DK172635B1 - Polypeptid og dets anvendelse i vaccine samt ekspressionssystem til dets eksprimering - Google Patents

Description

i DK 172635 B1 OPFINDELSENS OMRÅDE.

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt polypeptid, dets anvendelse til fremstilling af en vaccine imod humant parainfluenzavirus type 3, PIV3, en vaccine 5 indeholdende polypeptidet samt et ekspressionssystem indeholdende en DNA-sekvens, som kan eksprimere polypeptidet.

BAGGRUND.

Humant parainfluenzavirus type 3, PIV3, er en vigtig, 10 primær årsag til svær sygdom i de nedre luftveje hos spædbørn og unge børn. Virusset forekommer verden over og inficerer praktisk taget alle børn under 4 år. Akut luftvejssygdom og sekundære komplikationer er særligt alvorlige hos spædbørn og unge børn på grund af åndedrætssystemets umodenhed og 15 kan kræve indlæggelse på hospital i svære tilfælde. Infektioner i de nedre luftveje kan tilskrives alle segmenter af luftvejen, er sædvanligvis forbundet med feber, hoste, løbende næse og træthed og er klinisk diagnosticeret som bronchitis, bronchiolitis, pneumonia, strubehoste eller 20 virusinfektion. Andre børn og voksne geninficeres ligeledes hyppigt, selvom fornyet infektion typisk resulterer i mindre svær sygdom i den øvre luftvej.

Forsøg på udvikling af effektive vacciner imod PIV3 har stort set været resultatløse. Kliniske studier ved an-25 vendeIse af levende eller inaktiverede vacciner mod PIV3 har vist en forøgelse i virusspecifikke serumantistoffer, men har ikke tilvejebragt nogen signifikant beskyttelse imod sygdommen.

30 BESKRIVELSE AF KENDT TEKNIK.

Det er kendt, at rekombinantvacciniavirusekspres-sionssystemet separat eksprimerer F- og HN-glycoproteinerne i PIV3, og at det separat frembringer beskyttende immunreaktioner i inficerede bomuldsrotter, P.L. Collins m.fl., Ex-35 pression of the F and HN Glycoproteins of Human Parainfluenza Virus Type 3 by Recombinant Vaccinia Viruses: Contributions 2 DK 172635 B1 of the Individual Proteins to Host Immunity, Journal of Virology 61, 3416-3423 (1987). Det er ligeledes kendt, at rekombinantvacciniavirusekspressionssystemet frembringer PIV3-specifikke, serumneutraliserende antistoffer, og at 5 det giver resistens mod PIV3-replikation i luftvejene hos primater, P.L. Collins m.fl., Journal of Virology 62, 1293--1296 (1988). Immunisering med en blanding af rensede F- og HN-glycoproteiner har frembragt virusneutraliserende aktivitet og har givet fuldstændig beskyttelse mod infektion 10 hos hamstere, R. Ray m.fl., Journal of Virology 62, 783-787 (1988).

IKSPHE AT-QPFIWPEl>SEy·

Polypeptidet ifølge opfindelsen er ejendommeligt 15 ved, at det består af mindst ét immunogent fragment fra begge glycoproteiner F og HH i humant parainfluenzavirus type 3, eller er et derivat af dette polypeptid med samme biologiske virkning, vaccinen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den omfatter et sådant polypeptid, og ekspres-20 sionssystemet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter en egnet vært indeholdende en DNA-sekvens, som kan eksprimere et sådant polypeptid.

DETALJERET BESKRIVELSE.

25 De i det følgende definerede udtryk anvendes i nær værende beskrivelse. Udtrykket "cellekultur" refererer til opretholdelsen af voksende celler stammende fra enten en flercellet plante eller et flercellet dyr, hvilket tillader, at cellerne forbliver levedygtige uden for den oprindelige 30 plante eller det oprindelige dyr. Udtrykket "med strømmen" identificerer sekvenser, som forekommer længere fremme i ekspressionsretningen, f.eks. er koderegionen med strømmen fra initieringscodonet. Udtrykket "imod strømmen" identificerer sekvenser, som forekommer i den modsatte retning fra 3 DK 172635 B1 ekspression, f.eks. er bakteriepromotoren imod strømmen fra transkriptionsenheden, og initieringscodonet er imod strømmen fra koderegionen. Udtrykket '’mikroorganisme" omfatter både enkeltcellede, prokaryote og eukaryote organismer, såsom 5 bakterier, actinomycetes og gær. Udtrykket "operon" er en komplet enhed til genekspression og -regulering, herunder strukturgener, regulatorgener og kontrolelementer i DNA erkendt af regulatorgenprodukt. Udtrykket "plasmid" refererer til autonom, selvreplikerende, ekstrachromosomal, cirkulær 10 DNA og omfatter både ekspressions- og ikke-ekspressionstyper.

Hvor en rekombinantmikroorganisme eller -cellekultur er beskrevet som vært for et ekspressionsplasmid, omfatter udtrykket "ekspressionsplasmid" både ekstrachromosomal, cirkulær DNA og DNA, som er blevet inkorporeret i et eller 15 flere værtschromosomer. Hvor et plasmid opretholdes ved hjælp af en værtscelle, bliver plasmidet stabilt replikeret af cellerne under mitose enten som en autonom struktur eller som en inkorporeret del af værtens genom. Udtrykket "promotor" er en region af DNA, som er involveret i binding af 20 RNA-polymerasen til initiering af transkription. Vendingen "DNA-sekvens" refererer til et enkeltstrenget eller dobbeltstrenget DNA-molekyle, som udgøres af nucleotidbaser, adenosin, thymidin, cytosin og guanosin. Vendingen "praktisk taget ren" refererer til en proteinsammensætning, som intet 25 parainfluenzavirusprotein indeholder ud over det ønskede, chimære rekombinantglycoprotein. Selvom de praktisk taget rene proteiner kan være forurenet med lave niveauer af værts-cellebestanddele, er proteinet frit for forurenende, strukturelt og ikke-strukturelt virusprotein produceret af re-30 plikerende parainfluenzavira. Vendingen "egnet vært" refererer til en cellekultur eller mikroorganisme, som er forenelig med et rekombinantplasmid, og som vil tillade, at plasmidet replikerer, bliver inkorporeret i dens genom eller bliver eksprimeret.

35 Opfindelsen indebærer en række genetiske molekyl- manipulationer, som kan gennemføres på en mangfoldighed af 4 DK 172635 B1 kendte måder. Manipulationerne kan opsummeres som opnåelse af en cDNA af proteinet, kloning og replikat ion af cDNA i E. coli og ekspression af den ønskede cDNA i en egnet vært.

I det følgende vil de forskellige metoder, som er til rådig-5 hed til eksprimering af proteinet, blive detaljeret beskrevet og er efterfulgt af specifikke eksempler på foretrukne metoder .

Alment kan den nomenklatur og de almene laboratoriemetoder, som kræves ifølge opfindelsen, findes i Maniatis 10 m.fl., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Alle E. coli-stammer dyrkes på Luria-næringsmedium (LB) med glucose, Difco's antibiotikummedium nr. 2 og M9--medium suppleret med glucose og syrehydrolyserede casein-15 aminosyrer. Stammer med resistens mod antibiotika opretholdes ved de medikamentkoncentrationer, som er beskrevet i Maniatis. Transformationer gennemføres ifølge den metode, som er beskrevet af Rowekamp og Firtel, Dev. Biol., 79, 409-418 (1980).

20 Alle enzymer er blevet anvendt i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner. Transformanter er blevet analyseret ved kolonihybridisering som beskrevet i Grunstein og Wallis, Methods in Enzymology, 68, 379-388.

Efter hybridisering udtages og udvindes sonderne, og 25 filtrene vaskes i 0,1%'s SDS, 0,2 x SSC i ialt 3 timer med fem udskiftninger på hver 400 ml. Filtrene lufttørres grundigt, monteres og autoradiograferes ved anvendelse af "Kodak® X-0MAT-AR"-film og "Dupont Cronex"-belysning plus forstærkningsskærme i et hensigtsmæssigt tidsrum ved -70°C.

30 Til sekvensering af plasmider fremstilles renset plasmid-DNA ifølge de i Maniatis beskrevne metoder. Endemærkede DNA-fragmenter fremstilles og analyseres ved de kemiske sekvenseringsmetoder ifølge Maxam og Gilbert med modifikationer beskrevet af Collins og Wertz, J. Virol. 54, 35 65-71 (1985).

Nucleotidstørrelser er angivet i enten kilobaser 5 DK 172635 B1 (Kb) eller basepar (bp). Disse er anslået ud fra agarose-gelelektrophorese.

Det første trin til opnåelse af ekspression af protein er at opnå den DNA-sekvens, som koder for proteinet, ud fra 5 cDNA-kloner. Derefter klones denne sekvens ind i et ekspres-sionsplasmid, som kan dirigere transkription af genet, og som tillader effektiv translation af transkriptionen. Biblioteksmetoden til opnåelse af cDNA, som koder proteiner, er beskrevet alment i Haniatis og specifikt af Elango m.fl., 10 i Human Parainfluenza Type 3 Virus Hemagglutinin-Neuraminidase Glycoprotein: Nucleotide sequence of mRNA and Limited Amino Acid Sequence of the Purified Protein, J. Virol. 57, 481-489 (1986), og af Spriggs m.fl., i Fusion Glycoprotein of Human Parainfluenza Virus Type 3: Nucleotide Sequence of 15 the Gene, Direct Identification of the Cleavage-Activation Site, and Comparison with Other Paramyxoviruses, Virology 152, 241-251 (1986).

Kloner fremstilles ved indsættelse af cDNA i Pstl--spaltet pBR322, hvortil homopolymerområder af dGTP er blevet 20 enzymatisk adderet til 3' -enderne ved spaltningsstedet. Homopolymerområder af dCTP adderes enzymatisk til 3'-termini i cDNA-molekylerne ved de af Maniatis beskrevne metoder. Ideelt bør der adderes 10-30 rester af dCTP eller dGTP til maksimering af kloningseffektiviteten. cDNA og plasmid udglødes 25 sammen og transformeres ind i E. coli. De kloner, som indeholder cDNA af fuld længde, påvises ved hjælp af sonder af mærket virus-cDNA eller oligonucleotider, som er komplementære til dele af gensekvenserne, efterfulgt af restriktionsenzymanalyse og DNA-sekvensering.

