JPH03503760A

JPH03503760A - ヒト・パラインフルエンザウイルス３型の免疫原性セグメント類を含有するキメラ糖蛋白類

Info

Publication number: JPH03503760A
Application number: JP89502794A
Authority: JP
Inventors: ワーサン，マイケル
Original assignee: ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1988-04-22
Filing date: 1989-03-03
Publication date: 1991-08-22
Anticipated expiration: 2015-03-27
Also published as: AU611784B2; WO1989010405A1; KR970009347B1; NO303499B1; CA1306709C; DK172635B1; NO904538L; DE68915165D1; FI905184A0; HK37397A; DE68915165T2; US5169628A; EP0413695A1; NO904538D0; FI102616B; DK251890D0; FI102616B1; DK251890A; US5284764A; ATE105334T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１９、ワクチン接種によりヒト・パラインフルエンザウィルス３型からヒトを保護するワクチンを調製するための請求の範囲第１７項記載のポリペプチドの使用。

ヒト・パラインフルエンザウィルス３型の免疫原性セグメント類を含有するキメラ糖蛋白類発明の分野本発明は、ヒト・パラインフルエンザ３型、ＰＩＶ３に対するウィルス特異的免疫応答を調製するのに有用な新規キメラＭ蛋白類を含む。該糖蛋白類についてコード付けする構造遺伝子類で形質転換ミド類、該糖蛋白類から製造したワクチン類および該ワクチン類によってヒトを保護する方法も本発明の一部である。

背景ヒト・パラインフルエンザ３型、ＰＩＶ３は幼児および幼少の子供におけるひどい下部気道病の重要な主要原因である。該ウィルスは世界的に起こり、４才未満のすべての子供を事実上感染させる。

急性呼吸器病および２次的合併症は、呼吸器系の未成熟のため、幼ない。下部呼吸器感染は気道のすべてのセグメントに帰せるれ、通常、発熱、咳、鼻水、および疲労に関係し、臨床的には気管支炎、細気管支炎、肺炎、クループ、またはウィルス感染と診断される。

より年令のいった子供および成人も再感染するが、再感染は、典型的には、ひどくはない上部気道病となる。

効果的なＰｆＶ３ワクチン類を開発しようとする試みは大部分失敗に終わっている。生ＰＩＶ３ワクチンまたは不活化Ｐ［＼′３ワクチンはウィルス特異的血清抗体の増加を示したが、該病気に対する大きな保護を提供するものではなかった。

情報開示の陳述組換体ワクシニアウィルス発現系はＰ　Ｉ　Ｖ　３のＦおよびＨＮ糖蛋白類を別々に発現し、攻撃されたコノトン・ラットにおいて別々に保護免疫応答を誘導することが知られている［コリンズ・ビイ・エルら（Ｃｏｌｌｉｎｓ、　Ｐ、Ｌ、、ｅｔ　ａｔ）、組換体ワクシニアウィルスによるヒト・パラインフルエンザウィルス３型のＦおよびＨＮ糖蛋白類の発現：個々の蛋白類の宿主免疫性に対する寄与（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅＦ　ａｎｄ　ＩＮ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　３ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｄｉｖｉ−ｄｕａｌ　Ｐｒｏｔｅｒｎｓ　ｔｏ　Ｈｏ５ｔ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、ジセーナル・オブ・パイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６１．　３４１６〜３４２３（１９８７）］。

また、組換体ワクシニアウィルス発現系はＰＩＶ３−４％異異的血清中和体を誘導し、霊長類の気道におけるＰＩＶ３複製に対する耐性を付与することが知られている〔フリンズ・ビイ・エルら（Ｃｏｌｌｉｎｓ。

Ｐ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ）　、シイ−ナル・オブ・パイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｖｉ−ｒｏｌｏｇｙ）６２　：　１２９３−１２９６　（１９８８）　］　、精製したＦおよびＨＮｌｉＮｌ類の混合物での免疫化はウィルス中和活性を誘導し、ハムスターにおいて攻撃感染からの完全な保護を提供した［レイ・アールら（Ｒａｙ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ）、　　ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６２　：　７８３−７８７（１９８８）］。

発明の要約本発明は、シグナル配列ならびにヒト・パラインフルエンザウィルス３型のＦおよび）（Ｎ両糖蛋白からの少なくとも１つの免疫原性断片よりなるポリペプチドを含む。この蛋白のワクチンとしての使用、ＰＩＶ３−関連病を防止する方法、および組換技術を用いての本蛋白の調製もまた本発明の一部である。

詳細な記載以下に定義する語は本明細書中で用いる。「細胞培養」なる語句は、細胞が元の植物または動物の外部で活力を維持することを可能ならしめる、多細胞植物または動物いずれかに由来する増殖細胞の封じ込めをいう。「下流」なる語は発現の方向にさらに進めた配列に同じであり；例えば、コーディング領域は開始コドンよりも下流にある。「上流」なる語は発現から反対の方向に進めた配列に同じであり；例えば、細菌プロモーターは転写ユニットより上流にあり、開始コドンはコーディング領域よりも上流にある。「微生物」なる語は、細菌、放線菌および酵母のごとき単細胞原核生物および真核生物を共に包含する。「オペロンｊなる語は遺伝子の発現および調節の完全な二二、、トであり、構造遺伝子、調節遺伝子および調節遺伝子産生物によって認識されるＤＮＡにおける制御要素を包含する。

「プラスミド」なる語は、自律複製する染色体外環状ＤＮＡをいい、発現および非発現タイプを共に包含する。組換体微生物または細胞培養が発現プラスミドの宿主となると記載する場合、「発現プラスミド」なる語は染色体外環状ＤＮＡおよび宿主染色体に組み込まれたＤＮＡを共に包含する。プラスミドが宿主細胞によって維持されている場合、該プラスミドは、自律構造、あるいは宿主ゲノムの組み込まれた一部いずれかとして、有糸分裂の間、該細胞によって安定に複製される。「プロモーター」なる語は、転写を開始させるためにＲＮＡポリメラーゼを結合させることに関与するＤＮＡの領域である。ｒＤＮＡ配列」なる語句は、ヌクレオチド塩基、アデノシン、チミジン、シトシンおよびグアノシンよりなる一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子をいう。「実質的に純粋」なる語は、所望の組換体キメラ糖蛋白以外のパラインフルエンザウィルス蛋白を含有しない蛋白組成をいう。実質的に純粋な蛋白は低レベルの宿主細胞構成物で汚染し得るが、該蛋白は複製パラインフルエンザウィルスによって産生される汚染物たる構造および非構造ウィルス蛋白を欠く。「適当な宿主」なる語句は、組換体プラスミドに適合し、プラスミドが複製され、そのゲノムへ組み込まれ、または発現されるのを可能とする細胞培養または微生物をいう。

本発明は種々の公知方法で達成され得る一連の分子遺伝子操作を含む。該操作は、蛋白のＣＤＮＡを得ること、該ｃＤＮＡのイー・コリ中でのクローン化および複製ならびに適当な宿主中での所望のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの発現であると要約できる。以下の記載は蛋白を発現させるために利用できる種々の方法を詳細に述べたものであり、好ましい方法の特別の実施例によって裏付けられる。

一般に、本発明において必要な命名法および一般的な実験室的手法は、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ）、モレキユラー・クローニング−７ −ラボラトリ−・マニニアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、　ニューヨーク（１９８２）中に見い出すことができる。

すべてのイー・コリ株は、グルコースを含むルリア・ブロス（ＬＢ）、ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）の抗生物質培地＃２ならびにグルコースおよび酸加水分解したカゼインアミノ酸を補足したＭ９培地上で増殖させる。抗生物質に対して耐性な株をマニアティスに記載されている薬剤濃度で維持した。ロウエカンプおよびフィルチル（Ｒｏｖｅｋａｍｐ　ａｎｄ　Ｆｉｒｔｅｌ）　、ディベロップメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、）、　　７９　：　４０９〜４１８（１９８０）に記載されている方法に従って形質転換を行った。

すべての酵素は製造業者の指示に従って用いた。グルンステインおよびプラス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｗａｌｌｉｓ）、　メソノズ・インーｘンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　　６８　：　３７９〜３８８に記載されているごときコロニー・ノ＼イブリダイゼーションによって形質転換体を分析した。

ハイブリダイゼーションの後、プローブを取り出し、保存し、フィルターを０．１％ＳＤＳ、０．２ｘＳＳＣ中、各４０ｏｍＱを５回交換して合計３時間洗浄した。フィルターを十分に風乾し、セ・ノドし、コダックＸ−ＯＭＡＴ　　ＡＲフィルムおよびデュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）、クロネックス・ライテニング・プラス（Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ）補力スクリーンを用い、− ７０’にて、適当な時間オートラジオグラフィーに付した。

プラスミドの配列決定については、マニアテイスに記載されている方法に従って、精製したプラスミドＤＮＡを調製する。末端標識したＤＮＡ断片を調製し、コリンズおよびウエルツ（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ａｎｄｖｅｒｔｚ）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、　　５４　：６５−７１　（１９８５）によって記載されている修飾を伴うマ牛サムおよびギルバート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）の化学配列決定法によって分析した。

ヌクレオチドのサイズはキロベース（Ｋ　ｂ）または塩基対（ｂ　ｐ）で表す。

これらは、アガロースゲル電気泳動からの見積ったものである。

蛋白の発現を達成する第１工程は、ｃＤＮＡクローンから蛋白についてコード付けするＤＮＡ配列を得ることにある。次いで、この配列を、遺伝子の転写を指令でき、転写体の効果的な翻訳を可能とする発現プラスミドにクローン化した。蛋白をコード付けするｃＤＮＡを得るための実験室的方法は一般にマニアテイス、および、ことにエランゴら（Ｅｌａｎｇｏ、ｅｔ　ａｌ）　、　　ｒヒト・バラインフルエンザ３型ウイルス・血球凝集素−フイラミニダーゼ糖蛋白：ｍＲＮＡのヌクレオチド配列および精製蛋白の限定アミノ酸配列（Ｈｕａ＋ａｎＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　　Ｔｙｐｅ　　３　　Ｖｉｒｕｓ　　Ｈｅａａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｎｅｕｒａｓ＋１ｎｉｄａｓｅＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　：　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｓ　ｏｆ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　Ａａｉｎ。

Ａｃ１ｄ　５ｅｑｕｅｎｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｊ　、ジャーナル・オブａｔ＜イロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、　　Ｃ）７：４８１−４８９（１９８６）およびスブリッグズら（Ｓｐｒｉｇｇｓ、ｅｔ　ａｌ）、　　ｒヒト・パラインフルエンザウィルス３型の融合糖蛋白：ヒト遺伝子のヌクレオチド配列、切断−活性化部位の直接同定、および他のパラミキソウイルスとの比較（Ｆｕｓｉｏｎ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　３：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ、　　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　０ｔｈｅｒＰａｒａａ＋ｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）Ｊ　＋パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、　１５２　：　２４１−２５１　（１９８６）に記載されている。

