ES2845203T3 - Sistema de análisis de antígenos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para identificar un antígeno tumoral, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una biblioteca que comprende células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli, donde cada célula bacteriana de la biblioteca comprende un polipéptido heterólogo expresado en una célula tumoral; (b) poner en contacto las células bacterianas con una primera pluralidad de células humanas que comprende células presentadoras de antígenos humanos profesionales que internalizan las células bacterianas; (c) poner en contacto la primera pluralidad de células humanas con una segunda pluralidad de linfocitos humanos que están recién aislados; recién aislados y congelados hasta su uso; o recién aislados y estimulados para que proliferen in vitro de una manera no específica de antígeno, en condiciones en las que los linfocitos son estimulados por polipéptidos presentados por la primera pluralidad de células humanas; y (d) determinar si un linfocito de la segunda pluralidad de linfocitos humanos es estimulado por un polipéptido heterólogo presentado por una célula de la primera pluralidad de células humanas, donde la estimulación de un linfocito de la segunda pluralidad de linfocitos humanos por un polipéptido heterólogo presentado por una célula de la primera pluralidad de células humanas indica que el polipéptido heterólogo es un antígeno tumoral.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de análisis de antígenos

Antecedentes de la invención

A pesar de los avances en el desarrollo de vacunas y terapias antimicrobianas, las enfermedades infecciosas continúan estando muy extendidas. A nivel nacional, al menos 45 millones de personas de 12 años o más, o uno de cada cinco adolescentes y adultos, han tenido una infección por herpes genital. La prevalencia del virus del herpes simple -2 (HSV-2) está aumentando en todo el mundo y ahora hay pruebas que lo relacionan con la transmisión del VIH. El VIH ha infectado a 40 millones de personas hasta la fecha y causa entre 2 y 3 millones de muertes cada año (Programa Conjunto de las Naciones Unidas sobre el VIH/SIDA, Informe sobre la epidemia mundial de SIDA de 2006, Capítulo 2, 2006). En 2005 se notificaron nueve millones de nuevos casos de tuberculosis, con 1,6 millones de muertes solo en ese año (Young y col, Clin Invest. 118(4): 1255- 1265, 2008). La malaria causa enfermedad en cientos de millones y mata de 1 a 3 millones cada año (Snow y col., Nature 434 (7030):214-7, 2005). Los esfuerzos para limitar la propagación de estos y otros patógenos y controlar sus efectos devastadores en las poblaciones humanas requieren vacunas eficaces. Sigue existiendo la necesidad de mejorar las vacunas y de sistemas para desarrollarlas.

La eficacia de muchas vacunas actuales radica en su capacidad para provocar respuestas sólidas de anticuerpos. Sin embargo, la inmunidad mediada por células T es importante para la protección contra muchos tipos de infecciones, incluidas aquellas para las que no se dispone de una vacuna eficaz. Las células T CD4+ orquestan respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células in vivo. Las células T CD8+ son críticas para el control de patógenos intracelulares. La identificación de antígenos que provocan respuestas mediadas por células T ha sido técnicamente más laboriosa que la caracterización de antígenos humorales.

El documento US 2005/112576, EP 1715346, y Goodall, J. C. y col., Eur J Immunol (2001), 31 (5):1513-1522 describen procedimientos de análisis de antígenos usando líneas/clones de células T establecidas con especificidades definidas para las cuales se han seleccionado como lectura.

Resumen de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Se describen, entre otros, procedimientos para identificar antígenos de linfocitos humanos, así como composiciones que incluyen los antígenos y procedimientos para usar los antígenos, también se describen procedimientos para evaluar una respuesta inmunitaria en un sujeto humano, por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico.

Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la presente descripción se refiere a procedimientos para identificar antígenos. En determinadas realizaciones, los procedimientos incluyen (a) proporcionar una biblioteca de células (por ejemplo, células bacterianas), donde cada célula de la biblioteca incluye un polipéptido heterólogo; (b) poner en contacto las células con una primera pluralidad de células humanas que comprende células presentadoras de antígeno humano que internalizan las células de la biblioteca; (c) poner en contacto la primera pluralidad de células humanas con una segunda pluralidad de células humanas, cuya segunda pluralidad incluye linfocitos humanos (p. ej., células T, como células T CD4+, células T CD8+), en condiciones en las que los linfocitos son estimulados por polipéptidos presentados por la primera pluralidad de células humanas; y (d) determinar si un linfocito de la segunda pluralidad de células humanas es estimulado por un polipéptido heterólogo presentado por una célula de la primera pluralidad de células humanas. La estimulación de un linfocito por un polipéptido heterólogo indica que el polipéptido heterólogo es un antígeno.

En algunas realizaciones, las células de la biblioteca incluyen un polipéptido de citolisina, tal como listeriolisina O (LLO). En algunas realizaciones, las células de la primera y segunda pluralidad incluyen células primarias (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (CMSP) primaria). En algunas realizaciones, las células de la primera y segunda pluralidad incluyen células del mismo individuo. En algunas realizaciones, el individuo es un individuo que ha estado expuesto a un agente infeccioso, y los polipéptidos heterólogos son polipéptidos codificados por el agente infeccioso o una especie relacionada del mismo. En algunas realizaciones, el individuo es un individuo que tiene o ha tenido cáncer o una enfermedad autoinmune.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Breve Descripción del Dibujo

La Figura 1 es un gráfico que muestra el IFNy secretado en los sobrenadantes por células T CD8+ humanas cocultivadas con células presentadoras de antígeno autólogas pulsadas con E. coli que expresa listeriolisina O citoplásmica y polipéptidos codificados por el virus del herpes simple-2 (HSV-2) (clones virales individuales). Cada barra representa los niveles de IFNy secretados por células T expuestas a células presentadoras de antígenos que tenían células de la biblioteca internalizadas que expresan un único polipéptido viral. Las barras negras representan clones que también habían sido identificados previamente por otros procedimientos.

Definiciones

Antígeno: El término «antígeno», como se emplea en esta memoria, se refiere a una molécula (por ejemplo, un polipéptido) que provoca una respuesta inmunitaria específica. Respuestas inmunológicas específicas de antígeno, también conocidas como respuestas inmunitarias adaptativas, son mediadas por linfocitos (p. ej., Células T, células B) que expresan receptores de antígenos (p. ej., Receptores de células T, receptores de células B). En determinadas realizaciones, un antígeno es un antígeno de células T y provoca una respuesta inmunitaria celular. En determinadas realizaciones, un antígeno es un antígeno de células B y provoca una respuesta humoral (es decir, un anticuerpo). En determinadas realizaciones, un antígeno es tanto un antígeno de células T como un antígeno de células B. Como se emplea en esta memoria, el término "antígeno" abarca tanto un polipéptido de longitud completa como una porción del polipéptido y un epítopo peptídico dentro de los polipéptidos (por ejemplo, un epítopo peptídico unido por una molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) (por ejemplo, CMH clase I o CMH clase II).

Célula presentadora de antígeno: Una «célula presentadora de antígeno» o «CPA» se refiere a una célula que presenta péptidos en moléculas de CMH de clase I y/o de CMH de clase II. Las CPA incluyen tanto CPA profesionales (p. ej., células dendríticas, macrófagos, células B), que tienen la capacidad de estimular linfocitos sin tratar, como CPA no profesionales (p. ej., fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, células gliales). En determinadas realizaciones, las CPA son capaces de internalizar (por ejemplo, endocitosa) miembros de una biblioteca (por ejemplo, células de una biblioteca de células bacterianas) que expresan polipéptidos heterólogos como antígenos candidatos.

Polipéptido de autolisina: Un «polipéptido de autolisina» es un polipéptido que facilita o media la autólisis de una célula (por ejemplo, una célula bacteriana) que ha sido internalizada por una célula eucariota. En algunas realizaciones, un polipéptido de autolisina es un polipéptido de autolisina bacteriano. Los polipéptidos de autolisina incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos cuyas secuencias se describen en GenBank® con los números de acceso NP_388823.1, NP_266427.1 y P0AGC3.1.

Polipéptido de citolisina: Un «polipéptido de citolisina» es un polipéptido que tiene la capacidad de formar poros en la membrana de una célula eucariota. Un polipéptido de citolisina, cuando se expresa en una célula huésped (p. ej., una célula bacteriana) que ha sido internalizado por una célula eucariota, facilita la liberación de componentes de la célula huésped (p. ej., macromoléculas de la célula huésped, como polipéptidos de la célula huésped) en el citosol de la célula internalizadora. En algunas realizaciones, un polipéptido de citolisina es un polipéptido de citolisina bacteriana. En algunas realizaciones, un polipéptido de autolisina es un polipéptido de citolisina citoplasmático. Polipéptidos de citolisina incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos cuyas secuencias se describen en la Patente EE.UU. No.

6.004.815, y en GenBank® bajo Nos. Acc. NP_463733.1, NP_979614, NP_834769, YP_084586, YP_895748, YP_694620, YP_012823, NP_346351, YP_597752, BAB41212.2, NP_561079.1 e YP_001198769.

Polipéptido de citolisina citoplasmática: Un «polipéptido de citolisina citoplasmática» es un polipéptido de citolisina que tiene la capacidad de formar poros en una membrana de una célula eucariota y que se expresa como un polipéptido citoplásmico en una célula bacteriana. Un polipéptido de citolisina citoplasmática no es secretado de forma significativa por una célula bacteriana. Polipéptidos de citolisina citoplasmática pueden proporcionarse por diversos medios. En algunas realizaciones, un polipéptido de citolisina citoplasmática tiene una secuencia que está alterada con respecto a la secuencia de un polipéptido de citolisina secretada (por ejemplo, alterada por deleción o alteración de una secuencia señal para hacerla no funcional). En algunas realizaciones, un polipéptido de citolisina citoplásmica es citoplasmático porque se expresa en una célula incompetente para la secreción. En algunas realizaciones, un polipéptido de citolisina citoplasmática es citoplásmico porque se expresa en una célula que no reconoce ni media la secreción de una secuencia señal unida al polipéptido de citolisina. En algunas realizaciones, un polipéptido de citolisina citoplasmática es un polipéptido de citolisina bacteriana.

Heterólogo: El término «heterólogo», como se emplea en esta memoria para referirse a genes o polipéptidos, se refiere a un gen o polipéptido que no se encuentra naturalmente en el organismo en el que está presente y/o se expresa, y/o que se ha introducido en el organismo por la mano del hombre. Polipéptidos heterólogos usados de acuerdo con la presente descripción son típicamente polipéptidos de agentes infecciosos. En algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo expresado en una célula huésped bacteriana es un polipéptido codificado por una especie bacteriana que es diferente de la especie de la célula huésped bacteriana. En algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo expresado en una célula huésped bacteriana es un polipéptido codificado por un virus. Cuando una pluralidad de polipéptidos heterólogos diferentes debe introducirse y/o expresarse en células (por ejemplo, una biblioteca de células), los diferentes polipéptidos pueden ser todos del mismo agente infeccioso (por ejemplo, de una única especie bacteriana o viral). En algunas realizaciones, los diferentes polipéptidos son de más de un agente infeccioso (por ejemplo, de dos especies bacterianas, dos especies virales o una especie bacteriana y una especie viral). En algunasrealizaciones, la pluralidad de polipéptidos diferentes representa polipéptidos de un conjunto completo de marcos de lectura abiertos (MLA) expresados por un agente infeccioso.

Polipéptido de invasina: Un «polipéptido de invasina» es un polipéptido que facilita o media la captación de una célula (por ejemplo, una célula bacteriana) por una célula eucariota. La expresión de un polipéptido de invasina en una célula bacteriana no invasiva confiere a la célula la capacidad de entrar en una célula eucariota. En algunas realizaciones, un polipéptido de invasina es un polipéptido de invasina bacteriano. En algunas realizaciones, un polipéptido de invasina es un polipéptido de invasina de Yersinia (por ejemplo, un polipéptido de invasina de Yersinia que comprende una secuencia descrita en GenBank® bajo No. Acc. YP_070195.1).

Listeriolisina O (LLO): Los términos «listeriolisina O» o «LLO» se refieren a un polipéptido de listeriolisina O de Listeria monocytogenes y formas truncadas del mismo que retienen la capacidad de formación de poros (por ejemplo, formas citoplásmicas de LLO, incluidas las formas truncadas que carecen de una secuencia señal). En algunas realizaciones, una LLO es una LLO citoplásmica. Secuencias de LLO ejemplares se muestran en la Tabla 1, más abajo.

