ ＃１６５−４４３３〕の中に浸漬した。パルス追跡実験においては、細胞成 育性を維持するために低投与量の３Ｈ−ＴｄＲを使用したが、細胞は、他の 点では同様に取り扱った。このパルスは、０．１ｕＣｉ／ｍｌで２時間又は１６ 時間与えられ、後者は、より高い初期ラベリング指数をもらたした。これらの細 胞を洗浄し、収穫する前に１〜３日間追跡し、前述のような、免疫パーオキシダ ーゼ、オートラジオグラフィー、及びギムザ染色を用いて分析した。 ２週間及び３週間の培養物を、３Ｈ−ＴｄＲに曝して、増殖活性を試験した。 このラベルされた細胞を洗浄し、スライド上で回転させ、サイトスピンを、フォ トグラフィック乳化液に浸漬して曝す前にｍＡｂ及び免疫パーオキシダーゼ法を 用いて染色した。重要なマーカーは、ｍＡｂｓ ２Ａ１及びＮＬＤＣ−１４５で あり、これらは、それぞれ、成熟した樹枝状細胞における細胞内顆粒及び細胞表 面抗原であると認められる。 培養物を、３Ｈ−ＴｄＲの２時間パルスでラベルした時、凝集体におけるラベ リング指数は非常に高く、凝集体におけるプロフィールの少なくとも１０〜１５ ％がＳ期にあることが明らかであった。対照的に、典型的な非付着樹枝状細胞を 放出している培養物に３Ｈ−ＴｄＲを与えた場合には、この放出された分画は、 稀なラベルされたプロフィールしか含まなかった。ＧＭ−ＣＳＦを除去した場合 には、３Ｈ−ＴｄＲラベリングは１日のうちに起こった。実際に、凝集体におけ る３Ｈ−ＴｄＲラベルされた細胞の全てが、成熟した樹枝状細胞、即ち、２Ａ１ 及びＮＬＤＣ１４５において見い出されたマーカーに対してｍＡｂを用いてラベ ルされることはできなかった。抗−ＭＨＣクラスII ｍＡｂを用いて染色される レベルは、放出された樹枝状細胞集団においてよりも、Ｓ−期における細胞での 方が少なかった〔図示されていない〕。 その後、凝集体におけるラベルされた細胞が、典型的な樹枝状細胞を生じさせ ていることを確かめるために、パルス追跡実験を行った。培養物をまず、低投与 量の３Ｈ−ＴｄＲに、２時間あるいは１６時間のいずれかで曝したが、後者は、 凝集体における細胞を大きなパーセンテージでラベルするためである。これらの ウエルを、ラジオラベルせずに洗浄し、その後、凝集体を取り除き、1ｇ沈澱に よってフリーな細胞から分離した。この凝集体を、ラジオラベルされていない新 たな培地に移し替え、更に１〜３日間かけて培養すると、多くの樹枝状細胞が培 地中に放出された。この「追跡された」培養物を調べた際、いくつかの発見が明 らかであった。このラベリング指数は高く維持され、即ち、凝集体において増殖 されている細胞の後代のほとんどが、培養物から失われていないものであった。 第２に、粒子数は、元のパルスにおいて明らかであった数から数倍希釈された。 第３に、成熟樹枝状細胞〔ＮＬＤＣ１４５、２Ａ１顆粒抗原、高レベルのＭＨＣ クラスII〕のマーカーを表す細胞は、ここでもラジオラベルされた。従って、Ｇ Ｍ−ＣＳＦが培養されたマウス血液において誘導している細胞凝集体は、活動的 に増殖し、しかも、２Ａ１顆粒抗原、ＮＬＤＣ１４５マーカー、及び高レベルの ＭＨＣクラスIIを含む、成熟した樹枝状細胞についての典型的な細胞学的で抗原 的な特徴を多く有している非増殖後代を放出していた。 Ｆ．Ｔ細胞増殖応答に対する副細胞機能 ＭＬＲ刺激活性を、ＧＭ―ＣＳＦ処理された血液培養物においてモニターした 。血液培養物からの細胞を、１５００ｒａｄｓ〔１３７Ｃｓ〕で曝し、分量を変 えた投与量で、９６の充分な、平底のマイクロテストウエルにおいて、３ｘ１０⁵ の精製された先天性又は他生Ｔ細胞に与えた。このＴ細胞は、ナイロンウール 非付着性の、脾臓及びリンパ腺懸濁液であり、これを、残余のＡＰＣを除去する ために、Ｊ１１ｄ ｍＡｂｓ及び補体を加えた抗−Ｉａを用いて処理した。３Ｈ −ＴｄＲ吸収は、７２〜８６時間で測定した〔６Ｃｉ／ｍＭ、４ｕＣｉ／ｍｌ 最終〕。 最初には、ＭＬＲ刺激活性はほとんどないか、あるいは全くなかった〔図４、 ★〕。幾らかの刺激活性が、１日の培養において確認された〔図４、○〕。サイ トスピン試料の試験から、これらの１日の非付着血液細胞が、Ｉａ−強化樹枝状 プロフィールを少量〔＜０．３％〕でしか含まないが、Ｉａ−強化樹枝状プロフ ィールの明らかな部分集合を含むことがわかった。７日目までに、増殖凝集体が 単層上で最初に明らかであった時、取り出された凝集体の刺激活性は、更に増加 していたが、７日の時点、及び引き続いての時間の点における細胞のほとんどが 、ＭＨＣクラスII陽性であっても、特異活性の点では、典型的な樹枝状細胞より もまだ１００倍少なかった〔図４、△と●の比較〕。典型的な非付着樹枝状細胞 が、凝集体から放出されるのがちょうど開始される時期である１４日までに、こ の 非付着集団は、かなりのＭＬＲ刺激活性を有していた〔図４、▽〕。３週間後、 典型的な成熟した樹枝状細胞が強化され、これらは、実際に脾臓対部分に匹敵す るほどに刺激をもたらした〔図４、◇と●の比較〕。この培養物における他の細 胞、例えばこの凝集体から取り出されたものなどは、樹枝状細胞よりも約１０倍 活性が低かった〔図４、◆〕。我々は、増殖樹枝状細胞の凝集体は、ＭＬＲ刺激 活性を幾らか有しているが、これは、充分に強力で、１〜７日における出発培養 物における集団よりも、細胞基準あたり約１００〜３００倍以上活性であるとこ ろの成熟した放出細胞であると結論付けている。７〜２０日の培養の間に、全体 の細胞数もまた、少なくとも５〜１０倍に大きくなった。 Ｇ．インビボにおける樹枝状細胞のホーミング活性 樹枝状細胞の第２の特異的な特徴は、周辺リンパ組織（８、１０）のＴ領域に 戻ろうとする能力である。樹枝状細胞又は他の細胞種を、カルボキシフルオレス セインを用いて氷で１０分間、２〜１０ｘ１０⁶／ｍｌでラベルし〔Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃ−１１５７；５％のＦＣＳを用いたＨａｎｋｓ平衡 塩溶液（ＨＢＳＳ）において３０ｕＭの最終濃度〕、ＲＰＭＩ １６４０中で洗 浄し、フートパッドの中にＲＰＭＩ−１６４０を５０ｕＭの体積で注入した。１ 日後、ドレーン膝かがみ筋リンパ節を除去し、ＯＣＴ培地内で冷凍し、低温槽内 で分画〔１０μ〕した。全ての結節をサンプリングするために、我々は一定間隔 で重複した試料を採得した。この分画をマルチウエルスライド〔Ｃａｒｌｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅｓ ＃１１１００６〕にプライ ムし、−２０℃で貯蔵し、使用する前にデシケータ３０’内で乾燥させ〔あるい は室温で一昼夜放置し〕、アセトン中で固定させ、パーオキシダーゼ共役ラビッ ト抗−ＦＩＴＣ抗体〔Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、Ｐ４０４〕を用いて染色した。リン パ節における樹枝状細胞が前述のようにＴ−依存領域にある（８）ことを確かめ るために、我々は、適切なｍＡｂをＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ又は樹枝状 細胞に添加し、後者においては、クロモーゲン キット〔Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏ ｒｐ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ＃ｓ０４〕を加えたアルカリ性ホスファタ ーゼ共役マウス抗−ラットＩｇ〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、＃ ６０５−５３５７〕を用いて視覚化した。その後、我々は、”Ｅｎｄｏ Ｂｌｏ ｃｋｅｒ”〔Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒｐ、＃Ｍ６９〕を用い、引き続き前述のパ ーオキシダーゼ抗−ＦＩＴＣにより内因性パーオキシダーゼをブロック化した。 血液白血球は、フートパッドあたり１０⁶細胞の投与量で与えられた場合でも 、リンパ組織に戻ることはなかった。我々が、血液からＧＭ―ＣＳＦと共に生じ てきた樹枝状細胞を試験した際、２００，０００細胞の注入に伴ってＴ領域への 回帰が観察された。Ｔ領域への選択された局在化は、Ｂ細胞又はＴ細胞を染色す るｍＡｂを用いて試料を重複してラベリングすることにより確認された。従って 、培養物において生成した樹枝状細胞は、この直系のキーとなる機能的特徴を有 している。即ち、Ｔ−依存領域への回帰と強力な副活性である。 Ｈ．血液から樹枝状細胞コロニーを発生させるための必要条件 樹枝状細胞コロニーを生じさせる血液細胞の表面表現型は、抗体及び補体を用 いた出発集団を処理することによって評価された。３３Ｄ１抗−樹枝状細胞、抗 −ＭＨＣクラスII、又は抗ｔｈｙ−１のいずれかによる処理では、コロニー生成 ユニットが取り除かれなかった〔図示されていない〕。代わりに、ｔｈｙ−１⁺ 又はＩａ⁺細胞の除去により、コロニー数が数倍に高められた。ＧＭ―ＣＳＦ以 外のＣＳＦ類もまた試験され、１〜３週間の培養を開始してか、あるいは２〜３ 週間たった凝集体を移し替えて隠された細胞を生成した。試験されたＣＳＦ類、 即ちＩＬ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦのいずれも、コロニー又は成熟 した樹枝状細胞の生成を支持しなかった。従って、成長樹枝状コロニーは、ＧＭ −ＣＳＦに非常に依存している。樹枝状細胞系に対する増殖前駆体を同定するた めの努力において、我々は、いくつかの組織から培養物を作り出し、これらの組 織は成熟した樹枝状細胞を欠き、違った成長ファクター、特にＣＳＦ類〔Ｍ―Ｃ ＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ―１、及びＳＣＦ〕を用いて 補足されている。