【発明の詳細な説明】
精子透明帯結合タンパク質の自己抗原エピトープに対応する精子抗原
本発明は、国立衛生研究所からの補助金No.U54 HD29009により、政府援助を受
けて実施された。政府は、本発明に特定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、精子透明帯結合タンパク質の自己抗原エピトープに対応する抗原と
、同物質を使用した治療および診断方法に関する。
発明の背景
自己抗原は生体の組織構成成分であり、自己抗原に対しその生体は免疫応答を
向ける。このような自己指向型免疫応答の結果生じる状態は、自己免疫（または
「自己アレルギー」）として知られている。精子のタンパク質または精子の表面
上のタンパク質は、強力な自己抗原であることが知られており、そのようなタン
パク質の自己免疫は不妊の重大な原因と考えられている。
R．ShabanowitzおよびM．O'Rand，Ann．NY Acad．Sci．541，621-632(1988)は
図７において、ヒトの透明帯に親和性を有する種々のヒトタンパク質を記載して
いる。
M．O'RandおよびE．Widgren、米国特許第5,175,148号は、ウサギ精子膜自己抗
原（ＲＳＡ）の自己抗原エピトープに対応する精子抗原を開示している。ＲＳＡ
は、親和性の高い透明帯結合タンパク質として機能する、４つの低分子量糖タン
パク質（ＲＳＡ−１，２，３，４：１４Ｋ，１６Ｋ，１７Ｋ，１８Ｋ）から成る
一群であることが知られている。ウサギＲＳＡ３（「Ｓｐ１７」とも呼ばれる）
のクローニングが、R．RichardsonおよびM．O'Rand，Mol．Biol．Cell．3，15a(
1992)に記載されている。
発明の概要
本発明の第一点は、（ａ）配列番号２として本明細書に示されるアミノ酸配列
を持つヒトＳｐ１７タンパク質をコードしている単離ＤＮＡ（例えば、配列番号
１のＤＮＡ）、（ｂ）上記（ａ）の単離ＤＮＡとハイブリッド形成し、ヒトＳｐ
１７タンパク質をコードしている単離ＤＮＡ、（ｃ）遺伝コードの縮重により、
ヌクレオチド配列が上記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡと異なり、ヒトＳｐ１
７タンパク質をコードしている単離ＤＮＡ、および（ｄ）抗原ペプチド（すなわ
ち、下述のように、ヒトＳｐ１７タンパク質に結合する抗体と結合するペプチド
で、典型的には６ないし２５アミノ酸長のペプチド）をコードしている前記断片
からなるグループから選択される、ヒトＳｐ１７タンパク質またはその断片であ
る抗原ペプチドをコードしている単離ＤＮＡである。これらのタンパク質および
ペプチドは、下記においてしばしば「抗原」と呼ばれ、下記に検討されているよ
うに、免疫避妊薬および／または自己免疫性不妊の診断に有用である。
本発明の第二点は、ベクターＤＮＡと上記ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ配列であ
る。
本発明の第三点は、上記組換えＤＮＡ配列を含み、コードされているＳｐ１７
タンパク質またはその抗原ペプチド断片を発現することが可能な宿主細胞である
。
本発明の第四点は、（１）６ないし２５アミノ酸長の哺乳類Ｓｐ１７タンパク
質の抗原断片と（２）その抗原的に同等な断片とから成るグループから選択され
る免疫避妊薬として有用な、あるいは自己免疫性不妊の診断に有用な抗原ペプチ
ド（今後、「抗原」とも呼ばれる）である。前記抗原的に同等な断片は、（ａ）
１個以上のアミノ酸をその配列と置換することにより修飾された前記抗原断片を
含む修飾断片、または（ｂ）前記抗原断片の配列を組み込み、かつ（ｉ）前記配
列のＣ末端に付けられた４個までの余分なアミノ酸残基、（ii）前記配列のＮ末
端に付けられた４個までの余分なアミノ酸残基、または、（iii）前記配列のＣ
末
端に付けられた４個までの余分なアミノ酸残基と前記配列のＮ末端に付けられた
４個までの余分なアミノ酸残基を持つさらに長いペプチドであり、前記抗原的に
同等な断片は、哺乳類Ｓｐ１７タンパク質の前記抗原断片に結合する抗体に結合
する。哺乳類Ｓｐ１７タンパク質の抗原断片は、（ｉ）アミノ酸４からアミノ酸
２８の断片、（ii）アミノ酸３４からアミノ酸４９の断片、（iii）アミノ酸５
５からアミノ酸８２の断片、（iv）アミノ酸１１７からアミノ酸１３７の断片、
および（ｖ）少なくとも６アミノ酸長の（ｉ）から（iv）の断片から成るグルー
プから選択される。
本発明の第五点は、被験対象の受精能の低下に有効な量の上記抗原を、被験対
象（例えば、雌の被験対象）に投与することを含む免疫的避妊方法である。
本発明の第六点は、薬理学的に許容可能な担体と組み合わせた、被験対象の受
精能の低下に有効な量の上記抗原を含む免疫的避妊ワクチンである。
本発明の第七の点は、上記の抗原に結合する抗体の存在を被験対象において検
出することからなる被験対象（例えば雄の被験対象）における自己不妊の選別方
法である。前記抗体の存在は、被験対象が自己免疫性不妊に罹患していることを
示す。
本発明の第八点は、上記抗原をコードしており、コードされた抗原を発現する
ことができる組換えＤＮＡ配列を含む無毒性の宿主細胞（例えば、微生物の宿主
細胞）である。
本発明の第九点は、薬理学的に許容可能な担体と組み合わせた、被験対象の受
精能の低下に有効な量の、上記無毒性の宿主細胞を含む免疫不妊ワクチンである
。
前記の好ましい実施例において、無毒性の微生物は、βアスパラギン酸セミア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードしている本来の機能性染色体遺伝
子を欠失しており、更に機能性ａｓｄポリペプチドをコードしている組換え遺伝
子を含む。組換え遺伝子は、上記の１個以上の抗原をコードしている１個以上の
遺伝子に結合されている。無毒性の微生物は、微生物が実質的に機能的なアデニ
ル酸シクラーゼを産生できないように突然変異ｃｙａ遺伝子を、および／または
機能的なサイクリックＡＭＰレセプタータンパク質を微生物が実質的に産生でき
ないようにする突然変異ｃｒｐ遺伝子を含んでもよい。
本発明は、下記の図面と下記に提示されている明細書により、更に詳細に説明
される。
図面の簡単な説明
図１は、自分自身の精子を注射された雄ウサギの抗血清の、配列番号３から配
列番号４９として本明細書に開示されているアミノ酸配列を持つウサギＳｐ１７
の一連のデカペプチドへの結合を示している。この図において、各デカペプチド
の配列番号はその左側および／または右側に示されている。
図２は、図１に使用されたウサギＳｐ１７の一連のデカペプチドに対してテス
トされた抗精子抗体の力価が高い輸精管切除術を行った男性４人の血清プールの
結合を示している。このグラフのピークは全て、ヒト自己抗原性のＢ細胞エピト
ープを表している。
図３は、ウサギＳｐ１７組換え抗原により免疫感作された雌ウサギの免疫血清
の図１に記述されている一連のデカペプチドへの結合を示している。
図４は、合成ペプチドＧ２２Ｃにより免疫感作された雄ウサギから得られた免
疫血清の、図１に記述されている一連のデカペプチドへの結合を示している。
図５は、合成ペプチドＧ２２Ｃにより免疫感作された雌ウサギから得られた免