Polipéptido: El término «polipéptido», como se emplea en esta memoria, en general tiene su significado reconocido en la técnica de un polímero de al menos tres aminoácidos. Los expertos en la técnica apreciarán, sin embargo, que el término «polipéptido» pretende ser lo suficientemente general como para abarcar no solo los polipéptidos que tienen la secuencia completa mencionada en esta invención (o en una referencia o base de datos mencionada específicamente en esta invención), sino también para abarcar polipéptidos que representan fragmentos funcionales (es decir, fragmentos que retienen al menos una actividad) de dichos polipéptidos completos. Además, los expertos en la técnica comprenden que las secuencias de proteínas en general toleran alguna sustitución sin destruir la actividad. Por lo tanto, cualquier polipéptido que retenga actividad y comparta al menos aproximadamente 30-40% de identidad de secuencia general, a menudo más de aproximadamente 50%, 60%, 70% u 80%, y además usualmente incluye al menos una región de identidad mucho mayor, a menudo más del 90% o incluso del 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en una o más regiones altamente conservadas, que generalmente abarcan al menos 3-4 y, a menudo, hasta 20 o más aminoácidos, con otro polipéptido de la misma clase, se engloba dentro del término relevante «polipéptido» como se emplea en esta memoria. Los expertos en la técnica pueden determinar otras regiones de similitud y/o identidad mediante el análisis de las secuencias de varios polipéptidos.

Células primarias: Como se emplea en esta memoria, «células primarias» se refiere a células de un organismo que no se han inmortalizado in vitro. En algunas realizaciones, las células primarias son células extraídas directamente de un sujeto (por ejemplo, un ser humano). En algunas realizaciones, las células primarias son progenie de células tomadas de un sujeto (por ejemplo, células que se han pasado in vitro). Las células primarias incluyen células que han sido estimuladas para proliferar en cultivo.

Especies relacionadas: Como se emplea en esta memoria, una especie está «relacionada» con otra especie si pertenece a la misma familia o género y/o si los antígenos de la especie provocan una respuesta inmunitaria de reacción cruzada en un individuo. En algunas realizaciones, las células de un individuo que ha estado expuesto a un agente infeccioso se utilizan para identificar un antígeno del agente infeccioso o una especie relacionada del mismo. Por ejemplo, las células de un individuo que ha estado expuesto a una primera especie de herpesvirus pueden seleccionarse frente a células que expresan antígenos candidatos de la primera especie de herpesvirus, o una segunda especie de herpesvirus relacionada.

Estimular: Como se emplea en esta memoria, un péptido presentado por una célula presentadora de antígeno «estimula» un linfocito si el linfocito se activa detectablemente después de la exposición al péptido/CPA en condiciones que permiten que se produzca el reconocimiento específico del antígeno. Cualquier indicador de activación de linfocitos se puede evaluar para determinar si un linfocito está estimulado (por ejemplo, proliferación, secreción de citocinas, cambio en la expresión de uno o más marcadores de activación).

Descripción detallada de determinadas realizaciones de la invención

La presente invención proporciona sistemas para la identificación rápida de antígenos tumorales que provocan inmunidad de células T y, en particular, que provocan inmunidad de células T humanas. La presente descripción permite el análisis de proteomas completos de agentes infecciosos y es particularmente poderosa ahora que están disponibles genomas completos para cientos de tales agentes infecciosos. Por tanto, la presente invención resuelve el desafío final en el desarrollo de vacunas: la identificación de antígenos que provocan inmunidad de células T en humanos.

Generación de bibliotecas

Una biblioteca es una colección de miembros (por ejemplo, células o partículas no celulares, como partículas de virus, liposomas o perlas (por ejemplo, perlas recubiertas con polipéptidos, como polipéptidos traducidos in vitro, p. ej., perlas de afinidad, p. ej. perlas recubiertas de anticuerpo, o perlas de NTA-Ni unidas a polipéptidos de interés). En función de la presente descripción, los miembros de una biblioteca incluyen (p. ej., expresan internamente) polipéptidos heterólogos. En algunas realizaciones, los miembros de una biblioteca que son células expresan internamente polipéptidos heterólogos. En algunas realizaciones, los miembros de una biblioteca que son partículas incluyen internamente y/o están unidos a polipéptidos heterólogos. El uso de una biblioteca en un sistema de ensayo permite la evaluación simultánea in vitro de respuestas celulares a múltiples antígenos candidatos. Los miembros de la biblioteca se construyen para incluir (por ejemplo, expresar internamente) polipéptidos heterólogos de un agente infeccioso o célula diana de interés (por ejemplo, una célula tumoral o una célula que es una diana de una respuesta autoinmune). Según la presente invención, se diseña una biblioteca para ser internalizada por células presentadoras de antígenos humanos de modo que los péptidos de los miembros de la biblioteca, incluidos los péptidos de polipéptidos heterólogos expresados internamente, se presenten en moléculas de CMH de las células presentadoras de antígenos para su reconocimiento por células T.

Las bibliotecas se pueden usar en ensayos que detectan péptidos presentados por moléculas de CMH clase I y CMH clase II humanas. Los polipéptidos expresados por los miembros de la biblioteca internalizada se digieren en compartimentos endocíticos intracelulares (por ejemplo, fagosomas, endosomas, lisosomas) de las células humanas y se presentan en moléculas de CMH de clase II, que son reconocidas por células T CD4+ humanas. En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen un polipéptido de citolisina, además del polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen un polipéptido de invasina, además del polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen un polipéptido de autolisina, además del polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, a los miembros de la biblioteca se les proporcionan células que expresan un polipéptido de citolisina (es decir, la citolisina y el polipéptido heterólogo no se expresan en la misma célula, y una célula presentadora de antígenos se expone a miembros que incluyen la citolisina y miembros que incluyen el polipéptido heterólogo, tal que la célula presentadora de antígeno internalice ambos, y tal que la citolisina facilite el suministro de polipéptidos heterólogos a la ruta del CMH de clase I de la célula presentadora de antígeno). Un polipéptido de citolisina puede expresarse de forma constitutiva en una célula o puede estar bajo el control de un sistema de expresión inducible (por ejemplo, un promotor inducible). En algunas realizaciones, una citolisina se expresa bajo el control de un promotor inducible para minimizar la citotoxicidad en la célula que expresa la citolisina.

Una vez internalizado por una célula humana, un polipéptido de citolisina perfora los compartimentos intracelulares de la célula humana, lo que permite que los polipéptidos expresados por los miembros de la biblioteca obtengan acceso al citosol de la célula humana. Los polipéptidos liberados en el citosol se presentan en moléculas de CMH de clase I, que son reconocidas por las células T CD8+.

Una biblioteca puede estar comprendida por cualquier tipo de célula o partícula que pueda ser internalizada por un polipéptido heterólogo (y un polipéptido de citolisina, en aplicaciones donde es deseable un polipéptido de citolisina) a células presentadoras de antígeno para su uso en los procedimientos descritos en esta invención. Aunque el término «célula» se usa en toda la presente memoria descriptiva para hacer referencia a un miembro de la biblioteca, se entiende que, en algunas realizaciones, el miembro de la biblioteca es una partícula no celular, como una partícula de virus, un liposoma o una perla. En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen polinucleótidos que codifican el polipéptido heterólogo (y el polipéptido de citolisina) y pueden inducirse para que expresen el polipéptido heterólogo (y el polipéptido de citolisina) antes y/o durante la internalización por las células presentadoras de antígenos. En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen células bacterianas. En determinadas realizaciones, la biblioteca incluye células bacterianas no patógenas y no virulentas. Ejemplos de bacterias para su uso como miembros de la biblioteca incluyen E. coli, micobacterias, Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Bacillus subtilis o Salmonella.

En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen células eucariotas (por ejemplo, células de levadura). En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen virus (por ejemplo, bacteriófagos). En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen liposomas. Los procedimientos para preparar liposomas que incluyen una citolisina y otros agentes se describen en Kyung-Dall y col., Patente EE.UU. N° 5.643.599. En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca incluyen perlas. Procedimientos para preparar bibliotecas comprendidas de perlas se describen, por ejemplo, en Lam y col., Nature 354: 82-84, 1991, Patentes EE.UU. Nos. 5.510.240 y 7.262.269, y las referencias allí citadas.

En determinadas realizaciones, se construye una biblioteca clonando polinucleótidos que codifican marcos de lectura abiertos de un agente infeccioso o célula diana, o porciones de los mismos, en vectores que expresan los MLA en células de la biblioteca. Los polinucleótidos se pueden clonar diseñando cebadores que amplifiquen los MLA. Los cebadores se pueden diseñar utilizando software disponible, como Primer3Plus (disponible en la siguiente URL: bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi; ver Rozen y Skaletsky, en: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in MolecularBiology. Humana Press, Totowa, NJ, pp. 365-386, 2000). Los expertos en la técnica conocen otros procedimientos para diseñar cebadores. En algunas realizaciones, los cebadores se construyen para producir polipéptidos que están truncados y/o carecen de regiones hidrófobas (por ejemplo, secuencias señal o regiones transmembrana) para promover una expresión eficaz. La ubicación de las secuencias señal predichas y los sitios de escisión de la secuencia señal predicha en una secuencia MLA determinada se puede determinar usando software disponible, ver, por ejemplo,Dyrlov y col., J. Mol. Biol., 340:783-795, 2004, y la siguiente URL: cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Por ejemplo, si se predice que ocurrirá una secuencia señal en los 20 aminoácidos N-terminales de una secuencia polipeptídica dada, se diseña un cebador para hibridar con una secuencia codificante cadena abajo de los nucleótidos que codifican los 20 aminoácidos N-terminales, de manera que la secuencia amplificada codifica un producto que carece de esta secuencia señal.

Los cebadores también pueden diseñarse para incluir secuencias que faciliten las etapas de clonación posteriores. MLA se pueden amplificar directamente a partir de ADN genómico (por ejemplo, ADN genómico de un agente infeccioso) o de polinucleótidos producidos por transcripción inversa (RT-PCR) de ARNm expresados por el agente infeccioso. RT-PCR de ARNm es útil, por ejemplo, cuando la secuencia genómica de interés contiene regiones intrónicas. MLA amplificados por PCR se clonan en un vector apropiado y el tamaño, la secuencia y la expresión de los MLA se pueden verificar antes de su uso en ensayos inmunológicos.

En algunas realizaciones, una secuencia de MLA se une a una secuencia que codifica una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de epítopo N-terminal o C-terminal). Las etiquetas de epítopo facilitan la purificación de los MLA expresados y pueden permitir que uno verifique que un MLA dado se expresa correctamente en una biblioteca de células huésped, por ejemplo, antes de usar la célula en un análisis. Las etiquetas de epítopo útiles incluyen, por ejemplo, una etiqueta de polihistidina (His), una etiqueta de epítopo V5 de la proteína P y V de paramixovirus, una etiqueta de hemaglutinina (HA), una etiqueta myc y otras. En algunas realizaciones, una secuencia de MLA se fusiona con una secuencia que codifica una etiqueta que es un epítopo antigénico conocido (por ejemplo, un epítopo de células T restringido por CMH de clase I y/o CMH de clase II de un antígeno modelo tal como una ovoalbúmina), y que se puede usar para verificar que se expresa una secuencia de MLA y que el polipéptido de fusión MLA-etiqueta se procesa y presenta en ensayos de presentación de antígeno. En algunas realizaciones, una etiqueta incluye un epítopo de células T de una célula T murina (por ejemplo, una línea de células T murinas). En algunas realizaciones, una secuencia de MLA se une a una etiqueta que facilita la purificación y una etiqueta que es un epítopo antigénico conocido.

Los polinucleótidos que codifican los MLA se clonan en un vector de expresión para la introducción en la biblioteca de células huésped. Hay varios sistemas de vectores disponibles para facilitar la clonación y manipulación de MLA, como el sistema de clonación Gateway® (Invitrogen). Como saben los expertos en la técnica, los vectores de expresión de MLA incluyen elementos que impulsan la producción de polipéptidos codificados por el MLA en las células huésped de la biblioteca (por ejemplo, promotor y otros elementos reguladores). En algunas realizaciones, la expresión de MLA está controlada por un elemento inducible (por ejemplo, un promotor inducible, por ejemplo, un promotor inducible por IPTG o arabinosa, o un sistema de polimerasa De ARN de fago T7 inducible por IPTG, un promotor de lactosa (lac), un promotor de triptófano (trp), un promotor de tac, un promotor de trc, un promotor de fago lambda, un promotor de fosfatasa alcalina (phoA), para dar sólo unos pocos ejemplos; ver Cantrell, Meth. in Mol. Biol., 235:257- 276, Humana Press, Casali and Preston, Eds.). En algunas realizaciones, los MLA se expresan como polipéptidos citoplasmáticos. En algunas realizaciones, el vector usado para la expresión de MLA es un vector que tiene un alto número de copias en una biblioteca de células huésped. En algunas realizaciones, el vector usado para la expresión tiene un número de copias que es más de 25, 50, 75, 100, 150, 200 o 250 copias por célula. En algunas realizaciones, el vector usado para la expresión tiene un origen de replicación ColE1. Vectores útiles para la expresión de polipéptidos en bacterias Incluyen vectores pET (Novagen), vectores pDEST Gateway® (Invitrogen), vectores pGEX (Amersham Biosciences), vectores pPRO (BD Biosciences), vectores pBAD (Invitrogen), vectores pLEX (Invitrogen), vectores pMAL™ (New England BioLabs), vectores pGEMEX (Promega) y vectores pQE (Qiagen). Los sistemas de vectores para producir bibliotecas de fagos son conocidos e incluyen los vectores Novagen T7Select® y el sistema de clonación de visualización de péptidos Ph.D.™ de New England Biolabs.