ｄＧＴＰのホモポリマー・トラクトが切断部位の３゛末端に酵素的に付加されたＰｓｔＩ切断ｐＢＲ３２２にｃＤＮＡを挿入することによってクローンを調製する。マニアテイスによって記載されている方法に従い、ｄＣＴＰのホモポリマー・トラクトをｃＤＮＡ分子の３′末端に酵素的に付加する。理想的には、クローニング効率を最大化するためには、ｄＣＴＰまたはｄＧＴＰのｌＯ〜３０残基を添加すべきである。該ｃＤＮＡおよびプラスミドを一緒にアニールし、イー・コリに形質転換する。全長ｃＤＮＡを含有するクローンは、標識したウィルスｃＤＮＡまたは遺伝子配列の部分に対して相捕的なオリゴヌクレオチドのプローブ、続いての制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって検出する。

二一ドハムーバンデバンターら（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（＼ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、　　１２　：８１＋９−６１６８（１９８４）に記載されているごとき自動合成器を用い、ボーケージおよびカルザース（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）。

テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、　　２２　（２０）　：１５８９−１８６２　（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホルアミディトトリエステル法に従って、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する。オリゴヌクレオチドの精製は、パーソンおよびレニｖ　（Ｐｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｇｎｉｅｒ）、　　ジャーナル・オブークロマトグラフィー（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、）、　　２５５　：　１３７　（１９８３）に記載されているごと（、天然アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣいずれかによる。

合成オリゴヌクレオチドの配列は、マキサムおよびギルバート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）、　グロスマンおよびモルディプ（Ｇｒｏｓｓｉａｎａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｖｅ）！！、　アカデミツク・プレス（＾ｃａｄｅａ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、　　ニ二−ヨーク、メソソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｉｏｇｙ）、６５　：　４９９−５６０　（１９８０）の化学分解法を用いて確認することができる。

原核生物系においてクローン化遺伝子の高レベル発現を達成するには、最小限、ｍＲＮＡ転写を指令する強力なプロモーター、翻訳開始用リポソーム結合部位、および転写ターミネータ−を含有する発現ベクターを構築することが必須である。この目的に適した調節領域の例は、ヤノフスキイ、ケリー、およびホーン（Ｙａｎｏｆｓｋｙ。

Ｋｅｌｌｅｙ、ａｎｄ　Ｈｏｒｎ）　、　　ジャーナル・オブ・バクテリオロジ −（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　１５８　：　１０１８−１０２４　（１９８４）によって記載されているごときイー・コリのトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域ならびにヘルスコウィッッおよびハーゲン（ｔｌｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　ａｎｄ　Ｗａｇｅｎ）、アヌ・レブ・ジェネト（Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、）、　　１４　：　３９９−４４５　（１９８０）によって記載さイー・コリにて産生される蛋白は、システィン残基の存在、および適当な゛翻訳後修飾の欠損のため、適当には折り畳まれない。イー・コリからの精製の間、発現された蛋白をまず変性させ、次いで、復元させなければならない。これは、イー・コリ産生の蛋白を塩酸グアニジンに可溶化し、すべてのシスティン残基をβ−メルカプトエタノールで還元することによって達成される。次いで、蛋白を、ゆっくりとした透析またはゲル濾過いずれかによって復元する二米国特許第４５１１５０３号コ。

蛋白の検出は、ラジオイムノアッセイ、またはウェスタンブロッティング法あるいは免疫沈殿のごとき当該分野で公知の方法によって達成される。イー・コリからの精製は米国特許第４５１１５０３号に記載されている手法によって達成できる。

異種蛋白の酵母における発現はよく知られ、記載されている。メン・／ズ・イン・イースト・ジェネテ４　グロス（ＭｅｔｈＯｄｓ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔ　１ｃｓ）、　　ジャーマンら（Ｓｈｅｒｍａｎ、ｅｔ　ａｌ）、　　コールド・スプリング拳ハーバ−もラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。

（１９Ｂ２）は、酵母において蛋白を産生ずるのに用いる種々の方法を記載するよ（知られた文献である↓ 酵母における遺伝子の高レベル発現のためには、該遺伝子を原核生物におけるごとき強力なプロモーター系に結合し、また酵母遺伝子からの十分な転写停止／ボリアデニレーシ夏ン配列を供することが必須である。有用なプロモーターの例はＧＡＬｔ、１０ｒジ１ンストンおよびディビス（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ）、モレキユラー・アンド・セリ１ラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）、　４　：１４４０−１４４８（１９８４）コ、ＡＤＨ２［ラッセルら（Ｒｕｓｓｅｌｌ。

ｅｔ　ａｌ）、　　ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａｐ、）、２５８　：　２６７４−２６８２（１９８３）］、ＰＨ０５［ＥＭＢＯＪ、６　：　６７５−６８０（１９８２））およびＭＦαｌを包含する。Ｌｕｅ−２、ＵＲＡ−３、Ｔｒｐ−１，またはＨｉｓ−３のごとき選択マーカーを有するマルチコピープラスミドもまた望ましい。該ＭＦαｌプロモーターが好ましい。α交配型の宿主において該ＭＦα１プロモーターは構成的であるが、ａ交配を有する二倍体または細胞では作動停止している。しかしながら、それは、ＳＴＲ座の１つにｔｓ突然変異を有する宿主中で温度を上昇または低下させることによって調節できる。３５℃におけるかかる突然変異がα型細胞に与える影響はα交配型についてコード付けする通常はサイレントな遺伝子を作動開始する三とにある。一方、サイレントなａ交配型遺伝子の発現はＭＦα１プロモーターを作動停止させる。増殖温変の２７°Ｃへの低下は全プロセスを逆行させる。すなわち、ａ交配型を作動停止させ、ＭＦα１を作動開始させる二ヘルスコウィッツおよびオーシマ（Ｈｅｒｓｋｏｖｉｔｚ　ａｎｄ　Ｏｓｈｉｍａ）、ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・す・ノカロミセス（ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、　　シートラセルシン・ジジーンズおよびブローチ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｊｏｎｅｓ、　ａｎｄ　Ｂｒｏａｃｈ）綱、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、）、コールド・スプリング・ノ）−バー（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）、　　ニューヨーク、１８１−２０９　（１９８２）二。

ポリアゾニレ−ジョン配列はＡＤＨ１、ＭＦα１、またはＴＰＩのような高発現遺伝子いずれかの３°末端配列により供される［アルバーおよびカワサキ（Ａｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ）、゛シイーナル・オブ・モレキユラー・アンド・アプライド・ジエ不テイ・ノクス（Ｊ、　ｏｒ　Ｍｏｌ。

ａｎｄ　ＡＰＩ）１．Ｇｅｎｅｔ、）、　　１　：　４１９−４３４　（１９８２）　２゜ｙｇｐｓ、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４のような酵母発現プラスミドをベクターとして用いることができる。注目する遺（公子を前記プロモーターのいずれかに融合させ、次いで、種々の酵母宿主における発現用プラスミドに結ぶことができる。これらのプラスミドは、文献ポートスティンら（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、ｅｔ　ａｌ）、　　ジーン（Ｇｅｎｅ）、　　８　：　１７−２４　（１９７９）：ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ、　ｅｔ　ａｌ）、　　ジーン（Ｇｅｎｅ）。

８：１２１−１３３　（１９７９）に詳細に記載されている。

酵母細胞の形質転換で２種の手法を用いる。１の場合、チモラーゼ、リティカーゼまたはグルスラーゼを用いて酵母細胞をまずプロトプラストに変換し、続いてＤＮＡおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加する。次いで、該ＰＥＧ処理プロトプラストを選択条件下、３％寒天培地中で再生する。この手法の詳細はベッグズ（Ｂｅｇｇｓ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　（ｏンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））、　　２７５　：１０４−１０９　（１９７８）；およびヒンネンら（Ｈｉｎｎｅｎ、　ｅｔ　ａｌ）。

プロシーディングズ・オブ・ナシ１ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　　７５　：　１９２９−１９３３（１９７８）中に記載されている。第２の手法は細り壁の除去を含まない。代わりに細胞を塩化または酢酸リチウムとＰＥＧで処理し、選択平板上に置く　［イト−ら（Ｉｔｏ、　ｅｔ　ａｌ）　＋　　ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔ、）　、　　１５３　：　１６３−１６８（１９８３）］。

宿主細胞培養を形質転換するのに用いる種々の発現ベクターにｃＤＮＡを結ぶことができる。ベクターはすべて、形質転換されるべき宿主細胞に適合する蛋白の転写および翻訳を開始させるための配列を含有する。

加えて、ベクターは、好ましくは、ジヒドロ葉酸還元酵素またはメタロチオネインのごとき形質転換宿主細胞の選択についての表現型特性を提供するためのマーカーを持つ。加えて、複製ベクターはレプリコンを含有し得る。

昆虫または哺乳動物細胞培養は蛋白の産生に有用である。哺乳動物細胞浮遊液を用いることもできるが、哺乳動物細胞系はしばしば細胞の単層形態とする。哺乳動物細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬＡ、チャイニーズ＆／％ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ　１３８、ＢＨＫ、ＣＯ３−７またはＭＤＣＫ細胞系を包含する。

宿主細胞を形質転換するのに用いるベクターは、好ましくは、蛋白遺伝子配列の転写および翻訳を開始させるための配列を含有する。

これらの配列を発現制御配列という。宿主細胞が哺乳動物または昆虫起源のものである場合、有用な発現制御配列の例は５Ｖ−４０プロモーター、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　　２２２．　５２４−５２７（１９８３）、ＣＭＶ　　１．Ｅ、ブ（１％−夕−［プロシーテインクス・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）８１　：　６５９−６６３　（１９８４）コ、メタロチオネインプロモーター、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、　　２９６．　３９−４２（１９８２）またはバクロウィルス・ポリへドリンプロモーター（昆虫細胞）、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌ、）、　　１３１．　５６１−、＋６５（１９８３）から得られるものである。発現制御配列を含有するＤＮＡ物質を＊製しまたは組み込むためのプラスミドは制限酵素を用いて切断し、要すれば、あるいは所望によりサイズを調整し、当該分野でよく知みれた方法を用い、蛋白をコード付けするｃ　ＤＮＡで結ぶ。

高等動物宿主細胞を用いる場合、公知哺乳動物遺伝子からのポリアゾニレ−ジョンまたは転写ターミネータ−配列がベクターに組み込まれることを要する。ターミネータ−配列の例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアブニレ−シラン配列である。

加えて、ウシ・乳頭腫ウィルス型ベクター［サベリアーカンボ（Ｓａｖｅｒｉａ −Ｃａｍｐｏ）、「ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡ　：真核生物クローニングベクター（Ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ：ａ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）、ディ・エイ・エヌ・クローニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）■巻・・・実践的アプローチ（Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）、グロバー（Ｇｌｏｖｅｒ）ＩｉＡ、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、アーリントン（Ａｒｌ　ｉｎｇｔｏｎ）、バージニア州２１３−２３８（１９８５）］に見い出されるごときベクターに宿主細胞で複製を制御する遺伝子配列を組み込むこともできる。

チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で蛋白を発現するのに有用で好ましい発現ベクターは、各々、イー・コリおよびＣＨＯ細胞中でマーカーとしてアンピシリン耐性およびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用してＣＨＯおよびイー・コリ双方中で複製するシャトル・ベクターｐｓＶｃＯＷ？である。また、プラスミドｐｓＶｃＯＷ７は、ＣＨＯ細胞での発現に必要なウシ成長ホルモンからのボリアデニレーシ１ン配列を提供する。プラスミドｐＳＶＣＯＷ７を切断し、ウィルスプロモーターおよびｃＤＮＡを挿入する。

昆虫細胞中で蛋白を発現するための組換体バクロウィルスを形成するのに有用な好ましい発現ベクターはｐＡｃ３７３である［スミスら（Ｓｍｉｔｈ、　ｅｔ　ａｌ）、モレキユラー・アンド・セリニラ−・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）３　：　２１５６−２１６５　（１９８３）コ。

該プラスミドはアンピシリン耐性を利用してイー・コリ細胞中で複製し、遺伝子の発現用バクロウィルス・ポリヘトリン遺伝子からの真核生物プロモーターおよびポリアゾニレ−ジョンシグナルを提供する。プラスミドｐＡｃ３７３を切断し、ｃＤＮＡを該プロモーターに隣接させて挿入する。この新しいプラスミドを、リン酸カルシウム沈殿法によって、バクロウィルス（アウトグラバ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス）ＤＮＡで昆虫細胞に共トランスフェクトする。同種組換えによって、ｃＤＮＡを含有するｐＡｃ３７３ポリヘトリン遺伝子が、存在するウィルスポリヘトリン遺伝子を置き換えた組換体バクロウィルスは、プローブとして■Ｐ−標識ｃＤＮＡを用いるドソトブロットハイブリダイゼーシ璽ンによって検出される［サマーズおよびスミス（Ｓｕｍｍｅｒｓ　ａｎｄＳｍｉｔｈ）、バクロウィルスベクターおよび昆虫細胞培養法のマニュアル（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔＣｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）　、テキサス−エイ・アンド−ｚム大学（Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、カレッジ・ステージ薯ン（ＣｏｌｌｅｇｅＳｔａｔ　１ｏｎ）、テキサス州、２９−３０　（１９８６）コ。組換体バクロウィルスに感染した昆虫細胞はその閉塞陰性形態によって識別できる。というのは、ｃＤＮＡのポリヘトリン遺伝子への挿入はこの閉塞形成蛋白の合成を妨げるからである。

蛋白を発現させるウシ乳頭腫ウィルス（Ｂ　Ｐ　Ｖ）と組み合わせて用いる好ましい発現ベクターはｐＴＦＷ９である（プラスミドｐＴＦＷ９はブダペスト条約に従い寄託した。プラスミドｐＴＦＷ９をイー・コリ宿主中に維持し、１９８６年１１月１７日にノーザン・リージ璽ナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、イリノイ州、米国に寄託し、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１４１が与えられた）。該プラスミドはアンピシリン耐性を利用してイー・コリ中で複製し、遺伝子の発現のためのマウス・メタロチオネイン・プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニレーシ１ンシグナルを提供する。プラスミドｐＴＦＷ９を切断し、ｃ　ＤＮＡを該プロモーターに隣接して挿入する。次いで、この新しいプラスミドを切断してＢＰＶの挿入を可能とする。組換体プラスミドをリン酸カルシウム沈殿法によって動物細胞にトランスフェクトし、形質転換された細胞のフォーカスを選択する。

宿主細胞はトランスフエフシコンに対し受容能があるか、または種々の手段によって受容能を与える。ＤＮＡを動物細胞に導入するにはいくつかのよく知られた方法がある。これらは、リン酸力ルシラム沈殿、受容細胞とＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの融合、ＤＮＡを含有するリポソームでの受容細胞の処理、ＤＮＡの細胞への直接マイクロインジェクタ１ンを包含する。トランスフェクトした細胞を当該分野でよく知られた手段により培養する［細胞培養およびウィルス学における生化学方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌ　ａｎｄ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、クチナー、ドーデン、ヒ・２チンソンおよびロス・インコーポレイテノド（Ｋｕｃｈｌｅｒ、　Ｄｏｗｄｅｎ、　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　ａｎｄＲｏｓｓ、　Ｉｎｃ、）　（１９７７）　］ｏ前記真核生物発現系の１つで発現させた組換体糖蛋白を、よく知られた機械的または酵素的手法で宿主細胞系の破壊によって作った細胞浮遊液から単離する。細胞から分泌されるよう設計した蛋白は細胞を破壊することなく培地から単離する。糖蛋白の精製については、まず、細胞質画分を糖蛋白に特異的に結合するレンチル−レクチンカラムに適用するのが効果的である。次いで、溶出した糖蛋白を、抗体を含有するアフィニティーカラムに適用する。

典型的な糖蛋白は３つの領域に分けることができる。アミノ末端にはシグナル配列と呼ばれる疎水性領域がある。アミノ酸のこの配列は糖蛋白の細胞膜への輸送を指令する。輸送に続き、該シグナル配列は切断によって除去される。シグナル配列から下流に成熟糖蛋白の細胞外ドメインがある。これは、糖蛋白の免疫原性部分である。

というのは、それは抗体に接近できるからである。糖蛋白のカルボキシ末端には、糖蛋白の細胞膜中への保持を引き起こす疎水性アンカー領域がある。ＰＩＶ３　　Ｆは、アミノ末端シグナル配列およびカルボキシ末端アンカー配列を持つ点で典型的な糖蛋白である［スブリソグズら（Ｓｐｒｉｇｇｓ、ｅｔ　ａｌ）、パイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１５２　：２４１−２５　（１９８６）コ。

しかしながら、該ＰＩＶ３ＮＨ糖蛋白は通常ではない。というのは、そのアミノ末端はシグナルおよびアンカー領域双方として作用するからである［エランゴら（Ｅｌａｎｇｏ。

ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、　　５７　：４８１−４８９　　（１９８６）　　コ　。

糖蛋白は細胞から周りの培地に分泌されるように設計できる。これは、アンカー領域の翻訳前に糖蛋白の早期停止を引き起こすことによって達成されるニラス牛 −：）（Ｌａｓｋｙ、ｅｔ　ａｌ）、　／’イオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、　　２　：　５２７−５３２　（１９８４）　：ｌ　！早期停止はユニバーサル翻訳ターミネータ−・オリゴヌクレオチドを当該遺伝子のＤＮＡ中の適当な部位に挿入することによって達成できる。これらのオリゴヌクレオチドは商業的に入手可能である。また、早期停止は当該リーディングフレームを変更し、かくして翻訳終止フドンを生じさせることによって達成できる。

以下に記載のキメラ糖蛋白は、ＰＩＶ３ＮＨの細胞外ドメインに結合したＰ［Ｖ３　　Ｆのシグナルおよび細胞外ドメインよりなり、ＦＨＮと呼ぶ。真核生物発現ベクター中に適当に位置させる場合、前記ＦＨＮ遺伝子は、細胞表面に輸送されて、培地に分泌されるキメラ糖蛋白を発現するように設計される。

Ｐ［’３８Ｎ蛋白の細胞質ドメインの大部分は、ＤｒａＩ　（蛋白コーディング量的のヌクレオチド４５２位）およびＰＳｔｌ（蛋白コーディング領域のヌクレオチド１７０９位）制限酵素部位にわたるコーディング領域内に含有される。Ｐ［Ｖ３　　Ｆ蛋白の細胞質ドメインの大部分はＸｂａｌ（蛋白コーディング領域のヌクレオチド１３９８位）制限酵素部位に先立つコーディング領域内に包含される。この配列はシグナル領域および大部分の抗原性領域についてコード付けするが、Ｆ糖蛋白のアンカー領域についてはコード付けしない。

該ＨＮ糖蛋白配列をＰＩＶ３のＦ糖蛋白に挿入するには、該ＨＮ遺伝子をＰｓｔｌで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリラーゼで末端を平滑化する。配列：ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣ持つＸｂａ　Ｉリンカ−（二ニー・イングランド・／＜イオラブズ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））を末端に結ぶ。該遺伝子をアガロースゲル電気泳動によって、残存するリンカ−かみ分離する。前記リンカ−は蛋白合成を停止させるイン・フェイズ（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）ｉｌＩ訳終止シグナルを含有する。

次いで、該ＨＮ遺伝子をＤｒａ　Ｉで消化し、配列：ＴＧ　ＣＴ　ＣＴ　ＡＧ　ＡＧＣＡＡ　ＣＧＡＧＡ　Ｔ　ＣＴ　ＣＧＴを持つＸｂａ　Ｉリンカ−（二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））を末端に結ぶ。このリンカ−はイン・フェイズ（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）翻訳終止シグナルを含有せず、ＦないしＨＸ配列の蛋白の読み過ごしを可能とする。該リンカ−を含有するＨＮ遺伝子断片（１，３Ｋｂ）をＸｂａ　Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動によって、残存するリンカ− から分離する。ＰＩＶ３Ｆ遺伝子をＸｂａｌで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで悦リン酸化する。次いで、該１．３Ｋｂ　ＨＮ断片をＸｂａ　１部位にてＦ遺伝子に結び、イー・コリＨＢＩＯＩに形質転換する。キメラ糖蛋白遺伝子を含有するクローンを単離し、マキサム−キルバート配列決定法によって、ＦおよびＨＮのＤ　Ｎ　Ａ配列間の結合を正しいことを確認する。ＰＩＶ３キメラ糖蛋白遺伝子は適当な発現ベクターに入れることができる。

前記制限酵素部位はＦおよびＨＮ塘蛋白の関連領域の大部分の発現を可能とするので、それらを選択したものである。しかしながら、糖蛋白の他の部分は、これらの遺伝子の融合についてのＦおよびＨＮコーディング配列内の他の制限酵素部位を選択することによって発現され得る。例えば、制限酵素Ｈａｅｍ、Ｋｐｎｌ、またはＮＩａｌＶをＨＮ遺伝子の５°末端で切断するのに用いることができる。制限酵素Ｂａ１ｌ、ＢｇｌＩＩ、またはＨａｅｌｌをＨＮ遺伝子の３′末端で切断するのに用いることができる。ｇｐＦ遺伝子については、ＢｇＩｌｌ、ＨａｅＩＩ［、Ｎ５ｉｌ、またはＸｈｏＩ［制限酵素をＸｂａｌの代わりに用いることができる。結合領域におけるリーディングフレームを修正するためにリンカ− オリゴヌクレオチドを添加することができる。２の可能なフレームシフトを修正する２のオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能な５ａｌｌリンカー：ＧＧＴＣＧＡＣＣおよびＣ’ＧＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧ　　　　ＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣである。また、糖蛋白においてアンカー領域が所望される場合、リンカ−オリゴヌクレオチドを第２の結合に添加してｇｐＦアンカー領域の合成を可能とする。種々の配列の挿入または欠失によって、ＦＨＮキメラ蛋白の発現について別法を設計できる。該蛋白についての主要な評価基準はシグナル配列および２種の糖蛋白の免疫学的に重要な領域の保持である。