疫血清の、図１に記述されている一連のデカペプチドへの結合を示している。
図６は、組換えＳｐ１７（融合タンパク質）によるマウスの免疫感作が、受精
能に及ぼす効果を示している。６匹のマウスにヒトＳｐ１７が投与された。アジ
ュバント対照群（ｎ＝１２）はＴＩＴＥＲＭＡＸTMアジュバント（Sigma Co.，S
t．Louisより入手）のみを投与された。他の６匹のマウスは何も投与されなかっ
た。ヒトＳｐ１７組換えタンパク質により免疫感作されたマウスは、４２％の妊
娠率の低下を示した。
図７は、ウサギ（ＲＡＢＳＰ１７）、マウス（ＭＵＳＳＰ１７）、ヒト（ＨＵ
ＭＳＰ１７）のＳｐ１７タンパク質配列のアラインメントを示している。自己抗
原断片は枠内に表示されている。ヒト配列の番号付けに基づき、Ｎ末端からＣ末
端に向かって番号を付け、枠内に表示される自己抗原断片のアラインメントを最
大限にするために、他の哺乳動物の配列に空白を導入し、枠内に表示される自己
抗原断片の番号が種間で一致するように、空白を導入した部分の番号はとばして
表示されている。
発明の詳細な説明
本明細書に開示されているアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端
の方向に、左から右に表示されている。アミノ基とカルボキシル基は配列に表示
されていない。ヌクレオチド配列は、本明細書では、５’から３’方向に、左か
ら右に一本鎖のみによって表示されている。ヌクレオチドとアミノ酸は、本明細
書では、37CFR 1.822と確立された使用法に従って、IUPAC-IUB生化学命名法委員
会の推奨方法により、あるいは（アミノ酸に関しては）３文字コードにより表示
されている。例えば、PatentIn User Manual，99-102（1990年11月）（U.S．Pat
ent and Trademark Office，Office of Assistant Comissioner for Patents，W
ashington D.C．20231）、Hudson et al．の米国特許第4,871,670号の第３列第
２０〜４３行を参照。（本明細書に引用されているこの特許と他の全ての特許及
び文献を引用することによって本明細書に組み込むことを本出願人は特に意図し
ている。）Ａ．分子生物学
ヒトＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡは、ｃＤＮＡであろうと、ゲ
ノムＤＮＡであろうと、硫酸化された複合炭水化物と結合することによって高い
親和力でヒト透明帯に結合する、約１７キロダルトンのタンパク質をコードして
いる。この定義は、ＤＮＡの中の天然の対立遺伝子の変異を包含することを目的
としている。
本明細書に開示されているヒトＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡと
ハイブリッド形成するＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡは、ネズミ（
マウス、ラット）、ウサギ、ネコ、ブタ、ヒト、サルまたはヒヒを含むいずれの
種由来でも可能であるが、哺乳類由来のＳｐ１７タンパク質をコードするものが
好ましく、ヒトＳｐ１７タンパク質をコードするものが最も好ましい。公知の技
術に従って作製された合成ＤＮＡでもよい。
発現できるＳｐ１７タンパク質をコードしている他のＤＮＡ配列が、本明細書
に表示されているＤＮＡ配列とハイブリッド形成することを可能にするハイブリ
ッド形成条件は、一般に、高度に厳密な条件（high stringency condition）で
ある。例えば、標準的なin situ ハイブリッド形成分析において、このような配
列と本明細書に開示されているＤＮＡ（例えば配列番号１）とのハイブリッド形
成は、６０℃または７０℃でさえも、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン
酸ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳの洗浄の厳密さ（wash stringency）によ
って表される条件下で実施できる。(J．Sambrook et al.，Molecular Cloning，
A Laboratory Manual(第2版、1989)(Cold Spring Harbor Laboratoryを参照))。
一般に、Ｓｐ１７タンパク質をコードしており、本明細書に開示されているヒ
トＳｐ１７タンパク質とハイブリッド形成するＤＮＡ配列は、少なくとも７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、あるいは９５％以上も、本明細書に開示さ
れているヒトＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡ配列と相同である。
一般に、本明細書に開示されているヒトＳｐ１７タンパク質とハイブリッド形
成するヒトＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、９３％、９４％
、９５％、９６％、あるいは９７％以上も、本明細書に開示されているヒトＳｐ
１
７タンパク質をコードしているＤＮＡ配列と相同である。
更に、前記配列によりコードされているのと同じＳｐ１７タンパク質をコード
しているが、遺伝コードの縮重によりコドンの配列がこれらと異なるＤＮＡ配列
も本発明の一面である。遺伝コードの縮重は、異なる核酸配列により同じタンパ
ク質またはペプチドをコードできる現象を意味し、文献によって十分知られてい
る。例えば、Toole et al．の米国特許第4,757,006号、第２列、表１を参照。
遺伝子工学によるクローン化遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換され
た宿主細胞、タンパク質およびタンパク質断片の作製は公知である。例えば、Be
ll etal．の米国特許第4,761,371号の第６列第３行から第９列第６５行、Clark
et al．の米国特許第4,877,729号の第４列第３８行から第７列第６行、Schillin
gの米国特許第4,912,038号の第３列第２６行から第１４列第１２行、Wallnerの
米国特許第4,879,224号の第６列第８行から第８列第５９行を参照。
ベクターは、複製可能なＤＮＡ構成物である。ベクターは、本明細書に示され
るＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡを増幅するか、および／または本
明細書に示されるＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡを発現させるため
に、ここでは使用される。発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構成物で、その中
でＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、適切な宿主内でＤＮＡ配
列の発現を実行できる適切な制御配列と操作可能なように連結されている。この