En algunas realizaciones, las células huésped de la biblioteca expresan (ya sea de forma constitutiva o cuando se inducen, dependiendo del sistema de expresión seleccionado) un MLA hasta al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% de la proteína celular total. En algunas realizaciones, el nivel de expresión de un MLA en un miembro de la biblioteca (p. ej., célula, partícula de virus, liposoma, perla) es tal que las células presentadoras de antígeno expuestas a una cantidad suficiente de los miembros de la biblioteca presentes en los epítopos del MLA de las moléculas de CMH a una densidad que es comparable a la densidad presentada por células presentadoras de antígeno pulsadas con péptidos purificados.

Se encuentran disponibles procedimientos para la producción eficiente a gran escala de bibliotecas de MLA. Por ejemplo, pueden usarse recombinasas específicas de sitio o enzimas de restricción de corte raro para transferir MLA entre vectores de expresión en la orientación y el marco de lectura adecuados (Walhout y col., Meth. Enzymol.

328:575-592, 2000; Marsischky y col., Genome Res. 14:2020-202, 2004; Blommel y col., Protein Expr. Purif. 47:562-570, 2006).

Para la producción de bibliotecas de liposomas, los polipéptidos expresados (por ejemplo, polipéptidos purificados o parcialmente purificados) se pueden atrapar en membranas liposomales, por ejemplo, como se describe en Wassef y col., Patente EE.UU. N° 4.863.874; Wheatley y col., Patente EE.UU. N° 4.921.757; Huang y col., Patente EE.UU. N° 4.925.661; o Martin y col., patente EE.UU. N° 5.225.212.

Puede diseñarse una biblioteca para incluir polipéptidos de longitud completa y/o porciones de polipéptidos codificados por un agente infeccioso o una célula diana. La expresión de polipéptidos de longitud completa maximiza los epítopos disponibles para la presentación por una célula presentadora de antígeno humano, aumentando así la probabilidad de identificar un antígeno. Sin embargo, en algunas realizaciones, es útil expresar porciones de MLA, o MLA que de otro modo se alteran, para lograr una expresión eficaz. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los MLA que codifican polipéptidos que son grandes (por ejemplo, más de 1000 aminoácidos), que tienen regiones hidrofóbicas extendidas, péptidos señal, dominios transmembrana o dominios que causan toxicidad celular, se modifican (por ejemplo, por truncamiento C-terminal, truncamiento N-terminal o deleción interna) para reducir la citotoxicidad y permitir la expresión eficaz de una biblioteca celular, lo que a su vez facilita la presentación de los polipéptidos codificados en células humanas. También pueden usarse otros tipos de modificaciones, como mutaciones puntuales U optimización de codones, para mejorar la expresión.

Se puede variar el número de polipéptidos incluidos en una biblioteca. Se puede diseñar una biblioteca para expresar polipéptidos de al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más de los MLA en un agente infeccioso o célula diana. En algunas realizaciones, una biblioteca expresa al menos 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 polipéptidos heterólogos diferentes, cada uno de los cuales puede representar un polipéptido codificado por un único MLA de longitud completa o una parte del mismo.

En algunas realizaciones, es ventajoso incluir polipéptidos de tantos MLA como sea posible, para maximizar el número de antígenos candidatos a la selección. En algunas realizaciones, se expresa un subconjunto de polipéptidos que tienen una característica particular de interés. Por ejemplo, para ensayos enfocados en identificar antígenos asociados con una etapa particular de infección, se puede construir una biblioteca que exprese un subconjunto de polipéptidos asociados con esa etapa de infección (por ejemplo, una biblioteca que expresa polipéptidos asociados con la fase de infección de hepatocitos por Plasmodium falciparum, por ejemplo, una biblioteca que expresa polipéptidos asociados con una etapa de levadura o moho de un patógeno fúngico dimórfico). En algunas realizaciones, los ensayos pueden centrarse en identificar antígenos que son polipéptidos secretados, polipéptidos expresados en la superficie celular o determinantes de virulencia, por ejemplo, para identificar antígenos que probablemente sean dianas de respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células.

Además de los polipéptidos heterólogos, las bibliotecas pueden incluir etiquetas que permiten purificar, analizar o evaluar fácilmente la presentación de CMH del polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, los MLA expresados por una biblioteca incluyen etiquetas C-terminales que incluyen un epítopo de células T restringido por CMH de clase I y CMH de clase II de un antígeno modelo, tal como ovoalbúmina de pollo (OVA). La expresión de la proteína de la biblioteca y la presentación del CMH se valida utilizando estos epítopos. En algunas realizaciones, los epítopos son OVA247-265 y OVA258-265 respetivamente, correspondientes a posiciones en la secuencia de aminoácidos encontrada en GenBank® bajo No. Acc. NP_990483. La expresión y presentación de los MLA enlazados se puede verificar con ensayos de presentación de antígenos utilizando hibridomas de células T (p. ej., células de hibridoma T B3Z, que están restringidas por H2-Kb, y células de hibridoma T KZO, que están restringidas por H2-Ak) que reconocen específicamente estos epítopos (ver Ejemplo 3, más abajo).

Los procedimientos y composiciones descritos en esta invención pueden usarse para identificar y detectar respuestas a antígenos para cualquier agente que infecte a los seres humanos. Por ejemplo, se pueden diseñar bibliotecas para expresar polipéptidos codificados por virus, bacterias, hongos, protozoos o helmintos que infectan a los seres humanos.

En algunas realizaciones, los miembros de una biblioteca incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de un virus. Por ejemplo, se puede diseñar una biblioteca para expresar polipéptidos de uno de los siguientes virus: un virus de inmunodeficiencia (por ejemplo, un virus de inmunodeficiencia humana (VIH), por ejemplo, VIH-1, VIH-2), un virus de la hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis no A y no B), un virus del herpes (p. ej., virus del herpes simple tipo I (VHS-1), VHS-2, virus de Varicelazóster, virus de Epstein Barr, citomegalovirus humano, virus del herpes humano 6 (HHV-6), HHV-7, HHV-8), un poxvirus (p. ej., variola, vaccinia, viruela del simio, virus del molusco contagioso), un virus de la influenza, un virus del papiloma humano, adenovirus, rinovirus, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de la rabia, virus coxsackie, virus de la leucemia de células T humanas (tipos I, II y III), virus de la parainfluenza, paramixovirus, poliovirus, rotavirus, rinovirus, virus de la rubéola, virus del sarampión, virus de las paperas, adenovirus, virus de la fiebre amarilla , virus de Norwalk, virus del Nilo occidental, virus del dengue, coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), bunyavirus, virus del Ébola, virus de Marburg, virus de la encefalitis equina del este, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St. Louis, Virus de Junin, virus de Lassa y virus de la coriomeningitis linfocítica. También pueden producirse y usarse bibliotecas para otros virus en función de los procedimientos descritos en esta invención.

En algunas realizaciones, los miembros de una biblioteca incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de bacterias (por ejemplo, de un patógeno bacteriano). En algunas realizaciones, el patógeno bacteriano es un patógeno intracelular. En algunas realizaciones, el patógeno bacteriano es un patógeno extracelular. Ejemplos de patógenos bacterianos incluyen bacterias de los siguientes géneros y especies: Chlamydia (p.ej., Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis), Legionella (p.ej., Legionella pneumophila), Listeria (p.ej., Listeria monocytogenes), Rickettsia (p.ej., R. australis, R. rickettsii, R. akari, R. conorii, R. sibirica, R, japonica, R. africae, R. typhi, R. prowazekii), Actinobacter (p.ej., Actinobacter baumannii), Bordetella (p.ej., Bordetella pertussis), Bacillus (p.ej., Bacillus anthracis, Bacillus cereus), Bacteroides (p.ej., Bacteroides fragilis), Bartonella (p.ej., Bartonella henselae), Borrelia (p.ej., Borrelia burgdorferi), Brucella (p.ej., Brucella abortus, Brucella cams, Brucella melitensis, Brucella suis), Campylobacter (p.ej., Campylobacter jejuni), Clostridium (p.ej., Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), Corynebacterium (p.ej., Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium amycolatum), Enterococcus (p.ej., Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium), Escherichia (p.ej., Escherichia coli), Francisella (p.ej., Francisella tularensis), Haemophilus (p.ej., Haemophilus influenzae), Helicobacter {p.ej., Helicobacter pylori), Klebsiella (p.ej., Klebsiella pneumoniae), Leptospira (p.ej., Leptospira interrogans), Mycobacteria (p.ej., Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis), Mycoplasma (p.ej., Mycoplasma pneumoniae), Neisseria (p.ej., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis), Pseudomonas (p.ej., Pseudomonas aeruginosa), Salmonella (p.ej., Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica), Shigella (p.ej., Shigella dysenteriae, Shigella sonnei), Staphylococcus (p.ej., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus (p.ej., Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes), Treponoma (p.ej., Treponoma pallidum), Vibrio (p.ej., Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus), e Yersinia (p.ej., Yersinia pestis). También pueden producirse y usarse bibliotecas para otras bacterias en función de los procedimientos descritos en esta invención.

En algunas realizaciones, los miembros de una biblioteca incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de protozoos. Ejemplos de patógenos protozoarios incluyen los siguientes organismos: Cryptosporidium parvum, Entamoeba (p.ej., Entamoeba histolytica), Giardia (p.ej., Giardia lambila), Leishmania (p.ej., Leishmania donovani), Plasmodium spp. (p.ej., Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae), Toxoplasma (p.ej., Toxoplasma gondii), Trichomonas (p.ej., Trichomonas vaginalis), and Trypanosoma (p.ej., Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi). También pueden producirse y usarse bibliotecas para otros protozoos en función de los procedimientos descritos en esta invención.

En algunas realizaciones, los miembros de una biblioteca incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de un hongo. Ejemplos de patógenos fúngicos incluyen los siguientes: Aspergillus, Candida (p.ej., Candida albicans), Coccidiodes (p.ej., Coccidiodes immitis), Cryptococcus (p.ej., Cryptococcus neoformans), Histoplasma (p.ej., Histoplasma capsulatum), y Pneumocystis (p.ej., Pneumocystis carinii). También pueden producirse y usarse bibliotecas para otros hongos en función de los procedimientos descritos en esta invención.

En algunas realizaciones, los miembros de una biblioteca incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de un helminto. Ejemplos de patógenos helmínticos incluyen Ascaris lumbricoides, Ancylostoma, Clonorchis sinensis, Dracuncula medinensis, Enterobius vermicularis, Filaría, Onchocerca volvulus, Loa loa, Schistosoma, Strongyloides, Trichuris trichura, y Trichinella spiralis. También pueden producirse y usarse bibliotecas para otros helmintos en función de los procedimientos descritos en esta invención.

La información de la secuencia de genomas y MLA para agentes infecciosos está disponible públicamente. Ver, p.ej., la Base de Datos de Genoma Entrez (URL: ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Genome&itool=toolbar) y la Base de Datos ERGO™ (URL: igweb.integratedgenomics.com/ERGO__supplement/genomes.html), la Base de Datos En Línea de Genomas (GOLD)(URL: genomesonline.org)(Liolios y col., Nucleic Acids Res. 1 ;34(Database issue):D332-4, 2006).

En algunas realizaciones, una biblioteca incluye polinucleótidos que expresan polipéptidos humanos. Tales bibliotecas son útiles, por ejemplo, para identificar antígenos tumorales candidatos o dianas de respuestas inmunitarias autorreactivas. Una biblioteca ejemplar para identificar antígenos tumorales incluye polinucleótidos que codifican polipéptidos que se expresan diferencialmente o se alteran de otro modo en células tumorales. Una biblioteca ejemplar para evaluar respuestas inmunitarias autorreactivas incluye polinucleótidos expresados en el tejido contra el que se dirige la respuesta autorreactiva (por ejemplo, se usa una biblioteca que contiene secuencias de polinucleótidos pancreáticos para evaluar una respuesta inmunitaria autorreactiva contra el páncreas).