30 Oligonucleotider syntetiseres kemisk ifølge den phos- phoramidittriestermetode i fast fase, som først er beskrevet af Beaucage og Caruthers, Tetrahedron Letters, 22(20), 1859--1862 (1981), ved anvendelse af en automatisk syntetisator, som beskrevet i Needham-VanDevanter m.fl., Nucleic Acids 35 Res., 12, 6159-6168 (1984). Rensning af oligonucleotider sker enten ved nativ acrylamidgelelektrophorese eller ved 6 DK 172635 B1 anionbytter-HPLC som beskrevet i Pearson og Regnier, J.

Chrom., 255, 137-149 (1983).

Sekvensen af de syntetiske oligonucleotider kan verificeres ved anvendelse af den kemiske senderdelingsmetode 5 ifølge Maxam og Gilbert, Grossman og Moldave, udg., Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65, 499-560 (1980).

Til opnåelse af højt niveau af ekspression af en klonet gen i et prokaryot system er det essentielt at konstruere ekspressionsvektorer, soro minimalt indeholder en 10 stærk promotor til dirigering af mRNA-transkription, et ribosombindingssted til translationel initiering og en trans-kriptionsterminator. Eksempler på regulerende regioner, som er egnede til dette formål, er promotor- og operatorregionen i den biosyntetiske tryptophanvej roed E. coli soro beskrevet 15 af Yanofsky, Kelley og Horn, J. Bacteriol., 158, 1018-1024 (1984), og den venstrerettede promotor i phag-λ (Pl) som beskrevet af Herskowitz og Hagen, Ann. Rev. Genet., 14, 399-445 (1980).

De i E. coli producerede proteiner vil ikke foldes 20 på rigtig måde på grund af tilstedeværelsen af cysteinrester og manglen på egnede, posttranslationelle modifikationer.

Under rensning fra E. coli skal de eksprimerede proteiner først denatureres og derefter renatureres. Dette kan ske ved opløseliggørelse af de af E. coli producerede proteiner 25 i guanidin-HCl og reduktion af alle cysteinresterne med β--mercaptoethanol. Derefter renatureres proteinet enten ved langsom dialyse eller ved gelfiltrering, US patentskrift nr. 4.511.503.

Påvisning af proteiner opnås ved kendte metoder, 30 såsom radioimmunoafprøvninger, Western-pletteknik eller iromunoudfældning. Rensning fra E. coli kan opnås ved at følge de i US patentskrift nr. 4.511.503 beskrevne metoder.

Ekspression af heterologe proteiner i gær er velkendt og beskrevet. Methods in Yeast Genetics, Sherman m.fl., 35 Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), er et anerkendt arbejde, som beskriver de forskellige metoder, soro anvendes 7 DK 172635 B1 til produktion af proteiner i gær.

Til et højt niveau af ekspression af et gen i gær er det essentielt at forbinde genet til et stærkt promotorsystem ligesom i prokaryoten og ligeledes at tilvejebringe effektive 5 transkriptionsterminerings/polyadenylerings-sekvenser fra et gærgen. Eksempler på anvendelige promotorer omfatter GAL1,10, Johnston and Davis, Mol. and Cell. Biol., 4, 1440--1448 (1984), ADH2, Russell, m.fl., J. Biol. Chem. 258, 2674-2682 (1983), PH05, EMBOJ. 6, 675-680, (1982), ogMFal.

10 Et multikopiplasmid med et selektivt mærkestof, såsom Lue--2, URA-3, Trp-1 eller His-3, er ligeledes ønskeligt. MFol--promotoren foretrækkes. MFal-promotoren er i en vært af a--parringstypen grundlæggende, men er udelukket i diploider eller celler med a-parringstypen. Den kan imidlertid regule-15 res ved at hæve eller sænke temperaturen i værter, som har en ts-mutation på et af SIR-stederne. Virkningen af en sådan mutation ved 35*C på en celle af α-typen er at tænde for det normalt tavse gen, som koder for a-parringstypen. Ekspressionen af det tavse a-parringstypegen afbryder på sin 20 side MFal-promotoren. Sænkning af væksttemperaturen til 27'C reverserer hele processen, dvs. afbryder a-parringstypen og tilslutter MFal, Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones og Broach, udg. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, 25 NY, 181-209, (1982).

Polyadenyleringssekvenserne er tilvejebragt ved 3'--endesekvenserne i vilkårlige af de højt eksprimerede gener, såsom ADH1, MFal eller TPI, Alber og Kawasaki, J. of Mol. and Appl. Genet. 1, 419-434, (1982).

30 En række gærekspressionsplasmider, såsom YEp6, YEpl3 og YEp24, kan anvendes som vektorer. Et gen af interesse kan fusioneres til alle de ovenfor omtalte promotorer og derefter ligeres til plasmiderne til ekspression i forskellige gærværter. Disse plasmlder er blevet fuldstændigt be-35 skrevet i litteraturen, Botstein m.fl., Gene 8, 17-24, (1979); Broachm.fi., Gene, 8, 121-133 (1979).

8 DK 172635 B1

To metoder anvendes ved transformation af gærceller.

I det ene tilfælde omdannes gærceller først til protoplaster ved anvendelse af zymolyase, lyticase eller glusulaSe efterfulgt af addition af DNA og poly ethyl englycol (PEG). De 5 PEG-behandlede protoplaster regeneres derefter i et 3%'s agarmedium under selektive betingelser. Detaljer ved denne metode er angivet i artikler af Beggs, Nature (London), 275, 104-109 (1978), og Hinnen m.fl., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 75, 1929-1933 (1978). Den anden metode indebærer 10 ikke fjernelse af cellevæggen. I stedet behandles cellerne med lithiumchlorid eller -acetat og PEG og anbringes på selektive plader, Ito m.fl., J. Bact., 153, 163-168 (1983).

cDNA kan ligeres til forskellige ekspressionsvek-torer til anvendelse ved transformation af værtscellekul-15 turer. Vektorerne indeholder alle gensekvenser til initiering af transkription og translation af de proteiner, som er forenelige med den værtscelle, som skal transformeres.

Desuden indeholder vektorerne fortrinsvis et mærkestof til tilvejebringelse af en phænotypeegenskab til udvælgelse 20 af transformerede værtsceller, såsom dihydrofolatreduktase eller metallothionein. Desuden kan en replikerende vektor eventuelt indeholde et replikon.

Insekt- eller pattedyrcellekulturer er anvendelige til produktionen af proteiner. Pattedyrcellesystemer vil 25 ofte foreligge i form af monolag af celler, selvom pattedyr-cellesuspensioner også kan anvendes. Illustrative eksempler på pattedyrcellelinier omfatter VERO- og HeLa-celler, ovariecellelinier fra kinesisk hamster (CHO), WI38-, BKK-, COS-7-eller MDCK-cellelinier.

30 Den vektor, som anvendes til transformation af værts cellen, indeholder fortrinsvis gensekvenser til initiering af transkriptionen og translationen af proteinets gensekvens.

Disse sekvenser betegnes som ekspressionskontrolsekvenser.

Når værtscellen stammer fra et pattedyr eller insekt, opnås 35 illustrative, anvendelige ekspressionskontrolsekvenser fra SV-40-promotoren, Science, 222, 524-527 (1983), CMV-I.E.- DK 172635 B1 9 promotoren, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 659-663 (1984), metal-lothioneinpromotoren, Nature, 296, 39-42 (1982), eller ba-culoviruspolyhedrinpromotoren (insektceller), Virol., 131, 561-565 (1983). Plasmidet til replikation eller integrering 5 af DNA-materiale indeholdende ekspressionskontrolsekvenserne spaltes ved anvendelse af restriktionsenzymer og indstilles i størrelse efter behov eller ønske og ligeres med cDNA, som koder for proteiner, ved anvendelse af metoder, som er velkendte på området.

10 Når der anvendes værtsceller fra højere dyr, er det nødvendigt, at polyadenylerings- eller transkriptionster-minatorsekvenser fra kendte pattedyrgener inkorporeres i vektoren. Et eksempel på en terminatorsekvens er polyadenyleringssekvensen fra oksevæksthormongenet.

15 Yderligere gensekvenser til kontrol med replikation i værtscellen kan inkorporeres i vektoren, såsom dem, som findes i vektorer af oksepapillomavirustypen, Saveria-Campo, "Bovine papillomavirus DNA: a eukaryotic cloning vector", DNA cloning bind II, A practical approach, Glover, udg., 20 IRL Press, Arlington, Virginia 213-238 (1985).

Den foretrukne ekspressionsvektor, som kan anvendes til eksprimering af proteiner i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) er en pendulvektor pSVC0W7, som replikerer i både CHO- og E. coli-celler ved anvendelse af ampicillin-25 resistens- og dihydrofolatreduktasegener som mærkestoffer i hhv. E. coli- og CHO-celler. Plasmid pSVCOW7 tilvejebringer også den polyadenyleringssekvens fra oksevæksthormon, som er nødvendig for ekspression i CHO-celler. Plasmid pSVCOW7 spaltes, og en viruspromotor og cDNA’er indsættes.

30 Den foretrukne ekspressionsvektor, som kan anvendes ved dannelse af rekombinantbaculovirus til ekspression af proteiner i insektceller, er pAc373, Smith m.fl., Mol. Cell.

Biol. 3, 2156-2165 (1983). Plasmidet replikerer i E. coli-celler under udnyttelse af ampicillinresistens og tilveje-35 bringer den eukaryote promotor og polyadenyleringssignalet fra baculoviruspolyhedringenet til ekspression af gener.

DK 172635 B1 10

Plasmid pAc373 spaltes, og en cDNA indsættes stødende op til promotoren. Dette nye plasmid cotransficeres med baculo-virus-DNA (Autograpa californica, kernepolyhedrosis- virus) ind i insektceller ved calciumphosphatudfældning. Rekom-5 binantbaculovirus, hvori pAc373 polyhedringenet indeholdende en cDNA har erstattet det hvilende viruspolyhedringen ved homolog rekombination, påvises ved punktplethybridisering ved anvendelse af 32P-mærket cDNA som sonde, M.D. Summers og G.E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors 10 and Insect Cell Culture Procedures, Texas A & M University,

College Station, TX, 29-30 (1986). Insektceller inficeret med rekombinantbaculovirus kan også differentieres ved hjælp af deres occlusionsnegative morphologi, da indsættelsen af cDNA i polyhedringenet forhindrer syntesen af dette occlu-15 sionsdannende protein.