樹枝状細胞前駆体は、新産の表皮からは観察されず、この表皮 は、主にＩａランゲルハンス細胞（２９）を含んでいる。典型的な細胞コロニー 又は多数の樹枝状細胞の同定を困難にすることがある、バルク骨髄培養物におけ る顆粒球の過成長を避けるためには、２日及び４日で日付着性の増殖顆粒球を除 去することか好ましい。マウス中に数種の典型的な樹枝状細胞を含んでいる（３ ０）血液は、樹枝状細胞前駆体を得るのに非常に有用であることが確認された。 成長細胞凝集体は、培養物中に約６日間後に現れ、これらはしばしば、樹枝状細 胞の一般的でなく運動性のある突起を有したプロフィールで覆われていた。時間 と共に、典型的な非付着性樹枝状細胞が放出された。後者は、前述の如く、培養 されたマウス脾臓、マウス皮膚、幾つかの試料からのリンパ、及び人間の血液（ ２５〜２７）における樹枝状細胞の形態学及び運動を有していた。従って、増殖 樹枝状細胞を同定するためには、適切な出発集団、好ましくは血液を用いて開始 し、ＧＭ−ＣＳＦを用いて培養物を補足することが決定的であると思われる。 いかなる理論によっても結び付けられることを望まずに、我々は、培養物にお いて見られた初期の凝集体がクローンを表していたものと考えている。なぜなら ば、４〜６の細胞の非常に小さなグループが初期、即ち５日に観察されたからで ある。我々は、この凝集体が、マーカーを用いて、ＣＤ４４及びＭＨＣクラスII のようなポリモルフィック抗原を区別される系からの血液細胞と混合することに よってクローナルであることを証明することを試みた。しかしながら、我々は、 実験を完了させることができなかった。なぜならば、我々はマウス系が、コロニ ーを成長させる数及び速度の点で違っていることを見い出したからである。ＢＡ ＬＢ／Ｃ及びＤＢＡ〔及びそれらから誘導されたＦ１系〕が最も活性であった。 即ち、Ｂ６及びＢ１０は数倍活性が低かった。しかもＣＢＡ／Ｊ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ 及びＡ／Ｊのような系は、増殖した樹枝状細胞凝集体の低い源泉であった。 増殖樹枝状細胞の凝集体に対する前駆体は、典型的な単球又は樹枝状細胞では なかった。というのは、成長した凝集体の数は、もし一つが付着によって単球を 消耗させたり、あるいは抗体及び補体を用いてＩａ−陽性細胞を消耗させたとし ても、実質的に増加することが可能だからである。理論によって束縛されるとい う期待なしに、我々は、血液が、増殖凝集体を形成するＩａ−陰性前駆体を含有 するということを暫定的に結論付けている。この凝集体においては、樹枝状細胞 が成熟し、しかも非増殖後代として放出される。 樹枝状細胞の凝集体の生成は、外因性のＧＭ−ＣＳＦを必要とした。もし、こ の凝集体がマクロファージ又は顆粒球−限定されたＣＳＦ類〔Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ− ＣＳＦ〕中に置かれると、増殖が引き起こされ、マクロファージも顆粒球もいず れも生成されなかった。なぜならば、この培養物は、樹枝状細胞凝集体の他にマ クロファージや幾つかの間質細胞を含んでおり、他のサイトカインが生成され、 これらが樹枝状細胞の生成に決定的なものである可能性があった。しかしながら 、この凝集体における細胞はＭ−及びＧ−ＣＳＦに対する応答性を失っており、 しかも、樹枝状細胞が成育の明らかな脊髄経路を表しているように思われる。恐 らく、理論によって束縛されるという期待なしに、この経路は、一般的な前駆体 から生成し、この前駆体においては、樹枝状細胞直系が、もはやマクロファージ 及び顆粒球制限されたＣＳＦ類に対して応答することがない派生物である。 パルス及びパルス−追跡プロトコールを用いた３Ｈ−チミジンによるラベリン グは、これらの液体培養物において起こっている前駆体−生成物の関係を確かめ るのに重要であった。２時間のパルスにおいては、実際に、すべてのラベルされ た細胞には、成熟した樹枝状細胞の２つの典型的なマーカー、即ち、ＮＬＤＣ− １４５指状突起のある細胞表面抗原（１３）及び、最近に同定された２Ａ１／Ｍ ３４２顆粒細胞質抗原（３４）が欠けていた。これらのｍＡｂは、我々が単離さ れた細胞〔血液、脾臓、腹膜マクロファージ〕としてか、あるいは分画〔胸腺皮 質、脾臓赤色髄質、リンパ節髄質〕において調査した大部分のマクロファージ集 団を染色しなかった。パルス追跡プロトコルにおいては、多数のラベルされた後 代が凝集体から放出され、しかもこれらの放出された細胞は非付着性で、運動性 があり、ＭＬＲにおいて強力に刺激性であった。オートラジオグラフィー及び免 疫パーオキシダーゼラベリングを組み合わせた後、このラベルされた後代は、顆 粒抗原、ＮＬＤＣ−１４５抗原、及び非常に高いレベルのＭＨＣクラスIIを有し ていた。これらの細胞学的で抗原性マーカーのそれぞれは、樹枝状細胞に大きく 限定される。 理論により束縛されるという期待なしに、我々は、典型的な非増殖樹枝状細胞 に対する成熟は、凝集体の内部で起こっているものと考えている。この凝集体は 、樹枝状細胞のシート状又は覆われた突起を有する細胞により覆われている。成 熟した樹枝状細胞マーカー〔高いＭＨＣクラスII、２Ａ１陽性顆粒、ＮＬＤＣ抗 原〕のマーカーを有する細胞はまた、細胞凝集体の周囲においても観察された。 し かしながら、この凝集体をそのままの状態で、即ち、これらのもっと成熟した細 胞を取り除かずに分離することは困難であった。樹枝状細胞が成熟して、凝集体 が残る際の機構は明らかではなかった。成熟は古い培養物においても〔＞２週間 〕、あるいは付着性の間質細胞を除去することにより高められた。増殖と成熟の 両方は、培養物が非常に多くの線維芽細胞を含有する場合には、妨害された。 増殖凝集体において起こった機能的な成熟は衝突である。培養物において生じ た樹枝状細胞は、強力なＭＬＲ刺激剤であった。１００の樹枝状細胞は、１００ ，０００の血液白血球よりも多くの強力な初期ＭＬＲを誘導した。Ｉａ−陽性細 胞あたりの刺激活性の増加は、凝集体が最初に現れた時と、典型的な樹枝状細胞 が多数放出された時の間の、少なくとも２ ｌｏｇｓであった。この期間に渡り 、細胞回収は５〜１０倍に増加した。又、樹枝状細胞後代は、リンパ節のＴ細胞 領域への正確な方法に回帰し、もう一つの機能的な性質は、血液細胞においては 検出することができなかった〔データは示されていない〕。実施例２ ＧＭ−ＣＳＦを用いて補足されたマウス骨髄培養物からの多数の樹 枝状細胞の生成 材料 Ａ．マウス：雌ＢＡＬＢ／Ｃ、雄ＤＢＡ／２、及び、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス、 生まれて７週間のものを、Ｊａｐａｎ ＳＬＣ〔浜松、静岡、日本〕から購入し た。ＢＡＬＢ／Ｃ ｘ ＤＢＡ／２ Ｆ１、生まれて７〜１０週間で雄雌両方、 をＪａｐａｎ ＳＬＣ及びＴｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓａｒａｎａ ｃ Ｌａｋｅ、ＮＹから購入した。試薬 ：培養培地は、５％ＦＣＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール、及び２ ０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを用いて補足されたＲＰＭＩ−１６４０〔Ｎｉｓ ｓｕｉ、東京、日本；ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ〕であった 。鼠ｒＧＭ−ＣＳＦ〔１０⁸Ｕ／ｍｇ蛋白質〕は、キリンビール株式会社〔前橋 、群馬、日本〕により好意的に提供された。マウス白血球抗原に対するラット及 びハムスターｍＡｂｓのパネルは、別に記載されている（２３、２４）。ＦＩＴ Ｃ−及び、パーオキシダーゼ−共役マウス抗−ラットＩｇＧは、Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇ ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ〔インディアナポリス、ＩＮ〕から購入し、ＦＩＴＣ− 及び、パーオキシダーゼ−共役ヤギ抗−ハムスターＩｇ〔γ及びＬ−鎖〕は、Ｊ ａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ〔Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、 ＰＡ〕及びＣａｌｔａｇ〔サンフランシスコ、ＣＡ〕からそれぞれ購入した。 Ｂ．骨髄培養物：マウスの大腿部及び脛部から、ガーゼを用いて筋肉組織を全て 取り除いた後、この骨を７０％アルコールを含む６０ｍｍの皿に１分間置き、Ｐ ＢＳを用いて２回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０を含む新たな皿の中に移し替えた 。この骨の両方の端部を皿の中で鋏を用いて切断し、その後、シリンジ及び２５ Ｇニードルで、２ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を用いて骨髄を洗い出した。この組 織を懸濁させ、小さな片の骨及び残屑を除去するためにナイロンメッシュを通過 させ、赤色細胞を塩化アンモニウムを用いて溶解させた。洗浄後、リンパ球及び Ｉａ−陽性細胞を３７℃で６０分間、ｍＡｂｓ及びラビット補体の混合物を用い て殺した。このｍＡｂｓは、ＧＫ １．５抗−ＣＤ４、ＨＯ ２．２抗−ＣＤ８ 、Ｂ２１−２抗−Ｉａ、及びＲＡ３−３Ａ１／６．１抗−Ｂ２２０／ＣＤ４５Ｒ であり、これらは全てＡＴＣＣ〔それぞれＴＩＢ ２０７、１５０、２２９及び １４６〕から得られたものであった。７．