ような制御配列の必要性は、選択される宿主と選択される形質転換法によって異
なる。一般に、制御配列には、転写プロモーター、転写を調節するための最適な
オペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び、転写と翻訳の終
止を調節する配列が含まれる。典型的なベクターには、プラスミド、ウイルス、
ファージ、組み込み可能なＤＮＡ断片（すなわち、組換えにより宿主ゲノムに組
み込み可能な断片）が含まれるが、これらに限定されない。
ＤＮＡ領域は、互いに機能的に関連性がある場合には、操作可能なように結合
、
あるいは操作可能なように連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転
写を調節している場合には、プロモーターは操作可能なようにコード配列に結合
される。あるいは、リボソーム結合部位が翻訳を可能にするために配置されてい
る場合には、リボソーム結合部位は操作可能なようにコード配列に結合される。
形質転換された宿主細胞は、本明細書に開示されているＤＮＡ配列を含むベク
ターにより形質転換またはトランスフェクションされた細胞で、組換えＤＮＡ技
術を用いて作製される。形質転換された宿主細胞は通常はレセプターを発現する
が、クローニングまたは増幅を目的として形質転換された宿主細胞は、レセプタ
ーを発現する必要はない。
適切な宿主細胞には、原核動物、酵母、または哺乳動物の細胞や昆虫の細胞等
のより高等な真核細胞が含まれる。多細胞生物由来の細胞は、組換えＳｐ１７タ
ンパク質合成に特に適した宿主であり、哺乳動物の細胞が特に好ましい。このよ
うな細胞の細胞培養による増殖は、決まり切った手段となっている(Tissue Cult
ure，Academic Press，Kruse and Patterson編(1973))。有用な宿主細胞系の例
として、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞系がある。このような細胞のための発現ベクターは通常（必要であれば）、
複製起点と、発現されるべきＳｐ１７タンパク質をコードしているＤＮＡより上
流に位置し、操作可能なようにそれに結合されたプロモーターとを含み、またリ
ボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イントロンを含むゲノムＤＮＡが使
用される場合）、ポリアデニル化部位、及び転写終止配列も含む。
脊椎動物の細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写調節配列
および翻訳調節配列は、しばしばウイルスから供給される。例えば、一般的に使
用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）から得られる。例えば、米国特許第4,599,308号を参照。
複製起点は、ＳＶ４０またはその他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ
ウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）から得られるような外因性起点を含めるため
にベクターの構築によって供給されても、あるいは宿主細胞染色体の複製機序に
よって供給されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に組み入れられる場合に
は、通常後者で十分である。
ウイルスの複製起点を含むベクターを利用するよりも、選択可能なマーカーと
レセプターＤＮＡとの同時形質変換法により哺乳動物の細胞を形質転換すること
ができる。適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨ
ＦＲ）またはチミジンキナーゼである。この方法は、米国特許第4,399,216号に
更に詳細に記述されている。
Smith et al．の米国特許第4,745,051号および第4,879,236号に記述されてい
るように、昆虫の細胞（例えばSpodoptera frugiperdaの培養細胞）等の宿主細
胞と、バキュロウイルス発現ベクターのような発現ベクターを、本発明の実施に
使用できる。
原核動物の宿主細胞には、例えば大腸菌（E.coli）または桿菌等のグラム陰性
菌またはグラム陽性菌が含まれる。
酵母培養物等の真核微生物も、本明細書に開示されている単離ＤＮＡを持つベ
クターにより形質転換される。例えば、米国特許第4,745,057号を参照。多くの
他の菌株も利用可能であるが、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）が下等真
核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。Ｂ．ペプチド
本明細書の図１に示される本発明の抗原断片例の１群は、本明細書に配列番号
３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号
９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６
、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、
配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配
列
番号２９、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３として示
されるアミノ酸配列を持つペプチドと少なくとも６アミノ酸長の長さを持つその
断片とから成るグループから選択される抗原断片である。これらの中で、特に好
ましいのは、本明細書に配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配
列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列
番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番
号４０、配列番号４１、配列番号４３として示されるアミノ酸配列を持つペプチ
ドと少なくとも６アミノ酸長の長さを持つその断片とから成るグループから選択
される抗原断片である。
本明細書の図２に示される本発明の好ましい断片例の別の１群は、本明細書に
配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０
、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、
配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配
列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列
番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番
号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号
