FI102616B - Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen ty yppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä - Google Patents

Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen ty yppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä Download PDF

Info

Publication number
FI102616B
FI102616B FI905184A FI905184A FI102616B FI 102616 B FI102616 B FI 102616B FI 905184 A FI905184 A FI 905184A FI 905184 A FI905184 A FI 905184A FI 102616 B FI102616 B FI 102616B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
glycoprotein
expression system
gene
plasmid
dna
Prior art date
Application number
FI905184A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI102616B1 (fi
FI905184A0 (fi
Inventor
Michael Wathen
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of FI905184A0 publication Critical patent/FI905184A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI102616B publication Critical patent/FI102616B/fi
Publication of FI102616B1 publication Critical patent/FI102616B1/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Description

102616
Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä Tämä keksintö käsittää uuden ilmentämisjärjestelmän, joka on käyttökelpoinen, kun 5 valmistetaan erityisiä virusimmuunivasteita ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3, PIV3, vastaan. Isäntäsolut, jotka on transformoitu geeneillä, jotka koodaavat uudenlaisia glykoproteiineja, ilmentämis- ja replikaatioplasmidit, jotka sisältävät ra-kennegeenejä, ja menetelmä glykoproteiineista tehtyjen rokotteiden valmistamiseksi ovat myös osa tätä keksintöä.
10 Ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppi 3, PIV3, on ankaran alemman hengitystiesairauden tärkeä alkuperäinen aiheuttaja pikkulapsissa ja nuorissa lapsissa. Virusta esiintyy maailmanlaajuisesti ja se infektoi käytännöllisesti katsoen kaikki alle neljävuotiaat lapset. Akuutti hengitystiesairaus ja myöhemmät lisätaudit ovat erityisen vakavia pikkulapsilla ja nuorilla lapsilla, mikä johtuu hengitystiejärjestelmän kyp-15 symättömyydestä ja saattavat vaatia sairaalassa oloa vakavissa tapauksissa. Alemmat hengitystieinfektiot koskevat hengitystien kaikkia osia, liittyvät yleensä kuumeeseen, yskään, valuvaan nenään ja väsymykseen ja määritetään kliinisesti keuhkoputkentulehdukseksi, ilmatiehyttulehdukseksi, keuhkokuumeeksi, kuristustaudiksi tai virusinfektioksi. Vanhemmat lapset ja aikuiset myös usein infektoituvat uudelleen, 20 vaikka uusiutuvat infektiot tyypillisesti johtavat vähemmän ankaraan ylemmän hengitystien sairauteen.
‘ ' Yritykset kehittää tehokkaita PIV3-rokotteita eivät ole suureksi osaksi onnistuneet, ϊ Kliiniset tutkimukset käyttämällä eläviä tai inaktivoituja PIV3-rokotteita osoittavat • · · erityisten virusseerumivasta-aineiden lisääntymisen, mutta ne eivät antaneet merkit-: *: ’: 25 tävää suojaa sairautta vastaan.
. . Yhdistelmälehmärokkovirusilmentämisjärjestelmän tiedetään erikseen ilmentävän *. V PIV3:n F- ja HN-glykoproteiineja ja erikseen aiheuttavan suojaavia immuunivasteita • · · * puuvillarotissa, Collins, P.L., et ai, Expression of the F and HN Glycoproteins of
Human Parainfluenza Virus Type 3 by Recombinant Vaccinia Viruses: Contri-30 butions of the Individual Proteins to Host Immunity, Journal of Virology 61.: 3416- • » · 3423 (1987). Yhdistelmälehmärokkovirusilmentämisjärjestelmän tiedetään myös ai-· ·’ heuttavan erityisiä neutralisoivia PIV3-seerumivasta-aineita ja antavan vastustusky- '· ; kyä PIV3-replikaatiolle hengitystiessä kädellisillä, Collins, P.L. et ai., Journal of
Virology 62: 1293-1296 (1988). Immunisaatio puhdistettujen F-ja HN-glykopro- 2 102616 teiinien seoksella aiheutti virusta neutraloivaa aktiivisuutta ja tuotti täydellisen suojan infektiolle hamstereissa, Ray, R., et ai., Journal of Virology 62: 783-787 (1988).
Tässä hakemuksessa on kuvattu polypeptidi, joka koostuu signaalijaksosta ja ainakin yhdestä immunogeenisesta kappaleesta, joka on molemmista ihmisen parainfluens-5 sa-viruksen tyypin 3 F-ja HN-glykoproteiineista. Tämän proteiinin valmistus käyttämällä yhdistelmätekniikoita on osa tätä keksintöä.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Seuraavia määrättyjä termejä käytetään tässä yksityiskohtaisessa selityksessä. Termi "soluviljelmä" viittaa kasvaviin soluihin, jotka on saatu joko monisoluisesta kasvista 10 tai eläimestä, jolloin soluviljely sallii solujen pysyä elinkykyisinä alkuperäisen kasvin tai eläimen ulkopuolella. Termi "alavirtaan" identifioi jaksoja, jotka jatkuvat kauempana ilmentämisen suunnassa: esimerkiksi koodaava alue on alavirtaan aloi-tuskodonista. Termi "ylävirtaan" identifioi jaksoja, jotka jatkuvat ilmentämiselle vastakkaiseen suuntaan; esimerkiksi bakteerin promoottori on ylävirtaan transkrip-15 tioyksiköstä, aloituskodoni on ylävirtaan koodaavasta alueesta. Termi "mikro-organismi" sisältää sekä yksisoluisen prokaryootin että eukaiyoottiorganismeja, kuten bakteerit, aktinomykeetit ja hiivan. Termi "operoni" on geenin ilmentämisen ja säätelyn täydellinen yksikkö, joka sisältää rakennegeenit, säätelygeenit ja valvontaele-mentit DNA:ssa, jonka säätelygeenituote tunnistaa. Termi "plasmidi" viittaa itsenäi-20 sesti replikoituvaan kromosomin ulkopuoliseen rengasmaiseen DNA:han ja sisältää sekä ilmenevän tyypin että ilmenemättömän tyypin. Kun yhdistelmämikro-organis-min tai soluviljelmän selitetään olevan isäntänä ilmentämisplasmidille, termi : . . "ilmentämisplasmidi" sisältää sekä kromosomin ulkopuolisen DNA:n että DNA:n, * 4 t ”*./ joka on liitetty isännän kromosomiin/kromosomeihin. Kun isäntäsolu ylläpitää plas- "I 25 midia, solut replikoivat pysyvästi plasmidin mitoosin aikana joko itsenäisenä raken- • · · teenä tai isäntäsolun genomiin liitettynä osana. Termi "promoottori" on DNA:n alue, joka liittyy RNA-polymeraasin sitomiseen, jotta se aloittaisi transkription. Termi "DNA-jakso" viittaa yksi- tai kaksijuosteiseen DNA-molekyyliin, joka koostuu nuk- • · · v : leotidiemäksistä, adenosiinista, tymidiinistä, sytosiinistä ja guanosiinista. Sanonta 30 "olennaisesti puhdas" viittaa proteiinin koostumukseen, joka ei sisällä muita para-influenssa-virusproteiineja kuin halutun kimeerisen yhdistelmäglykoproteiinin.
‘: ’ Vaikka olennaisesti puhtaat proteiinit saattavat olla kontaminoituja pienellä määrällä : isäntäsoluaineosia, proteiini on vailla kontaminoivaa viruksen rakenne- tai muuta · proteiinia, jota on tuotettu replikoimalla parainfluenssaviruksia. Sanonta "sopiva 35 isäntä" viittaa soluviljelmään tai mikro-organismiin, joka sopii yhteen yhdistelmä-plasmidin kanssa ja sallii plasmidin replikoitua, liittyä genomiinsa tai ilmentyä.
3 102616 Tämä keksintö sisältää sarjan molekyyligeneettisiä käsittelyjä, jotka voidaan saada aikaan eri tunnetuilla tavoilla. Käsittelyistä voidaan tehdä yhteenveto, joka sisältää cDNA:n saamisen proteiinista, DNA:n kloonauksen ja kahdentumisen E. colissa ja halutun cDNA:n ilmentämisen sopivassa isännässä. Seuraavassa selitetään yksityis-5 kohtaisesti eri menetelmiä, jotka ovat käytettävissä proteiinin ilmentämiseen, ja sitten seuraavat erityiset esimerkit suosituista menetelmistä.
Yleensä tässä keksinnössä tarvittava nimistö ja yleiset laboratoriomenetelmät voidaan löytää teoksesta Maniatis, et ai., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).
10 Kaikki E. coli -kannat kasvatetaan Luria-lihaliemessä (LB) glukoosin kanssa, Difcon antibioottielatusaineessa #2 ja M9-elatusaineessa, joita on täydennetty glukoosilla ja happohydrolysoiduilla kaseiiniaminohapoilla. Kantoja, jotka olivat vastustuskykyisiä antibiooteille, ylläpidettiin lääkekonsentraatioilla, joita on selittänyt Maniatis. Transformaatiot suoritettiin menetelmän mukaan, jonka Rowekamp ja 15 Firtel ovat selittäneet, Dev. Biol., 79: 409-418 (1980).
Kaikkia entsyymejä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaan. Transformantit analysoitiin pesäkehybridisaation avulla, kuten on selitetty artikkelissa Grunstein ja Wallis, Methods in Enzymology, 68: 379-388.
Hybridisaation jälkeen koetin-DNA:t poistetaan ja säilytetään, ja suodattimia pes-20 tään 0,1 % SDS:ssä, 0,2 x SSC:ssä kaiken kaikkiaan 3 tuntia, jonka aikana vaihdetaan 5 kertaa 400 ml liuosta. Suodattimet kuivataan täydellisesti ilmassa, asetetaan paikoilleen ja suoritetaan autoradiografia käyttämällä Kodak X-OMAT AR -filmiä : ja Dupont Cronex Lightening Plus -vahvistusvarjostimia sopivan pitkän ajan -70 °C:ssa.
• · * • · · 25 Plasmidien sekvensoimista varten valmistetaan puhdistettua plasmidi-DNA:ta mene-telmien mukaan, joita on selittänyt Maniatis. Valmistetaan DNA-kappaleita, joiden • · · !.*. päät on leimattu ja DNA-kappaleet analysoidaan Maxamin ja Gilbertin kemiallisten sekvensointimenetelmien avulla, joita on muutettu, kuten Collins ja Wertz ovat selit-0 · täneet, J. Virol. 54: 65-71 (1985).
'·' 30 Nukleotidikoot annetaan joko kiloemäksinä (Kb) tai emäspareina (bp). Nämä ovat : '.: agaroosigeelielektroforeesista saatuja arvioita.
Ensimmäinen askel proteiinin ilmentämisen aikaansaamisessa on saada DNA-jakso, joka koodaa proteiinia cDNA-klooneista. Tämä jakso kloonataan sitten ilmentämis- 4 102616 plasmidiin, joka pystyy ohjaamaan geenin transkriptiota ja sallii transkriptin tehokkaan translaation. Kiijastomenetelmää cDNA:n saamiseksi, joka koodaa proteiineja, on selittänyt yleisesti Maniatis, ja erityisesti artikkeli Elango, et ai., Human Parainfluenza Type 3 Virus Hemagglutinin-Neuraminidase Glycoprotein: Nucleotide 5 sequence of mRNA and Limited Amino Acid Sequence of the Purified Protein, J. Virol. 57: 481-489 (1986) ja Spriggs, et al., Fusion Glycoprotein of Human Parainfluenza Virus Type 3: Nucleotide Sequence of the Gene, Direct Identification of the Cleavage-Activation Site, and Comparison with Other Paramyxoviruses, Virology 152: 241-251 (1986).
10 Valmistetaan klooneja liittämällä cDNA Pst I:llä pilkottuun pBR322:een, johon on entsymaattisesti lisätty dGTP.n homopolymeerialueita 3'-päihin pilkkomiskohtaan. dCTP:n homopolymeerialueita lisätään entsymaattisesti cDNA-molekyylien 3'-päihin Maniatiksen selittämien menetelmien mukaan. Pitäisi lisätä 10-30 dCTP- tai dGTP-tähdettä, jotta kloonaustehokkuus tehtäisiin suurimmaksi mahdolliseksi. 15 cDNA ja plasmidi liitetään yhteen ja transformoidaan E. coliin. Kloonit, jotka sisältävät täysipituisen cDNA:n, saadaan selville leimatun virus-cDNA-koettimen tai geenijaksojen osille komplementaaristen oligonukleotidikoettimien avulla, minkä jälkeen seuraa restriktioentsyymianalyysi ja DNA-sekvensointi.
Oligonukleotidit syntetisoidaan kemiallisesti kiinteä faasi fosforamidiitti-triesteri 20 -menetelmän mukaan, jonka Beaucage ja Caruthers ovat ensin selittäneet, Tetrahedron Letters, 22 (20): 1859-1862 (1981), käyttämällä automatisoitua syntetisaattoria, kuten on selitetty artikkelissa Needham-VanDevanter, et ai., Nucleic Acids Res., 12 6159-6168 (1984). Oligonukleotidit puhdistetaan joko alkuperäisen akryyliamidi-·.· · geelielektroforeesin avulla tai anioninvaihto-HPLC:n avulla, kuten Pearson ja 25 Regnier ovat selittäneet, J. Chrom., 255: 137-149 (1983).
• · · • · · • · · * Synteettisten oligonukleotidien jakso voidaan osoittaa oikeaksi käyttämällä Maxamin ja Gilbertin kemiallista hajoamismenetelmää, Grossman ja Moldave, • · · *·*·* toim., Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65: 499-560 (1980).
• · · m · · • · ·