５ｘ１０⁵細胞を、５００〜１０００ Ｕ／ｍｌ ｒＧＭ−ＣＳＦで補足された培地１ｍｌにおいて、２４のウエルプレ ート〔Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ〕内に入れた。これらの培養物は 、通常は２日ごとに、プレートをゆっくりと動かし、この培地の３／４を吸引し 、ＧＭ−ＣＳＦを含む新たな培地を戻して添加することにより約２〜１０日間与 えられた。このような洗浄の目的は、強固に接着したマクロファージに緩やかに 付着される樹枝状細胞を生成するクラスターを分離することなく、非付着性の顆 粒球を除去するためであった。 成長樹枝状細胞を強化するために、我々は、実施例１のマウス血液細胞培養物 について記載したものと同様の方法を用いた。簡単にいうと、付着された細胞の 凝集体を、パスツールピペットを用いて分離し、５０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６ ４０の６ｍｌカラムに適用した。この培養物における残余の顆粒球は、しばしば 凝集体においてのものと同様であり、この工程で容易に解離された。分離された 細胞の１ｇ沈澱により、クラスターは管の底に移動し、単一の顆粒球が上部に残 った。この凝集体を、ＧＭ−ＣＳＦを含む新たな培地にて、典型的には１６ｍｍ のウエルにて１日間、２〜３ｘ１０⁵／ｍｌで継代培養した。一昼夜の培養を行 った後、多数の典型的な樹枝状細胞が放出された。又、付着性マクロファージも これらの培地内に広がったが、ほとんどは、培養表面にしっかりと付着したまま 残った。 Ｃ．樹技状細胞前駆体及びＩａ−陽性の、骨髄非リンパ球の、細胞学的比較 骨髄の７日培養物における、放出された分画〔樹枝状細胞が豊富である；上部 〕と付着性の分画〔マクロファージが豊富である；底部〕とを比較するために、 Ｉａ−陰性の骨髄非付着細胞をＧＭ−ＣＳＦにおいて培養した。２日及び４日に は、非付着性細胞をゆっくりと洗浄し、６日には緩く付着した細胞凝集体を１ｇ 沈殿により分離した。培養物において１日後、この凝集体から放出された細胞を 、ガラススライド上でサイトスパンし、パーオキシダーゼ抗−Ｉｇを加えた異な るｍＡｂｓ及び、ギムザ及び非特異的エステラーゼを用いて染色した。元の培養 物におけるしっかりと付着した細胞をＥＤＴＡで分離し、再度サイトスパンした 。多くの樹枝状プロフィールが放出された分画〔ハンドレンズは、ギムザ染色に おける細胞の形状及び汚染顆粒球を検出するのに有用である〕内に存在している 一方で、付着細胞は最も部分的に典型的な空胞マクロファージについてのもので ある。強力なＭＨＣクラスII表現は、放出された細胞の全てに起こるが、幾つか の典型的な顆粒球について起こらなかった。しっかりと付着した細胞のサブセッ トしかクラスIIを示さなかった。ほとんどの放出された細胞は、２Ａ１内細胞空 胞抗原を示す一方、付着細胞は２Ａ１弱性かあるいは陰性である。 Ｄ．細胞表面及び細胞内抗原：細胞表面染色は、サイトフルオログラフィー〔Ｆ ＡＣＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅ ｗ ＣＡ〕を用いた。第１ラット又はハムスターｍＡｂｓを用いた染色の後、引 き続いて実施例１Ｄにおいて述べたようにＦＩＴＣ−共役マウス抗−ラット又は ヤギ抗−ハムスターＩｇにより行った。細胞表面（２３、２４）及び細胞内抗原 （３３、３４）に対するｍＡｂｓのパネルを、サイトスピン試料について試験し た。我々は、付着性及び非付着性集団の両方を研究し、前者は１０ｍＭのＥＤＴ Ａの存在下で分離した〔付着細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、ＥＤＴＡ−ＰＢ Ｓを用いて１回洗浄し、その後、３７℃で２０分間、ＥＤＴＡ−ＰＢＳで培養し た〕。このサイトスピンをアセトン内で固定し、ｍＡｂｓを用いて染色し、引き 続いてパーオキシダーゼ共役マウス抗−ラット又は抗−ハムスターＩｇにより行 った。このパーオキシダーゼは、ジアミノベンジジンを用いて視覚化し、核をギ ムザを用いて対比染色した。 Ｅ．細胞学的アッセイ：ギムザ染色は、サイトスピン試料を緩衝アセトンホルマ リンの代わりにハンクス培地中の２％グルタールアルデヒドで固定化した以外は 、標準的な方法（３５）を用いて、非特異的エステラーゼ〔基質としてα−ナフ チルアセテート〕染色の場合と同様にしてサイトスピン試料について行った。相 対照観察は、通常は生きた細胞についてのものであり、１００及び４００ｘの最 終倍率で倒立顕微鏡〔Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ〕を用いて行った。透過電子 顕微鏡法（３６）及び³Ｈ−チミジンオートラジオグラフィーは、実施例１Ｅに 記載される樹枝状細胞の成育について行った。 Ｆ．混合白血球反応：骨髄培養物からの細胞を、１５ＧｙのＸ線照射に曝し、分 量を変えた投与量で、９６のウエル平底培養プレート内で４日間、３ｘ１０⁵の 同系又は同種異系Ｔ細胞に適用した。このＴ細胞は、脾臓及びリンパ腺懸濁液を ナイロンウールを通して通過させ、その後、補体を加えたＪ１１ｄ ｍＡｂｓを 加えた抗−Ｉａを用いて残余のＡＰＣｓを消耗することによって調製した。３Ｈ −チミジン吸収は、４ｕＣｉ／ｍｌ〔２２２ ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｉｃ ａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕ ｉｓ，ＭＯ〕のパルスの後、６０〜９４時間で測定した。 Ｇ．ＧＭ−ＣＳＦを用いて補足されたマウス骨髄からの増殖樹枝状細胞の凝集体 培養の前に、我々は、ｍＡｂｓと、補体を加えたＢ細胞、Ｔ細胞、及びＭＨＣ クラスII抗原との混合物で骨髄懸濁液を処理した。Ｂ細胞及び顆粒球の数を減少 させる骨髄細胞の、このような前処理は、骨髄中の成長樹枝状細胞を同定するの に必要である。なぜならば、Ｂ細胞及び顆粒球はまた、ＧＭ−ＣＳＦ応答性であ り、樹枝状細胞前駆体の存在を増殖してマスクするからである。 従って、２日及び４日の培養時に、我々は、形態学において典型的な顆粒球で あり、しかもＲＢ６抗原を表現するものであることが確認された、緩く付着した 細胞を除去するために、ゆっくりとプレートを攪拌した〔以下を参照〕。これら の工程に伴い、我々は付着細胞の層に付着した４日目の細胞凝集体により確認し た。この凝集体におけるプロフィールの幾つかは、樹枝状細胞の、隠された又は シート状の突起を有していた。この凝集体は、ゆっくりしたピペッティングによ って取り出すことができ、しかも１ｇ沈殿によって分離することができた。３時 間のリプレーティング以内で、多くのスピニー付着細胞がクラスターから移出さ れ、そして、新たな牌付着細胞が現れた（１３）。もう１日の培養の後には、こ れらの付着細胞は表面が取れ、多くの典型的な樹枝状細胞が培養培地において浮 かんで見えた。樹枝状細胞の最適収量は、この凝集体を６日目に収穫し、その後 、一昼夜培養した時に得られた。樹枝状細胞を生成するための骨髄の容量は著し く、１週間で４つの主後脚骨から＞５ｘ１０⁶である。 培養ウエルの表面に付着したものは、マクロファージの細胞学的な特徴を有し た細胞であり、これらはまた、最初の一週間の培養の間に多数に拡がった。これ らの細胞は、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下で３７℃にて培養した後、ピペッティ ングによって取り出すことができた。 これらの培養物が、Ｍ−ＣＳＦ中で保持された場合には、多数のマクロファー ジが育成され、プラスチックの表面にしっかりと付着していた。しかしながら、 樹枝状細胞ではない凝集体又は樹枝状細胞の凝集体は明らかではなかった。Ｍ− ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦとの混合物が適用された場合には、その後、付着性のマク ロファージのコロニー並びに成長顆粒球と樹枝状細胞の凝集体が認められた。 Ｈ．骨髄培養物中の強力なＭＬＲ刺激剤細胞の成育 マウス骨髄の懸濁液は、ＭＬＲ刺激剤としては活性でなく（３８）、検出可能 な樹枝状細胞を含まないこと（３０）が知られている。前述の細胞学的な観察が 得られたことで、我々は、Ｉａ−陰性骨髄非リンパ球を６日間培養し、ＭＬＲ刺 激活性を１日毎の間隔でチェックした。これらの培養物がＧＭ―ＣＳＦを用いて 補足される限りは、強力なＭＬＲ刺激活性が発生した〔図５〕。この増加は、累 進的であり、６日では、１００しかない骨髄細胞、２０以上の刺激指数を有する ＭＬＲｓを誘導した。 ＭＬＲ刺激活性の進行と、これらの突然発生培養物における樹枝状細胞の発現 との相互関係を明らかにするために、我々は、まず最初に、これらの培養物を非 付着性の分画と緩く付着性を有する分画とに分離した〔図６Ａ〕。最初の４日間 においては、主に顆粒球であった非付着性細胞は、プレートをゆっくりと攪拌し て、細胞を収穫することにより得られた。この緩く付着した細胞は、４日目及び それ以降の時間においては、予定樹枝状細胞前駆体及び樹枝状細胞の凝集体を含 んでおり、しっかりと付着した間質細胞の表面上にピペッティングすることによ って分離された。２日と４日の時点では、最も強力な刺激活性が付着分画にあっ た。６日までは、非付着性分画は非常に活性なものであった。しっかりとした付 着性のマクロファージを試験した場合には、ＭＬＲ刺激活性はなかった〔図６Ｂ 、白い正方形〕。 上述の如く、ＧＭ−ＣＳＦの存在下では、これらの培養物は、４〜８日の間の 培養で典型的な樹枝状細胞を放出する成長細胞の凝集体を生成した。これらの凝 集体は、単層上をゆっくりとピペッティングすることによって単離することがで き、引き続いて１ｇ沈殿を行った。これらの凝集体を培養物に戻した場合には、 樹枝状細胞が豊富である集団が放出され、これらの放出された細胞は、樹枝状細 胞に特徴的である非常に強力なＭＬＲ刺激活性を有していることが明らかであっ た〔図６Ｂ〕。 