CZ302852B6

CZ302852B6 - Imunogenní polypeptid, polynukleotid, farmaceutický prostredek, expresní vektor, ockovací vakcína, izolovaná hostitelská bunka a zpusob prípravy imunogenního polypeptidu

Info

Publication number: CZ302852B6
Application number: CZ20100086A
Authority: CZ
Inventors: A. W. Skeiky@Yasir; Alderson@Mark; Campos-Neto@Antonio
Original assignee: Corixa Corporation
Priority date: 1998-04-07
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 2011-12-14
Also published as: JP4516616B2; PL209260B1; CO5070585A1; US6544522B1; JP2009000107A; EP2397555A1; AR020066A1; AR067658A2; TWI223001B; NO20120234L; EP2383342A1; US20040013677A1; US7064195B2

Abstract

Imunogenní polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytku 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8A a 8B), kde uvedená aminokyselinová sekvence prípadne obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci a prípadne nemá na N-terminálním konci vazbu histidinových zbytku. Polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje zminovaný polypeptid. V jiném provedení se jedná o polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za mírne stringentních podmínek nebo vysoce stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k tretí nukleotidové sekvenci, která kóduje zbytky 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8A a 8B), prípadne bez vazby histidinových zbytku na N-terminálním konci, pricemž uvedený polynukleotid obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci kódující imunogenní polypeptid, jež je funkcne ekvivalentní zbytkum 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16, prípadne bez vazby histidinových zbytku na N-terminálním konci, v testu proliferace T bunek nebo testu produkce interferonu gama. Rešení se též týká polypeptidu kódovaného tímto, výše uvedeným, polynukleotidem, a farmaceutického prostredku obsahujícího zminovaný polypeptid nebo zminovaný polynukleotid. Dalšími predmety vynálezu jsou expresní vektor obsahující zminovaný polypeptid a ockovací vakcína obsahující zminovaný polypeptid nebo zminovaný polynukleotid. Též je popsána izolovaná hostitelská bunka, která rekombinantne exprimuje zminovaný polypeptid. Konecne, rešení se týká zpusobu prípravy polypeptidu, pri kterém se rekombinantne exprimuje výše uvedený polynukleotid.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká fuzních proteinů, obsahujících alespoň dva antigeny Mycobacterium tuberculosis. Zejména se týká bi - fuzních proteinů, které obsahují dva samostatné antigeny AT. tuberculosis, tri - fuzních proteinů, které obsahují tři antigeny M. tuberculosis, tetra - fuzních proteinů, které obsahují čtyři antigeny AT. tuberculosis a penta - fuzních proteinů, které obsahují pět antigenů M. tuberculosis, a způsobů jejich použití při diagnóze, léčbě a prevenci infekce tuberkulózy.

Dosavadní stav techniky

Tuberkulóza je chronické infekční onemocnění, způsobené infekcí AT tuberculosis. V rozvojových zemích to je závažné onemocnění a v rozvojové části světa jde o rostoucí problém, s přibližně 8 miliony nových případů a 3 miliony úmrtí každý rok. Ačkoliv infekce může být bez příznaků po značně dlouhou dobu, nemoc se obvykle projeví jako akutní zápal plic, mající za následek horečku a neproduktivní kašel. Jestliže je neléčena, typickým následkem jsou vážné komplikace a smrt.

Ačkoliv tuberkulóza může být obecně zvládnuta použitím širokospektrální antibiotické léčby, taková to léčba není postačující k prevenci rozšíření onemocnění. Infikovaní jednotlivci můžou být nějakou dobu bez příznaků, ale nakažliví. Dále, ačkoliv dodržení léčebného způsobu je rozhodující, chování pacienta je těžké sledovat. Někteří pacienti nedokončí léčebnou kůru, což může vést k neefektivnosti léčby a vytvoření rezistence na léky.

Pro kontrolu rozšíření tuberkulózy má největší význam účinné očkování a správná včasná diagnóza nemoci. Nyní je očkování živými bakteriemi nejúčinnější pro získání imunity. Nejobvyklejší Macobacterium, používané pro tento účel, je Bacillus Calmette - Guerin (BCG), avirulentní kmen A/, bovis. Nicméně bezpečnost a účinnost BCG je zdrojem polemiky a některé země jako Spojené státy tímto agens širokou veřejnost neočkují.

Diagnóza tuberkulózy je obvykle ukončena kožním testem, který zahrnuje podkožní expozici tuberkulinu PPD (proteinový purifikovaný derivát). Odpověď antigen - specifických T lymfocytů má za následek měřitelné zatvrdnutí v místě injekce za 48 až 72 hodin po injekci, které ukazuje expozici mycobakteriální antigeny. Nicméně citlivost a specifíta jsou problémem tohoto testu a jednotlivci očkovaní BCG nemůžou být významně odlišeni od infikovaných jednotlivců.

Zatímco makrofágy byly ve skutečnosti dokázány jako hlavní efektory imunity proti M. tuberculosis, T lymfocyty jsou převládající induktory této imunity. Nezbytná role T lymfocytů při ochraně proti infekci AT. tuberculosis je dokázána častým výskytem AT. tuberculosis u pacientů se syndromem získaného selhání imunity z důvodu zničení CD4+ T lymfocytů asociovaných s virem způsobujícím AIDS (HIV). Na Mycobacterium reagující CD4+ T lymfocyty se ukázaly být silným producentem gama - interferonů (IFN - y), které se, v tomto případě, ukázaly být v myších spouštěčem anti - mycobacteriálního účinku makrofágů. Zatímco úloha IFN - y u lidí e málo jasná, studie ukázaly, že 1,25 - dihydroxy - vitamín D 3, buď samotný nebo v kombinaci s IFN - y nebo s faktorem alfa potlačujícím nádor, aktivuje lidské makrofágy k inhibici infekce AT. tuberculosis. Kromě toho je známo, že IFN - y podněcuje lidské makrofágy k tvorbě 1,25 dihydroxy - vitamínu D 3. Podobně bylo ukázáno, že interleukin - 12 (IL - 12) hraje roli při vytvoření rezistence proti infekci AT. tuberculosis. Pro přehled imunologie infekce AT. tuberculosis

-1CZ 302852 Β6 viz. Chán a Kaufmann, 1994, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC.

Proto je potřeba zlepšit očkování a zdokonalit metody pro diagnózu, prevenci a léčení tuberkulózy.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je imunogenní polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci a případně nemá na N-terminálním konci vazbu histidinových zbytků. Výhodně je imunogenní polypeptid tvořený z aminokyselinové sekvence podle zbytků 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci a případně nemá na N-terminálním konci vazbu histidinových zbytků. Dále je imunogenní polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), případně bez vazby histidinových zbytků na Nterminálním konci.

Dalším předmětem vynálezu je imunogenní polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků 9 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci. Výhodně je imunogenní polypeptid tvořený z aminokyselinové sekvence podle zbytků 9 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci.

V dalším předmětu vynálezu polynukleotid obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid výše uvedený. Dále byl vynalezen polynukleotid obsahující nebo složený z nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 15 (obr. 8 A a 8 B) nebo sekvence, jež kóduje tentýž genový produkt nebo genový produkt, jež je imunologicky ekvivalentní v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.

V jiném provedení vynálezu se jedná o polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za mírně stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje zbytky 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), případně bez vazby histidinových zbytků na N-terminálním konci, přičemž uvedený polynukleotid obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci kódující imunogenní polypeptid, jež je funkčně ekvivalentní zbytkům 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16, případně bez vazby histidinových zbytků na N-terminálním konci, v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama. V dalším provedení jde o polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za vysoce stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje zbytky 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), případně bez vazby histidinových zbytků na N-terminálním konci, přičemž uvedený polynukleotid obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci kódující imunogenní polypeptid, jež je funkčně ekvivalentní zbytkům 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16, případně bez vazby histidinových zbytků na N-terminálním konci, v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.

Vynález se též týká polypeptidu kódovaného tímto, výše uvedeným, polynukleotidem, A dále se týká farmaceutického prostředku obsahujícího zmiňovaný polypeptid nebo zmiňovaný polynukleotid.

-2CZ 302852 B6

Dalšími předměty vynálezu jsou expresní vektor obsahující zmiňovaný polypeptid a očkovací vakcína obsahující zmiňovaný polypeptid nebo zmiňovaný polynukleotid. Též je popsána izolovaná hostitelská buňka, která rekombinantně exprimuje zmiňovaný polypeptid.

Konečně se vynález týká též způsobu přípravy polypeptidu, při kterém se rekombinantně exprimuje výše uvedený polynukleotid.

Dále bude předkládaný vynález, týkající se fúzních proteinů anti genů A/. tuberculosis, popsán podrobněji v širších souvislostech. Částečně se vynález týká fúzních polypeptidů, které obsahují dva nebo více anti genů M tuberculosis, póly nukleotidů kódující takové polypeptidy, použití polypeptidů a polynukleotidů v diagnóze, léčbě a prevenci infekce M. tuberculosis.

Předkládaný vynález je částečně založen na objevu vynálezců, že póly nukleotidy, které obsahují dvě až pět sekvencí Λ/. tuberculosis, kódujících produkované rekombinantní fuzní proteiny, si uchovávají imunogenitu a antigenitu jejich jednotlivých částí. Fúzní proteiny, popsané zde, indukují odpověď T a B lymfocytů, jak bylo změřeno proliferací T lymfocytů, produkcí cytokinů a protilátek. Kromě toho fúzní protein byl použit jako imunogen s pomocnou látkou in vivo k vyvolání obou imunit, a sice buněčné a humorální imunity proti M. tuberculosis. Dále fúzní protein může být vytvořen fúzí konstruktu a použit v očkovací látce s pomocnou látkou k zajištění dlouhodobé ochrany zvířat proti rozšíření tuberkulózy. Fúzní protein byl více účinný imunogen než směs jeho jednotlivých proteinových částí.

Specifická část vynálezu, izolované nebo purifikované polypeptidy A/. tuberculosis podle vynálezu mohou být připraveny jako farmaceutický prostředek pro podávání subjektu pro prevenci a/nebo léčbu infekce Λ1. tuberculosis. Imunogenicita fúzního proteinu může být zvýšena přidáním pomocné látky.

Jiný aspekt vynálezu, izolace nebo purifikace polynukleotidů, je používán pro produkování rekombinantních fúzních polypeptídových antigenů in vitro. Volitelně póly nukleotidy mohou být podávány přímo subjektu jako DNA očkování v případě exprese antigenu uvnitř subjektu a následné indukci imunitní odpovědi proti Aí tuberculosis.

Další předmět vynálezu je, že polypeptidy jsou používány při in vivo analýze pro detekci humorálních protilátek nebo buněčné imunity proti M. tuberculosis pro diagnózu infekce nebo sledování průběhu nemoci. Dále polypeptidy mohou být použity jako in vivo diagnostická látka ve formě podkožního testu. Volitelně polypeptidy mohou být použity jako imunogeny pro přípravu protilátek proti M. tuberculosis na zvířatech. Protilátky mohou být použity k detekci cílových antigenů in vivo a in vitro.

Předkládaný vynález se týká antigenů, užitečných pro léčbu a prevenci tuberkulózy, polynukleotidů, kódujících takové antigeny, a způsobů jejich využití. Antigeny v předkládaném vynálezu jsou fúzní polypeptidy antigenů M. tuberculosis ajejich varianty. Přesněji, antigeny podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň dva polypeptidy M. tuberculosis, které jsou spojeny ve větší fúzní polypeptidovou molekulu. Antigeny podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat jiné složky, navržené ke zvýšení imunogenity antigenů nebo pro zlepšení těchto antigenů v jiných směrech, například při izolaci těchto antigenů prodloužením jednoho konce antigenu histidinovými zbytky.

Specifické antigeny M. tuberculosis - Antigeny podle předkládaného vynálezu jsou doloženy na figures l A až 13B, včetně homologie a variant těchto antigenů. Tyto antigeny mohou být modifikovány, například připojením peptidových sekvencí, popsaných níže. Tyto připojené peptidy mohou být vloženy mezi jeden nebo více polypeptidů, které vytvoří všechny fúzní proteiny, ukázané na figures 1A až 13B. Jiné antigeny podle předkládaného vynálezu jsou antigeny popsané na figures 1A až 13B, které mohou být spojeny do známého antigenu M. tuberculosis tak, jak byl

-3CZ 302852 B6 dříve popsán 38 kD (SEQ ID NO:27) antigen (Andersen and Hansen, 1989, Infect. Immun. 57: 2481 - 2488; Genbank Accesion No. M30046).

