PL209260B1 - Immunogenny polipeptyd, kodujący go polinukleotyd, polipeptyd,sposób wytwarzania polipeptydu, zawierająca immunogenny polipeptyd kompozycja farmaceutyczna, zawierający polinukleotyd wektor ekspresyjny, kompozycja szczepionki oraz komórka gospodarza - Google Patents
Immunogenny polipeptyd, kodujący go polinukleotyd, polipeptyd,sposób wytwarzania polipeptydu, zawierająca immunogenny polipeptyd kompozycja farmaceutyczna, zawierający polinukleotyd wektor ekspresyjny, kompozycja szczepionki oraz komórka gospodarzaInfo
- Publication number
- PL209260B1 PL209260B1 PL386292A PL38629299A PL209260B1 PL 209260 B1 PL209260 B1 PL 209260B1 PL 386292 A PL386292 A PL 386292A PL 38629299 A PL38629299 A PL 38629299A PL 209260 B1 PL209260 B1 PL 209260B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- seq
- polynucleotide
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 118
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 185
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 177
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 176
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 85
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 85
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 85
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 40
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 87
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 77
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 76
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 72
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 31
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 26
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 23
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 claims description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims description 9
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 claims description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 94
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 94
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 94
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 90
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 90
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 68
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 29
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 27
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 14
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 11
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 10
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 7
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 7
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 6
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- -1 γ-Abu Chemical compound 0.000 description 6
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobutanoic acid Natural products CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 101100224410 Solanum tuberosum DPEP gene Proteins 0.000 description 3
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 1,25-Dihydroxy-vitamin D3' Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CC(O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 2
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxynonadecane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)(C(O)=O)CC(O)=O HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000581364 Clinitrachus argentatus Species 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Chemical class OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical class OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N D-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical class OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- YFPJFKYCVYXDJK-UHFFFAOYSA-N Diphenylphosphine oxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1[P+](=O)C1=CC=CC=C1 YFPJFKYCVYXDJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N Gly-Cys-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC([O-])=O CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Chemical class 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101001044455 Rattus norvegicus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Chemical class 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 229940040563 agaric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 108091000085 chlorophyll binding Proteins 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- UMNKXPULIDJLSU-UHFFFAOYSA-N dichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)Cl UMNKXPULIDJLSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099364 dichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003979 granulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Chemical class 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000016412 positive regulation of cytokine production Effects 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Chemical class 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000032922 susceptibility to mycobacterium tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000001238 wet grinding Methods 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunogenny polipeptyd, kodujący go polinukleotyd, polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu, zawierająca immunogenny polipeptyd kompozycja farmaceutyczna, zawierający polinukleotyd wektor ekspresyjny, kompozycja szczepionki oraz komórka gospodarza. Niniejszy wynalazek znajduje przykładowo zastosowanie w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom wywoływanym Mycobacterium tuberculosis.
Gruźlica jest przewlekłą chorobą zapalną, wywoływaną zakażeniem M. tuberculosis. Jest ona jedną z najistotniejszych chorób występujących zarówno w krajach rozwijających się jak i stanowi coraz większy problem w rozwiniętych regionach świata. Co rocznie stwierdza się wystąpienie około 8 milionów nowych przypadków oraz 3 miliony zgonów z powodu gruź licy. Jakkolwiek zakażenie może przez dłuższy czas pozostawać nierozpoznane to zazwyczaj choroba daje objawy ostrego zapalenia płuc, z gorączką i kaszlem bez odkrztuszania. W przypadku braku leczenia dochodzi zwykle do poważnych powikłań i zgonu.
O ile, gruź licę można na ogół zwalczać długotrwałą antybiotykoterapią , to leczenie takie jest niewystarczające do zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby. U osób zakażonych mogą przez pewien czas nie występować jakiekolwiek objawy, a tym samym mogą one potencjalnie zakażać kolejne osoby. Ponadto, mimo że stosowanie się do zaleceń lekarskich ma kluczowe znaczenie, trudno jest nadzorować zachowanie pacjentów. Niektórzy chorzy nie kończą całego cyklu leczenia, co może prowadzić do nieskuteczności takiego leczenia i rozwoju lekooporności.
Dla kontrolowania rozprzestrzeniania się gruźlicy istotne znaczenie mają skuteczne szczepienia i trafne wczesne rozpoznanie choroby. Obecnie najskuteczniejszą metodą wywoł ywania ochronnej odporności jest szczepienie żywymi drobnoustrojami. Najczęstszym stosowanym w tym celu szczepem Mycobacterium jest Bacillus Calmette-Guerin (BCG), awirulentny szczep M. bovis. Jednakże bezpieczeństwo i skuteczność BCG budzą wątpliwości i w niektórych krajach, na przykład w Stanach Zjednoczonych, populacji ogólnej nie poddaje się szczepieniom tym szczepem.
Gruźlicę rozpoznaje się zwykle na podstawie testu skórnego, polegającego na śródskórnym podaniu tuberkuliny PPD (oczyszczonej pochodnej białkowej). Swoiste dla antygenu reakcje limfocytów T wywołują wystąpienie po 48-72 godzinach od wstrzyknięcia mierzalnego stwardnienia w miejscu wstrzyknięcia, co wskazuje na ekspozycję na antygeny Mycobacterium. W przypadku tego testu problemem jest jednak jego czułość i swoistość. Dodatkowo nie jest możliwym odróżnienie osób szczepionych BCG od osób zakażonych.
O ile, jak wykazano, gł ównymi efektorami odpornoś ci na M. tuberculosis są makrofagi, to gł ównymi induktorami tej odporności są limfocyty T. Dowodem kluczowej roli limfocytów T w ochronie przed zakażeniem M. tuberculosis jest częste występowanie M. tuberculosis u chorych z zespołem nabytego braku odporności (AIDS), związane ze zmniejszeniem liczby limfocytów T CD4+ spowodowanym zakażeniem ludzkim wirusem nabytego braku odporności (HIV). Wykazano, że reagujące na Mycobacterium limfocyty T CD4+ są silnymi induktorami interferonu gamma (IFN-γ), który z kolei, jak wykazano, wyzwala działanie makrofagów przeciwko Mycobacterium u myszy. Chociaż rola IFN-γ u ludzi jest mniej oczywista, badania wykazały, że 1,25-dihydroksywitarnina D3, sama lub w połączeniu z IFN-γ lub czynnikiem martwicy nowotworu-alfa, aktywuje ludzkie makrofagi do hamowania zakażenia M. tuberculosis. Ponadto wiadomo, że IFN-γ pobudza ludzkie makrofagi do wytwarzania 1,25-dihydroksywitaminy D3. Podobnie wykazano, że interleukina-12 (IL-12) odgrywa istotną rolę w pobudzaniu oporności na zakażenie M. tuberculosis. Przegląd immunologii zakażenia M. tuberculosis można znaleźć w Chan i Kaufmann, 1994, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, red. Bloom, ASM Press, Waszyngton, D.C.
W związku z tym wciąż istnieje potrzeba opracowania ulepszonych szczepionek i ulepszonych sposobów rozpoznawania, zapobiegania i leczenia gruźlicy.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunogenny polipeptyd zawierający, korzystnie składający się z sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 24, przy czym ta sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową delecję, addycję i/lub substytucję. Zgodnie z korzystną postacią wykonania przedmiotem wynalazku jest immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, korzystniej składający się z sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 24.
Przedmiotem wykonania jest również immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowa zgodną z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16 albo zgodną z resztami 9 do 596
PL 209 260 B1 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową substytucję, addycję i/lub delecję.
Immunogenny polipeptyd według wynalazku korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową zgodną z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną substytucję aminokwasową, korzystniej zawiera sekwencję aminokwasową zgodną z resztami aminokwasów 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16.
Zgodnie z inną postacią wykonania wynalazku immunogenny polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16 albo zgodnej z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym sekwencja ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową substytucję, addycję i/lub delecję, korzystnie zawiera jedną konserwatywną substytucję aminokwasową, jeszcze korzystniej immunogenny polipeptyd według wynalazku składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16 albo zgodnej z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24.