Jotta saataisiin kloonatun geenin korkea ilmentämistaso prokaryoottijärjestelmässä, 30 on olennaista rakentaa ilmentämisvektoreja, jotka sisältävät vähintään voimakkaan '· ·’ promoottorin ohjaamaan mRNA-transkriptiota, ribosomiin sitoutumispaikan trans- laation aloitusta varten, ja transkription lopettajan. Esimerkkeinä tätä tarkoitusta :1 ·.: varten olevista säätelyalueista ovat E. colin biosynteettisen tryptofaanireaktioketjun promoottori-ja operaattorialue, kuten Yanofsky, Kelley ja Horn ovat selittäneet, J. 35 Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984) ja lambda-faagin vasemmanpuoleinen promoot- 5 102616 tori (Pl), kuten Herskowitz ja Hagen ovat selittäneet, Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980).
E. colissa tuotetut proteiinit eivät laskostu kunnolla kysteiinitähteiden vuoksi ja koska sopivat translaation jälkeiset muuttelut puuttuvat. E. colista puhdistamisen aikana 5 ilmennetyt proteiinit täytyy ensin denaturoida ja sitten renaturoida. Tämä voidaan suorittaa liuottamalla E. colin tuottamat proteiinit guanidiini-HCl.ssä ja pelkistämällä kaikki kysteiinitähteet β-merkaptoetanolilla. Sitten proteiini renaturoidaan joko hitaasti dialysoimalla tai geelisuodatuksen avulla, US-patenttijulkaisu 4 511 503.
Proteiinien selville saaminen saavutetaan alalla tunnettujen menetelmien avulla kulo ten radioimmunokokeiden tai Western blotting -tekniikoiden tai immunosaostuksen avulla. Puhdistaminen E. colista voidaan saavuttaa seuraamalla US-patenttijulkai-sussa 4 511 503 selitettyjä menetelmiä.
Heterologisten proteiinien ilmeneminen hiivassa on hyvin tunnettua ja selitettyä. Methods in Yeast Genetics, Sherman, et ai., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) 15 on hyvin tunnettu työ, joka selittää eri menetelmiä, joita käytetään proteiinien tuottamiseen hiivassa.
Geenin korkeaa ilmentämistasoa varten hiivassa on olennaista liittää geeni vahvaan promoottorijärjestelmään, kuten prokaryootissa, ja myös antaa tehokkaita transkription lopetus/polyadenylaatio-jaksoja hiivan geenistä. Hyödyllisten promoottorien 20 esimerkkeihin kuuluvat GAL1,10, Johnston ja Davis, Mol. and Cell. Biol., 4: 1440-! 1448, (1984), ADH2, Russell, et ai., J. Biol. Chem. 258: 2674-2682, (1983), PH05, . . EMBOJ. 6: 675-680, (1982), ja MFal. Monikopioplasmidi, jossa on valikoiva :;|t: merkitsijä, kuten Lue-2, URA-3, Trp-1, tai His-3, on myös toivottava. MFal-pro- • · *···* moottori on suosittu. MFal-promoottori toimii a-pariutumistyypin isännässä va- \: · 25 kiosti, mutta ei toimi diploideissa tai α-pariutumistyypin soluissa. Sitä voidaan kui tenkin säädellä nostamalla tai laskemalla lämpötilaa isännissä, joilla on ts-mutaatio :V: yhdessä SIR-lokuksista. Tällaisen mutaation vaikutus 35 °C:ssa α-tyypin soluun on normaalisti toimimattoman geenin muuttaminen koodaamaan a-pariutumistyyppiä. .1. Toimimattoman α-pariutumistyypin geenin ilmeneminen puolestaan saa MFal- 30 promoottorin toimimattomaksi. Kasvulämpötilan laskeminen 27 °C:een kääntää ko-ko tapahtumasarjan kulun, so. kääntää α-pariutumistyypin pois päältä ja laittaa :***: MFal:n päälle, Herskowitz ja Oshima, The Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces, Strathem, Jones, ja Broach, toim., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 181-209, (1982).
6 102616
Minkä tahansa erittäin ilmenevän geenin, kuten ADHl:n, MFal.n, tai TPl:n, 3'-pään jaksot tarjoavat polyadenylaatiojaksoja, Alber ja Kawasaki, J. of Mol. and Appi. Genet. 1: 419-434, (1982).
Lukuisia hiivan ilmentämisplasmideja, kuten YEp6:ta, YEpl3:a, YEp24:ä, voidaan 5 käyttää vektoreina. Mielenkiinnon kohteena oleva geeni voidaan fuusioida mihin tahansa yllä mainittuun promoottoriin ja sitten liittää plasmideihin eri hiivaisännissä ilmentämistä varten. Nämä plasmidit on yksityiskohtaisesti selitetty kirjallisuudessa, Botstein, et ai., Gene, 8: 17-24, (1979); Broach, et ai., Gene, 8: 121-133, (1979).
Käytetään kahta menetelmää hiivasolujen transformoimisessa. Yhdessä tapauksessa 10 hiivasolut ensin muutetaan protoplasteiksi käyttämällä tsymolyaasia, lytikaasia tai glusulaasia, minkä jälkeen seuraa DNA:n ja polyetyleeniglykolin (PEG) lisäys. PEG:llä käsitellyt protoplastit sitten regeneroidaan 3-prosenttisessa agarelatus-aineessa valikoivissa olosuhteissa. Yksityiskohtia tästä menetelmästä annetaan artikkeleissa Beggs, Nature (Lontoo), 275: 104-109 (1978); ja Hinnen, et ai., Proc. Natl. 15 Acad. Sei. USA, 75: 1929-1933 (1978). Toinen menetelmä ei sisällä soluseinän poistoa. Sen sijaan soluja käsitellään litiumkloridilla tai asetaatilla ja PEG.llä ja ne laitetaan valikoiville maljoille, Ito, et ai., J. Bact., 153: 163-168, (1983).
cDNA voidaan liittää eri ilmentämisvektoreihin käytettäväksi isäntäsoluviljelmien transformoimiseen. Kaikki vektorit sisältävät geenijaksoja, jotka aloittavat proteiini-20 en, jotka sopivat yhteen transformoitavan isäntäsolun kanssa, transkription ja translaation.
. . Lisäksi vektorit mieluummin sisältävät merkitsijän, joka tarjoaa fenotyyppisen omi- *“.· naisuuden transformoitujen isäntäsolujen valikointia varten, kuten dihydrofolaattire- • · *···' duktaasin tai metallotioneiinin. Lisäksi replikoiva vektori saattaa sisältää replikaa- : 25 tioyksikön.
Hyönteis- tai nisäkässoluviljelmät ovat hyödyllisiä proteiinien tuotantoa varten. Ni-säkässolujärjestelmät ovat usein yksisolukerrosmuodossa, vaikka nisäkässolusus- • · · pensioita voidaan myös käyttää. Valaiseviin esimerkkeihin nisäkässolulinjoista • · · v : kuuluvat VERO-ja HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO) -solulinjat, ··!]] 30 WI38-, BHK-, COS-7- tai MDCK-solulinjat.
Vektori, jota käytetään isäntäsolun transformoimisessa, sisältää mieluummin geeni-;: jaksoja, jotka aloittavat proteiinin geenijakson transkription ja translaation. Näitä jaksoja pidetään ilmentämisen valvontajaksoina. Kun isäntäsolu on peräisin nisäkkäästä tai hyönteisestä, valaisevia hyödyllisiä ilmentämisen valvontajaksoja saadaan 7 102616 SV-40:n promoottorista, Science, 222, 524-527 (1983), CMV I.E. -promoottorista, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 659-663 (1984), metallotioneiini-promoottorista, Nature, 296, 39-42, (1982) tai baculoviruksen polyhedriini-promoottorista (hyönteissolut), Virol., 131, 561-565 (1983). Plasmidi, joka replikoi tai liittää DNA-materiaalia, jo-5 ka sisältää ilmentämisen valvontajaksoja, pilkotaan käyttämällä restriktioentsyymejä ja koko sovitetaan tarpeelliseksi tai toivottavaksi ja liitetään proteiineja koodaavaan cDNA:han käyttämällä alalla hyvin tunnettuja menetelmiä.
Kun käytetään korkeampia eläimiä isäntäsoluina, täytyy sisällyttää tunnetuista nisä-käsgeeneistä polyadenylaatio- tai transkription lopetusjaksot vektoriin. Esimerkki 10 lopetusjaksosta on härän kasvuhormonigeenin polyadenylaatiojakso.
Lisäksi voidaan vektoriin sisällyttää geenijaksoja, jotka valvovat replikaatiota isän-täsolussa, kuten jaksoja, jotka on löydetty härän papilloomavirustyypin vektoreista, Saveria-Campo, "Bovine papilloma-virus DNA: a eukaryotic cloning vector", DNA Cloning Vol.II--A practical approach, Glover, ed., IRL Press, Arlington, Virginia 15 213-238(1985).
Suosittu ilmentämisvektori, joka on hyödyllinen proteiinien ilmentämistä varten kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO) -soluissa, on pSVCOW7-sukkulavektori, joka replikoituu sekä CHO- että E. coli -soluissa käyttäen hyväksi ampisilliinivastustus-kyky- ja dihydrofolaattireduktaasigeenejä merkitsijöinä E. coli- ja CHO-soluissa 20 vastaavasti. pSVCOW7-plasmidi tarjoaa myös naudan kasvuhormonin polyadeny-laatiojakson, joka on tarpeellinen CHO-soluissa ilmentämistä varten. pSVCOW7-plasmidi pilkotaan ja viruksen promoottori ja cDNA:t liitetään.
Suosittu ilmentämisvektori, joka on hyödyllinen muodostettaessa yhdistelmä- • · baculovirusta proteiinien ilmentämistä varten hyönteissoluissa, on pAc373, Smith, *·’ * 25 et ai., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165 (1983). Plasmidi replikoituu E. coli -soluissa käyttäen hyväksi ampisilliinivastustuskykyä, ja tarjoaa eukaryoottisen promoottorin • · ja polyadenylaatiosignaalin baculoviruksen polyhedriini-geenistä geenien ilmentä-:T: mistä varten. pAc373-plasmidi pilkotaan ja cDNA liitetään promoottorin viereen.
Tämä uusi plasmidi transfektoidaan yhdessä baculoviruksen (Autographa califomi- · · 30 ca, nukleaarinen polyhedroosivirus) DNA:n kanssa hyönteissoluihin kalsiumfos-" faattisaostuksen avulla. Yhdistelmä-baculovirus, jossa cDNA.n sisältävä pAC373- : *.: polyhedriini-geeni on korvannut virukseen kuuluvan polyhedriini-geenin homologi- : ’ ·. i sen rekombinaation avulla, saadaan selville täpläsuodatinhybridisaation avulla käyt
tämällä koettimena 32P:lla leimattua cDNA’.ta, Summers ja Smith, A Manual of 35 Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A & M
g 102616
University, College Station, TX, 29-30 (1986). Yhdistehnä-baculoviruksella infektoidut hyönteissolut voidaan myös erottaa niiden okkluusio-negatiivisen morfologian perusteella, koska cDNA:n liittäminen polyhedriini-geeniin estää tämän okkluusiota muodostavan proteiinin synteesin.
5 pTFW9 on suosittu ilmentämisvektori, jota käytetään yhdessä naudan papillooma-viruksen (BPV) kanssa proteiinien ilmentämistä varten. (pTFW9-plasmidi talletettiin Budapestin sopimuksen mukaan. pTFW9-plasmidia pidetään yllä E. coli -isännässä ja se on talletettu Northern Regional Research Centerin kokoelmiin, Peoria, Illinois, USA, 17. marraskuuta, 1986 tulonumerolla NRRL B-18141.) Plasmidi rep-10 likoituu E. colissa käyttäen hyväksi ampisilliinivastustuskykyä ja taijoaa hiiren me-tallotioneiini-promoottorin ja SV40:n polyadenylaatio-signaalin geenien ilmentämistä varten. pTFW9-plasmidi pilkotaan ja cDNA liitetään promoottorin viereen. Tämä uusi plasmidi sitten pilkotaan, jotta BPV voidaan liittää. Yhdistelmäplasmidi trans-fektoidaan eläinsoluihin kalsiumfosfaattisaostuksen avulla ja valikoidaan transfor-15 moituneiden solujen pesäkkeet.
Isäntäsolut ovat kompetentteja tai ne tehdään kompetenteiksi transfektiota varten eri keinoilla. On useita hyvin tunnettuja menetelmiä DNA:n viemiseksi eläinsolujen sisään. Näihin kuuluvat: kalsiumfosfaattisaostus, vastaanottajasolujen fuusiointi DNA.n sisältävien bakteeriprotoplastien kanssa, vastaanottajasolujen käsittely 20 DNA:n sisältävien liposomien kanssa, ja DNA:n mikroinjektio suoraan solujen sisään. Transfektoituja soluja viljellään alalla hyvin tunnetuilla keinoilla, Biochemical ] Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinson ja Ross, Inc., (1977). Yhdistelmäglykoproteiinit, jotka on ilmennetty yhdessä edellä olevista euka- i.: : ryoottisista ilmentämisjärjestelmistä, eristetään solususpensioista, jotka on saatu ai- • · · 25 kaan isäntäsolujärjestelmän hajottamisella hyvin tunnettujen mekaanisten tai entsy-:T: maattisten keinojen avulla. Proteiinit, jotka on tarkoitettu eritettäväksi soluista, eristetään elatusaineista ilman, että soluja hajotetaan. Glykoproteiinien puhdistamis-ta varten on hyödyllistä ensin levittää solulimafraktio linssilektiinipylvään päälle, • · joka erityisesti sitoo glykoproteiineja. Eluoidut glykoproteiinit levitetään sitten vas- [· 30 ta-ainetta sisältävän affiniteettipylvään päälle.
• · · • · · : * * *: Tyypillinen glykoproteiini voidaan jakaa kolmeen alueeseen. Aminoterminaalisessa päässä on hydrofobinen alue, joka on nimeltään signaalijakso. Tämä aminohappojen • ·’ jakso antaa merkin glykoproteiinin kuljettamisesta solukalvolle. Kuljettamisen jäl- : keen signaalijakso poistetaan pilkkomalla. Signaalijaksosta alavirtaan on kypsän 35 glykoproteiinin solun ulkopuolinen alue. Tämä on glykoproteiinin immunogeeninen osa, koska vasta-aineet pääsevät sen luokse. Glykoproteiinin karboksyyliterminaali- 9 102616 sessa päässä on hydrofobinen ankkurialue, joka aiheuttaa glykoproteiinin pysymisen solukalvossa. PIV F on tyypillinen glykoproteiini, koska se sisältää aminoterminaa-lisen signaalijakson ja karboksyyliterminaalisen ankkurijakson, Spriggs, et ai., Virology 152: 241-25, (1986). Kuitenkin PIV 3 HN -glykoproteiini on erikoinen, koska 5 sen aminoterminaalinen pää toimii sekä signaali- että ankkurialueena, Elango, et ai., J. Virol. 57: 481-489, (1986).