Měření imunogenicity - Antigeny zde popsané, a jejich imunogenícká část, mají schopnost vyvolat imunitní reakci. Přesněji antigeny mají schopnost vyvolat proliferaci a/nebo produkci cytokinů (například produkci interferonu - γ a/nebo interleukinu - 12) v T lymfocytech, NK lymfocytech a/nebo makrofázích získaných od jednotlivců s imunitou proti ΛΪ. tuberculosis. Výběr lymfocytního typu pro použití k vyhodnocení imunitní odpovědi na antigen bude záviset na očekávané odpovědi. Například produkce interleukinu — 12 je snadněji vyhodnocená při použití preio pařátu, který obsahuje B lymfocyty a/nebo makrofágy. Jedinec s imunitou proti M. tuberculosis je ten, u něhož se bere v úvahu rezistence vůči rozvoji tuberkulózy díky větší efektivitě T lymfocytní reakce proti M. tuberculosis (například podstatně slabší symptomy nemoci). Tito jedinci mohou být určeni na základě silné pozitivity (například více než přibližně 10 mm průměru zatvrdnutí tkáně) při reakci na podkožní test na tuberkulózní proteiny (PPD) a absenci jakýchkoliv znaků nebo symptomů nemoci tuberkulózy. T lymfocyty, NK lymfocyty, B lymfocyty a makrofágy, získané od jedinců s imunitou proti M. tuberculosis, mohou být připraveny použitím metod, známým pracovníkům v oboru. Například příprava PBMCs (například periferních krevních mononukleámích buněk) může být provedena bez další separace buněčných komponent. PBMCs může být obecně připravena například gradientovou centrifugací přes „FICOLL“ (Winthrop

Laboratories, NY). T lymfocyty pro použití pro měření zde popsané mohou být také purifikovány přímo z PBMCs. Volitelně mohou být připraveny obohacené T lymfocytní linie, reagující proti mycobakteriálním proteinům, nebo T lymfocytní klony, reagující na jednotlivé mycobakteriální proteiny. Tyto T lymfocytní klony mohou být připraveny například kultivací PBMCs od jednotlivců s imunitou proti Λ/. tuberculosis a mycobakteriálními proteiny po dobu 2 až 4 týdny. To umožní rozvoj pouze T lymfocytů specifických na mycobakteriální proteiny, jehož výsledkem jsou linie složené výhradně s takovýchto lymfocytů. Tyto lymfocyty pak mohou být klonovány a testovány s jednotlivými proteiny použitím metod, známých pracovníkům v oboru, pro přesnější určení jednotlivé T lymfocytní specifiky. Obecně antigeny, které jsou pozitivně testovány při měření na proliferaci a/nebo produkci cytokinů (například produkce interferonu - γ a/nebo inter30 leukinu - 12) s použitím T lymfocytů, B lymfocytů a/nebo makrofágů získaných od jedinců s imunitou proti M. tuberculosis, jsou pokládány za ímunogenní. Takové měření může být dostatečné například s použitím uvedených postupů popsaných níže. Imunogenické části takových antigenů mohou být identifikovány použitím podobných měření a mohou být přítomny v polypeptidech zde popsaných.

Schopnost polypeptidů (například ímunogenní antigeny nebo jejich část nebo jejich jiná obměna) indukovat proliferaci lymfocytů je určená kontaktem lymfocytů (například T lymfocytů a/nebo NK lymfocytů) s polypeptidem a měřením proliferace lymfocytů. Obecně, množství polypeptidů, které je dostatečné pro určení přibližně 10⁵ lymfocytů, je v rozmezí od přibližně 10 ng/ml do přibližně 100pg/ml a přednostně je přibližně 10pg/ml. Inkubace polypeptidů s lymfocyty obvykle probíhá při 37 °C přibližně šest dní. Po inkubaci s polypeptidem je následně reakce lymfocytů měřena proliferaci, která může být určena metodami známými pracovníkům v oboru, jako je expozice buněk dávkám radioaktivně značeného thymidinu a měření jeho inkorporace do buněčné DNA. Obecně polypeptidy, které mají za následek alespoň trojnásobné zvýšení prolife45 race nad pozadí (například proliferace pozorovaná u kultur lymfocytů bez polypeptidů), jsou považovány za schopné indukovat proliferaci.

Schopnost polypeptidů stimulovat produkci interferonu γ a/nebo interleukinu - 12 v lymfocytech může být určena kontaktem lymfocytů s polypeptidem a měřením hladiny produkce interferonu 50 γ a/nebo interleukinu - 12 lymfocyty. Obecně množství polypeptidů, které je dostatečné pro určení přibližně 10⁵ lymfocytů, je v rozmezí od přibližně 10 ng/ml do přibližně 100 pg/ml a přednostně je přibližně 10pg/ml. Polypeptid může, ale nemusí, být imobilizován na pevném povrchu, jako jsou korálky nebo biodegradovatelné mikrokuličky, takové, jaké jsou popsány v U.S. Patent Nos. 4,897,268 a 5,075,109. Inkubace polypeptidů s lymfocyty obvykle probíhá při 37 °C šest

-4CZ 302852 B6 dní. Následuje inkubace s polypeptidem, v lymfocytech je měřen interferon - γ a/nebo interleukin - 12 (nebo jedna nebo více jeho subjednotek), který může být určen metodami, které jsou pracovníkům v oboru známé, jako je měření pomocí enzymu navázaného na imunosorbent (ELISA) nebo, v případě IL - 12 P70 subjednotky, bioměření, jako je měření proliferace T lymfocytů. Obecně polypeptid, který má výsledky produkci alespoň 50 pg interferonu — γ v ml supematantu kultury (obsahující 104 až 10⁵ T lymfocytů v ml), je považován za schopného stimulovat produkci interferonu - γ. Polypeptid, který stimuluje produkci alespoň 10 pg/ml subjednotky IL - 12 P70 a/nebo alespoň 100 pg/ml subjednotky IL - 12 P40 v 105 makrofágů nebo B lymfocytů (nebo v 3 x 105 PBMC), je považován za schopného stimulovat produkci IL - 12.

Obecně imunogenické antigeny jsou takové antigeny, které stimulují proliferaci a/nebo produkci cytokinu (například produkci interferonu - γ a/nebo interleukinu - 12) v T lymfocytech, NK lymfocytech, B lymfocytech a/nebo makrofázích u alespoň přibližně 25 % jedinců s imunitou vůči M. tuberculosis. Mezi těmito imunogenickými antigeny mohou být rozlišeny polypeptidy, které mají lepší terapeutické vlastnosti, na základě velikosti reakce při výše uvedených měření a na základě procentuálního zastoupení jedinců, u nichž je reakce pozorována. Navíc antigeny, které mají lepší terapeutické vlastnosti, nebudou stimulovat proliferaci a/nebo produkci cytokinu in vitro v lymfocytech získaných od více než přibližně 25 % jedinců, kteří nemají imunitu proti M. tuberculosis, z důvodu nepřítomnosti odpovědi, která není u lymfocytů, odpovídajících na ΛΖ tuberculosis, specifická. Tyto antigeny, které indukují reakci u vysokého procenta T lymfocytů, NK lymfocytů, B lymfocytů a/nebo makrofágů, připravených z jedinců s imunitou proti ΛΖ tuberculosis (s nízkým výskytem odpovědi v lymfocytech připravených z jiných jedinců), mají lepší terapeutické vlastnosti.

Antigeny s lepšími terapeutickými vlastnostmi mohou být také identifikovány na základě jejich schopnosti snížit sílu infekce M tuberculosis u experimentálních zvířat, jestliže jsou jim podávány jako očkování. Vhodná příprava očkování pro použití na experimentálních zvířatech je popsáno podrobně níže. Účinnost může být určena na základě schopnosti antigenů zajistit alespoň přibližně 50 % snížení počtu bakterií a/nebo alespoň přibližně 40 % pokles úmrtnosti při následné pokusné infekci. Vhodné pokusná zvířata zahrnují myši, guinejská prasata a primáty.

Izolace kódujících sekvencí - Předkládaný vynález se také týká molekul nukleových kyselin, které kódují fúzní polypeptidy M. tuberculosis. V části příklad provedení vynálezu bylo sestaveno třináct fúzních kódujících sekvencí M. tuberculosis. Podle vynálezu nukleotidová sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci fúzního proteinu, může být připravena rekombinací molekul, které jsou přímo exprimovány podle kódující sekvence.

Pro klonování zcela dlouhých kódujících sekvencí nebo homologních variant pro přípravu fúzních póly nukleotidů, mohou být značené DNA sondy, sestrojené z části nukleotidových sekvencí nebo komplementů zde uvedených, ověřeny v genomické nebo cDNA knihovně, připravené z různých kmenů M. tuberculosis pro identifikování kódujících sekvencí nebo jejich jednotlivých částí. Izolace kódujících sekvencí může být také provedena polymerázovými řetězovými reakcemi (PCR) použitím dvou degenerovaných oligonukleotidových příměrů zdrojů na základě kódujících sekvencí zde uvedených.

Vynález se také týká izolace nebo purifikace polynukleotidů komplementárních k nukleotidovým sekvencím SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 a polynukleotidům, které jsou selektivně hybridizované na takové komplementární sekvence. Upřednostňovaná část poskytuje polynukleotid, který hybridizuje na sekvenci SEQ ID NOS: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 nebo její komplementární sekvenci v podmínkách nízké přesnosti a který kóduje protein, který si uchovává imunogenitu fúzních proteinů SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 a 26. Podle nezkráceného příkladu, vhodné podmínky nízké přesnosti jsou následující (víz také Shilo and Weinberg, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:6789 - 6792): filtry obsahující DNA jsou připraveny 6 hodin při 40 °C v roztoku obsahujícím 35 % formamidu, 5 x SSC, 50 mM Tris - HC1 (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1 % PVP, 0,1 % Ficollu, 1 % BSA a

-5CZ 302852 B6

500 pg/ml denaturované lososové spermové DNA. Hybridizace proběhne ve stejném roztoku s následujícími modifikacemi: 0,02 % PVP, 0,02 % Ficollu, 0,2 % BSA, 100 pg/ml lososové spermové DNA, 10 % roztok síranu dextranu aje použita 5 až 20 x 106 cpm 32P značená sonda. Filtry jsou inkubovány v hybridizační směsi 18 až 20 hodin při 40 °C a pak jsou promývány 1,5 hodiny při 55 °C v roztoku obsahujícím 2 x SSC, 25 mM Tris - HCI (pH 7,4), 5 mM EDTA a 0,1 % SDS. Promývací roztok je nahražen čerstvým roztokem a další inkubace trvá 1,5 hodiny při 60 °C. Filtry jsou odsáty do sucha a autoradíograficky vyvolány. Jestliže je to nezbytné, filtry jsou promyty potřetí při 65 až 68 °C a znovu vyvolány. Ostatní podmínky nízké přesnosti, které mohou být použity, jsou v oboru dobře známy (například zařízení pro mezidruhovou hybridizaci).

Jiná upřednostňovaná část poskytuje polynukleotid, který hybridizuje na kódující sekvenci SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 nebo její komplementární sekvenci v podmínkách vysoké přesnosti a který kóduje protein, který si uchovává imunogenitu fuzních proteinů SEQ ID NOS: 2,4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 a 26. Podle nezkráceného příkladu, vhodné podmínky vysoké přesnosti jsou následující: pře - hybridizace filtrů, obsahujících DNA, se provádí od 8 hodin až přes noc při 65 °C v pufru, skládajícího se z 6 x SSC, 50 mM Tris - HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02 % PVP, 0,02 % Ficollu, 0,02 % BSA a 500 pg/ml denaturované lososové spermové DNA. Filtry jsou hybridizovány 48 hodin při 65 °C v pre - hybridizační směsy, obsahující 100 pg/ml denaturované lososové spermové DNA a 5 až 20 x 106 cpm 32P značené sondy. Promytí filtrů se provádí při 37 °C 1 hodinu v roztoku obsahujícím 2 x SSC, 0,01 % PVP, 0,01 % Ficoll a 0,01 % BSA. Dále následuje před autoradiografií promytí v 0,1 x SSC při 50 °C při 45 minut. Ostatní podmínky vysoké přesnosti, které mohou být použity, jsou v oboru dobře známy.