Como se señaló anteriormente, los miembros de la biblioteca pueden expresar un polipéptido de citolisina, además de un polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, el polipéptido de citolisina es heterólogo a la célula de la biblioteca en la que se expresa y facilita el suministro de polipéptidos expresados por la célula de la biblioteca en el citosol de una célula humana que ha internalizado la célula de la biblioteca. Los polipéptidos de citolisina incluyen polipéptidos de citolisina bacterianos, como listeriolisina O (LLO), estreptolisina O (SLO) y perfringolisina O (PFO). Se describen polipéptidos de citolisina adicionales en la patente EE.UU. 6.004.815. En determinadas realizaciones, los miembros de la biblioteca expresan LLO. En algunas realizaciones, la célula de la biblioteca no secreta significativamente un polipéptido de citolisina (por ejemplo, se secreta menos del 20%, 10%, 5% o 1 % del polipéptido de citolisina producido por la célula). Por ejemplo, el polipéptido de citolisina es un polipéptido de citolisina citoplásmico, tal como un polipéptido LLO citoplásmico (por ejemplo, una forma de LLO que carece de la secuencia señal N-terminal, como se describe en Higgins y col., Mol. Microbiol. 31(6): 1631-1641,1999). En la Tabla 1 se muestran ejemplos de secuencias de polipéptidos de citolisina. La secuencia de listeriolisina O (A3-25) mostrada en la segunda fila de la Tabla 1 tiene una deleción de los residuos 3-25, en relación con la secuencia de LLO mostrada en la primera fila de la Tabla 1, y es un polipéptido LLO citoplásmico. En algunas realizaciones, una citolisina se expresa de forma constitutiva en una biblioteca de células huésped. En otras realizaciones, una citolisina se expresa bajo el control de un promotor inducible. Los polipéptidos de citolisina se pueden expresar a partir del mismo vector, o de un vector diferente, como polipéptido heterólogo en una célula de la biblioteca.

Tabla 1. Polipéptidos de Citolisina Ejemplares

En algunas realizaciones, un miembro de la biblioteca (por ejemplo, un miembro de la biblioteca que es una célula bacteriana) incluye una invasina que facilita la captación por la célula presentadora de antígeno. En algunas realizaciones, un miembro de la biblioteca incluye una autolisina que facilita la autolisis del miembro de la biblioteca dentro de la célula presentadora de antígeno. En algunas realizaciones, un miembro de la biblioteca incluye tanto una invasina como una autolisina. En algunas realizaciones, un miembro de la biblioteca que es una célula de E. coli incluye una invasina y/o una autolisina. En varias realizaciones, las células de biblioteca que expresan una invasina y/o autolisina se usan en procedimientos que también emplean células presentadoras de antígenos no profesionales o células presentadoras de antígenos que son de líneas celulares. Isberg y col. (Cell, 1987, 50:769-778), Sizemore y col. (Science, 1995, 270:299-302) y Courvalin y col. (C.R. Acad. Sci. Paris, 1995, 318:1207-12) describen la expresión de una invasina para efectuar la endocitosis de bacterias por células diana. Autolisinas son descritas por Cao y col., Infect. Immun. 1998, 66(6): 2984-2986; Margot y col., J. Bacterial. 1998, 180(3):749- 752; Buist y col., Appl. Environ. Microbiol, 1997, 63(7):2722-2728; Yamanaka y col., FEMS Microbiol. Lett., 1997, 150(2): 269-275; Romero y col., FEMS Microbiol. Lett., 1993, 108(1):87-92; Betzner y Keck, Mol. Gen. Genet., 1989, 219(3): 489-491; Lubitz y col., J. Bacterial., 1984, 159(l):385-387; y Tomasz y col., J. Bacterial., 1988, 170(12): 5931- 5934. En algunas realizaciones, una autolisina tiene una característica que permite la lisis retardada, por ejemplo, la autolisina es sensible a la temperatura o sensible al tiempo (ver, p.ej., Chang y col., 1995, J. Bact. 177, 3283-3294; Raab y col., 1985, J. Mol. Biol. 19, 95-105; Gerds y col., 1995, Mol. Microbiol. 17, 205-210). Citolisinas útiles también incluyen autolisinas de adicción (veneno/antídoto), (ver, p.ej., Magnuson R, y col., 1996, J. Biol. Chem. 271(31), 18705-18710; Smith A S, y col, 1997, Mol. Microbiol. 26(5), 961-970).

En la mayoría de las realizaciones, un miembro de una biblioteca expresa un único polipéptido heterólogo de un agente infeccioso o célula diana. En algunas realizaciones, una célula de una biblioteca expresa múltiples polipéptidos heterólogos. Conjuntos de miembros de biblioteca (p. ej., células bacterianas) se pueden proporcionar en una matriz (p. ej., en un soporte sólido, como una placa de 96 pocillos) y se pueden separar de manera que los miembros en cada ubicación expresen un polipéptido heterólogo diferente o un conjunto diferente de polipéptidos heterólogos.

Procedimientos de uso de miembros de biblioteca para identificar antígenos de células T se describen en detalle a continuación. Además de estos procedimientos, los miembros de la biblioteca también tienen utilidad en ensayos para identificar antígenos de células B. Por ejemplo, el lisado preparado a partir de miembros de la biblioteca que incluyen polipéptidos heterólogos se puede utilizar para seleccionar una muestra que comprende anticuerpos (p. ej., una muestra de suero) de un individuo (p. ej., un individuo que ha estado expuesto a un agente infeccioso de interés), para determinar si los anticuerpos presentes en el individuo reaccionan con el polipéptido heterólogo. Se conocen procedimientos adecuados para evaluar la reactividad de los anticuerpos e incluyen ensayos ELISA.

Selecciones para Bibliotecas

Células humanas para presentación de antígenos

La presente invención proporciona, entre otros, composiciones y procedimientos para identificar antígenos reconocidos por células inmunes humanas. Las células presentadoras de antígenos humanos expresan ligandos para receptores de antígenos y otras moléculas de activación inmunitaria en linfocitos humanos. Dadas las diferencias en las especificidades de unión de péptidos del CMH y las enzimas de procesamiento de antígenos entre especies, es más probable que los antígenos procesados y presentados por células humanas sean antígenos humanos fisiológicamente relevantes in vivo que los antígenos identificados en sistemas no humanos. Por consiguiente, los procedimientos para identificar estos antígenos emplean células humanas para presentar polipéptidos de antígenos candidatos.

Cualquier célula humana que internalice miembros de la biblioteca y presente polipéptidos expresados por los miembros de la biblioteca en moléculas del CMH puede usarse como una célula presentadora de antígenos según la presente invención. En algunas realizaciones, las células humanas utilizadas para la presentación de antígenos son células humanas primarias. Las células pueden incluir células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de un ser humano. En algunas realizaciones, las células de sangre periférica se separan en subconjuntos (por ejemplo, subconjuntos que comprenden células dendríticas, macrófagos, monocitos, células B o combinaciones de los mismos) antes de su uso en un ensayo de presentación de antígeno. En algunas realizaciones, un subconjunto de células que expresa CMH clase II se selecciona de sangre periférica. En un ejemplo, una población de células que incluye células dendríticas se aísla de sangre periférica. En algunas realizaciones, se aísla un subconjunto de células dendríticas (por ejemplo, plasmocitoides, mieloides o un subconjunto de las mismas). Marcadores de células dendríticas humanas incluyen CD1c, CD1a, CD303, CD304, CD 141, y CD209. Las células se pueden seleccionar basándose en la expresión de uno o más de estos marcadores (por ejemplo, células que expresan CD303, CD1c y CD141).

Las células dendríticas se pueden aislar mediante selección positiva de sangre periférica usando kits disponibles comercialmente (por ejemplo, de Miltenyi Biotec Inc.). Las células dendríticas también se pueden producir cultivando células de sangre periférica en condiciones que promuevan la diferenciación de precursores de monocitos en células dendríticas in vitro. Estas condiciones típicamente incluyen el cultivo de células en presencia de citocinas como GM-CSF e IL-4. (ver, p.ej., Inaba y col, Isolation of dendritic cells, Curr. Protoc. Immunol. May; Chapter 3: Unit 3.7, 2001). Los procedimientos para la expansión in vitro de células madre y progenitoras hematopoyéticas (por ejemplo, extraídas de la médula ósea o sangre periférica) y la diferenciación de estas células en células dendríticas in vitro, se describen en la Patente EE.UU. N° 5.199.942 y la Patente EE.UU. Pub. 20030077263. Brevemente, las células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ se aíslan de sangre periférica o médula ósea y se expanden in vitro en condiciones de cultivo que incluyen uno o más de Flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando de c-kit.

En algunas realizaciones, células inmortalizadas que expresan moléculas del CMH humanas (por ejemplo, células humanas o células no humanas que se diseñan para expresar moléculas del CMH humanas) se utilizan para la presentación de antígenos. Por ejemplo, los ensayos pueden emplear células COS transfectadas con moléculas del CMH humanas o células HeLa.

En algunas realizaciones, se usan células humanas primarias en un procedimiento descrito en esta invención y tanto las células presentadoras de antígenos como las células inmunes usadas en el procedimiento se derivan del mismo sujeto (por ejemplo, se usan células T autólogas y CPA). En estas realizaciones, puede resultar ventajoso aislar secuencialmente subconjuntos de células de la sangre periférica del sujeto, para maximizar el rendimiento de células disponibles para los ensayos. Por ejemplo, primero se pueden aislar subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ de la sangre periférica. A continuación, se aíslan las células dendríticas (CD) de la población de células con depleción de células T. Las células con depleción de T y CD restantes se utilizan para complementar las CD en ensayos o se utilizan solas como células presentadoras de antígenos. En algunas realizaciones, las CD se utilizan con depleción de células T y de CD en un ensayo, en una proporción de 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5.

Las células presentadoras de antígenos pueden aislarse de fuentes distintas de la sangre periférica. Por ejemplo, las células presentadoras de antígeno se pueden tomar de un tejido mucoso (por ejemplo, nariz, boca, tejido bronquial, tejido traqueal, tracto gastrointestinal, tracto genital (por ejemplo, tejido vaginal) o tejido linfoide asociado), cavidad peritoneal, tejido linfático ganglios, bazo, médula ósea, timo, pulmón, hígado, riñón, tejido neuronal, tejido endocrino u otro tejido, para su uso en ensayos de análisis. En algunas realizaciones, las células se extraen de un tejido que es el sitio de una respuesta inmunitaria activa (por ejemplo, una úlcera, llaga o absceso). Las células pueden aislarse del tejido extraído quirúrgicamente, mediante lavado u otros medios.

Células presentadoras de antígenos útiles en los procedimientos descritos en esta invención no se limitan a células presentadoras de antígenos «profesionales». Sorprendentemente, los presentes inventores han demostrado que las células presentadoras de antígenos no profesionales se pueden utilizar eficazmente. Células presentadoras de antígenos no profesionales incluyen fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, células neuronales/gliales, células linfoides o mieloides que no son células presentadoras de antígenos profesionales. (p. ej., células T, neutrófilos), células musculares, células hepáticas y otros tipos de células.

Células presentadoras de antígeno se cultivan con miembros de la biblioteca que expresan un polipéptido heterólogo (y, si se desea, un polipéptido de citolisina) en condiciones en las que las células presentadoras de antígeno internalizan, procesan y presentan polipéptidos expresados por los miembros de la biblioteca en moléculas del CMH. En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca se eliminan o inactivan antes del cultivo con las células presentadoras de antígeno. Las células o los virus pueden inactivarse mediante cualquier agente apropiado (por ejemplo, fijación con disolventes orgánicos, irradiación, congelación). En algunas realizaciones, los miembros de la biblioteca son células que expresan MLA enlazadas a una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta que comprende uno o más epítopos de células T conocidos), cuya expresión se ha verificado antes del cultivo.

En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígeno se incuban con miembros de la biblioteca a 37°C durante entre 30 minutos y 5 horas (por ejemplo, durante 45 minutos a 1,5 horas). Después de la incubación, las células presentadoras de antígeno se pueden lavar para eliminar los miembros de la biblioteca que no se han internalizado. En determinadas realizaciones, las células presentadoras de antígeno no son adherentes y el lavado requiere la centrifugación de las células. Las células presentadoras de antígeno lavadas se pueden incubar a 37°C durante un período de tiempo adicional (p. ej., de 30 minutos a 2 horas) antes de la exposición a los linfocitos, para permitir el procesamiento del antígeno. En algunas realizaciones, es deseable fijar y destruir las células presentadoras de antígeno antes de la exposición a los linfocitos (por ejemplo, tratando las células con paraformaldehído al 1%).

La célula presentadora de antígeno y el número de miembros de la biblioteca se pueden variar, siempre que los miembros de la biblioteca proporcionen cantidades de polipéptidos heterólogos suficientes para la presentación en moléculas del CMH. En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígeno se proporcionan en una matriz y se ponen en contacto con conjuntos de células de biblioteca, expresando cada conjunto un polipéptido heterólogo diferente. En determinadas realizaciones, cada ubicación en la matriz incluye 1 x 103 - 1 x 106 células presentadoras de antígeno, y las células se ponen en contacto con 1 x 103 - 1 x 108 células de biblioteca que son células bacterianas.

En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, las células presentadoras de antígeno se pueden aislar recientemente, mantener en cultivo o descongelar del almacenamiento congelado antes de la incubación con células de la biblioteca o después de la incubación con células de la biblioteca.

Linfocitos humanos

En los procedimientos de la presente invención, los linfocitos humanos se analizan para determinar la reactividad específica del antígeno con las células presentadoras de antígenos, por ejemplo, células presentadoras de antígenos que se han incubado con bibliotecas que expresan polipéptidos antigénicos candidatos como se describió anteriormente. Los procedimientos de la presente invención permiten la identificación rápida de antígenos humanos usando grupos de linfocitos aislados de un individuo o progenie de las células. La detección de respuestas específicas de antígeno no depende de procedimientos laboriosos para aislar clones de células T individuales. En algunas realizaciones, los linfocitos humanos son linfocitos primarios. Así como las células presentadoras de antígenos pueden separarse en subconjuntos antes de su uso, en los ensayos de presentación de antígenos, se puede usar una población de linfocitos que tengan un marcador específico u otra característica.