Ｉ．細胞表面マーカー −− サイトフルオログラフィー サイトフルオログラフィーにより細胞の二つの集団は、非付着性の細胞又は容 易に分離される細胞に簡単に区別された。一方の集団は、低い前方光拡散、高レ ベルのＲＢ６抗原、及び低いレベルのＭＨＣクラスIIを有していた。他方の集団 は、より大きなものであり、相互表現型を有していた。この凝集された細胞は、 ＭＨＣクラスII陽性細胞における分画されていない培養物に比べて豊富であり〔 図８、左と中央を比較〕、しかも、樹枝状細胞の非常に豊富な集団を放出するた めに、凝集体を一昼夜培養した時、個々の細胞についてのＭＨＣクラスIIのレベ ルが増加した〔図８、中央と右を比較〕。ＭＨＣクラスIIがより豊富であるＲＢ ６抗原陰性細胞は、４日の培養物に対して６日の培養物において見られた〔図８ 〕。これらの細胞はいずれも、Ｂ細胞のＢ２２０抗原又はマクロファージのＳＥ Ｒ−４抗原についてのｍＡｂｓとは反応しなかった〔図示されていない〕。 更に詳しいＦＡＣＳ研究を、凝集体から放出された細胞について行った。この 顆粒球は、低い前方光散乱に基づいて追い出された。より大きな樹枝状細胞は、 均一な高レベルのＭＨＣクラスＩ及びＩＩ、並びにＣＤ４４及びＣＤ１１ｂ〔Ｍ ａｃ−１；Ｍ１／７０〕を有していた。中間レベルの染色は、熱安定性のある抗 原〔ＨＳＡ；Ｍ１／６９〕、ＣＤ４５〔Ｍ１／９．３〕及びＣＤ１８〔２Ｅ６〕 について確認された。低いレベルの染色は、低い親和性ＩＬ−２レセプター〔Ｃ Ｄ２５、７Ｄ４〕、指状細胞抗原〔ＮＬＤＣ−１４５〕、Ｆｃγレセプター〔２ ．４Ｇ２〕、樹枝状細胞抗原〔３３Ｄ１〕、マクロファージ抗原〔Ｆ４／８０〕 及びＣＤ１１ｃ ｐ１５０／９０β２−インテグリン〔Ｎ４１８〕について明ら かであった。幾つかの抗原は検出することができず、この中には、ファゴサイト 〔ＳＥＲ−４ マージナルゾーンマクロファージ、ＲＢ６顆粒球〕及びリンパ球 〔ＲＡ３−６．１ Ｂリンパ球；ｔｈｙ−１，ＣＤ３，４，８ Ｔリンパ球〕マ ーカーが含まれる。この表現型は、脾臓及び表皮樹枝状細胞（２４，２７，２８ ）において見られたものと多くの点で同様である。一つの例外は、ＣＤ１１ｂの 骨髄誘導細胞において高レベルである、脈管構造からの骨髄細胞の媒介移出を助 けるインテグリンである。 Ｊ．サイトスピン調合物 サイトスピンを、しっかりと付着した集団を有する放出された樹枝状細胞とさ らに比較するために調製した。ギムザ染色により、凝集体から放出された細胞は 、樹技状細胞の典型的な星状形状を有している一方、この付着性細胞は、最も部 分的な空胞マクロファージに対するものであった。多くの樹技状細胞は、非特異 的なエステラーゼ染色の核周囲スポットを有している一方、より付着性のある集 団は、強化サイトプラスミックエステラーゼを有していた。 この放出された細胞は、典型的な顆粒球核による汚染を除いては、ＭＨＣクラ スII生成物に対して、強力に染色した。この強力な付着細胞は、クラスII陽性細 胞のサブ集団を含んでいた。最近では、抗原は、樹枝状細胞及びＢ細胞の細胞内 空胞に主に位置しており、単核ファゴサイトではないと記載されてきている。こ の抗体はＭ３４２（３４）及び２Ａ１と名付けられている。樹枝状細胞の多くが 強力な２Ａ１染色を有しており、数値の小さい方がＭ３４２で示された。この付 着細胞は弱性２Ａ１を有する幾つかのプロフィールを有していた。 Ｉａ−陽性細胞及び顆粒状の細胞内抗原を示す細胞の成育を、サイトスピンに ついて定量化した〔図１０〕。ＭＨＣクラスII抗原がまず示され、引き続いて２ Ａ１及びＭ３４２顆粒抗原が示された〔図１０〕。８日までに、細胞の大部分が 樹枝状であり、高レベルのＭＨＣクラスII生成物及び２Ａ１抗原を有していた。 顆粒球が培養物から除去されない場合には、非付着細胞の収量はもっと大きくな るが、我々が検出したＭＨＣクラスII陽性細胞の最も高いパーセンテージは３０ ％であり、樹枝状細胞成長の部分であった凝集体を同定し、かつ単離することは 困難であった。 このサイトスピンが、他の骨髄抗原についての染色された時には、放出された 細胞が弱く染色し、時にはＦｃγレセプター〔２．４Ｇ２〕及びマクロファージ 制限抗原〔Ｆ４／８０〕についてのモノクローナルとの上記バックグラウンドを 全く染色しなかった。しっかりした付着細胞のほとんどは、対照的に両方の抗原 に対して強く染色した。このことは、低レベルの２．４Ｇ２及びＦ４／８０が放 出された樹枝状細胞の表面において見られる一方、合成及び発現が恐らくは、表 皮樹枝状細胞が培養物中に置かれた時に多く起こるような下方調整されたもので ある（２７）ことを示している。 ４日には、約３０〜５０，０００のＩａ−陽性細胞が培養物中に浮かんでいる 一方、６日及び８日の両方では、更に５０〜１００，０００のＩａ−陽性細胞が 収穫された。この定量的データは、各ウエルが１週間のうちに約２００，０００ 以上のＩａ−陽性細胞を生成したことを示していた。我々は、約２０〜３０ウエ ルの、２つの脛骨と２つの大腿骨から開始Ｉａ−陰性骨髄細胞を得たので、Ｉａ −陽性細胞の全体の収量が５ｘ１０⁶以上であり、マウスの皮膚におけるランゲ ルハンス細胞の全体の算出数を越えている。 Ｋ．３Ｈ−チミジンパルス追跡実験 これらの培養物における樹枝状細胞の増殖及び分化を証明するために、細胞の クラスターを４日で分離し、³Ｈ−チミジンの１２時間パルスに曝し、オートラ ジオグラフィーにより、直後又は、³Ｈ−チミジンを含まない培地における１、 ２及び３日後の追跡を測定した。この凝集体における細胞の大部分は、最初には ラベルされており、凝集体から放出されたのほとんど全ての細胞がラベルされて いた。追跡の間、放出された後代の増加したパーセンテージは、成熟した樹枝状 細胞の２Ａ１顆粒抗原を示した。 Ｌ．電子顕微鏡法 放出された細胞は、細胞体の幾つかの方向から延びた多くの大きなベール又は ラメリポディアを有していた。この細胞質は、多くのミトコンドリア、幾つかの 電子密度の高い顆粒及びリポソームを有しているが、多嚢胞体の細胞学的な特徴 を有した幾つかの電子光輝小胞ソームは有していなかった。樹枝状細胞から延び た多数の細胞突起が、我々の調合物の半−薄分画において明らかであった。 ５日の培養物における、骨髄から誘導された樹技状細胞は、多くのサイトラス ミックベールを示している。核周囲領域の拡大図は、滑らかな細網及び空胞のプ ロフィールを示している。幾つかのリソソーム的又は食細胞的構造がある。 実施例３ インビボにおけるミコバクテリア抗原に対しマウスを増感させる マウス樹枝状細胞プロジェニター食作用粒子 材料及び方法 Ａ．マウス： ＢＡＬＢ／Ｃ ｘ ＤＢＡ／２ Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６ ｘ Ｄ ＢＡ／２ Ｆ１、及びＢＡＬＢ／Ｃの雄及び雌を、Ｔｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉ ｔｕｔｅ〔Ｓａｒａｎａｃ Ｌａｋｅ、ＮＹ〕及び、Ｊａｐａｎ ＳＬＣ〔浜松 〕から購入し、生まれて６〜１０週間のものを使用した。 Ｂ．骨髄培養物：前記実施例２に記載したように、大腿部及び脛部から骨髄を洗 浄し、０．８３％の塩化アンモニウムを用いて赤血球を放血し、そして、５％の ウシ胎児血清、２０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及び１０００Ｕ／ｍｌの組換 マウスＧＭ−ＣＳＦ〔キリンビール、前橋、群馬、日本；９．７ｘ１０⁷Ｕ／ｍ ｇ〕を用いて補足されたＲＰＭＩ−１６４０ １ｍｌにおいて１０⁶細胞／ウエ ルで、２４のウエルプレート〔Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ及びＣｏ ｒｎｉｎｇ ＃２５８２０、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ〕内で培養した。２日におい て、０．７５ｍｌの培地と非付着細胞を除去し、新たな培地に置き換えた。４〜 ５日にこのような操作を繰り返し、それによって発育した顆粒球の大部分を除去 し、散乱したマクロファージを含む間質に付着した増殖樹枝状細胞のクラスター を後に残した。その後、この培養培地を、〔以下に詳細に記載した〕ＢＣＧミコ バクテリアの微粒子物で補足し、食作用が通常は５〜６日において２０〜２４時 間進行するようにした。この時点で、培養物を、自由な疎性細胞及び粒子となる ように濯ぎ、粒子吸収のために直ちに細胞を分析した。もしくは、洗浄された培 養物中の細胞を分離し、３〜４ｘ１０⁶細胞を、粒子を含まない、新たな、ＧＭ −ＣＳＦ補足培地において、１日間又は２日間の「追跡」期間、６０ｍｍのペト リ皿に移し替えた。クラスIIが豊富で、成熟した樹枝状細胞が、実施例２に記載 される追跡の間に発育し、これらを細胞選別〔以下〕により分離した。発育して 成熟した樹枝状細胞の食細胞活性を比較するために、単一の非増殖性の成熟樹枝 状細胞が豊富な７〜８日の骨髄培養物に、粒状物もまた投与した。 Ｃ．粒状物：ＢＣＧミコバクテリア〔Ｔｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１ ．５〜２．５ｘ１０⁸ＣＦＵ／ｍｌ；協和製薬工業、東京〕を、直径１６ｍｍの ウエルについて、約１０⁷の生きたＢＣＧで投与した。吸収は、Ｚｉｅｈｌ Ｎ ｅｅｌｓｅｎよりももっと感度が良く、微生物の数を容易に数えられる、オーラ ミン−ローダミン法を用いて、引き続き行われる「耐酸性」染色で測定した。コ ロ イダルカーボン〔ペリカンインキ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ，ドイツ〕を１：２０００ の割合で希釈して添加した。