Den foretrukne ekspressionsvektor anvendt i forbindelse med oksepapillomavirus (BPV) til eksprimering af proteiner er pTFW9. Plasmidet pTWF9 er deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten. Plasmid pTFW9 opretholdes i 20 en E. coli-vært og er deponeret hos Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, US, den 17. november 1986 og tildelt accessionsnummer NRRL B-18141. Plasmidet replikerer i E. coli under udnyttelse af ampicillinresistens og tilvejebringer musemetallothioneinpromotoren og SV40 25 polyadenyleringssignalet til ekspression af gener. Plasmid pTFW9 spaltes, og en cDNA indsættes stødende op til promotoren. Dette nye plasmid spaltes derefter for at tillade indsættelse af BPV. Rekombinantplasmidet transficeres ind i dyreceller ved calciumphosphatudfældning, og steder med 30 transformerede celler udvælges.

Værtscellerne er kompetente eller gøres kompetente til transfektion på forskellig måde. Der er adskillige velkendte metoder til indføring af DNA i dyreceller. Disse omfatter calciumphosphatudfældning, fusion af modtagecel lerne 35 med bakterieprotoplaster indeholdende DNA, behandling af modtagecellerne med liposomer indeholdende DNA og mikroind- i 11 DK 172635 B1 sprøjtning af DNA direkte i cellerne. De transficerede celler dyrkes på måder, som er velkendte på området, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., (1977). Rekombinantglycoproteiner 5 eksprimeret i et af ovennævnte, eukaryote ekspressionssystemer isoleres fra cellesuspensioner frembragt ved itu-brydning af værtscellesystemet ved velkendte, mekaniske eller enzymatiske metoder. Proteiner, som er konstrueret til at blive udskilt fra cellerne, isoleres fra mediet uden 10 itubrydning af cellerne. Til rensning af glycoproteiner er det en hjælp først at påføre cytoplasmafraktionen på en linselectinkolonne, som specifikt vil binde glycoproteiner.

De eluerede glycoproteiner påføres derefter en affinitetskolonne indeholdende antistof.

15 Et typisk glycoprotein kan opdeles i tre regioner.

Ved aminoterminalenden findes en hydrofob region betegnet signalsekvensen. Denne aminosyresekvens signalerer transporten af glycoproteinet til cellemembranen. Efter transport fjernes signalsekvensen ved fraspaltning. Med strømmen fra 20 signalsekvensen findes det ekstracellulære domæne i det modne glycoprotein. Dette er den immunogene del af glycoproteinet, da den er tilgængelig for antistoffer. Ved carb-oxyterminalenden af glycoproteinet findes den hydrofobe ankerregion, som bevirker, at glycoproteinet holdes tilbage 25 i cellemembranen. PIV3-F er et typisk glycoprotein, da det indeholder en aminoterminalsignalsekvens og en carboxyter-minalankersekvens, Spriggs m.fl., Virology 152, 241-251 (1986). PIV3-HN-glycoproteinet er imidlertid usædvanligt, da dets aminoterminalende virker både som signal- og anker-30 region, Elango m.fl., J. Virol. 57, 481-489 (1986).

Et glycoprotein kan være konstrueret til at blive udskilt fra celler ud i det omgivende medium. Dette opnås ved, at der tilvejebringes en tidlig terminering af glycoproteinet før translation af ankerregionen, Lasky m.fl., 35 Biotechnology, 2, 527-532 (1984). Tidlig terminering kan opnås ved indsættelse af et universaltranslationsterminator- 12 DK 172635 B1 oligonucleotid på et hensigtsmæssigt sted i genets DNA.

Disse oligonucleotider er kommercielt tilgængelige. Tidlig terminering kan også opnås ved ændring af læserammen, således at der frembringes en translationstermineringscodon.

5 Det nedenfor beskrevne, chimære glycoprotein består af signaldomænet og det ekstracellulære domæne i PIV3-F bundet til det ekstracellulære domæne i PIV3-HN og vil blive betegnet som FHN. Rigtigt placeret i en eukaryot ekspressionsvektor er det ovenfor beskrevne FHN-gen konstrueret 10 til ekspression af et chimært glycoprotein, som vil blive transporteret til cellens overflade og udskilt ud i mediet.

Hovedparten af cytoplasmadomænet i PlV3-HN-proteinet findes i den koderegion, som er omspændt af restriktionsenzymsteder Dral (nucleotidstilling 452 i den proteinkodende 15 region) og PstI (nucleotidstilling 1709 i den proteinkodende region). Denne sekvens koder ikke for signal/anker-regionen i glycoproteinet. Hovedparten af cytoplasmadomænet i PIV3--F-proteinet findes i koderegionen forud for restriktionsenzymstedet Xbal (nucleotidstilling 1398 i den proteinkodende 20 region). Denne sekvens koder for signalregionen og størstedelen af antigenregionen, men ikke ankerregionen i F-glyco-proteinet.

Til indsætning af HN-glycoproteinsekvensen i F-glyco-proteinet i PIV3 digereres HN-genet med PstI, og enden gøres 25 stump med T4-DNA-polymerase. En Xbal-linker (New England Biolabs) med sekvensen CTAGTCTAGACTAG CATCAGATCTGATC

ligeres til enden. Genet adskilles fra tilbageværende linker 30 ved agarosegelelektrophorese. Ovenstående linker indeholder et translationstermineringssignal i fase til standsning af proteinsyntese. Derefter digereres HN-genet med Dral, og en Xbal-linker (New England Biolabs) med sekvensen TGCTCTAGAGCA 35 ACGAGATCTCGT

ligeres til enden. Denne linker indeholder ikke et transla- 13 DK 172635 B1 tionstermineringssignal i fase og vil tillade gennemlæsning af proteinet fra F- til HN-sekvenserne. HN-genfragmentet (1,3 Kb) indeholdende linkerne digereres med Xbal og adskilles fra tilbageværende linkere ved agarosegelelektrophorese.

5 PIV3-F-genet digereres med Xbal og dephosphoryleres med alkalisk phosphatase fra bakterier. HN-fragmentet på 1,3 Kb ligeres derefter ind i F-genet ved Xbal-stedet og transformeres ind i E. coli HB101. En klon indeholdende det chi-mære glycoproteingen isoleres, og forbindelserne mellem ΓΙΟ og HN-DNA-sekvenserne verificeres korrekt ved Maxam-Gilbert--sekvensering. Det chimære PIV3-glycoproteingen kan anbringes i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor.

Ovennævnte restriktionsenzymsteder er blevet udvalgt, fordi de tillader ekspression af en stor del af de relevante 15 regioner i F- og HN-glycoproteinerne. Andre dele af glyco-proteinerne kunne imidlertid eksprimeres ved udvælgelse af andre restriktionsenzymsteder i de F- og HN-kodende sekvenser til fusionen af disse gener. F.eks. kunne restriktionsenzymerne Haelll, Kpnl eller NlalV anvendes til spaltning ved 20 5'-enden af HN-genet. Restriktionsenzymerne Ball, Bglll

eller Haelll kunne anvendes til spaltning ved 3'-enden af HN-genet. Enzymerne kan anvendes i en vilkårlig kombination af to, hvor der et enzym fra hver gruppe, til opnåelse af immunogene fragmenter. Til gpF-genet kunne restriktions-25 enzymerne Bglll, Haelll, Nsil eller XhoII anvendes i stedet for Xbal. Linkeroligonucleotider kan adderes til korrektion af læserammen i forbindelsesregionerne. To oligonucleotider, som vil korrigere de to mulige rammeskift, er Sall-linkerne GGTCGACC og CGGTCGACCG 30 CCAGCTGG GCCAGCTGGC

som er kommercielt tilgængelige. Også når der i glycoprote inet ønskes en ankerregion, adderes et linkeroligonucleo-tid ved den anden sammenknytning for at tillade syntese af gpF-ankerreglonen. Alternative strategier kan konstrueres 35 til ekspressionen af et chimært FHN-protein ved indsættelse eller udeladelse af forskellige sekvenser. Hovedkriteriet 14 DK 172635 B1 for proteinet er bibeholdelsen af en signalsekvens og de immunologisk vigtige regioner af de to glycoproteiner.

Indsættelse af FHN-genet i CHO-, BPV- eller baculo-virusekspressionsvektorer er allerede beskrevet.

5 Det chimære FHN-glycoprotein giver fordele sammen lignet med ekspression af de individuelle glycoproteiner.

Da FHN er et enkelt protein, kræver det kun det halve arbejde og de halve reagenser til rensning sammenlignet med de separate F- og HN-glycoproteiner. Ligeledes udskilles det 10 chimære FHN-glycoprotein i mediet til let rensning. F-glyco-proteinet kan konstrueres som et udskilt glycoprotein ved afskæring forud for ankerregionsekvenserne. PIV3-HN-glyco-proteinet indeholder imidlertid en signal/anker-region ved sin aminoterminalende. Derfor vil afskæring af dette glyco-15 protein ikke skabe en udskilt form. Signal/anker-regionen kan erstattes med en signalregion fra et fremmed glycoprotein, men dette ville indføre fremmede proteinsekvenser i den potentielle vaccine.

Konventioner, som er anvendt til gengivelse af plas-20 mider og fragmenter i skemaerne 1-6, skal forstås som værende synonyme med konventionelle, cirkulære gengivelser af plas-mider og deres fragmenter. Til forskel fra de cirkulære figurer repræsenterer de retliniede figurer på skemaerne både cirkulær og lineær, dobbeltstrenget DNA, idet initiering 25 eller transkription sker fra venstre mod højre (5' til 3').

Stjerner (*) repræsenterer brodannelsen mellem nucleotider til komplettering af plasmidernes cirkulære form. Fragmenter har ikke stjernemarkeringer, fordi de er lineære stykker af dobbeltstrenget DNA. Endonucleaserestriktionssteder er vist 30 over linien. Genmærkestoffer er vist under linien. Den relative afstand mellem mærkestoffer angiver ikke de faktiske afstand, men skal kun forstås som visende deres relative stillinger på den illustrerede DNA-sekvens.