Glykoproteiini voidaan määrätä eritettäväksi soluista ympäröiviin elatusaineisiin. Tämä toteutetaan aiheuttamalla glykoproteiinin aikainen lopetus ennen ankkurialu-een translaatiota, Lasky, et ai., Biotechnology, 2: 527-532 (1984). Aikainen lopetus 10 voidaan toteuttaa liittämällä translaation yleislopettajaoligonukleotidi sopivaan kohtaan geenin DNA:ssa. Nämä oligonukleotidit ovat kaupallisesti saatavilla. Aikainen lopetus voidaan myös toteuttaa muuttamalla lukukehystä, täten aiheuttamalla translaation lopetuskodoni.
Seuraavassa selitetty kimeerinen glykoproteiini koostuu PIV3 F:n signaali- ja solun 15 ulkopuolisesta alueesta, jotka on liitetty PIV3 HN:n solun ulkopuoliseen alueeseen, ja siihen viitataan FHN:llä. Jos edellä selitetty FHN-geeni on sopivasti sijoitettu eu-karyoottiseen ilmentämisvektoriin, FHN-geeni on suunniteltu ilmentämään kimeeris-tä glykoproteiinia, joka kuljetettaisiin solun pinnalle ja eritettäisiin elatusaineisiin.
Pääosa PIV3 HN-proteiinin solulima-alueesta sisältyy koodaavaan alueeseen, johon 20 ulottuu Dral- (proteiinikoodausalueen nukleotidipaikka 452) ja Pstl-restriktioentsyy- mikohta (proteiinikoodausalueen nukleotidipaikka 1709). Tämä jakso ei koodaa gly- . : koproteiinin signaali/ankkuri -aluetta. Pääosa PIV3 F -proteiinin solulima-alueesta : :': sisältyy koodaavaan alueeseen, joka on ennen Xbal-restriktioentsyymikohtaa (pro- « · · « .*·*. teiinikoodausalueen nukleotidipaikka 1398). Tämä jakso koodaa signaalialueen ja 25 pääosaa antigeenisestä alueesta, mutta ei F-glykoproteiinin ankkurialuetta.
Jotta HN-glykoproteiinijakso voitaisiin liittää PIV3:n F-glykoproteiiniin, HN-geeni • · pilkotaan Pstl:llä ja pää tehdään tylpäksi T4 DNA -polymeraasin avulla. Xbal- :T: linkkeri (New England Biolabs), jossa on jakso •
0 : CTAGTCTAGACTAG
O 30 CATCAGATCTGATC
:\ liitetään päähän. Geeni erotetaan jäljelle jääneestä linkkeristä agaroosigeelielektro- ‘ · : foreesin avulla. Edellä oleva linkkeri sisältää oikeassa vaiheessa olevan translaation lopetussignaalin, joka pysäyttää proteiinisynteesin. HN-geeni sitten pilkotaan Dral.lläja Xbal-linkkeri (New England Biolabs), jossa on jakso ίο 102616
TGCTCTAGAGCA
ACGAGATCTCGT
liitetään päähän. Tämä linkkeri ei sisällä oikeassa vaiheessa olevaa translaation lope-tussignaalia ja sallii proteiinin lukemisen F-jakson läpi HN-jaksoon. Linkkerit sisäl-5 tävä HN-geenikappale (1,3 Kb) pilkotaan XbaLllä ja erotetaan jäljelle jääneistä linkkereistä agaroosigeelielektroforeesin avulla. PIV3 F-geeni pilkotaan XbaMlä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. 1,3 Kb HN-kappale liitetään sitten F-geeniin Xbal-kohtaan ja transformoidaan E. coli HB101:een. Kimeerisen glykoproteiini-geenin sisältävä klooni eristetään ja liitoskohdat F- ja HN-DNA-jak-10 sojen välillä osoitetaan oikeiksi Maxam-Gilbert-sekvensoinnin avulla. Kimeerinen PIV3-glykoproteiini voidaan sijoittaa sopivaan ilmentämisvektoriin.
Edellä olevat restriktioentsyymikohdat valittiin, koska ne sallivat F- ja HN-glyko-proteiinien merkityksellisten alueiden suuren osan ilmentämisen. Kuitenkin muita glykoproteiinien osia voitaisiin ilmentää valitsemalla muita restriktioentsyymikohtia 15 F- ja HN-koodausjaksoista näiden geenien fuusiota varten. Esimerkiksi Haelll-, Kpnl-, tai NlalV-restriktioentsyymejä voitaisiin käyttää pilkkomisessa HN-geenin 5'-päässä. Bal 1 -, Bgl II -, tai Haelll-restriktioentsyymejä voitaisiin käyttää pilkkomisessa HN-geenin 3-päässä. Entsyymejä voitaisiin käyttää missä tahansa kahden yhdistelmässä, jolloin on yksi entsyymi kummastakin ryhmästä, jotta saataisiin im-20 munogeenisia proteiinikappaleita. gpF-geenille voitaisiin käyttää Bgl II-, Haelll-, Nsil-, tai XhoII-restriktioentsyymejä Xbal.n sijaan. Linkkerioligonukleotideja voitaisiin lisätä korjaamaan lukukehystä liitoskohta-alueilla. Kaksi oligonukleotidia, jotka korjaisivat kaksi mahdollista lukukehyksen muutosta, ovat Sall-linkkerit
GGTCGACC CGGTCGACCG
• · 25 Ja
' CCAGCTGG GCCAGCTGGC
:V: jotka ovat kaupallisesti saatavilla. Myös, kun halutaan ankkurialue glykoproteiiniin, linkkerioligonukleotidi lisätään toiseen liitoskohtaan, mikä sallii gpF-ankkurialueen • synteesin. Vaihtoehtoisia strategioita voitaisiin suunnitella kimeerisen FHN-proteii- *;].* 30 nin ilmentämistä varten eri jaksojen liittämisen tai häviämisen avulla. Päätunnus- • · ‘ * merkki proteiinille on signaalijakson ja kahden glykoproteiinin immunologisesti tär- i · ’: keiden alueiden säilyttäminen.
FHN-geenin liittäminen CHO-, BPV- tai baculovirus-ilmentämisvektoreihin on kuten on jo selitetty.
II
102616
Kimeerinen FHN-glykoproteiini tarjoaa etuja verrattuna yksittäisten glykoproteiini-en ilmentämiseen. Koska FHN on yksi ainoa proteiini, se vaatii puhdistamista varten puolet siitä työstä ja reagensseista, jotka tarvitaan erillisten F- ja HN-glykoproteii-nien puhdistamiseen. Kimeerinen FHN-glykoproteiini myös eritetään elatusainei-5 siin, mikä helpottaa puhdistamista. F-glykoproteiini voidaan muuttaa eritettäväksi glykoproteiiniksi katkaisemalla se ennen ankkurialuejaksoja. Kuitenkin PIV3 HN -glykoproteiini sisältää signaali/ankkurialueen sen aminoterminaalisessa päässä. Siksi tämän glykoproteiinin katkaiseminen ei synnytä eritettävää muotoa. Signaali/-ankkurialue voitaisiin korvata vieraan glykoproteiinin signaalialueella, mutta tämä 10 lisäisi vieraita proteiinijaksoja mahdolliseen rokotteeseen.
Konventioiden, joita käytetään plasmidien ja kappaleiden kuvaamisessa taulukoissa 1-6, on tarkoitus olla samanmerkityksisiä kuin tavaksi tulleiden rengasmaisten plasmidien ja niiden kappaleiden kuvausten. Toisin kuin rengasmaiset kuviot, yksiviiva-kuviot taulukoissa kuvaavat sekä rengasmaista että suoraa kaksijuosteista DNA:ta, 15 jossa on aloitus tai transkriptio tapahtuu vasemmalta oikealle (5':sta 3':uun). Tähdet (*) kuvaavat nukleotidien täyttämistä, jotta plasmidien rengasmainen muoto tehtäisiin täydelliseksi. Kappaleilla ei ole tähtimerkkejä, koska ne ovat kaksijuosteisen DNA:n suoria osia. Endonukleaasikohdat osoitetaan viivan yläpuolella. Geenimer-kitsijät osoitetaan viivan alapuolella. Merkitsijöiden suhteellinen väli ei osoita to-20 dellisia etäisyyksiä, vaan niiden on vain tarkoitus osoittaa niiden suhteellinen sijainti kuvitetussa DNA-jaksossa.
Esimerkki 1 G-C-häntien poisto F-glykoproteiini-geenistä, taulukko 1 : ; Jotta saataisiin F-glykoproteiinin enimmäisilmeneminen, G-C-nukleotidit, joita :***: käytetään cDNA:n liittämiseksi pBR322-plasmidiin, täytyy poistaa cDNA.n päistä.
25 Jotta liitettäisiin FHN-cDNA sopivasti CHO-soluja varten olevaan suosittuun ilmen-tämisvektoriin (pSVCOW7, selitetty jäljempänä), tai baculovirusta varten olevaan suosittuun ilmentämisvektoriin (pAc373, selitetty jäljempänä), on välttämätöntä • · · !.*. hankkia BamHI-kohta ylävirtaan proteiinikoodausjaksosta. Menetelmät F-glykopro- teiinin koko jakson sisältävien cDNA-kloonien synteesiä varten on selitetty. Spriggs, :T: 30 et ai., Virology 152: 241-251, (1986).
* * * "·' cDNA, joka sisältää ehjän PIV3-F-geenin (pGPFl), pilkotaan BstXI:llä ja Ndekllä.
: '.: BstXI pilkkoo F-geenin paikassa 39, joka kuuluu geenin aloituskodoniin, Ndel pilk- :. ’ koo paikassa 1599. Oligonukleotidi 1 liitetään BstXI-pilkkomiskohtaan ja oligonuk- leotidi 2 liitetään Ndel-pilkkomiskohtaan. Oligonukleotidi 1 sisältää DNA-jaksot 10 35 emäksestä ennen koodausaluetta BstXI-pilkkomiskohtaan F-geenin koodausalueella 12 102616 (-10:stä +39:ään), ja oligonukleotidilla on BamHI-kohta 5'-päässään. Oligonukleo-tidi 2 sisältää DNA-jaksot Ndel-pilkkomiskohdasta F-geenin lopetuskodoniin (+1599:stä +1620:een). Oligonukleotidi 2:n 3'-päässä on Nrul-restriktioentsyymi-kohta, mitä seuraa BamHI-restriktioentsyymikohta.
5 Oligonukleotidien liittämisen jälkeen DNA pilkotaan BamHI:llä ja F-geeni (kappale 1, 1,6 Kb) puhdistetaan geelissä. Kappale 1 liitetään pBR322-plasmidiin (Pharmacia), joka on pilkottu BamHI:llä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasil-la. Plasmidi (pGPF2) transformoidaan E. coli HB 101:een. pGPF2:n juuri syntetisoidut alueet sekvensoidaan Maxam-Gilbert-menetelmän avulla oikean synteesin ja 10 liittämisen tarkistamiseksi.
Oligonukleotidi 1
CGGATCCACTGAACATGATGCAACCTCAATACTGCTAATTATTACAACCATGATT GCCT AGGTGACTTGT ACT ACGTTGGAGTT ATGACGATT AATAATGTTGGTA
Oligonukleotidi 2
15 TATGTATT AAC AAAC AAATGATCGCGACGGATCCG
ACATAATTGTTTGTTTACTAGCGCTGCCTAGGC
Esimerkki 2 Kimeerisen PIV3-FHN-geenin rakentaminen, taulukko 2 A. PIV3-HN-glykoproteiinigeenin valmistaminen
Kloonit, jotka sisältävät PIV3-HN-geenin koko koodausalueen ja menetelmät tällais- : 20 ten kloonien eristämistä varten on selitetty. Elango et ai., J. Virol. 57: 481-489, (1986). cDNA-klooni, joka sisältää PIV3-HN-geenin (pGPHNl), pilkotaan PstEllä.
v · Tämä entsyymi pilkkoo HN-geenin 3'-päätä kohti (nukleotidi +1714). Kappaleen päät tehdään tylpiksi T4 DNA-polymeraasilla ja sitten defosforyloidaan bakteerin ;*:*· alkalisella fosfataasilla. Xbal-linkkeri (New England Biolabs; linkkeri 1), jolla on • · 25 jakso « « « ·*
:T: CTAGTCTAGACTAG
·.;;;·. gatcagatctgatc : '.; liitetään päähän. cDNA erotetaan jäljelle jääneestä linkkeristä elektroforeesin avulla j 1,2 % agaroosigeelissä. 1,7 Kb kappale (kappale 2), joka sisältää HN-geenin, irro- 30 tetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista. Edellä oleva linkkeri sisältää oikeassa vaiheessa olevan translaation lopetussignaalin, joka pysäyttää proteiinisyn- 13 102616 teesin. HN-geeni sitten pilkotaan Drakllä. Tämä entsyymi pilkkoo HN-geenin sig-naali/ankkuri-koodausalueen 3'-päästä (nukleotidi +452). Xbal-linkkeri (New England Biolabs; linkkeri 2), jossa on jakso
TGCTCTAGAGCA 5 ACGAGATCTCGT
liitetään päähän. Tämä linkkeri ei sisällä oikeassa vaiheessa olevaa translaation lope-tussignaalia. DNA pilkotaan Xbalrllä ja erotetaan jäljelle jääneistä linkkereistä elektroforeesin avulla 1,2 % agaroosigeelissä. 1,3 Kb kappale, joka sisältää HN-geenin merkityksellisen alueen, irrotetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista.
10 B. HN-cDNA:n liittäminen PIV3-F-glykoproteiinigeeniin pGPF2-plasmidi pilkotaan Xbakllä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfa-taasilla. 1,3 Kb kappale liitetään Xbal-kohtaan, jolloin saadaan kimeerinen FHN-geeni (pGPFHNl). Plasmidi transformoidaan E. coli HB 101:een. Kloonit eristetään ja valikoidaan ne kloonit, joissa HN-cDNA on oikein päin F-geenissä pilkkomalla 15 BamHI:llä ja PvuII:lla, mikä synnyttää FHN-geenistä noin 2,5 Kb ja 350 bp kappaleet. Jos HN-kappale on väärin päin, saadaan BamHI:llä ja PvuIIilla pilkkomalla noin 1,5 Kb ja 1,3 Kb kappaleet. Oikein päin olevan kloonin liitoskohta-alueet sek-vensoidaan Maxam-Gilbert-tekniikan avulla, jotta varmistetaan HN-kappaleen liittyminen oikein.
20 Esimerkki 3 DNA-oligonukleotidien käyttäminen geenien synnyttämiseksi, jotka . . koodaavat eri pituisia kimeerisiä FHN-glykoproteiineja, taulukko 3 t · F-HN-glykoproteiinien eri alueita sisältäviä kimeerisiä FHN-glykoproteiineja koo-daavia geenejä voidaan synnyttää käyttämällä restriktioentsyymien yhdistelmää ja oligonukleotideja. Tämä menetelmä sallii F- ja HN-glykoproteiinien liittämisen mi-25 hin tahansa haluttuun kohtaan niiden aminohapporungossa, sallii alueiden liittämi- • « · sen tai poistamisen, jotka todennäköisesti sisältävät epitooppeja, jotka isännän im- • · # *. muunijärjestelmä tunnistaa. Jos halutaan, voidaan myös vaihtaa yksittäisiä amino- • · · : happoja. Syntetisoidaan oligonukleotideja, jotka vastaavat DNA-jaksoa halutusta : liitoskohdasta sopivaan restriktioentsyymikohtaan. Tällä restriktioentsyymillä pilko- 30 taan glykoproteiinigeeni ja oligonukleotidi liitetään geeniin restriktioentsyymikoh-. taan, jolloin syntyy halutun pituinen DNA-kappale. Syntetisoidaan oligonukleotide ja, joiden päät sopivat yhteen restriktioentsyymikohtien kanssa, mikä helpottaa liittymistä.