ＦＨＮ遺伝子のＣＨＯ％ＢＰＶ、またはバクロウィルス発現ベクターへの挿入はすでに述べた通りである。

ＦＩ（Ｎキメラ糖蛋白は個々の糖蛋白の発現よりも優れた利点を提供する。ＦＨＮは単一の蛋白であるから、別々のＦおよびＨＮ糖蛋白と比較して、精製については、労力および試薬は半分を要するだけである。また、精製を容易とするために、ＦＨＮキメラ糖蛋白を培地に分泌させる。Ｆ糖蛋白は、アンカー領域配列に先立つ切断（こよって分泌糖蛋白に設計できる。しかしながら、ＰＩＶ３　　ＨＮ糖蛋白はそのアミ／末端にシグナル／アンカー領域を含有する。従って、この糖蛋白の切断は分泌形を生じさせないであろう。シグナル／アンカー領域は外来性糖蛋白からのシグナル領域で置き換えることができるが、これにより、外来性蛋白配列が可能なワクチン（二導入されるであろう。

チャート１〜６でプラスミドおよび断片を表すのに用いる約束はプラスミドおよびその断片の通常の環状表示に同義であることを意図する。環状の図とは異なり、チャート上の単一線図は、左から右（５′ないし３°）に開始または転写が起こる環状および直線状二本鎖ＤＮＡを共に表す。星印（＊）はプラスミドの環状形態を完成させるためのオリゴヌクレオチドの架橋を示す。断片は二本鎖ＤＮＡの直線片であるゆえ、断片は星印を有しない。エンドヌクレアーゼ制限部位は該線の上方に表す。遺伝子マーカーは該線の下方に示す。

マーカー間の相対的間隔は現実の距離を示すものではなく、示されたＤＮＡ配列についてその相対的位置を示すだけである。

Ｆ糖蛋白の最大発現を得るために、ｃＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２に挿入するのに用いるＧ−ＣヌクレオチドをｃＤＮＡの末端から除去しなければならない。ＦＨＮｃＤＮＡをＣＨＯ細胞についての好ましい発現ベクター（後記ｐＳＶＣＯＷ７）　、またはバクロウィルスについての好ましい発現ベクター（後記ｐＡｃ３７３）に都合よく挿入するためには、蛋白コーディング配列の上流にＢａｍＨＩ部位を供する必要がある。Ｆ糖蛋白についての全配列を含有するＣＤＮＡクローンの合成法は記載されている［スブリノグスら（Ｓｐｒｉｇｇｓ、ｅｔ　ａｌ）、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１５２　二２４１−２５１（１９８６）　　コ　。

無傷ＰＩＶ３　　Ｆ遺伝子を含有するｃＤＮＡ　（ｐＧＰＦ　ｌ）をＢｓ　ｔＸＩおよびＮｄｅ［で消化する。ＢｓｔＸＩは遺伝子の開始コドンに対して３９位でＦ遺伝子を切断し、Ｎｄｅｌは１５９９位で切断する。オリゴヌクレオチド１をＢｓｔＸＩ切断部位に結び、オリゴヌクレオチド２をＮｄｅｌ切断部位に結ぶ。オリゴヌクレオチド１は、Ｆ遺伝子のコーディング領域における該コーディング領域の１０塩基対前からＢｓ　ｔＸＩ切断部位まで（−１０ないし＋３９）を含有し、オリゴヌクレオチドの５′末端上にＢａｍＨ１部位を有する。オリゴヌクレオチド２は、Ｆ遺伝子のＮｄｅｌ切断部位ないし停止コドンのＤＮＡ配列（〒１５９９ないし−１６２０）を含有する。オリゴヌクレオチド２の３′末端には、Ｎｒｕｌ制限酵素部位、続いてＢａｍＨＩ制限酵素部位がある。

オリゴヌクレオチドを結んだ後、該ＤＮＡをＢａｒｎＨＩで消化し、Ｆ遺伝子（断片１，１．６Ｋｂ）をゲル精製する。ＢａｍＨＩで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化したプラスミドｐＢＲ３２２（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に断片ｌを結ぶ。プラスミド（ｐＧＰＦ２）をイー・コリＨＢＩＯＩに形質転換する。

ｐＧＰＦ２の新しく合成した領域をマキサム−ギルバート法によって配列決定して正確な合成および結びを確認する。

オリゴヌクレオチドＩＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＧＣＡ　ＡＣＣＴＣＡＡＴＡＣＴＧＣＴＡ　ＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＡＴＴＧＣＣＴＡＧＧＴＧ　Ａ　ＣＴＴＧＴＡＣＴＡ　ＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧ　Ａ　ＣＧＡＴＴＡＡＴＡ　Ａ　ＴＧＴＴＧＧＴＡオリゴヌクレオチド２ＴＡＴＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＣＴＡＧＣＧＣＴＧＣＣＴへＧＧＣ実施例２　　ＰＩＶ３キメラＦＨＮ遺伝子の構築・・・チで一ト２Ａ、ＰＩＶ３　ＨＮ糖蛋白遺伝子の調製ＰＩＶ３８Ｎ遺伝子の全コーディング領域を含有するクローンおよびかかるクローンの単離法は記載されている［エランゴら（Ｅｌａｎｇｏ。

ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）５７　：４８１−４８９（１９８６）］。ＰＩＶ３ＨＮ遺伝子を含有するＣＤＮＡクローン（ｐＧＰＨＮｌ）をＰｓｔｌで消化する。この酵素はＨＮ遺伝子の３°末端（ヌクレオチド＋１７１４）に向けて切断する。断片の末端を７４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いで、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。配列：ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣを持つＸｂａ　Ｉリンカ−（二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　；リンカ−１）を末端に結ぶ。１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって、ｃＤＮＡを残存するリンカ−から分離する。

Ｉ（Ｎ遺伝子を含有する１、７Ｋｂ断片（断片２）をゲルから切り出し、ＤＮＡをアガロースから精製する。前記リンカ−は蛋白合成を停止させるイン・フェイズ（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）ｉｎ訳終止シグナルを含有する。次いで、ＨＮ遺伝子をＤｒａ　Ｉで消化する。この酵素は、ＨＮ遺伝子のシグナル／アンカーをコード付けする領域（＋４５２）に対し３′を切断する。配列：ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＴを持つＸｂａ　Ｉリンカ−（二ニー・イングランド・バイオラプス゛（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　；りンカー２）を末端に結ぶ。このリンカ −はイン・フェイズ（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）翻訳終止シグナルを含有する。該ＤＮＡをＸｂａ　Ｉで消化し、１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって、残存するリンカ−から分離する。ＨＮ遺伝子の関連領域を含有する１、３Ｋｂ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡをアガロースから精製する。

Ｂ、ＨＮｃＤＮＡのＰＩＶ３　　Ｆ糖蛋白遺伝子への挿入プラスミドｐＧＰＦ２をＸｂａ　ｌで消化し、ｆｌＩｌ菌アルカリ性ホスファターゼで税リン酸化する。１．３Ｋｂ断片をＸ　ｂ　ａ　１部位に結んでキメラＦＨＮ遺伝子（ｐＧＰＦＨＮｌ）を得る。該プラスミドをイー・コリＨＢ　Ｉ　ＯＨ二形質転換する。クローンを単離し、ＦＨＮ遺伝子内にほぼ２．５Ｋｂおよび３５０ｂｐの断片を生じるＢａｍＨｌおよびＰｖｕｌｌでの消化によって、Ｆ遺伝子内のＨＮ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの正しい配位から選択する。ＨＮ断片の正しくない配位は、ＢａｍＨＴおよびＰｖｕＵでの消化に際し、はぼ１．５Ｋｂおよび１．３Ｋｂの断片を生じさせ。適当に配位したクローンの結合領域をマキサム−ギルバート法によって配列決定してＨＮ断片の適当な結びを確認する。

実施例３　種々の長さのキメラＦＨＮ糖蛋白についてコード付けする遺伝子を生じさせるためのＤＮＡオリゴヌクレオチドの使用・・チャート３ＦおよびＨＮ糖蛋白の種々の領域を含有するキメラＦＨＮ糖蛋白についてコード付けする遺伝子は、制限酵素およびオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて生じさせることができる。この手法により、ＦおよびＨＮ塘蛋白がそのアミノ酸骨格のいずれの所望の地点に結合することも可能となり、宿主免疫系によって認識されるエピトープを含有するような領域の一体化および除去が可能となる。個々のアミノ酸は、所望ならば、変化させることができる。オリゴヌクレオチドは都合よい制限酵素部位に対する所望の結合地点からＤＮＡ配列に対応させて合成する。糖蛋白遺伝子はその制限酵素で消化し、該オリゴヌクレオチドを該制限酵素部位で該遺伝子に結んで所望の長さのＤＮＡ断片を得る。該オリゴヌクレオチドは末端が結ぶのに容易なように制限酵素部位に適合させて合成する。

Ａ、糖蛋白ＨＮ　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡのＦ糖蛋白遺伝子への挿入クローンｐＧＰＨＮ１をＰｓｔＴおよびＤｒａ　Ｔで消化する。ヌクレオチド４５２位ないし１７１４位からのｃＤＮＡ領域を表す１．３Ｋｂ断片（断片４）をゲル精製する。次いで、ＨＮ　ｃＤＮＡの隣接領域を表すオリゴヌクレオチドを断片４の各末端に結ぶ。これらのオリゴヌクレオチドにおけるＤＮＡ配列はＨＮ糖蛋白上で見い出れるさらなるエピトープについてコード付けし得る。個々のオリゴヌクレオチドは、唯一のエピトープ類を含有し得る領域類を一体化するように設計した。ＨＮｃＤＮ、Ａの５゛末端に結んだオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド３（ｃＤＮＡヌクレオチド３９５ないし４５２ン、オリゴヌクレオチド３−４（ＣＤＮＡヌクレオチド３３５ないし４５２）、オリゴヌクレオチド３〜４−５（ｃＤＮＡヌクレオチド′２７５ないし４５２ン、オリゴヌクレオチド３−４−５−６　（ｃＤＮＡヌクレオチド２１８ないし４５２）、またはオリゴヌクレオチド３− ４−５−６〜７（ｃＤＮＡヌクレオチド１６２ないし４５２）いずれかよりなり得る。括弧は末端オリゴヌクレオチドにのみ包含されるヌクレオチド類を囲う。

例えば、囲んだヌクレオチド類は、オリゴヌクレオチド６を付加したとすれば、オリゴヌクレオチド５に包含されない。これらの囲んだヌクレオチド類はＸｂａ　１部位についてコードする。オリゴヌクレオチド類の適合末端間の結びを可能とするためにさらにオリゴヌクレオチド（類）が付加される場合は、囲んだヌクレオチド類は包含されない。例えば、オリコメクレオチド３０５゛末端は、括弧で囲まれたヌクレオチド類がオリゴヌクレオチド３に包含されない場合、オリゴヌクレオチド４の３゛末端に適合する。オリゴヌクレオチド８をＨＮ遺伝子断片の３°末端に結ぶ。このオリゴヌクレオチドの３′末端に結ぶ。このオリゴヌクレオチドの５°末端は断片４０３′末端に適合する。このオリゴヌクレオチドの３°末端はイン・フェイズ（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）翻訳終止シグナル、続いてのＸｂａ　Ｉ制限酵素部位を含有する。