このカーボンは、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（登録商標） 〔Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ，マイアミ、ＦＬ〕を用いて 染色された試料における黒色顆粒占領として同定された。２ｕラテックス粒子〔 ０．５％ ｖ／ｖ；Ｓｅｒａｄｙｎ，インディアナポリス，ＩＮ〕の懸濁液を、 培養物ウエルの表面がビーズで覆われる投与量である、５０ｕｌ／ウエルで培養 物に加えた。 Ｄ．細胞選別による成熟した樹枝状細胞の分離 実施例２において先に記載したように、ＧＭ−ＣＳＦ刺激骨髄培養物において 生産される樹枝状細胞は、非常に高いレベルの表面ＭＨＣクラスII生成物〔ＡＴ ＣＣからのモノクローナル Ｂ２１−２，ＴＩＢ２２７及びＭ５／１１４，ＴＩ Ｂ １２０〕並びに、中位のレベルの、モノクローナル ＮＬＤＣ−１４５によ り認められた樹枝状細胞制限抗原を示す。ＢＣＧを用いたパルスの直後、あるい は更に２日の「追跡」培養の後に、細胞を、バイオチンＢ２１−２及びＦＩＴＣ −ストレプタビジン〔Ｔａｇｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ〕を用いて染色し た。その後、クラスIIが豊富な細胞を、選別〔ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓ，Ｂｅ ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ〕し、ガラススラ イド〔Ｓｈａｎｄｏｎ Ｉｎｓｔ．Ｓｅｗｉｃｋｙ，ＣＡ〕上でサイトスパンし た。この選別された細胞を、サイトスピン中の樹枝状細胞の星形形状の輪郭を出 し、かつ内部移行したコロイダルカーボン又はラテックス球の核周囲蓄積質を含 んだプロフィールの算出を可能とするＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（登録商標）を用いて 染色した。ＢＣＧを視覚化するために、サイトスピンを室温で１０分間無水アセ トン中で固定させ、Ｍ５／１１４抗−クラスII、ＮＬＤＣ−１４５抗−樹枝状細 胞、又はＲＡ３−６Ｂ２抗−Ｂ２２０又は抗−Ｂ細胞〔後者はコントロールとし て〕を用い、引き続いてＰＯＸ共役マウス抗−ラットＩｇ〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナポリス，ＩＮ〕及び、ジアミノベンジジン 四塩酸〔Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ〕を用 いて染色した。その後、この調合物を、オーラミンローダミンを用いて耐酸性細 菌に対して二重にラベルした。実際に、この調合物における全ての細胞は、ＮＬ ＤＣ−１４５及びＭＨＣクラスII生成物が豊富であった。少なくとも４００細胞 においてのＢＣＧ細菌の数を算出した。 Ｅ．電子顕微鏡観察： 細胞関連ＢＣＧが全て内部移行されていることを証明す るために、パルス追跡プロトコル〔上記〕において生産された樹枝状細胞を２． ５％のグルタールアルデヒド内で固定し、実施例２に記載されるようなＥＭにつ いて行った。 Ｆ．インビトロにおける抗原提示 完全フロインド補助液〔ＣＦＡ，ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；前部 及び後部脚に２５ｕｌ〕又は、コントロールとしてミコバクテリアを含まない不 完全フロインド〔ＩＣＦＡ〕を用いて、マウスはプライムされた。７〜１４日後 、取り出したリンパ腺を、単一の細胞懸濁液の中に解離し、ＭＨＣクラスII、Ｂ ２２０、及び熱安定性のある抗原〔Ｍ５／１１４抗−Ｉａ，ＲＡ３−６Ｂ２抗− Ｂ２２０、及びＪ１１ｄ抗−ＨＳＡ；ＴＩＢ １２０、１４６、及び１８３、そ れぞれＡＴＣＣからのもの〕についてのｍＡＢｓ及びウサギ補体を用いてＡＰＣ ｓを放血した。これらのＡＰＣ−放血され、プライムされたＴ細胞の３ｘ１０⁵ を、０．５％のマウス血清及び５０ｕＭの２−メルカプトエタノールを用いて補 足されたＲＰＭＩ−１６４０培地において、９６のウエル平底マイクロテストウ エル〔Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃２５８６０〕で培養した。ＢＣＧ−パルスされた骨髄 又は脾臓ＡＰＣｓを、分量を変えた投与量で添加した。１ｕＣｉの３Ｈ−チミジ ン〔ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；４ｕＣｉ／ｍｌ〕吸収 を、７２〜８８時間の時点でＤＮＡ合成をモニターするために添加した。示され ているデータは、標準誤差が平均の１５％未満である三組の平均値である。 Ｇ．インビボにおける抗原提示 インビトロで抗原とパルスされたＡＰＣｓを、まだプライムされていないＣｘ Ｄ２ Ｆ１マウスに対してインビボで投与した。放血したリンパ腺においてＴ細 胞をプライムするために、２ｘ１０⁵の樹枝状細胞を脚に注入し、リンパ腺細胞 を５日後に準備した。脾臓においてＴ細胞をプライムするために、１０⁶細胞を 脈間で注入し、脾細胞を５日又は１０日後に準備した。Ｔ細胞プライムを測定す るために、バルクリンパ腺又は脾細胞を上述のようにして培養し、プロテイン抗 原の投与量を変えて試み、精製されたプロテイン誘導体〔ＰＰＤ，Ｓｔａｔｅｎ ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、コペンハーゲン、デンマーク、又は樋田一郎 博士、日本ＢＣＧ研究所、清瀬、東京〕又は、ウシ血清アルブミン〔シグマ〕及 び３Ｈ−チミジンのいずれかを７２〜８８時間の時点で測定した。増殖細胞を特 徴付けるために、この個体群を、３Ｈ−チミジン吸収を測定する前に、抗体及び 補体を用いて処理した。 Ｈ．成育する樹枝状細胞のクラスターの内部におけるラテックス粒子の食作用： パルス及びパルス追跡プロトコル マウス骨髄又は血液がＧＭ−ＣＳＦを用いて刺激される時、増殖細胞凝集物が 現れ、これらは、多数の典型的な免疫刺激樹枝状細胞を生じさせる。以下に記載 した実験について使用された骨髄においては、培養物においてＧＭ−ＣＳＦによ っても誘導される非付着顆粒球の大部分を洗浄除去することにより、増殖凝集物 が最も良く同定される。凝集物が最初にかなり大きくなった時期〔５〜１０細胞 の大きさ〕である５〜６日においては、我々は、２０〜２２時間の時間をかけて 違った粒子を適用した。 ２ｕのラッテクス球を引き続いて投与し、重いレベリングが単層上に拡散した マクロファージに認められた。更に、幾つかのハッキリしたラベリングが、成育 した樹枝状細胞凝集物の範囲内で起こった〔図１２Ａ〕。粒子に曝されてきた凝 集物を、更に２日間再培養した。この時間の間、多数の細胞が懸濁液中に放出さ れた。これらは主に、星状形状の特徴を有し、高レベルのＭＨＣクラスII及びＮ ＬＤＣ−１４５抗原を有する成熟した樹枝状細胞であった。この放出された細胞 を光顕微鏡法により調査した際、多くがラテックス球を含んでおり、しばしば明 らかな核周囲ゾーン又は中心球を取り囲んでいた〔図１２Ｂ〕。又、我々は、同 様の方法によりコロイダルカーボン吸収を研究した。凝集物をコロイドを用いて パルスし、かつ成熟した樹枝状細胞を追跡期間の間に形成させる際には、放出さ れた細胞のいくつかは、小さいが、綺麗に切断されたカーボン沈澱物ではない中 心球を有していた〔図１２Ｃ〕。対照的に、ラテックス又はカーボンが成熟した 樹枝状細胞に与えられた時には、吸収はほとんど起こらなかった〔図１２Ｄ〕。 Ｉ．樹枝状細胞を成育することによるＢＣＧミコバクテリア吸収 −− 耐酸性染色 前述のラッテクス粒子を投与するためにプロトコルを用い、２０〜２２時間の 期間に渡って、食細胞食として、生きたＢＣＧミコバクテリアを投与した。細胞 関連細菌は、感度の良い螢光耐酸性染色により視覚化した。２０時間のパルスに 伴って、成育した樹枝状細胞凝集物は多くの微生物を含んでいた。培養物からの より成熟した樹枝状細胞を分離するために、細胞を再懸濁し、高いレベルのＭＨ ＣクラスII生成物を含む細胞を選別した。ＢＣＧパルスの直後には、約２０％の 選別された細胞が、耐酸性の細菌を含んでいた〔表１〕。ＭＨＣクラスII弱性細 胞の大部分は、細胞選別の間に過度の付着性となるので、これ以上の研究は行わ なかった。 その後、伴細胞培養物を、２日の追跡培養の後に調査した。なぜならば、多く の成熟した樹枝状細胞が追跡期間の間に形成され、Ｉａ−豊富な後代の数が４倍 に増加したからである〔表１〕。 表１ ＧＭ−ＣＳＦ刺激されたマウス骨髄培養物における 食作用化されたＢＣＧ微生物を伴う樹技状細胞の頻度 ＢＣＧを含有する樹枝状細胞の定量的データ。マウス骨髄培養物を、ＧＭ―Ｃ ＳＦを用いて５日間、１６ｍｍのウエルにおいて刺激し、洗浄し、２０時間ＢＣ Ｇ微生物に曝した。この培養物を再び洗浄し、直ちに試験するか、あるいはプー ルして、更に２日の追跡培養のために６０ｍｍの皿に移し替えるかのいずれかと した。この培養物における樹枝状細胞は、螢光活性化された細胞選別機を用いて Ｉａ−豊富な細胞として選別され、その後、耐酸性細菌に染色を行うためにガラ ススライド上にサイトスパンされた。追跡期間の間、この培養物におけるＩａ− 豊富な細胞のパーセンテージは２〜２．５倍に増加し、全体の細胞の数が２倍に 増加し、その結果、Ｉａ−豊富な細胞の数において４〜５倍の増加が生じた。 ＢＣＧを含有する樹枝状細胞のパーセンテージはまた、５０％にまで上昇した 〔表１、図１３〕。二重ラベリング実験からは、耐酸性細菌を含む細胞はＭＨＣ クラスII及び、樹枝状細胞制限ＮＬＤＣ １４５抗原を示すことが証明された。 図１３。なぜならば、ＭＨＣクラスII及びＮＬＤＣ−１４５陽性細胞の全体の数 が、ちょうど２日で４倍に増加し、これらのＢＣＧ−積載樹枝状細胞が、凝集物 において成熟はしているが、食細胞性でないプロジェニターから誘導されたと思 われるからである。 