En algunas realizaciones, se aísla una población de linfocitos T. En algunas realizaciones, se aísla una población de células T CD4+. En algunas realizaciones, se aísla una población de células T CD8+. Las células T CD8+ reconocen los antígenos peptídicos presentados en el contexto de las moléculas del CMH de clase I. Por tanto, en algunas realizaciones, las células T CD8+ se utilizan con células presentadoras de antígenos que han sido expuestas a una biblioteca de células huésped que coexpresan un polipéptido de citolisina, además de un antígeno candidato. También se pueden aislar subconjuntos de células T que expresan otros marcadores de superficie celular, por ejemplo, para proporcionar células que tengan un fenotipo particular. Estos incluyen CLA (para células T que se alojan en la piel), CD25, CD30, CD69, CD154 (para células T activadas), CD45RO (para células T de memoria), CD294 (para células Th2), células que expresan TCR y/6 , CD3 y CD56 (para células T NK). También se pueden seleccionar otros subconjuntos.

Los linfocitos pueden aislarse y separarse por cualquier medio conocido en la técnica (por ejemplo, usando procedimientos basados en anticuerpos tales como los que emplean separación de perlas magnéticas, cribado o citometría de flujo). Los reactivos para identificar y aislar linfocitos humanos y subconjuntos de los mismos son bien conocidos y están disponibles comercialmente.

Los linfocitos para su uso en los procedimientos descritos en esta invención pueden aislarse de células mononucleares de sangre periférica o de otros tejidos en un ser humano. En algunas realizaciones, los linfocitos se extraen de los ganglios linfáticos, un tejido mucoso (por ejemplo, nariz, boca, tejido bronquial, tejido traqueal, el tracto gastrointestinal, el tracto genital (por ejemplo, tejido vaginal) o tejido linfoide asociado), cavidad peritoneal, bazo, timo, pulmón, hígado, riñón, tejido neuronal, tejido endocrino, cavidad peritoneal, médula ósea u otros tejidos. En algunas realizaciones, las células se extraen de un tejido que es el sitio de una respuesta inmunitaria activa (por ejemplo, una úlcera, llaga o absceso). Las células pueden aislarse del tejido extraído quirúrgicamente, mediante lavado u otros medios.

Los linfocitos extraídos de un individuo se pueden mantener en cultivo o congelar hasta su uso en ensayos de presentación de antígenos. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que los linfocitos recién aislados pueden simularse in vitro mediante células presentadoras de antígeno expuestas a células de biblioteca como se describió anteriormente. Estos linfocitos exhiben una estimulación detectable sin la necesidad de una expansión previa no específica de antígeno. Sin embargo, los linfocitos primarios también provocan respuestas específicas de antígeno detectables cuando se estimulan por primera vez de forma inespecífica in vitro. Por tanto, en algunas realizaciones, los linfocitos se estimulan para que proliferen in vitro de una manera no específica de antígeno, antes de su uso en un ensayo de presentación de antígeno. Los linfocitos también se pueden estimular de una manera específica de antígeno antes de su uso en un ensayo de presentación de antígeno. Por ejemplo, las células de un individuo que se cree que ha estado expuesto a un virus pueden estimularse con células presentadoras de antígeno infectadas con el virus, o pulsarse con una composición que comprende antígenos virales (por ejemplo, lisado viral o polipéptidos recombinantes). En algunas realizaciones, las células se estimulan para que proliferen mediante una biblioteca (por ejemplo, antes de su uso en un ensayo de presentación de antígeno que emplea la biblioteca). La expansión de células in vitro proporciona un mayor número de células para su uso en ensayos. Las células T primarias pueden estimularse para expandirse, por ejemplo, mediante la exposición a un mitógeno de células T policlonales, como fitohemaglutinina o concanavalina, mediante tratamiento con anticuerpos que estimulan la proliferación, o mediante tratamiento con partículas recubiertas con los anticuerpos. En algunas realizaciones, las células T se expanden mediante tratamiento con anticuerpos anti-CD2, anti-CD3 y anti-CD28.

Ensayos de presentación de antígenos

En los ensayos de presentación de antígenos, las células T se cultivan con células presentadoras de antígenos preparadas en función de los procedimientos descritos anteriormente, en condiciones que permiten el reconocimiento de las células T de los péptidos presentados por moléculas del CMH en las células presentadoras de antígenos. En algunas realizaciones, las células T se incuban con células presentadoras de antígeno a 37°C durante entre 12 y 48 horas (por ejemplo, durante 24 horas). En algunas realizaciones, las células T se incuban con células presentadoras de antígeno a 37°C durante 3, 4, 5, 6, 7 u 8 días. Se puede variar el número de células presentadoras de antígeno y de células T. En algunas realizaciones, la proporción de células T a células presentadoras de antígeno en un ensayo dado es 1:10, 1:5, 1:2, 1:1, 2:1, 5:1 o 10:1. En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígenos se proporcionan en una matriz (por ejemplo, en una placa de 96 pocillos), donde las células en cada ubicación de la matriz se han puesto en contacto con conjuntos de células de la biblioteca, cada conjunto incluye un polipéptido heterólogo diferente. En ciertas realizaciones, cada ubicación en la matriz incluye 1 x 103 - 1 x 106 células presentadoras de antígeno, y las células se ponen en contacto con 1 x 103 - 1 x 106 células T.

Una vez que las células T se han incubado con células presentadoras de antígeno, se analizan los cultivos para determinar su estimulación. La estimulación de linfocitos puede detectarse por cualquier medio conocido en la técnica. En algunas realizaciones, los sobrenadantes del cultivo se recogen y analizan para determinar la secreción de un polipéptido asociado con la activación, por ejemplo, una citocina, como IFNy, TNFa, TNFp interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL- 3, IL-10, IL-17, TGFp o GM-CSF. La secreción de citocinas en los sobrenadantes de cultivos se puede detectar, por ejemplo, mediante ELISA, matriz de perlas, por ejemplo, con un analizador Luminex®. La producción de citocinas también puede ensayarse mediante RT-PCR de ARNm aislado de las células T, o mediante análisis ELISPOT de las citocinas liberadas por las células T. Otros polipéptidos asociados con la activación de células T, que pueden ensayarse para detectar estimulación, incluyen perforina, granzima, ligando Fas y ligando CD40, CD25 y CD69. En algunas realizaciones, se determina la proliferación de células T en los cultivos (por ejemplo, detectando la incorporación de timidina 3H). En algunas realizaciones, se determina la lisis de las células diana (por ejemplo, detectando la lisis dependiente de linfocitos T de las células presentadoras de antígeno marcadas con Na²51CrO4). Los ensayos de lisis de células diana se realizan típicamente con células T CD8+. Se conocen protocolos para estos procedimientos de detección. Ver, p.ej., Current Protocols In Immunology, John E. Coligan y col. (eds), Wiley and Sons, New York, N.Y., 2007. Un experto en la técnica entenderá que se utilizan controles apropiados en estos procedimientos de detección, por ejemplo, para ajustar la activación de fondo no específica de antígeno, para confirmar la capacidad estimuladora de las células presentadoras de antígeno y para confirmar la viabilidad de los linfocitos.

En algunas realizaciones, los ensayos de presentación de antígenos se repiten usando células presentadoras de antígenos y linfocitos de diferentes individuos, por ejemplo, para identificar antígenos reconocidos por múltiples individuos o comparar reactividades que difieren entre individuos.

Aplicaciones

Después de que se determina que un polipéptido heterólogo presentado por una célula presentadora de antígeno en un ensayo descrito en esta invención estimula linfocitos humanos, el polipéptido heterólogo, ahora identificado como un antígeno, puede producirse e incorporarse en composiciones para su uso en la provocación de respuestas inmunitarias. Estas y otras aplicaciones se analizan a continuación.

Donantes de células humanas

Una ventaja de los procedimientos descritos en esta invención es su capacidad para identificar antígenos humanos clínicamente relevantes. Los seres humanos que han estado expuestos a un estímulo inmunogénico (p. ej., de una infección natural por un agente infeccioso) contienen linfocitos que reconocen específicamente los antígenos del agente infeccioso, que son el producto de una respuesta inmunitaria adaptativa que surge de la exposición anterior. En algunas realizaciones, estas células están presentes con una frecuencia más alta que las células de un individuo sin tratar y/o las células se reactivan fácilmente cuando se vuelven a exponer al estímulo antigénico apropiado (por ejemplo, las células son células de «memoria»). Por tanto, los seres humanos que han estado expuestos a un agente infeccioso son donantes de células particularmente útiles para identificar antígenos in vitro. El individuo puede ser alguien que se haya recuperado de la infección o alguien que haya estado expuesto al agente infeccioso y permanezca asintomático. En algunas realizaciones, el individuo ha sido infectado recientemente con el agente infeccioso (por ejemplo, el individuo fue infectado con el agente infeccioso menos de tres meses, dos meses, un mes o dos semanas, antes del aislamiento de linfocitos y/o células presentadoras de antígeno del individuo). En algunas realizaciones, el individuo se infectó primero con el agente más de tres meses, seis meses o un año antes del aislamiento de linfocitos y/o células presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el individuo está infectado de forma latente o persistente con el agente infeccioso. En algunas realizaciones, el individuo ha sido vacunado contra un agente infeccioso de interés (p. ej., con una vacuna bacteriana de células completas, una vacuna vírica atenuada, de péptidos o de ácido nucleico). Los procedimientos en esta invención pueden usarse para analizar una respuesta inmunitaria a un vector de vacuna en sí mismo. Por ejemplo, las células de un paciente inmunizado con un vector bacteriano o viral que porta uno o más antígenos de un organismo heterólogo pueden aislarse y analizarse para caracterizar una respuesta inmunitaria contra el vector bacteriano o viral. En algunas realizaciones, las células del individuo se seleccionan en ensayos en los que las células presentadoras de antígenos se han puesto en contacto con una biblioteca de células cuyos miembros expresan polipéptidos del agente infeccioso o una especie relacionada del mismo.

En algunas realizaciones, las células de un individuo que ha estado expuesto a un agente infeccioso se utilizan para identificar antígenos en una especie relacionada. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus y la especie relacionada es un virus de la misma familia. Para dar un ejemplo, las células de un paciente infectado con el virus de Epstein-Barr (EBV) se pueden analizar frente a células presentadoras de antígeno que se han incubado con una biblioteca que expresa polipéptidos del virus del herpes simple-2 (HSV-2). Los polipéptidos identificados en tal análisis pueden ser útiles como antígenos que provocan respuestas inmunitarias de reacción cruzada ampliamente protectoras contra múltiples tipos de virus del herpes.

En algunas realizaciones, los linfocitos se analizan frente a células presentadoras de antígeno que se han puesto en contacto con una biblioteca de células cuyos miembros expresan polipéptidos de un agente infeccioso, y los linfocitos son de un individuo que no ha estado expuesto al agente infeccioso. En algunas realizaciones, tales linfocitos se usan para determinar reactividades de fondo (es decir, no específicas de antígeno). En algunas realizaciones, tales linfocitos se usan para identificar antígenos, cuya reactividad existe en individuos sin tratar.

Las células de múltiples donantes se pueden recolectar y analizar en los procedimientos descritos en esta invención. En algunas realizaciones, las células de múltiples donantes se analizan para verificar que un antígeno dado es reactivo en una amplia porción de la población, o para identificar múltiples antígenos que luego se pueden combinar para producir una composición inmunogénica que será eficaz en una amplia porción de la población.

Los procedimientos descritos en esta invención tienen aplicaciones que se extienden más allá de la identificación de antígenos. Por ejemplo, la capacidad de detectar rápidamente respuestas de células T específicas de antígeno humano in vitro puede usarse para determinar si un individuo ha estado expuesto a un agente infeccioso o un conjunto de agentes infecciosos. En algunas realizaciones, los ensayos de presentación de antígenos se utilizan para evaluar aspectos cualitativos de la reacción inmunológica previa o en curso de un individuo a un agente infeccioso. Algunos agentes infecciosos como las micobacterias y los virus de la hepatitis provocan infecciones persistentes. Otros agentes infecciosos no se eliminan eficazmente mediante la respuesta inmunitaria de los pacientes. La comparación de los tipos de reactividades antigénicas asociadas con infecciones persistentes y la inmunidad exitosa a estos agentes puede ayudar en el diseño de composiciones inmunogénicas que probablemente proporcionarán protección. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, los procedimientos descritos en esta invención se utilizan para comparar las reactividades antigénicas encontradas en pacientes que padecen infecciones por herpes diseminadas con las de pacientes en los que se resolvió una infección por herpes. Estos análisis pueden revelar reactividades antigénicas prominentes en infecciones resueltas y carentes de infecciones diseminadas. Para proporcionar otro ejemplo, en algunas realizaciones, los procedimientos en esta invención se utilizan para comparar reactividades antigénicas en pacientes que padecen enfermedad inflamatoria pélvica (EIP) debido a un agente infeccioso como C. trachomatis o N. gonorrhoeae a pacientes expuestos a esos agentes, y que no presente enfermedad inflamatoria pélvica. La identificación de antígenos asociados con una forma patológica particular de infección facilita el desarrollo de ensayos de diagnóstico para controlar el curso de la infección y determinar la probabilidad de desarrollar la patología. Por ejemplo, los antígenos identificados como asociados con EIP se pueden usar en ensayos de diagnóstico para pacientes que están infectados con un agente causal y que aún no han desarrollado EIP, para ayudar a evaluar la probabilidad de aparición de esta complicación.