４０、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９として示され
るアミノ酸配列を持つペプチドと少なくとも６アミノ酸長の長さを持つその断片
とから成るグループから選択される抗原断片である。これらの中で、特に好まし
いのは、本明細書に配列番号８、配列番号９、配列番号１４、配列番号１５、配
列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列
番号３４、配列番号４０、配列番号４３として示されるアミノ酸配列を持つペプ
チドと少なくとも６アミノ酸長の長さを持つその断片とから成るグループから選
択される抗原断片である。
一般に、より長いペプチドは、好ましくは上記の抗原ペプチドの配列を含む。
より長いペプチドは、その分子の露出部位に抗原配列を提供し、結合に利用でき
ない分子内部に抗原配列を埋没することはない。抗原のＮ末端またはＣ末端に４
個またはそれ以下の付加的なアミノ酸を加えたさらに長いペプチドが好ましい。
なぜならば、一般にこのような長さの配列は、抗原の活性を障害する可能性があ
る更に他のエピトープをさらに長いペプチドに追加するには、長さが不十分だか
らである。
本発明の実施に利用されるペプチドは、その類似体を含む。本明細書に使用さ
れるように、類似体は上述のペプチドと同じアミノ酸配列は持たないが、類似の
三次元構造を持つ化合物である。レセプターと相互作用するタンパク質分子にお
いて、タンパク質とレセプターの相互作用は、安定な三次元分子の表面のアクセ
ス可能な部位において起こる。重要な結合部位残基を適切なコンフォメーション
に配置することによって、本発明のペプチドの必須の表面の特徴を模倣したペプ
チドが、公知の技術に従ってデザインされ、合成される。ペプチドの三次元構造
とそれに対する類似体を決定する方法は公知であり、しばしば「合理的薬物デザ
イン法」と呼ばれる。例えば、Geysenの米国特許第4,833,092号、Nestorの米国
特許第4,859,765号、Pantolianoの米国特許第4,853,871号、Blalockの米国特許
第4,863,857号を参照（本明細書に引用された米国特許参照文献の開示は、引用
することによって本明細書に全てを組み込むことを出願人は特に意図している）
。Waldrop，Science，247，28029(1990)、Rossman，Nature，333，392-393(1988
)、Weiss et al.，Nature，333，426-431(1988)も参照。特定のタンパク質に特
異的に結合するペプチドを同定するためのペプチド配列のライブラリーを構築し
、スクリーニングする方法も公知である。Scott and Smith，Science，249，386
-390(1990)、Devlin et al.，Science，249，404-406(1990)。更に、当該技術分
野に精通する者は、過度にその活性を障害することなく、本発明のペプチドのア
ミノ酸配列に僅かに欠失または置換を生じさせることが可能であることを理解す
る
であろう。従って、このように僅かな欠失または置換を含むペプチドも、本発明
の更なる一点である。
アミノ酸の置換を含むペプチドにおいて、その配列の抗原性に影響を与えない
１個以上の他のアミノ酸によって、ペプチド配列の１個以上のアミノ酸を置換す
ることができる。このような変更は、電荷密度、疎水性／親水性、サイズ、立体
配置等の物理特性に関する２つのアミノ酸の公知の類似性を指針とすることが可
能で、それによって、アミノ酸は、実質的に同じ官能特性を持つ別のアミノ酸に
置換される。例えば、
アラニンはバリンまたはセリンに置換できる。
バリンはアラニン、ロイシン、メチオニンまたはイソロイシンに置換でき、ア
ラニンまたはロイシンが好ましい。
ロイシンはアラニン、バリンまたはイソロイシンに置換でき、バリンまたはイ
ソロイシンが好ましい。
グリシンは、プロリンまたはシステインに置換でき、プロリンが好ましい。
プロリンは、グリシン、システイン、セリンまたはメチオニンに置換でき、グ
リシン、システイン、またはセリンが好ましい。
システインは、グリシン、プロリン、セリンまたはメチオニンに置換でき、プ
ロリンまたはメチオニンが好ましい。
メチオニンは、プロリンまたはシステインに置換でき、システインが好ましい
。
ヒスチジンは、フェニルアラニンまたはグルタミンに置換でき、フェニルアラ
ニンが好ましい。
フェニルアラニンはヒスチジン、チロシン、トリプトファンに置換でき、ヒス
チジンまたはチロシンが好ましい。
チロシンは、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはトリプトファンに置換でき
、フェニルアラニンまたはトリプトファンが好ましい。
トリプトファンは、フェニルアラニンまたはチロシンに置換でき、チロシンが
好ましい。
アスパラギンは、グルタミンまたはセリンに置換でき、グルタミンが好ましい
。
グルタミンはヒスチジン、リジン、グルタミン酸、アスパラギンまたはセリン
に置換でき、アスパラギンまたはセリンが好ましい。
セリンはグルタミン、トレオニン、プロリン、システインまたはアラニンに置
換できる。
トレオニンは、グルタミンまたはセリンに置換でき、セリンが好ましい。
リジンはグルタミンまたはアルギニンに置換できる。
アルギニンは、リジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に置換でき、リジ
ンまたはアスパラギン酸が好ましい。
アスパラギン酸は、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換でき、アル
ギニンまたはグルタミン酸が好ましい。
グルタミン酸は、アルギニンまたはアスパラギン酸に置換でき、アスパラギン
酸が好ましい。
一旦変更されれば、その抗原に結合する抗体によって、抗原性に対する影響を
測定するために、変更を定期的に選別することが可能である。
本明細書に使用される「抗原的に同等な断片」という言葉は、同等性を確立し
ようとしているタンパク質またはペプチドに結合する抗体に結合するタンパク質
またはペプチドを指す。このような抗原的に同等な断片を選択するために使用さ
れる抗体は、ここでは「選択用抗体」と呼ばれる。抗原的に同等な断片は、本来
の配列内の反応基を修飾することによって、あるいはＮ末端アミノ基および／ま
たはＣ末端カルボキシル基を修飾することによって形成できる。このような同等
物には、酸および／または塩基を用いて形成される塩、特に生理的に許容可能な
無機および有機の酸および塩基が含まれる。他の同等物には、エステルまたはア
ミドを生成するために抗原上の修飾されたカルボキシル基および／またはアミノ
基、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル基のようなアミノ酸保護基が含まれる。好まし
い修飾は、生体内で酵素分解しにくいより安定な活性ペプチドを供給する修飾で
ある。Ｃ．免疫的避妊方法
上述のように、本発明は被験動物に被験動物の受精能を低下させるのに有効な
量の上記抗原を投与することからなる免疫的避妊方法を提供する。受精能の部分