15 DK 172635 B1

Eksempel l

Fjernelse af G-C-halerne fra F-qlvcoproteinaenet.

SKEMA-A

5 KONSTRUKTION AF pGPF2

PstI BstXI Nrul PstI

* ___i—IX_i—i—*

1 TTTFFFFFFFFFFFFFTTT

TcR

10 (a) Plasmid pGPFl digereres med BstXI og Nrul. Oligo-nucleotider 1 og 2 ligeres til enderne. DNA digereres med BamHI, og fragment 1 (1,6 Kb) gelisoleres.

.c BamHI BstXI Nrul BamHI

J-1-1-~i 11111 FFFFFFFFFFFFFFFFFFFF 2222 (b) Plasmid pBR322 (4,4 Kb) digereres med BamHI og dephosphoryleres med alkalisk phosphatase fra bakterier.

20 Fragment 1 ligeres ind i BamHI-stedet til dannelse af pGPF2 (6,0 Kb).

BamHI BstXI Nrul BamHI

* -,-1-1_I_1—* I 1111 FFFFFFFFF 222

AmpR

25 TcR = Tetracyclinresistens

AmpR Ampicillinresistens T = Guanosin/cytosin-hale

F = Glycoprotein F

l =* Oligonucleotid 1 30 2 Oligonucleotid 2

Til opnåelse af maksimal ekspression af F-glycopro-teinet skal de G-C-nucleotider, som er anvendt til indsættelse af cDNA i plasmidet pBR322, fjernes fra enderne af 35 cDNA. Til bekvem indsættelse af FHN-cDNA i den foretrukne ekspressionsvektor for CHO-celler (pSVCOW7, beskrevet i det 16 DK 172635 B1 følgende) eller den foretrukne ekspressionsvektor for baculo-virus (pAc373, beskrevet i det følgende) er det nødvendigt at tilvejebringe et BamHI-sted imod strømmen fra den proteinkodende sekvens. Metoder til syntesen af de cDNA-kloner, 5 som indeholder hele sekvensen for F-glycoproteinet, er blevet beskrevet, Spriggs m.fl., Virology 152, 241-251 (1986).

cDNA indeholdende det intakte PIV3-F-gen (pGPFl) digereres med BstXI og Ndel. BstXI spalter F-genet i stilling 39 i forhold til genets initeringscodon, og Ndel spalter i 10 stilling 1599. 01igonucleotid 1 ligeres til BstXI-spalt- ningsstedet, og oligonucleotid 2 ligeres til Ndel-spalt-ningsstedet. 01igonucleotid 1 indeholder DNA-sekvensen fra 10 baser før koderegionen til BstXI-spaltningsstedet i kode-regionen i F-genet (fra -10 til +39) og har et BamHI-sted 15 på 5'-enden af oligonucleotidet. 01igonucleotid 2 indeholder DNA-sekvenserne fra Ndel-spaltningsstedet til terminerings-codonen af F-genet (fra +1599 til +1620). Ved 3'-enden i oligonucleotid 2 findes et Nrul-restriktionsenzymsted efterfulgt af BamHI-restriktionsenzymsted.

20 Efter ligering af oligonucleotiderne digereres DNA

med BamHI, og F-genet (fragment 1, 1,6 Kb) gelrenses. Fragment 1 ligeres ind i plasmid pBR322 (Pharmacia), som er blevet digereret med BamHI og dephosphoryleret med alkalisk phosphatase fra bakterier. Plasmidet (pGPF2) transformeres 25 ind i E. coli HB101. De nysyntetiserede regioner i pGPF2 sekvenseres ved Maxam-Gilbert-metoden til verifikation af nøjagtig syntese og ligering.

Oligonucleotid 1 3 0 CGGATCCACTGAACATGATGCAACCTCAATACTGCTAATTATTACAACCATGATT GCCTAGGTGACTTGTACTACGTTGGAGTTATGACGATTAATAATGTTGGTA Oligonucleotid 2

TATGTATTAACAAACAAATGATCGCGACGGATCCG

ACATAATTGTTTGTTTACTAGCGCTGCCTAGGC

17 DK 172635 B1

Kanstraktion af et chimært PiV3-FHN-aen.

SKEMA 2

5 KONSTRUKTION AF ET CHIMÆRT FHN-GLYCOPROTEINGEN

Petl Dral PstI PstI

*-j-1-1_I_I_*

I TTTHHHHHHHHHHHHHHHHHHTTT

TcR

10 (a) Plasmid pGPHNl digereres med PstI. Enderne geres stumpe med T4-DNA-polymerase og dephosphoryleres derefter med alkalisk phosphatase fra bakterier. En Xbai-linker (linker 1) ligeres til enderne, og fragment 2 (1,7 Kb) gelrenses.

15 Fragment 2

Dral -1_ 111 TTTHHHHHHHHHHHHHHHHHH 1111 (b) Fragment 2 digereres med Dral. En Xbai-linker 20 (linker 2) ligeres til enderne. DNA digereres med Xbal, og fragment 3 (1,3 Kb) gelrenses.

Fragment 3

Xbal Xbal

25 J-L

222 HHHHHHHHHHHHHHHH 111 (c) Plasmid pGPF2 (skema 1) digereres med Xbal og dephosphoryleres med alkalisk phosphatase fra bakterier.

Fragment 3 ligeres ind i Xbal-stedet til opnåelse af 30 pGPFHNl.

BanHI Xbal Xbal BanHI

*---1----1-1-1--.*

I FFFFFFFFFHHHHHHHH|FFFFF

AmpR Term 18 DK 172635 B1

TcR = Tetracyclinresistens

AmpR - Ampicillinresistens T = Guanosin/cytosin-hale H * DNA-sekvenser for HN-glycoprotein 5 F « DNA-sekvenser for F-glycoprotein 1 ** Linker 1 2 Linker 2

Term · Translationstermineringssignal 10 A. Fremstilling af PIV3-HN-qlvcoproteinqenet.

Kloner indeholdende hele koderegionen i PlV3-HN-genet og metoder til isolering af sådanne kloner er blevet beskrevet, Elango m.fl., J. Virol. 57, 481-489 (1986). En

cDNA-klon indeholdende PIV3-HN-genet (pGPHNl) digereres med 15 Pstl. Dette enzym spalter i nærheden af 3'-enden af HN-genet (nucleotid +1714). Fragmentets ender gøres stumpe med T4-DNA-polymerase og dephosphoryleres derefter med alkalisk phosphatase fra bakterier. En Xbal-linker (New England Biolabs, linker 1) med sekvensen 20 CTAGTCTAGACTAG

GATCAGATCTGATC

ligeres til enden. cDNA adskilles fra tilbageværende linker ved elektrophorese i en 1,2%'s agarosegel. Fragmentet på 1,7 Kb (fragment 2) indeholdende HN-genet udskæres fra gelen, 25 og DNA renses fra agarosen. Ovenstående linker indeholder et translationstermineringssignal i fase til standsning af proteinsyntese. Derefter digereres HN-genet med Dral. Dette enzym spalter 3' for den signal/anker-kodende region i HN--genet (nucleotid +452). En Xbal-linker (New England Biolabs,

30 linker 2) med sekvensen TGCTCTAGAGCA ACGAGATCTCGT

ligeres til enden. Denne linker indeholder ikke et translationstermineringssignal i fase. DNA digereres med Xbal og 35 adskilles fra tilbageværende linkere ved elektrophorese i en 1,2%'s agarosegel. Fragmentet på 1,3 Kb indeholdende den 19 DK 172635 B1 relevante region af HN-genet udskæres fra gelen, og DNA renses fra agarosen.

B. Indsættelse af HN-cDNA i PIV3-F-qlycoproteingenet.

5 Plasmid pGPF2 digereres med Xbal og dephosphoryleres med alkalisk phosphatase fra bakterier. Fragmentet på 1,3 Kb ligeres ind i Xbal-stedet til opnåelse af det'chimære FHN-gen (pGPFHNl). Plasmidet transformeres ind i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges ud fra den korrekte orien-10 tering af HN-cDNA i F-genet ved digerering med BamHl og PvuII, som vil skabe fragmenter på ca. 2,5 Kb og 350 bp i FHN-genet. Den ukorrekte orientering af HN-fragmentet vil give fragmenter på ca. 1,5 Kb og 1,3 Kb ved digerering med BamHl og PvuII. Forbindelsesregionerne i en rigtigt oriente-15 ret klon sekvenseres ved Maxam-Gilbert-teknikken til verifikation af rigtig ligering af HN-fragmentet.

EKSÆTnpel^j

Anvendelse_af_DNA-olfgonucleotider_tU frembringelse_af 20 gener, som koder for chimære FHN-alycoproteiner af forskellige længder.

SKEMA 3 01igonucleotidanvendelse til frembringelse af FHN-gener af 25 varierende længde (a) Oligonucleotid A består af oligonucleotid 3 (57 bp), eller oligonucleotider 3 og 4 ligeret sammen (117 bp), 30 eller oligonucleotider 3, 4 og 5 ligeret sammen (177 bp), eller oligonucleotider 3, 4, 5 og 6 ligeret sammen (234 bp), eller 35 oligonucleotider 3, 4, 5, 6 og 7 ligeret sammen (290 bp) .

20 DK 172635 B1 SKEHA 3 (fortsat)

Oligonucleotid B består af oligonucleotid 8 (12 bp). Oligonucleotider A og B er gelrenset.

5 Oligonucleotid A Oligonucleotid b 3333 8888888 10 - 33334444 333344445555 15 3333444455556666 20 33334444555566667777 (b) Plasmid pGPHNl digereres med PstI og Dral, og fragment 4 (1,3 Kb) gelrenses.

25 Fragment 4

Dral PstI

J-1

HHHHHHHHHHHHHHH

(c) Oligonucleotider A og B ligeres til fragment 4.

30 DNA digereres med Xbal, og fragment 5 gelrenses (længde af fragment 5 varierer fra 1330 bp til 1565 bp, afhængigt af oligonucleotider indeholdt i oligonucleotid A).

Fragment 5 35 Xbal Dral PstI Xbal J-1-1-1

AAAAAHHHHHHHHHHHHHHBBBB

(d) Plasmid pGPF2 digereres med Xbal og dephosphory-leres med alkalisk phosphatase fra bakterier. Fragment 5 40 ligeres derefter ind i Xbal-stedet i pGPF2 til dannelse af PGPFHN2.