オリゴヌクレオチドをＨＮ　ｃＤＮＡ断片に結んだ後、該Ｄ　Ｎ　ＡをＸｂａ　Ｉで消化し、拡大したＨＮ　ｃＤＮＡ断片（断片５）をゲル精製する。次いで、新しいＨＮ　　ｃＤＮＡ断片をＸｂａｌ消化のｐＧＰＦ２に結ぶ。該ＤＮＡをコー・コリＨＢｉ０１に形質転換し、Ｆ遺伝子内に正しい向きでＨＮ遺伝子を含有するクローンを単離する（ｐＧＰＦＨＮ２）。配位は適当な制限酵素類での消化によって判断する。キメラ遺伝子の新しく合成した領域をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。次いで、該クローンを後記するごとく種々の発現ベクターに入れることができる。

Ｂ、オリゴヌクレオチドＣＡＣＡＴＧＡＴ（ＹＧにＧＣＡＴＡＡＡＡＣＣ’ｒＴＡにＴＣＡＴにＴＣＣＡＣＡＡＴｒＡＴＡＴＡＣＣＧＡにＴ（ＴＡにＡＴ’ｒＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＡＴＧＡＡτＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＡＧにＴＡ（ＴｍＣＡＣｍＴｒＣＣＣ（ｉＴＡＣＴＴＡにＴＡＡＣＧ＾Ｔ（ＴｒＣＴＣＣＡτ丁丁（ＴｒＡＡＴＣＴＡＧＡＧ実施例４　アンカー領域を含有するＰＩＶ３キメラＦＨＮ糖蛋白遺伝子の構築実施例２および３は、アンカー領域を含有せず、従って発現細胞の培地に分泌されるキメラＦＨＮ糖蛋白についてコード付けする遺伝子の合成を説明する。アンカー領域を含有するキメラＦＨＮ糖蛋白についてコード付けする遺伝子を合成することができる。アンカー領域は、はとんどのウィルス糖蛋白と同様に、キメラ糖蛋白の細胞膜中への保持を引き起こすであろう。アンカー領域は、ＦおよびＨＮＮ精糖蛋白らのキメラ分子の免疫原性領域が細胞外流動体に突き出るように、糖蛋白のカルボキシ末端上に位置させ得る。以下に記載の遺伝子は、アミノ末端からカルボキシ末端にかけてＰＩＶ３Ｆの細胞外領域、ＰＩＶ３　ＨＮの細胞外領域、およびＰ　Ｉ　Ｖ　３Ｆのアンカー領域の順序のこれらよりなるキメラ糖蛋白についてコード付けする。

Ａ、ＨＮ　ｃＤＮＡ断片のＰＩＶ３Ｆ糖蛋白遺伝子への挿入クローン１）ＧＰＨＮｌをＤｒａ　！およびＰｓｔｌで消化する。まず、オリゴヌクレオチド９をＤＮＡ断片に結ぶ（オリゴヌクレオチドはＤｒａ　１部位に適合する）。次いで、オリゴヌクレオチド１゜を（Ｐｓｔｒ部位に適合する）ＤＮＡ断片に結ぶ。両オリゴヌクレオチド類はＸｂａ　Ｔ制限酵素部位を含有する。

９）　　　　ＴＣ；ＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣ；Ｔ１０）　　　　　　　ＧＴＣＴＡＧＡＧＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＴＣ結んだ後、該Ｄ　Ｎ　ＡをＸｂａ　Ｉで消化し、ＨＮｃＤＮＡの１　、３　Ｋｂ断片（断片６）をゲル精製する。次いで、断片６をＸｂａ　ｒ消化のｐＧＰＦ２に結ぶ。該ＤＮＡをイー・コ！ＪＨＢ　Ｉ　Ｃ１に形質転換する。次いで、適当に配位したクローンの結合領域をマ牛すムーギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。このクローン（ｐＧＰＦＨＮ３）Ｌｔｉ記するごとく種々の発現ベクターに入れることができる。

実施例５　Ｐ！ｖ３キメラＨＮＦ糖蛋白遺伝子の構築ＰＩＶ３　　Ｆ糖蛋白の細胞外領域の一部をＨＮ糖蛋白のカルボキシ末端に位置させることができる。このキメラ糖蛋白は、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ＨＮのアミノ末端からのシグナル／アンカー領域、ＨＮの細胞外領域の大部分、およびＦの細胞外領域の一部の順序のこれらよりなる。

Ａ、ＰＩＶ３　　ＨＮ糖蛋白遺伝子の調製・・・チャート５発現用クローンｐＧＰＨＮ１を調製するためには、ｃＤＮＡクローニングで用いるＧ−Ｃテールを除去しなければならず、適合する制限酵素部位をその末端に位置させなければならない。ＨｐｈｒはｃＤＮＡ遺伝子コーディング配列上の７５位にて切断する。次いで、以下のオリゴヌクレオチドを該ｃＤＮＡ断片に結ぶ。

ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＧＡＧＡＴＧＧＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＣＧ（ｉＡＡＡにＡＴＧＣＴＧＧα：”ｒＡＧＧＴＴＴＡＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＴ＾τＧＡＣＣＴＴＣＧτＧＴＧＧＴｒＡＧτｃｃｃｃ’ｎ了Ｃ丁ＡＣＧＡＣＣＴＭＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡτＣＣＡＴＣＧＣＴＡＣＴＣ＾τ ＧＣＣＡＴＴＡＣＴＣＧＡＣ（：ｍＧＴＡＧＧ；ＴＡＣＣＧＡＴＧＡにＴＡＣＣオリゴヌクレオチド１１を該Ｈｐｈ　１部位に結び、該ｃ　Ｄ　Ｎ　−Ａ断片の５゛末端上にＢａｍＨＩ制限酵素部位を生じる。オリゴヌクレオチド１１を結んだ後、該ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌで消化する（ＰｓｔｌはＨＮ遺伝子においてヌクレオチド１７１４位にて切断する）。該ＤＮＡを１．２％アガロースゲルにて電気泳動する。

１．７ＫｂＨＮ　ｃＤＮＡ断片（断片７）をゲルから切り出し、該ＤＮＡをアガロースから精製する。次いで、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１９に断片７を結んでｐＧＰＨＮ２を得る。該プラスミドをイー・コリＨＢＩＯＩに形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離する。

Ｂ、Ｆ　　ｃＤＮＡ断片のＰＩＶ３　　ＨＮ糖蛋白遺伝子への挿入・・・チャート６りｏ−７ｐＧＰＦ１を１３ｓｔＥＩＩおよびＸｂａ　Ｉで消化する。

Ｂｓ　ｔ　ＥＩＩは、Ｆ　　ｃＤＮＡ遺伝子配列上、１９０位にて切断し、Ｘｂａ　Ｉは１３９８位にて切断する。次いで、以下のオリゴヌクレオチド類を該ｃＤＮＡ断片に結ぶ。

Ｇｌｌ；Ａα；ＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＴＡにＡＡＴＡＡＴＡＧＴＣＧＣにＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧｍＡＴＴＡＴＣＡｃｃｃＣＴｃｃＴＡｃｃＡｃＧＴｃｃオリゴヌクレオチド１２をＢｓ　ｔＥＩ［部位に結び、ｃＤＮＡ断片の５”末端上にＰｓｔｌ制限酵素部位を生じる。

オリゴヌクレオチド１３をＸｂａＩ部位に結び、翻訳終止コドン、Ｎｒｕｌ制限酵素部位、ＢａｍＨＩ制限酵素部位、およびＰｓｔｌ制限酵素部位が、示した順序（５′ないし３°）で、ｃＤＮＡ断片の３′末端に生じる。次いで、該ＤＮＡをＰｓｔｌで消化し、１．２Ｋｂ　　Ｆ　　ｃＤＮＡ断片（断片８）をゲル精製する。次いで、Ｐｓｔｌで消化したｐＧＰＨＮ２に断片８を結ぶ。該プラスミドをイー・コリＨＢＩＯＩに形質転換する。クローンを単離し、２．９Ｋｂ断片を生じさせるＢａｍＨＩおよびＮｒｕ　Ｉでの消化によって、ＨＮ遺伝子内のＦ　　ｃＤＮＡの正しい配位から選択する。正しくない配位は１，７Ｋｂ断片を生じさせる。次いで、適当に配位したクローンの結合領域をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。このクローン（ｐＧＰＨＮＦ　１）は後記するごと（種々の発現ベクターに入れることができる。

実施例６　　ＰＩＶ３のキメラＦＨＮ糖蛋白のＣＨＯ細胞での発現Ａ、ｐｓＶｃＯＷ７の構築（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシランから入手可能であるか、またはニス・スブラマニら（Ｓ、５ｕｂｒａＩＩａｎｉ、ｅｔ　ａｌ）、「シミアンウィルス４ｏにおけるマウス・ジヒドロ葉酸還元酵素相補的デオキシリボ核酸の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅＲｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｒ＋ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ｉｎ　５１ｍ１ａｎＶｉｒｕｓ　４０）Ｊ、モレキュラー・アンド・セリュラー・パイロロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　２　：　８５４−８６４　（１９８１年９月）の手法に従って調製される）出発プラスミドｐＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化してアンピシリン耐性遺伝子、ＳＶ４０複製開始点、およびｄｈｆｒ遺伝子を含有する５、　ＯＫ　ｂ断片（断片９）を得る。ｐＳＶＣＯＷ７の第２部分をプラスミドｐλＧＨ２Ｒ２から得、ｐＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒを切断するのに用いる同制限エンドヌクレアーゼで消化してゲノミノク・ウシ成長ホルモン遺伝子、すなわちＢＧＨｇＤＮＡの３′末端を含有する２、ＩＫｂ断片（断片１０）を得る。プラスミドｐλＧＨ２Ｒ２は、イリノイ州、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）にあるノーザン・リージ璽ナル・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に寄託したイー・コリＨＢ　１０１宿主（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５１５４）から公に入手できる。断片９および１０を結ん”？’ｐｓＶｃＯＷ？　（７，ＩＫｂ）を得る。

Ｂ、ｐＧＰＦＨＮ−ＩＥ−ＰＡの構築実施例２〜５で構築した遺伝子はＣＨＯ細胞におけるキメラ糖蛋白の発現に用いる。プラスミドｐＧＰＦＨＮ−１は以下の実施例で用いる。池のキメラ遺伝子は、特に断りのない限り、ｐＧＰＦＨＮ−１について記載したごとく処理する。ｐＧＰＦＨＮ−［Ｅ−ＰＡの組立は２段工程で行う。まず、ｐＧＰＦＨＮｌからのｇ　ｐ　Ｆ　ＨＮＣＤＮＡをｐｓＶｃＯＷ７に挿入し、ｐＧＰＦＨＮ−ＰＡを得、次いで、Ｐ　Ｉ　Ｖ　Ｓ様蛋白の転写を開始させるためにサイトメガロウィルスの即時型プロモーターを挿入してｐＧＰＦＨＮ−）ＥＰＡを得る。