Ｊ．ＢＣＧパルスＡＰＣｓの電子顕微鏡法 光学顕微鏡による細胞関連粒子の核周囲位置は、微生物が内部移行されたこと を示していた。このことは、電子顕微鏡法により確かめられた。樹枝状細胞プロ フィールの約５０％が、内部移行されたＢＣＧを含有していたが、プロフィール あたりの微生物の数は少なく、通常は１つかあるいは４つまでしかなかった、図 １４ Ａ，Ｂ。それぞれの微生物は、それ自身の空胞を占めているように思われ た。ファゴソーム膜はほとんど細菌に似かよったものであるように思われた、図 １４ Ｃ，Ｄ。 Ｋ．プライムされたＴ細胞に対するミコバクテリア抗原のインビトロにおける 提示 ＢＣＧ微生物を用いてパルスされたか、あるいはパルス追跡された樹枝状細胞 に存在する機能を試験するために、我々はまず、取り出されたマウスのリンパ腺 から抗原応答性のあるＴ細胞を調製し、このリンパ腺には、ＣＦＡ〔熱殺菌され たミコバクテリアを含む完全フロインド補助液〕又は、不完全フロインド補助液 〔コントロールとしてＩＦＡ；方法を参照〕を注入しておいた。樹枝状細胞をＩ ＦＡ−プライムされたＴ細胞に添加した際、同質混合の白血球反応が観察された 。このことから、ＡＰＣｓがＢＣＧに曝されたか否かを比較することができた〔 図１５、右〕。しかしながら、樹枝状細胞がＢＣＧと共にパルスされ、ＣＦＡ− プ ライムされたＴ細胞に添加された時、強力な増殖応答が誘導された〔図１５、左 〕。樹枝状細胞が、１日のパルスの直後、あるいは更に２日の追跡期間の後に試 験された場合には、追跡された個体群はもっと強力であった。〔図１５、左；◆ と▼を比較〕。１００ＢＣＧのパルス追跡された樹枝状細胞だけはインビトロで 、かなり大きなＴ細胞応答をもたらした〔図１５、左 ◆〕。このＢＣＧパルス −追跡個体群もまた、ＰＰＤ又はＢＣＧのいずれかに新たに曝された成熟した樹 枝状細胞よりも、ミコバクテリア抗原に対する応答性を誘導するのが５〜１０倍 強力であった〔図１５、左；◆と●、▲を比較〕。従って、食作用の程度は、パ ルス追跡個体群が最も活性のあるＡＰＣｓであり、かつ最も細胞内ＢＣＧを含ん でいたので、提示の効率と関係しているように思われた〔表１〕。 Ｌ．増感されていないマウスに対するミコバクテリア抗原のインビボにおける 提示 ＢＣＧ−パルスされた、及びＢＣＧ−パルスされ、かつ追跡されたＡＰＣｓの 比較し得る個体群が、プライムされていないマウスに対するミコバクテリア抗原 を提示する能力について試験された。フートパッドへの注入に引き続いて、ＰＰ Ｄに対する強力な応答性が観察された〔図１６〕。又、２日追跡後に試験した場 合にも、樹枝状細胞が最も強力であり〔図１６、◇と△の比較〕、この追跡期間 により、樹枝状細胞の全体の収量が非常に増加した。 ＢＣＧパルス−追跡された樹枝状細胞の機能を示す増加した抗原が、ＢＣＧを 有するＡＰＣｓの増加した数に関連しているか否かを試験するために、プライム された個体群もまた、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕に対する応答性について試 験した。というのは、樹枝状細胞がウシ胎児血清の存在下で成長したからであっ た。全ての樹枝状細胞個体群は、ＢＣＧへの露出の細部とは無関係に、ＢＳＡと 同様にマウスにプライムされた。〔図１６、黒く塗られた記号〕。このことは、 それぞれの個体群が、溶解性プロテインを免疫化するのにかなり有効であったこ とを示している一方、ＢＣＧを食作用した樹枝状細胞が、ミコバクテリア抗原に 対する応答性をもたらすのにより有用であったことを示している。 プライムされた細胞の表面マーカーは、３Ｈ−チミジン吸収を測定する前に、 抗体及び個体群の補体媒介溶解によって試験した〔データは示されていない〕。 この増殖細胞は、ｔｈｙ−１に対しては陽性であったが、ＭＨＣクラスII、熱安 定性抗原、及びＢ２２０に対しては陰性であった。抗−ＣＤ４ハイブリドーマ培 地上澄み液は、８５％以上増殖を抑制し、即ちプライムされた細胞はヘルパー− タイプＴ細胞であった。 プライムはまた、ＢＣＧ−パルスされた、及びＢＣＧ−パルス追跡された樹枝 状細胞の静脈内注入の後に、脾臓Ｔ細胞を試験した時にも観察された〔図１７〕 。この細胞は、注入後、１０日に対する５日の時点でより応答性があった〔図１ ７ＡとＣを比較〕。又、ＢＣＧに曝した後、２日間培養された〔「追跡された」 〕樹枝状細胞が、最も強力であった〔図１２ ◆と▲を比較；しかし、全ての個 体群はＢＳＡと同様に脾臓細胞をもたらした〔図１７Ｂ〕。我々は、樹枝状細胞 祖先剤が捕捉し、しかもインビボで高い免疫原性である方法でミコバクテリア抗 原を保持することを結論付けている。実施例４ 抗原は、免疫原として樹枝状細胞を活性化した。 実施例１に記載した方法に従って調製された樹枝状細胞は、２４のウエルプラ スチック培養プレートのウエルについて、約１ｘ１０⁵細胞の濃度で載せられた 。この細胞は、５％ウシ胎児血清及びＧＭ−ＣＳＦ（３０Ｕ／ｍｌ）を含有して いるＲＰＭＩ １６４０内で培養される。抗原を樹枝状細胞培養物に添加し、こ の培養物を約４時間あるいは充分な時間で抗原と培養し、その結果、樹枝状細胞 を、免疫学的に適切な形態で、あるいはＴ細胞により確認可能な形態で抗原を取 り扱うことが可能となる。このような樹枝状細胞による抗原の取扱いには、樹枝 状細胞を、１）得ること、２）プロセッシング、及び３）Ｔ細胞により確認可能 な形態でＴ細胞に対する抗原を提示することを含む。樹枝状細胞に対する抗原の 結合に引き続いて、細胞を培養物から集め、同系のマウスを免疫化するのに使用 した。この活性化された樹枝状細胞は、抗原との免疫応答を誘導するのに充分な 量で、マウスに皮下に注入する。実施例５ 実施例１に記載したようにして調製した樹枝状細胞を、蛋白質抗原で十分な時 間パルスし、樹枝状細胞が、変性抗原を、獲得、加工し、該樹枝状細胞上に生じ させるようにする。その後、樹枝状細胞を、該変性抗原の抽出用に培養から集め る。 変性抗原の抽出には、樹枝状細胞を洗浄剤で溶媒和し、ＭＨＣ分子に結合した 変性抗原を抽出する。変性抗原に結合したＭＨＣ分子は、ＭＨ₂のようなＭＨＣ 分子と結合する抗体で沈殿させて精製する。変性抗原は分析するために、該沈殿 から抽出する。実施例６ ヒト血液から樹枝状細胞の調製 Ａ．患者 コンソリデーション化学療法を受け（完全寛解で白血病／リンパ腫の１５人、 固形腫瘍の２人）、次いでＧ−ＣＳＦ治療しているヒト患者からの血液で１７の 実験を実施した。３例は、化学療法（急性骨髄球性の白血病１人、固形腫瘍２人 ）し、ＢＭ−ＣＳＦ治療した後の患者からの血液で実施した。これら３例の結果 を、Ｇ−ＣＳＦ治療した患者群からの２名、ＡおよびＢと、ＧＭ−ＣＳＦ治療し た患者群からの１名、Ｃ、で提示する。 Ｂ．原理的説明 マウス血液に関する実施例１と骨髄に関する実施例２に記載される方法(J．Ex p．Med．175:1157-1167，1992およびJ．Exp．Med．176:1693-1702，1992)の結果 を、樹枝状細胞増殖と発育のいくつかの特色で確認した。（ａ）樹枝状細胞の先 祖は成熟免疫制限性子孫および多くの他の細胞型（Ｂ細胞、単球細胞）の代表的 なものであるＭＨＣクラスIIの抗原を発現しない；（ｂ）樹枝状細胞の先祖は、 増殖および成熟するのに、ＧＭ：ＣＳＦおよび該細胞で提供される他のシトキン 類を、培養でまたは補体として必要とする；（ｃ）樹枝状細胞の増殖および発育 における臨界的な工程は、標準細胞培養表面への接着がゆるい特有の凝集体に生 ずる；（ｄ）これらの凝集体の出現をモニターすることによって、樹枝状細胞の 世代に適切である多くの変量を評価できる。 （Ann．Rev．Immunol．9:271-296，1991）。 Ｃ．実験記録 １．血液単核細胞を、標準的な濃厚媒体、ここではLympoprep（Nycomed，Oslo ）中で沈降法で単離した。 ２．単離した単核細胞は、樹枝状細胞の先祖でない細胞から完全に除いた。こ れらの不純物は、ＣＤ３およびＨＬＡ−ＤＲ抗原に対するモノクロナル抗体でコ ートし、親和性−精製したヤギの抗−マウスＩｇＧ(panning)でコートしたペト リ皿上で枯渇された。 ３．培養媒体の１ml中の１０⁶の細胞を、直径１６mmのプラスチック培養ウエ ル（Costar，Rochester，N．Y.）に入れた。この媒体は、５０UMの２−メルカプ トエタノール、１０mMのグルタミン、５０ug/mlのゲンタマイシン、〔加熱不活 性化なしの）帯血からの血清５％またはウシ胎児血清（不活性化した）５％およ びヒト組み換え体ＧＭ−ＣＳＦ４００U/mlで補足されたＲＰＭＩ−１６４０であ った。その後、２日毎に、１６日間、培養は、該媒体の0.3mlを除去し、シトキ ン類を補足した新鮮な媒体0.5mlで、これを置き換えることによって、栄養補給 される。 細胞を下記の条件で培養した：１）付加的なシトキン類の存在なしで；２）Ｇ Ｍ−ＣＳＦ、４００または８００Ｕ／ml；３）ＧＭ−ＣＳＦ、４００または８０ ０Ｕ／ml、パルスＩＬ−１α、５０ＬＡＦ単位／ml（培養の最後の２４時間）、 ４）ＧＭ−ＣＳＦ、４００または８００Ｕ／ml、パルスＴＮＦα、５０Ｕ／ml； ５）ＧＭ−ＣＳＦ、４００または８００Ｕ／ml、パルスＴＮＦ−α、５０Ｕ／ml 、パルスＩＬ−１α、５０ＬＡＦ単位／ml（培養の最後の２４時間）、６）ＧＭ −ＣＳＦ、４００または８００Ｕ／ml、パルスＩＬ−３、１００Ｕ／ml；７）Ｇ Ｍ−ＣＳＦ、４００または８００Ｕ／ml、パルスＩＬ−３、１００Ｕ／ml、パル スＩL−１α、５０ＬＡＦ単位／ml（最後の２４時間）。 実験Ｃでは、濃厚なメトリツアミド(metrizamide)に沈めた非−樹枝状細胞を も試験した。 ４．固有増殖する樹枝状細胞凝集体（以下ボールと称する）が５日目迄に現れ た。相対比倒立顕微鏡（inverted phase contrast microscope）で試験して明ら かとなる。