的低下（すなわち、被験集団における受精能の低下率として反映される効果）は
、本発明の範囲内と見なされている。
鳥と哺乳動物の両者を含むいかなる動物も、本発明の免疫的避妊方法により治
療できる。哺乳動物の例として、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒ
ツジ、ウマ、ヒトが挙げられる。哺乳動物の被験対象が好ましい。被験対象は雄
でも雌でもよい。抗原は、適切などのような手段によっても被験対象に投与する
ことができる。例として、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、経
口投与、経鼻スプレーが挙げられる。
投与される抗原の量は、投与経路、種、ブースター投与の使用等の因子によっ
て変わる。一般に、投与量は、被験対象の体重１ポンドあたり約０．１〜約１０
０μｇが使用され、１ポンドあたり約１μｇがより好ましい。
本発明の免疫的避妊方法はヒトと動物の両者の治療を考慮し、本発明の抗原は
ヒトと動物の両者のワクチンとして調製できる。本発明のワクチンは、薬理学的
に許容可能な担体中の抗原から成る。抗原は、治療される被験対象の受精能を低
下させる有効量が担体中に含められる。薬理学的に許容可能な担体は好ましくは
液体、特に燐酸ナトリウム緩衝液等の水性担体である。ワクチンは、ゴム栓で密
封された滅菌ガラス容器に保管でき、ゴム栓を通して液体を注入でき、そのワク
チンをシリンジで吸引できる。
本発明のワクチンは、１種類以上のアジュバントを最適に含めることができる
。適切なアジュバントはどれでも利用できる。例として、水酸化アルミニウム、
燐酸アルミニウム、植物油および動物油等があり、アジュバントの量は使用され
る特定のアジュバントの性質によって異なる。更に、ワクチンは１種類以上の安
定剤を含めることができ、例としてソルビトール、マンニトール、デンプン、シ
ョ糖、デキストリン、グルコース等の炭水化物、アルブミンまたはカゼイン等の
タンパク質、アルカリ金属燐酸塩等の緩衝液がある。Ｄ．診断方法
本発明の診断方法は、雌雄両方の被験対象の自己免疫性不妊の診断方法を提供
する。雌の被験対象における免疫は外因性の精子に対するものなので、「自己免
疫」という言葉は、ここでは包括的な意味に使用されている。
凝集および沈殿反応、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定
法（ＥＬＩＳＡ）のような酵素免疫検定（例えば、米国特許第3,654,090号）、
不均質蛍光免疫検定（例えば米国特許第4,201,763号、第4,171,311号および第3,
992,631号）、均質（分離がない）イムノアッセイ等の従来のどの抗体検出方法
でも、本発明の診断試験の実施に利用できる。一般にBasic and Clinical Immun
ology，364-73（J．Fudenberg et al.編、第3版、1980）の参照によれば、ＥＬ
ＩＳＡが好ましい。
好ましい実施例において、血清中の抗体は溶液中で抗原と反応するように、診
断すべきヒトの血清を上記の抗原と接触させる。好ましくは抗原は固体支持体に
結合されるが、抗体の検出に均質（分離がない）イムノアッセイが利用される場
合には、固体支持体は必要ない。
血清は、一般に指先を穿刺し、（血清がその構成成分である）全血を採血して
得られる。しかし、血清を結合された抗原と接触させる前に、全血の血清または
血漿部分のみを得るために血液を処理することができる。その中に含まれる抗体
が抗原と結合する能力を保持している限り、患者から血清または血漿を得るため
のどの方法でも利用できる。
抗原は、公知の方法により、固体支持体に結合させることができる。例えば、
抗原を固体支持体に付着させるために、二官能有機分子を利用してもよい。固体
はプラスチック（例えば、マイクロタイタープレートのウェルの底表面）、ファ
イバーグラス、酢酸セルロース、ニトロセルロース（例えばディスク）等の材料
から作製できる。固体支持体に付着後、所望により、抗原を架橋結合させること
ができる。
検出可能な抗体が固体支持体に結合された抗原と相互作用できるように、固体
支持体を検出可能な抗体に接触させる工程を実施する。検出可能な抗体は、精製
された抗原に結合する被験者の血清から得られたヒト抗体に結合することができ
、ここで検出可能な抗体は検出が可能となる。特に、検出可能な抗体は、基質の
存在下に検出可能な酵素等の基に結合されている抗ヒト免疫グロブリンが可能で
ある。アフィニティー精製された酵素に結合されているヤギまたはウサギの抗ヒ
ト抗体が好ましい。一般に、検出可能な抗体に結合されている検出可能な基は、
任意の酵素、あるいはイムノアッセイ用に開発された他の検出可能な種類が可能
である。例えば、酵素、蛍光性基、放射性基等が利用できる。酵素ペルオキシダ
ーゼが特に好ましい。ペルオキシダーゼが検出可能な抗体に結合された検出可能
な基である場合には、３．３’，５．５−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フ
ェニレンジアミン等の基質が、検出可能な抗体を検出するための基質として利用
できる。
ヒト抗体と反応した検出可能な抗体を検出する工程は、その存在を明らかにす
るために、検出可能な抗体に結合されている検出可能な基を処理あるいは操作す
ることを含む。例えば、ペルオキシダーゼのような酵素が抗体に結合されている
場合には、検出工程は、ペルオキシダーゼの基質を結合されている酵素に加える
工程と、基質の色付きの種への変換をペルオキシダーゼが触媒するにつれ、色が
変化するのを観察する工程とを含む。アルカリホスファターゼおよびβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ等の他の酵素の場合、他の基質を利用できる。基質から生成物へ
の化学的変換を酵素が触媒した後、このテストを採用した人が変化を観察できる
ように、使用される基質を選択すべきである。３．３’，５’．５−テトラメチ
ルベンジジン、ｐ−ニトロフェニルホスフェートまたは３．３−ジアミノ−ベン
ジジンのような基質が利用できる。他の検出可能な基も、抗体に結合できる。
血清抗体の検出に基づく診断テストを実施するのに必要な成分を含むキットを
組み立てることができる。キットは、ミクロタイタープレートウェルの底のよう
な固体支持体、ニトロセルロースまたは酢酸セルロースのディスク上またはその
中に被覆された精製抗原を含むパッケージと、抗原に結合する患者の血清中の抗
体を結合できる検出可能な抗体複合体の容器とを含む。ＥＬＩＳＡテストは、陽
性または陰性の診断をすぐに下せるため、キットに最も好ましい。従って、キッ
トには、検出可能な抗体に結合されている酵素と反応する基質の容器も含め、基
質は、酵素と反応後直ちに検出可能であるようにする。診断キットに使用される
抗原は、好ましくは実質的に、あるいは実質的に他のタンパク質を含まない。Ｅ．無毒性の担体細胞
上述のように、微生物のような無毒性の担体細胞が本発明の抗原の投与に使用
される。この方法は、適切な担体微生物は、その微生物が発現する抗原に対する
ｓＩｇＡの産生を促進できることから、特に適している。植物担体細胞と微生物