En otras realizaciones relacionadas más, los ensayos de presentación de antígenos como se describen en esta invención se utilizan para evaluar la respuesta de un individuo a un agente infeccioso para determinar la etapa de la infección. Por ejemplo, la presencia de reactividad a un antígeno solo expresada en una fase latente o persistente de una infección puede indicar que la infección ha progresado a una de estas etapas. En algunas realizaciones, los ensayos de presentación de antígenos como se describen en la presente memoria se utilizan para evaluar las respuestas de sujetos que se someten a tratamiento terapéutico para una infección. En algunas realizaciones, los ensayos de presentación de antígeno como se describen en la presente memoria se utilizan para evaluar las respuestas de sujetos a los que se les ha administrado una composición inmunogénica (por ejemplo, como parte de un ensayo clínico para una vacuna candidata).

Los ensayos de presentación de antígenos también son útiles en el contexto de enfermedades no infecciosas. Los procedimientos descritos en esta invención son aplicables a cualquier contexto en el que sea beneficiosa una evaluación rápida de la inmunidad celular humana. En algunas realizaciones, se evalúa la reactividad antigénica a polipéptidos que se expresan diferencialmente por células neoplásicas (por ejemplo, células tumorales). Se han identificado conjuntos de ácidos nucleicos expresados diferencialmente por células neoplásicas usando técnicas establecidas como la hibridación sustractiva. Los procedimientos descritos en esta invención se pueden usar para identificar antígenos que eran funcionales en un sujeto en el que se produjo una respuesta inmunitaria antitumoral. En otras realizaciones, se usan procedimientos para evaluar si un sujeto tiene linfocitos que reaccionan con un antígeno tumoral o un conjunto de antígenos tumorales. En algunas realizaciones, los ensayos de presentación de antígenos se usan para examinar la reactividad a los autoantígenos en las células de un individuo, por ejemplo, un individuo predispuesto a, o que padece, una condición autoinmune. Dichos procedimientos pueden usarse para proporcionar indicadores de diagnóstico o pronóstico del estado de la enfermedad del individuo o para identificar autoantígenos. Para estos ensayos, en algunas realizaciones, se preparan bibliotecas que incluyen una matriz de polipéptidos humanos. En algunas realizaciones, se preparan bibliotecas que incluyen polipéptidos de agentes infecciosos de los que se sospecha que provocan respuestas de reacción cruzada a autoantígenos. Para ver ejemplos de antígenos de agentes infecciosos que se cree que provocan respuestas autoinmunes de reacción cruzada, ver Barzilai y col., Curr Opin Rheumatol., 19(6):636-43, 2007; Ayada y col., Ann N YAcad Sci., 1108:594-602, 2007; Drouin y col., Mol Immunol., 45(1): 180-9, 2008; y Bach, J Autoimmun., 25 Suppl:74-80, 2005.

Identificación de epítopos

La presente invención incluye procedimientos en los que se expresan polipéptidos heterólogos en células de biblioteca. Después de que las células presentadoras de antígenos internalizan las células de la biblioteca, los polipéptidos heterólogos se procesan proteolíticamente dentro de las células presentadoras de antígenos y los fragmentos de péptidos de los polipéptidos heterólogos se presentan en moléculas del CMH expresadas en las células presentadoras de antígenos. La identidad del polipéptido heterólogo que estimula un linfocito humano en un ensayo descrito en esta invención puede determinarse a partir del examen del conjunto de células de biblioteca que se proporcionaron a las células presentadoras de antígeno que produjeron la estimulación. En algunas realizaciones, es útil mapear el epítopo dentro del polipéptido heterólogo que está unido por moléculas del CMH para producir la estimulación observada. Este epítopo, o el polipéptido más largo del que se deriva (ambos se denominan «antígeno» en esta invención) puede formar la base de una composición inmunogénica o de un estímulo antigénico en ensayos de presentación de antígeno futuros.

Se conocen procedimientos para identificar péptidos unidos por moléculas del CMH. En algunas realizaciones, los epítopos se identifican generando mutantes por deleción del polipéptido heterólogo y probando la capacidad de estos para estimular linfocitos. Las deleciones que pierden la capacidad de estimular a los linfocitos, cuando son procesadas y presentadas por células presentadoras de antígenos, han perdido el epítopo peptídico. En algunas realizaciones, los epítopos se identifican sintetizando péptidos correspondientes a porciones del polipéptido heterólogo y probando la capacidad de los péptidos para estimular linfocitos (por ejemplo, en ensayos de presentación de antígenos en los que las células presentadoras de antígenos se pulsan con los péptidos). Otros procedimientos para identificar péptidos unidos al CMH implican la lisis de las células presentadoras de antígeno que incluyen el péptido antigénico, la purificación por afinidad de las moléculas del CMH de los lisados celulares y la elución y análisis posteriores de péptidos del CMH (Falk, K. y col. Nature 351:290, 1991, y Pat. EE. UU. N.° 5.989.565).

Composiciones inmunogénicas y usos de las mismas

Se describen composiciones que incluyen un antígeno o antígenos identificados mediante los procedimientos descritos en esta invención, ácidos nucleicos que codifican los antígenos, y procedimientos de uso de las composiciones. En algunas realizaciones, una composición incluye antígenos que son péptidos de 8 a 40 aminoácidos de longitud (por ejemplo, péptidos de unión al CMH, por ejemplo, péptidos de 8 a 25, 8 a 20, 8 a 15, 8 a 12 aminoácidos de longitud). En algunas realizaciones, una composición incluye antígenos que son polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos codificados por marcos de lectura abiertos de longitud completa de un agente infeccioso, o porciones del mismo). Las composiciones pueden incluir antígenos que son, o que comprenden, péptidos de unión al CMH de clase I, péptidos de unión al CMH de clase II o péptidos de unión al CMH de clase I y CMH de clase II. Las composiciones pueden incluir un solo antígeno o múltiples antígenos. En algunas realizaciones, una composición incluye un conjunto de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más antígenos. En algunas realizaciones, el conjunto de antígenos proviene de un solo agente infeccioso. En algunas realizaciones, el conjunto de antígenos proviene de dos agentes infecciosos.

También se describen los ácidos nucleicos que codifican los antígenos. Los ácidos nucleicos pueden usarse para producir vectores de expresión, por ejemplo, para la producción recombinante de los antígenos, o para la administración basada en ácidos nucleicos in vivo (por ejemplo, vacunación con ADN).

En algunas realizaciones, los antígenos se utilizan en ensayos de diagnóstico. Para estos ensayos, las composiciones que incluyen los antígenos se pueden proporcionar en kits, por ejemplo, para detectar la reactividad del anticuerpo, o la reactividad celular, en una muestra de un individuo.

En algunas realizaciones, las composiciones de antígeno se utilizan para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal no humano. Las composiciones de antígeno se pueden usar para generar anticuerpos (por ejemplo, en un animal no humano, como un ratón, rata, hámster o cabra), por ejemplo, para uso en ensayos de diagnóstico y para aplicaciones terapéuticas. Como ejemplo de uso terapéutico, un antígeno descubierto por un procedimiento descrito en en esta invención puede ser un antígeno potente de células T y células B, anticuerpos para los cuales proporcionan inmunidad protectora in vivo neutralizando un agente infeccioso. Se pueden producir preparaciones de anticuerpos neutralizantes inmunizando a un sujeto con el antígeno y aislando el antisuero del sujeto. Son conocidos en la técnica procedimientos para obtener titulaciones altas de anticuerpos específicos de antígeno de alta afinidad, y para aislar los anticuerpos específicos de antígeno de antisueros. En algunas realizaciones, las composiciones de antígeno se utilizan para generar anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos.

En algunas realizaciones, se usa una composición de antígeno para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto humano para proporcionar protección contra la infección o para proporcionar una respuesta terapéutica. La protección puede ser completa o parcial. En algunas realizaciones, una composición de antígeno provoca una respuesta inmunitaria a un agente infeccioso que hace que el sujeto tenga síntomas más leves y/o una duración más corta de la enfermedad, cuando se expone al agente infeccioso, por ejemplo, en comparación con un sujeto al que no ha sido administra la composición de antígeno. En algunas realizaciones, donde se desea una respuesta terapéutica, la composición de antígeno provoca una respuesta que reduce los síntomas o la duración de la enfermedad asociada con la infección, o niveles reducidos del agente infeccioso, en el sujeto, por ejemplo, en comparación con un sujeto al que no se ha administrado la composición de antígeno.

En algunas realizaciones, la inmunogenicidad de un antígeno se evalúa in vivo. En algunas realizaciones, se evalúan las respuestas humorales a un antígeno (p. ej., detectando titulaciones de anticuerpos contra el antígeno administrado). En algunas realizaciones, las respuestas inmunitarias celulares a un antígeno se evalúan, p. ej., detectando la frecuencia de células específicas de antígeno en una muestra del sujeto (p. ej., tiñendo células T del sujeto con tetrámeros del CMH/péptido que contienen el péptido antigénico, para detectar células T específicas de antígeno, o detectando células específicas de antígeno usando un ensayo de presentación de antígeno tal como un ensayo descrito en esta invención). En algunas realizaciones, la capacidad de un antígeno o antígenos para provocar inmunidad protectora o terapéutica se evalúa en un modelo animal.

En algunas realizaciones, la composición incluye un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición inmunogénica también puede incluir un adyuvante para mejorar la inmunogenicidad de la formulación (por ejemplo, aceite en agua, adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, adyuvantes de saponina o dipéptidos de muramil). Otros adyuvantes son conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un antígeno unido a una proteína transportadora. Ejemplos de proteínas transportadoras incluyen, por ejemplo, toxinas y toxoides (químicos o genéticos), que pueden ser mutantes o no, como la toxina del ántrax, PA y d Ni (PharmAthene, Inc.), toxoide diftérico (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) o CRM 197, toxina tetánica, toxoide tetánico (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.), fragmento Z de toxina tetánica, exotoxina A o mutantes de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, flagelina bacteriana, neumolisina, una proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidis (cepa disponible de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Va.)), proteína Hcpl de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina termolábil de E. coli, toxina similar a shiga, proteína LTB humana, un extracto de proteína de células bacterianas completas y cualquier otra proteína que pueda reticularse mediante un enlazador.

Otras proteínas transportadoras útiles incluyen albúmina de suero bovino (BSA), P40 y riboflavina de pollo. Muchas proteínas transportadoras están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Sigma Aldrich).

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica que incluye un antígeno identificado mediante un procedimiento descrito en esta invención se usa junto con una vacuna disponible.

Por ejemplo, un antígeno identificado como se describe en la presente memoria puede usarse como componente suplementario de una formulación de vacuna o como antígeno de refuerzo en un protocolo de vacunación.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica está en un volumen de aproximadamente 0,5 mL para inyección subcutánea, 0,1 mL para inyección intradérmica o 0,002-0,02 mL para administración percutánea. Una dosis de 0,5 mL de la composición puede contener aproximadamente 2-500 gg del antígeno.

En algunas realizaciones, se administra una composición inmunogénica por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). En algunas realizaciones, se usa la administración por un medio que penetra físicamente en la capa dérmica (por ejemplo, una aguja, pistola de aire comprimido o abrasión).

En algunas realizaciones, se administra una composición inmunogénica a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, inyección intradérmica o inmunización transcutánea con adyuvantes inmunes apropiados. Las composiciones pueden administrarse, una o más veces, a menudo incluyendo una segunda administración diseñada para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto. La frecuencia y la cantidad de dosificación de la composición pueden variar dependiendo de la actividad específica de la composición y pueden determinarse mediante experimentación de rutina.

Las formulaciones de composiciones inmunogénicas se pueden proporcionar en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y se pueden almacenar en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

Ejemplificación

Ejemplo 1: Preparación de una biblioteca para la identificación de antígenos humanos del virus del herpes simple-2 Generación de biblioteca

Se creó una biblioteca de expresión a partir del virus del herpes simple-2 (VHS-2) mediante la amplificación por PCR específica del gen de cada región codificante, seguida de una segunda reacción de PCR en la que se utilizaron cebadores universales para añadir una secuencia de recombinación adicional (el sistema Gateway™) a las secuencias amplificadas para la clonación. En algunos casos, las dianas de genes fueron sintetizadas por una fuente comercial y transferidas dentro de un vector plásmido.

