JP2000504330A - 発現された組換えタンパク質から得られる応答の増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、組換えワクシニアベクターから発現されるタンパク質からの応答を増幅する方法に関する。本発明は、そのような発現が例えば、ワクチンの製造、ワクチン接種および遺伝子治療で望まれるあらゆる方法で発現されたタンパク質の意図した効果を増幅するのに使用できる。本発明は、合成ペプチド、核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列、およびそのＮ末端にシグナルペプチドを、そのＣ末端にアンカーペプチドを含むタンパク質をコードするＤＮＡセグメントに結合したベクターを包含する構築物にも関する。これらの発現ベクターは、種々の動物細胞でポリペプチドを発現するのに一般に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 発現された組換えタンパク質から得られる応答の増幅技術分野 本発明は、発現ベクター、好ましくは組換えワクシニアベクターから発現され たタンパク質から得られる応答を増幅する方法に関する。本発明は、例えばワク チン製造、ワクチン接種および遺伝子治療のような発現が望まれるあらゆる方法 において、効果を意図した発現されたタンパク質を増幅するのに使用されうる。 本発明はまた、合成ペプチド、核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列、並びに、その Ｎ末端にシグナルペプチド及びそのＣ末端にアンカー配列を含むタンパク質をコ ードするＤＮＡセグメントに連結したベクターを含む構築物にも関する。これら の発現ベクターは、一般に、種々の動物細胞中でポリペプチドを発現するのに有 用である。 発現ベクター中でＮ末端がシグナルペプチドを含み、Ｃ末端がアンカー配列を 含むようなタンパク質をコードすることによって、発現されたタンパク質は、シ グナル配列またはアンカー配列を含まないタンパク質と比較してかなり増幅され た応答または意図した効果を引き出す。本発明の方法は、中でもワクチン製造、 ワクチン接種および遺伝子治療のような疾患の処置を含めた種々の目的のための 発現されたタンパク質の効果を増幅するのに使用しうる。 さらに詳細には、本発明は、遺伝子治療技術に従って発現したタンパク質の治 療上または免疫原性上の効果、または抗原決定基としてタンパク質またはペプチ ドに依存するワクチンにおける治療上または免疫原性上の効果を増幅する方法に 関する。 特に、ワクチン治療または疾患予防に関連した実施例で、本発明は、中でも細 菌、ウイルス、真菌および原生動物を含む種々の微生物によって引き起こされる 多くの疾患を予防または治療するのに有用な、ある種のワクチンに関する。特に 、本発明の方法は、多くのもののなかでも、単純ヘルペス、サイトメガロウイル ス、肝炎および熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によってヒトに 引き起こされたマラリアに対するワクチンに発現される抗原タンパク質を増幅す るのに使用しうる。 本研究は、ＤＡＲＰＡ交付番号N-00014-90号によって支援された。政府は、本 発明に一定の権利を保持している。発明の背景 微生物感染を含めた種々の疾患状態を予防または治療することが、長年、健康 上の難問であった。多くの疾患状態および感染、特にウイルス変異種によるもの は、抗微生物剤で十分に治療できない。抗微生物剤で治療可能なそれらの疾患は 、しばしば、治療後に耐性になる。これらの感染を治療するためにここ数年で安 定した進展が見られたが、適切なデリバリーシステム用ビヒクルの選択およびタ ンパク質の発現を含めたいくつかの問題はまだ克服されなければならない。 ほとんどの例で、多くの疾患に対して使用するためのワクチンの開発は、ワク チンに存在した抗原タンパク質の免疫原性効果を高めるアジュバントを含ませる ことを伴う。 単純ヘルペスは、生殖器に起こったり、他の感染（一般的に唇ヘルペスと呼ば れる一般に口にできるもの）の原因となるウイルス性作用因子である。単純ヘル ペスの発生は、過去２０年間で数倍に増加した。有効なワクチンに対する必要性 は相当である。そのウイルスに行われた中和抗体が、主要な抗原として機能する ２つの糖タンパク（糖タンパクＢおよびＤ）により単純ヘルペスの表面の糖タン パクを認識することが立証された。組換え糖タンパク質は、チャイニーズハムス ター卵巣（ＣＨＯ）細胞で生成され、直接的抗原投与に対してモルモットを保護 する方法を提供することが示された。保護の程度は変化し、糖タンパク質と共に 投与して与えられるアジュバントに左右される。多くのヘルペス糖タンパク質は 、バキュロウイルス（昆虫基質の細胞系）中でも発現され、これらの内のいくつ かは、フロイント・アジュバントと共に投与されたときに保護的に免疫化する能 力も示した。このアジュバントの炎症特性は、ヒトへの使用を阻み、実験室の試 験動物での使用を強力に緩和する。ウイルスから得られるキャプシドタンパク質 を、組換えワクシニアウイルスによって十分に発現できる。 ヒトサイトメガロウイルスは、特に免疫的に弱体化した個体において死に至る ような病的状態を引き起こしうる病原体である。妊婦では、感染すると、胎児で の運動系の発達は不適切なものになる。そのウイルスは、１％の発生率で広く拡 散し、年々数千の先天性欠損の下流である。受胎前の女性における免疫の獲得は 、有害な影響の発生率を素早く減退するであろう。感染個体は、体液性または細 胞性成分の両方を含めた免疫応答を上げることができることが立証された。試験 は、免疫原としてそのウイルスの弱毒化株を用いて行われた。アジュバントと組 み合わせたタンパク質抗原を投与することによって、保護を与える試みがなされ たが、現在のところ、条件に合うような結果は得られなかった。 肝炎は、広範にみられる、消耗度の高い、そして時には致命的な疾患である。 ヒトに対する代表的には肝炎Ａ、ＢおよびＣ等を感染する多くの形態のウイルス 性肝炎がある。ヒト用に開発された一番目の組換えワクチン製品は、肝炎のＢ株 から作られたもので、アジュバント基剤製剤である。この材料の免疫応答を最大 限にするのはいまだに困難であり、アジュバント指向性の応答を改善する上での 維続した試みが、目下のところなされている。市販の肝炎ウイルスの一つは、酵 母から生成され、ミョウバンと混合された材料から作られる。このような生成物 は、哺乳類宿主細胞中で発現することによって、ウイルス性糖タンパク質に与え られた情報を欠如する可能性がある（例えば、特異的な立体構造特性を付与し、 プロセシングを調節し、安定性を増大できる複雑な糖鎖形成など）。 感染性疾患のワクチンの開発における最優先の問題は、保護的抗原を正確に同 定し、それらを宿主に対して効果的に供することにある。免疫原性的効果を促進 するアジュバントの使用に依る配合物は、それらの使用をさまたげる有害な反応 を起こす危険を冒す。アジュバントと一緒に使用された場合にのみ有効であるワ クチン調製物が、免疫細胞に対する提示が本質的に不十分であるものであること を強調することは重要である。この圧倒的な欠点は、おそらく多くの先行技術の ワクチンが市販化できなかった主要な理由である。 本発明の１つの態様では、中でもウイルス、細菌、原生動物および真菌を含め た微生物によって引き起こされる疾患の宿主に対するワクチンを製造するための 先行技術の試みの欠点を克服する一般的な手段が提供される。本発明によるワク チン類は、それらが免疫原的効果を作り出すことがなおさら考えられるような形 態で抗原性タンパク質を現す。 患者が適量の１つまたはそれ以上の重要なタンパク質またはポリペプチドを生 成する能力のない場合に、多くの遺伝子疾患が生じていることが明らかとなって いる。多くの神経学的疾患、筋肉または造血障害またはそれらに関連した疾患は 、その原因が重要なタンパク質またはポリペプチドを十分量で生成する個人の能 力について欠損しているによることがしばしば突きとめられている。実施可能な 他の治療法は、欠損タンパク質の生合成または合成回復にかかっている。また、 遺伝性疾患に罹っている患者にタンパク質発現ベクターを投与することを含めた 遺伝子治療技術は、実施可能な治療法であることが示されている。 過去には、生ワクシニアウイルスが痘瘡を完全に根絶するワクチンとして使用 され、ウイルス性抗原を発現する組換えワクシニアウイルスは、免疫された動物 で強力な抗体反応を誘導して、疾患を防御することが示された（Arita，I.，Nat ure、２７９巻、２９３〜２９８頁（１９７９年））。さらに、免疫原性と免疫 原 性の高いワクシニアウイルスタンパク質とを共に提示させれば、特異的な免疫原 に対する強い免疫応答を引き起こすことができることが動物モデルで示された（ Moss および Flexner、Annals of the New York Academy of Sciences、８６〜 １０３頁。Mackett および Smith、J．Gen．Virol、６７巻、２０６７〜２０８ ２頁、１９８６年。Houardら、J．Gen．Virol、７６巻、４２１〜４２３頁、１ ９９５年。Hujiiら、J．Gen．Virol、７５巻、１３３９〜１３４４頁、１９９４ 年。Rodriguesら、J．