Zgodnie z kolejnym aspektem przedmiotem niniejszego wynalazku jest polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogenny polipeptyd według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również polinukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową zgodną z SEK NR ID: 15 albo z SEK NR ID: 23 lub sekwencją kodują c ą ten sam produkt genowy, korzystnie polinukleotydu składającego się z sekwencji nukleotydowej zgodnej z SEK NR ID: 15 albo z SEK NR ID: 23 lub z sekwencją kodującą ten sam produkt genowy, najkorzystniej składającego się z sekwencji nukleotydowej zgodnej z SEK NR ID: 15 albo z SEK NR ID: 23.
Przedmiotem wynalazku jest także polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 16, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na DPV, MTI i MTCC2 w teście proliferacji komórek T lub teście wytwarzania interferonu gamma, przy czym korzystnie polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugim nukleotydem, który jest komplementarny do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 16, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na DPV, MTI i MTCC2 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma.
Zgodnie z innym aspektem wykonania przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, przy czym polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma, przy czym korzystnie polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, przy czym polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej reszty 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub wytwarzania interferonu gamma. Korzystnie polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej reszty 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub wytwarzania interferonu gamma.
Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku. Korzystnie, polipeptyd ten jest w fuzji z drugim polipeptydem heterologicznym.
PL 209 260 B1
Wynalazek dostarcza ponadto kompozycji farmaceutycznej do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zakażenia M. tuberculosis zawierającej immunogenny polipeptyd według wynalazku albo polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku.
Zgodnie z kolejnym korzystnym aspektem wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zakażenia M. tuberculosis zawierającej polinukleotyd według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor ekspresyjny, korzystnie wektor wirusowy, zawierający polinukleotyd według wynalazku.
Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji szczepionki, zawierającej immunogenny polipeptyd według wynalazku albo polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku i adiuwant.
Wynalazek dostarcza ponadto kompozycji szczepionki zawierającej polinukleotyd według wynalazku i adiuwant.
Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub w zapobieganiu zakażeniom M. Tuberculosis.
Zgodnie z innym aspektem, przedmiotem wynalazku jest również polinukleotyd według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub w zapobieganiu zakażeniom M. Tuberculosis.
Kolejno, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu według wynalazku, w którym prowadzi się rekombinowaną ekspresję polinukleotydu wedł ug wynalazku.
Zgodnie z kolejnym aspektem wynalazek dotyczy izolowanej komórki gospodarza, w której zachodzi rekombinacyjna ekspresja polipeptydu według wynalazku.
Niniejszy wynalazek opiera się w części na spostrzeżeniu, że polinukleotydy, które zawierają od dwóch do pięciu sekwencji kodujących M. tuberculosis, wytwarzają rekombinacyjne białka fuzyjne, które zachowują immunogenność i antygenowość ich poszczególnych składowych. Te opisane niniejszym białka fuzyjne według wynalazku indukują zarówno reakcje limfocytów T, jak i limfocytów B, co można potwierdzić poprzez proliferację limfocytów T, wytwarzanie cytokin i wytwarzanie przeciwciał. Ponadto jako immunogen stosowano in vivo białko fuzyjne z adiuwantami w celu wywołania zarówno komórkowej, jak i humoralnej odporności na M. tuberculosis. Ponadto wytwarzano konstrukt białka fuzyjnego do stosowania w wytwarzaniu szczepionki z adiuwantem do uzyskania długotrwałej ochrony zwierząt przed rozwojem gruźlicy. Białko fuzyjne było immunogenem skuteczniejszym, niż mieszanina poszczególnych jego składników białkowych.
Izolowane lub oczyszczone polipeptydy M. tuberculosis stosuje się powszechnie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do podawania pacjentowi w celu zapobiegania i/lub leczenia zakażenia M. tuberculosis. Immunogenność białka fuzyjnego można zwiększyć dodając adiuwant.
Izolowane lub oczyszczone polinukleotydy stosuje się natomiast do wytwarzania rekombinacyjnych antygenów polipeptydu fuzyjnego in vitro. Polinukleotydy można także podawać pacjentowi bezpośrednio jako szczepionki DNA w celu wywołania ekspresji antygenu w organizmie pacjenta, i w wyniku tego wywołania reakcji immunologicznej przeciwko M. tuberculosis.
Polipeptydy te można również stosować do testów in vitro do wykrywania przeciwciał humoralnych lub odporności komórkowej przeciwko M. tuberculosis w celu rozpoznawania zakażenia lub obserwacji postępu choroby. Ponadto polipeptydy można stosować jako środek diagnostyczny in vitro w postaci śródskórnego testu skórnego. Zamiast tego polipeptydy, można stosować jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał przeciwko M. tuberculosis w organizmie zwierzęcia (innego niż człowiek). Przeciwciała można stosować do wykrywania docelowych antygenów in vivo i in vitro. 4.
Niniejszy wynalazek zilustrowano w opisanych poniżej przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym
Fig. 1A i 1B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 1) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 2) białka trifuzyjnego Ra12-TbH9-Ra35 (oznaczonego jako Mtb32A)
Fig. 2: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 3) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 4) białka trifuzyjnego Erdl4-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb39A)
Fig. 3A-3D: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 5) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 6) białka trifuzyjnego TbRa3-38kD-Tb38-1
Fig. 4A-4D: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 7) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 8) białka bifuzyjnego TbH9-Tb38-1
Fig. 5A-5J: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 9) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 10) białka tetrafuzyjnego TbRa3-38kD-Tb38-1DPEP (oznaczonego jako TbF-2)
PL 209 260 B1
Fig. 6A i 6B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 11) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 12) białka pentafuzyjnego Erdl4-DPV-MTI-MSL-MTCC2 (oznaczonego jako Mtb88f)
Fig. 7A i 7B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 13) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 14) białka tetrafuzyjnego Erdl4-DPV-MTI-MSL (oznaczonego jako Mtb46f)
Fig. 8A i 8B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 15) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 16) białka tetrafuzyjnego DPV-MTI-MSL-MTCC2 (oznaczonego jako Mtb71f)
Fig. 9A i 9B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 17) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 18) białka trifuzyjnego DPV-MTI-MSL (oznaczonego jako Mtb31f)
Fig. 10A i 10B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 19) i sekwencja aminokwasowa (SEK NR ID: 20) białka trifuzyjnego TbH9-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb61f)
Fig. 11A i 11B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 21) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 22) białka trifuzyjnego Erdl4-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb36f)
Fig. 12A i 12B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 23) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 24) białka bifuzyjnego TbH9-Ra35 (oznaczonego jako Mtb59f)
Fig. 13A i 13B: przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK NR ID: 25) i sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 26) białka bifuzyjnego Ra12-DPPD (oznaczonego jako Mtb24)
Fig. 14A-14F: przedstawia reakcje proliferacyjne limfocytów T sześciu osobników PPD+ po stymulacji dwoma białkami fuzyjnymi i ich oddzielnymi składnikami
Fig. 15A-15F: przedstawia wytwarzanie IFN-γ w organizmach sześciu osobników PPD+ po stymulacji dwoma białkami fuzyjnymi i ich oddzielnymi składnikami
Fig. 16A-16F: przedstawia proliferację limfocytów T myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem
Fig. 17: przedstawia wytwarzanie IFN-γ myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem
Fig. 13: przedstawia wytwarzanie IL-4 myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem
Fig. 19A-19F: przedstawia stężenie przeciwciał w surowicy myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem
Fig. 20A-20C: przedstawia przeżycie świnek morskich po ekspozycji na M. tuberculosis w aerozolu. Przed ekspozycją na bakterie u świnek morskich zastosowano jako immunogen białka fuzyjne Mtb32A i Mtb39A, w kompozycji z adiuwantem SBASlc (20A), SBAS2 (20B) lub SBAS7 (20C). Kontrolą dodatnią jest BCG.
Fig. 21A i 21B: przedstawia stymulację proliferacji i wytwarzania IFN-γ w TbH9-swoistych limfocytach T przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1.
Fig. 22A i 22B: przedstawia stymulację proliferacji i wytwarzania IFN-γ w Tb38-1-swoistych limfocytach T przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1.