Další upřednostňovaná část poskytne polynukleotid, který hybridizuje na kódující sekvenci SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25 nebo její komplementární sekvenci v podmínkách mírné přesnosti a který kóduje protein, který si uchovává imunogenitu fuzních proteinů SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 a 26. Vhodné podmínky mírné přesnosti jsou následující: filtry obsahující DNA se připravují 6 hodin při 55 °C v roztoku obsahujícím 6x SSC, 5 x Denhartův roztok a 100 pg/ml denaturované lososové spermové DNA. Hybridizace proběhne ve stejném roztoku a je použita 5 až 20 x 106 cpm 32P značená sonda. Filtry jsou inkubovány v hybridizační směsi 18 až 20 hodin při 55 °C a pak promyty dvakrát 30 minut při 60 °C v roztoku obsahujícím 1 x SSC a 0,1 % SDS. Filtry jsou odsáty do sucha a autoradíograficky vyvolány. Ostatní podmínky mírné přesnosti, které mohou být použity, jsou v oboru dobře známy. Promytí filtrů probíhá při 37 °C 1 hodinu v roztoku, obsahujícím 2 x SSC, 0,1 % SDS.

Polypeptidy kódované kódující sekvencemi - V souladu s vynálezem, polynukleotid podle vynálezu, který kóduje fúzní protein, jeho fragmenty nebo jeho funkční ekvivalenty, může být použit k přípravě rekombínantních molekul nukleových kyselin, které přímo expresují fuzní protein, jeho fragmenty nebo jeho funkční ekvivalenty, ve vhodných hostitelských buňkách. Fúzní polypeptidové produkty, kódované takovými polynukleotidy, mohou být pozměněny molekulární manipulací kódující sekvence.

Z důvodu vlastní degenerace genetického kódu, ostatní sekvence DNA, které kódují v podstatě stejné nebo funkční ekvivalenty aminokyselinové sekvence, mohou být použity při praktickém užití vynálezu pro expresi fuzních polypeptidů. Tyto sekvence DNA obsahují takové sekvence, které jsou schopné hybridizovat na kódující sekvence nebo jejich komplementy, zde uvedené, při nízké, mírné nebo vysoké přesnosti při podmínkách popsané v oddílu izolace kódujících sekvencí.

Pozměnění nukleotidových sekvencí, kterých může být použito v souladu s vynálezem, zahrnující delece, vložení nebo substituce odlišných nukleotidových zbytků, které mají za důsledek sekvenci, která kóduje stejný nebo funkčně ekvivalentní genový produkt. Genový produkt sám o

-6CZ 302852 B6 sobě může obsahovat delece, vložení nebo substituce aminokyselinových zbytků, které mají za následek neúčinnou výměnu, a tak produkují funkční ekvivalent antigenového epitopu. Takové konzervativní aminokyselinové substituce mohou být připraveny na základě podobné polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobicity, hydrofilicity a/nebo amfipatického charakteru zahrnutých zbytků. Například aminokyseliny s negativním nábojem zahrnují kyselinu aspartátovou a kyselinu glutamovou; aminokyseliny s pozitivním nábojem zahrnují lysin, histidin a arginin; aminokyseliny s nenabitými polárními hlavními skupinami, které mají podobné hodnoty hydrofobicity, zahrnují následující: glycin, asparagin, glutamin, serin, treonin a ty ros i n; a aminokyseliny s nepolárními hlavními skupinami zahrnují alanin, valin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, metionin a tryptofan,

Nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být navrženy jako sekvence kódující pozměněný fúzní protein s různými konci, zahrnující také změny, které pozměňují zpracování a expresi genového produktu. Například mutace mohou být způsobeny použitím technik, které jsou v oboru dobře známy, například cílená lokální mutageneze, vložení nového restrikčního místa, pozměnění glykosy lační látky, fosfory láce a tak dále. V alternativní části vynálezu kódující sekvence fúzního proteinu může být syntetizována, celá nebo část, použitím chemických metod v oboru dobře známých. Viz. například Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7 : 215 - 233; Crea and Hom, 180, Nuc. Acids Res. 9 (10): 2807 - 2817. Volitelně polypeptid sám o sobě může být připraven použitím chemických metod syntetizováním aminokyselinové sekvence celé nebo části. Například peptidy mohou být syntetizovány technikami na pevné fázi, odštěpeny z nosiče a purifikovany preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií. (Viz. Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y. pp. 50 - 60). Složení syntetických polypeptidů může být potvrzena aminokyselinovou analýzou nebo sek věnováním (například degradačním procesem podle Edmana; viz. Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y. pp. 34 - 49).

Dále kódující sekvence fúzního proteinu může být mutována in vitro nebo in vivo k vytvoření a/nebo zabránění translační, iniciační a/nebo term i načni sekvence nebo k vyvolání změn v kódujících oblastech a/nebo k vytvoření nových restrikčních míst endonukleázy nebo k zabránění jejich odstranění k usnadnění další in vitro modifikace. Techniky pro mutageneze známé v oboru zahrnují také chemické mutageneze, in vitro cílené lokální mutageneze (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), použití TAB® linkrů (Pharmacia) a podobně. Je důležité, že manipulace nezabraňují imunogenitě fúzních polypeptidů.

Dále mohou být netypické aminokyseliny nebo chemické aminokyselinové analogy zavedeny do sekvence jako substituce nebo přídavek. Netypické aminokyseliny zahrnují také D - izomery obvyklých aminokyselin, a - aminoisobutánovou kyselinu, 4 - aminobutánovou kyselinu, Abu, 2 - aminobutánovou kyselinu, γ - Abu, ε — Ahx, 6 - aminohexanovou kyselinu, Aib, 2 aminoisobutánovou kyselinu, 3 - aminopropionovou kyselinu, omitin, norleucin, norvalin, hydroxyprolin, sarcosin, citrulin, cysteinovou kyselinu, t - butylglycin, t - butylalanin, fenylglycin, cyklohexyalanin, β - alanin, fluoroaminokyseliny, uměle vytvořené aminokyseliny jako jsou β methylaminokyseliny, a - C - methy laminokysel iny, α - N - methy laminoky sel iny a aminokyselinové analogy obecně. Kromě toho aminokyselina může být D (pravotočivá) nebo L (levotočivá).

V některém případě ve specifické části vynálezu jsou kódující sekvence každého antigenů ve fúzním proteinu spojeny v N nebo C konci přes peptidovou vazbu. Volitelně může být vytvořena sekvence peptidového můstku k oddělení jednotlivých polypeptidů, které tvoří fúzní polypeptid, dostatečnou vzdáleností k zabezpečení toho, aby se každý polypeptid složil do sekundární a terciální struktury, která maximalizuje jeho antigenickou účinnost pro prevenci a léčbu tuberkulózy. Takové sekvence peptidového můstku jsou začleněny do fúzního proteinu použitím standardních technik v oboru dobře známých. Vhodné sekvence peptidového můstku mohou být vybrány na základě následujících faktorů: (1) schopnosti získat flexibilní prodlouženou konformaci; (2) neschopnosti získat sekundární strukturu, která může interagovat s funkčním epitopem prvního a

-7CZ 302852 B6 druhého polypeptidů; a (3) nedostatek hydrofóbních nebo nabitých zbytků, které silně reagují s polypeptidovým funkčním epitopem. Upřednostňované sekvence peptidového můstku obsahují Gly, Asn a Ser zbytky. Ostatní téměř neutrální aminokyseliny, jako je Thr a Ala, mohou být také použity v sekvenci můstku. Aminokyselinové sekvence, které mohou být výhodně použity jako obsahující můstky, byly uvedeny v Marateaet al., Gene 40 : 39-46, 1985; Murphy et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 8258 - 8262, 1986; U. S. Patent 4,751,180. Sekvence můstku mohou být od 1 do 50 aminokyselin dlouhé. Peptidové sekvence nejsou potřeba, když první a druhý polypeptid má neesenciální N-koncové aminokyselinové oblasti, které mohou být použity k oddělení funkčních domén a k zabránění stérické interference. Například antigeny ve fúzním proteinu mohou být spojeny flexibilním polylínkerem, jako jsou Gly-Cys—Gly nebo Gly-GlyGly-Gly-Ser, opakující se 1 až 3 krát (Bird et al., 1988, Science 242: 423 - 426; Chaudhary et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 87: 1066- 1070).

V jedné části vynálezu je takový protein připraven expresí rekombinantní nukleové kyseliny, kódující protein. Takový fúzní produkt může být ligován vhodnými sekvencemi nukleových kyselin, kódujících navzájem vhodné aminokyselinové sekvence, metodami známými v oboru, ve vlastním kódujícím rámci a exprimovat produkt metodami známými v oboru. Volitelně takový produkt může být připraven technikami proteinové syntézy, například použitím peptidového syntetizátoru. Kódující sekvence pro ostatní molekuly, jako je cytokin nebo pomocná látka, mohou být také přidány do fúzního polynukleotidu.

Produkce fúzních proteinů - K produkci fúzního proteinu podle vynálezu je nukleotidová sekvence, kódující protein nebo jeho funkční ekvivalent, vložena do vhodného expresního vektoru, například do vektoru, který obsahuje nezbytné části pro transkripci a translaci vložené kódující sekvence. Hostitelské buňky nebo buněčné linie transfekované nebo transformované rekombinantními expresními vektory mohou být použity k různým cílům. Ty zahrnují také velkou míru produkce fúzního proteinu.

Metody, které jsou dobře známy odborníkům, mohou být použity pro konstrukci expresních vektorů, které obsahují fúzní kódující sekvence a vhodné transkripční/translační kontrolní signály. Tyto metody zahrnují in vitro rekombinantní DNA techniky, syntetické techniky a invivo rekombinace/genetické rekombinace. (Viz., například, techniky popsané v Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory, N. Y. a Ausubel et al, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.). RNA schopná kódovat polypeptid může být také chemicky syntetizovaná (Gait, ed., 1984, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford).

Expresní systémy - Různé hostitelské expresní vektorové systémy mohou být použity pro expresi sekvence kódující fúzní protein. Ty zahrnují také mikroorganismy, jakou jsou bakterie (Například E. coli, B. sub t His) transformované bakteriofágem, s rekombinantní DNA, expresními vektory s plasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA, které obsahují kódující sekvenci; kvasinky (například Saccharomycdes, Pichia) transformované rekombinantními kvasinkovými expresními vektory, které obsahují kódující sekvenci; hmyzí buněčné systémy, infikované rekombinantními virovými expresními vektory (například baculovirus); rostlinné buněčné systémy infikované rekombinantními expresními vektory (například virus květákové mozaiky; CaMV; virus tabákové mozaiky, TM V) nebo transformované rekombinantními plasmidovými expresními vektory (například Ti plasmid), které obsahují kódující sekvenci; nebo savčí buněčné systémy (například COS, CHO, ΒΗΚ, 293, 3T3 buňky). Expresní složky těchto systémů se liší sílou a specifítou.

V závislosti na použitém hostitelském/vektorovém systému, některé z množství vhodných transkr i pěních a translačních složek, které obsahují konstitutivní a inducibilní promotory, mohou být použity v expresním vektoru. Například když klonujeme v bakteriálním systému, mohou být použity inducibilní promotory, jako jsou pL z bakteriofágu λ, plac, ptrp, ptač (ptrp - lac hybridní promotor; cytomegalovirus promotor) a podobně; když klonujeme v hmyzím buněčném systému, mohou být použity promotory jako je baculovirus polyhedron promotor; když klonujeme

-8CZ 302852 B6 v rostlinném buněčném systému, mohou být použity promotory odvozené z genomu rostlinných buněk (například heat shok promotory; promotor pro malé subjednotky RUBISCA; promotor pro protein vázající chlorofyl α/β) nebo z rostlinných virů (například 35S RNA promotor CaMV; promotor obalujícího proteinu TM V); když klonujeme v savčím buněčném systému, mohou být použity promotory odvozené z genomu savčích buněk (například metalothioninový promotor) nebo ze savčích virů (například pozdní adenovirový promotor; 7,5 K. promotor viru neštovic); když připravujeme buněčné linie, které obsahují více kopií sekvence kódující antigen, mohou být použity vektory na základě SV 40-, BPV- a EBV- s vhodným selektivním markrem.

Pro expresy antigenů M. tuberculosis jsou upřednostňovány bakteriální systémy. Pro dodání in vivo, bakterie jako Bacillus ~ Calmette - Guerrin mohou být využity pro expresy fúzních polypeptidů podle vynálezu na jejich buněčném povrchu. Množství jiných bakteriálních expresních vektorů může být vhodně vybráno v závislosti na zamýšlené expresi produktů. Například jestliže má být produkováno velké množství fúzního proteinu pro vytvoření farmaceutických směsí, mohou být vhodné ty vektory, které přímo expresují vysokou hladinu fúzních proteinových produktů, které se snadno purifikují. Takové vektory zahrnují také expresní vektor E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), ve kterém kódující sekvence může být ligována do vektoru v konstruktu s lacZ kódující oblastí, takže hybridní produkt je produkován; ρΓΝ vektory (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101 - 3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503 - 5509); a podobně. pGEX vektory mohou být také použity pro expresí cizích polypeptidů jako jsou fúzní proteiny s glutathion S - transferázou (GST). Obecně takové fúzní proteiny jsou rozpustné a mohou být snadno purifikovány z lyzátu buněk absorpcí na glutathion - agarosové korálky, po které následuje eluce v přítomnosti volného glutathionu. pGEX vektory jsou sestrojeny tak, že obsahují trombin nebo faktor štěpících míst Xa proteázy, takže sledovaný klonovaný fúzní polypeptid může být uvolněn z GST části.