Immunol、１５３巻、４６３６〜４６４８頁、１９９４年 ）。したがって、ワクチンとして組換え生ワクシニアウイルスを使用すると、大 腸菌、酵母または昆虫の発現系で組換えタンパク質を製造するときに目下遭遇さ れる抗原発現および送達の際の多くの問題を克服できうる。外来遺伝子を、１８ ０ｋｂのワクシニアウイルスのゲノム内のいくつかの部位に挿入させる転移ベク ターのパネルが構築されてきた（Earl および Moss、Current Protocols in Mol ecular Biology、１６．１７．１〜１６．１７．１６、１９９３年）。さらに、 ２５ｋｂより大きい外来ＤＮＡがワクシニアウイルスゲノムに挿入できることが 報告された（Smith および Moss、Gene、２５巻、２１〜２８頁、１９８３年） 。正しいプロセッシング（Chakrabartaら、Nature、３２０巻、５３５〜５３７ 頁、１９８６年）および適切な翻訳後修飾（Huら、Nature、３２０巻、５３７〜 ５４０頁、１９８６年。Ballら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、８３巻、２４６ 〜２５０頁、１９８６年。de la Salleら、Nature、３１６巻、２６８〜２７０ 頁、１９８５年）、輸送および分泌（Ballら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、８ ３巻、２４６〜２５０頁、１９８６年および、Langfordら、Mol．Cell．Biol.、 ６巻、３１９１〜３１９９頁、１９８６年）は、発現されたタンパク質の一次構 造によって示される。さらに、組換えワクシニアウイルス・ワクチンは、比較的 安価で、容易に保存、移動、そして送達ができるという利点を示し、発展途上国 、例えばマラリアや他の疾患が最も流行している地域で特に重要である特性は、 特に有利であ る。発明の概要 本発明は、被患動物で発現されたタンパク質またはペプチドの生物学上または 製薬学上の効果を増強する方法に関する。本発明では、遺伝子または意図した製 薬学上の効果を示すタンパク質またはペプチド配列をコードする他の核酸配列を 含む発現ベクターが、その被患動物に導入される。発現されたタンパク質または ペプチド配列は、そのＣ末端にアンカーペプチド配列、また、任意にそのＮ末端 にシグナル配列をも含む。特に好ましい態様では、好ましくは、発現されたタン パク質またはペプチド配列は、免疫原性であり、そのＮ末端にシグナルペプチド およびそのＣ末端にアンカーペプチド配列の両方を含む。 発現ベクターが被患動物、好ましくはヒトのような哺乳類に導入された後、そ のベクターは、患者中でシグナルペプチドおよびアンカーペプチドを含む所望の タンパク質を発現し、意図する製薬学上の効果を生じる。発現されたペプチド配 列のＮ末端にシグナルペプチドを、発現されたペプチド配列のＣ末端にアンカー 配列を含ませると、発現されたタンパク質から得られた結果としての製薬学上の 効果について著しく改善がなされたことが予期せずに分かった。免疫原性タンパ ク質またはペプチドが、シグナルおよびアンカータンパク質によって発現される と、免疫原性効果は、しばしば、タンパク質またはペプチドがシグナルまたはア ンカーペプチドなしに発現される場合より実質的に大きい。 患者における発現されたタンパク質の製薬学上の効果を著しく増強する方法は 、発現されたペプチドのＣ末端においてアンカーペプチドと組み合わせて、任意 に、発現されたペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを含む、発現されるべき製 薬学上活性のあるタンパク質またはペプチドを包含するペプチド配列であって、 通常では、シグナルペプチドおよび／またはアンカーペプチドにより発現されな いペプチド配列をコードするＤＮＡ（核酸）配列を発現ベクターに組み込むステ ップ と、患者に前記発現ベクターを投与するステップとを包含する。その方法は、非 常に広範に応用できる。本発明は、発現ベクターに組み込まれ、タンパク質が発 現された細胞の外側においてその生物学上または製薬学上の効果を示す実質的に あらゆるタンパク質の生物学上または製薬学上の効果を増強するのに適切である 。その方法は、多くの中でも細胞表面の発現が免疫原性タンパク質および免疫原 性ペプチド、インシュリン耐性糖尿病の場合のインシュリンレセプター、ホルモ ンレセプターおよび成長因子レセプターを含めたレセプター類を包含する重要な 機能上の事象である基本的にあらゆるタンパク質またはペプチドに適用できる。 本発明は、特に、アジュバントを共に投与する必要なしに、増強した免疫原性活 性を引き出すワクチンを製造するのに適用できる。本発明は、多数の他の生物学 上および治療用途のなかでも遺伝子治療技術に有用性も見出す。 本発明の方法のステップにより、発現されたタンパク質またはペプチドから得 られた製薬学上の結果は、シグナルペプチドおよびアンカーペプチドなしの同じ タンパク質の発現から得られた結果と比較して、相当量に増強されている。一般 に、シグナルおよびアンカーペプチドとともに用いると、シグナルおよびアンカ ーペプチドを含有しないペプチドによって生み出される応答より少なくとも２倍 多い効果が生じる。好ましい例では、その効果は、５倍大きく、さらに好ましく は、少なくとも約１０倍大きく、ある場合には、その効果は、１００倍またはそ れ以上大きくさえなりうる。抗原については、この増強は、レシピエント宿主で 誘起された抗体の直接比較に基づいた方法で測定される。これらの抗体は、タン パク質／ペプチドのコア構造に向けられ、ＥＬＩＳＡによって定量される。本発 明の治療態様の場合に、目的のタンパク質の発現は、標準的な捕捉ＥＬＩＳＡで 特異的抗原を使用することによるか、または例えば、特異的な生物学的機能（例 えば、酵素活性または他の活性のような）を測定することによって定量できる。 本発明による発現ベクターでは、投与後、発現ベクターによって所望のタンパ クドメインをコードする核酸が患者中で発現される。完全なタンパク質またはそ の後患者で発現されるそれのサブフラグメントとしてペプチドは、患者に所望の 治療効果を供するか、またはワクチンのアプローチ法の場合には、抗原性タンパ ク質またはペプチドに対する体液性応答および／または細胞性応答を上昇させ、 その応答は、ワクチン接種した患者を、発現されたタンパク質またはペプチドを 含む微生物によるその後の感染から保護する効果を供する。本発明による好まし い態様では、発現ベクターは、数日間、数ヶ月または数年間にわたって、患者中 でタンパク質またはペプチドを発現し続け、したがって発現されたペプチドによ る患者の治療効果または免疫応答を強化する。 発現ベクターによって発現されるペプチドは、アンカーペプチドを含有する。 好ましい態様は、シグナルペプチドおよびアンカーペプチド配列をも有利に備え る。本発明によれば、発現したペプチドにシグナルおよびアンカーペプチドを付 加すると、予期せずに、発現されたタンパク質の患者での治療または免疫原性効 果が増強することが分かった。本発明により発現されたペプチドにシグナルおよ びアンカーペプチドを含ませると、そのペプチドを単独で生成するより、あるい はワクチンの場合には、単独またはアジュバントと組み合わせたときより明らか に治療または免疫原性の応答が大きくなることがわかったことは予期されたこと ではない。 本発明のワクチンの態様は、抗原性タンパク質またはペプチドの免疫原性効果 を増強するために、アジュバントを共に投与する必要がない点で従来技術より特 に優れている。本発明の免疫原性態様の場合には、発現ベクターによって発現さ れた抗原ペプチド配列に、発現されたペプチドとシグナルおよびアンカーペプチ ドを含ませると、シグナルまたはアンカーペプチド配列を含まない抗原性ペプチ ドによって生じる免疫原性応答より少なくとも２倍大きい免疫応答となり、また 、１００倍程度またはそれ以上大きい免疫原性応答になりうる。 感染疾患のワクチンを開発する上での最優先の問題は、保護抗原を正確に同定 し、それらを宿主に効果的に提示することにある。アジュバントの使用に左右さ れる製剤は、それらの使用を阻みうる有害な反応を起こす危険性がある。アジュ バントと共に使用される場合のみに有効であるワクチン製造は、免疫細胞に対す る提示が本質的に不十分であるものである。本発明では、提供される一般的手段 は、この欠点を克服する。ワクチンの製造の場合に、原形質膜で生産されたタン パク質を固定する手段により、感染した宿主細胞における正しい経路についての 遺伝子情報を含むということは、細胞が死滅する場合でさえ、宿主免疫細胞に対 する有用性を保証する。 患者での免疫原性応答を誘導し、または疾患に対して患者をワクチン接種する 疾患の治療方法も、本発明によって意図される。この方法では、患者が、所望の タンパク質またはペプチドを、指標の障害を治療する量で生成するか、あるいは 、発現されたタンパク質またはペプチドに対する免疫応答を生じさせるような目 的のタンパク質またはペプチドを発現するのに有効な量の発現ベクター、特にワ クシニアウイルスのベクターを患者に投与する。ワクチンの場合には、生じた免 疫原性応答は、好ましくは「実質的に保護的」であり、すなわち、そのワクチン は、疾患により患者が死亡することを含めて、その疾患のさらに重篤な症状や生 理学上の状態から患者を保護する。 