Fig. 23A i 23B: przedstawia stymulację proliferacji i wytwarzania IFN-γ w limfocytach T, dla których uprzednio wykazano reakcję zarówno na antygen TbH-9, jak i Tb38-1, przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są immunogeniczne polipeptydy, które stanowią antygeny użyteczne w leczeniu i zapobieganiu gruźlicy, polinukleotydy kodujące takie antygeny i sposoby ich zastosowania. Antygeny te są polipeptydami fuzyjnymi antygenów M. tuberculosis i jego odmian. Bardziej szczegółowo, antygeny te zawierają co najmniej dwa polipeptydy M. tuberculosis, które uległy fuzji do większej cząsteczki polipeptydu fuzyjnego. Mogą one ponadto zawierać inne składniki, przeznaczone do zwiększenia immunogenności antygenów lub do ulepszenia tych antygenów w innych aspektach, na przykład izolacja antygenów poprzez dodanie przedłużenia z reszt histydynowych na jednym z końców antygenu.
Antygeny swoiste dla M. tuberculosis
Antygeny swoiste dla M. tuberculosis przedstawiono na Fig. 1A-13B, włączając homologi i odmiany tych antygenów. Antygeny te można modyfikować poprzez na przykład dodanie łącznikowych sekwencji peptydowych, jak to opisano poniżej. Te peptydy łącznikowe można włączać między jeden lub więcej polipeptydów, tworzących każde z białek fuzyjnych przedstawionych na Fig. 1A-13S. Innymi antygenami są antygeny opisane na Fig. 1A-13B, połączone ze znanym antygenem M. tuberculosis, takim jak uprzednio opisywany antygen 38 kD (SEK NR ID: 27) (Andersen i Hansen, 1989, Infect. Immun. 57:2481-2488; Genbank nr nabycia M30046).
PL 209 260 B1
Testy immunogenności
Antygeny i ich immunogenne części, mają zdolność do wywoływania reakcji immunogennej. Bardziej szczegółowo, antygeny mają zdolność do wywoływania proliferacji i/lub wytwarzania cytokin (to znaczy wytwarzania interferonu γ i/lub interleukiny 12) w limfocytach T, komórkach NK, limfocytach B i/lub makrofagach, pochodzą cych od osobnika odpornego na M. tuberculosis. Dobór typu komórki do zastosowania w ocenie reakcji immunogennej będzie zależał od badanej reakcji. Na przykład wytwarzanie interleukiny 12 najłatwiej ocenia się z zastosowaniem preparatów zawierających limfocyty B i/lub makrofagi. Osobnik odporny na M. tuberculosis jest to taki osobnik, którego uważa się za opornego na rozwój gruźlicy poprzez to, że doszło u niego do skutecznej reakcji limfocytów T przeciwko M. tuberculosis (to znaczy, jest on w zasadzie wolny od objawów choroby). Osobniki takie można zidentyfikować w oparciu o silnie dodatni (to znaczy, stwardnienie o średnicy powyżej 10 mm) wynik testu skórnego na białka gruźlicy (PPD) i brak jakichkolwiek przedmiotowych i podmiotowych objawów gruźlicy. Limfocyty T, komórki NK, limfocyty B i makrofagi pochodzące od osobnika odpornego na M. tuberculosis można wytwarzać sposobami znanymi specjalistom. Na przykład można stosować preparat PBMC (to znaczy, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej) bez dalszego rozdzielania komórek składowych. PBMC można na ogół wytworzyć na przykład stosując odwirowanie gęstości poprzez „FICOLL (Winthrop Laboratories, NY).
Limfocyty T do testów można również oczyszczać bezpośrednio z PBMC. Zamiast tego można stosować wzbogaconą linię komórkową limfocytów T przeciwko białkom Mycobacterium, lub klony limfocytów T reaktywne na poszczególne białka Mycobacterium. Takie klony limfocytów T można wytwarzać na przykład poprzez hodowlę PBMC od osobników odpornych na M. tuberculosis z białkami Mycobacterium przez czas 2-4 tygodni. Umożliwia to ekspansję jedynie limfocytów T swoistych przeciwko białkom Mycobacterium, co powoduje powstanie linii złożonej wyłącznie z takich komórek. Komórki te można następnie klonować i badać z poszczególnymi białkami, stosując sposoby znane specjalistom w celu dokładniejszego zdefiniowania swoistości poszczególnych limfocytów T. Ogólnie, antygeny, które wypadają dodatnio w testach na proliferację i/lub wytwarzanie cytokin (to znaczy wytwarzanie interferonu γ i/lub interleukiny 12), wykonanych z zastosowaniem limfocytów T, komórek NK, limfocytów B i/lub makrofagów pochodzących od osobników odpornych na M. tuberculosis, uważa się za immunogenne. Testy takie można przeprowadzić na przykład stosując przykładowe opisane poniżej procedury. Immunogenne części takich antygenów można zidentyfikować stosując podobne testy, i mogą one być obecne w polipeptydach opisanych poniżej.
Zdolność polipeptydu (na przykład immunogenicznego antygenu, lub jego części lub innej odmiany) do wywoływania proliferacji komórek, ocenia się poprzez zetknięcie komórek (na przykład komórek T i/lub komórek NK) z polipeptydem i pomiar proliferacji komórek. Na ogół ilość polipeptydu, wystarczająca do oceny około 105 komórek, wynosi od około 10 ng/ml do około 100 μg/ml, a korzystnie wynosi około 10 μg/ml. Inkubację polipeptydu z komórkami prowadzi się typowo w temperaturze 37°C przez około sześć dni. Po inkubacji z polipeptydem komórki bada się pod kątem reakcji proliferacyjnej, którą można oceniać sposobami znanymi specjalistom, na przykład poprzez eksponowanie komórek na impuls znakowanej radioaktywnie tymidyny i pomiar włączania znacznika do DNA komórek. Ogólnie, polipeptyd powodujący co najmniej trzykrotne zwiększenie proliferacji powyżej poziomu tła (to znaczy proliferacji obserwowanej dla komórek hodowanych bez polipeptydu) uważa się za zdolny do indukcji proliferacji.
Zdolność polipeptydu do stymulowania wytwarzania interferonu γ i/lub interleukiny 12 można oceniać poprzez zetknięcie komórek z polipeptydem i pomiar poziomu interferonu γ lub interleukiny 12 wytwarzanej przez komórki. Ogólnie, ilość polipeptydu, wystarczająca do oceny około 105 komórek, wynosi od około 10 ng/ml do około 100 μg/ml, a korzystnie, wynosi około 10 μg/ml. Polipeptyd może być, lecz niekoniecznie, unieruchomiony na podłożu stałym, takim jak kulka lub ulegająca rozpadowi biologicznemu mikrosfera, takich jak opisane w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4897268 i 5075109. Inkubację polipeptydu z komórkami typowo prowadzi się w temperaturze 37°C przez około sześć dni. Po inkubacji z polipeptydem, komórki bada się pod kątem interferonu γ i/lub interleukiny 12 (lub jednej lub więcej z jej podjednostek), które można oceniać sposobami znanymi specjalistom, takimi jak enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA), lub, w przypadku podjednostki P70 IL-12, test biologiczny, taki jak test z pomiarem proliferacji limfocytów T. Ogólnie polipeptyd powodujący wytwarzanie co najmniej 50 pg interferonu γ na ml nadsączu hodowli (zawierającego 104-105 komórek na ml) uważa się za zdolny do stymulowania wytwarzania interferonu γ. Polipeptyd, który pobudza wytwarzanie co najmniej 10 pg/ml podjednostki P70 IL-12 i/lub co najmniej 100 pg/ml podjednostki P40 IL-12,
PL 209 260 B1 na 10s makrofagów lub limfocytów B (lub na 3x105 PBMC) uważa się za zdolny do pobudzania wytwarzania IL-12.
Ogólnie, antygenami immunogennymi są te antygeny, które pobudzają proliferację i/lub wytwarzanie cytokin (to znaczy, interferonu γ i/lub interleukiny 12) w limfocytach T, komórkach NK, limfocytach B i/lub makrofagach, pochodzących od co najmniej około 25% osobników odpornych na M. tuberculosis. Wśród tych antygenów immunogennych, można wyróżnić polipeptydy o korzystnych właściwościach terapeutycznych w oparciu o wielkość reakcji w powyższych testach i w oparciu o odsetek osobników, dla których obserwuje się reakcję. Ponadto, antygeny o korzystnych właściwościach terapeutycznych nie będą pobudzały proliferacji ani wytwarzania cytokin in vitro w komórkach pochodzących od więcej niż 25% osobników nieodpornych na M. tuberculosis, co eliminuje reakcje nie spowodowane swoiście komórkami reagującymi na M. tuberculosis. Antygeny pobudzające reakcję w dużym odsetku preparatów limfocytów T, komórek NK, limfocytów B i/lub makrofagów od osobników odpornych na M. tuberculosis (z małą częstością reakcji w preparatach komórek od innych osobników) mają korzystne właściwości terapeutyczne.