Diseño de cebador de PCR

Los marcos de lectura abiertos (MLA) del genoma de HSV-2 se generaron utilizando la secuencia PubMed publicada con el número de acceso NC 001798. Los cebadores de los 77 genes se diseñaron utilizando el software Primer3Plus disponible en la siguiente URL: bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi. Las secuencias de codificación para cada gen se importaron en el software Primer3Plus y el programa de software calculó los cebadores basándose en umbrales establecidos como Tm. Las proteínas que se predice que tienen una secuencia señal se truncaron para que se expresen sin la secuencia señal. Los cebadores directos se diseñaron comenzando en el sitio de inicio de la transcripción, ATG, y los cebadores inversos estaban cadena arriba del codón de terminación. Se añadió una secuencia universal 5'- ACAAAAAAGCAGGCTGC-3’ (SEQ ID NO: 5) al extremo 5' de cada cebador directo y 5'-ACAAGAAAGCTGGGTAG-3‘ (SEQ ID NO: 6) se añadió al extremo 5' de cada cebador inverso como un sitio de amplificación para la adición de secuencias de clonación attP, como se describe en el manual Invitrogen Gateway Cloning.

Amplificación por PCR de genes virales

Cada MLA se amplificó en una placa de 96 pocillos con un MLA amplificado por pocillo, utilizando los conjuntos de cebadores descritos anteriormente, ADN polimerasa mejorada con Herculasa (Stratagene, LaJolla, CA) y ADN genómico purificado (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD). Los parámetros del ciclo de PCR fueron 1 ciclo a 98°C durante 4 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, 72°C durante 30 segundos y 1 ciclo de 72°C durante 3 minutos 30 segundos. Se volvieron a amplificar cinco microlitros de los productos resultantes con los cebadores 5'-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC-3’ (SEQ ID NO: 7) y 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAG-3' (SEQ ID NO: 8) para añadir las secuencias de clonación attP en cada producto. Los parámetros de los ciclos de PCR fueron los mismos que los de la primera ronda de PCR. Los productos de PCR se procesaron en gel E al 1,2% (Invitrogen, Carlsbad, CA) para verificar el tamaño de cada uno de los productos de PCR.

Clonación de productos de PCR

Los amplicones generados para cada marco de lectura abierto se recombinaron individualmente en el vector pDONR221 (Invitrogen) usando la mezcla de enzimas BP Clonase II (Invitrogen). Cada reacción se incubó durante 1 hora por kb de inserto. Todas las reacciones de recombinación se transformaron en células Mach1 químicamente competentes (Invitrogen) con choque térmico. Las colonias transformantes resultantes se seleccionaron usando PCR de colonias y cebadores de consenso que amplificaron un pequeño fragmento del vector además del clon insertado. Para la PCR, se inocularon reacciones de 25 pl [2X PCR Master Mix (Promega, Madison, WI), DMSO al 6% (Fisher, Pittsburg, PA) y cebadores directos e inversos MI3 (10 pM)] con un solo transformante y se calentaron a 95°C durante 4 minutos, seguido de 25 ciclos de 98°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, 72°C durante 1 minuto por kb, y terminando con una extensión final a 72°C durante 2 minutos. Las reacciones se analizaron mediante electroforesis utilizando geles E de agarosa de 96 pocillos al 1% o de 12 pocillos al 1,2% que contenían bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV. Se cultivaron colonias positivas para insertos de tamaño correcto para la purificación del ADN plasmídico (Promega). Después de la validación, el ADN plasmídico purificado se sometió a una segunda reacción de recombinación para recombinar el inserto en el vector de expresión pEXP4-DEST (Invitrogen) usando la mezcla de enzimas LR Clonase II (Invitrogen). Cada reacción se incubó durante 1 hora por kb de inserto. Todas las reacciones de recombinación se transformaron en células Mach1 químicamente competentes con choque térmico.

Las colonias transformantes resultantes se seleccionaron utilizando técnicas de PCR de colonias con cebadores de consenso T7. Para la PCR, se inocularon reacciones de 25 pl con un solo transformante en la misma mezcla maestra descrita anteriormente y se calentó a 95°C durante 4 minutos, seguido de 25 ciclos de 98°C durante 20 segundos, 45°C durante 20 segundos, 72°C durante 1 minuto por kb, y terminando con una extensión final a 72°C durante 2 minutos. Las reacciones se analizaron mediante electroforesis utilizando geles E de agarosa de 96 pocillos al 1% o de 12 pocillos al 1,2% que contenían bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV. Se cultivaron colonias (pEXP4-DEST(+) HSV-2 MLA) positivas para insertos de tamaño correcto para la purificación del ADN plasmídico (Promega). El ADN plasmídico de cada MLA pEXP4-DEST(+) HSV-2 validado se transformó a continuación con choque térmico en células químicamente competentes Stbl2 (Invitrogen) y también en Stbl2 que expresa una variante citoplásmica de listeriolisina O (Stbl2/pAC(+)cLLO) . Se prepararon reservas de glicerol a partir de cada una de las bibliotecas y se almacenaron a -80°C.

Generación sintética de clones

Tres marcos de lectura abiertos contenían intrones y no pudieron amplificarse por PCR debido a la falta de disponibilidad del ARNm viral. Como resultado, esos clones fueron generados de novo por una empresa contratada (DNA 2.0, Menlo Park, CA). Además, se sintetizó adicionalmente un cuarto clon de novo después de repetidos intentos fallidos de clonarlo utilizando procedimientos estándar. Los fragmentos de ADN sintetizados se recibieron de DNA 2.0 como insertos de pDONR221 después de que los fragmentos fueron validados por tamaño y secuencia, y los insertos se recombinaron en pEXP4-DEST como se describió anteriormente.

Validación de secuencia de biblioteca

Para verificar la secuencia de cada MLA clonado, se envió toda la biblioteca de pEXP4-DEST(+) MLAeoma para secuenciación de un solo paso en Agencourt en Beverly, MA. Para preparar las muestras para la secuenciación, se dividieron en alícuotas de medio 200 pl (10 g/L de triptona y 5 g/L de extracto de levadura (ambos de BD), más 5 g/L de cloruro de sodio y glicerol al 10% (ambos de Fisher) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y cada pocillo se inoculó con un solo clon de las reservas de glicerol de la biblioteca MLA de MachI/pEXP4(+) HSV-2. Los cultivos se hicieron crecer estáticamente durante aproximadamente 8 horas a 37°C, a continuación, se comprobó el crecimiento y se congelaron a -80°C. La placa se entregó a Agencourt a través de un servicio de mensajería y la secuenciación de una sola pasada se realizó mediante paso de cebador. Los datos de la secuencia se analizaron utilizando el software Vector NTI (Invitrogen).

Inducción de biblioteca

Se inocularon placas de 96 pocillos profundos que contenían las bibliotecas congeladas mediante alícuotas de 500 pL de LB 100 pg/mL de carbenicilina (+ 40 pg/mL de cloranfenicol si la biblioteca contenía cLLO) por pocillo de placas de 96 pocillos profundos y con una pipeta p200 de 12 canales, perforando las puntas en la reserva de glicerol de la biblioteca congelada y transfiriendo la suspensión al LB. Las placas se cubrieron con una membrana permeable a los gases y se incubaron durante la noche con agitación a 37°C. Al día siguiente, los cultivos se volvieron a diluir 1:100 en placas nuevas en 1 mL de LB que contenía maltosa al 0,2%, 100 pg/mL de carbenicilina (y 40 pg/mL de cloranfenicol si la biblioteca contenía cLLO). Las placas se cubrieron con una membrana permeable a los gases y se incubaron con agitación hasta que la DO⁶⁰⁰ alcanzó entre 0,6 y 0,8. Se calculó la mediana de la DO de la placa y se extrapoló el número medio de bacterias por pocillo. Se añadieron diez milimolares de MgSO4 a cada pocillo seguido del bacteriófago ACE6 (Novagen, Gibbstown, NJ) a una multiplicidad de infección de doce fagos a una bacteria. Las placas se mezclaron suavemente y a continuación se incubaron a 37°C sin agitar durante 20 minutos y a continuación una hora y cuarenta minutos más con agitación, después de lo cual se midió la DO⁶⁰⁰. A partir de los cálculos de DO, se determinó el número de bacterias por pocillo. Se sedimentaron las bacterias y se resuspendieron en paraformaldehído al 0,5% por pocillo, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se lavaron dos veces con IX PBS. Las bacterias se sedimentaron nuevamente y a continuación se resuspendieron en RPMI que contenía FCS al 10%, 2-mercaptoetanol 55 pM y aminoácidos no esenciales IX, piruvato de sodio y L-glutamina para una concentración final de 2x108 bacterias por mL. Las bacterias inducidas se dividieron en alícuotas en volúmenes de 50 pL en los mismos pocillos de las nuevas placas de fondo en V de 96 pocillos; las placas se cubrieron con selladores de placas de aluminio y se congelaron a -80°C.

Ejemplo 2: Análisis de una biblioteca con células sanguíneas periféricas humanas para identificar antígenos humanos del virus del herpes simple-2

Preparación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)

Se recogió sangre humana completa de un paciente con HSV-2+/HSV-1- mediante venopunción en ocho tubos CPT de heparina sódica (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ) en Bioreclamation Inc. (Hicksville, NY), para un total de 64 mL. El paciente fue diagnosticado en 1988, con una última aparición informada en abril de 2007, y estaba tomando medicamentos antivirales diarios. Todos los tubos se centrifugaron inmediatamente después de la recogida en función de las instrucciones del fabricante y a continuación se enviaron a 4°C durante la noche. Al recibir los tubos, las muestras se aclimataron a temperatura ambiente, se mezclaron y luego se centrifugaron nuevamente en función de las instrucciones del fabricante. El plasma se extrajo y se congeló a -20°C y la capa de células se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 mL. El tubo CPT vacío se lavó tres veces con 3 mL de PBS y los lavados se combinaron en el tubo que contenía las células. Las células se sedimentaron y a continuación se resuspendieron en PBS desgasificado que contenía EDTA 2 mM y BSA al 0,5% y se contaron.

Clasificación de células

Se seleccionaron positivamente poblaciones de células específicas del total de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) utilizando perlas magnéticas (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células T CD4+ se clasificaron primero, seguidas de las células T CD8+ de la fracción de células con depleción de CD4. Finalmente, las células dendríticas (CD) se clasificaron de la fracción con depleción de células T. Todas las células clasificadas se almacenaron en hielo hasta su uso. Se usó una fracción de las células restantes (con depleción de T y CD) para complementar las CD para el análisis ex vivo de la biblioteca (que se describe a continuación) y el resto se congeló a una concentración de 106 células/mL en FBS caracterizado que contenía 10% DMSO y almacenado en nitrógeno líquido.

Análisis de biblioteca ex vivo

Las células T (CD8⁺ para la biblioteca que contiene cLLO y CD4⁺ para la biblioteca que no contiene cLLO) se contaron y ajustaron a una concentración de 5 x 105 células/mL en medio completo (volúmenes iguales de RPMI-1640 y a-MEM con glutamax que contiene suero AB humano al 10%, 2-mercaptoetanol 55 pM y IX de cada uno de HEPES, aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio y L-glutamina) que contiene 20U/mL de rhIL-2 y se volvieron a poner en hielo hasta su uso.

Las placas que contenían las bibliotecas inducidas, fijadas y congeladas (con o sin cLLO coexpresado) se sacaron del congelador a -80°C y se dejaron descongelar a temperatura ambiente. Células dendríticas recién aisladas se mezclaron con células con depleción de T y CD para una concentración final de 2x106 células/mL (la proporción de células CD a células no CD/T fue aproximadamente 1:4) y se cargaron 50 pL por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo para un total de 1x105 CPA por pocillo. Se añadieron 50 pL de la biblioteca descongelada a cada pocillo (107 bacterias por pocillo) y las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C, 5% de CO². Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con IX PBS, centrifugando las placas con cada lavado para sedimentar las células. A continuación, las células se incubaron en medio completo a 37°C, CO² al 5% durante una hora adicional para permitir el procesamiento del antígeno. Después de la segunda incubación, las células se sedimentaron y luego se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 1% durante 15 minutos, después de lo cual se lavaron e incubaron con lisina 120 mM en PBS para eliminar cualquier PFA residual.

Después de un lavado más en PBS, los sedimentos se resuspendieron en 200 pL por pocillo de células T diluidas adecuadamente. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h, después de lo cual se recogieron 150 pL de sobrenadante sin células en los mismos pocillos de una nueva placa de 96 pocillos con fondo en V y se congelaron a -20°C para el análisis ELISA. Se reemplazaron 150 pL de medio completo recién preparado (sin IL-2) en cada pocillo y las placas se dejaron incubar a 37°C, 5% de CO² durante 6 días adicionales, seguido de una segunda recogida de 150 pL de sobrenadante libre de células para un segundo análisis ELISA.