本発明は、医薬製剤のような治療様式として、またはワクチンとしての発現ベ クターの投薬形態にも関する。本発明による投薬形態は、例えば、発現されるべ きタンパク質またはペプチドが正常に生産されない遺伝子疾患のような疾患を治 療するか、または疾患に対して保護効果を生み出すために、タンパク質またはペ プチドに対する免疫原性応答を誘導するのに使用できる。 患者に、ライム病（原因となるスピロヘータとしてボレリア・ブラドルフェリ （Borrelia buradorferi））、単純痘瘡、サイトメガロウイルスおよび肝炎（A 、 B、C等）のような中でも、特に細菌およびウイルス感染を含めた多数の微生物感 染に対するワクチン接種をする方法をも、本発明により意図される。この方法で は、免疫原性応答を生じるのに有効な量の発現ベクター、好ましくは疾患を起こ す微生物の抗原性タンパク質またはペプチドを発現する能力のあるワクシニアウ イルスベクターを投与することによって、患者に、微生物感染に対するワクチン を接種する。 本発明は、発現されたタンパク質またはペプチドとアンカーペプチドとの両方 を含むキメラペプチド配列にも関する。任意に、キメラペプチド配列は、発現さ れたタンパク質またはペプチド、アンカーペプチドおよびシグナルペプチドを包 含する。これらのキメラペプチドは、治療用または免疫原性製剤として、単独ま たは適切な発現ベクターからの発現後のいずれかとして利用することができる。 本発明は、自己免疫性疾患、合成されるタンパク質濃度が低いか又はタンパク 質がまったく生産されない遺伝性疾患、癌、ウイルス性感染、原生動物感染、他 の微生物感染を含めた多数の疾患に使用できる。本発明の詳細な説明 以下の語句は、本発明を説明するために、本明細書を通して使用される。 「患者」又は「被患動物」の語句は、哺乳類、特に本発明による投薬形態の発 現ベクターを投与されるヒト患者を含めた動物を示すのに使用される。本発明で は、発現ベクターは、所望のタンパク質またはペプチドをコードし、そのコード されたタンパク質またはペプチドを患者体内で発現する。発現されたタンパク質 またはペプチドは、治療上のまたは免疫原性効果を治療される患者に供する。 「キメラペプチド」または「キメラペプチド配列」の語句は、発現されたタン パク質またはペプチド、アンカーペプチドおよび／またはシグナルペプチドを包 含する本発明による天然に存在しないペプチド配列を示すのに使用される。この 語句を使用することによって注目されるとおりに、キメラペプチドは、このよう なシグナルおよび／またはアンカーペプチド配列と組み合わせて、所望の標的タ ンパク質またはペプチド、または標的タンパク質またはペプチドの一部（天然に は、シグナルおよび／またはアンカー配列との組み合わせては、通常は、存在し ない）を備える発現ベクターによって生産される合成ペプチドである。 「発現ベクター」の語句は、所望のタンパク質を発現または生産するために、 特定のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはそ れらの変異、さらに好ましくはＤＮＡ断片を含めた核酸を、患者、または患者の 組織に導入できる手段を示すのに使用される。このようなベクターとしては、所 望のタンパク質またはペプチド、及び、アンカーペプチド配列、任意に、シグナ ルペプチド配列をコードする核酸配列、宿主生物に（全ての要求されるかまたは 所望の操作要素によって）導入できるかまたは複製できる全てのベクターが挙げ られる。好ましいベクターは、真核細胞中でペプチドまたはタンパク質配列を発 現する能力があり、その制限部位がよく知られており、所望のタンパク質または ペプチド配列の発現に必要とされる作動エレメントを含むものである。本発明で は、ベクターは、哺乳類細胞に感染する能力を有し、宿主の生合成機構を利用し てタンパク質を発現または合成するワクシニアウイルスベクター、アデノウイル スベクターまたはヘルペスウイルスベクターであるのが好ましい。そのような場 合に、送達のために使用されるウイルスベクターは、細胞に感染するが、複製に よる溶解を引き起こさないもの（すなわち、同様の型のものの中でも、アデノウ イルス、ワクシニアウイルスおよびヘルペスウイルスから選択される弱毒化され たか、部分的に損傷のあるウイルス）であるのが最適である。 本発明でのベクター法によって、ベクターは、宿主細胞に感染し、宿主細胞の 生合成経路を用いて、そのベクターによってコードされたタンパク質またはペプ チドを合成する。詳細な遺伝的およびヒト用途に長年使われてきた全ての免疫媒 体は、本発明で発現ベクターとして使用できる。好ましい発現ベクターは、ウイ ルスベクター、さらに好ましくは、例えば Earl および Moss、Current Protoco ls in Molecular Biology、１６．１７．１〜１６．１７．１６、１９９３年お よび Smith および Moss、Gene、２５巻、２１〜２８頁、１９８３年によって記 載されたとおり、ワクシニアウイルスベクターである。しかし、上述の方法で使 用できる全てのワクシニアまたは他のウイルス性ベクターは、本発明に使用する のに適切である。経口的に投与される治療用製品の場合に、そのタンパク質の発 現が胃腸管で生じるとき、細菌の発現ベクター、例えばサルモネラ属（Salmonel la）の発現ベクターを使用することが好ましい。 所望のタンパク質またはペプチド配列を発現するために、発現ベクターは、少 なくとも１つのプロモーター、少なくとも１つのオペレーター、少なくとも１つ の終止コドン、および核酸をベクターから十分に転写、それに続いて翻訳するた めに必要である任意の他の配列を含有すべきである。これらの作動エレメントは 、当業者に公知である。本発明による好ましい具体例では、発現ベクターは、少 なくとも１つの選択可能なマーカー、および核酸（好ましくは、ＤＮＡ）配列の 転写を開始する能力のある少なくとも１つのプロモーター配列を伴う宿主生物に よって認識される少なくとも１つの複製の起点を適切に包含する。 「発現されたペプチド」、「発現されたポリペプチド」および「発現されたタ ンパク質」の語句は、疾患または症状を治療するか、または疾患に対する免疫原 性応答または保護効果を発生させるために、本発明による発現ベクターによって 発現される標的ペプチドおよびタンパク質を示すのに使用される。好ましい発現 されたタンパク質またはペプチドとしては、細胞表面の発現が重要な機能事象で あるあらゆるタンパク質またはペプチドが挙げられる。これらのタンパク質、ペ プチドまたはポリペプチドの全ては、正常に（すなわち天然に）はシグナルおよ び／またはアンカー配列との組み合わせでは見られない。標的ペプチドおよびタ ンパク質は、天然に見られるが、シグナルおよび／またはアンカー配列との組み 合わせでは存在しない。 本発明による好ましいタンパク質およびポリペプチドとしては、多数のものの 中でも、例えば、ホルモン、成長因子、凝血因子、酵素、神経タンパク質、アポ リポタンパク質、腫瘍サプレッサー、内因性または外因性腫瘍の抗原タンパク質 およびペプチドを含めた抗原、細菌表面タンパク質およびペプチド、ウイルス表 面タンパク質およびペプチド、原生動物細胞表面タンパク質およびペプチド、真 菌表面タンパク質およびペプチド、およびウイルス性逆転写酵素および関連のウ イルス性特異的酵素を含む寄生物質が挙げられる。他の好ましいタンパク質とし ては、インシュリン耐性の糖尿病の場合のインシュリンレセプター、ホルモンレ セプター、成長因子レセプターのようなレセプターが挙げられる。 「ワクチン」の語句は、有効な免疫学的予防法について意図される製品を示す のにこの明細書を通して使用される。本発明では、ワクチンは、哺乳類のような 動物に投与した後、疾患を起こす微生物から得られた抗原性タンパク質またはペ プチドを発現する発現ベクター、好ましくはワクシニアウイルス発現ベクターを 包含する。本発明によるワクチンを投与する方法は、変更可能であり、中でも静 脈内、バッカル(baccal)、経口、経皮および鼻内が挙げられるが、筋肉内または 皮下投与が最も一般的な投与方法である。ヒトまたは他の動物に対するワクチン を作るためのこの手段では、発現されるべき所望のタンパク質またはペプチドを コードするＤＮＡは、技術的に公知の一般的に入手可能な方法によって、または さもなければ詳細に後述するように、発現ベクターに組み込まれる。その後、ベ クターは、ワクチンとして免疫原性のある投与形態として配合され、上述の１つ またはそれ以上の方法によって患者に投与されて、疾患からその患者を保護する 。 「アミノ末端」または「Ｎ末端」および「アミノ端」の語句は、本発明による 発現されたタンパク質またはペプチドの一部（このような語句は、アミノ末端の アミノ酸を包含する）が、タンパク質またはペプチドのアミノ末端にあるか、ま たはそこに近傍することを示すのに使用される。シグナルタンパク質またはシグ ナルペプチドをコードする配列が見られるのは、発現されたタンパク質またはペ プチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ配列の５’末端かまたはその近傍であり （一般にタンパク質またはペプチドをコードする配列の５’末端から直接に上流 に、またはある場合にはわずかに上流にあり）、発現されたタンパク質またはペ プチドのアミノ末端である。 