Antygeny o korzystnych właściwościach terapeutycznych można również zidentyfikować na podstawie ich zdolności do zmniejszania nasilenia zakażenia M. tuberculosis u zwierząt doświadczalnych przy podawaniu w postaci szczepionki. Korzystne preparaty szczepionki do zastosowania u zwierząt doświadczalnych opisano szczegółowo poniżej. Skuteczność można określić w oparciu o zdolność antygenu do zapewniania co najmniej oko ł o 50% zmniejszenia liczby bakterii i co najmniej około 40% zmniejszenia śmiertelności po zakażeniu doświadczalnym. Do korzystnych zwierząt doświadczalnych należą myszy, świnki morskie i Naczelne.
Izolowanie sekwencji kodujących
Przedmiotem niniejszego wynalazku są również cząsteczki kwasów nukleinowych, kodujące polipeptydy fuzyjne M. tuberculosis. W szczegółowych wykonaniach podanych jako przykładowe w poniższym przykładzie 6, zbudowano trzynaście fuzyjnych sekwencji kodujących M. tuberculosis. Każdą sekwencję nukleotydową, kodującą sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego można stosować do wytwarzania rekombinacyjnych cząsteczek, kierujących ekspresją sekwencji kodującej.
Dla klonowania pełnej długości sekwencji kodujących lub odmian homologicznych dla wytworzenia polinukleotydów fuzyjnych, można stosować wyznakowane sondy DNA, wytworzone z dowolnej części sekwencji nukleotydowych lub ich komplementów według niniejszego wynalazku, do przeszukiwania biblioteki genomowej lub cDNA, utworzonej z różnych szczepów M. tuberculosis, w celu zidentyfikowania sekwencji kodującej każdego składnika. Izolowanie sekwencji kodujących można przeprowadzić poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR), stosując dwie pule zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych, wytworzone na podstawie sekwencji kodujących.
Wynalazek dotyczy izolowanych lub oczyszczonych polinukleotydów komplementarnych do sekwencji SEQ ID nr: 15 i 23, oraz polinukleotydów wybiórczo hybrydyzujących do takiej sekwencji komplementarnej. W korzystnym wykonaniu w łagodnych warunkach hybrydyzacji polinukleotyd według wynalazku koduje białko zachowujące immunogeniczność białek fuzyjnych o sekwencji SEQ ID nr: 16 i 24.
Inne izolowane lub oczyszczone polinukleotydy, mogą być komplementarne do sekwencji nukleotydowych SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 i 25, oraz do polinukleotydów, które wybiórczo hybrydyzują do takich sekwencji komplementarnych. Zapewniono też polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji SEQ ID nr: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 i 25 lub jej sekwencji komplementarnej w łagodnych warunkach hybrydyzacji i kodujący białko, zachowujące immunogenność białek fuzyjnych o SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22 i 26.
Jako przykład łagodnych warunków hybrydyzacji można podać następujące warunki: (zob. także Shilo i Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:6789-6792): filtry zawierające DNA poddaje się obróbce wstępnej przez 6 godzin w temperaturze 40°C w roztworze zawierającym 35% formamidu, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA i 500 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Hybrydyzację prowadzi się z zastosowaniem tego samego roztworu z następującymi modyfikacjami: stosuje się 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 μg/ml DNA spermy łososiowej, 10% (masa/obj.) siarczanu dekstranu i 5-20 X 10s cpm sondy wyznakowanej 32P. Filtry inkubuje się w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez 18-20 h w temperaturze 40°C, a następnie płucze przez 1,5 godziny w temperaturze 55°C w roztworze zawierającym 2xSSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA i 0,1% SDS. Roztwór płuczący zastępuje się świeżym roztworem i inkubuje przez dodatkowe półtorej godziny w temperaturze 60°C. Filtry osusza się bibułą i eksponuje na autoradiografię. Jeżeli jest to konieczne, filtry płucze się po raz trzeci w temperaturze 65-68°C i ponownie
PL 209 260 B1 eksponuje na film. Inne warunki łagodnej hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki (na przykład takie, jak stosowane do hybrydyzacji międzygatunkowej).
W innym korzystnym wykonaniu dostarcza się polinukleotyd, hybrydyzują cy do sekwencji kodującej SEK NR ID: 15 albo 23, lub jej sekwencji komplementarnej w surowych warunkach hybrydyzacji i kodują cy biał ko, zachowują ce immunogenność biał ek fuzyjnych o SEK NR ID: 16 i 23.
Można także zapewnić polinukleotyd, hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 i 25 lub jej sekwencji komplementarnych w surowych warunkach hybrydyzacji i kodujący białko, zachowujące immunogenność białek fuzyjnych o SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22 i 26. Surowe warunki hybrydyzacji są następujące. Wstępną hybrydyzację filtrów, zawierających DNA, prowadzi się od 8 godzin do czasu przez noc w temperaturze 65°C w buforze złożonym z 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 500 μml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Filtry hybrydyzuje się przez 48 godzin w temperaturze 65°C w mieszaninie hybrydyzacji wstępnej, zawierającej 100 μg/ml denaturowanego DMA spermy łososiowej i 5-20 X 105 cpm sondy wyznakowanej 32P. Płukania filtrów dokonuje się w temperaturze 37°C przez 1 godz. w roztworze zawierającym 2 X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll i 0,01% BSA. Następnie prowadzi się płukanie w 0,1 X SSC w temperaturze 50°C przez 45 minut przed autoradiografią. Inne surowe warunki hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki.
W innym korzystnym wykonaniu zapewnia się polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEK NR ID: 15 albo 23 lub do jej sekwencji komplementarnej w średnich warunkach hybrydyzacji i kodujący białko zachowujące immunogenność białka fuzyjnego o SEK NR ID: 16 albo 24.
Można też zapewnić polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEK NR ID: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21 lub 25 lub do jej sekwencji komplementarnej w średnich warunkach hybrydyzacji i kodujący białko zachowujące immunogenność białka fuzyjnego o SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22 i 26. Przykładowe średnie warunki hybrydyzacji są następujące: filtry zawierające DNA poddaje się obróbce wstępnej przez 6 godz. w temperaturze 55°C w roztworze zawierającym 6 X SSC, 5X roztwór Denhardta, 0,5% SDS i 100 μg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Hybrydyzację prowadzi się w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez 18-20 godz. w temperaturze 55°C i następnie płucze dwukrotnie przez 30 minut w temperaturze 60°C w roztworze zawierającym 1 X SSC i 0,1% SDS. Filtry osusza się bibułą i eksponuje na autoradiografię. Inne średnie warunki hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki. Płukanie filtrów prowadzi się w temperaturze 37°C przez 1 godz. w roztworze zawierającym 2 X SSC, 0,1% SDS.
Polipeptydy kodowane przez sekwencje kodujące
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem polinukleotyd według niniejszego wynalazku, kodujący białko fuzyjne, jego fragmenty lub funkcjonalne odpowiedniki można stosować do wytwarzania cząsteczek rekombinacyjnych kwasów nukleinowych, kierujących ekspresją białka fuzyjnego, jego fragmentów lub funkcjonalnych odpowiedników w odpowiednich komórkach-gospodarzach. Produkty polipeptydu fuzyjnego kodowane przez takie polinukleotydy można modyfikować poprzez molekularną manipulację sekwencji kodującej.
Z uwagi na nieodłączną degenerację kodu genetycznego w praktyce niniejszego wynalazku można stosować inne sekwencje DNA, kodujące w zasadzie tę samą lub funkcjonalnie równoważną sekwencję aminokwasową do ekspresji polipeptydów fuzyjnych. Do takich sekwencji DNA należą sekwencje zdolne do hybrydyzacji do sekwencji kodujących lub ich komplementów, opisanych w niniejszym wynalazku, w łagodnych, średnich lub surowych warunkach hybrydyzacji opisanych powyżej.