Proteinová purifikace - Jestliže probíhá exprese rekombinantního proteinu, může být identifikován měřením na základě fyzikálních nebo funkčních vlastností produktu, které zahrnují radioaktivní značení produktu, po kterém následuje gelová elektroforéza, radioimunoanalýza, ELISA, bioměrení a tak dále.

Jakmile je jednou kódovaný protein identifikován, může být isolován a purifikován standardními metodami, které zahrnují ehromatografií (například vysokotlakou kapalinovou ehromatografií, iontovou ehromatografií, afmitní a kolonovou ehromatografií), odstřeďování, rozdílnou rozpustnost nebo jinou standardní techniku pro purifikaci proteinů. Skutečné podmínky, které budou použity, částečně závisí na faktorech, jako je celkový náboj, hydrofobicita, hydrofilicita a tak dále, ajsou zřejmé těm, kteří jsou kvalifikovaní v oboru. Funkční vlastnosti mohou být určeny použitím vhodných měření jako je navázání protilátek, indukce proliferace T lymfocytů, stimulace produkce cytokinu, jako je IL 2, IL - 4, IFN - γ. Pro praxi podle předkládaného vynálezu je upřednostňováno, aby každý fúzní protein byl alespoň z 80 % purifikován od ostatních proteinů. Více je upřednostňováno, aby byly purifikovány alespoň z 90 %. Pro podávání in vivo je upřednostňováno, aby proteiny byly purifikovány z více než 95 %.

Použití sekvence kódující fúzní protein - Sekvence kódující fúzní protein podle vynálezu mohou být použity ke kódování proteinového produktu pro jeho použití jako imunogen k indukci a/nebo zvýšení imunitních reakcí proti \í tuberculosis. Navíc taková kódující sekvence může být ligována s kódující sekvencí jiné molekuly, jako je cytokin nebo pomocná látka. Tyto molekuly mohou být použity in vivo jako DNA očkovací látka (U. S. Patent 5,589,466; 5,679,647; 5,703,055). V této části vynálezu exprese póly nukleotidu v příjemci přímo indukuje imunitní reakci. Polynukleotidy mohou být podány injekčně do subjektu, se kterým ještě nebyl podniknut žádný pokus, pro navození primární imunitní reakce na jeho kódovaný produkt nebo pro zvýšení sekundární imunitní odpovědi infikovaného nebo imunizovaného subjektu.

V upřednostňované části vynálezu terapeutický prostředek obsahuje sekvenci kódující fúzní protein nebo fragmenty, které jsou částí expresního vektoru. Zvláště takový polynukleotid obsahuje

-9CZ 302852 B6 promotor schopný spojení s kódující oblastí, vedený promotor je inducibilní nebo konstitutivní a, volitelně, tkáňově specifický. V jiné části polynukleotid obsahuje kódující sekvenci ohraničenou oblastmi, které podporují homologní rekombinaci ve vhodném místě v genomu, takže způsobují intrachromozomální expresi kódující sekvence (Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8932 - 8935; Zijlstra et aí, 1989, Nátuře 342: 435 - 438).

Podání nukleové kyseliny do subjektu může být provedeno bud¹ přímo, v tom případě subjekt je přímo vystaven nukleové kyselině nebo vektoru nesoucího nukleovou kyselinu, nebo nepřímo, v tom případě jsou buňky nejdříve transformovány nukleovou kyselinou in vitro a pak přeneseny do subjektu. Tyto dva přístupy jsou známy jako in vivo nebo ex vivo genový přenos.

Ve specifické Části vynálezu nukleová kyselina je přímo podávána in vivo, kde probíhá exprese a produkce kódovaného fúzního proteinového produktu. To může být dosaženo některými z množství metod známými v oboru, například konstrukcí části vhodného expresního vektoru nukleové kyseliny a jeho podáním tak, že se stane intracelulámím, například infekcí použitím defektního nebo zeslabeného retrovirálního nebo jiného virálního vektoru (viz. U. S. patent 4 980 286), nebo přímo injekčně podané samotné DNA nebo použitím ostřelováním mikročásticemi (například genového těla; Biolisticu; Dupontu) nebo potaženým lipidy nebo povrchovými buněčnými receptory nebo transfekovanými nosiči, opouzdřenými v liposomech, mikročásticích nebo mikrokapsulích (U. S. patent 5 407 609; 5 814 344 a 5 820 883), nebo jejím podáním ve spojení s peptidem, který je nezbytný pro vstup do jádra, jejím podáním ve spojení s ligandovým subjektem přes receptorem zprostředkovanou endocytózou (viz. například Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429 - 4432), která může být použita na cílové buněčné typy specificky expresí receptorů, a tak podobně. V jiné části vynálezu komplex nukleová kyselina - ligand může být tvořen tak, že ligand obsahuje fúzogenní virální peptid pro rozbití endosomů, což dovoluje nukleové kyselině vyhnout se lysozomální degradaci, V další Části vynálezu nukleová kyselina může být cílena in vivo do buněk specifickou absorpcí a expresí přes cílové specifické receptory (viz. například PCT Publications WO 92/06180 dated Apríl 16, 1992; WO 92/22635 dated December 23, 1992; WO 92/20316 dated November 26, 1992; WO 93/14188 dated July 22, 1993; WO 93/20221 dáte October 14, 1993). Volitelně nukleová kyselina může být zavedena intracelulámě a inkorporována do hostitelské buněčné DNA pro expresi přes homologní rekombinaci (Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8932 - 8935; Zijlstra et aí, 1989, Nátuře 342:435-438).

Ve specifické Části vynálezu může být použit virální vektor, jako je retrovirální vektor (viz. Miller et aí, 1993, Meth. Enzymol. 217: 581 - 599). Retrovirální vektory byly modifikovány delecí retrovirálních sekvencí, které nejsou nezbytné pro sbalení virálního genomu a integrací do DNA hostitelské buňky. Fúzní kódující sekvence je klonována do vektoru, který usnadňuje podání nukleové kyseliny příjemci. Více detailů o retrovirálních vektorech lze nalézt v Boesen et aí, 1994, Biotherapy 6: 291 - 302, kde je popsáno použití retrovirálního vektoru pro podání mdr 1 genu do hematopoietických kmenových buněk pro zvýšení rezistence kmenových buněk při chemoterapii. Ostatní odkazy, které ukazují použití retrovirálních vektorů v genové terapii, jsou: Clowes et aí, 1994, J. Clin. Invest. 93: 644 - 651; Kiem et aí, 1994, Blood 83: 1467 - 1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129 - 141; and Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opion. in Genetics and Devel. 3> 110 - 114.

Adenoviry jsou ostatní virální vektory, které mohou být použity v genové terapii. Adenoviry jsou zvláště vhodný prostředek pro podání genů do dýchacího epitelu. Adenoviry přirozeně infikují dýchací epitel, kde způsobují mírné onemocnění. Jinými cílovými místy pro podávači systémy založených na adenovirech jsou játra, centrální nervový systém, endotelní buňky a svalové buňky. Adenoviry mají tu výhodu, že jsou schopné infikovat nedělící se buňky. Adeno - asociovaný vir (AVV) může být také navržen pro použití in vivo genového transferu (Walsh et aí, 1993, Proč. Soc. Exp. Biol. Med 204: 289 - 300).

- 10CZ 302852 B6

V této části je nukleová kyselina zavedena do buňky přednostně podáním in vivo výsledné rekombinantní buňce. Takové zavedení může být provedeno nějakou metodou známou v oboru, zahrnující také transfekci, elektroporaci, mikroinjekci, infekci virálním nebo bakteriofágovým vektorem, který obsahuje sekvence nukleové kyseliny, buněčnou fúzí, genovým transferem chromozomálního nosiče, genovým transferem mikrobuněčného nosiče, fúzí sféroplastů a podobně. V oboru je známo množství technik pro zavedení cizích genů do buněk (viz. například Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599 - 618; Cohen et aí, 1993, Meth. Enzymol. 217:618- 644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69 -92) a mohou být použity v souladu s předkládaným vynálezem.

Polynukleotidy podle vynálezu mohou být také použity v diagnostice tuberkulózy pro detekci specifických polynukleotidových sekvencí M. tuberculosis u pacienta. Tato detekce může být provedena například izolací polynukleotidů z biologického vzorku získaného od pacienta s podezřením na bakteriální infekci. Pro izolaci polynukleotidů z biologického vzorku, značený polynukleotid podle vynálezu, který je komplementární k jednomu nebo více polynukleotidům, dovoluje hybridizaci na polynukleotidy v biologickém vzorku použitím technik hybridizace nukleových kyselin, které jsou známy odborníkům. Například tato hybridizace může být provedena v roztoku nebo s hybridizačním partnerem na pevném povrchu.

Terapeutické a profyfaktické použití fúzního proteinu - Purifikované nebo částečně purifikované fúzní proteiny nebo jejich fragmenty mohou být připraveny jako očkování nebo terapeutický prostředek. Takové složení může obsahovat pomocné látky ke zvýšení imunitní reakce. Navíc takové proteiny mohou být dále rozptýleny v olejové emulzi pro případ pomalého uvolnění proteinů in vivo po injekčním podáním. Optimální podíl každé složky v přípravku může být určen technikami dobře známými odborníkům.

Některé z různých pomocných látek mohou být použity v očkovacích látkách podle vynálezu ke zvýšení imunitní reakce. Většina pomocných látek obsahuje složky navržené k ochraně antigenu před rychlým ketabolismem, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej, a nespecifické stimulátory imunitní reakce, jako je lipid A, Bortadella pertusis nebo Mycobactertum tuberculosis. Vhodné pomocné látky jsou komerčně dostupné a zahrnují například Freundovou neúplnou pomocnou látku a Freundovou úplnou pomocnou látku (Difco Laboratories) a pomocnou látku Merck 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ). Jiné vhodné podpůrné látky zahrnují kamenec, biodegradovatelné mikrokuličky, monofosforyl lipid A, obal A, SBASlc, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15: 1562- 1567), SBAS7 a A1(OH)3.

V očkovacích látkách podle předkládaného vynálezu je upřednostňováno, aby pomocná látka způsobovala imunitní reakcí, zahrnující Thl aspekt. Vhodné soustavy pomocných látek obsahují například kombinaci monofosforyl lipidu A, přednostně 3 - de - O - acylovaného monofosforyl lipidu A (3 D - MLP) společně s hlinitou solí. Vylepšená soustava obsahuje kombinaci monofosforyl lipidu A a saponinového derivátu, zvláště kombinaci 3 D - MLP a saponinu QS 21, jak je uvedeno v WO 94/00153, nebo méně reaktivní složení, kde QS 21 je potlačena cholesterolem, jak je uvedeno v WO 96/33739. Předešlé experimenty ukázaly čistý synergický efekt kombinace 3 D - MLP a QS 21 při indukci humorální imunitní reakce a buněčné imunitní reakce typu Th 1. Zvláště silný přípravek pomocné látky obsahuje QS21,3D-MLPa tocoferol v emulzi oleje ve vodě, jak je popsáno v WO 95/17210, a je upřednostňovaným přípravkem.

Přípravky, obsahující antigen podle předkládaného vynálezu, mohou být podány do subjektu perse nebo ve formě farmaceutického nebo terapeutického prostředku. Farmaceutické prostředky, obsahující proteiny, mohou být vyrobeny prostřednictvím tradičních procesů míchání, rozpouštění, granulace, přípravy dražé, rozmělňování, emulsifikace, opouzdření, zachycení nebo lyofilizace. Farmaceutické prostředky mohou být připraveny tradičním způsobem s použitím jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů, naředění, masťových nebo podpůrných látek, které usnadňují vstup polypeptidů do preparátu, který může být použit farmaceuticky. Vhodná příprava závisí na vybrané cestě použití.

- 11 CZ 302852 B6

Pro aktuální použití proteiny mohou být připraveny jako roztoky, gely, mastě, krémy, suspenze a tak dále, jak je velmi dobře známo v oboru.