「カルボキシル末端」および「Ｃ末端」は、本発明による発現されたタンパク 質またはペプチドの一部（このような語句は、カルボキシル末端アミノ酸を包含 する）が、タンパク質またはペプチドのカルボキシル末端にあるかまたは付近に あることを示すために使用される。カルボキシル末端をコードするＤＮＡ配列は 、発現されたタンパク質またはペプチドをコードする配列の３’末端またはその 近傍にある。アンカータンパク質またはペプチドが一般に見られるのは、発現さ れたタンパク質またはペプチドのカルボキシル末端をコードするＤＮＡ配列のほ ぼ３’末端であり（一般にタンパク質またはペプチドをコードする配列の３’末 端から直接に下流に、またはある場合にはわずかに下流にあり）、発現されたタ ンパク質またはペプチドのＣ末端である。 ある種のワクチンでは、発現されたタンパク質またはペプチドのカルボキシル 末端、またはカルボキシル末端の近くにある領域は、そのようなタンパク質セグ メントに対して引き起こされうる免疫応答の特異性の程度によって、体液性およ び／または細胞性応答の開発のための所望の標的を現すことができる。したがっ て、本発明のワクチンで使用するためのある種の好ましい免疫原性のあるタンパ ク質またはペプチドは、完全な免疫原性タンパク質のカルボキシル末端またはカ ルボキシル末端の近くにある領域にある可能性がある。 「シグナルペプチド」、「シグナル配列」または「シグナルタンパク質」の語 句は、７〜３０単位のアミノ酸ペプチド配列、好ましくは約１５〜２６単位のア ミノ酸ペプチド配列を示すのに使用され、それは、本発明により患者でのタンパ ク質またはペプチドの生物学的活性を実質的に増強するために、本発明に使用さ れる発現されたタンパク質またはペプチドのＮ末端に、あるいは付近に一般的に 見られる。シグナル配列は、一般に約７〜３０アミノ酸単位の間、さらに好まし くは約１５〜２６アミノ酸単位、さらにいっそう好ましくは約１６〜２４のアミ ノ酸単位、最も好ましくは細胞内で膜にタンパク質鎖（一般に、分泌タンパク質 ）を標的にするのに必須であると思われる１８〜２０アミノ酸単位の疎水性ペプ チド配列を含有する。これらの疎水性配列は、細胞膜の脂質二重層を越えるのに 十分な長さであるものである。シグナル配列は、細胞の巨大分子の流通の指令塔 としての役割を果たす。これらのタンパク質は、膜を通してポリペプチド鎖を移 送する上で重要な役割を果たすと考えられる。本発明では、ワクチン接種した患 者によって発現されたタンパク質またはペプチドのアミノ末端にシグナルタンパ ク質配列を含ませるのは、発現されたタンパク質またはペプチドと関連した（免 疫原性の治療上の効果を含めた）生物学的活性における実質的な増強に関連する 。本発明では、技術上公知であるシグナル配列は、本発明に使用できる。例えば 、酵母またはより低次栄養段階生物目のシグナル配列を活用するのが可能である が、明らかに哺乳類のシグナル配列は哺乳類に使用するのに好ましく、特定種の シグナル配列が、治療されるべき所望の哺乳類種に使用するのに最も好ましい。 したがって、ヒトに発現されたタンパク質またはポリペプチドを提供する上で、 ヒトのシグナル配列は最も好ましい。 本発明に使用するためのシグナル配列は、一般に３つの領域を含む。すなわち 、非常に極性が高いが電荷を帯びていない、約５〜７アミノ酸残基を含むペプチ ドのカルボキシル末端にある第一領域あるいはｃ領域（シグナルペプチダーゼ酵 素のための切断部位として役割を果たす）と、一般に長さ約７〜１３のアミノ酸 残基をもち（主ににＬｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、および Ｔ ｒｐアミノ酸を包含するが、しかし、場合により、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒまた はＴｈｒアミノ酸残基を含む）、非常に疎水性の高い、ｃ領域に対してＮ末端側 にある第二領域あるいはｈ領域と、長さとその組成において可変性に富み、しか し一般にＮ末端及び任意の電荷を帯びた残基により正の荷電を帯びた（酸性残基 から供された負の荷電も知られている）第三領域あるいはｎ領域とを含む。ｃ領 域およびｈ領域の間は、小さくそして電荷を帯びていない１〜３アミノ酸残基（ Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、その他）である。ロイシン、イソロイシン、フェニル アラニン、バリン、アラニンおよびトリプトファン、好ましくは、ロイシン、イ ソロイシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を含む合 成ホモ重合性ｈ領域は、本発明によるシグナルタンパク質に使用してもよい。一 般には von Heijne、European Jounal of Biochemistry、１３３巻、１７〜２ １頁（１９８３年）参照。 本発明に使用されるシグナル配列は、好ましくは真核生物のシグナル配列、好 ましくは長さ７〜３０のアミノ酸単位、好ましくは１５〜２６単位、さらに好ま しくは約１６〜２６のアミノ酸単位、さらにいっそう好ましくは１８〜２０のア ミノ酸単位を包含する。本発明では、シグナルペプチドのｃ領域は、いっそう極 性であるべきであり、残基−５と−６、または−７と−８（シグナル配列の切断 の位置から計算して、すなわち、成熟または発現されたタンパク質またはペプチ ドの最初のアミノ酸は＋１である）の間のｈおよびｃ領域の間の境界は、小さく てそして電荷を帯びていない１〜３アミノ酸残基である（Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅ ｒ、その他）。アミノ酸についてのｈ／ｃでの好ましい位置関係は、以下の通り である。 −１０は、最も好ましくはロイシン、または、イソロイシン、バリン、アラ ニン、またはフェニルアラニンである。 −９は、最も好ましくはロイシン、または、イソロイシン、アラニン、バリ ン、 フェニルアラニンである。 −８は、最も好ましくはロイシン、または、イソロイシン、アラニン、バリ ン、グリシン、フェニルアラニンである。 −７は、最も好ましくはアラニン、または、ロイシン、イソロイシン、バリ ン、フェニルアラニンである。 −６は、最も好ましくはバリン、または、ロイシン、バリン、イソロイシン 、フェニルアラニン、アラニンである。 −５は、最も好ましくはプロリン、または、グリシン、アラニン、ロイシン 、バリンである。 −４は、最も好ましくはグリシン、または、プロリン、ロイシン、アラニン 、バリンである。 −３は、最も好ましくはアラニン、または、バリンである。 −２は、最も好ましくはロイシン、または、フェニルアラニンである。 −１は、最も好ましくはアラニン、または、グリシンである。 本発明に使用されるシグナル配列では、ｈ領域は、長さをも変更可能である。 ｎ領域は、極性であり、正の電荷を帯びたアミノ酸（主にリジンおよびアルギニ ン）を含有し、上述のとおりシグナルペプチドの全長で変化する。ｃ領域は、シ グナルペプチド／発現または成熟タンパク質の残基−１から−５まで伸長する。 ｃ、ｈおよびｎ領域の位置の点では、ｃ領域は、発現または成熟タンパク質に対 するＮ末端にあり、ｈ領域は、（ｃおよびｈ領域の間の１〜３アミノ酸境界を有 する）ｃ領域に対してＮ末端にあり、ｎ領域は、ｈ領域に対して正の電荷を帯び たＮ末端にある。要するに、ｎ領域は、長さにおいて変更可能で、一般に正にの 電荷を帯び（好ましい電荷は＋２）、ｈ領域は、疎水性であり、長さにおいて変 更可能で、ｃ領域は、好ましくは約５（５〜７）の一般的に極性のアミノ酸を含 む。 疎水性ドメインの末端（すなわち、上記の数を付けられた疎水性残基の間の境 界）は、好ましくは位置−６／−５にあるべきである。全般的に、シグナル配列 は、５から１０単位の残基の開始配列（メチオニンで始まる）を、続いて少なく とも７残基の配列（上述のとおり）および１〜１０残基の長さの追加のアミノ酸 を包含すべきである。上述の領域についての代表的な配列は、次のとおりである 。 ＩＬＬＬＬＡＶ 使用されるシグナル配列は、タンパク質の発現に使用された細胞型の特徴を示 す。したがって、獣医学上の用途では、使用されるシグナル配列は、特質に合っ て哺乳類であるべきである。ほとんどの哺乳類のシグナル配列は、他の哺乳類細 胞中でタンパク質またはペプチドを発現する際に相当な有効性を示す。ヒトのシ グナル配列は、ヒトに使用するために使用されるのが好ましい。 「アンカータンパク質」または「アンカーペプチド配列」の語句は、一般にホ スファチジルイノシノトールを含有するグリカンに結合する共有結合によって原 形質膜の外側表面にしっかりと固定されたタンパク質またはペプチドを示すのに 使用される。アンカータンパク質またはペプチドが結合されるこれらの構造は、 グリコシルホスファチジルイノシトールすなわちＧＰＩとしばしば称される。全 ての細胞では、ＧＰＩに共有結合したアンカータンパク質は、細胞の原形質膜の 外側面に、または分泌小胞のラメラ表面に見られる。 本発明では、「アンカータンパク質」または「アンカーペプチド」は、一般に 本発明による発現ベクターによって発現されたタンパク質またはペプチドのカル ボキシル末端（所望のタンパク質またはペプチドを発現するＤＮＡ配列の３’末 端、および発現されたタンパク質またはペプチドのカルボキシル末端）で発現さ れる好ましくは長さで約１５〜３５の残基のペプチド配列を包含する。 