Do modyfikacji sekwencji nukleotydowych, które można stosować według niniejszego wynalazku, należą delecję, addycję lub substytucje różnych reszt nukleotydowych, powodujące powstanie sekwencji kodujących ten sam lub funkcjonalnie równoważny produkt genowy. Sam produkt genowy może zawierać delecję, addycję lub substytucje reszt aminokwasowych, powodujące nieme zmiany, dając w ten sposób funkcjonalnie równoważny epitop antygenowy. Takich konserwatywnych substytucji aminokwasów można dokonywać w oparciu o podobieństwo polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilności i/lub amfipatycznej natury danych reszt. Na przykład do aminokwasów o ładunku ujemnym należą kwas asparaginowy i glutaminowy; do aminokwasów o ładunku dodatnim należą lizyna, histydyna i arginina; do aminokwasów o nienaładowanych polarnych grupach początkowych o podobnej hydrofilności należą glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina i tyrozyna, a do aminokwasów o niepolarnych grupach początkowych należą alanina, walina, izoleucyna, leucyna, fenyloalanina, prolina, metionina i tryptofan.
PL 209 260 B1
Sekwencje nukleotydowe według niniejszego wynalazku można wytwarzać w celu zmiany sekwencji kodującej białka fuzyjnego w wielu celach, włączając w to, jednak bez ograniczenia, zmiany powodujące modyfikację obróbki i ekspresji produktu genowego. Na przykład można wprowadzać mutacje sposobami znanymi ze stanu techniki, takimi jak mutageneza ukierunkowana na miejsce, w celu wprowadzenia nowych miejsc restrykcyjnych, w celu zmiany wzorca glikozylacji, fosforylacji itd.
W innym wykonaniu niniejszego wynalazku moż na syntetyzować sekwencję kodują c ą biał ka fuzyjnego, w całości lub w części, znanymi sposobami chemicznymi opisanymi, na przykład, przez Caruthers i wsp., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea i Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10) 2331; Matteucci i Caruthers, 1980, Tetrahedron Letter 21:719 i Chow i Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9 (12): 2807-2817. Zamiast tego, sam polipeptyd można wytwarzać stosując sposoby chemiczne w celu wytworzenia w całości lub w części sekwencji aminokwasowej. Na przykład peptydy można syntetyzować technikami fazy stałej, odcinać z żywicy i oczyszczać poprzez preparacyjną wysokowydajną chromatografię cieczową. (Zob. Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., str. 50-60). Skład syntetycznych polipeptydów można potwierdzać poprzez analizę aminokwasów lub sekwencjonowanie (na przykład sposób degradacji Edmana, zob. 5 Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., str. 34-49).
Ponadto sekwencję kodującą, białka fuzyjne można poddawać mutacji in vitro lub in vivo w celu stworzenia i/lub usunięcia sekwencji translacyjnych, inicjacyjnych i/lub terminacyjnych, lub w celu stworzenia odmian w regionach kodujących i/lub stworzenia nowych restrykcyjnych miejsc endonukleazowych lub zniszczenia miejsc uprzednio istniejących w celu ułatwienia dalszych modyfikacji in vitro. Można stosować dowolną technikę mutagenezy znaną ze stanu techniki, włączając w to, jednak bez ograniczenia, mutagenezę chemiczną, ukierunkowaną na miejsce mutagenezę in vitro (Hutchinson, C. i wsp., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), zastosowanie łączników TAB (Pharmacia) i tym podobne. Ważne jest, aby manipulacje nie zniszczyły immunogenności polipeptydów fuzyjnych.
Ponadto, jako substytucje lub addycję do sekwencji można wprowadzać nieklasyczne aminokwasy lub chemiczne analogi aminokwasów. Do aminokwasów nieklasycznych należą, jednak bez ograniczenia, D-izomery pospolitych aminokwasów, kwas α-aminobutyrowy, 4-aminobutyrowy, Aby, 2-aminobutyrowy, γ-Abu, ε-Ahx, 6-aminoheksanoesowy, Aib, 2-aminobutyrowy, 2-aminopropionowy, ornityna, norleucyna, norwalina, hydroksyprolina, sarkozyna, cytrulina, kwas cysteinowy, t-butyloglicyna, t-butyloalanina, fenyloglicyna, cykloheksyloalanina, β-alanina, kwasy fluoroaminowe, tworzone aminokwasy, takie jak β-metyloaminokwasy, Ca-metyloaminokwasy, Na-metyloaminokwasy i ogólnie analogi aminokwasów. Ponadto aminokwas może być D (prawoskrętny) lub L (lewoskrętny).
W swoistym wykonaniu sekwencje kodujące każdego antygenu w białku fuzyjnym są połączone na swych końcach aminowych lub karboksylowych poprzez wiązanie peptydowe w dowolnej kolejności. Zamiast tego można stosować peptydową sekwencję łącznikową do oddzielania poszczególnych polipeptydów, tworzących polipeptyd fuzyjny, o odległość wystarczającą do zapewnienia, że każdy polipeptyd składa się w strukturę drugo- i trzeciorzędową, co maksymalizuje jego skuteczność antygenową w zapobieganiu i leczeniu gruźlicy. Taką peptydową sekwencję łącznikową włącza się do białka fuzyjnego z zastosowaniem standardowych sposobów znanych ze stanu techniki. Można dobierać korzystne peptydowe sekwencje łącznikowe w oparciu o następujące czynniki (1) ich zdolność do przyjęcia giętkiej rozciągniętej konformacji (2) ich niezdolność do przyjęcia struktury drugorzędowej, która mogłaby wchodzić w interakcje z epitopami funkcyjnymi na polipeptydzie pierwszym i drugim i (3) brak hydrofobowych lub naładowanych reszt, które mogłyby reagować z funkcyjnymi epitopami polipeptydu. Korzystne peptydowe sekwencje łącznikowe zawierają reszty Gly, Asn i Ser. W sekwencji łącznikowej można również stosować inne niemal obojętne aminokwasy, takie jak Thr i Ala. Do sekwencji aminokwasowych, które można korzystnie stosować jako łączniki, należą sekwencje opisane przez Maratea i wsp., Gene 40:39-46, 1985; Murphy i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; patencie Stanów Zjednoczonych nr 4935233 i patencie Stanów Zjednoczonych nr 4751180. Sekwencja łącznikowa może mieć długość od 1 do około 50 aminokwasów. Sekwencje peptydowe nie są konieczne, gdy polipeptydy pierwszy i drugi mają okolice nieniezbędnych N-końcowych aminokwasów, które można stosować do oddzielenia domen funkcyjnych i zapobiegania interferencji sterycznej. Na przykład antygeny w białku fuzyjnym mogą być połączone poprzez giętki polilinker, taki jak Gly-Cys-Gly lub Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, powtórzony 1-3 razy (Bird i wsp., 1988, Science 242:423-426; Chaudhary i wsp., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066-1070).
W jednym z wykonań takie białko wytwarza się poprzez rekombinacyjną ekspresję kwasu nukleinowego, kodującego białko. Taki produkt fuzyjny można wytwarzać poprzez ligację ze sobą odpo10
PL 209 260 B1 wiednich sekwencji kwasów nukleinowych, kodujących pożądane sekwencje aminokwasowe sposobami znanymi ze stanu techniki, w odpowiedniej ramce kodującej, i ekspresję produktu sposobami znanymi ze stanu techniki. Zamiast tego produkt taki można wytwarzać technikami syntezy białek, na przykład poprzez zastosowanie syntetyzatora peptydów. Do polinukleotydu fuzyjnego można również dodawać sekwencje kodujące dla innych cząsteczek, takich jak cytokina lub adiuwant.
Wytwarzanie białek fuzyjnych
W celu wytworzenia białka fuzyjnego M. tuberculosis według niniejszego wynalazku sekwencję nukleotydową, kodującą białko, lub jej równoważnik funkcjonalny, wprowadza się do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, to znaczy do wektora zawierającego elementy niezbędne do transkrypcji i translacji wprowadzonej sekwencji kodującej. Komórki-gospodarzy lub linie komórkowe, transfekowane lub transformowane rekombinacyjnymi wektorami ekspresji, można stosować w wielu celach. Należy do nich, jednak bez ograniczenia, produkcja białka fuzyjnego na dużą skalę.