Systémové přípravky obsahují ty, které jsou navržené pro podávání injekčně, například podkožně, nitrožilně, nitrosvalově, do hrudní dutiny, do břišní dutiny, nebo ty, které jsou navrženy pro podání přes kůži, sliznice, ústy nebo plícemi.

Pro injekční podání proteiny mohou být připraveny ve vodných roztocích, přednostně ve fyziologicky slučitelných pufrech, jako je Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo fyziologický roztok. Roztok může obsahovat směsné nosiče jako jsou suspendované, stabilizované a/nebo dispergované nosiče. Volitelně proteiny mohou být v práškové formě a před použitím smíchány s vhodným nosičem, například sterilní vodou bez pyrogenu.

Pro podání přes sliznice jsou v přípravku použity vhodné látky prostupující bariéry. Takové prostupující látky jsou obecně známy v oboru.

Pro ústní podání směs může být snadno připravena kombinací proteinů s farmaceuticky přijatelnými nosiči dobře známými v oboru. Takové nosiče umožňují proteinům být připraveny jako tablety, pilulky, dražé, kapsle, tekutiny, gely, sirupy, řídké kaše, suspenze a podobně, pro ústní užívání subjektem, který je bere. Pro ústní pevné přípravky, jako jsou například prášky, kapsle a tablety, vhodný masťový základ zahrnuje plnidla jako jsou cukry, jako je laktosa, sacharóza, manitol a sorbitol; celulózové přípravky jako je kukuřičný škrob, pšenicový škrob, rýžový škrob, bramborový Škrob, želatina, klovatina, metyl celulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, sodná sůl karboxy mety lcelulózy a/nebo polyvinylpyrolidin (PVP); granulovaná činidla a vázající činidla. Jestliže je to vhodné, mohou být přidána rozkladná činidla, jako je zesítěný polyvinylpyrolidin, agar nebo alginová kyselina nebo její sůl, jako je sodná sůl kyseliny alginové.

Jestliže je to vhodné, pevné dávkové formy mohou být potaženy cukrem nebo střívkem použitím standardních technik.

Pro ústní tekuté přípravky, jako jsou například suspenze, tinktury a roztoky, vhodné nosiče, masťový základ nebo ředidla zahrnují vodu, glykoly, oleje, alkoholy a tak dále. Pro ústní podání proteiny mohou být ve formě tablet, pastilek a tak dále, připraveny obvyklým způsobem.

Pro inhalační podání proteiny pro použití v souladu s předkládaným vynálezem jsou bez obtíží dodávány ve formě aerosolového spreje v tlakových obalech nebo rozprašovači s použitím vhodného hnacího plynu, například dichlorodifluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluoroetanu, oxidu uhličitého nebo jiného vhodného plynu. V případě tlakovaného aerosolu dávková jednotka může být zajištěna poskytnutím ventilu k dodání měřitelného množství. Kapsle a náplně, například želatiny, pro použití v inhalátoru nebo insuflátoru mohou být připraveny s obsahem práškové směsi proteinů a vhodného práškového základu, jako je laktosa nebo škrob.

Proteiny mohou být také připraveny ve složení pro podání do konečníku nebo pochvy, jako jsou čípky nebo zadržovací klystýr, obsahující například obvyklý základ čípku, jako je kakaové máslo nebojiné glyceridy.

Navíc pro přípravu, popsanou dříve, mohou být proteiny také připraveny jako skladiště přípravku. Takové dlouhodobě působící přípravky mohou být podávány implantací (například podkožně nebo nitrosvalově) nebo nitrosvalově injekčním podáním. Tak například proteiny mohou být připraveny s vhodnými polymeruími nebo hydrofobními látkami (například jako emulze v přijatelném oleji) nebo iontoměničová pryskyřice, nebo jako pomalu rozpustné deriváty, například jako pomalu rozpustná sůl.

- 12CZ 302852 B6

Volitelně mohou být využity jiné farmaceutické systémy podání. Liposomy a emulze jsou velmi známé příklady prostředků podání, které mohou být použity k podání antigenů. Některá organická rozpouštědla, jako d imetyl sulfoxid, také mohou být využity, ačkoliv obvykle zvyšují toxicitu. Fúzní proteiny mohou také být zapouzdřeny do mikrokuliček (U. S. patent 5,407,609; 5,853,763; 5,814,344 a 5,820,883). Dodatečně proteiny mohou být podány použitím postupně uvolňujícího systému, jako je semipermeabilní matrice tuhých polymerů, obsahující terapeutickou nebo očkovací látku. Byly nalezeny různé postupně uvolňující materiály a jsou dobře známy odborníkům. Postupně uvolňující kapsle mohou, v závislosti na jejich chemickém složení, uvolňovat proteiny několik týdnů až více než 100 dnů. V závislosti na chemickém charakteru a biologické stabilitě složek mohou být využity další strategie pro stabilizaci proteinů.

Ve schopnostech odborníků je určení účinného množství fúzní ho proteinu pro indukci imunitní reakce v subjektu, zvláště v případě zde poskytnutého detailního objasnění.

Účinná dávka může být nejprve odhadnuta z měření in vitro. Například dávka může být připravena na zvířecích modelech k dosažení indukce imunitní reakce použitím technik, které jsou dobře známy v oboru. Každý pracovník v oboru může snadno co nejlépe upravit podávání lidem na základě údajů ze zvířat. Dávkové množství a intervaly mohou být přizpůsobeny individuálně. Například jestliže jsou použity jako očkovací látky, polypeptidy a/nebo polynukleotídy podle vynálezu mohou být podány v přibližně 1 až 3 dávkách v 1 až 36 týdenním období. Přednostně jsou podány tři dávky v intervalech přibližně 3 až 4 měsíce a zvýšené očkovací dávky mohou být podány opakovaně poté. Pro jednotlivé pacienty může být vhodné střídat léčebné postupy. Vhodná dávka je množství polypeptidu nebo DNA, které, jestliže je podáno jak je uvedeno výše, je schopné zvýšit u imunizovaného pacienta imunitní reakci dostatečně k ochraně pacienta před infekcí M tuberculosis po dobu alespoň 1 až 2 let. Obecně množství polypeptidu obsaženého v dávce (nebo produkovaného in šitu DNA v dávce) je v rozmezí od přibližně 1 pg do přibližně 100 mg na kg tělesné hmotnosti, obvykle od přibližně 10 pg do přibližně 1 mg a přednostně od přibližně 100 pg do přibližně l pg. Vhodné rozmezí dávky se bude lišit s velikostí pacienta, ale obvykle rozmezí bude od přibližně 0,1 ml do přibližně 5 ml.

Diagnostické použití fúzního proteinu - Fúzní polypeptidy podle vynálezu jsou užitečné při diagnóze infekce tuberkulózy in vitro a in vivo. Schopnost polypeptidu podle vynálezu indukovat proliferaci lymfocytů nebo cytokinovou produkci může být měřena metodami uvedenými v části měření imunogenicity.

Z jiného pohledu vynález poskytuje způsoby pro použití jednoho nebo více fúzních polypeptidu pri diagnostikování tuberkulózy použitím kožního testu in vivo. Jak je použit zde, kožní test je měření fungující přímo na pacientovy, u kterého je pozdější typ hypersenzitivní (DTH) reakce (jako je otok, zčervenání nebo zánět kůže) měřen následujícím podkožním injekčním podáním jednoho nebo více polypeptidů, které jsou popsány výše. Takové injekční podání může být provedeno použitím vhodného zařízení, dostačujícího ke kontaktu polypeptidu s kožními buňkami pacienta, jako je například tuberkolínova stříkačka nebo l ml stříkačka. Přednostně je reakce měřena alespoň přibližně 48 hodin po injekčním podání, ještě lépe přibližně 48 až přibližně 72 hodin po injekčním podání.

DTH reakce je buněčná imunitní reakce, která je vyšší u pacientů, kteří byli dříve podrobeni antigenovému testu (například imunogenickou částí použitého polypeptidu nebo jeho obměn). Reakce může být měřena vizuálně, s použitím stupnice. Obecně je reakce, která je vetší než přibližně 0,5 cm v průměru, přednostně více než přibližně 1,0 cm v průměru, pozitivní reakce, svědčící o tuberkulózové infekci, která se může nebo nemusí projevit aktivní chorobou.

Fúzní polypeptidy podle tohoto vynálezu jsou přednostně připraveny, pro použití při kožním testu, jako farmaceutické prostředky obsahující polypeptid a fyziologicky přijatelný nosič. Takové prostředky obvykle obsahují jeden nebo více výše uvedených polypeptidů v množství v rozmezí přibližně od 1 gg do přibližně 100 gg, přednostně od přibližně 10 gg do přibližně

- 13CZ 302852 B6 pg v objemu 0,1 ml. Přednostně použitý nosič vlakových farmaceutických prostředcích je fyziologický roztok s vhodnými konzervačními přísadami, jako je fenol a/nebo Tween 80™

Z jiného pohledu předkládaný vynález poskytuje způsoby pro použití polypeptidů pro diagnostiku tuberkulózy. Z tohoto pohledu jsou metody využity pro zjištění infekce M. tuberculosis v biologickém vzorku použitím fúzních polypeptidů samotných nebo v kombinaci. Jak je použit zde, „biologický vzorek“ je vzorek, obsahující protilátku, získaný od pacienta. Přednostně je vzorek samotná krev, hlen, sérum, plasma, sliny, mozkomíšní mok nebo moč. Ještě lépe vzorek je krevní, sérový nebo plasmový vzorek, získaný od pacienta, nebo krevní derivát. Polypeptid(y) je používán v měření, jak je popsáno níže, k určení přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek proti polypeptidu(ům) ve vzorku ve vztahu k běžným hodnotám. Přítomnost takových protilátek ukazuje na předcházející zcitlivění proti mycobakteriálním antigenům, které může svědčit o tuberkulóze.

V částech vynálezu, ve kterých je použito více než jednoho fúzního polypeptidů, použité peptidy jsou přednostně komplementární (například, jedna část polypeptidů bude mít sklon ke zjištění infekce ve vzorcích, kde infekce nebude zjištěna jinou částí polypeptidů). Komplementární polypeptidy mohou obecně být určeny použitím každého polypeptidů jednotlivě k určení sérových vzorků, získaných od řady pacientů, o kterých je známo, že jsou infikovány Λ/ tuberculosis. Po určení, které testované vzorky jsou pozitivní (jak je popsáno níže) s jakým polypeptidem, mohou být připraveny kombinace dvou nebo více fúzních polypeptidů, které jsou schopné zjistit infekci ve většině nebo ve všech testovaných vzorcích. Takové póly peptidy jsou komplementární. Přibližně 25 až 30 % sér od tuberkulózy infikovaných jedinců jsou negativní na protilátky proti samotnému proteinu. Komplementární polypeptidy mohou tedy být použity ve spojení se zvýšením citlivosti diagnostického testu.

Odborníkům jsou známy různé druhy měření pro použití jednoho nebo více polypeptidů ke zjištění protilátek ve vzorku. Viz. například Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, kteiý je zde zahrnut do odkazů. V upřednostňované části měření zahrnuje použití polypeptidů, i mobilizovaného na pevném podkladě, k navázání a odstranění protilátky ze vzorku. Navázaná protilátka může pak být určena použitím detekční látky, která obsahuje detekční skupinu. Vhodné detekční látky zahrnují protilátky, které jsou navázané na protilátka / polypeptidový komplex a volný polypeptid značený detekční skupinou (například při semikompetitivním měření). Volitelně může být použito kompetitivní měření, při kterém je protilátka, která je navázána na polypeptid, značena detekční skupinou a dovoluje navázání na imobilizovaný antigen po inkubaci antigenů se vzorkem. Rozsah, ve které složky vzorku zabraňují navázání značené protilátky na polypeptid, svědčí o schopnosti reakce vzorku s imobilizovaným polypeptidem.

Pevný podklad může být pevná látka, známá odborníkům, se kterou antigen může být spojen. Pevný podklad může být například testovací jamka na mikrotitrační destičce nebo na nitrocelúloze nebo jiné vhodné membráně. Volitelně podklad mohou tvořit korálky nebo kotoučky, skleněné, laminátové, latexové nebo z plastických materiálů, jako je polystyren nebo polyvinylchlorid. Podklad mohou také tvořit magnetické částice nebo senzory z optických vláken, jak je uvedeno například v U. S. patent 5,359,681.