本発明では、患者に発現される多くのタンパク質またはペプチド、特に患者に 発現される本発明によるワクチンの免疫原性タンパク質またはペプチドは、アン カーペプチドがそのタンパク質またはペプチドのカルボキシル末端に組み込まれ た場合に、実質的に増強される患者体内の生物学的または免疫原性応答を生じる 。発現されたタンパク質のカルボキシル末端にあるアンカーペプチドに加えて、 Ｎ末端に、あるいはその近くにシグナルタンパク質を含ませることは、発現され たタンパク質の生物学上の効果について予測できなかった増強に関連する。これ は、発現されたタンパク質が、天然に抗原性または免疫原性であることは特に正 しいことを示す。 発現されたタンパク質またはペプチド残基のカルボキシル末端は、細胞表面に 修飾タンパク質またはペプチドをしっかりと固定する役割を果たす糖脂質アンカ ーの付着によって修飾される。ＧＰＩアンカーが添加されるペプチド残基は、常 に、グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリンおよびシステ インのような小さなアミノ酸の１つである。これらは、目的のタンパク質／ペプ チドのカルボキシル末端に生じ、したがって、目的のタンパク質／ペプチドを特 定するｃＤＮＡ配列に加えられるべきＤＮＡ断片中の適切なコドンを挿入するこ とによって設定できる。さらに、アンカーの付加部位の下流の２残基は、通常に 小さい。 切断／アンカー付加部位は、３つの小さなアミノ酸残基のドメインに存在する が、３つの残基の中心は、空間的な配置に対する要求が厳しくないことを示す。 タンパク質／ペプチド標的のカルボキシル末端に、または付近にある機能的にま たは免疫学的に重要なアミノ酸が損傷がないことを確実にするため、総数１０の 残基まででなる数種の付加のアミノ酸（好ましくは、スレオニン、アラニンおよ びプロリンと同様にリシンまたはアルギニンのような極性のあるもの）がカルボ キシル末端にあるような方向で挿入される。付加したシグナル配列の残りは、先 端のカルボキシル末端に疎水性ドメインを有する１５から３５のアミノ酸を含有 する。このドメインは、１５〜２５のアミノ酸に拡大し、バリン、ロイシン、イ ソロイシン、アラニン、フェニルアラニンのようなアミノ酸を含みうるが、トリ プトファンと同様にプロリンおよびグリシンも含有できる。典型的なこのような 配列は、以下の通りである。 TACDLAPPAGTTD AAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETATAP この小さな配列は、左側部分のボールド体はタンパク質の末端を表し、Ｄ残基 はＧＰＩ付加の部位を表す。右側部分は、ＧＰＩ付加の間に切断される配列であ り、疎水性末端は下線付きで示す。 本発明では、アンカーペプチドは、切断可能なＮ末端配列を有すことができ、 ＧＰＩアンカーが付加される小胞体および細胞通路経路(cellular trafficking pathway)にペプチドを向ける。上述の通り、アンカーペプチドは、一般に約１５ から約３５まで、さらに好ましくは約１５から３０、さらにいっそう好ましくは 約１５から２５のアミノ酸残基のサイズの範囲にある一番末端のカルボキシル末 端に優先的に疎水性の配列も有し、ＧＰＩアンカー付加を信号で伝え、ＧＰＩ付 加と同時に切断される。アンカー付加に重要であるのは、自身の配列よりむしろ 疎水性である。基本的に、少なくとも約１５から約３５、さらに好ましくは約１ ５から３０アミノ酸残基のあらゆる疎水性アミノ酸配列は、ＧＰＩアンカーの付 加を行う能力がある。アンカー付加は、一般にＧＰＩ前駆体の遊離のエタノール アミンのアミノ基が、Ｃ末端アミノ酸になる標的アミノ酸のペプチド結合を（求 核付加の方法によって）攻撃するアミド転移反応である。 一般に、発現されたアンカーペプチド配列では、ＧＰＩアンカーが付加される 疎水性配列のちょうど上流は、親水性アミノ酸を含有する親水性スペーサー（通 常約５〜１０残基）である。ＧＰＩアンカーが付加される残基（「アンカー付加 部位」）は、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、アスパラギン、アラニン 、セリンおよびシステインからなる群から選択されるその親水性スペーサー内の アミノ酸残基である。さらに、アンカー付加部位から下流の２つの残基は、アン カ ー付加部位で明らかに立体障害を最小限にする通常に小さなアミノ酸残基でもあ る。 ＧＰＩ部分は、予め組み立てられそして発現されたタンパク質またはペプチド のカルボキシル末端の近くの特定のアミノ酸残基に単独単位として付加されるの が好ましい。したがって、カルボキシル末端領域は、好ましくは長さ１０から３ ０のアミノ酸であり、ＧＰＩアンカーを付加するのに必要とされる情報を提供す るＣ末端のシグナルペプチドの存在によって特徴づけることができる。ＧＰＩ構 造が装着される実際のアミノ酸残基は、オメガ部位と呼ばれ、この残基は、グリ シン、アラニン、システインン、セリン、アスパラギンまたはアスパラギン酸で あるべきである。オメガ＋１部位（発現したプロセッシングされていないタンパ ク質のカルボキシル末端に向かって）は、グリシン、アラニン、システイン、セ リン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタメートおよびスレオニンから選択 されるのが好ましい。オメガ＋２部位は、アラニンまたはグリシンである。オメ ガ＋２部位は、好ましくは電荷を帯びたアミノ酸およびプロリンを含む理想的に は５から７のアミノ酸のヒンジまたはスペーサーに続く。これは、好ましくはカ ルボキシルシグナルペプチドを終止する疎水性配列にすぐに続く。 そのアンカーペプチドの全般的構造は、発現されたタンパク質またはペプチド のカルボキシル末端にある１５〜３５のアミノ酸ペプチドとして要約されうる。 このアンカーペプチド配列（アミノ末端に向かってその末端から読む）は、種々 の長さのアミノ酸の疎水性伸縮部で始まり、好ましくは電荷を帯びた残基を含む ５〜７アミノ酸の配列に続き、３つのアミノ酸（オメガ＋２部位にグリシンまた はアラニンのいずれか）に続くか、＋１オメガ部位にグリシン、アラニン、シス テイン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタメートおよびスレオニ ンのいずれか、オメガ部位にグリシン、アラニン、セリン、システイン、アスパ ラギン酸またはアスパラギンのいずれかに続く。 本発明では、シグナルペプチド配列は、一般に発現されたタンパク質またはペ プチドのＮ末端で見られ（Ｎ末端で直接に、またはＮ末端から１０００またはそ れ以上のアミノ酸を除いて）、アンカーペプチド配列は、一般にカルボキシル末 端に見られる一方で、そのシグナルペプチドは、発現された標的タンパク質また はペプチドのカルボキシル末端で、またはその近くに見られることがわかった。 本発明では、本技術分野で公知のアンカー配列は、本発明に使用できる。例え ば、酵母またはより低次栄養段階生物目のアンカー配列を利用することが可能で あるが、明らかに哺乳類のアンカー配列は、哺乳類に使用することが好まれ、特 定の種のシグナル配列は、治療されるべき所望の哺乳類種に最も好ましい。した がって、ヒトに発現されたタンパク質またはポリペプチドを供するときに、ヒト アンカー配列が最も好ましい。 「有効量」の語句は、疾患を治療するのに治療的に有効であるか、または疾患 に関して保護的免疫原性のある応答を生じる、すなわち疾患に対して患者にワク チン接種する免疫原性的に有効である多くのタンパク質またはペプチドを発現ま たは生成するのに有効な組換え発現ベクターの量または濃度に該当する。一般に 、患者に投与される有効量の発現ベクターは、その患者が、発現されるべきペプ チドまたはタンパク質のいずれかを生成するかどうか、またはその患者を、免疫 原性反応が所望されるペプチドまたはタンパク質に予めさらすかどうかを含めた その患者に関連した多くの因子によって変化する。ワクシニアウイルスの有効量 は、生成物の用量を変えること、生成されたタンパク質またはペプチドの生じた 濃度を測定することによって決定できる。ワクチンの場合には、細胞性免疫およ び体液性免疫および／または治療応答は、投与前に測定できる。一般的に、ヒト では、有効量の組換え発現ベクターは、広い範囲を越えて変化でき、一般に、ウ イルス性ワクシニアベクターの場合でのように、有効量は、およそ１０³から約 １０⁸のプラーク形成単位、さらに好ましくは約１０⁴〜約１０⁷のプラーク形成 単位を示 す。ワクチンの場合には、好ましい有効量は、約１０⁴〜約１０⁷のプラーク形成 単位、さらに好ましくは約１×１０⁶〜約５×１０⁶のプラーク形成単位の範囲に ある（ここに記載されるとおり、アッセイによって測定される）。上述の範囲の 投与ワクシニアウイルスは、十分量のタンパク質またはペプチドを毒性のある反 応を生じずに生成する見込みを増進するために選択されることが注目される。ワ クチンの場合には、有効な濃度は、ワクチン接種される予定である患者に重度の 感染を起こさせることなしに免疫原性応答を引き起こす能力のあるものである。 キメラペプチドが、疾患を治療するのに治療的に有効であるか、または疾患に 対する保護的免疫原性のある応答を生じる、すなわち疾患に対して患者にワクチ ン接種するのに免疫原性的に有効である量で、発現ベクターよりむしろ、直接投 与できることが示される。 