Do wytwarzania wektorów ekspresji, zawierających fuzyjną sekwencję kodującą i odpowiednie sygnały kontroli transkrypcji/translacji, można stosować sposoby znane specjalistom. Do sposobów tych należą sposoby rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i rekombinacja/genetyczna rekombinacja in vivo. (Zob. na przykład sposoby opisane przez Sambrooka i wsp., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., i Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Można również wytwarzać chemicznie RNA zdolne do kodowania polipeptydu (red. Gait, 1984, Oligonucleoide Synthesis, IRL Press, Oxford).
Systemy ekspresji
W celu ekspresji sekwencji kodującej białko fuzyjne można stosować różne systemy gospodarzwektor ekspresji. Należą do nich, jednak bez ograniczenia, drobnoustroje, takie jak bakterie (na przykład E. coli, B. subtilis) transformowane rekombinacyjnym DNA bakteriofaga, wektory ekspresji DNA plazmidowego lub DNA kosmidowego, zawierające sekwencję kodującą, drożdże (na przykład Saccharomyces, Pichia), transformowane rekombinacyjnymi drożdżowymi wektorami ekspresji, zawierającymi sekwencję kodującą, systemy komórek owadów, zakażone rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresji (na przykład bakulowirus), zawierające sekwencję kodującą, systemy komórek roślinnych, zakażone rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (na przykład wirus mozaiki kalafiora - CaMV; wirus mozaiki tytoniowej - TMV) lub transformowane rekombinacyjnymi plazmidowymi wektorami ekspresji (na przykład plazmid Ti), zawierającymi sekwencję kodującą, lub systemy komórek ssaków (na przykład COS, CHO, BHK, komórki 293, 3T3). Elementy ekspresji tych systemów mają różną moc i właściwości.
W zależności od stosowanego układu gospodarz/wektor, w wektorze ekspresji można stosować dowolny z wielu korzystnych elementów transkrypcji i translacji, włączając w to promotory konstytutywne i indukowalne. Na przykład przy klonowaniu w systemach bakteryjnych można stosować promotory indukowalne, takie jak pL bakteriofaga X, plac, ptrp, ptac (promotor hybrydowy ptrp-lac; promotor cytomegalowirusowy) i tym podobne; przy klonowaniu w roślinnych systemach komórkowych można stosować promotory pochodzące z genomu komórek roślinnych (na przykład promotory wstrząsu cieplnego, promotor małej podjednostki RUBISCO, promotor białka wiążącego chlorofil oc/β) lub z wirusów roślinnych (na przykład promotor 35S RNA CaMV; promotor białkowy powłoki TMV); przy klonowaniu w systemach komórek ssaków - promotory pochodzące z genomu komórek ssaków (na przykład promotor metalotioneinowy) lub z wirusów ssaków (na przykład późny promotor adenowirusowy, promotor wirusa krowianki 7.5K); przy wytwarzaniu linii komórkowych, zawierających liczne kopie antygenowej sekwencji kodującej można stosować, wektory oparte na SV-40, BPV i EBV z odpowiednim dobieralnym znacznikiem.
Do ekspresji antygenów M. tuberculosis korzystne są systemy bakteryjne. Do zastosowania in vivo można wytwarzać bakterię, taką jak Bacillus Calmette-Guerin, w celu ekspresji polipeptydu fuzyjnego według niniejszego wynalazku na powierzchni komórki. Można korzystnie dobierać inne bakteryjne systemy ekspresji w zależności od zamierzonego zastosowania produktów po ekspresji. Na przykład, gdy ma być wytworzona duża ilość białka fuzyjnego do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych, korzystne mogą być wektory kierujące ekspresją wysokiego poziomu produktów białka fuzyjnego, które łatwo jest oczyszczać. Do wektorów takich należą, bez ograniczenia, wektor ekspresyjny E. coli pUR278 (Inouye i Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke i Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509) i tym podobne. Można również stosować wektory pGEX dla ekspresji obcych polipeptydów jako białek fuzyjnych z glutationo-S-transferazą (GST). Ogólnie takie
PL 209 260 B1 białka fuzyjne są rozpuszczalne i można je łatwo oczyszczać z uległych lizie komórek poprzez adsorpcję na kulki glutationowo-agarozowe i następnie elucję w obecności wolnego glutationu. Wektory pGEX wytwarza się tak, aby zawierały miejsca cięcia trombiny lub proteazy czynnika Xa, tak aby korzystny klonowany polipeptyd fuzyjny mógł być uwalniany z cząstki GST.
Oczyszczanie białek
Po uzyskaniu ekspresji białka rekombinacyjnego można je zidentyfikować poprzez testy oparte na fizycznych lub funkcjonalnych właściwościach produktu, włączając w to radioaktywne znakowanie produktu i następnie analizę poprzez elektroforezę żelową, test radioimmunologiczny, ELISA, testy biologiczne itd.
Po zidentyfikowaniu kodowanego białka można je izolować i oczyszczać standardowymi sposobami, włączając w to chromatografię (na przykład chromatografię cieczową wysokosprawną, jonowymienną, powinowactwa i kolumny różnicującej wielkość), odwirowanie, różnicową rozpuszczalność lub dowolny inny standardowy sposób oczyszczania białek. Rzeczywiste warunki będą zależeć w części od czynników takich, jak ł adunek netto, hydrofobowość, hydrofilność itd., i bę dą oczywiste dla specjalisty. Właściwości funkcjonalne można oceniać stosując dowolny korzystny test, taki jak wiązanie przeciwciał, indukcja proliferacji limfocytów T, pobudzenie wytwarzania cytokin, takich jak
IL2, IL-4 i IFN-γ. Dla praktyki niniejszego wynalazku korzystne jest, aby każde białko fuzyjne było w co najmniej 80% oczyszczone od innych białek. Korzystniejsze jest, aby było oczyszczone w co najmniej 90%. Do podawania in vivo, korzystne jest, aby białka były oczyszczone w ponad 95%.
Zastosowanie sekwencji kodującej białko fuzyjne
Sekwencję kodującą białko fuzyjne według niniejszego wynalazku można stosować do kodowania produktu białkowego do zastosowania jako immunogen do indukowania i/lub wzmagania reakcji immunologicznej na M. tuberculosis. Ponadto taką sekwencję kodującą można poddać ligacji z sekwencją kodującą innej cząsteczki, takiej jak cytokina lub adiuwant. Takie polinukleotydy można stosować in vivo jako szczepionki DNA (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5589466, 5679647, 5703055). W tym wykonaniu wynalazku polinukleotyd wykazuje ekspresję kodowanego przez siebie białka w organizmie biorcy w celu bezpośredniego pobudzenia reakcji immunologicznej.
Polinukleotyd można wstrzykiwać nieuodpornionemu pacjentowi w celu zapoczątkowania reakcji immunologicznej na produkt kodowany przez ten polinukleotyd, lub podawać zakażonemu lub uodpornionemu pacjentowi w celu zwiększenia wtórnych reakcji immunologicznych.
W korzystnym wykonaniu, kompozycja terapeutyczna zawiera sekwencję kodującą białko fuzyjne lub jej fragmenty, które są częścią wektora ekspresyjnego. W szczególności polinukleotyd taki zawiera promotor połączony w sposób umożliwiający działanie z regionem kodującym, przy czym promotor ten jest indukowalny lub konstytutywny, i ewentualnie swoisty tkankowo. W innym wykonaniu polinukleotyd zawiera sekwencję kodującą otoczoną regionami sprzyjającymi rekombinacji homologicznej w pożądanym miejscu genomu, zapewniając w ten sposób wewnątrzchromosomalną ekspresję sekwencji kodującej (Roller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8932-8935; Zijlstra i wsp. 1989, Nature 342: 435-438).
Podawanie kwasu nukleinowego pacjentowi może być bezpośrednie - w tym przypadku pacjenta eksponuje się bezpośrednio na kwas nukleinowy lub wektor zawierający kwas nukleinowy, lub pośrednie - w tym przypadku komórki transformuje się najpierw kwasem nukleinowym in vitro i następnie wszczepia pacjentowi. Te dwa sposoby znane są, odpowiednio, jako transfer genów in vivo i ex vivo.