14 102616 A. HN-glykoproteiini-cDNA:n liittäminen F-gly koproteiinigeeniin pGPHNl-klooni pilkotaan Pstl.llä ja Dral.llä. 1,3 Kb kappale, joka vastaa cDNA-aluetta nukleotidipaikasta 452 1714:ään (kappale 4), puhdistetaan geelissä. Sitten oligonukleotidit, jotka vastaavat HN-cDNA:n viereisiä alueita, liitetään kappale 4:n 5 molempiin päihin. Näissä oligonukleotideissa olevat DNA-jaksot saattavat koodata lisäepitooppeja, joita on löydetty HN-glykoproteiinista. Yksittäiset oligonukleotidit suunniteltiin sisältämään alueita, jotka saattavat sisältää ainutlaatuisia epitooppeja. HN-cDNA:n 5'-päähän liitetty oligonukleotidi saattaa koostua joko oligonukleotidis-ta 3 (cDNA-nukleotidit 395:stä 452:een), oligonukleotideista 3-4 (cDNA-nukleotidit 10 355:stä 452:een), oligonukleotideista 3-4-5 (cDNA-nukleotidit 275:stä 452:een), oligonukleotideista 3-4-5-6 (cDNA-nukleotidit 218:sta 452:een), tai oligonukleotideista 3-4-5-6-7 (cDNA-nukleotidit 162:sta 452:een). Sulut sisältävät nukleotidit, jotka sisällytettäisiin vain päässä olevaan oligonukleotidiin. Esimerkiksi mukaan liitettyjä nukleotideja ei sisällytettäisi oligonukleotidiin 5, jos oligonukleotidi 6 olisi 15 määrä lisätä. Nämä mukaan liitetyt nukleotidit koodaavat Xbal-kohtaa. Mukaan liitettyjä nukleotideja ei sisällytetä, kun on määrä lisätä oligonukleotidi/oligonukleo-tideja, jotta sallittaisiin oligonukleotidien yhteen sopivien päiden liittyminen. Esimerkiksi 3-oligonukleotidin 5'-pää sopii yhteen 4-oligonukleotidin 3'-pään kanssa, kun sulkujen sisältäviä nukleotideja ei sisällytetä oligonukleotidiin 3. Oligonukleo-20 tidi 8 liitetään HN-geenikappaleen 3-päähän. Tämän oligonukleotidin 5'-pää sopii yhteen 4-kappaleen 3'-pään kanssa. Tämän oligonukleotidin 3'-pää sisältää oikeassa vaiheessa olevan translaation lopetussignaalin, jota seuraa Xbal-restriktioentsyymi-kohta.
: Kun oligonukleotidit on liitetty HN-cDNA-kappaleeseen, DNA pilkotaan XbaLllä ja 25 suurentunut HN-cDNA-kappale (kappale 5) puhdistetaan geelissä. Uusi HN-cDNA- ··» : kappale sitten liitetään Xbalillä pilkottuun pGPF2:een. DNA transformoidaan E.
coli HB 101 reen ja eristetään klooni (pGPFHN2), joka sisältää HN-geenin oikein :V: päin F-geenissä. Oikea suunta määritetään pilkkomalla sopivilla restriktioentsyy- :T: meillä. Kimeerisen geenin juuri syntetisoidut alueet osoitetaan oikeiksi Maxam- y.. 30 Gilbert-sekvensoinnin avulla. Klooni voidaan sitten sijoittaa eri ilmentämisvekto- *; ’, * reihin, kuten seuraavassa on selitetty.
• I
• · • · 15 102616 B. Oligonukleotidit
3) (GTCTAGA AATTAGGA) ATGATAATC AAGAAGTGCCTCC AC AAAGAATAA (CAGATCT)TTAATCCT TACTATTAGTTCTTCACGGAGGTGTTTCTTATT
CACATGATGTGGGCATAAAACCTT 5 GTGTACTACACCCGTATTTTGGAA
4) (GTCTAGA TATACCGA)TATCATTGACACAACAAATGTCGGATCTTAGGAAATT (CAGATCT)ATATGGCT ATAGTAACTGTGTTGTTTACAGCCTAGAATCCTTTAA
C ATTAGTGAAATT AC AATTAGGA GTAATCACTTT AATG
10 5) (GTCTAGA TCTAATAC)AGTCAGGAGTGAATACAAGGCTTCTTACAATTCAG
(CAGATCT)AGATTATG TCAGTCCTCACTTATGTTCCGAAGAATGTTAAGTC AGTC ATGTCC AGAATTAT ATACCGA TCAGTACAGGTCTTAAT
6) (GTCTAGA CAATGAGT)TTATGGAAGTTACAGAAAAGATCCAAATGGCATCGG
15 (CAGATCT)GTTACTCA AATACCTTCAATGTCTTTTCTAGGTTTACCGTAGCC
ATAATATTAATGATCTAATAC TATTATAATTACT
7) GTCTAGATTCCATCAAAAGTGAAAAAGCCCATGAATCATTGCTACAA
. i: CAGATCTAAGGTAGTTTTCACTTTTTCGGGTACTTAGTAACGATGTT
1.: : 20 GACGTAAACAATGAGT
CTGCATTT
• ♦ ·
* 8) GTTAATCTAGAG
ACGTCAATTAGATCTC
• · · • · · • · :T: Esimerkki 4 Ankkurialueen sisältävän kimeerisen PIV3-FHN-glykoproteiinigee- 25 nin rakentaminen, taulukko 4 • · · •
Esimerkit 2 ja 3 valaisevat geenien synteesiä, jotka koodaavat kimeerisiä FHN-: ·. ·. glykoproteiineja, jotka eivät sisällä ankkurialueita ja sen vuoksi ne eritetään ilmen- : tävien solujen elatusaineeseen. Voidaan syntetisoida geeni, joka koodaa kimeeristä FHN-glykoproteiinia, joka sisältää ankkurialueen. Ankkuri aiheuttaisi kimeerisen 30 glykoproteiinin jäämisen solukalvoihin samalla tavalla kuin useimpien virusten gly- 16 102616 koproteiinien jäämisen. Ankkurialue voi olla glykoproteiinin karboksyyliterminaali-sessa päässä siten, että kimeerisen molekyylin immunogeeniset alueet sekä F- että HN-glykoproteiineista työntyisivät ulos solun ulkopuoliseen nesteeseen. Jäljempänä selitetty geeni koodaa kimeeristä glykoproteiinia, joka koostuu PIV3-F:n solun ulko-5 puolisesta alueesta, PIV3-HN:n solun ulkopuolisesta alueesta, ja PIV3-F:n ankkuri-alueesta edellä olevassa järjestyksessä aminopäästä karboksyylipäähän.
A. HN-cDNA-kappaleen liittäminen PIV3-F-glykoproteiinigeeniin pGPHNl -klooni pilkotaan Dralillä ja Pstl.llä. Oligonukleotidi 9 ensin liitetään DNA-kappaleeseen (oligonukleotidi sopii yhteen Dral-kohdan kanssa). Oligonuk-10 leotidi 10 sitten liitetään DNA-kappaleeseen (sopii yhteen Pstl-kohdan kanssa). Molemmat oligonukleotidit sisältävät Xbal-restriktioentsyymikohdat.
9) TGCTCTAGAGCA ACGAGATCTCGT
10) GTCTAGAG
15 ACGTCAGATCTC
Ligaation jälkeen DNA pilkotaan Xbalillä ja HN-cDNA:n 1,3 Kb kappale (kappale 6) puhdistetaan geelissä. Kappale 6 sitten liitetään Xbalillä pilkottuun pGPF2:een. DNA transformoidaan E. coli HB 101:een. Kloonit eristetään ja valikoidaan ne, joissa DNA-kappale on oikein päin kuten on selitetty esimerkissä 2. Oikein päin 20 olevien kloonien liitoskohta-alueet sitten osoitetaan oikeiksi Maxam-Gilbert-sek-vensoinnin avulla. Tämä klooni (pGPFHN3) voidaan sijoittaa eri ilmentämisvekto- . : reihin, kuten on selitetty seuraavassa.
« · • · · • · · Ί;.* Esimerkki § Kimeerisen PIV3-HNF-glykoproteiinigeenin rakentaminen • · • · • · · :T: Osa PIV3-F-glykoproteiinin solun ulkopuolisesta alueesta voidaan sijoittaa HN- 25 glykoproteiinin karboksyyliterminaaliseen päähän. Tämä kimeerinen glykoproteiini koostuisi signaali/ankkuri-alueesta HN:n aminopäästä, pääosasta HN:n solun uiko- • # puolisesta alueesta, ja osasta F:n solun ulkopuolisesta alueesta edellä olevassa jär-.*:. jestyksessä aminopäästä karboksyylipäähän.
A. PIV3-HN-glykoproteiinigeenin valmistaminen, taulukko 5 30 Jotta valmistettaisiin pGPHNl-klooni ilmentämistä varten, cDNA-kloonauksessa käytetyt G-C-hännät täytyy poistaa ja sijoittaa yhteen sopivat restriktioentsyymi-kohdat DNA:n päihin. pGPHNl-klooni pilkotaan Hphlillä. Hphl pilkkoo cDNA- 17 102616 geenin koodausjakson paikassa 75. Seuraava oligonukleotidi sitten liitetään cDNA-kappaleeseen:
11) GGATCCAAATCCGAGATGGAATACTGGAAGC AC ACC AATCACGGGAAAGATGCTGG CCTAGGTTTAGGCTCTACCTTATGACCTTCGTGTGGTTAGTGCCCTTTCTACGACC
5 TAATGAGCTGGAAACATCCATGGCTACTCATGGC
ATT ACTCGACCTTTGTAGGT ACCGATGAGTACC
Oligonukleotidi 11 liittyy HphI-kohtaan ja synnyttää BamHI-restriktioentsyymi-kohdan cDNA-kappaleen 5'-päähän. Oligonukleotidi 11 :n liittymisen jälkeen DNA pilkotaan BamHIillä ja Pstlillä (PstI pilkkoo nukleotidipaikassa 1714 HN-geenissä). 10 DNA ajetaan 1,2% agaroosigeelielektroforeesissa. 1,7 Kb HN-cDNA-kappale (kappale 7) irrotetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista. Kappale 7 sitten liitetään pUC19:ään, jota on pilkottu BamHIillä ja Pstl.llä, jolloin saatiin pGPHN2. Plasmidi transformoidaan E. coli HB lOlieen ja plasmidi-DNA eristetään.
B. F-cDNA-kappaleen liittäminen PIV3-HN-glykoproteiinigeeniin, taulukko 6 15 pGPFl pilkotaan BstEIIilla ja Xbalillä. BstEII pilkkoo paikassa 190 ja Xbal paikas sa 1398 F-cDNA-geenijaksossa. Seuraavat oligonukleotidit sitten liitetään cDNA-kappaleeseen.
12) CCTGCAGGTG GGACGTCCACCACTG
·; 20 13) CTAGAATAATAGTCGCGAGGATCCTGCAGG
/'/ TTATTATCAGCGCTCCTAGGACGTCC
• · · • · · • · · · ;**·. Oligonukleotidi 12 liittyy Bstll-kohtaan ja synnyttää Pstl-restriktioentsyymikohdan • t · cDNA-kappaleen 5'-päähän. Oligonukleotidi 13 liittyy Xbal-kohtaan ja synnyttää • · · translaation lopetuskodonin, Nrul-restriktioentsyymikohdan, BamHI-restriktio-25 entsyymikohdan ja Pstl-restriktioentsyymikohdan ilmaistussa jäijestyksessä (5':sta 3':uun) cDNA-kappaleen 3'-päähän. DNA sitten pilkotaan Pstlillä ja 1,2 Kb F- • · ♦ cDNA-kappale (kappale 8) puhdistetaan geelissä. Kappale 8 sitten liitetään :T: pGPHN2:een, jota on pilkottu Pstlillä. Plasmidi transformoidaan E. coli HB 101 :een.
:"': Kloonit eristetään ja niistä valikoidaan kloonit, joissa F-cDNA on oikein päin HN- 30 geenissä pilkkomalla BamHIillä ja Nrulillä, mikä saa aikaan 2,9 Kb kappaleen. Jos F-cDNA on väärin päin, syntyy 1,7 Kb kappale. Oikein päin olevan kloonin liitoskohta-alueet osoitetaan sitten oikeiksi Maxam-Gilbert-sekvensoinnin avulla. Tämä 18 102616 klooni (pGPHNFl) voidaan sijoittaa eri ilmentämisvektoreihin, kuten jäljempänä on selitetty.
Esimerkki 6 PIV3:n kimeerisen FHN-glykoproteiinin ilmeneminen CHO-soluissa 5 A. pSVCOW7:n rakentaminen pSV2dhfr-plasmidi (saatavilla American Type Culture Collectionista tai valmistetaan S. Subramanin ym. menetelmän mukaan, "Expression of the Mouse Dihydrofo-late Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular Biology 2: 854-864 syyskuu 1981) pilkotaan BamHI.llä ja 10 EcoRIrllä, jolloin saadaan 5,0 Kb kappale (kappale 9), joka sisältää ampisilliini-vastustuskykygeenin, SV 40:n replikaation aloituskohdan, ja dhfr-geenin. pSVCOW7:n toinen osa saadaan ρλΟΗ2Κ2-ρΐ38ΐηϊ<ϋ8ί3, jota on pilkottu samoilla restriktioendonukleaaseilla, joita käytettiin pSV2dhir:n pilkkomisessa, jotta saatiin 2,1 Kb kappale (kappale 10), joka sisältää genomisen naudan kasvuhormonigeenin 15 3'-pään, se on, BGH-gDNA:n. pXGH2R2-plasmidi on julkisesti saatavilla E. coli HB 101 -isännästä, joka on talletettu Northern Regional Research Laboratoriesin kokoelmiin Peoriaan, Illinoisiin (NRRL B-15154). Kappaleet 9 ja 10 liitetään, jolloin saadaan pSVCOW7 (7,1 Kb).
B. pGPFHN-IE-PA:n rakentaminen '. 20 Esimerkeissä 2-5 rakennettuja geenejä voidaan käyttää kimeerisen glykoproteiinin ilmentämistä varten CHO-soluissa. pGPFHN-l-plasmidia käytetään seuraavassa : esimerkissä. Muita kimeerisiä geenejä käsitellään kuten on selitetty pGPFHN-l:n • « · osalta paitsi, kun toisin on osoitettu. pGPFHN-IE-PA:n kokoaminen toteutetaan kahdessa vaiheessa. Ensin gpFHN-cDNA pGPFHNl:stä liitetään pSVCOW7:ään, • · « ' 25 jolloin saadaan pGPFHN-PA ja sitten sytomegaloviruksen hyvin varhaisen alueen promoottori liitetään aloittamaan PIV3-tyyppisten proteiinien transkriptio, jolloin saadaan pGPFHN-IE-PA.
• · · • · · • » · ,lm Vaihe 1. pSVCOW7-plasmidi pilkotaan EcoRIllä ja PvuILlla ja eristetään kappale 11 (600 bp), joka sisältää naudan kasvuhormonin polyadenylaatiojakson, joka ulot-30 tuu BGH-geenin eniten 3'-päässä olevan eksonin PvuII-kohdasta EcoRI-kohtaan, joka on alavirtaan 3'-päästä. BGH-polyadenylaatiojakson täydellinen yhteenveto löytyy seuraavista viitteistä: (1) Eurooppalainen patenttihakemus 0112012, julkaistu 27. kesäkuuta 1984, jossa genomisen BGH-DNA:n identifiointi ja tunnusomaiset piirteet on tuotu esiin; (2) Woychik, R.P. et ai., "Requirement for the 3' Flanking 19 102616
Region of the Bovine Growth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3944-3948 (heinäkuu 1984); ja D.R. Higgs, et al., Nature 306: 398-400 (24. marraskuuta 1983) ja näissä siteeratut viitteet tuovat esiin sen, että AATAAA-nukleotidijakso on tunnusomaista polyadenylaatiosignaalille paikas-5 sa, joka on ll:stä 30:een nukleotidia ylävirtaan (5'-päähän päin) BGH-geenin 3'-päästä.