本発明の方法に用いる場合に、所望の標的ペプチドまたはタンパク質が最初に 同定され、その後投与された発現ベクターによって最後に発現される特定のアミ ノ酸配列を決定するために配列決定する。適切なアミノ酸配列は、現在当業者が 一般に入手可能な標準的な配列決定技術を用いて、単離タンパク質またはペプチ ドから十分に得ることができる。または、現在入手可能な配列は、例えば、中で もＧＣＧおよびブルックヘブン（Brookhaven）のデータベースを含めた多くのデ ータベースから得ることができる。使用される標的ペプチド断片は、単離タンパ ク質から得られたアミノ酸配列から容易に得ることができる。 標的タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を同定した後、対応する核酸断 片（一般に、ＤＮＡ断片だが、これに限らず）がその後合成される。使用される べきシグナルペプチド配列およびアンカーペプチド配列についても同様である。 発現されるべき所望のタンパク質またはペプチド配列に対応する所望の核酸配列 を生成する上で、当業者には、十分知られた技術を使用することができる。ＤＮ Ａ断片を合成するための核酸合成機および技術は、当業者には現在十分に入手可 能であり、これらは、例えば当業者に、発現されるべきタンパク質またはペプチ ドの公知のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を合成させることが十分にできる 。 制限消化断片を含む適切なＤＮＡ配列を合成した後、その断片をクローン化し 、その後結合されるか、または、ライゲーションし、その後クローニングベクタ ーに挿入する。発現されるべき標的タンパク質またはペプチド、アンカーペプチ ド配列およびシグナルペプチド配列に対応するＤＮＡ断片は、最初にクローン化 され、増幅後結合されることが好ましい。増幅のために適量のＤＮＡを生成する のに使用できるクローニングベクターとしては、例えば、中でも以下のクローニ ングベクター、すなわち、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ３ｚ、ｐＳＰ７０、ｐＳＥ４ ２０、ｐＲＳＥＴ、ラムダＺＡＰが挙げられ、全て市販されている。このような 制限消化断片は、真核生物または原核生物源から単離されるクローンから得るこ とができる。 適切なＤＮＡ配列（単独で、または、アンカーペプチド配列、任意にシグナル 配列と組み合わせて、発現されるべきタンパク質またはペプチドのいずれか）を 適切なクローニングベクターでクローン化し、ゲル電気泳動または関連の方法を 用いて単離し、その後増幅ベクターに組み込むことによって増幅される。所望の ＤＮＡ配列も、所望の量のＤＮＡを得るために十分多くのサイクル（所望される ＤＮＡの量によって、約５サイクルから約４０サイクルまたはそれ以上）の標準 的ポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅できる。アンカーペプチド配列および任 意にシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡは、発現されるべき所望のペプチ ドまたはタンパク質を含有するベクターに組み込むことができ、ＰＣＲおよびエ ンドヌクレアーゼ消化によって陽性クローン中の適切なＤＮＡ断片を同定した後 （選択およびスクリーニング）、同じ技術を用いてそれ相当に増幅される。 増幅後、好ましくはＤＮＡの形態で、核酸は、転写ベクターに組み込まれ、真 核細胞、例えばサルの腎臓細胞（ＢＳＣ−１細胞）で、野生型のワクシニアウイ ルス（ＷＲ）をトランスフェクトされ、組換えワクシニアウイルスを生成する。 組換えワクシニアウイルスは、その後増幅前に精製される。増幅後、場合によっ ては、さらなる精製後、所望のタンパク質またはペプチド、好ましくはアンカー ペプチド、任意にシグナルペプチドと組み合わせて、発現する治療または免疫原 性のある投与形態として、組換えワクシニアウイルスをその後動物に投与する。 アンカーペプチド配列、任意にシグナルペプチド配列と、他の作動エレメント と組み合わせて所望のタンパク質またはペプチドに対応する１コピー以上のＤＮ Ａ配列を組み込むことが好ましいことに注目すべきである。この方法では、アン カーペプチドおよび都合によりシグナルペプチドと組み合わせて、同じ標的タン パク質の複数のコピーが発現できる。ある具体例では、内部リボソーム挿入部位 すなわちＩＲＥＳ(internal ribosomal entry site)の制御下で、所望のタンパ ク質またはペプチドとアンカーペプチドとを発現させることによって、複数のタ ンパク質を、単鎖のポリシストロニックベクター中で発現させることができる。 例えば、Mollaら、Nature、１９９２年、３５６巻：２５５頁；Jangら、J．of V irol．、１９８９年、２６３巻：１６５１頁参照。このアプローチ法を用いて、 発現されたタンパク質の量は、相当に増加できる。 いったん免疫原性のキメラタンパク質をコードする核酸配列が、適切な発現ベ クターに存在すると、発現ベクターは、その後治療的または免疫原性投与形態で 使用でき、または、そのベクターは、免疫原性キメラタンパク質を適切な真核細 胞系で発現させる、例えば宿主動物の外側に所望のペプチド配列の生成を促進す る目的に使用できる。このような真核細胞系としては、例えばHeLa、L929、T2ま たはRMA-2、好ましくはT2またはRMA-Sが挙げられる。この方法では、発現ベクタ ー(類)を含有する細胞が増殖され、その後、アンカーペプチド配列と任意にシグ ナル配列と組み合わせて、所望のタンパク質またはペプチド配列を含有する合成 ペプチドを単離するために溶解される。単離ペプチド配列は、その後治療または 免疫原性投与形態で直接使用できる。あるいは、発現ベクターは、患者に直接投 与され、そこで、発現ベクターは所望のタンパク質またはペプチドやアンカー配 列を発現し、意図した治療または免疫原性効果をその患者に与える。 発現されたタンパク質は、中でもゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラ フィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィー、分別沈降法、分子ふるい クロマトグラフィー、等電点およびイオン交換クロマトグラフィーを含みうるこ とができる技術的に公知の標準タンパク質精製手段によって、細胞が溶解された 後に細胞培養物から得ることができる。免疫アフィニティークロマトグラフィー の場合には、タンパク質またはペプチドは、少なくともタンパク質またはペプチ ドの一部に特異性のある抗体を結合した樹脂を含有するカラムを通すことによっ て精製することができる。 細胞培養物から得られるアンカーペプチド配列、任意にシグナルペプチド配列 を含有する発現されたタンパク質またはペプチドは、粗溶解物を細胞培養から精 製することによって、そのような治療の必要性な患者に純粋または実質的に純粋 な形態で投与できる。発現されたタンパク質は、製薬上許容しうる添加剤、担体 またはレシピエントと組み合わせて、アンカーペプチド配列、任意にシグナルペ プチド配列を含み、治療的にまたは免疫原性的に有効量の発現されたタンパク質 を包含する組成物または配合物として製薬学上の投与形態で投与されるのが好ま しい。製剤は、技術的に公知の方法で製造された単位投与形態で送出できる。投 与される発現されたタンパク質またはペプチドの量は、製薬動態パラメーター、 治療される疾患の重篤度または所望の免疫原性応答によって変化する。もちろん 、用量は、患者の年齢、体重および症状を含め、免疫原性用量形態の場合には、 患者が、本発明の製薬上の用量形態から発現されたタンパク質の放出特質と同様 にワクチン接種されるべき疾患を招く微生物に予めさらされたかどうかを含めて 、処方する医師の考慮すべき関連因子によって設定される。 本発明によって投与される発現されたタンパク質の量は、意図した効果を生じ るのに有効な量を含む。治療用量の場合には、意図した効果は、タンパク質また はペプチドの欠陥や、そのような欠陥が生じる生理学的徴候を実質的に減少また は削除することである。免疫原性の発現されたタンパク質またはペプチドを投与 する場合には、意図した効果は、感染に実質的に保護的効果を提供する患者での 免疫原性応答を得ることである。 本発明によるある種の好ましい具体例では、発現ベクターは、好ましくは組換 えワクシニアウイルスの形態で、直接患者に投与される。発現ベクターを直接患 者に投与することによって、ベクターは、標的タンパク質またはペプチドを直接 患者に生じ、したがって、標的タンパク質またはペプチドを連続に投与する必要 を減少または削減する。この実施例では、患者に投与される組換えワクシニアウ イルスの量は、患者での治療または免疫原性応答を提供するために十分なタンパ ク質またはペプチドを発現するのに有効な量である。発現されたタンパク質また はペプチドは、シグナルおよびアンカーペプチドを含まないタンパク質またはペ プチドと比較して、発現されたタンパク質またはペプチドの治療効果および／ま たは免疫原性を実質的に増加するために発現ベクター中のアンカーペプチド配列 などにより、シグナルペプチド配列と一緒にされる。