W swoistym wykonaniu kwas nukleinowy podaje się bezpośrednio in vivo, gdzie ulega ekspresji w celu wytworzenia kodowanego produktu-białka fuzyjnego. Można tego dokonać jednym z licznych sposobów znanych ze stanu techniki, na przykład poprzez wytworzenie go jako części odpowiedniego wektora ekspresyjnego kwasu nukleinowego i podanie go, tak aby stał się wewnątrzkomórkowy, na przykład poprzez zakażenie z zastosowaniem defektywnego lub atenuowanego wektora retrowirusowego lub innego wektora wirusowego (zob. patent Stanów Zjednoczonych nr 4980286) lub poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie nagiego DNA, lub poprzez zastosowanie bombardowania mikrocząstkami (na przykład działo genowe; Bioloistic, Dupont) lub powlekanie lipidami lub receptorami powierzchni komórkowej lub czynnikami transfekującymi, zamknięcie w liposomach, mikrocząstkach lub mikrokapsułkach (patent Stanów Zjednoczonych nr 5407609, 5853763, 5814344 i 5820883) lub przez podawanie go w połączeniu z peptydem, o którym wiadomo, że wchodzi do jądra, poprzez podanie go w połączeniu z ligandem podlegającym endocytozie, której mediatorem jest receptor (zob. na przykład Wu i Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), który można stosować do typów komórek docelowych wykazujących swoistą ekspresję receptorów itp. W innym praktycznym wykonaniu można wytwarzać
PL 209 260 B1 kompleks kwasu nukleinowego i ligandu, w którym ligand zawiera fuzogenny peptyd wirusowy do rozsadzania endosomów, co umożliwia uniknięcie lizosomalnego rozpadu kwasu nukleinowego. W jeszcze innym praktycznym wykonaniu kwas nukleinowy można ukierunkowywać in vivo na swoisty komórkowo wychwyt zwrotny i ekspresję, poprzez ukierunkowywanie swoistego receptora (zob. na przykład publikacje PCT WO 92/06180 z 16 kwietnia 1992; WO 92/22635 z 23 grudnia 1992; WO 92/20316 z 26 listopada 1992; WO 93/14188 z 22 lipca 1993 i WO 93/20221 z 14 października 1993). Zamiast tego kwas nukleinowy można wprowadzać wewnątrzkomórkowo i włączać do DNA komórki gospodarza w celu ekspresji przez rekombinację homologiczną (Roller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra i wsp., Nature 342: 435-438).
W swoistym wykonaniu można stosować wektor wirusowy, taki jak wektor retrowirusowy (zob. Miller i wsp., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Wektory retrowirusowe zmodyfikowano w celu delecji sekwencji retrowirusowych, które nie są konieczne do pakowania genomu wirusowego i włączania do DNA komórki-gospodarza. Fuzyjną sekwencję kodującą klonuje się do wektora, co ułatwia podawanie kwasu nukleinowego biorcy. Więcej szczegółów na temat wektorów retrowirusowych można znaleźć w Boesen i wsp., 1994, Biotherapy 6: 291-302, gdzie opisano zastosowanie wektora retrowirusowego do podawania genu mdrl do hematopoetycznych komórek macierzystych w celu nadania komórkom macierzystym większej oporności na chemioterapię. Innymi pozycjami piśmiennictwa ilustrującymi zastosowanie wektorów retrowirusowych do terapii genowej są: Clowers i wsp., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiem i wsp., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons i Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141 i Grossman i Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3: 110-114.
Innymi wektorami wirusowymi, które można stosować w terapii genowej, są adenowirusy. Adenowirusy są szczególnie atrakcyjnymi nośnikami do podawania genów na nabłonek dróg oddechowych. Adenowirusy w naturalnych warunkach zakażają nabłonek dróg oddechowych, gdzie wywołują chorobę o lekkim przebiegu. Innymi miejscami docelowymi opartych na adenowirusach systemów podawania są wątroba, ośrodkowy układ nerwowy, komórki śródbłonka i mięśnie. Adenowirusy mają tę zaletę, że są zdolne do zakażania komórek niedzielących się. Proponowano także zastosowanie do transferu genów in vivo wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (Walsh i wsp., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300).
Inna technika obejmuje przeniesienie struktury do komórek w hodowli tkankowej takimi sposobami, jak elektroporacja, lipofekcja, transfekcja, której mediatorem jest fosforan wapnia lub zakażenie wirusowe. Zwykle sposób transferu obejmuje transfer dobieralnego znacznika do komórek. Komórki umieszcza się następnie w warunkach selekcji w celu wyizolowania tych komórek, w których doszło do wychwytu i ekspresji transferowanego genu. Komórki te podaje się następnie pacjentowi.
W tym wykonaniu kwas nukleinowy wprowadza się do komórki przed podaniem in vivo powstałej komórki rekombinacyjnej. Takiego wprowadzenia można dokonać dowolnym sposobem znanym ze stanu techniki, włączając w to, bez ograniczenia, transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, zakażenie wektorem wirusowym lub bakteriofagowym, zawierającym sekwencje kwasu nukleinowego, fuzje komórkowe, chromosomalny transfer genu, mikrokomórkowy transfer genu, fuzję sferoplastu itp. Ze stanu techniki znane są liczne sposoby wprowadzania obcych genów do komórek (zob. na przykład Loeffler i Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen i wsp., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) i można je stosować według niniejszego wynalazku.
Polinukleotydy według niniejszego wynalazku można również stosować w rozpoznawaniu gruźlicy do wykrywania u pacjenta sekwencji polinukleotydowych swoistych dla M. tuberculosis. Takiego wykrywania można dokonywać na przykład poprzez izolowanie polinukleotydów z próbki biologicznej uzyskanej od pacjenta podejrzanego o zakażenie bakterią. Po izolowaniu polinukleotydów z próbki biologicznej umożliwia się hybrydyzację wyznakowanego polinukleotydu według niniejszego wynalazku, komplementarnego do jednego lub więcej polinukleotydów, do polinukleotydów w próbce biologicznej, stosując techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych znane specjalistom. Hybrydyzację taką można prowadzić na przykład w roztworze lub z zastosowaniem partnera hybrydyzacyjnego na stałym podłożu. Terapeutyczne i profilaktyczne zastosowanie białka fuzyjnego
Oczyszczone lub częściowo oczyszczone białka fuzyjne lub ich fragmenty można wytwarzać jako szczepionki lub kompozycję terapeutyczną. Takie kompozycje mogą zawierać adiuwanty w celu wzmożenia reakcji immunologicznych. Ponadto białka takie można dalej zawieszać w emulsji olejowej w celu spowodowania wolniejszego uwalniania białek in vivo po wstrzyknięciu. Optymalny stosunek każdego składnika w preparacie można określać technikami znanymi specjalistom.
PL 209 260 B1
W szczepionkach według niniejszego wynalazku do nasilania reakcji immunologicznej można stosować dowolny z wielu adiuwantów. Większość adiuwantów zawiera substancję, która ma zabezpieczać antygen przed szybkim katabolizmem, taką jak wodorotlenek glinu lub olej mineralny, i substancję nieswoiście stymulującą reakcje immunologiczne, taką jak lipid A, Bordetella pertussis lub Mycobacterium tuberculosis. Odpowiednie adiuwanty są dostępne w handlu i należą do nich na przykład niepełny adiuwant Freunda i pełny adiuwant Freunda (Difco Laboratories) i adiuwant 65 Mercka (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Do innych korzystnych adiuwantów należą ałun, mikrosfery ulegające rozpadowi biologicznemu, monofosforylolipid A, guil A, SBASlc, SBAS2 (Ling i wsp., 1997, Vaccine 15: 1562-1567), SBAS7 i Al(OH)3.
W szczepionkach według niniejszego wynalazku pożądane jest, aby adiuwant indukował reakcję immunologiczną zawierającą aspekty Th1. Do użytecznych adiuwantów należą na przykład połączenie monofosforylolipidu A, a zwłaszcza 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MLP) wraz z solą glinu. System wzmożony obejmuje połączenie monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, zwłaszcza połączenie 3D-MLP i saponiny QS21, jak to opisano w opisie WO 94/00153, lub mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 jest szybko oziębiana z cholesterolem, jak to opisano w opisie WO 96/33739. Uprzednie doświadczenia dowiodły ewidentnego synergistycznego działania połączenia 3D-MLP i QS21 w indukowaniu zarówno reakcji immunologicznej humoralnej, jak i komórkowej typu Thl. Szczególnie silny adiuwant, obejmujący QS21, 3D-MLP i tokoferol w emulsji typu olej w wodzie, opisano w opisie WO 95/17210, i jest to korzystny preparat.