pSVCOW7:n toinen näyte pilkotaan EcoRI.llä ja BamHI.llä, jolloin saadaan kappale 12 (5,8 Kb). Kappale 12 voidaan vaihtoehtoisesti saada EcoRI/BamHI-kappa-leesta pSV2dhfr-plasmidista, joka on saatavilla Bethesda Research Laboratoriesilta. 10 Kappale 12 sisältää pBR322:n replikaation aloituskohdan ja ampisilliini-vastustus-kykygeenin, joka ilmenee E. colissa, mikä sallii plasmidin valikoimisen E. colissa. Kappale sisältää myös hiiren dihydrofolaattireduktaasi-cDNA:n rakennelmassa, joka sallii ilmentämisen nisäkässoluissa. Subramani, et ai., Mol. Cell. Biol. 854-864 (1981).
15 pGPFHNl-plasmidi pilkotaan BamHI:llä ja NruTllä, jolloin saadaan kappale 13 (2,7 Kb), joka eristetään geelissä. BamHI-kohta on FHN-mRNA:n translatoimattomia 5'-jaksoja koodaavasta cDNA:sta juuri ylävirtaan, ja Nrul-kohta on muutama emäs alavirtaan translaation lopetuskodonista.
Kappaleet 11, 12 ja 13 liitetään muodostamaan pGPFHN-PA (9,1 Kb), joka on 20 replikaatiovektori, joka pystyy sukkuloimaan E. coli- ja CHO- solujen välillä. pGPFHN-PA-plasmidi transformoidaan E. coliin.
Vaihe 2. Vaiheessa 2 pGPFHN-PA vaihdetaan pGPFHN-IE-PA-ilmentämisplasmi- • diin liittämällä ihmisen sytomegaloviruksen hyvin varhaisen alueen geenin promoot- ;···. tori (CMV-I.E.-promoottori). CMV-I.E.-promoottori saadaan pilkkomalla CMV- • · · 25 genomi Pstkllä. Ihmisen sytomegaloviruksen (CMV) genomin, joka sisältää hyvin varhaisen päägeenin (CMV I.E.), restriktioendonukleaasipilkkomiskartat on selitetty tV< yksityiskohtaisesti artikkelissa Stinski, et ai., J. Virol. 46: 1-14, 1983; Stenberg, et l.',' ai., J. Virol. 49: 190-199, 1984; ja Thomsen, et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: : 659-633, 1984.
• · · • · « • « t . 30 Stinskin ja Thomsenin viitteet selittävät 2,0 kiloemäs Pstl-kappaletta, joka sisältää ‘; hyvin varhaisen päägeenin promoottorin. Kun tämä 2,0 Kb Pstl-kappale eristetään ja : '. pilkotaan Sau3AI:llä, saadaan tuotteiden joukosta 760 emäsparin kappale. Tämä 760 : .: emäsparin kappale voidaan erottaa muista tuotteista sen koon ja kappaleessa olevien
Sacl-pilkkomiskohdan ja Ball-pilkkomiskohdan perusteella. Tämän Sau3AI-kappa- 20 102616 leen sopivan identifikaation vuoksi, Sau3AI-kappaleen hyödyntäminen on CMV- I.E.-promoottorin käytön suosittu menetelmä, kuten tässä julkaisussa.
pGPFHN-PA-plasmidi pilkotaan BamHIillä, ja CMV:n hyvin varhaisen alueen promoottorin sisältävä Sau3AI-kappale liitetään yhteen sopivaan BamHI-kohtaan. Plas-5 midit, jotka sisältävät CMV-promoottorikappaleen siten, että transkriptio promoottorista syntetisoisi lähetti-RNA:n PIV3-tyyppistä proteiinia varten, tunnistetaan pilkkomalla plasmidit Sackllä. Tulokseksi saatu plasmidi nimitetään pGPFHN-IE-PA:ksi, jolla on CMV-I.E.-promoottori cDNA:n 5-päässä ja BGH-polyadenylaatio-signaali sen 3-päässä. Plasmidia pidetään yllä E. colissa kunnes se transfektoidaan 10 CHO-soluihin.
C. CHO-solujen transfektio ja viljeleminen pGPFHN-IE-PA-plasmidi transfektoidaan kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO) -soluihin, joilta puuttuu dihydrofolaattireduktaasi (dhfr), käyttämällä DNA:n trans-fektoimiseksi soluihin kalsiumfosfaattimenetelmää, jonka Graham ym. ovat yksi-15 tyiskohtaisesti selittäneet, Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss Inc., N.Y., 1980, pp. 3-25. Käytetty solulinja on DXB-ll-mu-tantti, joka oli alun perin saatavilla L. Chasinilta Kolumbian yliopistosta ja on selitetty täysin artikkelissa Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216-4220 (1980). Edellä olevat transfektiomenetelmät ovat riippuvaisia siitä tosiasiasta, että solut, jotka sisäl-20 lyttävät transfektoituneet plasmidit, eivät ole enää vajavaisia dhfr:n suhteen ja kasvavat Dulbeccon muutetussa Eaglen elatusaineessa, jossa on proliinia.
Jos kimeerinen glykoproteiini ei sisällä ankkurialuetta, eritettävää kimeeristä FHN-j :proteiinia ilmentävien CHO-solujen supematantti puhdistetaan sentrifugoimalla pie-neliä nopeudella. Supematantti levitetään konkonavaliini-A- tai linssilektiini-pyl- • · · 25 vään päälle. Glykoproteiini eluoidaan laajan pesemisen jälkeen a-D-metyyligluko- sidin lineaarisella gradientilla (0-0,5 M), joka on edellä olevassa puskurissa. Eluoitu glykoproteiini dialysoidaan 0,1 % Triton X-100:aa sisältävää PBS:ää vastaan ja levi- l.'. tetään affiniteettipylvään päälle. Affiniteettipylväs koostuu joko polyklonaalisista tai • · · '·[ * monoklonaalisista vasta-aineista, jotka on suunnattu Sepharose 4B-helmiin 30 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) liitettyä PIV3:a vastaan tunnettujen tekniikkojen avulla. Pylväs pestään dialyysipuskurissa ja PIV3-FHN-glykoproteiini eluoidaan PBS:llä, joka sisältää 0,1 M glysiiniä (pH 2,5) ja 0,1% Triton X-100:aa. Glykoproteiini dialysoidaan suolaliuosta vastaan ja puhtaus tarkistetaan elektroforeesin avulla SDS-PAGE-geelissä.
21 102616
Jos kimeerinen glykoproteiini sisältää ankkurialueen, glykoproteiinia ilmentävät CHO-solut pestään fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja sitten solut hajotetaan PBS:ssä, joka sisältää 1,0 % Triton X-100:aa ja 1,0 % natriumdeoksiko-laattia. Kun tumat on sentrifugoitu, solulimauute levitetään konkonavaliini-A-pyl-5 vään päälle ja puhdistetaan, kuten on selitetty edellä eritettävien glykoproteiinien puhdistamiseksi.
Esimerkki 7 PIV3-GPFHN:n ilmeneminen käyttämällä naudan papilloomavirus-ta (BPV).
A. Transkriboimattoman ilmentämiskasetin sisältävän kloonausvektorin rakentami-10 nen, joka replikoituu E. colissa pTFW8:n ja pTFW9:n rakennelmat tarjoavat sopivaa aloitusmateriaalia PIV3-pro-teiinien ilmentämistä varten käyttämällä BPV:tä. Talletetun plasmidin transkription lopettaja estää PIV3-proteiinien ilmentämisen ja se pitää poistaa yksivaiheisessa poistamisessa ja liittämisessä.
15 1. pTFW8 :n rakentaminen pdBPV-MMTneo-plasmidi (342-12) on selitetty artikkelissa Mol. and Cell Biol., Voi 3 (n:o 11): 2110-2115 (1983) ja on saatu Peter Howleyltä National Cancer -instituutista, Bethesda, Maryland, USA. pdBPV-MMTneo-plasmidi (342-12) käsittää kolme osaa: kokonaisen BPV-l-genomin (100 %), joka on avattu ainoasta BamHI-20 kohdasta; pML2:n (pBR322:n "myrkky-miinus"-johdannainen); ja transkriptionaali-: sen kasetin, joka koostuu hiiren metallotioneiini-I-geenin promoottorista, Tn 5:n : neomysiinifosfotransferaasi-II-geenistä ja simian-virus 40:n varhaisen alueen trans- kription käsittelysignaaleista. pdBPV-MMTneo-plasmidi (342-12) pilkotaan ensin BamHI.llä, jotta poistettaisiin BP V-jaksot, jotka eristettiin ja säilytettiin myöhempää *·’ ’ 25 liittämistä varten. Jäljelle jäänyt kappale liitetään uudelleen käyttämällä T4-ligaasia, jotta muodostettaisiin pMMpro.nptll (6,7 Kb). BPV-genomin poisto helpottaa myö- *. V hempiä geneettisiä käsittelyjä luomalla ainutlaatuisia restriktioentsyymikohtia jäljel- • « « v : le jäävään plasmidiin. Kun uudelleenjärjestelyt ovat valmiita, BPV-genomi sijoite- taan uudelleen.
• « « • « ' ·; ' 30 pMMpro.nptll-plasmidi pilkotaan Bglll.lla ja ainutlaatuisia restriktioentsyymikohtia sisältävä synteettinen DNA-kappale 14 sijoitetaan ja liitetään käyttämällä T4-ligaa-: ‘ siä, jolloin saadaan pTFW8 (6,7 Kb). pTFW8-plasmidi on sama kuin pMMpro.nptll paitsi, että sillä on ainutlaatuisia restriktioentsyymikohtia hiiren metallotioneiini-I-geenin promoottorin ja neomysiini-vastustuskykygeenin välillä.
22 102616 2. pTFW9:n rakentaminen pTFW9-plasmidi sisältää lambda-faagin transkription Trlopettajan, joka on sijoitettu metallotioneiini-I-geenin promoottorin ja neomysiini-vastustuskykygeenin väliin. Transkription lopettaja voidaan saada Donald Courtilta National Cancer -instituutis-5 ta, Bethesda, Maryland, USA. Transkription lopettaja toimitetaan pKG1800sib3:ssa, joka on sama kuin pUS6, kuten on selitetty artikkelissa Gene, 28: 343-350 (1984), paitsi, että tyissä on sib3-mutaatio, kuten on selitetty artikkelissa Guameros, et ai., PNAS, 79: 238-242 (1982). Lambda-faagin normaalin infektiotapahtuman aikana tr lopettaja toimii siten, että se estää λ-bakteriofaagin int-geenin ilmentämisen pL:stä ja 10 lopettaa int-geenin transkription, joka on alkanut p{:stä. Lopettaja irrotetaan pKG1800sib3:sta käyttämällä AluLtä ja PvuLtä kappaleeksi 15 (1,2 Kb), joka eristetään geelissä ja Xhol-linkkerit sijoitetaan kappaleen molempiin päihin.
Linkkerit ovat saatavilla New England Biolabsistä, Beverly, MA, USA. Komplementaarisiin Xhol-päihin sidottu lopettajakappale liitetään sitten pTFW8:aan, joka 15 on aikaisemmin pilkottu XhoLllä. Sitten kappaleet liitetään käyttämällä T4 DNA -ligaasia, jolloin saadaan pTWF9 (7,9 Kb). pTWF9-plasmidi talletettiin Budapestin sopimuksen mukaan. pTFW9-plasmidia pidetään yllä E. coli -isännässä ja se on talletettu Northern Regional Research Centerin kokoelmiin, Peoria, Illinois, USA, 17. marraskuuta, 1986 ja tulonumero on NRRL B-18141.
20 B. pTFW/GPFHN:n rakentaminen
Esimerkeissä 2-5 rakennettuja geenejä voidaan käyttää kimeerisen glykoproteiinin ilmentämiseen käyttämällä BPV:tä. pGPFHN-l-plasmidia käytetään tässä esimer-kissä. Muita kimeerisiä geenejä käsitellään kuten on selitetty pGPFHN-l:n osalta paitsi, lam on toisin osoitettu. Jotta rakennettaisiin pTFW/GPFHN, pGPFHNl pii- • « · 25 kotaan BamHLllä. Päät tehdään suoriksi Klenow-entsyymillä ja synteettiset Bglll-linkkerit (New England Biolabs) liitetään kloonin päihin. DNA pilkotaan Bgl II:lla ja nimetään kappaleeksi 16 (2,7 Kb). gpFHN-geenin sisältävä kappale 16 (2,7 Kb) • · · eristetään sitten geelistä. Puhdistettu kappale liitetään pTFW9:ään, jota on pilkottu : Bgl II:lla, jolloin saadaan pTFW/GPFHN (10,6 Kb).
• · · 30 C. pTFW/GPFHN:n vaihtaminen eukaryoottiseen ilmentämisvektoriin ; pTFW/GPFHN-plasmidi vaihdetaan eukaryoottiseen ilmentämisvektoriin liittämällä uudelleen 100 % kokonainen BPV-l-genomi, joka on leikattu BamHLllä. pTFW/GPFHN-plasmidi pilkotaan BamHLllä ja ehjä BPV-l-genomi, 7,9 Kb kappa- 23 102616 le liitetään, jolloin saadaan pTFW/GPFHN/BPV* (18,5 Kb), jota replikoidaan E. colissa, kunnes halutaan tuottaa FHN-glykoproteiineja eukaryoottisolujen avulla.
D. gpFHN:n ilmeneminen hiiren C 127-soluissa
Ennen transfektiota hiiren C127-soluihin, pTFW/GPFHN/BPV* pilkotaan XhoI:llä, 5 jotta leikattaisiin Tj-lopettaja ja liitetään uudelleen T4 DNA-ligaasilla. Tulokseksi saatu pTFW/GPFHN/BPV-plasmidi (17,4 Kb) nyt ohjaa suurien gpFHN-määrien ilmentämistä, jotka eritetään viljelyelatusaineisiin. C127-solut ovat saatavilla American Type Culture Collectionista ja kasvatetaan Dulbeccon muutetussa minimi-elatusaineessa, joka sisältää 10 % vasikan alkion seerumia. gpFHN-proteiinien tasot 10 C127-solujen elatusaineissa määritetään Western blot -kokeiden avulla anti-PIV3-vasta-aineella ja 125I-leimatulla proteiini-A:lla.
PIV3-gpFHN puhdistetaan viljelyelatusaineista tai soluista, kuten on selitetty esimerkissä 6.
Esimerkki 8 PIV3-GPFHN:n ilmeneminen käyttämällä baculovirusta 15 Seuraava esimerkki koskee FHN-glykoproteiinin ilmentämistä hyönteissoluviljel-missä. Kaikki menetelmät ovat yksityiskohtaisesti Summers, M.D. ja Smith, G.E., A Manual for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, jonka College of Agriculture on julkaissut, Texas Agricultural Experiment Station, Texas Agricultural Extension Service, College Station, Texas, 1986. pAc373-aloitusplasmidi (7,1 ; 20 Kb) on yleinen baculovirus-ilmentämisvektori, jolla on ainutlaatuinen BamHI-kohta ; heti alavirtaan Autographa califomica nukleaarinen polyhedroosiviruksen (AcNPV) : polyhedroni-promoottorista. Polyhedroni-proteiini on solun ulkoinen tukiraken- • i « neproteiini, joka ei ole olennainen viruksen infektiolle ja replikaatiolle in vitro.
• ·
Plasmidi on saatavilla professori Max Summersilta entomologian osastolta Texas A
• · 4 25 & M -yliopistosta, College Station, Texas 77843 ja on täysin selitetty artikkelissa