本発明の治療用途は、発現 されたタンパク質またはペプチドの欠陥と関連した生理学上の効果を実質的に削 除する上で治療効果を提供し、一方で本発明の免疫原性態様は、感染に対して保 護効果を提供する。 本発明による医薬組成物は、有効量のタンパク質またはペプチドを包含できる か、または、実質的に純粋な形態で、または、医薬上許容しうる添加剤、担体ま たは賦形剤と組み合わせて、有効量の発現ベクターを包含できる。組成物は、直 接投与でき、または投与の都合により、製薬上許容しうる添加剤、賦形剤または 担体に添加できる。適切な製薬学上許容しうる担体は、当業者にとって明らかで あり、低分子量アルカロイド、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、 およびプロピレングリコールのようなポリアルカロイド、並びに非極性担体を含 めた水および他の極性物質が挙げられる。抗吸収剤を含めた安定化剤および他の 添加剤は、本発明の医薬組成物に効率よく使用できる。 本発明による医薬組成物を生成する際に、有効成分は、一般に医薬上の添加剤 、賦形剤または担体と均質で安定した関係になり、一般に液体、懸濁液または固 体として単位用量形態に置かれる。非経口的に、例えば、筋肉内に、静脈内に、 皮下に、または腹膜組織内に投与される溶液または懸濁液は、一般に患者または レシピエントの血液に等張である。そのような処方は、塩化ナトリウム、他の塩 類、アミノ酸等のような生理学的に適合した物質を含み、生理学上の溶液と適合 した溶液のｐＨを緩衝する水に有効成分を溶解することによって製造できる。投 与形態は、無菌形態で投与される。無菌溶液は、医薬組成物の成分または効果に 実質的に衝撃を加えることなしに、製品を汚染するかもしれないあらゆる微生物 を取除くように設計される濾材を通して溶液を濾過することによって製造できる 。 本発明は、特に発現されたタンパク質に直接投与することに関する場合（すな わち、患者体内でタンパク質またはペプチドを生成する発現ベクターの形態にな い）、活性の開放を制御する手段で投与できる。制御された徐放製品の製造は、 医薬上適合しうるポリマーを使用することを通して、またはタンパク質またはペ プチドあるいはそれらの誘導体を複合するかまたは吸収するためにポリマーを混 合するか、または中でもマイクロカプセル、リポソーム、アルブミンマイクロス フィアーおよびマイクロエマルジョンに取り込むことによって達成できる。 経口製品は、しょ糖、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、スターチ、ア ラビアゴムのようなゴムを含めた種々の炭化水素、アルギンおよびカラギナンや 、中でもメチルセルロースおよびヒロドキシプロピルセルロースのようなセルロ ースエステル類のような典型的な経口担体で有効成分を混ぜることによって製造 さ れる。 発現ベクターを投与する場合に、投与の経路は、筋肉内、皮下、腹膜組織内お よび経口でさえよいが、静脈内であるのが好ましい。発現ベクターの用量、好ま しくは担体と一緒に投与される本発明による組換えワクシニアウイルスは、しば しば、単独（併用投与なしで）で投与される量とおよそ同じである。発現ベクタ ーは、実質的に純粋な形態で、または核酸に親和性を示す物質および核酸に親和 性を示す物質に結合したインターナリゼーション因子との複合体として投与でき る。例えば、Wuら、J．Bio．Chem．、２６２巻、４４２９頁（１９８７年）およ びＷａｇｎｅｒら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、８７巻：３６５５頁（１９９ ０年）参照。ポリリジンのようなポリカチオンは、投与用の発現ベクターと複合 化できる。細胞上のある種のレセプターに特異性を示すリガンドのようなインタ ーナリゼーション因子は、投与の時に所望しうる標的細胞に発現ベクターを向け て行うことができる。インターナリゼーション因子としては、例えばトランスフ ェリンおよび発現ベクターが望まれるとおりに標的にされる細胞表面タンパク質 に特異的である抗体を挙げることができる。 投与された発現ベクターの用量は、患者の年齢、体重および症状を含め、免疫 原性用量形態の場合には、患者が、ワクチン接種されるべき疾患を招く微生物お よび本発明の製薬上の用量形態から発現ベクターの放出特質に予めさらされたか どうか、を含めて、処方する医師の考慮すべき関連因子によって設定される。 本発明の免疫化またはワクチン態様では、発現ベクター、好ましくはワクシニ アウイルスの用量は、それが投与される形態に左右される。例えば、ワクチンは 、一般に、発現免疫原性タンパク質の所望されるレベルによって、約１０⁴〜約 １０⁷プラークの形成単位の範囲にある濃度のウイルスを含む。したがって、本 発明のワクチンに含まれるワクシニアウイルスの濃度または量は、一般にこの範 囲内に入る。しかし、あらゆるワクチン形態で使用された組換えワクシニアウイ ルスの 量は、引き起こされた免疫原性応答の強度に左右される。 本発明の治療態様では、発現ベクター、好ましくはワクシニアウイルスの用量 は、一般に所望される発現されたタンパク質の濃度（通常は、疾患の重篤度およ び発現されるべきタンパク質の型に左右される）、いずれかの付与されたベクタ ーが生成できるタンパク質またはペプチドのコピーの数または濃度による範囲内 にある。一般に、本発明のこの治療態様でワクシニアウイルス発現ベクターの場 合には、濃度は、一般に約１０⁴〜約１０¹⁰のプラーク形成単位、より好ましく は約１０⁶〜約１０⁷のプラーク形成単位の範囲内にある。本発明のこの治療態様 では、発現ベクターの濃度は、もちろん、発現されたタンパク質またはペプチド の所望の濃度範囲によって、ワクチン態様でよりさらに高い可能性がある。 発現ベクター、特に、示されたワクチン用量でのワクシニアウイルスの量を測 定するときに、以下の方法が使用できる。ある種のワクチン用量形態では、上述 されたとおり、標準医薬上の担体が包含することができる。ワクチンに含まれる ウイルスの比は、意図された用量と同様に、ウイルスの化学的特性、溶解性、お よび安定性に左右される。腹膜組織内、筋肉内、皮下、乳房内または他の経路の ようなこのような非経口経路を介して非経口投与または注入として、ワクシニア ウイルスの無菌溶液が製造される。本発明によるワクチンは、静脈内に投与する こともできる。好ましくは、本発明によるワクチンは、皮下経路を介して投与さ れる。 使用されるワクチンの用量および治療計画は、この一般的な治療の方法が行わ れる他のワクチン接種または治療養生のために通常に使用される診療を行う。１ つ以上の治療用量またはワクチンが、最初に必要とされることは予想されないが 、ワクチンの場合には効能促進剤を提供する可能性が予想される。好ましくは、 ほとんどの微生物に免疫化するための用量計画は、少なくとも約１×１０⁶のワ クチンのプラーク形成単位の皮下注射を包含する。 本発明による治療方法で、ヒト患者に有効量の発現ベクター、好ましくは、組 換えワクシニアウイルスを投与して、それでアンカーペプチド配列および都合に より、シグナルペプチド配列と組み合わせた標的タンパク質またはペプチドの発 現が行われる。ある例では、組換えワクシニアウイルスの付加的なブースターは 、治療または免疫原性応答を促進するために行われる。組換え組換えウイルスの 付加用量は、必要であれば、初期接種を増大するために提供できる。 本発明は、好ましい具体例として、シグナルペプチド配列およびアンカーペプ チド配列の両方を、発現されたタンパク質またはペプチドに組み込むことを意図 する。この組み合わせは、標的タンパク質またはペプチドに治療および免疫原性 応答を生じる際に特に有効に見られる。シグナルペプチド配列は、アミノ末端で 、またはの近くで標的タンパク質またはペプチドに組み込まれるのが好ましく、 アンカーペプチドは、一般にそのタンパク質またはペプチドのカルボキシル末端 で、または近傍に組込まれる。組換え発現ベクター、好ましくは組換えワクシニ アウイルスを投与した後、そのタンパク質またはペプチドは、てベクターによっ て発現され、シグナルペプチド配列およびアンカーペプチド配列を含む。したが って、本発明では、シグナルおよびアンカーペプチドは、それぞれ、発現された タンパク質またはペプチドのアミノおよびカルボキシル末端で発現されるのが好 ましい。したがって、好ましい具体例では、シグナルペプチド配列は、発現され たタンパク質またはペプチドから上流に位置し、アンカーペプチドはそのタンパ ク質またはペプチドから下流にある。 以下の実施例は、例示することのみを目的として示すものであり、本発明の範 囲を限定することを意図するものではない。 例例１ 単純ヘルペス ウイルスに対する中和抗体は、優性抗原として機能する２つの糖タンパク質 （糖タンパク質ＢおよびＤ）を有するウイルスの表面糖タンパクを認識すること が立証された。組換え糖タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞で生成され、直接的な抗原投与に対してモルモットを保護する方法を提供す ることが示された。保護の程度は変化し、一般にフロイントアジュバントに左右 されるため、ヒトに使用するのを阻む。 公知の抗原的に有効なヘルペス糖タンパク質のクローン（ｇＢ１／ｇＢ２）は 、入手可能である。