これらのボールは、一週間（５−１１日）の経過で大きく膨張した。 いくつかのボールは、最初のウエル（工程３及び４）で現れたが、これらは非接 着性ウエル（工程４）と同じ大きさにまで大きくならなかった。このウエルは、 細胞密度が増すように、例えば、１ウエル分割を２−３ウエルに、継代培養する 必要がある。 ５．生育培養からの成熟樹枝状細胞を単離するために二つの異なる方法を用い た。一つの方法は、非接着性の細胞を除去し、１ｇの遠心沈降法でノンボールか らボールを分離するものである。樹枝状細胞は、その後、付加的に１−２日間培 養してボールから多数放出される。そして、成熟樹枝細胞を、公知の(Freudenth al and Steinman，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:7698-7702，1990)濃厚なメ トリツアミド上のフローテションでノンボールから単離した。第二の方法は、簡 単であるが、本質的にその処理の成長相を終止する。この第二の方法では、ボー ルが非常に大きい時、非接着性細胞を取り入れる。この細胞は、氷上に２０分間 残し、ボールを分離するようにピペットで激しく再浮遊させ、成熟樹枝状細胞を メトリツアミドコラム上に浮遊させた。 ６．樹枝状細胞子孫の免疫刺激活性を証明するために、補助細胞−枯渇Ｔ細胞 （混合白血球反応分析に対して２００，０００、ＭＬＲ；酸化有糸分裂誘発分析 に対して１５０，０００、ＯＸＭＩ）に、照射した細胞を段階的に投与（３倍の 段階希釈で３０−３０，０００）した。Ｔ細胞反応は、５日目（ＭＬＲ）又は２ 日目（ＯＸＭＩ）に３Ｈ−チミジンの１６ｈパルスで測定した。Ｔ細胞シミュレ ーション試験（酸化有糸分裂誘発と混合白血球反応）を１mg／mlのインドメタシ ンの存在下で実施した。３つのＭＬＲ試験で得られたデータは図１８Ａ、Ｂおよ びＣに示される。 Ｄ．結果 １．ＧＭ−ＣＳＦは本質的にシトキンである。Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＦ −３、またはシトキンでないものは、樹枝状細胞の発育を許さない。４００−８ ００Ｕ／mlでＧＭ−ＣＳＦは、ドナーが血液中の骨髄性祖先の数を増すようにＧ Ｍ―ＣＳＦまたはＧ―ＣＳＦのいずれかで処理するか否かに関係なく、最適であ る。１０−５０Ｕ／mlでＴＮＦαの添加は、通常、常ではなが、樹枝状細胞の収 量を二倍に増加する(Caux et al.，「腫瘍壊死因子アルファは、インターロイイ ン−３および顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子−誘発した、ヒト造血 ＣＤ３４＋始原細胞の増殖に強く作用する」Blood 2292-2298，1990)。図１８Ａ 、ＢおよびＣに記載される典型的な試験結果から明らかなように、ＴＮＦα補足 もまた、樹技状細胞子孫の機能を十分改良する。数個の試験では、ｒｈｕ ＩＬ −１α（５０ＬＡＦ単位／ml）が、培養の最後の２４時間の間に加えられた時、 更に機能の増強することが立証された。固形腫瘍または白血病／リンパ腫をもっ た患者からの組織での実験では、樹枝状細胞の生成に関して比較できる結果が得 られた。 ２．血液６０mlから出発し、ＧＭ−ＣＳＦだけの存在下で培養した後、代表的 な成熟免疫刺激性樹枝状細胞の収量は、６−１２×１０⁶個の細胞であった。こ れは全細胞の４０−８０％に相当する。この収量は、新鮮な血液６０mlの成熟樹 枝状細胞の収量（５％程度）より２０倍以上大きい(Proc．Natl．Acad．Sci．87 :7698-7702，1990)。 ３．この方法で生成した樹枝状細胞の表現形は、細胞がＨＬＡ−ＤＲ、ＭＨＣ クラスIIに対しては強く陽性であるが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４およびＢ細胞マーカ ー類には陰性であることを含む。 ４．この培養における顆粒球の発育は樹枝状細胞の純度を下げる。典型的には 、これらの顆粒球ボールは接着性がより強く、上記実験記録の日２移転法で後に 残せる。仮にこれらの接着性顆粒球コロニーが再び現れても、簡単な移転で、成 長する樹技状細胞を他のウエルに移すことができる。実施例７ 他の樹枝状細胞前駆体源を実施例６に記載の方法で試験した。 ａ）２人の患者用に、骨髄の少量の試料を準備した。上述の方法を適応した時 、樹枝状細胞ボールと成熟免疫刺激性樹枝状細胞が大量に形成された。 ｂ）７人の正常なドナーからの血液を実施例６記載の方法を用いて評価した。 ボールの数はたいしたものではなかった（２×１０⁶個の細胞のウエル当たり１ ０−２０）であったが、正常血液の使用は明らかに容易で、マウス血液や骨髄に 比べて、前述（コメント５）したように顆粒球コロニーが形成されないという利 点がある(J．Exp．Med．175:1157-1167，1992 vs．J．Exp．Med．176:1693-1702 ，1992)。 ｃ）胎児又は臍帯血液も試験した。これは成人血液より非常に多量の祖先細胞 を含むからである。ＣＤ３４⁺祖先の数はなお小さい（約１％）ので、我々は、 ＣＤ３４⁺細胞を最初に精製しないという上記簡易法で試験した。ＤＣボールは 既に誘発された。ただし、毒性ある赤血球は枯渇させた。抗−赤血球性モノクロ ナルＶＩＥ−Ｇ４（Dr．W．Knapp，Viennaにより提供された）をパニング工程（ 工程２）に加え、パニング後Lymphoprep（工程１）に付加的なフローテーション を使用。臍帯血液からの樹枝状細胞の収量は、上記方法に記載されたものと大体 対応するものである（１−５×１０⁶樹枝状細胞、メトリツアミドフローデショ ン工程なしに、４０mlの臍帯血液から全細胞の２０−４０％に相当する）上記ボ ールはより接着性があり、樹枝状細胞を成人血液と対比してＣＤ１ａと表す。 我々は本発明の多くの具体例を上に述べたが、基本的な構成を変化させて、本 発明の方法及び組成物を利用する他の具体例を提供することも可能である。従っ て、本発明の範囲は、実施例として上に述べた特定の具体例によるのではなく、 添付の請求の範囲によって規定されるものであることを認識されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／０４０，６７７ (32)優先日 平成５年３月31日(1993．3．31) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ (72)発明者 スタインマン，ラルフ，エム. アメリカ合衆国、コネチカット州 06889、 ウエストポート、ノース アベニュー 62 (72)発明者 稲葉 カヨ 京都府京都市左京区田中東樋ノ口町11番地 の２ (72)発明者 シュレル，ゲロルト オーストリア共和国、アー−6020 インス ブルック、フィッシュナーレルシュトラー セ 21／15デー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）樹枝状細胞前駆体を含む組織源を準備し、 （ｂ）（ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、 インビトロ培養に適した細胞集団を得、 （ｃ）ＧＭ―ＣＳＦを含む培養培地中の基体上で、この細胞源を培養して、 非付着性細胞および細胞集団を得、 （ｄ）この非付着性細胞および細胞集団を継代培養して増殖する樹枝状細胞 前駆体を含む細胞凝集体を製造し、 （ｅ）この細胞凝集体を一回以上順次継代培養して樹枝状細胞前駆体の比率 を増加させることを特徴とする増殖している細胞培養物から樹枝状細胞の集団 を製造する方法。 ２．上記組織源が血液または骨髄であり、ＧＭ―ＣＳＦが約１−１０００Ｕ／ml の濃度で上記培地中に存在する請求項１の方法。 ３．上記組織源が骨髄である時、処理工程（ｂ）が、更に、補体を含む媒体中で 樹枝状細胞前駆体上に存在しない抗原に対する特異抗体と、骨髄を接触するこ とによって、樹枝状細胞前駆体上で発現されない抗原を発現する細胞を殺す工 程を含む請求項２の方法。 ４．上記組織源が骨髄で、上記抗体が、Ｉａ抗原、Ｔ細胞上に存在する抗原およ び成熟樹枝状細胞上に存在する抗原からなる群から選ばれる一個以上の抗原に 対するものである請求項３の方法。 ５．上記骨髄が、約５００−１０００Ｕ／mlの濃度のｒＧＭ―ＣＳＦで培養され る請求項４の方法。 ６．Ｉａ−陰性骨髄非リンパ球が約５×１０⁵細胞／cm²の濃度で培養される請求 項５の方法。 ７．抗−Ｉａ抗原抗体と抗−Ｔ細胞、Ｂ細胞および単核細胞抗体が、ＧＫ1.5抗 −ＣＤ４、Ｈｏ2.2抗−ＣＤ８、Ｂ２１−２抗−Ｉａ、およびＲＡ３−３Ａ１ ／6.1抗−Ｂ２２０／ＣＤ４５Ｒからなる群から選ばれる請求項６の方法。 ８．工程（ｅ）の細胞凝集体が１ないし５回連続して継代培養されている請求項 ３の方法。 ９．上記細胞凝集体が２ないし３回連続して継代培養されている請求項８の方法 。 10.上記細胞凝集体が２回連続して継代培養されている請求項９の方法。 11.工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を約0.3ないし１日の後に、継代培 養し、上記細胞凝集体を全て３ないし３０日連続して継代培養する請求項３の 方法。 12.上記細胞凝集体を全て１０ないし２０日連続して継代培養する請求項１１の 方法。 13.上記細胞凝集体を全て２０日連続して継代培養する請求項１２の方法。 14.上記細胞源が血液または骨髄で、工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団 を約0.3ないし１日の後に、継代培養し、上記細胞凝集体を全て３ないし３０ 日連続して継代培養する請求項３の方法。 15.工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を約半日後に、継代培養し、上記 細胞凝集体を２０日後に二度連続して継代培養する請求項１４の方法。 