Molecular and Cell. Biology, 3(12): 2156-2165 (1983).
• · I
• · « • · . · :1. A. pAcGPFHN:n rakentaminen • 'Esimerkeissä 2-6 rakennettuja geenejä voidaan käyttää kimeerisen glykoproteiinin ilmentämistä varten käyttämällä baculovirusta. pGPFHNl-plasmidia käytetään tässä , , ' , 30 esimerkissä. Muita kimeerisiä geenejä käsitellään kuten on selitetty pGPFHNl:n osalta paitsi, kun on toisin osoitettu. pGPFHNl-plasmidi pilkotaan BamHI:llä ja kappale 17 (2,7 Kb), joka sisältää gpFHN-geenin, eristetään geelistä. Puhdistettu kappale liitetään pAc373:een, jota on pilkottu BamHI:llä.
24 102616 B. S. frugiperdan transfektio ja viljeleminen pAcGPFHN.n gpFHN-cDNA-liite yhdistetään uudelleen alkuperäisen AcNPV-DNA:n kanssa yhteistransfektion avulla S. frugiperdassa. S. frugiperdaa (SF 9; ATCC CRL 1711) viljellään Grace-elatusaineissa (Gibco Lab. Livonia, MI 48150), 5 10 % vasikan alkion seerumissa ja täydennettiin Difco Lactalbumin -hydrolysolaa- tilla ja hiivan yeastolate-aineella. Solut yhteistransfektoidaan 1 μg/ml AcNPV-DNAilla ja 2 pg/ml pAcGPFHN:llä. Tulokseksi saadaan viruksia keräämällä elatus-aineet ja poistamalla solumateriaali sentrifugoimalla pienellä nopeudella. Virusta sisältäviä elatusaineita käytetään sitten S. frugiperdan infektoimisessa. Kun S. frugi-10 perda on infektoitu käyttämällä viruksia, jotka sisältävät sekä alkuperäisen virus-DNA:n että DNA.n, johon on uudelleen liitetty FHN-glykoproteiinia koodaava DNA, tuloksena seuraa se, että eräät solut ilmentävät PIV3-proteiinia polyhedroni-proteiinin sijaan. Yhdistelmäviruksen puhdistaminen toteutetaan rajoitettujen lai-mennossarjojen maljauksella 96-syvennyksisille kudosviljelymaljoille, jotka sisältä-15 vät S. frugiperda -soluja. Yhdistelmävirusta sisältävät syvennykset saadaan selville täpläsuodatin-hybridisaation avulla käyttämällä koettimena pGPFHNl:tä, joka on leimattu 32P-dCTP:llä nick-translaation avulla. Kun yhdistelmävirus on tarpeeksi puhdas, se saadaan selville sen ainutlaatuisen okkluusio-negatiivisen plakkimorfo-logian avulla. Yhdistelmä-baculoviruksen infektoimissa soluissa syntetisoitu PIV3-20 proteiini saadaan selville Western blot -kokeiden avulla anti-PIV3-vasta-aineen ja 125I-leimatun proteiini-A:n avulla (Amersham Corp.).
PIV3-proteiini puhdistetaan viljelyelatusaineista tai soluista, kuten on selitetty esimerkissä 6.
: Esimerkki 9 Rokotteen valmistus • · · · • · · • · • · i" 25 Immunogeeni voidaan valmistaa rokoteannosmuodossa hyvin tunnettujen menetel-• · · ’·* * mien avulla. Rokote voidaan antaa lihaksen sisään, ihonalaisesti tai nenän kautta.
Ruoansulatuskanavan ulkopuolista hoitoa, kuten lihakseen ruiskuttamista, varten immunogeeni voidaan yhdistää sopivan kantajan kanssa, esimerkiksi se voidaan an- • · · v : taa vedessä, suolaliuoksessa tai puskuroiduissa välittäjissä joko sellaisenaan tai eri 30 apuneuvojen tai immunomukauttavien vaikuttavien aineiden kanssa, kuten alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti, alumiinikaliumsulfaatti (aluna), berylliumsulfaatti, kvartsi, posliinisavi, hiili, vesi öljyssä -emulsiot, öljy vedessä -emulsiot, muramyy-lidipeptidi, endobakteerimyrkky, X-lipidi, Corynebacterium parvum (Propiono-bacterium acnes), Bordetella pertussis, polyribonukleotidit, natriumalginaatti, lano-35 liini, lysolesitiini, A-vitamiini, saponiini, liposomit, levamisoli, DEAE-dekstraani, 25 102616 lukitut kopolymeerit, ISCOMS tai muut synteettiset apuneuvot. Tällaisia apuneuvoja on kaupallisesti saatavilla eri lähteistä, esimerkiksi Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ).
Immunogeenin ja apuneuvon osuutta voidaan vaihdella laajalla vaihteluvälillä niin, 5 että molempia on vaikuttava määrä. Esimerkiksi alumiinihydroksidia voi olla noin 0,5 %:n määrä rokoteseoksesta (Al203-pohja). Per annos pohjalta immunogeenin konsentraatio voi vaihdella noin 0,015 pg:sta noin 1,5 mg.aan kilogrammassa potilaan ruumiin painoa kohti. Parempi annostus vaihtelee noin 0,5 pgista noin 0,15 mg:aan potilaan ruumiinpainokiloa kohti. Sopiva annossuuruus ihmisille on noin 10 0,1-1 ml, mieluummin noin 0,1 ml. Niinpä lihakseen ruiskutettava annos esimerkiksi käsittäisi 0,1 ml sekoitusta, joka sisältää immunogeenia ja 0,5 % alumiinihydroksidia.
Rokotetta voidaan antaa raskaana tai lisääntymisiässä oleville naisille herättämään äidin vasta-aineita. Nainen voidaan rokottaa uudelleen, jos on tarpeen. Pikkulapset 15 voidaan rokottaa 2:sta 3:een kuukauden iässä äidin vasta-aineiden hävittyä ja rokottaa uudelleen, jos on tarpeellista, mieluummin 6:sta 9:ään kuukauden iässä immuunijärjestelmän kypsymisen jälkeen. Rokottamattomille äideille syntyneet vauvat voidaan rokottaa 2:sta 3:een kuukauden iässä. Rokote voi myös olla hyödyllinen muissa herkissä populaatioissa, kuten vanhahkoissa tai heikoissa potilaissa.
20 Rokote voidaan myös yhdistää muita sairauksia varten olevien rokotteiden kanssa, jotta tuotettaisiin monenarvoisia rokotteita. Se voidaan myös yhdistää muiden lääk-.: keiden, kuten antibioottien kanssa.
• · • · · • · · « · · · • · · • · • « • · · • 1 · • · c • · ♦ • « • · · • · · · · • · » • · · 26 102616
Taulukko 1 pGPF2:n rakentaminen pGPFl-plasmidi
PstI BstXI NruI PstI
* _I_1__I 1 1
I TTTFFFFFFFFFFFFFTTT
TcR
5 (a) pGPFl-plasmidi pilkotaan BstXIillä ja Nrulillä. Oligonukleotidit 1 ja 2 liite tään päihin. DNA pilkotaan BamHIillä ja kappale 1 (1,6 Kb) eristetään geelissä.
Kappale 1
BamHI BstXI NruI BamHI
I_I_i____i 11111 FFFFFFFFFFFFFFFFFFFF 2 2 2 2 (b) pBR322-plasmidi (4,4 Kb) pilkotaan BamHIillä ja defosforyloidaan bakteerin 10 alkalisella fosfataasilla. Kappale 1 liitetään BamHI-kohtaan muodostamaan pGPF2 (6,0 Kb).
BamHI BstXI NruI BamHI
* _i_X__l- i 1
AmpR 1111 FFFFFFFFF 2 2 2
TcR = tetrasykliini-vastustuskyky ..: AmpR = ampisilliini-vastustuskyky : 15 T = guanosiini/sytosiini-häntä • · · F = F-glykoproteiini 1 = oligonukleotidi 1 ’1' 1 2 = oligonukleotidi 2 • · • · · • · · • # · « • · · • · ·
Taulukko 2
Kimeerisen FHN-glykoproteiinigeenin rakentaminen pGPHN 1 -plasmidi 27 102616
PstI Dral PstI PstI
* _I_1_I_-I-* J, „ ΤΤΊΉΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΤΤΤ
TcR
5 (a) pGPHN 1-plasmidi pilkotaan PstLllä. Päät tehdään tylpiksi T4 DNA -polyme- raasilla ja sitten defosfoiyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. Xbal-linkkeri (linkkeri 1) liitetään päihin ja kappale 2 (1,7 Kb) puhdistetaan geelissä.
Kappale 2 tj>ral 1 1 1 TTTHHHHHHHHHHHHHHHHHH 1111
10 (b) Kappale 2 pilkotaan Drakllä. Xbal-linkkeri (linkkeri 2) liitetään päihin. DNA
pilkotaan Xbakllä ja kappale 3 (1,3 Kb) puhdistetaan geelissä.
Kappale 3
Xbal Xbal
1_I
222 HHHHHHHHHHHHHHHH 1111 (c) pGPf2-plasmidi (taulukko 1) pilkotaan Xbalillä ja defosfoiyloidaan bakteerin 15 alkalisella fosfataasilla. Kappale 3 liitetään Xbal-kohtaan, jolloin saadaan pGPFHNl.
• · a • · · ·
Bamffl Xbal Xbal BamHI
* 1___l_*
: AmpR FFFFFFFFFHHHHHHHH FFFFF
Term ♦ · • · ·
TcR = tetrasykliini-vastustuskyky * i « '·] * AmpR = ampisilliini-vastustuskyky 20 T = guanosiini/sytosiini-häntä H = DNA-jaksot HN-glykoproteiinia varten F = DNA-jaksot F-glykoproteiinia varten 1 = linkkeri 1 2 = linkkeri 2 25 Term = translaation lopetussignaali 28 102616
Taulukko 3
Oligonukleotidien käyttäminen eri pituisten FHN-geenien synnyttämiseksi (a) Oligonukleotidi A koostuu oligonukleotidista 3 (57 bp) tai yhteen liittyneistä oligonukleotideista 3 ja 4 (117 bp) tai yhteen liittyneistä oligonukleotideista 3, 4 ja 5 5 (177 bp) tai yhteen liittyneistä oligonukleotideista 3, 4, 5 ja 6 (234 bp) tai yhteen liittyneistä oligonukleotideista 3, 4, 5, 6 ja 7 (290 bp).
Oligonukleotidi B koostuu oligonukleotidista 8 (12 bp). Oligonukleotidit A ja B puhdistetaan geelissä.
Oligonukleotidi A Oligonukleotidi B
3333 8888888 10 _ 33334444 333344445555 3333444455556666 33334444555566667777 15 (b) pGPHNl-plasmidi pilkotaan Pstkllä ja Drakllä, ja kappale 4 (1,3 Kb) puhdis tetaan geelissä.
m : Kappale 4 • « · • · • «
:T: Dral PstI
HHHHHHHHHHHHHHH
• « • · · *;[;* (c) Oligonukleotidit A ja B liitetään kappaleeseen 4. DNA pilkotaan Xbalrllä ja • · · ’·' ’ 20 kappale 5 puhdistetaan geelissä (kappaleen 5 pituus vaihtelee 1330 bp:sta 1565 : *: ’ bp:iin riippuen oligonukleotidi A:n sisältämistä oligonukleotideista).
Kappale 5
Xbal Dral PstI Xbal
I_1_I_I
AAAAAHHHHHHHHHHHHHHBBBB
Taulukko 3 (jatkuu) 29 102616 (d) pGPF2-plasmidi pilkotaan Xbal.llä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. Sitten kappale 5 liitetään pGPF2:n Xbal-kohtaan muodostamaan pGPFHN2.
5 pGPFHN2-plasmidi
BamHI Xbal Xbal BamHI
-1-L_I_I_*
AmpR FFFFFFFFFFAAAHHHHHBBFFFF
Term
AmpR = ampisilliini-vastustuskyky F = DNA-jaksot F-glykoproteiinia varten H = DNA-jaksot HN-glykoproteiinia varten
10 A = oligonukleotidi A
B = oligonukleotidi B
Term = translaation lopetussignaali • · · • · · • · ♦ · • · · • · • · • · · • « · • « · • · * • · • · · • · · • · ♦ · ♦ • · » • · * ··»
* « I
Ankkurialueen sisältävän FHN-geenin rakentaminen.
pGPHN 1 -plasmidi
Taulukko 4 30 102616
PstI Dral PstI PstI
* _I I_I_I *
| TTTTTHHHHHHHHHHHHHHTTTTT
TcR
5 (a) pGPHN 1-plasmidi pilkotaan Drabllä ja Psthllä. Oligonukleotidi 9 liitetään DNA:hän, sitten oligonukleotidi 10 liitetään DNA:han. DNA pilkotaan Xbakllä ja kappale 6 (1,3 Kb) puhdistetaan geelissä.
Kappale 6 *baI 9raI PstI Xbal
I_I_I_I
9 9 9 HHHHHHHHHHHHH 10 10 10 10 (b) pGPF2-plasmidi pilkotaan Xbal:llä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. Kappale 6 liitetään pGPF2.n Xbal-kohtaan muodostamaan pGPFHN3.
pGPFHN 3 -plasmidi
BamHI Xbal Dral PstI Xbal BamHI
* _I_I I_I_I__*
AmpRFFFFFFFF 9 9 HHHHHHHH 10 10 AAAA ·; : Term • · ·
TcR = tetrasykliini-vastustuskyky 15 AmpR = ampisilliini-vastustuskyky • · · * T = guanosiini/sytosiini-häntä F = DNA-jaksot F-glykoproteiinia varten :V: H = DNA-jaksot HN-glykoproteiinia varten 9 = oligonukleotidi 9 20 10 = oligonukleotidi 10
Term = translaation lopetussignaali A = F-glykoproteiinin ankkurialuetta koodaavat DNA-jaksot HN-geenin valmistaminen kimeerisen HNF-geenin rakentamista varten pGPHN 1 -plasmidi
Taulukko 5 31 102616
PstI Hphl PstI PstI
* l_Il_I_J-1
i n TTHHHHHHHHHHHHHHHHHTTT TcR
5 (a) pGPHN 1-plasmidi pilkotaan HphLllä. Oligonukleotidi 11 liitetään DNA.han.
DNA pilkotaan BamHI:lläja Pstlrllä, ja kappale 7 (1,7 Kb) puhdistetaan geelissä.
Kappale 7
BamHI Hphl pstj
11 11 11 HHHHHHHHHHHH
(b) pUC19-plasmidi pilkotaan BamHI:llä ja Pstkllä. Kappale 7 liitetään 10 pUC19:ään muodostamaan pGPHN2.
pGPHN2-plasmidi
BamHI Hpffl PstI
·_._I_1_I_♦
AnipR Π Π Π HHHHHHHHHHH
•..: T = guanosiini/sytosiini-häntä ; .·. TcR = tetrasykliini-vastustuskyky • · · 15 AmpR = ampisilliini-vastustuskyky H = DNA-jaksot HN-glykoproteiinia varten *' 1 11 = oligonukleotidi 11 • · « · · • · · • · • · · • · · • · · « · ·
Taulukko 6 102616 32 F-cDNA:n liittäminen pGPHN2:een pGPFl-plasmidi
PstI BstEII Xbal Pstl * _|_I _|_I *
I TTFFFFFFFFFFFFFFFFFFFTTT
TcR
5 (a) pGPFl-plasmidi pilkotaan BstEII:lla ja Xbal:llä. Oligonukleotidit 12 ja 13 lii tetään DNA:han. DNA pilkotaan PstPllä ja kappale 8 (1,2 Kb) puhdistetaan geelissä.
Kappale 8
Pstl BstEII Xbal Pstl
I_I_I_I
12 12 FFFFFFFFFFFFFF 13 13 10 (b) pGPHN2-plasmidi (taulukko 5) pilkotaan PstEllä. Kappale 8 liitetään pGPHN2:n Pstl-kohtaan muodostamaan pGPHNFl.
pGPHNF 1 -plasmidi
BamHI Hphl Pstl BstEII Xbal Pstl ♦ I II li II.
AmpR Π Π HHHHHHHH 12 12 FFFFFFFF 13 13
Term • · · · AmpR = ampisilliini-vastustuskyky • · · 15 TcR = tetrasykliini-vastustuskyky ··· ί,ί : T = guanosiini/sytosiini-häntä F = DNA-jaksot F-glykoproteiinia varten H = DNA-jaksot HN-glykoproteiinia varten • · 11 = oligonukleotidi 11 m·" 20 12 = oligonukleotidi 12 '; * ' 13 = oligonukleotidi 13 ' ..' Term = translaation lopetussignaali