担体細胞の両者を含む、適切な無毒性の担体細胞は、R．Curtissによる米国特許
第4,888,170号の組換え遺伝子である抗原遺伝子産物から得られるワクチン、R．
Curtiss and G．GardineauによるＰＣＴ出願WO90／02484のトランスジェニック
植物による経口免疫感作、R．CurtissによるＰＣＴ出願公開WO92／09684の組換
え無毒性サルモネラ避妊ワクチンに記載されている。これらの文献は、引用する
こと
によって本明細書に組み込まれる。
一般に、配偶子特異的な抗原の遺伝子を１個以上含む組換えプラスミドを、標
的宿主中に長期生存するために必要な遺伝子の突然変異を含む幾つかの無毒性細
菌株の１つに導入することが可能である。有用な無毒性の微生物には、サルモネ
ラ（Salmonella）と大腸菌とサルモネラの雑種が含まれるがこれらに限定されな
い。好ましい微生物は、ネズミチフス菌(S．typhimurium)、チフス菌(S．typhi)
、パラチフス菌(S．paratyphi)、鳥チフス菌(S．gallimarum)、S．Pullorum、腸
炎菌(S．enteritidis)、豚コレラ菌(S．choleraesuis)、S．arizonaまたはS．du
blin等のサルモネラ属に属する菌株である。ネズミチフス菌と腸炎菌の無毒性の
誘導体は、多くの宿主において広く利用される。鳥チフス菌、S．Pullorum、S．
arizonaの無毒性誘導体は、トリ種の免疫感作に特に有用であり、ネズミチフス
菌、チフス菌、パラチフス菌はヒトにおいて使用するのに好ましい。豚コレラ菌
はブタの免疫感作に使用するのに好ましく、S．dublinはウシに使用される。
特に有用なのは、成長が障害されるように、対応する機能タンパク質を宿主内
で実質的に産生できないｃｙａ、ｃｒｐ、ａｓｄのうち１つ、２つまたは３つす
ぺての突然変異体である。しかし、他の無毒性の微生物も本発明に利用できるこ
とが判明するであろう。このような無毒性の微生物には、ａｒｏＡ、ａｒｏＤ、
ｇａｌＥ、ｐｈｏＰ、ｃｄｔ、ｏｍｏＲ、ｈｔｒＡの突然変異を有する微生物が
含まれる。ａｓｄ突然変異体が使用される場合、抗原とａｓｄの両方をコードし
ているベクターを使用して担体微生物に目的の抗原が移される。従って、所望の
配偶子特異的な抗原を含む担体微生物だけが生存し、これらの微生物は更なる利
用のために選択することができる。所望の抗原をコードしている組換え遺伝子の
発現は、ａｓｄ遺伝子に結合された制御配列に恐らく依存している。この結合は
、ベクター内の２つの遺伝子の配座により生じたもので、従って２つの遺伝子は
例えば、同じ制御要素、すなわち同じプロモーターとオペレーターの制御を受け
る
ものと思われる。
ｃｙａ突然変異体および／またはｃｒｐ突然変異体は、サルモネラの毒性を支
配しているｃｒｐ遺伝子に隣接する遺伝子内で、好ましくは欠失により更に突然
変異させることが可能である。この遺伝子、つまりｃｄｔ遺伝子における突然変
異は、細菌が深部組織、例えば脾臓に効果的にコロニー形成する能力を低下させ
る。ｃｒｐ+遺伝子を持つプラスミドが、Δ（ｃｒｐ−ｃｄｔ）菌株内に入れら
れると、菌株はその無毒性と免疫原性を保持するため、ｃｙａおよびｃｒｐ突然
変異体と類似の表現型を有する。プラスミド上のｃｒｐ+遺伝子を含むΔ（ｃｒ
ｐ−ｃｄｔ）突然変異を持つ突然変異体は、腸管と消化管関連リンパ組織（ＧＡ
ＬＴ）にコロニー形成する正常の能力を保持するが、より深部の組織にコロニー
形成する能力は低下する。
好ましい免疫応答を促進するために、経口投与、経鼻投与、胃管挿入あるいは
エアロゾルの形態で、また気嚢接種（鳥の場合のみ）、気管内接種等により、微
生物または遺伝子産物を腸または気管支に直接導入することが好ましい。他の適
切な方法には、ハーダー腺に達するための経結膜投与および乳腺内接種がある。
例えば、静脈内、筋肉内、皮下注射による他のワクチン投与方法も可能であり、
下記に詳細に示すように、主に二次免疫応答の促進に使用される。
一般に、抗原を発現する担体微生物がヒトまたは他の哺乳動物に投与される場
合、これらは薬理学的に許容可能な担体内に存在する。例えば、担体微生物は、
適切なゼラチン様物質により腸溶性物質でコートするか、またはカプセルとする
ことが可能であり、これは当該技術分野において公知である（Cryz and Gluck，
1990，in G．Woodrow and Mr．Levine: 新世代ワクチン、Marcel Dekker，New Y
ork，pp921-932）。
一旦担体微生物が動物の体内に入ったら、抗原は動物の免疫システムにより利
用できるようにならなくてはならない。これは、担体微生物が死滅し、抗原分子
が放出された時に達成され得る。勿論、溶解せずにペリプラズムの成分を放出す
る「漏出性」の無毒性突然変異体の使用も可能である。あるいは、細胞が死滅す
る前に、担体細胞によって外部環境が利用できるような抗原の産生を制御する遺
伝子を選択することもできる。
抗原は、エアロゾルとして、あるいは経鼻投与により投与することもできる。
ヒト用経鼻投与剤には、通常、鼻粘膜に炎症も起こさず、また繊毛機能も顕著に
障害しない賦形剤（vehicle）が含まれる。水、水食塩水またはその他の公知の
物質等の希釈剤を本発明に使用することができる。経鼻投与剤には、例えばクロ
ロブタノールおよび塩化ベンズアルコニウム等の保存薬も含めることができるが
、これらに限定されない。鼻粘膜による対象タンパク質の吸収を増強するために
、界面活性剤も含めてよい。
１回目の経口投与、経鼻投与、胃管またはエアロゾルによる免疫感作と組み合
わせて、配偶子特異的な抗原の注入投与も可能である。一旦配偶子に特異的な遺
伝子産物に対する分泌型免疫システムが、配偶子に特異的な遺伝子産物を発現す
る担体微生物による免疫感作で始動すると、このような非経口投与による免疫感
作は、分泌型免疫応答の発現を増強するためのブースターとして作用することが
できる。増強された応答は二次応答、ブースター応答あるいは既往応答として知
られ、長時間にわたる宿主の免疫防御が得られる。ブースター免疫感作は、何回
も繰り返すことができ、有益な結果を得ることができる。
ブースター等に用いるためにワクチンを注射液として調製する場合、液体溶液
または懸濁液として調製することができる。溶液あるいは懸濁液に含めるのに適
切な固体形態、注入前の液体賦形剤も調製できる。製剤は乳化することも可能で
、あるいは活性成分をリポソームの賦形剤中にカプセル化することもできる。活
性免疫原性成分は、しばしば薬理学的に許容可能であり、かつ、活性成分と適合
する補形剤（excipient）を含む賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば
水、
生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等とそれらの組み合わ
せである。更に、所望により、賦形剤は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ま
たはワクチンの有効性を強化するアジュバント等の少量の補助剤を含んでよい。