工程ｌ、プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　ＣＯＷ　７をＥｃｏＲＩおよびＰｕｖｌｌで切断し、ＢＧＨ遺伝子の最も３′側エクソンにおけるＰ〜・ｕｌＩ部位から３′末端より下流のＥｃｏＲ１部位まで伸びるウシ成長ホルモンのポリアゾニレ−ジョン配列を含有する断片１１　　（６００ｂｐ）を単離スる。ＢＧＨポリアゾニレ −ジョン配列の詳細な考察につ（Ｘでは、以下の文献二　（１）ＢＧＨゲノミノクＤＮＡの同定および特徴付けが開示されている、１９８４年６月２７日に公開された欧州特許出師０１１２０１２号；　（２）ヌクレオチド配列ＡＡＴＡＡＡがＢＧＨ遺伝子の３′末端かろ１１ないし３０ヌクレオチド上流（５′末端へ向けて）の位置におけるポリアゾニレ−ジョンフグナルを特徴付けることを開示する、ウオイチノク・アール・ビイら（Ｗｏｙｃｈｉｃｋ、　Ｒ，Ｐ、　ｅｔ　ａｌ）、「正確なポリアゾニレ−ジョンにつ０てのウソ成長ホルモン遺伝子の３゛フランキング領域の要件（Ｒｅｑｕｉｒｅ−ｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　３’　Ｆｌａｎｋｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｇｒｏｔｉｔｈ　ＨｏｒｍｏｎｅＧｅｎｅ　ｆｏｒ　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｐｏ１ｙａｄｅｎｙｉａｔｉｏｎ）ｊ、ブロンーデイングズ８オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８１　：　３９４４−３９４８（１９８４年７月）；およびディ・アール・ヒノグズら（Ｄ、　Ｒ，Ｈｉｇｇｓ、　ｅｔ　ａｌ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０６：３９８−４００　（１９８３年１１月２４日）およびそこに引用された文献を参照。

ｐｓｖｃｏｗ７の第２の試料をＥｅｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して断片１２（５，８Ｋｂ）を得る。別法として、断片１２はベセスグ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可能な親ブセスミドｐＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒからのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１断片から得ることができる。断片１２は、ｐＢＲ３２２からの複製開始点およびイー・フリ中のプラスミドの選択を可能とするイー・フリ中で発現されるアンピシリン耐性遺伝子を含有する。

また、該断片は、哺乳動物細胞中での発現を可能とするマウス・ジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡを組立体中に含有する［スブラマニら（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、ｅｔ　ａｌ）、モレキュラー・アンド・セリニラ−・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）１　：　８５４−８６４　（１９８１）コ。

プラスミドｐＧＰＦＨＮ１をＢａｍＨＩおよびＮｒｕ　Ｉで切断して断片１３　（２，７Ｋｂ）を得、−これをゲル単離する。Ｂａｍ８１部位はＦＨＮｍＲＮＡの５°非非翻訳列についてコード付けするｃＤＮＡの丁度上流にあり、Ｎｒｕ　１部位は翻訳終止フドンから数塩基対下流にある。

断片１１．１２および１３を結んでｐＧＰＦＨＮ−ＰＡ　（９，ＩＫｂ）を得るが、これはイー・コリおよびＣＨＯ細胞の間を往来できる複製ベクターである。

プラスミドｐＧＰＦＨＮ−ＰＡをイー・コリに形質転換する。

工程２゜工程２においては、ヒト・サイトメガロウィルスからの即時型遺伝子プロモーター（ＣＭ〜７　１．Ｅ、プロモーター）を挿入することによって、ｐＧＰＦＨＮ −ＰＡを発現プラスミドｐＧＰＦＨＮ−ＩＥ−ＰＡに変換する。該ＣＭＶ　　１．Ｅ、プロモーターはＣＭＶゲノムのＰｓｔＩ消化かち得られる。主要即時型遺伝子（ＣＭＶ　　１．、Ｅ、）を含有するヒト・サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）ゲノムの領域の制限エンドヌクレアーゼ切断地図は詳細に記載されている［ステインスキイら（Ｓｔｉｎｓｋｉ、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・ノイイロロジ−（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　）４６　：　１〜１４．１９８３　：ステンベルグ：）（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ、ｅｔａｌ）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（ＪＪｉｒｏｌ、）４９　：　１９０〜１９９．１９８４．およびトムセンら（Ｔｈｏｍｓｅｎ、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳ　Ａ、　　８　１　　：　　６５９〜６６３．１９８４コ　。

該スティンスキイおよびトムセンの文献は主要即時型遺伝子についてのプロモーターを含有する２、０キロベースのＰｓｔＴｌｒ片を記載する。この２．０ＫｂＰｓ　ｔ　Ｉ断片を単離し５ａｕ３ＡＩで消化すると、７６０塩基対断片が産生物中に得られる。この７６０塩基対断片はそのサイズなちびに該断片内の５ａｃｌ切断部位およびＢａ１ｌ切断部位の存在によって池の産生物から区別できる。

その便利な同定のため、この５ａｕＡＩ断片の利用は、本明細書中に記載するごとく、ＣＭＶ　　１．Ｅ、プロモーターの使用の好ましい方法である。

プラスミドｐＧＰＦＨＮ−ＰＡをＢａｍＨＩで切断し、ＣＭＶ即時型プロモーターを含有する５ａｕＡｒ断片を適合ＢａｍＨｒ部位に結ぶ。プロモーターからの転写によりＰＩＶＳ様蛋白についてのｍＲＮＡを合成するような配位でＣＭＶプロモーター断片を含有するプラスミドは５ａｃｌでのプラスミドの切断によって同定される。

得られたプラスミドはｐＧＰＦＨＮ−Ｉ　Ｅ−ＰＡと命名され、ｃＤＮＡの５° 末端にＣＭＶ　　１．Ｅ、プロモーターおよびその３′末端上にＢＧＨポリアゾニレ−ジョンシグナルを有する。ＣＨＯ細胞へのトランスフェクシヨンまで該プラスミドをイー・コリ中に維持する。

Ｃ，トランスフェクシヨンおよびＣＨＯ細胞の培養グラハムら（Ｇｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ）、［マクロ分子の活性哺乳動物細胞への導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１ｎｔｏ　Ｖｉａｂｌｅ　ＭａＩＩｌｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ）Ｊ　、アラン・アール・リス・インコーホレイテッド（Ａｌａｎ　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、）、二ニーヨーク、１９８０．３〜２５頁によって詳細に記載されているＤＮＡの細胞へのトランスフェクシヨンについてのリン酸カルシウム法を用い、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄ　ｈ　ｆ　ｒ）を欠くチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にプラスミドｐＧＰＦＨＮ−ＩＥ−ＰＡをトランスフェクトする。用いる細胞系はコロンビア大学のエル・チェイスン（Ｌ、　Ｃｈａｓ　ｉｎ）から元来入手可能であって、プロシーディングズ・オブ・シジナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｕ　Ｓ　Ａ　７７　：　４２１６−４２２０　（１９８０）に詳細に記載されている突然変異体ＤＸＢ−１１である。トランスフェクシヨンについての前記方法は、トランスフェクトされたプラスミドを一体化する細胞がちはやｄｈｆｒを欠くものでなく、ダルベツコの修正イーグル培地＋プロリンで増殖するという事実に基づく。

キメラ糖蛋白がアンカー領域を含有しない場合、次いで、分泌されたキメラＦＨＮ蛋白を発現するＣＨＯ細胞からの上澄みを低速遠心によって清澄化する。該上澄みをフンカナバリンＡまたはレンチル・レクチンカラムに適用する。前記緩衝液中のα−Ｄ−メチルグルコシドの直線グラジェント（０〜０．５Ｍ）で十分洗浄した後、糖蛋白を溶出する。溶出した糖蛋白を０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳに対して透析し、アフィニティーカラムに適用する。

該アフィニティーカラムは、公知技術により、セファロース４Ｂビーズ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ビスカッタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ）、二ニーシャーシー州）に結合したＰ　Ｉ　Ｖ　３に対し定方向化された単クローンまたは多クローン抗体よりなる。該カラムを透析緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）および０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳでＰＩＶ３　　ＦＨＮ糖蛋白を溶出する。

糖蛋白を生理食塩水に対して透析し、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動によって純度をチェックする。

キメラ糖蛋白がアンカー領域を含有する場合、糖蛋白を発現するＣＨＯ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１．０％トリトンＸ−１００および１．０％デオキシコール酸ナトリウムを含有するＰＢＳ中で溶解する。核をペレット化した後、細胞質抽出物をコンカナバリンＡカラムに適用し、分泌された糖蛋白について前記したごとくに精製する。

実施例７　ウシ・乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）を用いるＰＩＶ３ＧＰＦＨＮの発現Ａ、イー・コリにおける複製に適した転写不能発現カセットを含有するクローニングベクターの構築ｐＴＦＷ８およびｐＴＦＷ９（７）構築は、ＢＰＶを用いるＰＩｖ３蛋白を発現するための便利な出発物質を供する。寄託したプラスミドの転写ターミネータ− はＰＩＶ３蛋白の発現を妨げ、単一工程の切り出しおよび結びで除去しなければならない。

１、ＰＴＦＷ８の構築ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　（３４２−１２）は、モレキュラー・アンド・セリニラ−・パイロロジー（Ｍｏ１．ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、　　３巻（１１号）：２１１０〜２１１５　（１９８３）記載され、米国、メリーランド州、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、ナショナル・キャンサー・インステイテニート（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のピータ−・ホウレイ（Ｐｅｔｅｒ　Ｈｏｖｌｅｙ）から得られる。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　（３４２−１２）は３つの部分：唯一のＢａｍＨＩ部位で開いた完全なりＰＶ−１ゲノム（１００％）；　ｐＭＬ２　（ｐＢＲ３２２の「ポイズン− マイナス」誘導体）；ならびにマウス・メタロチオネインＩ遺伝子プロモーター、Ｔｎ５のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子、およびシミアンウィルス４０初期領域転写プロセッシングシグナルよりなる転写力セントからなる。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｐ　（３４２−１２）をまずＢａｍＨｌで消化してＢＰＶ配列を除去し、単離し、後の挿入用に保存した。Ｔ４リガーゼを用い、残存する断片を再度結んでｐＭＭｐ　ｒｏ。

ｎｐｉ　ｎ　（６，７Ｋｂ）を得る。ＢＰＶゲノムの除去は、残存するプラスミドに唯一の制限部位を生じさせることによって後の遺伝子操作を容易とする。組換えが完了すると、ＢＰＶゲノムを置き換える。