Claims (12)

102616
1. Ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että se sisältää sopivan transformoidun isäntäsolun, joka sisältää DNA-jakson, joka pystyy ilmentämään polypeptidiä, joka käsittää signaalijakson, ainakin yhden immunogeenisen kappaleen ihmisen parain- 5 fluenssa-viruksen tyypin 3 F -glykoproteiinista ja ainakin yhden immunogeenisen kappaleen ihmisen parainfluenssa-viruksen tyypin 3 HN -glykoproteiinista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että kyseessä oleva DNA-jakso tuottaa polypeptidin, jossa on N-terminaalisesta päästä lähtien F-glykoproteiinin signaalijakso, F-glykoproteiinin immunogeeninen kappale ja
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että kyseessä oleva sopiva transformoitu isäntäsolu valikoidaan ryhmästä, johon kuuluvat bakteerisolut, hiivasolut, nisäkässolut ja hyönteissolut.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että ky-15 seessä oleva sopiva transformoitu isäntäsolu valikoidaan ryhmästä, johon kuuluvat E. coli -bakteerit, kiinalaisen hamsterin munasaqasolut, hiiren C127-solut ja S. fru-giperda -solut.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että ky- ;. seessä oleva sopiva transformoitu isäntäsolu erittää kyseessä olevaa polypeptidiä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että ky- : ; seessä oleva DNA-jakso sisältyy plasmidiin.
• · · • · · • · · · .···. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että ky- .···, seessä oleva plasmidi on sytomegaloviruksen promoottorin kontrollin alaisena. • · · •
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että ky- :V; 25 seessä olevan plasmidin replikaatio silloin, kun se on sopivassa transformoidussa :T: eukaryootti-isäntäsolussa, on naudan papilloomaviruksen DNA-jaksojen kontrollin A. alaisuudessa.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että ky seessä oleva DNA-jakso sisältyy baculovirusperheen yhdistelmävirukseen.
10. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ilmentämisjäijestelmä, tunnettu siitä, että vi rus on Autographa califomica, nukleaarinen polyhedroosivirus. 102616
10 HN-glykoproteiinin immunogeeninen kappale.
11. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3 varten, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisella ilmentämisjäijestelmällä saadun polypeptidin lisäämisen farmakologisesti sopivaan kantajaan siinä määrin, että se on sopiva suojelemaan ihmisiä ihmisen parainfluens- 5 sa-viruksen tyyppiä 3 vastaan.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3 varten, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää N-terminaalisesta päästä lähtien F-glykoproteiinin signaalijakson, F-glykopro-teiinin immunogeenisen kappaleen ja HN-glykoproteiinin immunogeenisen kappa- 10 leen.
FI905184A 1988-04-22 1990-10-19 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä FI102616B1 (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18464888A 1988-04-22 1988-04-22
US18464888 1988-04-22
PCT/US1989/000814 WO1989010405A1 (en) 1988-04-22 1989-03-03 Chimeric glycoproteins containig immunogenic segments of human parainfluenza virus type 3
US8900814 1989-03-03