16.上記培養培地が、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭおよびα−ＭＥＭからなる群 から選ばれるものであり、かつ上記培養培地が血清で補足されている請求項３ の方法。 17.牛胎児の血清が上記培養培地に約１〜１５％の量で存在する請求項１６の方 法。 18.牛胎児の血清が上記培養培地に約１０％の量で存在する請求項１７の方法。 19.上記細胞源が血液で、培地中のＧＭ―ＣＳＦ濃度が約３０−１００Ｕ／mlで ある請求項１４の方法。 20.上記細胞源が骨髄で、培地中のＧＭ―ＣＳＦ濃度が約５００−１０００Ｕ／ mlである請求項１４の方法。 21．（ａ）樹枝状細胞前駆体を含む組織源を準備し、 （ｂ）（ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、 インビトロ培養に適した細胞集団を得、 （ｃ）ＧＭ―ＣＳＦを含む培養培地中の基体上で、この細胞源を培養して、 非付着性細胞および細胞集団を得、 （ｄ）この非付着性細胞および細胞集団を継代培養して増殖する樹枝状細胞 前駆体を含む細胞凝集体を製造し、 （ｅ）この細胞凝集体を一回以上順次継代培養して、樹枝状細胞前駆体の比 率を増加させ、 （ｆ）この樹枝状細胞前駆体を、それらを成熟樹枝状細胞に熟成させるに充 分な時間、培養し続けることを特徴とする増殖している細胞培養物から成熟樹 枝状細胞の集団を製造する方法。 22.上記組織源が血液または骨髄であり、ＧＭ―ＣＳＦが約１−１０００Ｕ／ml の濃度で上記培地中に存在する請求項２１の方法。 23.上記組織源が骨髄である時、全処理段階で、補体を含む媒体中で樹枝状細胞 前駆体上に存在しない抗原に対する特異抗体と、骨髄を接触することによって 、樹枝状細胞前駆体上で発現されない抗原を発現する細胞を殺す工程を含む請 求項２１の方法。 24.上記組織源が骨髄で、上記抗体が、Ｉａ抗原、Ｔ細胞上に存在する抗原およ び成熟樹枝状細胞上に存在する抗原からなる群から選ばれる一個以上の抗原に 対するものである請求項２３の方法。 25.上記骨髄が、約５００−１０００Ｕ／mlの濃度のｒＧＭ―ＣＳＦで培養され る請求項２４の方法。 26．Ｉａ−陰性骨髄非リンパ球が細胞濃度約５×１０⁵／cm²で培養される請求項 ２５の方法。 27.抗−Ｉａ抗原抗体と抗−Ｔ細胞、Ｂ細胞および単核細胞抗体が、ＧＫ1.5抗− ＣＤ４、Ｈｏ2.2抗−ＣＤ８、Ｂ２１−２抗−Ｉａ、およびＲＡ３−３Ａ１／6 .1抗−Ｂ２２０／４５Ｒからなる群から選ばれる請求項２５の方法。 28.工程（ｅ）の細胞凝集体が１ないし５回連続して継代培養されている請求項 ２１の方法。 29.上記細胞凝集体が２ないし３回連続して継代培養されている請求項２８の方 法。 30.上記細胞凝集体が２回連続して継代培養されている請求項２９の方法。 31.工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を、約0.3ないし１日の後に、継 代培養し、上記細胞凝集体を全て３ないし３０日連続して継代培養する請求項 ２１の方法。 32.上記細胞凝集体を全て１０ないし２０日連続して継代培養する請求項３１の 方法。 33.上記細胞凝集体を全て２０日連続して継代培養する請求項３２の方法。 34.上記細胞凝集体を１ないし５回連続して継代培養する請求項３１の方法。 35.工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を約半日後に、継代培養し、上記 細胞凝集体を２０日後に二度連続して継代培養する請求項２９の方法。 36.上記培養培地が、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭおよびα−ＭＥＭからなる群 から選ばれるものであり、かつ上記培養培地が血清で補足されている請求項２ １の方法。 37.牛胎児の血清が上記培養培地に約１〜１５％の量で存在する請求項３６の方 法。 38.牛胎児の血清が上記培養培地に約１０％の量で存在する請求項３７の方法。 39.上記細胞源が血液で、培地中にＧＭ―ＣＳＦが約３０−１００Ｕ／mlの濃度 で存在する請求項２１の方法。 40.上記細胞源が骨髄で、培地中にＧＭ―ＣＳＦが約５００−１０００Ｕ／mlの 濃度で存在する請求項２１の方法。 41.抗原を請求項２１、３９または４０のいずれかの方法で得た樹枝状細胞の集 団に曝し、抗原−活性化した樹枝状細胞を製造し、次いで、この抗原−活性化 した樹枝状細胞をホストに接種することを特徴とするホストに抗原を付与する 方法。 42.ホストが人間である請求項４１の方法。 43.請求項２１、３９または４０のいずれかの方法で調製された樹枝状細胞を含 む組成物。 44.請求項２１で調製された樹枝状細胞が抗原でパルスされ、樹枝状細胞が上記 抗原を処理し、この樹枝状細胞で発現される変性された抗原を製造することを 特徴とする抗原−活性化した樹枝状細胞を含む組成物。 45.変性さるべき基体を、請求項２１、３９または４０のいずれかの方法で得た 樹枝状細胞の集団に曝し、この基体を樹技状細胞で変性し、変性した抗原を製 造することを特徴とする樹枝状細胞変性した抗原を含む組成物。 46.請求項４４の組成物を含むワクチンを投与することを特徴とする人間または 動物の病気に対して免疫にする方法。 47.請求項４４の組成物を含むワクチン。 48.請求項４５の組成物を含むワクチンを投与することを特徴とする人間または 動物の病気に対して免疫にする方法。 49.請求項４５の組成物を含むワクチン。 50.請求項４４の組成物の治療効果のある量を治療の必要な人に投与するもので 、変性さるべき抗原が自己−蛋白質であることを特徴とする自己免疫疾患を治 療する方法。 51.請求項４５の組成物の治療効果のある量を治療の必要な人に投与するもので 、変性さるべき抗原が自己−蛋白質であることを特徴とする自己免疫疾患を治 療する方法。 52.自己免疫疾患が、多発硬化症、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎および若年 糖尿病からなる群から選ばれる請求項５０の方法。 53.自己免疫疾患が、多発硬化症および若年糖尿病からなる群から選ばれる請求 項５１の方法。 54.請求項１の方法で調製される樹枝状細胞前駆体。 55.組織源が血液または骨髄である請求項４６による樹枝状細胞前駆体。 56.組織源が血液である請求項５５による樹枝状細胞前駆体。 57.組織源が骨髄である請求項４７による樹枝状細胞前駆体。 58.組織源が人間の血液で、培地中にＧＭ―ＣＳＦが約４００−８００Ｕ／mlの 濃度で存在する請求項２の方法。 59.ＴＮＦ−α、Ｇ―ＣＳＦ、ＩＬ―１およびＩＬ―３からなる群から選ばれる 一個以上のファクターが、培養培地中に存在する請求項５８の方法。 60.組織源が人間の血液で、培地中にＧＭ―ＣＳＦが約４００−８００Ｕ／mlの 濃度で存在する請求項１４の方法。 61.ＴＮＦ−α、Ｇ―ＣＳＦ、ＩＬ―１およびＩＬ―３からなる群から選ばれる 一個以上のファクターが、培養培地中に存在する請求項６０の方法。 62.組織源が人間の血液で、培地中にＧＭ―ＣＳＦが約４００−８００Ｕ／mlの 濃度で存在する請求項２２の方法。 63.ＴＮＦ−α、Ｇ―ＣＳＦ、ＩＬ―１およびＩＬ―３からなる群から選ばれる 一個以上のファクターが、培養培地中に存在する請求項６２の方法。 64.上記細胞が人間の血液から得られ、約４００−８００Ｕ／mlの濃度のＧＭ− ＣＳＦの存在下で培養される請求項５６による樹枝状細胞前駆体。 65.抗原から抗原フラグメントを調製する方法で、樹枝状細胞および樹枝状細胞 前駆体からなる群から選ばれる細胞と抗原を接触させ、該細胞が抗原をフラグ メントに加工し、細胞表面に抗原フラグメントが存在するに充分な時間、該細 胞と抗原を培養することを特徴とする抗原から抗原フラグメントを調製する方 法。 66.樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体が血液または骨髄から得られたものであ る請求項６５の方法。 67.樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体が血液から得られたものである請求項６ ６の方法。 68.樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体が人間の血液から得られ、約４００−８ ００Ｕ／mlの濃度のＧＭ―ＣＳＦの存在下で培養されたものである請求項６７ の方法。 69.抗原が樹枝状細胞前駆体により食作用を受ける請求項６５の方法。 70.抗原がミコバクテリア抗原、バクテリア抗原およびウイルス抗原からなる群 から選ばれる請求項６９の方法。 71.抗原がミコバクテリア結核菌である請求項７０の方法。 72.ミコバクテリア結核菌がＢＣＧである請求項７１の方法。 73.請求項６５の方法で調製された抗原フラグメント。 74.抗原が食作用を受ける請求項７３の抗原フラグメント。 75.抗原がミコバクテリア抗原、バクテリア抗原またはウイルス抗原からなる群 から選ばれる請求項７４の抗原フラグメント。 76.抗原がミコバクテリア結核菌抗原である請求項７５の抗原フラグメント。 77.ミコバクテリア結核菌がＢＣＧである請求項７６の抗原フラグメント。 78.抗原が樹技状細胞前駆体により食作用を受けるウイルスベクターである請求 項７５の抗原フラグメント。 79.請求項７７の抗原フラグメントの治療効果ある量を投与することを特徴とす る結核の治療法。 80.組織源が、個人から組織源を取り出す前に造血を刺激するような物質で前処 理された個人から得られたものである請求項１の方法。 81.造血物質がＧＭ―ＣＳＦおよびＧ―ＣＳＦからなる群から選ばれる請求項８ ０の方法。