プラスミドｐＭＭｐ　ｒ　ｏ、ｎ　ｐ　ｔ　ＩＩをＢｇｌＩＩで消化し、唯一の制限部位を含有する合成りＮＡ断片１４を挿入し、Ｔ４リカーゼを用いて結び、ｐＴＦＷ８（６，７Ｋｂ）を得る。プラスミドｐＴＦＷｌは、マウス・メタロチオネイン■遺伝子プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子との間の唯一の制限部位の挿入を除き、ｐＭＭｐｒｏ。

ｎｐｔ［［と同一である。

２、ｐＴＷＦ９の構築プラスミドｐＴＷＦ９はメタロチオネイン■遺伝子プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子との間に挿入されたファージラムダからの転写ターミネータ−ＴＸを含有する。該転写ターミネータ−は米国、メリーランド州、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のナショナル・キャンサー・インスティテｓ　−ト（Ｎａｉｔｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のドナルド・コート（Ｄｏｎａｌｄ　Ｃｏｕｒｔ）氏から入手可能である。該転写ターミネータ−は、ＴＸがグアネロスら（Ｇｕａｎｅｒｏｓ、ｅｔ　ａｌ）、ＰＮＡＳ、７９：２３８−２４２　（１９８２）に記載されているごとき５ｉｂ３突然変異を担持する以外はジーン（Ｇｅｎｅ）、　　２８　：　３４３−３．）０（１９８４）に記載されているごきｐＵＳ６と同一であるｐＫＧ−１８００ｓｉｂ３にて供給される。ファージラムダの通常の感染過程の間、Ｔ１ターミネータ−はＰＬからのバクテリオファージλｉｎｔ遺伝子発現の抑制、およびＰｌに由来するｉｎｔ遺伝子転写の終止で機能する。Ａｌｕｌおよびｐｖｕ　Ｉを用い、該ターミネータ−を断片１５　（１，２Ｋｂ）としてＩ）ＫＧ１８００ｓ　ｉｂ３から切り出し、ゲル単離し、Ｘｈｏｌリンカ−を該断片のいずれかの端部に位置させる。

該リンカ−は米国、マサチューセッツ州、ベバリイ（Ｂｅｖｅｒｉｙ）、二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から得られる。次いで、Ｘｈｏｌで予め消化したｐＴＷＦ８にＸｈｏ　１相補端と境界を接する該ターミネータ−断片を挿入する。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて断片を結んでｐＴＷＦ９　（７，９Ｋｂ）を得る。プラスミドｐＴＷＦ９はブダペスト条約に従って寄託した。

プラスミドｐ”ｌ’Ｆ９をイー・フリ宿主に維持し、１９８６年１１月１７日に、米国、イリノイ州、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、／−イン・リージョナル自すサーチ争センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｉｇｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）に寄託し、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１４１が与えられた。

Ｂ、ｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮの構築実施例２〜５で構築した遺伝子は、ＢＰＶを用いるキメラ糖蛋白の発現で用いることができる。プラスミドｐＧＰＦＨＮ−１は本実施例で用いる。池のキメラ遺伝子は、特に断りのない限り、ｐＧＰＦＨＮ−１について記載したごとくに処理する。ｐ　Ｔ　Ｆ　Ｗ／ＧＰＦＨＮを構築するために、ｐＧＰＦＨＮｌをＢａｍＨＩで消化する。その末端をクレノー酵素で平滑とし、合成りｇｌｎリンカ−（二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））をクローンの端部に結ぶ。該ＤＮＡをＢｇｌＩ［で消化し、断片１６（２，７ｋｂ）と命名する。次いで、ｇｐＦＨＮ遺伝子（２，７ｋ　ｂ）を含有する断片１６をゲルから単離する。Ｂｇｌｌｌで予め消化したｐＴＦＷ９に精製した断片を結んでｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮ（１０，６ｋｂ）を得る。

Ｃ，ｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮの真核生物発現ベクターへの変換ＢａｍＨＩで切り出した１００％完全なりＰＶ−１ゲノムを再度挿入することによって、プラスミドｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮを真核生物発現ベクターに変換する。プラスミドｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮをＢａｍＨＩで切断し、ＢＰＶ−１無傷ゲノム、７．９Ｋｂ断片を挿入してｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮ／ＢＰＶ＊　（１８，５Ｋｂ）を得、真核生物細胞による糖蛋白ＦＨＮの産生が所望されるまでイー・フリ。

中で複製させる。

Ｄ、ｇｐＦＨＮのマウスＣ１２７細胞における発現マウスＣ１２７細胞へのトランスフェクション前に、ｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮ／ＢＰＶ＊をＸｈｏ［’消化してＴｒツタ−、＊−ターを切り出し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再度結ぶ。得られたプラスミドｐＴＦＷ／ＧＰＦＨＮ／ＢＰＶ　（１７，４Ｋｂ）は、今や、培地に分泌される高レベルのｇｐＦＨＮの発現を指令する。Ｃ１２７細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１０％胎児ウシ血清を含有するダルベツコの修正最小必須培地中で増殖させる。Ｃ１２７細胞の培地中のｇｐＦＨＮ蛋白のレベルは抗−ＰＩＶ３抗体および１２５．−標識蛋白Ａでのウェスタンプロット実験によって測定する。

ＰＩＶ３　　ｇｐＦＨＮを実施例６に記載したごとくに培地または細胞から精製する。

実施例８　バクロウィルスを用いるＰＩＶ３ＧＰＦＨＮの発現以下の実施例は糖蛋白ＦＨＮの昆虫細胞培養における発現に関する。すべての手法は、１９８６年にテキサス州、カレ、ノジステーション（Ｃｏｌｌｅｇｅ　５ｔａｔｉｏｎ）、テキサス・アグリカルチユラル・イクステンシ１ン０サービス（Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）、テキサス・アグリ力ルチニラル・エクスペリメンタル・ステーション（Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ）、カレ・ノジ・オブ・アグリカルチ＋−（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）によって発行された、サマーズ・エム・ディおよびスミス・シイ・イー（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、　Ｄ。

ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、　Ｅ、　）、−バクロウィルスベクターおよび昆虫培養法についてのマニュアル（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｂａｃｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔＣｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）　Ｊに詳細が述べられている。出発プラスミドｐＡｃ３７３　（７，ＩＫｂ）はアウトグラファ・カリフオルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）についてのポリへドロンプロモーターからすぐ下流の唯一のＢａｍＨＩ部位を有する一般的なバクロウィルス発現ベクターである。ポリへドロン蛋白はウィルス感染およびｉｎ　ｖｉｔｒｏでの複製に非必須のマトリックス蛋白である。該プラスミドはテキサス７７８４３、カレ・ノジ・ステージ１ン（Ｃｏｌｌｅｇｅ　５ｔａｔｉｏｎ）、テキサス−エイ・アンド・エム大学、昆虫学部のマックス・サマーズ（Ｍａｗ　Ｓｕｍｍｅｒｓ）教授から入手可能であり、モレキユラー・アンド・セリュラー・ノイイロロジ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄｃｅｌｌ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、３　（１２）　　：　２１５６−２１８５　（１９８３）に詳細に記載されている。

Ａ、ｐＡｃＧＰＦＨＮの構築実施例２〜６で構築した遺伝子はバクロウィルスを用いるキメラ糖蛋白の発現で用いることができる。プラスミドｐＧＰＦＨＮ　１は本実施例で用いる。他のキメラ遺伝子は、特に断りのない限り、ｐＧＰＦＨＮ　ｌについて記載したごとくに処理する。プラスミドｐ　Ｇ　Ｐ　Ｆ　ＨＮ　１をＢａｍ）（Ｉで消化し、ｇｐｔ’Ｈｘ遺伝子を含有する断片１７　（２，７Ｋｂ）をゲルから単離する。予めＢａｍＨ［で消化したｐＡｃ３７３に精製した断片を結ぶ。

Ｂ、ニス・フルギペルダ（Ｓ、　Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のトランスフェクシヨンおよび培養ｐＡｃＧＰＦＨＮのｇｐＦＨＮ　ｃＤＮＡインサートをニス・フルギペルダにおける共トランスフェクションによる天然ＡｃＮＰＶＤＮＡで組み換える。ニス・フルギベルダ（Ｓ　Ｆ　９　；　ＡＴＣＣＣＲＬ　　１７１１）をディフッ（Ｄｉｒｃｏ）ラクトアルブミン加水分解物および酵母分解物を補足したブレイス培地（ジブコ・ラブ（Ｇｉｂｃ。

Ｌａｂ、　）、リボニア（Ｌｉｂｏｎｉａ）、ミシガン４８４５０）、１０％胎児ウシ血清で培養する。細胞を、各々、ｌμｇ／ｍ（ｌおよび２μｇ／ｍＨ：て、ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡおよびｐＡｃＧＰＦＨＮで共トランスフェクトする。培地を収集し、低速遠心により細胞物質を除去することによってウィルス粒子を得る。次いで、含ウィルス培地を用いてニス・フルギペルダを感染させる。天然ウィルスＤＮＡおよび糖蛋白ＦＨＨについてコード付けするｃＤＮＡで組み換えたＤＮＡ双方を包含するこれらのウィルス粒子を用いる続いてのニス・フルギペルダの感染の結果、多角体蛋白の代わりにＰ　Ｉ　Ｖ　３蛋白を発現するいくらかの細胞を得る。組換体ウィルスの精製は、ニス・フルギベルダ細胞を含有する９６ −ウェル組織培養平板での一連の限界希釈平板培養によって行う。組換体ウィルスを含有するウェルは、ニックトランスレーションにより”Ｐ−ｄＣＴＰで１ｍした　　　ｐＧＰＦＨＮ１をプローブとして用いるドノトブロットノ）イブリダイゼーションによって検出される。十分に純粋になれば、該組換体ウィルスはそのユニークな閉塞陰性プラーク形態によって検出される。組換体バクロウィルス感染細胞中で合成されたＰＩＶ３蛋白を、抗−ＰＩＶ３抗体および＋ｔｓｌ−標識蛋白Ａ（アメルスノ〜ム・コーポレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）でのウェスタンプロ・ノド実験によって検出する。

実施例６に記載したごとく、ＰＩＶ３蛋白を培地または細胞から精製する。

実施例９　ワクチンの調製免疫原はよく知られた手法によってワクチン投与形態に調製できる。該ワクチンは、筋肉内、皮下または鼻孔内投与できる。筋肉内投与のごとき非経口投与については、免疫原を適当な担体と組み合わせることができる。例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、カーボン、油中水型エマルジ言ン、水中油型エマルシヨン、ムラミルジペプチド、細菌エンドトキシン、リピドＸ１コリネバクテリウム０パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）（プロピオノバクテリウム・アクネス（ＰｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｌａｃｎｅｓ））、ボルデテラ・ペルトウシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ１サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストリン、ブロックコポリマー、ｌＳＣ０Ｍ５またはｆ也のアジュバントのごときアジュバントまたは免疫調節剤を含むまたは含まない水、生理食塩水または緩衝ビヒクル中にて投与できる。かかるアジュバントは種々の源、例えばメルク・アジュバント（Ｍｅｒｅｋ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）６５（メルク・アンド・カンパニー・インコーポレイテソド（Ｍｅｒｃｋａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　　Ｉｎｃ、）、ラーウエイ（Ｒａｈｗａｙ）、二ニージャーシイ州）から商業的に入手可能である。