21 DK 172635 B1 SKEMA 3 (fortsat)

Plasmid pGPFHN2

BaoHI Xbal Xbal BaaHI

*—i-1-1-1_I_*

I FFFFFFFFFFAAAHHHHHBBFFFF

5 AnpR I

Tara

AmpR * Ampicillinresistens F «* DNA-sekvenser for F-glycoprotein H » DNA-sekvenser for HN-glycoprotein

10 A * Oligonucleotid A

B * Oligonucleotid B

Term « Translationstermineringssignal

Gener, som koder for chimære FHN-glycoproteiner inde-15 holdende forskellige regioner af F- og HN-glycoproteinerne, kan frembringes ved anvendelse af en kombination af restriktionsenzymer og oligonucleotider. Denne metode tillader, at F- og HN-glycoproteinerne bindes på ethvert ønskeligt punkt af deres aminosyrerygrad, hvilket tillader inkorporering 20 eller fjernelse af regioner, som sandsynligvis indeholder epitoper, som vil blive erkendt af værtens immunsystem. Individuelle aminosyrer kan også ændres, hvis dette ønskes. Oligonucleotider syntetiseres svarende til DNA-sekvensen fra det ønskede bindingspunkt til et hensigtsmæssigt restrik-25 tionsenzymsted. Glycoproteingenet digereres med dette restriktionsenzym, og oligonucleotidet ligeres til genet ved restriktionsenzymstedet til skabelse af et DNA-fragment af den ønskede længde. Til let ligering syntetiseres oligo-nucleotiderne med ender, som er forenelige med restriktions-30 enzymstederne.

A. Indsættelse af olvcoproteln HN-cDNA i F-qlycopro- teinoenet.

Klon pGPHNl digereres med PstI og Dral. Fragmentet 35 på 1,3 Kb, som repræsenterer cDNA-regionen fra nucleotid-stilling 452 til 1714 (fragment 4) gelrenses. Oligonucleo- 22 DK 172635 B1 tider, som repræsenterer tilstødende regioner i HN-cDNA, ligeres derefter til hver ende af fragment 4. DNA-sekvenseme i disse oligonucleotider kan eventuelt kode for yderligere epitoper, som findes på HN-glycoproteinet. De individuelle 5 oligonucleotider er konstrueret til inkorporering af regioner, som eventuelt kan indeholde særegne epitoper. Det oli-gonucleotid, som ligeres til 5'-enden af HN-cDNA, kan bestå af enten oligonucleotid 3 (cDNA-nucleotider 395-452), oligonucleotider 3-4 (cDNA-nucleotider 335-452), oligonucleotider 10 3-4-5 (cDNA-nucleotider 275-452), oligonucleotider 3-4-5-6 (cDNA-nucleotider 218-452) eller oligonucleotider 3-4-5-6-7 (cDNA-nucleotider 162-452). Parenteserne omslutter nucleo-tider, som kun ville blive medtaget i det terminale oligonucleotid. F.eks. ville de omsluttede nucleotider ikke være 15 medtaget på oligonucleotid 5, hvis oligonucleotid 6 skulle adderes. Disse omsluttede nucleotider koder for et Xbal-sted. De omsluttede nucleotider medtages ikke, når der skal adderes et eller flere oligonucleotider, for at tillade ligering mellem de forenelige ender af oligonucleotiderne.

20 F.eks. er 5'-enden af oligonucleotid 3 forenelig med 3'-enden af oligonucleotid 4, når de nucleotider, som er omsluttet af parenteser, ikke er medtaget i oligonucleotid 3. Oligonucleotid 8 ligeres til 3'-enden af HN-genfragmentet.

5'-enden af dette oligonucleotid er forenelig med 3'-enden 25 af fragment 4. 3'-enden af dette oligonucleotid indeholder et translationstermineringssignal i fase efterfulgt af et Xbal-restriktionsenzymsted.

Efter ligering af oligonucleotiderne til HN-cDNA--fragmentet digereres DNA med Xbal, og det forstørrede HN-30 -cDNA-fragment (fragment 5) gelrenses. Det nye HN-cDNA-fragment ligeres derefter ind i Xbal-digereret pGPF2. DNA transformeres ind i E. coli HB101, og en klon indeholdende HN-genet i den korrekte orientering i F-genet isoleres (pGPFHN2). Orienteringen bestemmes ved digerering med hen-35 sigtsmæssige restriktionsenzymer. De nysyntetiserede regioner i det chimære gen verificeres korrekt ved Maxam-Gilbert 23 DK 172635 B1 sekvensering. Klonen kan derefter anbringes i forskellige ekspressionsvektorer som beskrevet i det følgende.

B. Oligonucleotider

5 3) (GTCTAGA AATTAGGA)ATGATAATCAAGAAGTGCCTCCACAAAGAATAA

(CAGATCT)TTAATCCT TACTATTAGTTCTTCACGGAGGTGTTTCTTATT

CACATGATGTGGGCATAAAACCTT

GTGTACTACACCCGTATTTTGGAA

10

4) (GTCTAGA TATACCGA)TATCATTGACACAACAAATGTCGGATCTTAGGAAATT (CAGATCT)ATATGGCT ATAGTAACTGTGTTGTTTACAGCCTAGAATCCTTTAA

CATTAGTGAAATTACAATTAGGA 15 GTAATCACTTTAATG

5) (GTCTAGA TCTAATAC)AGTCAGGAGTGAATACAAGGCTTCTTACAATTCAG (CAGATCT)AGATTATG TCAGTCCTCACTTATGTTCCGAAGAATGTTAAGTC AGTCATGTCCAGAATTATATACCGA

2 0 TCAGTACAGGTCTTAAT

6) (GTCTAGA CAATGAGT)TTATGGAAGTTACAGAAAAGATCCAAATGGCATCGG (CAGATCT)GTTACTCA AATACCTTCAATGTCTTTTCTAGGTTTACCGTAGCC

2 5 ATAATATTAATGATCTAATAC

TATTATAATTACT

7) GTCTAGATTCCATCAAAAGTGAAAAAGCCCATGAATCATTGCTACAA CAGATCTAAGGTAGTTTTCACTTTTTCGGGTACTTAGTAACGATGTT

30

GACGTAAACAATGAGT

CTGCATTT

8) GTTAATCTAGAG

3 5 ACGTCAATTAGATCTC

24 DK 172635 B1

Eksempel 4

Konstruktion af et chimært PIV3-FHN-qlycoproteincien indeholdende en ankerreglon.

5 SKEMA 4

Konstruktion af et FHN-gen med en ankerregion

Plasmid pGPHNl

PstI Dral PstI PstI

10 *—i-1-1-1-1_*

1U | TTTTTHHHHHHHHHHHHHHTTTTT

TcR

(a) Plasmid pGPHNl digereres med Dral og PstI. Oligo-nucleotid 9 ligeres til DNA, og oligonucleotid 10 ligeres derefter til DNA. DNA digereres med Xbal, og fragment 6 15 (1,3 Kb) gelrenses.

Fragment 6

Xbal Dral PstI Xbal J_I-1-1 999 HHHHHHHHHHHHH 10 10 10 20 (b) Plasmid pGPF2 digereres med Xbal og dephosphory-leres med alkalisk phosphatase fra bakterier. Fragment 6 ligeres ind i Xbal-stedet i pGPF2 til dannelse af pGPFHN3.

25 Plasmid pGPFHN3

BamHI Xbal Dral PstI Xbal BamHI

*___I_U_I_I_I_* I FFFFFFFF 9 9 HHHHHHHH 10 10 AAAA \

AmpR Term

TcR « Tetracyclinresistens 30 AmpR = Ampicillinresistens T = Guanosin/cytosin-hale F = DNA-sekvenser for F-glycoprotein H = DNA-sekvenser for HN-glycoprotein 9 = Oligonucleotid 9 35 10 = Oligonucleotid 10

Term * Translationstermineringssignal 25 DK 172635 B1 A = DNA-sekvenser, som koder for ankerregion i F-glyco- protein

Eksempel 2 og 3 illustrerer syntesen af gener, som 5 koder for chimære FHN-glycoproteiner, som ikke indeholder ankerregioner, og som derfor vil blive udskilt i mediet i eksprimerende celler. Et gen, som koder for et chimært FHN--glycoprotein, og som indeholder en ankerregion, kan syntetiseres. Ankerregionen vil bevirke, at det chimære glycopro-10 tein holdes tilbage i cellemembranerne på en måde, som ligner den for de fleste virusglycoproteiner. Ankerregionen kan være på carboxyterminalenden af glycoproteinets, således at de immunogene regioner i det chimære molekyle fra både F-og HN-glycoproteinerne vil stikke frem ud i det ekstracel-15 lulære fluidum. Det nedenfor beskrevne gen vil kode for et chimært glycoprotein bestående af den ekstracellulære region i PIV3-F, den ekstracellulære region i PIV3-HN og ankerregionen i PIV3-F i ovennævnte rækkefølge fra aminotermlnus til carboxyterminus.

20 A. Indsættelse af HN-cDWA-fragmentet i PIV3-F-alycopro-teingenet.

Klonen pGPHNl digereres med Dral og Pstl. Oligonucleo-tid 9 ligeres først til DNA-fragmentet (oligonucleotidet 25 er foreneligt med Dral-stedet) . Derefter ligeres oligonucleo-tid 10 til DNA-fragmentet (foreneligt med Pstl-stedet).

Begge oligonucleotider indeholder Xbal-restriktionsenzym-steder.

30 9) TGCTCTAGAGCA

ACGAGATCTCGT

10) GTCTAGAG

ACGTCAGATCTC

26 DK 172635 B1

Efter ligering digereres DNA med Xbal, og fragmentet af HN-cDNA på 1,3 Kb (fragment 6) gelrenses. Derefter ligeres fragment 6 ind i Xbal-digereret pGPF2. DNA transformeres ind i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges fra den 5 korrekte orientering som beskrevet i eksempel 2. Sammenknytningsregionerne i en rigtigt orienteret klon verificeres derefter som korrekte ved Maxam-Gilbert-sekvensering. Denne klon (pGPFHN3) kan anbringes i forskellige ekspressionsvektorer som nedenfor beskrevet.