Expansión no específica de células T clasificadas

Las células T clasificadas que no se usaron en el análisis de la biblioteca ex vivo que se describe a continuación se expandieron de manera no específica usando las partículas MACSiBead de Miltenyi siguiendo los protocolos recomendados. En resumen, se cargaron 108 partículas de MACSiBead anti-biotina con concentraciones iguales de anticuerpos específicos CD2, CD3 y CD28 conjugados con biotina, y se mezclaron con las células T clasificadas en medio completo en una proporción de 0,5:1. Las células y perlas se cultivaron a 37°C, 5% de CO² , a una densidad de 5 x 106 células/mL/cm2 durante tres días. Los días tres y cinco, los cultivos se dividieron en dos partes iguales y se suplementaron con medio que contenía 20U/mL de rhIL-2. El día siete, las células se usaron para analizar la biblioteca de HSV-2, como se describe a continuación.

Análisis de biblioteca con células T expandidas no específicamente

El análisis de la biblioteca se configuró como se describe para el análisis ex vivo, con la excepción de que se añadió medio solo o 5 pg/mL de PH A (Sigma) a las células T en pocillos separados como controles negativos y positivos, respectivamente; las células presentadoras de antígenos eran células con depleción de T y DC que habían sido congeladas a -80 °C y descongeladas justo antes del ensayo; y el sobrenadante del ensayo se recogió y se congeló solamente a las 24 h.

Ensayo ELISA para determinación de IFN^y

Los niveles de IFNy en los sobrenadantes se analizaron usando el kit OptEIA IFNy ELISA de BD Biosciences (San José, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante, con la excepción de que todos los volúmenes se redujeron a la mitad. Los sobrenadantes se descongelaron a temperatura ambiente y se diluyeron 1:5 y 1:20 en PBS que contenía FCS al 10%. Las muestras que fueron positivas en el ELISA se volvieron a analizar en un segundo ensayo ELISA para verificar los resultados.

La Figura 1 muestra los resultados de las células T CD8⁺ recién aisladas de un paciente infectado por HSV-2. Las células se cultivaron conjuntamente con células presentadoras de antígenos autólogas que se habían pulsado con E. coli que expresaba LLO citoplásmico. Los sobrenadantes libres de células se recogieron después de 7 días de cultivo. Cada barra representa los niveles de IFNy secretados por células T expuestas a células presentadoras de antígenos pulsadas con un único clon viral. Las barras negras representan antígenos que habían sido identificados previamente usando otros procedimientos. Seis de los clones representados por barras blancas no tienen una función conocida y probablemente no se habrían identificado mediante procedimientos convencionales de descubrimiento de antígenos. Estos datos muestran que los procedimientos descritos en esta invención identifican con éxito antígenos humanos conocidos frente a un agente infeccioso y pueden usarse para revelar nuevos antígenos.

Ejemplo 3. Validación de biblioteca de alto rendimiento de expresión de polipéptidos heterólogos y presentación de CMH

Para realizar una determinación de alto rendimiento de la expresión de proteínas de la biblioteca y la entrega a las vías de presentación del CMH de clase I o del CMH de clase II, una etiqueta C-terminal que contiene epítopos de células T CD4⁺ y CD8⁺ de ovoalbúmina de pollo (OVA247-265 (PDEVSGLEQLESIINFEKL; SEQ ID NO: 9) y OVA258-265 (SIINFEKL; SEQ ID NO: 10) respectivamente, correspondiente a posiciones en la secuencia de aminoácidos encontrada en GenBank® bajo No. Acc. NP 990483) se insertó en pDEST17 para crear pDESTSL4.8. Cuando los productos de PCR que contienen MLA (por ejemplo, MLA de un agente infeccioso de interés) se recombinan en pDESTSL4.8 utilizando el sistema de recombinación Gateway, la etiqueta se fusiona con cada MLA expresado en el C-terminal. Esta etiqueta se puede utilizar para determinar si cada proteína se expresó en su longitud completa y se entregó a la vía de presentación del CMH adecuado.

Para evaluar la presentación del CMH de clase I, las proteínas se coexpresan con cLLO en E. coli. A continuación, las bacterias se pulsan sobre macrófagos de médula ósea (MMO) derivados de un ratón haplotipo H2^b . La cLLO facilita la entrega de cada MLA expresada junto con la etiqueta C-terminal a la vía de presentación del CMH de clase I en los MMO. Si la longitud de caída de cada MLA se expresa y se entrega correctamente a la vía del CMH de clase I, el péptido OVA258-265 se procesa y se presenta en las moléculas del CMH de clase I, que son moléculas de H2-K^b , en las células MMO. La presentación de este péptido puede detectarse mediante el uso de células de hibridoma B3Z T, que se activan al reconocer este complejo péptido OVA específico-CMH. Las células T B3Z activadas producen pgalactosidasa, que puede detectarse mediante el uso de sustratos colorimétricos de p-galactosidasa como el rojo de clorofenilo p-D galactopiranósido (CPRG). El CPRG cambia de un color amarillo a un magenta oscuro cuando se escinde con la p-galactosidasa, lo que indica que el MLA se expresa y procesa correctamente.

Para la presentación del CMH de clase II, las proteínas se inducen en E. coli en ausencia de cLLO. A continuación, las bacterias se pulsan sobre MMO derivados de un ratón haplotipo H2^k . La proteína expresada permanece en la vacuola y se entrega a la vía del CMH de clase II junto con la etiqueta C-terminal. La etiqueta OVA^247-265 se procesa y se presenta en moléculas H2-A^k en la superficie de la célula que son reconocidas por las células del hibridoma T KZO. Las células KZO regulan positivamente la p-galactosidasa en respuesta al complejo péptido-CMH que se mide nuevamente con la detección de CPRG. De esta manera, la expresión de proteínas y la presentación de CMH de clase I y clase II se pueden confirmar antes de analizar la biblioteca con células T específicas de patógenos.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para identificar un antígeno tumoral, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar una biblioteca que comprende células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli, donde cada célula bacteriana de la biblioteca comprende un polipéptido heterólogo expresado en una célula tumoral;

(b) poner en contacto las células bacterianas con una primera pluralidad de células humanas que comprende células presentadoras de antígenos humanos profesionales que internalizan las células bacterianas;

(c) poner en contacto la primera pluralidad de células humanas con una segunda pluralidad de linfocitos humanos que están recién aislados; recién aislados y congelados hasta su uso; o recién aislados y estimulados para que proliferen in vitro de una manera no específica de antígeno, en condiciones en las que los linfocitos son estimulados por polipéptidos presentados por la primera pluralidad de células humanas; y

(d) determinar si un linfocito de la segunda pluralidad de linfocitos humanos es estimulado por un polipéptido heterólogo presentado por una célula de la primera pluralidad de células humanas, donde la estimulación de un linfocito de la segunda pluralidad de linfocitos humanos por un polipéptido heterólogo presentado por una célula de la primera pluralidad de células humanas indica que el polipéptido heterólogo es un antígeno tumoral.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde:

(1) la primera y segunda pluralidad de células humanas comprenden células aisladas del mismo individuo;

(2) la primera pluralidad de células humanas comprende células sanguíneas periféricas con depleción de células T y células dendríticas;

(3) la biblioteca expresa etiquetas C-terminales que incluyen etiquetas de epítopo CMH clase I y CMH clase II; o

(4) las etapas (b) a (d) se repiten con células humanas aisladas de uno o más individuos adicionales, donde los individuos adicionales tienen diferentes reactividades al cáncer o al antígeno tumoral que los individuos iniciales.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde las células bacterianas comprenden un polipéptido de citolisina, por ejemplo listeriolisina O (LLO), y opcionalmente donde: (a) la expresión del polipéptido de citolisina se induce en las células bacterianas, antes de poner en contacto las células bacterianas con la primera pluralidad de células humanas; o (b) la segunda pluralidad de linfocitos humanos comprende células T CD8+.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde: (a) la primera pluralidad de células humanas y/o la segunda pluralidad de linfocitos humanos comprenden células humanas primarias, opcionalmente aisladas del mismo individuo; (b) se destruye la primera pluralidad de células humanas, antes de poner en contacto las células con la segunda pluralidad de linfocitos humanos; o (c) la primera pluralidad de células humanas se proporciona en una matriz, donde las células en cada ubicación de la matriz se ponen en contacto con un conjunto de células bacterianas, cada conjunto comprende un polipéptido heterólogo diferente, opcionalmente donde la primera pluralidad de células humanas y la segunda pluralidad de linfocitos humanos en cada ubicación de la matriz comprende cada una 1x104 - 1x106 células.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, donde la primera pluralidad de células humanas y la segunda pluralidad de linfocitos humanos comprenden células humanas primarias de sangre periférica, donde opcionalmente: (a) la primera pluralidad de células humanas comprende células de sangre periférica con depleción de las células T y las células dendríticas; o (b) la primera pluralidad de células humanas comprende células dendríticas y células de sangre periférica con depleción de las células T y las células dendríticas, por ejemplo en una proporción de aproximadamente 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5; o (c) la segunda pluralidad de células humanas comprende células T CD4+; o (d) la segunda pluralidad de células humanas comprende células T CD8+.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, donde la primera pluralidad de células humanas y la segunda pluralidad de linfocitos humanos comprenden células humanas primarias y la primera pluralidad de células humanas comprende células dendríticas.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, donde el individuo es un individuo que tiene o ha tenido un cáncer.

8. El procedimiento de la reivindicación 4, donde el individuo padece un cáncer o tumor, y donde los polipéptidos heterólogos se expresan o alteran diferencialmente en las células tumorales.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, donde la biblioteca de células bacterianas comprende al menos 25, 50, 75, 100 o 250 conjuntos de células bacterianas, y donde las células de cada conjunto comprenden un polipéptido heterólogo que es diferente del polipéptido heterólogo de los otros conjuntos.

10. El procedimiento de la reivindicación 4, donde los polipéptidos heterólogos comprenden: (a) polipéptidos de longitud completa que se expresan o alteran diferencialmente en células tumorales; o (b) polipéptidos que son fragmentos de polipéptidos de longitud completa que se expresan o alteran diferencialmente en células tumorales.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde (a) se induce la expresión del polipéptido heterólogo en las células bacterianas, antes de poner en contacto las células bacterianas con la primera pluralidad de células humanas; o (b) las células bacterianas se ponen en contacto con la primera pluralidad de células humanas durante 30 minutos a 5 horas, antes de la etapa (c), donde opcionalmente se lava la primera pluralidad de células humanas para eliminar las células bacterianas que no son internalizadas por las células humanas, antes de la etapa (c); o (c) donde la primera pluralidad de células humanas se pone en contacto con la segunda pluralidad de linfocitos humanos en una proporción de aproximadamente 1:1; o (d) donde la primera pluralidad de células humanas se pone en contacto con la segunda pluralidad de linfocitos humanos durante 18-72 horas, 72 horas o más o 5 días o más, antes de la determinación de la etapa (d); o (e) la determinación de la etapa (d) comprende detectar la secreción de citocinas por la segunda pluralidad de linfocitos humanos, por ejemplo donde se detecta la secreción de IFNy, TNFa o TNFp; o (f) la determinación de la etapa (d) comprende detectar la proliferación de la segunda pluralidad de linfocitos humanos; o (g) la determinación de la etapa (d) comprende detectar un cambio en la expresión de una molécula de la superficie celular en células de la segunda pluralidad de linfocitos humanos, con respecto a un control; o (h) se identifican dos o más antígenos tumorales.

12. El procedimiento de la reivindicación 8, que comprende además repetir las etapas (b) a (d) con células humanas aisladas de uno o más individuos adicionales.

13. Un procedimiento para evaluar una respuesta inmunitaria de un sujeto humano, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar una biblioteca que comprende células bacterianas, donde cada célula bacteriana de la biblioteca comprende un polipéptido heterólogo expresado en una célula tumoral;

(b) poner en contacto las células bacterianas con una primera pluralidad de células humanas que comprende células presentadoras de antígenos humanos profesionales que internalizan las células bacterianas;

(c) poner en contacto la primera pluralidad de células humanas con una segunda pluralidad de linfocitos humanos que están recién aislados; recién aislados y congelados hasta su uso; o recién aislados y estimulados para que proliferen de una manera no específica de antígeno en condiciones en las que los linfocitos son estimulados por polipéptidos presentados por la primera pluralidad de células humanas; y

(d) determinar si un linfocito de la segunda pluralidad de linfocitos humanos es estimulado por un polipéptido heterólogo presentado por una célula de la primera pluralidad de células humanas, evaluando así una respuesta inmunitaria del sujeto humano, opcionalmente donde: (i) la primera pluralidad de células humanas se aísla del sujeto humano; y/o (ii) los polipéptidos heterólogos comprenden polipéptidos que se expresan o alteran diferencialmente en las células tumorales, y donde la estimulación de un linfocito del sujeto humano por un polipéptido expresado o alterado diferencialmente en una célula tumoral presentada por una célula de la primera pluralidad de células humanas indica que el sujeto humano tiene una respuesta inmunitaria al polipéptido expresado en una célula tumoral.