Polypeptidy mohou být navázány na pevný podklad použitím různých technik známých odborníkům. V souvislosti s předkládaným vynálezem se termín „navázané“ vztahuje jak k nekovalentním vazbám, jako je adsorpce, tak ke kovalentním vazbám (které mohou být přímým spojením mezi antigenem a funkčními skupinami na podkladě nebo mohou být spojením přes spojující činidlo). Upřednostňováno je navázání adsorpcí do jamky na mikrotitrační desce nebo na membráně. V takových případech adsorpce může být dosaženo kontaktem polypeptidů, ve vhodném pufru, s pevným podkladem po vhodnou dobu. Doba kontaktu se liší podle teploty, aleje obvykle mezi přibližně 1 hodinou a 1 dnem. Obecně kontakt jamky mikrotitrační desky z plastu (jako je polystyren nebo polyvinylchlorid) s množstvím polypeptidů v rozmezí od přibližně 10 ng do při- 14CZ 302852 B6 bližně 1 gg, přednostně přibližně 100 ng, je dostatečný knavázání odpovídajícího množství antigenu.

Kovalentní vazby polypeptidu na pevný podklad může být obecně dosaženo jednou reakcí podkladu s bifunkčním činidlem, které bude reagovat s podkladem a funkční skupinou, jako je hydroxyl nebo amino skupina, na polypeptidu. Například polypeptid může být navázán na povrchy, které mají vhodný polymemí povlak, použitím benzochinonu nebo kondenzací aldehydové skupiny na povrchu s aminem a na polypeptidu s aktivním vodíkem (viz. například Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook. 1991, at A 12 - A 13).

V některých částech je k měření použito enzymu navázaného na imunosorbent (ELISA). Toto měření může být uskutečněno prvním kontaktem fúzního polypeptidového antigenu, který byl imobilizován na pevný povrch, obvykle do prohlubně mikrotitrační desky, se vzorkem, jakým jsou protilátky proti polypeptidu ve vzorku, které jsou schopné navázat se na imobilizovaný polypeptid. Nenavázaný vzorek je pak odstraněn z imobilizovaného polypeptidu a je přidáno detekční činidlo, schopné navázání na imobilizovaný komplex protilátka - polypeptid. Množství detekčního činidla, které se nenavázalo na pevný povrch, je pak určeno použitím metody vhodné ke specifické detekci činidla.

Přesněji, jakmile je polypeptid imobilizován na povrchu, jak je popsáno výše, zbývající proteinová vazebná místa jsou obvykle blokována. Může být využito vhodné blokující činidlo, známé odborníkům, jako je hovězí sérový albumin nebo Tween 20™ (Signa Chemical Co., St. Louis, MO). Imobilizovaný polypeptid je pak inkubován se vzorkem a protilátka se může navázat na antigen. Vzorek může být před inkubací rozpuštěn ve vhodném rozpouštědle, jako je fyziologický roztok pufrovaný fosfáty (phosphate - buffered šalině, PBS). Obecně vhodná doba kontaktu je časový úsek, který je dostatečný ke zjištění protilátky ve vzorku infikovaném AL tuberculosis. Přednostně je doba kontaktu dostatečná, jestliže je dosaženo hladiny navázání alespoň 95 % z navázání, kterého je dosaženo při rovnováze mezi navázanou a nenavázanou protilátkou. Odborníci uznají, že doba nezbytná k dosažení rovnováhy může být snadno určena z měření hladiny navázání v průběhu času. Při pokojové teplotě je obecně dostatečná doba inkubace přibližně 30 minut.

Nenavázaný vzorek pak může být odstraněn promytím pevného povrchu vhodným pufrem, jako je PBS obsahující 0,1 % Tween 20™. Pak může být detekční činidlo přidáno k pevnému povrchu. Vhodné detekční činidlo je sloučenina, která se váže na imobilizovaný komplex protilátka polypeptid a která může být detekována různými způsoby známými v oboru. Přednostně detekční činidlo obsahuje složku (například protein A, protein G, lectin nebo volný antigen), konjugovanou s detekční skupinou. Upřednostňované detekční skupiny zahrnují enzymy (jako je peroxidáza křenu selského), substráty, kofaktory, inhibitory, barviva, radionuklidy, luminiscentní skupiny, fluoroscentní skupiny, biotik a koloidní částice, jako je koloidní zlato nebo selen. Konjugace vázající složky na detekční skupinu může být dosaženo použitím standardních metod, které jsou známy odborníkům. Obvykle vázající složka může být také zakoupena konjugovaná na různé detekční skupiny z komerčních zdrojů (například Zymed Laboratories, San Francisco, CA, and Pierce, Rockford. IL).

Detekční činidlo je pak inkubováno s imobilizovaným komplexem protilátka - polypeptid po dobu dostatečnou k detekci navázané protilátky. Vhodná doba může být obecně určena z pracovního protokolu nebo měřením hladiny navázání v časovém intervalu. Nenavázané detekční činidlo je pak odstraněno a detekční činidlo je detekováno pomocí detekční skupiny. Použitá metoda pro detekci detekční skupiny závisí na charakteru detekční skupiny. Pro radioaktivní skupiny je obecně vhodné scintilační měření nebo autoradiografické metody. Spektroskopické metody mohou být použity pro detekci barviv, luminiscentních skupin a fluorescentních skupin. Biotin může být detekován použitím avidinu, spojeného sjinou detekční skupinou (obvykle radioaktivní nebo fluorescentní skupina nebo enzym). Enzymové detekční skupiny mohou být

- 15CZ 302852 B6 obecně detekovány přídavkem substrátu (obecně během specifického časového úseku) a následující spektroskopické nebo jiné analýzy reakčních produktů.

K určení přítomnosti nebo absence protilátek proti M. tuberculosis ve vzorkuje signál, detekovaný od detekční skupiny, která je navázána na pevném povrchu, obecně srovnatelný se signálem, který odpovídá běžným hodnotám. V jedné upřednostňované části vynálezu je běžná hodnota průměrný střední signál, získaný, když imobilizovaný antigen je inkubován se vzorky od neinfikováného pacienta. Obecně vzorek, který generuje signál, který je tři standardní odchylky nad běžnou hodnotou, je pokládán za pozitivní tuberkulózu. V alternativní upřednostňované části běžná hodnota je určena použitím získané operační křivky (Receiver Operátor Curve) podle metody podle Sackett er al., 1985, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., pp. 106 - 107. Stručně v této části běžná hodnota může být určena z diagramu dvojic pozitivních poměrů (například citlivosti) a falešně pozitivních poměrů (100 % specifičnosti), které odpovídají každé možné běžné hodnotě pro výsledek diagnostického testu. Běžná hodnota na diagramu, která je posunuta do horního levého rohu (například hodnota, která je vložena do celé plochy) je přesnější běžná hodnota a vzorek vysílající signál, který je vyšší než běžná hodnota určená touto metodou, může být pokládán za pozitivní. Volitelně běžná hodnota může být posunuta doleva podle diagramu, pro minimalizování falešného pozitivního poměru, nebo doprava, pro minimalizování falešného negativního poměru. Obecně vzorek vysílající signál, který je vyšší než běžná hodnota určená touto metodou, je pokládán za pozitivní na tuberkulózu.

V odpovídající části je měření provedeno s použitím rychlé přímé průtočné nebo proužkové metody, ve kterém je antigen imobilizován na membránu, jako je nitrocelulóza. Při přímé průtočné metodě se protilátky ve vzorku naváží na imobilizovaný polypeptid, když vzorek prochází přes membránu. Detekční činidlo (například protein A - koloidní zlato), které se naváže na komplex protilátka - polypeptid jako roztok, obsahující detekční činidlo, protéká přes membránu. Detekce navázaného detekčního činidla může pak být provedena tak, jak je popsáno výše. Při použití proužkové metody jeden konec membrány, na kterém je polypeptid navázán, je ponořen do roztoku obsahující vzorek. Vzorek putuje podél membrány přes oblast obsahující detekční činidlo a do oblasti imobilizovaného polypeptidů. Koncentrace detekčního činidla na polypeptidů dokazuje přítomnost protilátek proti Λ7. tuberculosis ve vzorku. Obvykle koncentrace detekčního činidla na tomto místě vytvoří obrazec, jako je přímka, která může být vizuálně odečtena. Nepřítomnost takového obrazce dokazuje negativní výsledek. Obecně množství polypeptidů, imobilizovaného na membránu, je zvoleno tak, aby vytvořilo vizuálně rozeznatelný obrazec, jestliže biologický vzorek obsahuje množství protilátek, které je dostatečné k vytvoření pozitivního signálu při ELISE, jak je ukázáno výše. Přednostně množství polypeptidů, imobilizovaného na membránu, je v rozmezí od přibližně 5 ng do přibližně 1 pg a lépe od přibližně 50 ng do přibližně 500 ng. Takové testy mohou být obvykle provedeny s velmi malým množstvím (například jednou kapkou) pacientova séra nebo krve.

Vynález byl popsán, následující příklady jsou poskytnuty pro jasné vysvětlení.

Přehled obrázků na výkresech obr. 1 A a 1 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 1) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 2) tri - fúzního proteinu Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 (označená Mtb 32 A).

obr. 2: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 3) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 4) tri - fuzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI (označená Mtb 39 A), obr. 3 A až 3 D: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 5) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 6) tri - fúzního proteinu TbRa 3 - 38 kD - Tb38 - 1.

- 16CZ 302852 B6 obr. 4 A až 4 D: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 7) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 8) bi - fúzního proteinu TbH 9 - Tb 38 - 1.

obr. 5 A až 5 J: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 9) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 10) tetra - fúzního proteinu TbRa 3 - 38 kD - Tb 38 - 1 - DPEP (označená TbF - 2).

obr. 6 A a 6 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 11) a aminokyselinová sekvence (SEQ

ID NO: 12) penta - fúzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI - MSL - MTCC 2 (označená Mtb 88 f).

obr. 7 A a 7 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO; 13) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 14) tetra - fúzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI - MSL (označená Mtb 46 f)· obr. 8 A a 8 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 15) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 16) tetra - fúzního proteinu DPV - MTI - MSL - MTCC 2 (označená Mtb 71 f).

obr. 9 A a 9 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 17) a aminokyselinová sekvence (SEQ

ID NO: 18) tri - fúzního proteinu DPV - MTI - MSL (označená Mtb 31 f).

obr. 10 A a 10 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 19) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 20) tri - fúzního proteinu TbH 9 - DPV - MTI (označená Mtb 61 f).

obr. 11 A a 11 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 21) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 22) tri - fúzního proteinu Erd 14 - DPV - MTI (označená Mtb 36 f).

obr. 12 A a 12 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 23) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 24) bi - fúzního proteinu TbH 9 - Ra 35 (označená Mtb 59 f).

obr. 13 A a 13 B: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 25) a aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 26) bi - fúzního proteinu Ra 12 - DPPD (označená Mtb 24).

obr. 14 A až 14F: Proliferace T lymfocytů šesti PPD+ subjektů, jestliže jsou stimulovány dvěma fúzními proteiny a jejich jednotlivými složkami.

obr. 15 A až 15 F: Produkce IFN -γ šesti PPD+ subjektů, jestliže jsou stimulovány dvěma fúzními proteiny a jejich jednotlivými složkami.

obr. 16 A a 16 F: Proliferace T lymfocytů myší, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.

obr. 17: Produkce IFN -γ myšmi, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.

obr. 18: Produkce IL - 4 myšmi, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.

obr. 19 A až 19 F: Koncentrace protilátek v séru myší, imunizovaných fúzním proteinem nebo jeho jednotlivými složkami a pomocnou látkou.

obr. 20 A až 20 C: Zůstatek guinejských prasat po aerosolovém imunologickém testu M. tuberculosis. Fúzní proteiny, Mtb 32 A a Mtb 39 A, byly připraveny s pomocnou látkou SBAS 1 c (20 A), SBAS 2 (20 B) nebo SBAS 7 (20 C) a použity jako imunogen v guinejských prasatech v předcházejícím imunologickém testu s bakteriemi. BCG je pozitivní kontrola.

obr. 21 A a 21 B: Stimulace proliferace a produkce IFN - γ v TbH 19-1 specifických T lymfocytech fúzním proteinem TbH 9 - Tb 38 - 1.

obr. 22 A a 22 B: Stimulace proliferace a produkce IFN - γ v Tb 38 - 1 specifických T lymfocytech fúzním proteinem TbH 9 - Tb 38 - 1.

obr. 23 A a 23 B: Stimulace proliferace a produkce IFN - γ v T lymfocytech, které dříve vykazovaly odpověď na oba antigeny TbH - 9 a Tb 38 - 1, fúzním proteinem TbH 9-Tb38-l.