10

Eksempel 5

Konstruktion af et chimært PIV3-HNF-qlvcoproteingen.

En del af den ekstracellulære region i PIV3-F-glyco-proteinet kan anbringes ved carboxyterminalenden af HN-glyco-15 proteinet. Dette chimære glycoprotein vil bestå af signal--anker-regionen fra aminoterminus i HN, størstedelen af den ekstracellulære region af HN og en del af den ekstracellulære region i F i ovennævnte rækkefølge fra aminoterminus til carboxyterminus.

20 A. Fremstilling af PIV3-HN-glvcoproteinqenet, gKEHA ?

Fremstilling af HN-gen til konstruktion af chimært HNF-gen 25

Plasmid pGPHNl

PstI Hphl PstI PstI

*_i_I_I-1_I-*

I TTHHHHHHHHHHHHHHHHHTTT

TcR

30 (a) Plasmid pGPHNl digereres med Hphl. Oligonucleotid 11 ligeres til DNA. DNA digereres med BamHI og PstI, og fragment 7 (1,7 Kb) gelrenses.

27 DK 172635 B1 SKEMA 5 (fortsat)

Fragment 7

BamHI Hphl Pstl j_Π_i

11 11 11 HHHHHHHHHHHH

5 (b) Plasmid pUC19 digereres med BamHI og Pstl. Fragment 7 ligeres ind i puci9 til dannelse af pGPHN2.

Plasmid pGPHN2 10 BamHI Hphl Pstl *-,-1-4-1--*

I 11 11 11 HHHHHKHHHHH

AmpR

TcR = Tetracyclinresistens

AmpR = Ampicillinresistens 15 T = Guanosin/cytosin-hale H = DNA-sekvenser for HN-glycoprotein 11 = Oligonucleotid 11

Til fremstilling af klonen pGPHNl til ekspression 20 skal de G-C-haler, som er anvendt ved cDNA-kloning, fjernes, og forenelige restriktionsenzymsteder anbringes på dens ender. Klon pGPHNl digereres med Hphl. Hphl spalter ved stilling 75 på den cDNA-genkodende sekvens. Derefter ligeres følgende oligonucleotid til cDNA-fragmentet: 25

11) GGATCCAAATCCGAGATGGAATACTGGAAGCACACCAATCACGGGAAAGATGCTGG CCTAGGTTTAGGCTCTACCTTATGACCTTCGTGTGGTTAGTGCCCTTTCTACGACC

TAATGAGCTGGAAACATCCATGG CTA CTCATGG C 3 0 ATTACTCGACCTTTGTAGGTACCGATGAGTACC

Oligonucleotid 11 vil ligere til HphI-stedet og skabe et BamHI-restriktionsenzymsted på 5'-enden af cDNA-frag-mentet. Efter ligering af oligonucleotid 11 digereres DNA 35 med BamHI og Pstl (Pstl spalter ved nucleotidstilling 1714 I HN-genet). DNA elektrophoreseres i en 1,2%'s agarosegel.

28 DK 172635 B1 HN-cDNA-fragmentet på 1,7 Kb (fragment 7) udskæres fra gelen, og DNA renses fra agarosen. Derefter ligeres fragment 7 ind i pUC19, som er blevet digereret med BamHI og PstI til opnåelse af pGPHN2. Plasmidet transformeres ind i E. coli 5 HB101, og plasmid-DNA isoleres.

B. Indsættelse af et F-cDNA-fragment 1_ PIV3-HN-glvco- proteinoenet.

10 SKEMA 6

Indsættelse af F-cDNA i pGPHN2

Plasmid pGPFl

PstI BstEII Xbal PstI

15 *-j-1-i-1 1-*

I TTFFFFFFFFFFFFFFFFFFFTTT

TcR

(a) Plasmid pGPFl digereres med BstEII og Xbal. Oligo-nucleotider 12 og 13 ligeres til DNA. DNA digereres med PstI, og fragment 8 (1,2 Kb) gelrenses.

20

Fragment 8

PstI BstEII Xbal PatI

J_1_I_l 12 12 FFFFFFFFFFFFFF 13 13 25 (b) Plasmid pGPHN2 (skema 5) digereres med PstI.

Fragment 8 ligeres ind i Pstl-stedet i pGPHN2 til dannelse af pGPHNFl.

Plasmid pGPHNFl

30 BamHI Hphl PstI BstEII Xbal PstI

*__I__I_I_I_I-,-I-* I 11 11 HHHHHHHH 12 12 FFFFFFFF 13|13

AmpR Term

TcR = Tetracyclinresistens

AmpR = Ampicillinresistens 35 T = Guanosin/cytosin-hale F = DNA-sekvenser for F-glycoprotein 29 DK 172635 B1 H = DNA-sekvenser for HN-glycoprotein 11 = Oligonucleotid 11 12 = Oligonucleotid 12 13 = Oligonucleotid 13 5 Term « Translationstermineringssignal

Klonen pGPFl digereres med BstEII og Xbal. BstEII spalter i stilling 190 og Xbal ved stilling 1398 på F-cDNA--gensekvensen. Derefter ligeres følgende oligonucleotider 10 til cDNA-fragmentet:

12) CCTGCAGGTG

GGACGTCCACCACTG

15 13) CTAGAATAATAGTCGCGAGGATCCTGCAGG

TTATTATCAGCGCTCCTAGGACGTCC

Oligonucleotid 12 vil ligere til BstEII-stedet og vil skabe et Pstl-restriktionsenzymsted på 5'-enden af cDNA-20 -fragmentet. Oligonucleotid 13 vil ligere til Xbal-stedet og vil skabe en translationstermineringscodon, et Nrul-res-triktionsenzymsted, et BarnHI-restriktionsenzymsted og et Pstl-restriktionsenzymsted i den angivne rækkefølge (fra 5' til 3’) på 3'-enden af cDNA-fragmentet. DNA digereres der-25 efter med PstI, og F-cDNA-fragmentet på 1,2 Kb (fragment 8) gelrenses. Derefter ligeres fragment 8 ind i pGPHN2, som er blevet digereret med PstI. Plasmidet transformeres ind i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges fra den korrekte orientering af F-cDNA i HN-genet ved digerering med BamHI 30 og Nrul, hvilket vil skabe et fragment på 2,9 Kb. Den ukorrekte orientering vil skabe et fragment på 1,7 Kb. Derefter verificeres sammenknytningsregionerne i en rigtigt orienteret klon som korrekte ved Maxam-Gilbert-sekvensering. Denne klon (pGPHNFl) kan anbringes i forskellige ekspressionsvek-35 torer som nedenfor beskrevet.

30 DK 172635 B1

Eksempel 6

Ekspression af det chimære FHN-glvcoproteln fra PIV3 i CHO--ceUer· A. Konstruktion af PSVC0W7.

5 Udgangsplasmidet pSV2dhfr (tilgængeligt fra American

Type Culture Collection eller fremstillet ved metoden ifølge S. Subramani m.fl., "Expression of the Mouse Dihydfofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular Biology 1, 854-864 (sept.

10 1981) digereres med BamHI og EcoRI til opnåelse af et frag ment på 5,0 Kb (fragment 9) indeholdende ampicillinresistensgenet, SV40-oprindelsen og dhfr-genet. Den anden del af pSVC0W7 opnås ud fra plasmid pXGH2R2, som digereres med samme restriktionsendonucleaser, som er anvendt til spaltning 15 af pSV2dhfr, til opnåelse af fragmentet på 2,1 Kb (fragment 10) indeholdende 3'-enden i genomoksevæksthormongenet, dvs.

BGH-gDNA. Plasmid pXGH2R2 er offentlig tilgængeligt fra en E. coli HBlOl-vært, deponeret hos Northern Regional Research Laboratories i Peoria, Illinois (NRRL B-15154) . Fragmenterne 20 9 og 10 ligeres til opnåelse af pSVCOW7 (7,1 Kb).

B. Konstruktion af pGPFHN-IE-pa.

De i eksemplerne 2-5 konstruerede gener kan anvendes til ekspression af et chimært glycoprotein i CHO-celler. I 25 det efterfølgende eksempel vil der blive anvendt plasmidet pGPFHN-1. De andre, chimære gener behandles som beskrevet for pGPFHN-1, medmindre andet er angivet. Samlingen af pGPFHN-IE-PA sker i to trin. Først indsættes gpFHN-cDNA fra pGPFHNl i PSVC0W7, hvilket giver pGPFHN-PA, og derefter 30 indsættes den umiddelbart tidlige promotor i cytomegalovirus til initiering af transkription af de PIV3-agtige proteiner, hvilket giver pGPFHN-IE-PA.

Trin 1. Plasmid pSVCOW7 opskæres med EcoRI og PuvII, og fragment 11 (600 bp) indeholdende polyadenyleringssekven-35 sen i oksevæksthormon strækkende sig fra PvuII-stedet i den 3'-enden nærmeste exon i BGH-genet til EcoRI-stedet med 31 DK 172635 B1 strømmen fra 3'-enden isoleres. Til en fuldstændig diskussion af BGH-polyadenyleringssekvensen henvises til følgende referencer: (1) EP offentliggørelsesskrift nr. 0.112.012, hvori identifikationen og karakteriseringen af BGH-genom-DNA er 5 beskrevet; (2) R.P. Woychik m.fl., "Requirement for the 3'

Flanking Region of the Bovine Growth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3944-3948 (juli 1984); og D.R. Higgs m.fl., Nature 306, 398-400 (24. november 1983), og deri angivne litteraturhen-10 visninger, som beskriver, at nucleotidsekvensen AATAAA karakteriserer polyadenyleringssignalet ved en stilling 11-30 nucleotider imod strømmen (hen imod 5'-enden) fra 3'-enden i BGH-genet.

En anden prøve af pSVCOW7 opskæres med EcoRl og BamHI 15 til opnåelse af fragment 12 (5,8 Kb). Fragment 12 kan alternativt stamme fra EcoRl/BamHI-fragmentet fra stamplasmidet pSV2dhfr, som er tilgængeligt fra Bethesda Research Laboratories. Fragment 12 indeholder oprindelsen til replikation fra pBR322 og et ampicillinresistensgen eksprimeret i E.

20 coli, hvilket tillader udvælgelsen af plasmidet i E. coli.