この用途では、（発現糖タンパクのＮ末端に有効に挿入する ための）ＤＮＡの５’末端における哺乳類のシグナルペプチド、および、そのＤ ＮＡの３’末端にアンカーペプチドを付加することによって、ヘルペスウイルス の糖タンパク質Ｂの情報をコードするクローン化ｃＤＮＡが増大される。あるい は、ヘルペスタンパク質ｇＫをコードするｃＤＮＡも使用される。これは、存在 する５’配列との相同性および制限エンドヌクレアーゼのための限定された範囲 の切断部位をもたらす特定の糖ヌクレオチドを使用することにより、５’配列の 初期伸長によって行われる。ｃＤＮＡの３’末端に、そのタンパク質のカルボキ シル末端にグリコシルホスファチジルイノシトール鎖を付加する酵素系によって 認識されるアミノ酸（アンカー配列）をコードする配列を付加するのに同様の攻 略法が使われる。この後者の場合に、その制限部位は、その配列の３’末端に位 置する。処理されたｃＤＮＡ構築物は、その後、当業者には公知の技術を用いて 、適切な転移ベクターまたは宿主生物にライゲーションされる。適切な移転ベク ターは、ワクシニアウイルスの産生に利用できるもの、例えばｐＳＣ６５である 。適切な宿主生物は、直接経口投与に適切なビヒクルを調製するレシピエントと して利用できる腸内生物であってもよい。 組換えワクシニアウイルスは、その後、目的のｃＤＮＡ構築物に加えてワクシ ニゲノムの非必須領域に相同性を有する配列と選択可能なマーカーをコードする 配列と有する転移ベクターと、野生型のワクシニアウイルスとを共に、哺乳類宿 主細胞（ＢＳＣ−１のような）、好ましくはヒト宿主細胞を共感染することによ って製造される。標準法を利用して、組換えウイルスが単離できる。これは、ヒ ト宿主に接種すると、細胞に感染し、ヒト免疫系の細胞とのそれの作用を最大限 にする形態でヘルペス糖タンパクの産生を起こす。ワクシニアは、宿主免疫細胞 に局部的な「救援」シグナルとして働き、それによってアジュバントに対する必 要性を不要にする。目的のタンパク質へのシグナルおよびアンカーの付加は、免 疫細胞との相互作用に適切な向きで、細胞の分泌経路の適切な推移および感染細 胞の表面に最終分子産物（例えば、糖タンパクＢ）の位置決めを確保する。例２ サイトメガロウイルス 妊娠前に免疫の獲得は、有害な影響の発生を急速に減少する。感染した個体が 、体液性および細胞性成分の両方を含む免疫応答を上げることができることが立 証された。治験は、抗原としてウイルス弱毒た株で行った。アジュバントと組み 合わせてタンパク質抗原を投与することによって保護を供する試みがなされた。 この例では、ウイルス性タンパク質についての遺伝的情報に加えて、単純ヘル ペスに示されるシグナルおよびアンカー配列の組合わせを含む組換えベクターが 構築され、その上、宿主免疫系に正しいトラフィキング（trafficking）および 接近法を保証する。 発現ベクターに組み込むために選択されるタンパク質は、ｇBである。これは 、ウイルスのよく知られた免疫応答を提供し、異なるウイルス株でも高度に保存 されている点で有利である。このタンパク質のためのｃＤＮＡは、入手可能であ り、昆虫細胞で予め完全に発現されている。 単純ヘルペスについて上述される一般的攻略法は、ｇＢ ｃＤＮＡについて行 われる。ウイルスのシグナル配列のための５’末端での領域が取除かれ、哺乳類 のシグナル配列をコードするものに置換される。これは、ヌクレアーゼ消化、目 的の配列および不可欠の重複を含む合成オリゴヌクレオチドとのライゲーション 、 組換え産物の選択、および、ＧＰＩアンカーを加エタンパク質に付加するのに必 要な情報を供する配列の３’末端でのさらなる修飾によって達成される。これは 、正常な３’末端における先端の切断、所望の配列をコードするオリゴヌクレオ チドの付加、及び、正常な３’未翻訳領域の伸長によって、シグナル配列を取り 込むことに関してほとんど同じ方法で達成される。 （細菌ベクターのようなワクシニアまたは経口ベクター中の）最終の構築物は 、それぞれ、シグナルおよびアンカー配列の５’および３’付加を伴うｇＢタン パク質のためのコーディング配列を含有する。投与のために選択されるビヒクル は、ウイルス性または細菌性であることが可能である。皮下投与には前者が好ま しく、後者は経口投与に好ましい。例３ 肝炎 Ｂ型肝炎表面抗原（ｒＨＢ、特にＨＢＡｇ）ｃＤＮＡの組換えクローンは、入 手可能であり、再操作ワクチンの製造用の出発物質を成形する。または、上述さ れた他のスプライシングおよび組立て技術を利用して、シグナルおよびアンカー 配列の５’および３’付加を伴うｒＨＢｓをコードするＤＮＡをそのゲノムの一 部として含有する送達用生物が、構築される。組換えベクターを有する宿主動物 (家畜またはヒト)の接種が、感染細胞の表面で、細胞外ドメインに向けられたｒ ＨＢを生成させる。このことは、宿主免疫系との相互作用を最大限にし、それに よって保護を改善させる。 この一般的攻略法は、他の肝炎株と同様に、Ａ型およびＣ型肝炎から免疫原性 表面抗原（タンパク質またはペプチド）のための組換え発現ベクターを生成する のに利用できる。 上で概略された一般的方法は、発現すべき、実質的にはあらゆるタンパク質ま たはペプチド配列のためにも使用できる。 本発明がその好ましい例において記載されているが、使用された語は限定する ためではなく、むしろ説明のための語であること、並びに、その変更は、広範囲 な態様の中では、発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の請求 の範囲内で行うことができることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 39/25 38/36 39/285 38/43 39/29 39/245 48/00 39/25 Ｃ０７Ｋ 14/005 39/285 14/035 39/29 14/07 48/00 14/195 Ｃ０７Ｋ 14/005 14/435 14/035 14/475 14/07 14/525 14/195 14/575 14/435 Ａ６１Ｋ 37/02 14/475 37/24 14/525 37/46 14/575 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ヤン，シュートン アメリカ合衆国、20007 ワシントン・デ ィー・シー、ノース・ウェスト、ダブリュ ー・ストリート 4115、アパートメント ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）標的タンパク質または標的ペプチドと、 ｂ）アンカー配列ペプチドと、 任意に、ｃ）シグナル配列ペプチドと を含んでなるキメラペプチド配列。 ２．前記標的タンパク質または標的ペプチド配列が、レセプター、ホルモン、 成長因子、凝血因子、酵素、神経タンパク質、アポリポタンパク質、腫瘍サプレ ッサー、抗原、腫瘍抗原性タンパク質およびペプチド、細菌性表面タンパク質お よびペプチド、ウイルス性表面タンパク質およびペプチド、原生動物細胞表面タ ンパク質およびペプチド、および真菌性表面タンパク質およびペプチド、および ウイルス酵素からなる群から選択される請求項１に記載のペプチド配列。 ３．前記レセプターが、インシュリンレセプター、ホルモンレセプターおよび 成長因子レセプターからなる群から選択される請求項２に記載のペプチド配列。 ４．前記酵素が、ウイルス性酵素である請求項２に記載のペプチド配列。 ５．前記ウイルス性酵素が、逆転写酵素である請求項４に記載のペプチド配列 。 ６．前記標的タンパク質またはペプチドが、ウイルス性表面タンパク質である 請求項１に記載のペプチド配列。 ７．前記ウイルス性表面タンパク質が、サイトメガロウイルスのｇＢまたはそ の免疫原性配列である請求項６に記載のペプチド配列。 ８．前記ウイルス性表面タンパク質が、Ｂ型肝炎のｒＨＢまたはその免疫原性 配列である請求項６に記載のペプチド配列。 ９．前記ウイルス性表面タンパク質が、単純ヘルペスの糖タンパク質Ｂまたは その免疫原性配列である請求項６に記載のペプチド配列。 １０．請求項１に記載のペプチド配列を純粋または実質的に純粋な形態で包含 する医薬組成物。 １１．前記ペプチド配列が、製薬上許容しうる添加剤、賦形剤または担体と組 み合わせて調合される請求項９に記載の組成物。 １２．患者に投与される発現ベクターに、発現されるペプチドをコードするヌ クレオチド配列を組み込むステップと、ここで、該配列は、哺乳類のシグナルペ プチドまたは該発現されるタンパク質のＣ末端に哺乳類のアンカーペプチドをコ ードするものでもあり、該発現ベクターを該患者に投与するステップとを含む、 患者において発現されたペプチドによって生み出される製薬学上の効果を相当に 増強する方法。 １３．前記ヌクレオチド配列が、シグナルペプチドおよびアンカーペプチドの 両方を含むペプチドをコードする請求項１２に記載の方法。 １４．前記発現ベクターが、組換えワクシニアウイルスである請求項１２に記 載の方法。 １５．前記ペプチドが、細菌、ウイルス、原生動物または真菌から得られる抗 原性ペプチドである請求項１２に記載の方法。 １６．前記ペプチドが、表面抗原である請求項１５に記載の方法。 １７．前記ペプチドが、ウイルスの表面抗原である請求項１２に記載の方法。 １８．前記ウイルスが、単純ヘルペス、サイトメガロウイルスまたは肝炎ウイ ルスである請求項１７に記載の方法。