- 17CZ 302852 B6

Příklad provedení vynálezu

Fúzní proteiny antigenů M. Tuberculosis si uchovávají imunogenicitu jednotlivých částí.

Materiál a metody

Konstrukce fúzních proteinů - Kódující sekvence antigenů M. Tuberculosis byly modifikovány PCR pro usnadnění jejich fúze a následné exprese fúzní ho proteinu. Amplifikace DNA byla uskutečněna použitím 10 μΐ lOx Pfu pufru, 2 μΐ 10 mM dNTPs, 2 μΙ každého PCR primeru v 10 μΜ koncentraci, 81,5 μΐ vody, 1,5 μΐ Pfu DNA polymerázi (Stratagene, La Jolla, CA) a 1 μΐ DNA v buď 70 ng/μΐ (pro antigen TbRa 3), nebo 50 ng/μΐ (pro antigeny 38 kD a Tb 38 - 1). Pro antigen TbRa 3 byla provedena denaturace při 94 °C po dobu 2 minut, následována 40 cykly 96 °C po 15 sekundách a 72 °C po 1 minutě a nakonec 72 °C po 4 minuty. Pro 38 kD antigen byla provedena denaturace při 96 °C po dobu 2 minut, následována 40 cykly 96 °C po 30 sekundách, 68 °C po 15 sekundách a 72 °C po 3 minutách a nakonec 72 °C po 4 minuty. Pro antigen Tb 38 1 denaturace při 94 °C po dobu 2 minut byla následována 10 cykly 96 °C po 15 sekundách, 68 °C po 15 sekundách a 72 °C po 1,5 minutě, 10 cykly 96 °C po 15 sekundách, 64 °C po 15 sekundách a 72 °C po 1,5 a nakonec 72 °C po 4 minuty.

Po následující úpravě restrikční endonukleázou, poskytující vhodné kohézní nebo tupé konce, byl polynukleotid, specifický pro každý fúzní polypeptid, ligován do expresního plasmidu. Každý výsledný plasmíd obsahuje kódující sekvence jednotlivých antigenů každého fúzního polypeptidu. Použité expresní vektory byly pET- 12bapT7^AL2IL 1.

Tří kódující sekvence pro antigeny Ra 12, TbH 9 a Ra 35 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 1 a 2) (obr. 1 A a 2 B). Jiné tři kódující sekvence pro antigeny Erd 14, DPV a MTI byly ligovány do kódovaného druhého fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 3 a 4) (obr. 2). Tři kódující sekvence pro antigeny TbRa 3, 38 kD a Tb 38 - 1 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 5 a 6) (obr, 3 A - 3 D), Dvě kódující sekvence pro antigeny TbH 9 a Tb 38 - 1 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 7 a 8) (obr. 4 A - 4 D). Čtyři kódující sekvence pro antigeny TbRa 3, 38 kD, Tb 38 - 1 a DPEP byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 9 a 10) (obr. 5 A 5 J). Pět kódujících sekvencí pro antigeny Erd 14, DPV, MTI, MSL a MTCC 2 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 11 a 12) (obr. 6 A a 6 B). Čtyři kódující sekvence pro antigeny Erd 14, DPV, MTI a MSL byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 13 a 14) (obr. 7 A a 7 B). Čtyři kódující sekvence pro antigeny DPV, MTI, MSL a MTCC 2 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 15 a 16) (obr. 8 A a 8 B). Tři kódující sekvence pro antigeny DPV, MTI a MSL byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 17 a 18) (obr. 9 A a 9 B). Tři kódující sekvence pro antigeny TbH 9, DPV a MTI byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 19 a 20) (obr. 10 A a 10 B). Tři kódující sekvence pro antigeny Erd 14, DPV a MTI byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 21 a 22) (obr. 11 A a 11 B). Dvě kódující sekvence pro antigeny TbH 9 a Ra 35 byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 23 a 24) (obr. 12 A a 12 B). Dvě kódující sekvence pro antigeny Ra 12 a DPPD byly ligovány do jednoho kódovaného fúzního proteinu (SEQ ID NOS: 25 a 26) (obr. 13 A a 13 B).

Rekombinantní proteiny byly expresovány v E. coli se Šesti histidinovým i zbytky v N-koncové části použitím pET plasmidového vektoru (pET - 17 b) a T 7 RNA polymerázového expresního systému (Novagen, Madison, WI). Pro silnou expresi byl použit kmen E, coli BL 21 (DE 3) pLysE (Novagen). Rekombinantní (His - Tag) fúzní proteiny byly purifikovány z tekutého supematantu nebo nerozpustného inkluzního tělíska z 500 ml IPTG indukovaných sádkových kultur afinitní chromatografii použitím jednoho kroku QIA express Ni - NT A agarózového základu (QIAGEN, Chatsworth, CA) v přítomnosti 8 M močoviny. Stručně, 20 ml přes noc saturované kultury BL 21, obsahující pET konstrukt, bylo přidáno do 500 ml 2 x YT média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a 34 μg/ml chloramfenikolu, a rostlo při 37 °C za míchání. Bakteriální

-18CZ 302852 B6 kultury byly indukovány 2 mM IPTG při OD 560 0,3 a rostly ještě 3 hodiny (O. D. = od 1,3 do 1,9). Buňky byty získány z 500 ml sáňkových kultur centrifugací a resuspendováním ve 20 ml spojovacího pufru (0,1 M sodný fosfát, pH 8,0; 10 mM Tris - HCI, pH 8,0), obsahujícího 2 mM PMSF a 20 pg/ml leupeptinu plus kompletní tabletu inhibitoru proteázy (Boehringer Mannheim) na 25 ml. E. coli byla lyžována zmrazením a rozmražením, následovaným krátkým působením ultrazvuku, pak byla stočena při 12 k rpm a 30 minutách do pelety inkluzních tělísek.

Inkluzní tělíska byly promyty třikrát v 1 % CHAPS v 10 mM Tris - HCI (pH 8,0). Tento krok značně snižuje hladinu kontaminujícího LPS. Inkluzní tělísko bylo nakonec rozpuštěno ve 20 ml spojovacího pufru, obsahujícího 8 M močovinu nebo 8 M močovina byla přidaná po stočení přímo do supematantu. Rekombinantní fúzní proteiny s His - Tag zbytky byly ve várkách navázány na NÍ - NTA agarózovou pryskyřici (5 ml pryskyřice na 500 ml indukované várky) třepáním při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a celkové projití přes kolonu. Průtok skrz byl proveden dvakrát přes tu samou kolonu a kolona byla třikrát promyta promývacím pufrem (0,1 M fosforečnan sodný a 10 mM Tris - HCI, pH 6,3) také obsahujícím 8 M močovinu. Navázaný protein byl eluován 30 ml 150 mM imidazolu v promývacím pufru a byly odchytávány 5 ml frakce. Frakce, obsahující některý rekombinantní fuzní protein, byly použity dále, dialyzovány proti 10 mM trisHCI (pH 8,0), navázány jednou nebo vícekrát na Ni - NTA podklad, eluovány a dialyzovány v 10 mM Tris - HCI (pH 7,8). Množství rekombinantního proteinu kolísá od 25 do 50 mg na litr indukované bakteriální kultury s vyšší než 98 % čistotou. U rekombinantních proteinů byla měřena endotoxinová kontaminace použitím Limulusového měření (BioWhittaker) a byl zjištěn obsah < 10 E. U. Img.

Měření proliferace T lymfocytů - Purifikované fúzní polypeptidy byly testovány, zda jsou schopny indukovat proliferaci T lymfocytů v přípravcích z periferních krevních mononukleámích buněk (PBMC). PBMC od dárců, kteří měli pozitivní PPD kožní test a u kterých byla pozorována proliferace T lymfocytů jako reakce na PPD, a nezpracované rozpustné proteiny M. tuberculosis byly upraveny na RPMI 1640, doplněny 10 % uchovaným lidským sérem a 50 μg/ml gentamicinu. Purifikované proteiny byly přidány dvojmo v koncentraci od 0,5 do 10 μΙ/ml. Po šesti dnech přípravy v 96 jamkách na destičce s kulatým dnem v objemu 200 μΐ bylo 50 μΙ média odebráno z každé jamky pro určení hladiny IFN - γ, jak je popsáno níže v Měření interferonu γ. Destičky byly poté inkubovány s 1 pCi/jamka triciováného thymidinu po dobu dalších 18 hodin, odebrány a bylo v nich změřeno tricium použitím plynového scintilačního detektoru. Frakce, které dávají při proliferaci v obou paralelkách třikrát větší reakci, než je pozorována při proliferace buněk kultivovaných v samotném médiu, byly označeny za pozitivní.

Měření interferonu - γ - Sleziny z myší byly asepticky odebrány a byla připravena suspenze jednotlivých buněk v kompletním RPMI, následována lyží červených krvinek. 100 μΐ buněk (2 x 10“ ⁵ buněk) bylo umístěno do jamky v 96 jamkové mikrotitrační destičce s rovným dnem. Kultury byly stimulovány označenými rekombinantními proteiny 24 hodin a v supematantu byl změřen IFN-γ.

Hladina IFN - γ v supematantu byla analyzována nekompetitivní ELISOU použitím dvojic protilátek a postupu dostupnému od PharMingenu. Standardní křivky byly připraveny použitím rekombinantních myších cytokinů. ELISA destičky (Corning) byly potaženy 50 μΙ/jamka (1 pg/ml, v 0,1 M uhličitan obsahujícího pufru, pH 9,6) cytokinů vázaného mAb (krysí protimyší IFN - γ (PharMingen; Cat. # 18181 D)) a inkubovány 4 hodiny při pokojové teplotě. Třepání destiček, obsahujících a blokovaných PBS - 0,05 % Tweenem, 1,0 % BSA (200 μΙ/jamka), probíhalo přes noc při 4 °C a pak byly promyty 6 x v PBS - 0,1 % Tweenem. Standardy (myší IFN γ) a vzorky supematantů, zředěných PBS - 0,05 % Tweenem, 0,1 % BSA, byly pak přidány na 2 hodiny při pokojové teplotě. Destičky byly promyty jak je uvedeno výše a pak inkubovány 2 hodiny při pokojové teplotě se 100 μΙ/jamka druhého Ab (krysí biotin a myší IFN - γ (Cat. # 18112 D; PharMingen) při 0,5 μg/ml zředěného PBS - 0,05 % Tweenem, 0,1 % BSA. Po promytí destičky byly inkubovány se 100 μΐ / jamka streptavidin - HRP (Zymed), zředěného 1 :

-19 CZ 302852 B6

2500 PBS - 0,05 Tweenem, 0,1 % BSA při pokojové teplotě 1 hodinu. Destičky byly promyty naposledy a vyvinuty se ΙΟΟμΙ/jamka TMB substrátu (3,3'5,5' - tetramethylbenzidin, Kírkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) a reakce je zastavena po zbarvení H₂SO₄, 50 μΙ/jamka. Absorbance (O. D.) byla určena při 450 nm použitím 570 nm jako referenční vlnové délky a koncentrace cytokinu určena použitím standardní křivky.

Výsledky

Trojfúzními proteiny indukovaná imunitní reakce - Tri kódující sekvence antigenů Λ/. tuberculosis byly vloženy do expresního vektoru pro produkci fúzního proteinu. Antigeny, označené Ra 12, TbH 9a Ra 35, byly produkovány jako jeden fúzní protein (obr. 1 A a 1 B). Antigeny Erd 14, DPV a MTI byly produkovány jako druhý fúzní protein (obr. 2). Dva fúzní proteiny byly puriťikovány afinitní chromatografií pro použití v in vitro a in vivo měření.

Dva fúzní proteiny byly testovány, zda jsou schopny stimulovat reakci T lymfocytů ze šesti PPD⁺subjektů. Když byla měřena proliferace T lymfocytů, oba fúzní proteiny se projevily podobnou reaktivitou jako jejich jednotlivé části (obr, 14 A až 14 F). Podobné výsledky byly získány, když byla měřena produkce IFN - γ (obr. 15 A a 15 F). Například subjekt D 160 reagoval na antigeny TbH 9 a MTI jednotlivě. Subjekt D 160 také reagoval na fuzní proteiny, které obsahovaly tyto antigeny (obr. 14 B a 15 B). Naopak reakce T lymfocytů zD 160 na jiné jednotlivé antigeny nebyla pozorována. Jiný subjekt, D 201, který nereagoval s jednotlivými antigeny Erd 14, DPV nebo MTI, nebyl také citlivý na fúzní proteiny, obsahující tyto antigeny. Můžeme si všimnout, že když reakce T lymfocytů na jednotlivé části dvou fúzních proteinů nebyla zvlášť silná, fúzní proteiny vyvolaly ve většině případů reakci, která byla stejná nebo vyšší než ta, která byla indukována jednotlivými antigeny.