アジュバントは、例えば、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウ
ム、油、サポニン、当該技術分野において公知のその他の物質等を含んでよい。
このような投与形態の実際の調製方法は公知であるか、あるいは当該技術分野に
精通する者にとって明らかである。例えば、Remington Pharmaceutical Science
s，Mack Publishing Company，Easton，PA，第15版、1975を参照。投与される組
成物または処方剤は、いかなる場合でも、治療される個体において所望の免疫感
作状態を達成するのに十分なタンパク質量を含む。
投与される抗原の量は、治療される被験対象ごとに異なる。つまり、被験対象
の抗体を合成する免疫システムの能力、所望の防御効果の程度によって変わる。
有効量は、当該技術分野に精通する者によって、用量反応曲線を作成する決まり
きった試験により容易に確立できる。特定の抗原またはその断片、またはその類
似体を少なくとも１回投与することによって、被験対象を免疫感作する。担体微
生物を使用する典型的な用量は、免疫感作された被験対象あたり組換え無毒性細
菌１×106〜１×1010個のオーダーである。配偶子特異的な抗原に対する免疫感
作状態を維持するために必要とされる、用量漸増法により、あるいは反復投与法
により被験対象に投与できる。
１種類以上の抗原を同時にあるいは連続して投与してよい。これは、１種類以
上の配偶子特異的な抗原をコードしている遺伝子を含む無毒性担体を投与するこ
とにより、あるいは異なる担体微生物を投与することにより達成できる。
本発明を、以下の実施例において詳細に説明するが、以下の実施例は限定する
ことを目的としたものではない。
実施例１
ヒト精子透明帯結合タンパク質Ｓｐ１７のクローニングと配列決定
我々は以前にウサギＳｐ１７のクローニングと配列データを報告した(Richard
son and O'Rand，Mol．Biol．Cell 3，15a(1992))。このタンパク質は、ウサギ
精巣／精子自己抗原のウサギ精子抗原（ＲＳＡ）族の１つであり、マウスにも発
現されることは公知である。このタンパク質に相当する物質をヒトにおいて検出
する試みが、ウサギＳｐ１７遺伝子のタンパク質コード領域をプローブとして用
いて、ヒト精巣ｃＤＮＡのスクリーニングから開始された。１つのクローンは、
ヌクレオチドレベルでウサギＳｐ１７遺伝子と７１％が同じである１２８７塩基
対の挿入断片を含み、４５５塩基対の読み取り枠を含み、配列番号１として本明
細書に示される配列を持っていた。このクローンは、配列番号２として本明細書
に示される配列を持つ１５１個のアミノ酸から成るタンパク質をコードしており
、計算された分子量は１７，５３４ダルトンで、ウサギＳｐ１７と７６．７％が
同一で、マウスＳｐ１７タンパク質配列と７１．８％が同一であった。特に、最
初の４４個のアミノ酸は、マウス、ウサギ、ヒトの配列で完全に同一であり、ヒ
ト精巣ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼIIα型調節サブユニット二量体相互作
用部位と４３％が同一である。興味深いことに、ウサギ、マウス、ヒトのアミノ
酸配列を比較したところ、ヒトＳｐ１７の分子の中央に他の配列には含まれてい
るシステイン残基が１つ欠失していることが明らかにされた。一連のマウス、ヒ
ヒ、ヒトの組織のノザンブロット解析は、精巣に限定される極めて限られた遺伝
子発現パターンを示した。更に、ノザンブロット解析によって、ヒト精巣におけ
る、約１．３ｋｂと０．９ｋｂの２種類の転写物サイズの存在が明らかにされた
。２９ｋＤａの優勢な免疫反応性タンパク質を実証するために、Ｓｐ１７組換え
タンパク質（ｒＳｐ１７）に対する抗血清が調製され、ヒト精子溶解物のウェス
タンブロットに使用された。抗原は、抗ｒＳｐ１７を用いて免疫蛍光法によりヒ
ト精子に局在することが明らかとなった。ＥＬＩＳＡにおいて、ｒＳｐ１７はフ
コイ
ダンと、飽和速度論的に結合することが明らかにされた。抗精子抗体の力価を有
する輸精管切除された男性の血清もｒＳｐ１７に反応性を示したことから、ヒト
Ｓｐ１７はヒト精子自己抗原であることが示された。
実施例２
一連のデカペプチドの調製とイムノアッセイ法
ウサギＮ末端タンパク質の断片に対応する一連の４７個のＮ末端をアセチル化
された一連のデカペプチドを、公知の方法に従って合成した。これらのデカペプ
チドは本明細書に配列番号３から配列番号４９として開示されている。
酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）を、公知の方法（例えば、M．O
'Rand et al.，Dev．Biol．129，231(1988)を参照）に従い、製造者の説明書に
従ってＭＵＬＴＩＳＰＩＮTMシステム用に改変して実施した。(Chiron Mimotope
s Pty．Ltd.，Clayton，Victoria，3168 Australia)。下記のＥＬＩＳＡデータ
の表示にあたり、標準法に従い、正常対照被験者のＩｇＧの対照吸光度（O.D．v
alue）を実験値から減じた。
実施例３
ペプチドＧ２２Ｃに対する抗体の産生
アミノ酸６１からアミノ酸８２に及ぶウサギＳｐ１７の断片に対応する（かつ
ＧＡＫＶＤＤＲＦＹＮＮＨＡＦＱＥＨＥＳＥＫＣの配列を有する）ペプチドＧ２
２Ｃを、標準法に従い、ＮＩＨとの契約NO1-HD-0-2906の下にSalk Instituteに
て合成した。
雌雄のウサギは、Ｇ２２ＣのＣ末端アミノ酸のシステインによりカギアナカサ
ガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合されたＧ２２Ｃペプチドを用いて免疫感作さ
れた。結合は、ＩＭＪＥＣＴR免疫原結合キットの形態でPierce Scientificから
入手したエルマン試薬、５，５−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］を用い
て実施した。各ウサギは完全フロイントアジュバント中の３００μｇの複合体を
皮下注射後、さらに３週間後に不完全フロイントアジュバント中の２００μｇの
複合体を注射し、最後に不完全フロイントアジュバント中の１００μｇの複合体
を３週間後に皮下注射した。複合体は、アジュバントと１：１の割合で、１００
μｌの水に希釈されて、提供された。
実施例４
一連のウサギＳｐ１７デカペプチドへのウサギ自己免疫血清の結合
雄ウサギに自分自身の精子を注入し、自己免疫血清を調製した。具体的には、
２ｍｇの精子をＰＢＳ中で３回洗浄し、５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、フロイント
完全アジュバントにより１：１の容量で希釈し、皮下注射した。１カ月後に初回
ブースター投与を行い、更に２週間後に２回目のブースター投与を行い、更に２
週間後に３回目のブースター投与を行い、更に３カ月後に４回目のブースター投
与を行った。上述の一連のデカペプチドを用いて、上記のＥＬＩＳＡにより免疫
血清をスクリーニングした。結果を図１に示す。自己抗原エピトープが密集して
いることに注意すること。
実施例５