Fragmentet indeholder ligeledes musedihydrofolatreduktase--cDNA i en konstruktion, som tillader ekspression I pattedyrceller, S. Subramani m.fl., Molecular and Cellular Biology 1, 854-864 (sept. 1981).

25 Plasmid pGPFHNl opskæres med BamHI og Nrul til op nåelse af fragment 13 (2,7 Kb), som gelisoleres. BamHI-stedet er umiddelbart imod strømmen fra den cDNA, som koder for de 5'-ikke-translaterede sekvenser i FHN-mRNA, og Nrul-stedet er nogle få baser med strømmen fra translationsterminerings-30 codonen.

Fragmenterne 11, 12 og 13 ligeres til dannelse af pGPFHN-PA (9,1 Kb), som er en replikationsvektor, som er i stand til at pendle mellem E. coli- og CHO-celler. Plasmid pGPFHN-PA transformeres ind i E. coli.

35 Trin 2. I trin 2 omdannes pGPFHN-PA til ekspressions- plasmidet pGPFHN-IE-PA ved indsætning af den umiddelbart 32 DK 172635 B1 tidlige genpromotor fra humant cytomegalovirus (CMV-I.E.--promotor). CMV-I.E.-promotoren opnås ud fra Pstl-digerering af CMV-genomet. Restriktionsendonucleasespaltningskortene over den region i det humane cytomegalovirusgenom (CMV), 5 soro indeholder det umiddelbart tidlige hovedgen (CMV-I.E.)/ er blevet detaljeret beskrevet, Stinski m.fl., J. Virol.

46, 1-14 (1983); Stenberg m.fl., J. Virol. 49, 190-199 (1984); og Thomsen m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 659-663 (1984).

10 Stinski1s og Thomsen’s arbejder beskriver et Pstl- -fragment på 2,0 kilobase, som indeholder promotoren for det umiddelbart tidlige hovedgen. Når dette Pstl-fragment på 2,0 Kb isoleres og digereres med Sau3AI, fås der blandt produkterne et fragment på 760 basepar. Dette fragment på 15 760 basepar kan skelnes fra de andre produkter ved dets størrelse og tilstedeværelsen af et Sacl-spaltningssted og et Ball-spaltningssted i fragmentet. På grund af dets bekvemme identifikation er anvendelse af dette Sau3AI-fragment den foretrukne metode til anvendelse af CMV-I.E.-promotoren 20 som beskrevet i nærværende beskrivelse.

Plasmid pGPFHN-PA spaltes med BamHl, og et Sau3Al--fragment indeholdende den umiddelbart tidlige CMV-promotor ligeres ind i det forenelige BamHI-sted. Plasmider indeholdende CMV-promotorfragmentet i en sådan orientering, at 25 transkription fra promotoren vil syntetisere en mRNA for et PIV3-agtigt protein, identificeres ved spaltning af plas-miderne med sacl. Det resulterende plasmid betegnes pGPFHN--IE-PA med CMV-I.E.-promotoren ved 5'-enden af cDNA og BGH--polyadenyleringssignalet ved 3'-enden. Plasmidet opretholdes 30 i E. coli indtil transfektion ind i CHO-celler.

C. Transfektion og dyrkning af CHO-celler.

Plasmid pGPFHN-IE-PA transficeres ind i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), som mangler dihydrofolatreduktase 35 (dhfr), ved anvendelse af calciumphosphatmetoden til transfektion af DNA ind i celler, hvilken metode er detaljeret 33 DK 172635 B1 beskrevet af Graham m.fl., Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss Inc., N.Y. (1980), side 3-25. Den anvendte cellelinie er mutanten DXB-ll, som oprindeligt er tilgængelig fra L. Chasin, Columbia Univer-5 sity, og som er fuldstændigt beskrevet i Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 77, 4216-4220 (1980). Ovennævnte metoder til trans-fektion beror på den omstændighed, at celler, som inkorporerer de transficerede plasmider, ikke mere har mangel på dhfr og vil vokse i Dulbecco's modificerede Eagle's medium 10 plus prolin.

Hvis det chimære glycoprotein ikke indeholder en ankerregion, klares ovenstående væske fra CHO-celler, som eksprimerer udskilt, chimært FHN-protein, ved centrifugering med lav hastighed. Den ovenstående væske påføres en con-15 conavalin A- eller linselectinkolonne. Glycoproteinet elueres efter extensiv vask med en lineær gradient af a-D-methyl-glucosid (0-0,5 M) i ovenstående puffer. Det eluerede glycoprotein dialyseres imod PBS indeholdende 0,1% "Triton® X--100" og påføres en affinitetskolonne. Affinitetskolonnen 20 er sammensat af enten polyklonale eller monoklonale antistoffer rettet imod PIV3 bundet til "Sepharose® 4B"-perler (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) ved kendt teknik. Kolonnen vaskes i dialysepuffer, og PIV3-FHN-glycoproteinet elueres med PBS indeholdende 0,1M glycin (pH 2,5) og 0,1% "Triton® 25 X-100". Glycoproteinet dialyseres imod saltopløsning og afprøves for renhed ved elektrophorese på en SDS-PAGE-gel.

Hvis det chimære glycoprotein indeholder en ankerregion, vaskes CHO-cellerne, som eksprimerer glycoproteinet, i phosphatpufret saltopløsning (PBS) og lyseres derefter i 30 PBS indeholdende 1,0% "Triton® X-100" og 1,0% natriumdeoxy-cholat. Efter pelletering af kernerne påføres cytoplasma-ekstrakten på en conconavalin A-kolonne og renses som ovenfor beskrevet for udskilte glycoproteiner.

34 DK 172635 B1

Eksempel 7

Ekspression af PIV3-GPFHN ved anvendelse af oksepapilloma-virus fBPVl.

A. Konstruktion af en kloninasvektor indeholdende en 5 ikke-transkriberbar ekspressionskassette_egne_fc_til replikat ion i E. coU.

Konstruktionerne af pTFW8 og pTFW9 giver et hensigtsmæssigt udgangsmateriale til ekspression af PIV3-proteiner ved anvendelse af BPV. Transkriptionsterminatoren i det 10 afsatte plasmid forhindrer ekspressionen af PIV3-proteiner og skal fjernes ved udskæring og ligering i et enkelt trin.

1. Konstruktion af PTFW8.

Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) er beskrevet i Mol. og Cell Biol., bind 3 (nr. 11), 2110-2115 (1983), og opnået fra 15 Peter Howley hos National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, US. Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) består af tre dele:

Et komplet BPV-l-genom (100%) åbnet ved det eneste BamHI--sted; pML2 (et "gift-minus"-derivat af pBR322); en trans-kriptionel kassette sammensat af musemetallothioneingenpro-20 motoren I, neomycinphosphortransferasegenet II I Tn5 og transkriptionsbehandlingssignalerne fra den tidlige region i menneskeabevirus 40. Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) digere-res forst med BamHI til fjernelse af BPV-sekvenserne, som isoleres og opbevares til senere indsættelse. Det resterende 25 fragment religeres ved anvendelse af T4-ligase til dannelse af pMMpro.nptll (6,7 Kb). Fjernelse af BPV-genomet letter senere genetiske manipulationer ved skabelse af særegne restriktionssteder i det tilbageværende plasmid. Efter at rekombinationerne er afsluttet, indsættes BPV-genomet igen.

30 Plasmid pMMpro.nptll digereres med Bglll, og et synte tisk DNA-fragment 14 indeholdende særegne restriktionssteder indsættes og ligeres ved anvendelse af T4-ligase til opnåelse af pTFW8 (6,7 Kb). Plasmid pTFW8 er identisk med pMMpro.nptll bortset fra indsættelsen af særegne restrik-35 tionssteder mellem musemetallothioneingenpromotoren I og neomycinresistensgenet.

35 DK 172635 B1 2. Konstruktion af PTWF9.

Plasmid pTWF9 indeholder transkriptionsterminatoren Tj fra phag-X indsat mellem metallothioneingenpromotoren I og neomycinresistensgenet. Transkriptionsterminatoren kan 5 fås fra Donald Court hos National Cancer Institute, Bethesda,

Maryland, US. Transkriptionsterminatoren leveres i pKG1800sib3, som er den samme som pUS6 som beskrevet af U.

Schmeissner m.fl., i Gene, 28, 343-350 (1984), bortset fra at tj bærer sib3-mutationen som beskrevet i Guarneros m.fl., 10 PNAS, 79, 238-242 (1982). Under den normale infektionsproces af phag-λ fungerer tj-terrainatoren ved inhibering af bak-teriophag λ-int-genekspression ud fra PL og ved terminering af int-gentranskription, som stammer fra Pj. Terminatoren udskæres fra pKG1800sib3 ved anvendelse af Alul og Pvul som 15 fragment 15 (1,2 Kb), som gelisoleres, og Xhol-linkeré placeres på begge ender af fragmentet.

Linkerne er tilgængelige fra New England Biolabs,

Beverly, MA, US. Terminatorfragmentet bundet af komplementære Xhol-ender indsættes derefter i pTWF8, som i forvejen er 20 blevet digereret med Xhol. Derefter ligeres fragmenterne ved anvendelse af T4-DNA-ligase til opnåelse af pTWF9 (7,9 Kb). Plasmid pTWF9 er deponeret i overensstemmelse med Buda-pest-traktaten. Plasmid pTFW9 opretholdes i en E. coli-vært og er blevet deponeret hos Northern Regional Research Center, 25 Peoria, Illinois, US, den 17. november 1986 og tildelt acces-sionsnr. NRRL B-18141.

B. Konstruktion af pTFW/GPFHN.

De i eksemplerne 2-5 konstruerede gener kan anvendes til ekspression af et chimært glycoprotein ved anvendelse 30 af BPV. I dette eksempel vil der blive anvendt plasmidet pGPFHN-l. De andre, chimære gener behandles som beskrevet for pGPFHN-l, medmindre andet er angivet. Til konstruktion af pTFW/GPFHN digereres pGPFHNl med BamHI. Dets ender gores glatte med Klenow-enzym og syntetiske Bglll-linkere (New 35 England Biolabs) og ligeres til klonens ender. DNA digereres med Bglll og betegnes fragment 16 (2,7 Kb). Fragment 16 36 DK 172635 B1 indeholdende gpFHN-genet (2,7 Kb) isoleres derefter fra en gel. Det rensede fragment ligeres ind i pTFW9, som er blevet digereret med Bglll, til opnåelse af pTFW/GPFHN (10,6 Kb).