免疫原およびアジュバントの割合は、双方を有効量で存在させる限り、広範囲にわたって変化させることができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物（ＡｆｆｔＯｓ）の約０．５％の量で存在させることができる。用量ベース当たりでは、免疫原の濃度は、患者体重１ｋｇにつき約０．０１５μｇないし約１．５ｍｇの範囲とすることができる。好ましい用量範囲は約０．５μｇ／ｋｇないし約０．１５ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ヒトにおける適当な用量サイズは約０．１〜１ｍｊ、好ましくは約０．１ｍ１２である。従って、例えば、筋肉的注射についての用量は、０．５％水酸化アルミニウムと混合した免疫原を含有する０、１ｍ（！よりなる。

ワクチンは妊婦または子供を持つ年令の婦人に投与して母仔抗体を刺激することができる。要すれば、女性には再度ワクチン接種できる。幼児には、母仔抗体の枯渇の後２ないし３力月、好ましくは免疫系の成熟の６ないし９力月後にワクチン接種できる。ワクチン接種をしていない母親かみ生まれた赤ん坊は２ないし３月令にワクチン接種できる。また、該ワクチンは、年のいったまたは虚弱な患者のごとき他の罹患集団でも有用である。

また、ワクチンを池の病気についての他のワクチンと組み合わせて多価ワクチンを得ることもできる。また、抗生物質のごとき他の医薬品と組み合わせることもできる。

チャート１ｐＧＰＦ２の構築プラスミドｐＧＰＦ　１（ａ）プラスミドｐＧＰＦ　１をＢｓ　ｔＸＩおよびＮｒｕ　Ｉで消化する。オリゴヌクレオチド１および２を末端に結ぶ。該ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、断片１　（１，６Ｋｂ）をゲル単離する。

（ｂ）プラスミドｐＢＲ３２２（４，４Ｋｂ）をＢａｍＨＩで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。断片１をＢａｍＨＩ部位に結んでｐＧＰＦ２　（６，０Ｋｂ）を得る。

チャート１　（続き）ＴｃＲ＝テトラサイクリン耐性ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性Ｔ＝ニブアノシン／シトシンテール＝糖蛋白Ｆ１＝オリゴフクレオチド１２＝オリゴフクレオチド２チャート２キメラＦＨＮ糖蛋白遺伝子の構築プラスミドｐＧＰＨＮ　１（ａ）プラスミドｐＧＰＨＮ　１をＰｓｔｌで消化する。Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、次いで、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。Ｘｂａ　Ｉリンカ−（リンカ−１）を末端に結び、断片２　（１，７Ｋｂ）をゲル精製する。

断片２（ｂ）断片２をＤｒａｌで消化する。Ｘｂａ　Ｉリンカ−（リンカ−２）を末端に結ぶ。該ＤＮＡをＸｂａ　Ｉで消化し、断片３（１，３Ｋｂ）をゲル精製する。

チャート２（続き）断片３（ｃ）プラスミドｐＧＰＦ２（チャート１）をＸｂａ　Ｉで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。断片３をＸｂａ１部位に結んでｐＧＰＦＨＮｌを得る。

ＴｃＲ＝テトラサイクリン耐性ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性Ｔ＝ニブアノシン／シトシンテール＝ＨＮ糖蛋白についてのＤＮＡ配列Ｆ＝Ｆ糖蛋白についてのＤＮＡ配列Ｔｅｒｍ＝翻訳終止シグナルチャート３種々の長さのＦＨＮ遺伝子を生じさせるためのオリゴヌクレオチド類の使用（ａ）オリゴヌクレオチドＡは、オリゴヌクレオチド３（＋７ｂｐ）、または− 緒に結んだオリゴヌクレオチド３および４（１１７ｂｐ＞、または−緒に結んだオリゴヌクレオチド３．４および５（１７７ｂｐ）、または−緒に結んだオリゴヌクレオチド３．４．５および６（２３４ｂｐ）、または−緒に結んだオリゴヌクレオチド３．４．５、および６、または−緒に結んだオリゴヌクレオチド３．４．５．６、および７　（２９０ｂｐ）よりなる。オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチド８　（１２Ｍ）よりなる。オリゴヌクレオチドＡおよびＢはゲル精製する。

チャート３　（続き）（ｂ）プラスミドｐＧＰＨＮ　１をＰｓｔｌおよびＤｒａｌで消化し、断片４　（１，３Ｋｂ）をゲル精製する。

断片４（Ｃ）オリゴヌクレオチドＡおよびＢを断片４に結ぶ。該ＤＮＡをＸｂａ　Ｉで消化し、断片５をゲル精製する（断片５の長さは、オリゴヌクレオチドＡ内に含有されたオリゴヌクレオチド類に応じて１３３０ｂｐないし１５６５ｂｐに変化する）。

断片５（ｄ）プラスミドｐＧＰＦ２をＸｂａ　Ｉで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。次いで、断片５をｐＧＰＦ２のＸｂａ　１部位に結んでｐＧＰＦＮ２を得る。

チャート３（続き）プラスミドＰＧＰＦＮ２ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性Ｆ＝Ｆ＠蛋白のＤ　Ｎ　Ａ配列Ｈ＝ＨＮ糖蛋白のＤ　Ｎ　Ａ配列Ａ＝ニオリボヌクレオチドＢ−オリゴヌクレオチドＢＴｅｒｍ＝翻訳終止シグナルチャート４アンカー領域を含有するＦＨＮ遺伝子の構築プラスミドｐＧＰＦＮ１（ａ）プラスミドｐＧＰＦＮ１をＤｒａ　ＩおよびＰｓｔｌで消化する。オリゴヌクレオチド９を該ＤＮＡに結び、次いで、オリゴヌクレオチド１０を該ＤＮＡに結ぶ。該ＤＮＡをＸｂａＴで消化し、断片６　（１，３Ｋｂンをゲル精製する。

断片６（ｂ）プラスミドｐＧＰＦ２をＸｂａ　Ｉで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。断片６をｐＧＰＦ２のＸｂａ　１部位に結んでｐＧＰＦＨＮ３を得る。

チャート４　（続き）プラスミドｐＧＰＦＨＮ３ＴｃＲ＝テトラサイクリン耐性ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性Ｔ＝グア／シン／シトシンテールＦ＝Ｆ糖蛋白についてのＤＮＡＨ＝ＨＮ糖蛋白についてのＤＮＡ９＝オリゴヌクレオチド９ＩＯｚオリゴヌクレオチド１０Ｔｅｒｍ＝翻訳終止シグナルＡ＝Ｆ糖蛋白のアンカー領域についてコード付けするＤＮＡ配列チャート５ＩＮＦキメラ遺伝子の構築用ＨＮ遺伝子の調製プラスミドｐＧＰＨＮ　１（ａ）　ブ５スミ）’ＰＧＰＨＮ１をＨｐｈｌで消化する。オリゴヌクレオチド１１を該ＤＮＡに結ぶ。該ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＰｓｔｒで消化し、断片７　（１，７Ｋｂ）ゲル精製する。

断片７　　　　　・（ｂ）プラスミドｐＵｃ１９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌで消化する。断片７をｐＵＣ１９に結んでｐＧＰＨＮ２を得る。

プラスミドｐＧＰＨＮ２チャート６（続き）ＡｍｐＲ””アンピシリン耐性ＴｃＲ＝テトラサイクリン耐性Ｔ＝ニブアノシン／シトシンテール＝Ｆ糖蛋白についてのＤＮＡ配列Ｈ＝ＨＮ糖蛋白についてのＤＮＡ配列１１＝オリゴヌクレオチド１１１２＝オリゴヌクレオチド１２１３；オリゴヌクレオチド１３国際調査報告ｓＩ＋ｍ　ｒｒｖｅ　　Ｇｅｌ　／＾ｎ貴−４国際調査報告ｕｓ　８９００８１４Ｓ＾　　　２７１ｉ８

Claims

【特許請求の範囲】

１．シグナル配列ならびにヒト・パラインフルエンザウイルス３型のＦおよびＨＮ両糖蛋白からの少なくとも１つの免疫原性断片よりなるポリペプチド。
２．該ポリペプチドが、Ｎ末端で開始し、糖蛋白Ｆからのシグナル配列、糖蛋白Ｆの免疫原性断片および露蛋白ＨＮの免疫原性断片である請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
３．請求の範囲第１項記載のポリペプチドよりなるヒト・ワクチン。
４．該ポリペプチドが、Ｎ末端で開始し、糖蛋白Ｆからのシグナル配列、露蛋白Ｆの免疫原性断片および槍蛋白ＨＮの免疫原性断片である請求の範囲第３項記載のワクチン。
５．ワクチン接種によりヒト・パラインフルエンザウイルス３型からヒトを保護するワクチンを調製するための請求の範囲第１項記載のポリペプチドの使用。
６．該ポリペプチドが、Ｎ末端で開始し、糖蛋白Ｆからのシグナル配列、糖蛋白Ｆの免疫原性断片および糖蛋白ＨＮの免疫原性断片である請求の範囲第５項記載の使用。
７．請求の範囲第１項記載のポリペプチドを発現できるＤＮＡ配列を含有する適当な宿主よりなる発現系。
８．該ＤＮＡ配列が、Ｎ末端で開始し、糖蛋白Ｆからのシグナル配列、糖蛋白Ｆの免疫原性断片および糖蛋白ＨＮの免疫原性断片であるポリペプチドを産生する請求の範囲第７項記載の発現系。
９．該適当な宿主が細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞よりなる群から選択される請求の範囲第７項記載の発現系。
１０．該適当な宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、マウスＣ１２７細胞およびエス・フルギベルサ（Ｓ．Ｆｒｕｇｉｐｅｒ３ａ）細胞よりなる群から選択される請求の範囲第９項記載の発現系。
１１．該適当な宿主が該ポリペプチドを分泌する請求の範囲第７項記載の発現系。
１２．該ＤＮＡ配列がプラスミドに含有される請求の範囲第７項記載の発現系。
１３．該プラスミドがサイトメガロウイルスプロモーターの制御下にある請求の範囲第１２項記載の発現系。
１４．適当な真核生物宿主における該プラスミドの複製がウシ乳頭腫ウイルスＤＮＡ配列の制御下にある請求の範囲第１２項記載の発現系。
１５．該ＤＮＡ配列がバクロウイルス科の組換体ウイルスに含有される請求の範囲第７項記載の発現系。
１６．該ウイルスがアウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏ−ｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスである請求の範囲第１５項記載の発現系。
１７．ヒト・パラインフルエンザウイルス３型のＦおよびＨＮ両糖蛋白からの少なくとも１つの免疫原性断片よりなるポリペプチド。
１８．請求の範囲第１７項記載のポリペプチドよりなるヒト・ワクチン。
１９．ワクチン接種によりヒト・パラインフルエンザウイルス３型からヒトを保護するワクチンを調製するための請求の範囲第１７項記載のポリペプチドの使用。