一連のウサギＳｐ１７デカペプチドへのプールされた自己免疫血清の結合
図２は、上記ＥＬＩＳＡにより上記の一連のデカペプチドに対してテストされ
た、抗精子抗体の力価が高い４人の輸精管切除術を施された男性の同量の血清プ
ールの結合を示している。
図２の全てのピークは、ヒト自己抗原性のＢ細胞エピトープを表していること
に注意すること。
実施例６
一連のウサギＳｐ１７デカペプチドへのＳｐ１７により免疫感作された
ウサギ血清の結合
組換えウサギＳｐ１７融合タンパク質により免疫感作された雌ウサギから得ら
れた免疫血清の、上記一連のデカペプチドへの結合を図３に示す。
組換え融合タンパク質は、以下のプライマーを使用してＰＣＲにより作製した
。プラス鎖に関しては、ＢａｍＨＩ部位を含む５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧ
ＴＣＧＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣ−３’、アンチセンスプライマープライマーに
関しては、ＫｐｎＩを含む５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＣＣ−ＣＴ
ＣＡＡＴＴＧＴ−３’。ＰＣＲ生成物は、ｐＱＥ−３０のポリリンカー領域に方
向性をもってクローニングされ、挿入断片が完全であるかを確認するために配列
決定され、Qiage Inc.（Chatsworth、カリフォルニア州）によって提供されたプ
ロトコールに従って細菌によって発現された。このシステムを用いて、最初の１
１個のＮ末端アミノ酸は欠失しているが、Ｓｐ１７アミノ酸に先行するＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒの配列と、その後に６個のヒスチジンと１個のグリシンとを含む
Ｎ末端を持ち組換えウサギＳｐ１７タンパク質（ｒＳｐ１７）が発現される。融
合タンパク質を、金属キレート吸着剤ニッケル−ＮＴＡ−アガロース（Qiagen，
Inc.）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細菌溶解物から精製し
た。融合タンパク質を、ｐＨを５．９に調整した８Ｍ尿素、０．１Ｍ燐酸ナトリ
ウム（一塩基）、０．０１Ｍトリスを用いて溶出し、ＰＢＳを３回変えて透析を
行った。１ｍｇのＡＤＪＵＰＲＩＭＥTMアジュバント（Pierce Chemical Co.，R
ockford，イリノイ州、米国）を加えた０．５ｍｌのＰＢＳに含めた２００μｇ
のタンパク質を皮下投与した。同じ容量の２００μｇの初回ブースターを３週間
後に投与した。
実施例７
一連のウサギＳｐ１７デカペプチドへのＧ２２Ｃにより免疫感作された
ウサギ血清の結合
上述のＥＬＩＳＡにより明らかにされた、上記実施例３に記述されている合成
ペプチドＧ２２Ｃを用いて免疫感作された雄ウサギから得られた免疫血清の上記
一連のデカペプチドへの結合を図４に示し、上記実施例３に記述されている合成
ペプチドＧ２２Ｃを用いて免疫感作された雌ウサギから得られた免疫血清の上記
一連のデカペプチドへの結合を図５に示す。
実施例８
一連のウサギＳｐ１７デカペプチドへのヒトＳｐ１７ウサギ免疫血清の結合
図７は、組換えヒトＳｐ１７（融合タンパク質）によるマウスの免疫感作が受
精能に及ぼす影響を示すものである。６匹のマウスはマウスＳｐ１７のみを投与
され、他の６匹のマウスはマウスＳｐ１７、その後ウサギＳｐ１７を投与され、
また他の６匹のマウスはヒトＳｐ１７のみを投与された。アジュバント対照（ｎ
＝１２）は、ＴＩＴＥＲＭＡＸTMアジュバント（Sigma Co.，St．Louisから入手
）のみを投与された。他の６匹のマウスは、何も注射されなかった。ヒトＳｐ１
７組換えタンパク質により免疫感作されたマウスは、妊娠率が４２％減少した。
組換えヒトＳｐ１７は、得られた生成物からＮ末端Ｓｐ１７アミノ酸が全く欠
失していなかった点を除いて、組換えウサギＳｐ１７に関する上記の方法と実質
的に同じ方法で、融合タンパク質として調製された。Ｂａｌｂ／ｃマウスはフロ
イント完全アジュバントにより１：１に希釈された、水に含めた約５μｇの融合
タンパク質を用いて免疫感作された。最初の免疫感作から４週間後、不完全アジ
ュバントに含めた融合タンパク質の注射を更に３回、２週間おきに行った。
実施例９
ヒトＳｐ１７の直線
図８は、ウサギ（ＲＡＢＳＰ１７）、マウス（ＭＵＳＳＰ１７）、ヒト（ＨＵ
ＭＳＰ１７）のＳｐ１７タンパク質配列のアラインメントを示している。自己抗
原断片を枠内に示す。ヒト配列の番号付けに基づきＮ末端からＣ末端に番号を付
け、枠内に表示される自己抗原断片のアラインメントを最大限にするために、他
の哺乳動物の配列に空白を入れ、枠内に表示されている自己抗原断片の番号が種
間で一致するように、空白の部分をとばして番号が付けられている。
実施例１０
ヒト精子透明帯への組換えＳｐ１７の結合
ビオチニル化されたヒト組換えＳｐ１７は、ヒト精子透明帯に結合することが
ＥＬＩＳＡによって示された。これは、組換え哺乳動物Ｓｐ１７が哺乳動物の精
子透明帯に結合することが初めて実証されたものである。
前記実施例は、本発明を説明するものであり、本発明を制限することを意図し
たものではない。本発明は以下の請求項によって定義され、請求項と同等物もこ
の中に含められる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 39/00 ＡＣＺ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ
Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 7/00
Ｃ０７Ｋ 7/00 9356−4Ｈ 14/47
14/47 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ 33/564 Ｚ
33/564 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02
//(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ
，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，
ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ
Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ
，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ウィドグレン，エスター・イー
アメリカ合衆国、27516 ノース・キャロ
ライナ、チャペル・ヒル、ブランディーワ
イド・ロード 324
(72)発明者 リチャードソン，リチャード・ティー
アメリカ合衆国、27514 ノース・キャロ
ライナ、チャペル・ヒル、ルート ９、ボ
ックス 511−ビー
(72)発明者 リー，イザベル・エイ
アメリカ合衆国、27514 ノース・キャロ
ライナ、チャペル・ヒル、エフェサス・チ
ャーチ・ロード 1250、アパートメント
エイチ１