Troj fúzní proteiny Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 byly také testovány jako imunogeny in vivo. V těchto experimentech byl pro imunizaci fúzní protein podán injekčně do měkké části nohy myší. Každá skupina tří myší dostala protein v různých pomocných látkách: SBAS 1 c, SBAS 2 (Linge et al., 1997, Vaccine 15: 1562 - 1567), SBAS 7 a A1(OH)₃. Po dvou podkožních imunizacích ve třech týdenních intervalech byla zvířata o další týden později usmrcena a jejich vysušené mízní uzliny byly odebrány pro použití jako referenční lymfocyty při měření proliferace T lymfocytů a produkce cytokinu.

Bez ohledu na to, která pomocná látka byla použita při imunizaci, byla indukována silná proliferace T lymfocytů proti TbH 9, když byl použit jako jednotlivý antigen (obr. 16 A). Slabší reakce byla indukována proti Ra 35 a Ra 12 (obr. 16 B a 16 C). Když byl Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 fúzní protein použit jako imunogen, reakce byla podobná stou, která byla pozorována proti jednotlivým složkám.

Když byla měřena produkce cytokinu, pomocné SBAS 1 c a SBAS 2 vyvolaly podobnou reakci IFN - γ (obr. 17) a IL - 4 (obr. 18). Nicméně kombinace SBAS 7 a hydroxidu hlinitého vyvolává nej silnější IFN - γ reakci a nej nižší produkci IL - 4 pro všechny tři antigeny. Vzhledem k odpovědi humorálními protilátkami in vivo, figuře 19 A až 19 F ukazují, že fúzní protein vyvolává obě IgG] a IgG₂A antigen - specifické reakce, když byl použit sjakoukoliv ze tří pomocných látek.

Dodatečně byly imunizovány C 57 BL / 6 myši kombinací dvou expresních konstruktů, každý obsahoval kódující sekvenci Ra 12 - TbH 9 - Ra 35 (Mtb 32 A) nebo Erd 14 - DPV - MTI (Mtb 39 A) jako DNA očkovací látku. Při následné aerosolové stimulaci živými bakteriemi byla imunizovaná zvířata významně chráněna proti tuberkulóze. Na základě těchto výsledků byly připraveny fúzní konstrukty Mtb 32 A a Mtb 39 A kódujících sekvencí, a jimi kódovaný produkt byl testován na modelových guinejských prasatech jako dlouhodobá ochrana. V této studii guinejská prasata byla imunizována samostatným rekombinantním fúzním proteinem nebo směsí proteinů Mtb 32 A a Mtb 39 A ve směsi obsahující pomocnou látku. Obr. 20 A až 20 C ukazuje, že

-20CZ 302852 B6 guinejská prasata, imunizovaná fúzním proteinem v SBAS 1 c nebo SBAS 2, byla lépe chráněna proti rozvinutí tuberkulózy při další stimulaci ve srovnání se zvířaty, imunizovanými dvěma protilátkami ve směsi v pomocné látce stejného složení. Fúzní proteiny ve směsi SBAS 2 umožnily u zvířat nejlepší ochranu. Tak mohou být fúzní proteiny různých antigenů M tuberculosis použity v očkovací látce jako efektivnější imunogeny než je směs jednotlivých složek.

Imunitní reakce indukovaná dvojfúzním proteinem - Dvojfuzní protein, obsahující antigeny TbH-9 a Tb 38 - 1 bez čepové sekvence, byl produkován rekombinantními metodami. Byla zkoušena schopnost fúzního proteinu TbH 9 - Tb 38 - 1 indukovat proliferaci T lymfocytů a io produkci IFN - γ. Byly použity PBMC od tří dárců: u jednoho dárce byla dříve zjištěna reakce na

TbH 9, ale ne na Tb 38 - 1 (dárce 131); u dalšího byla zjištěna reakce na Tb 38 - 1, ale ne na

TbH 9 (dárce 184); a u dalšího byla zjištěna reakce na oba antigeny (dárce 201). Výsledky těchto studií ukazují funkční aktivitu obou antigenů ve fúzním proteinu (obr. 21 A a 21 B, 22 A a 22 B a 23 A a 23 B).

Reakce čtyřfúzního proteinu se sérem pacienta s tuberkulózou - Fúzní protein, obsahující TbRa

3, antigen 38 KD, Tb 38 - 1 a DPEP, byl produkován rekombinantními metodami. Reaktivita tohoto čtyřfúzního proteinu, která se vztahuje k TbF - 2 ze séra z pacientů, infikovaných M tuberculosis, byla testována ELISOU. Výsledky těchto studií (tabulka 1) ukazují, že všechny čtyři antigeny jsou ve fúzním proteinu nezávisle funkční.

Odborník ocení, že uspořádání jednotlivých antigenů v každém fúzním proteinu může být změněno a že srovnání aktivit dává předpoklad, že každý epitop je stále funkčně dostupný. Dále zkrácené formy proteinů, obsahující aktivní epitopy, mohou být použity pro přípravu fúzních protei25 nů.

Předkládaný vynález je v nezkráceném rozsahu s uvedenými částmi, které jsou myšleny jako ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu, a klony, nukleovými nebo aminokyselinovými sekvencemi, které jsou funkčně zaměnitelné, jsou v rozsahu vynálezu. Jistě, různé modifikace vynálezu zde popsané, budou odborníkům zřejmé z již uvedeného popisu a doprovodných obrázků. Takové modifikace jsou promyšleně uvedeny v rozsahu připojených patentových nároků. Je také pochopitelné, že všechny základní párové velikosti, uvedené pro nukleotidy, jsou přibližně a použité za účelem popsání.

Všechny publikace zde citované jsou připojeny v odkazech jako celek.

-21CZ 302852 B6

Tabulka 1: reakce fúzního proteinu TbF-2sTBa přirozeným sérem

sérum ID	charakter	TbF OD 450	charakter	TbF - 2 OD 450	charakter	reakce při ELISE
						38 kD	TbRa 3	Tb 38 - 1	DPEP
B 931 - 40	TB	0,57	+	0,321	+	-		-	+
B 931 -41	TB	0,601	+	0,396	+	+	+		•
B 931 - 109	TB	0,494	+	0,404		+	+	++	-
B 931 - 132	TB	1,502	+	1,292	+		+	+	++
5004	TB	1,806	+	1,666	+	++	++	+	-
15004	TB	2,862	+	2,468	+		+		-
39004	TB	2,443	+	1,722	+	+	+		-
68004	TB	2,871	+	2,575	+	4-	+	+	-
99004	TB	0,691	+	0,971	+	-	++		-
107004	TB	0,875	+	0,732	+	-	++	+	-
92004	TB	1,632	+	1,394	+		++	++	-
97004	TB	1,491	+	1,979	+	+	++	-	4-
118004	TB	3,182	+	3,045	+	+	++	•	-
173004	TB	3.644		3,578	+	+	+	+	-
175004	TB	3,332	+	2,916	+	+	+	-	-
274004	TB	3.696	+	3,716	+	-	+	-	+
276004	TB	3,243	+	2,56	+	-	-	+	*
282004	TB	1.249	+	1,234	+	+	-	-	-
289004	TB	1,373	+	1,17	+	-	+	-	-
308004	TB	3,708	+	3,355	+	-	-	+	-
314004	TB	1,663	+	1,399	+	-	-		*
317004	TB	1,163	+	0,92	+	+	-	-	•
312004	TB	1,709	+	1,453	+	-	+	-	-
380004	TB	0,238	-	0,461	+	-	++	-	-(-
451004	TB	0,18	-	0,2	-	-		-
478004	TB	0,188	-	0,469	+	-	-	-	++
410004	TB	0,384	+	2,392	+	++	-	-	+
411004	TB	0,306	+	0,874	+	-		-	+
421004	TB	0,357	+	1,456	+	-	+	-	+
528004	TB	0,047		0,196		-	-	-	+
A 6 - 87	normální	0,094		0,063	-	-	-	-	-
A 6 - 88	normální	0,214		0,19	-	-	-	-	-
A 6 - 89	normální	0,248		0,125	-	-		-	-
A 6 - 90	normální	0,179		0,206	-	-	-	-	-
A 6 - 91	normální	0,135		0,151	-	-	-	-	-
A 6 - 92	normální	0,064		0,097	-	-		-	-
A 6 - 93	normální	0,072		0.098	-	-	-	-	-
A 6 - 94	normální	0,072	-	0,064	-	-	-	-	-
A 6 - 95	normální	0,125	-	0,159	-	-	-	-	-
A6 - 96	normální	0,121	-	0,12	-	-	-	-	-

bčžnč hodnoty		0,284		0,266

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Imunogenní polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci a případně nemá na A-terminálním konci vazbu histidinových zbytků.
2. Imunogenní polypeptid podle nároku 1, tvořený z aminokyselinové sekvence podle zbytků 2 io až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci a případně nemá na Nterminálním konci vazbu histidinových zbytků.
3. Imunogenní polypeptid podle nároku 1, obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), případně bez vazby histidinových zbytků na is Y-terminálním konci.
4. Imunogenní polypeptid podle nároku 2, tvořený z aminokyselinové sekvence podle zbytků 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), případně bez vazby histidinových zbytků na N—terminálním konci.
5. Imunogenní polypeptid podle nároku 3, obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků

20 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr, 8 A a 8 B).
6. Imunogenní polypeptid podle nároku 4, tvořený z aminokyselinové sekvence podle zbytků 2 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B).
7. Imunogenní polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků 9 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (viz obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně

25 obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci.
8. Imunogenní polypeptid podle nároku 7, tvořený z aminokyselinové sekvence podle zbytků 9 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedená aminokyselinová sekvence případně obsahuje jednu aminokyselinovou deleci, vložení a/nebo substituci,
9. Imunogenní polypeptid podle nároku 7, obsahující aminokyselinovou sekvenci podle zbytků

30 9 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B).
10. Imunogenní polypeptid podle nároku 8, tvořený z aminokyselinové sekvence podle zbytků 9 až 710 sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B).
11. Polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.

35
12. Polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 15 (obr. 8 A a 8 B) nebo sekvenci, jež kóduje tentýž genový produkt nebo genový produkt, jež je imunologicky ekvivalentní v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
13. Polynukleotid složený z nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 15 (obr. 8 A a 8 B) nebo sekvence, jež kóduje tentýž genový produkt nebo genový produkt, jež je imunologicky ekvivalentní

40 v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
14. Polynukleotid složený z nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 15 (obr. 8 A a 8 B).
15. Polynukleotid obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za mírně stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje zbytky 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a

45 8B), případně bez vazby histidinových zbytků na AMerminálním konci, přičemž uvedený polynukleotid obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci kódující imunogenní polypeptid, jež je funkčně

-23CZ 302852 B6 ekvivalentní zbytkům 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16, případně bez vazby histid i nových zbytků na TV-terminálním konci, v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
16. Polynukleotid podle nároku 15, obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za mírně stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje zbytky 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedený polynukleotid obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci kódující imunogenní polypeptid, jež je funkčně ekvivalentní zbytkům 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16, v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
17. Polynukleotid podle nároku 15, obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za vysoce stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje zbytky 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), případně bez vazby histidinových zbytků na ?V-terminálním konci, přičemž uvedený polynukleotid obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci kódující imunogenní polypeptid, jež je funkčně ekvivalentní zbytkům 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16, případně bez vazby histidinových zbytků na AMerminálním konci, v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
18. Polynukleotid podle nároku 17, obsahující prvou nukleotidovou sekvenci, která za vysoce stringentních podmínek hybridizuje s druhou nukleotidovou sekvencí, jež je komplementární k třetí nukleotidové sekvenci, která kóduje zbytky 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 (obr. 8 A a 8 B), kde uvedený polynukleotid obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci kódující imunogenní polypeptid, jež je funkčně ekvivalentní zbytkům 2 až 710 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16, v testu proliferace T buněk nebo testu produkce interferonu gama.
19. Polypeptid kódovaný polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 15 až 18.
20. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 nebo 19,
21. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 11 až 18.
22. Expresní vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 11 až 18.
23. Expresní vektor podle nároku 22, který je virální vektor.
24. Očkovací vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 nebo 19 a adjuvant.
25. Očkovací vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 11 až 18.
26. Izolovaná hostitelská buňka, která rekombinantně exprimuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 nebo 19.
27. Způsob přípravy polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 nebo 19, vyznačující se tím, že se rekombinantně exprimuje polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 11 až 18.