C. Omdannelse af pTFW/GPFHN til en eukarvot ekspres-5 sionsvektor.

Plasmid pTFW/GPFHN omdannes til en eukaryot ekspressionsvektor, ved at det 100% komplette BPV-l-genom, som er udskåret med BamHI, genindsættes. Plasmid pTFW/GPFHN opskæres med BamHI, og det intakte BPV-l-genom, et fragment på 7,9 10 Kb, indsættes til opnåelse af pTFW/GPFHN/BPV* (18,5 Kb), som replikeres i E. coli, indtil der ønskes produktion af glycoprotein-FHN ved hjælp af eukaryote celler.

D. Ekspression af gpFHN i muse-C127-celler.

Før transfektionen i muse-ci27-celler digereres 15 pTFW/GPFHN/BPV* med Xhol til udskæring af Tj-terminatoren, og der religeres med T4-DNA-ligase. Det resulterende plasmid pTFW/GPFHN/BPV (17,4 Kb) vil nu dirigere ekspressionen af høje niveauer af gpFHN, som udskilles ud i kulturmediet. Cl27-cellerne er tilgængelige fra American Type Culture 20 Collection og dyrkes i Dulbecco's modificerede, minimale, essentielle medium indeholdende 10% kalvefosterserum. Niveauerne af gpFHN-proteiner i Cl27-cellernes medium bestemmes ved Western-pletforsøg med anti-PIV3-antistof og 125I-mærket protein A.

25 PIV3-gpFHN renses fra dyrkningsmediet eller cellerne som beskrevet i eksempel 6.

Eksempel 8

Ekspression af PIV3-GPFHN ved anvendelse af baculovirus.

30 Nedenstående eksempel angår ekspressionen af glyco protein-FHN i insektcellekulturer. Alle processer er detaljeret beskrevet i M.D. Summers og G.E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, udgivet af the College of Agriculture, Texas 35 Agricultural Experiment Station, Texas Agricultural Extension Service, College Station, Texas, 1986. Udgangsplasmidet 37 DK 172635 B1 pAc373 (7,1 Kb) er en almen baculovirusekspressionsvektor med et enkelt BamHI-sted umiddelbart med strømmen fra poly-hedronpromotoren for Autographa californica kernepolyhedro-sisvirus (AcNPV). Polyhedronproteinet er et grundmassepro-5 tein, som er ikke-essentielt for virusinfektion og replika-tion in vitro. Plasmidet er tilgængeligt fra Professor Max Summers hos Department of Entomology, Texas A & M University,

College Station, Texas 77843, og er fuldstændigt beskrevet i Smith ro.fl., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165 (1983).

10 A. Konstruktion af pAcGPFHN.

De i eksemplerne 2-6 konstruerede gener kan anvendes til ekspression af et chiroært glycoprotein ved anvendelse af baculovirus. I dette eksempel vil der blive anvendt plasmidet pGPFHNl. De andre, chimære gener behandles som be-15 skrevet for pGPFHNl, medmindre andet er angivet. Plasmid pGPFHNl digereres med BamHI, og fragment 17 (2,7 Kb) indeholdende gpFHN-genet isoleres fra en gel. Det rensede fragment ligeres ind i pAc373, som er blevet digereret med BamHI.

B. Transfektion og dyrkning af S. fruqjperda.

20 gpFHN-cDNA-indsætningen i pAcGPFHN rekombineres med nativ AcNPV-DNA ved cotransfektion i S. frugiperda. S., frugi-perda (SF9, ATCC CRL 1711) dyrkes i Grace-medium (Gibco Lab. Livonia, Ml 48150), 10% kalvefosterserum og suppleret med Difco-lactalbuminhydrolysolat og yeastolat. Cellerne 25 cotransficeres med AcNPV-DNA og pAcGPFHN, hhv. ved 1 *tg/ml og 2 Mg/ml. Resulterende viruspartikler fås ved indsamling af medierne og fjernelse af cellemateriale ved centrifugering ved lav hastighed. Det virusholdige medium anvendes derefter til infektion af S. frugiperda. Efterfølgende infektion af 30 S. frugiperda ved anvendelse af disse viruspartikler, som omfatter både nativ virus-DNA og DNA rekombineret med cDNA kodende for glycoprotein-FHN, vil resultere i, at nogle celler eksprimerer PIV3-proteinet i stedet for polyhedronproteinet. Rensning af rekombinantvirus opnås ved en række 35 pletteringer med begrænset fortynding i vævskulturplader med 96 huller indeholdende S. frugiperda-celler. Huller 38 DK 172635 B1 indeholdende rekombinantvirus påvises ved punktplethybridise-ring ved som sonde at anvende pGPFHNl, som er blevet mærket med 32P-dCTP ved indskæringstranslation. Når det først er tilstrækkeligt rent, påvises rekombinantvirusset ved dets 5 særegne, occlusionsnegative plaquemorphologi. PIV3-protein syntetiseret i celler inficeret med rekombinantbaculovirus påvises ved Western-pletforsøg med anti-PIV3-antistof og 125I-mærket protein A (Amersham Corp.).

PIV3-proteinet renses fra dyrkningsmediet eller cello lerne som beskrevet i eksempel 6.

Eksempel 9

Fremstilling af en vaccine.

Immunogenet kan fremstilles i vaccinedosisform ved 15 velkendte metoder. Vaccinen kan indgives intramuskulært, subkutant eller intranasalt. Til parenteral indgivelse, såsom intramuskulær indgivelse, kan immunogenet kombineres med et egnet bærestof, idet det f.eks. kan indgives i vand, saltopløsning eller pufrede grundmasser med eller uden for-20 skellige adjuvanser eller immunomoduleringsmidler, såsom aluminiumhydroxid, aluminiumphosphat, aluminiumkaliumsulfat (alun), berylliumsulfat, siliciumoxid, kaolin, carbon, vand--i-olie-emulsioner, olie-i-vand-emulsioner, muramyldipeptid, bakterielt endotoxin, lipid X, Corynebacterium parvum (Pro-25 pionobacterium aenes), Bordetella pertussis, polyribonucleo-tider, natriumalginat, lanolin, lysolecithin, vitamin A, saponin, liposomer, levamisol, DEAE-dextran, blokerede co-polymere, ISCOMS eller andre syntetiske adjuvanser. Sådanne adjuvanser er kommercielt tilgængelige fra forskellige kil-30 der, f.eks. "Merck® Adjuvants 65" (Merck and Company, Inc.,

Rahway, NJ).

Mængden af immunogen og adjuvans kan varieres over et bredt interval, når blot de begge er til stede i effektive mængder. F.eks. kan aluminiumhydroxid være til stede i en 35 mængde på ca. 0,5% af vaccineblandingen (A^C^-basis). Baseret pr. dosis kan koncentrationen af immunogenet variere 39 DK 172635 B1 fra ca. 0,015 Mg til ca. 1,5 mg/kg patientlegemsvægt. Et foretrukket doseringsområde er fra ca. 0,5 Mg/kg til ca.

0,15 mg/kg patientlegemsvægt. En egnet dosisstørrelse hos mennesker er fra ca. 0,1 til ca. 1 ml, fortrinsvis 0,1 ml.

5 I overensstemmelse hermed vil en dosis til f.eks. intramusku-laer injektion omfatte 0,1 ml indeholdende immunogen i blanding med 0,5% aluminiumhydroxid.

Vaccinen kan indgives til gravide kvinder eller til kvinder i den fødedygtige alder til stimulering af moder-10 antistoffer. Kvinden kan revaccineres efter behov. Børn kan vaccineres, når de er 2-3 måneder gamle, efter at moderantistofferne er udtømt, og revaccineres efter behov, fortrinsvis når de er 6-9 måneder gamle, efter modning af immunsystemet.

Børn født af uvaccinerede mødre kan vaccineres, når de 2-3 15 måneder gamle. Vaccinen kan også anvendes i andre, modtagelige populationer, såsom ældre eller indlagte patienter.

Vaccinen kan også kombineres med andre vacciner mod andre sygdomme til fremstilling af multivalente vacciner.

Den kan også kombineres med andre medikamenter, såsom anti-20 biotika.

Claims (10)

1. Polypeptid, kendetegnet ved, at det består af mindst ét immunogent fragment fra begge glycopro-teiner F og HN i humant parainfluenzavirus type 3, og deri- 5 vater af dette polypeptid med samme biologiske virkning.

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det yderligere består af en signalsekvens.

3. Polypeptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det, når der begyndes roed N-terminalenden, består af 10 signalsekvensen fra glycoprotein F, et immunogent fragment i glycoprotein F og et immunogent fragment i glycoprotein HN.

4. Vaccine til mennesker, kendetegnet ved, at den omfatter et polypeptid ifølge ethvert foregående krav.

5. Anvendelse af et polypeptid ifølge ethvert fore gående krav til fremstilling af en vaccine til beskyttelse af mennesker mod humant parainfluenzavirus type 3 ved vaccination.

6. Ekspressionssystem, kendetegnet ved, 20 at det omfatter en egnet vært indeholdende en DNA-sekvens, som kan eksprimere et polypeptid ifølge ethvert af kravene 1 til 3.

7. Ekspressionssystem ifølge krav 6,kendete g-n e t ved, at værten er valgt blandt bakterieceller, gær- 25 celler, pattedyrceller og insektceller, f.eks. E. coli-bak-terier, ovarieceller fra kinesisk hamster, muse-C127-celler eller S. frugiperda-celler.

8. Ekspressionssystem ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, at værten er i stand til at udskille 30 polypeptidet.

9. Ekspressionssystera ifølge ethvert af kravene 6 til 8,kendetegnet ved, at DNA-sekvensen indeholdes i et plasmid, der står under kontrol af en cytomegalo-virus-promotor, eller i en eukaryot vært af oksepapilloma- 3. virus-DNA-sekvenser. DK 172635 B1

10. Ekspressionssystein ifølge ethvert af kravene 6 til 8, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen indeholdes i et rekombinant virus af baculovirus-familien, f.eks. Autographa californica kernepolyhedrosevirus. 5