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI905184A0 FI905184A0 (fi) 1990-10-19
FI102616B true FI102616B (fi) 1999-01-15
FI102616B1 FI102616B1 (fi) 1999-01-15

Family

ID=22677770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI905184A FI102616B1 (fi) 1988-04-22 1990-10-19 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5169628A (fi)
EP (1) EP0413695B1 (fi)
KR (1) KR970009347B1 (fi)
AT (1) ATE105334T1 (fi)
AU (1) AU611784B2 (fi)
CA (1) CA1306709C (fi)
DE (1) DE68915165T2 (fi)
DK (1) DK172635B1 (fi)
FI (1) FI102616B1 (fi)
HK (1) HK37397A (fi)
NO (1) NO303499B1 (fi)
WO (1) WO1989010405A1 (fi)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5486599A (en) * 1989-03-29 1996-01-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Construction and use of synthetic constructs encoding syndecan
GB8914968D0 (en) * 1989-06-29 1989-08-23 Connaught Lab Production of virus and purification of viral envelope proteins for vaccine use
JP2649285B2 (ja) * 1990-11-29 1997-09-03 藤倉化成株式会社 ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスフュージョンプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質
GB9120221D0 (en) * 1991-09-23 1991-11-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9200117D0 (en) 1992-01-06 1992-02-26 Connaught Lab Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use
US6479055B1 (en) * 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5550017A (en) * 1993-10-12 1996-08-27 Emory University Anti-paramyxovirus screening method and vaccine
EP1520859B9 (en) * 1994-01-14 2010-12-29 Rath, Matthias, Dr. med. Hydrophilic signal oligopeptides and methods of therapeutic use
US7300918B2 (en) 1994-01-14 2007-11-27 Matthias Rath Method of producing vaccines from protein signal oligopeptides
US5869036A (en) * 1995-12-08 1999-02-09 St. Louis University Live attenuated vaccines based on CP45 HPIV-3 strain and method to ensure attenuation in such vaccine
WO1997027216A1 (en) * 1996-01-29 1997-07-31 Georgetown University Amplification of response from expressed recombinant protein
FR2751229B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins
US6060308A (en) 1997-09-04 2000-05-09 Connaught Laboratories Limited RNA respiratory syncytial virus vaccines
AU749345B2 (en) 1997-11-14 2002-06-27 Connaught Laboratories Limited Alphavirus vectors for paramyxovirus vaccines
CN100352921C (zh) 1999-05-06 2007-12-05 威克福雷大学 用于鉴定引起免疫反应的抗原的组合物和方法
US6764685B1 (en) 2000-03-21 2004-07-20 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
IL157003A0 (en) 2001-01-19 2004-02-08 Vironovative Bv A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
CN1646684B (zh) 2002-02-21 2010-10-06 免疫医疗疫苗公司 重组副流感病毒表达系统以及包含源自间质肺病毒的异种抗原的疫苗
CN101410519B (zh) 2003-04-25 2013-04-24 免疫医疗有限责任公司 间质肺病毒株及其在疫苗制剂中以及用作抗原性序列表达载体的用途和繁殖病毒的方法
EP1629004B1 (en) * 2003-06-05 2008-08-13 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions comprising venezuelan equine encephalitis virus replicon vectors and paramyxovirus protein antigens
EP4011451A1 (en) 2015-10-22 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Metapneumovirus mrna vaccines
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US20230036213A1 (en) * 2019-12-10 2023-02-02 Children's National Medical Center T-cell epitopes of human parainfluenza virus 3 for adoptive t-cell immunotherapy

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4743553A (en) * 1984-07-18 1988-05-10 W. R. Grace & Co. Synthetic genes for bovine parainfluenza virus
JP2564268B2 (ja) * 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
US4790987A (en) * 1985-11-15 1988-12-13 Research Corporation Viral glycoprotein subunit vaccine
NZ230425A (en) * 1988-09-02 1992-07-28 Molecular Eng Ass Production of paramyxovirus fusion (f) protein using recombinant baculovirus expression vector

Also Published As

Publication number Publication date
NO904538L (no) 1990-12-27
AU3197589A (en) 1989-11-24
DK172635B1 (da) 1999-03-22
KR970009347B1 (en) 1997-06-10
EP0413695B1 (en) 1994-05-04
US5169628A (en) 1992-12-08
JPH03503760A (ja) 1991-08-22
ATE105334T1 (de) 1994-05-15
DK251890D0 (da) 1990-10-18
EP0413695A1 (en) 1991-02-27
FI102616B1 (fi) 1999-01-15
KR900700613A (ko) 1990-08-16
DK251890A (da) 1990-10-18
FI905184A0 (fi) 1990-10-19
NO303499B1 (no) 1998-07-20
WO1989010405A1 (en) 1989-11-02
NO904538D0 (no) 1990-10-19
AU611784B2 (en) 1991-06-20
US5284764A (en) 1994-02-08
CA1306709C (en) 1992-08-25
DE68915165D1 (de) 1994-06-09
DE68915165T2 (de) 1994-09-08
HK37397A (en) 1997-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI102616B (fi) Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen ty yppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä
US5194595A (en) Chimeric glycoproteins containing immunogenic segments of the glycoproteins of human respiratory syncytial virus
US5149650A (en) Vaccines for human respiratory virus
KR0166585B1 (ko) 앵커-결여 vzv 당단백질, 이를 제조하는 방법 및 이의 면역보호적 용도
AU605476B2 (en) Vaccines for human respiratory virus
IE912745A1 (en) Expression of human cmv glycoprotein-h using the¹baculovirus-insect cell expression system
WO1992001057A1 (en) Ehv-4 glycoprotein vaccine
JP3026986B2 (ja) ヒト・パラインフルエンザウイルス３型の免疫原性セグメント類を含有するキメラ糖蛋白類
AU672870B2 (en) Vaccines against varicella-zoster virus (VZV)
EP0489033B1 (en) Bovine coronavirus polypeptides and vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
HC Name/ company changed in application

Owner name: PHARMACIA & UPJOHN COMPANY

FG Patent granted

Owner name: PHARMACIA & UPJOHN COMPANY

MA Patent expired