Preparaty zawierające antygen według niniejszego wynalazku można podawać pacjentowi per se lub w postaci kompozycji farmaceutycznej lub terapeutycznej. Preparaty farmaceutyczne, zawierające białka, można wytwarzać za pomocą konwencjonalnego mieszania, rozpuszczania, granulowania, wytwarzania drażetek, mielenia mokrego i frakcjonowania sedymentacyjnego, emulgowania, zamykania w kapsułki, procesów wychwytywania lub liofilizacji. Kompozycje farmaceutyczne można wytwarzać w sposób konwencjonalny z zastosowaniem jednego lub więcej fizjologicznie dopuszczalnych nośników, rozcieńczalników, zaróbek lub substancji pomocniczych, ułatwiających obróbkę polipeptydów do preparatów, które można stosować farmaceutycznie. Odpowiednie wytwarzanie zależy od wybranej drogi podawania.
Do podawania miejscowego, białka można wytwarzać w postaci roztworów, żelów, maści, kremów, zawiesin itd., znanych ze stanu techniki.
Do preparatów o działaniu ogólnoustrojowym należą preparaty przeznaczone do podawania w postaci wstrzyknięć, na przykład podskórnych, dożylnych, domięśniowych, dokanałowych lub dootrzewnowych, jak również preparaty przeznaczone do podawania przezskórnego, przezśluzówkowego, doustnego lub do płuc.
Do wstrzyknięć białka można wytwarzać w postaci roztworów wodnych, korzystnie w buforach zgodnych fizjologicznie, takich jak roztwór Hanksa, roztwór Ringera lub sól fizjologiczna. Roztwór może zawierać środki ułatwiające wytwarzanie, takie jak środki zawieszające, stabilizujące i/lub dyspergujące. Zamiast tego białka można wytwarzać w postaci proszku do rozpuszczania w odpowiednim nośniku, na przykład jałowej, apirogennej wodzie, przed zastosowaniem.
Do podawania przezśluzówkowego w preparacie stosuje się środki penetrujące odpowiednie do danej bariery. Takie środki penetrujące są ogólnie znane.
Do podawania doustnego kompozycję można łatwo wytwarzać poprzez łączenie białek z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami znanymi ze stanu techniki. Nośniki te umożliwiają wytworzenie z białek preparatów w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, cieczy, żelów, syropów, zawiesin i tym podobnych, do podawania doustnego leczonemu pacjentowi. Do korzystnych zaróbek do doustnych preparatów stałych, takich jak proszki, kapsułki i tabletki, należą wypełniacze, takie jak cukry, na przykład laktoza, sacharoza, mannit i sorbit; pochodne celulozy, takie jak skrobia kukurydziana, skrobia pszenna, skrobia ryżowa, skrobia ziemniaczana, żelatyna, tragakanta, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy i/lub poliwinylopirolidon (PVP); środki granulujące i środki wiążące. Jeżeli jest to korzystne, można dodawać środki rozsadzające, takie jak usieciowany poliwinylopirolidon, agar lub kwas alginowy lub jego sól, taką jak alginian sodowy.
Jeżeli jest to korzystne, stale postacie dawkowania mogą być powlekane cukrem lub powłoką dojelitową z zastosowaniem standardowych technik.
Do płynnych preparatów doustnych, takich jak na przykład zawiesiny, eliksiry i roztwory, do odpowiednich nośników, zaróbek lub rozcieńczalników należą woda, glikole, oleje, alkohole itp. Oprócz tego można dodawać środki smakowe, konserwujące, barwniki i tym podobne.
PL 209 260 B1
Do podawania podpoliczkowego białka można wytwarzać w postaci tabletek, tabletek do ssania itp., w sposób konwencjonalny.
Do podawania poprzez inhalację białka do zastosowania według niniejszego wynalazku, korzystnie, podaje się w postaci aerozolu z opakowania pod ciśnieniem lub nebulizatora, z zastosowaniem odpowiedniego propelentu, na przykład dichlorofluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluoroetanu, dwutlenku węgla lub innego korzystnego gazu. W przypadku aerozolu pod ciśnieniem jednostkę dawkową można określić poprzez zaopatrzenie go w zawór do podawania odmierzonej dawki. Można wytwarzać kapsułki i naboje, na przykład żelatynowe, do stosowania w inhalatorze, zawierające proszek-mieszaninę białek i odpowiedniego podłoża proszku, takiego jak laktoza lub skrobia.
Białka można również wytwarzać w postaci kompozycji do podawania doodbytniczego lub dopochwowego, jako czopki lub wlewki, zawierające na przykład konwencjonalne podłoża czopków, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy.
Oprócz preparatów opisanych powyżej białka można również wytwarzać w postaci preparatów o przedłużonym uwalnianiu. Takie długodziałające preparaty można podawać przez wszczepienie (na przykład podskórne lub domięśniowe) lub wstrzyknięcie domięśniowe. I tak na przykład białka można wytwarzać w postaci preparatu z odpowiednimi substancjami polimerowymi lub hydrofobowymi (na przykład w postaci emulsji w dopuszczalnym oleju) lub żywicami jonowymiennymi, lub jako pochodne słabo rozpuszczalne, na przykład w postaci słabo rozpuszczalnej soli.
Zamiast tego można stosować inne farmaceutyczne systemy podawania. Przykładami dobrze znanych nośników do podawania leków są liposomy i emulsje, które można stosować do podawania antygenu. Można również stosować pewne rozpuszczalniki organiczne, takie jak dimetylosulfotlenek, jakkolwiek zazwyczaj kosztem większej toksyczności. Białka fuzyjne można również zamykać w mikrosferach (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5407609, 5853763, 5814344 i 5820883). Dodatkowo można podawać białka stosując system o przedłużonym uwalnianiu, taki jak półprzepuszczalne macierze stałych polimerów, zawierające lek lub szczepionkę. Znane są różne substancje do wytwarzania preparatów o przedłużonym uwalnianiu. Kapsułki o przedłużonym uwalnianiu mogą, w zależności od swej natury chemicznej, uwalniać białka przez czas od kilku tygodni do ponad 100 dni. W zależności od natury chemicznej i stabilności biologicznej odczynnika, można stosować inne sposoby stabilizacji białka.
Dobór ilości białka fuzyjnego skutecznej do wywoływania reakcji immunologicznej u pacjenta mieści się w kompetencjach specjalisty, zwłaszcza w świetle niniejszego szczegółowego ujawnienia wynalazku.
Skuteczną dawkę można określić wstępnie na podstawie testów in vitro. Na przykład, można wytwarzać dawkę w modelach zwierzęcych w celu osiągnięcia indukcji reakcji immunologicznej z zastosowaniem sposobów znanych ze stanu techniki. Specjalista łatwo zoptymalizuje zastosowanie u ludzi w zależności od danych z badań na zwierzętach. Dawki i odstęp między nimi można ustalać indywidualnie. Na przykład przy stosowaniu jako szczepionki polipeptydy i polinukleotydy według niniejszego wynalazku można podawać w około 1-3 dawkach przez czas od 1 do 36 tygodni. Korzystnie, podaje się 3 dawki w odstępach około 3-4 miesięcy, po czym okresowo podaje się dawkę przypominającą. Dla niektórych pacjentów odpowiednie mogą być inne schematy podawania. Korzystna dawka jest to taka ilość polipeptydu lub DNA, która, po podaniu w wyżej opisany sposób, jest zdolna do wywołania reakcji immunologicznej u uodpornionego pacjenta, wystarczającej do zabezpieczenia pacjenta przed zakażeniem M. tuberculosis przez co najmniej 1-2 lata. Ogólnie, ilość polipeptydu obecnego w dawce (lub wytworzonego in situ przez DNA zawarte w dawce) wynosi od około 1 pg do około 100 mg na kg masy ciała gospodarza, typowo od około 10 pg do około 1 mg, i korzystnie od około 100 pg do około 1 μg. Korzystny zakres dawek będzie zależał od masy i wzrostu pacjenta, typowo będzie jednak wynosił od 0,1 ml do około 5 ml.
Zastosowanie diagnostyczne białka fuzyjnego
Polipeptydy fuzyjne według niniejszego wynalazku są korzystne w rozpoznawaniu zakażenia gruźlicą in vitro i in vivo. Zdolność polipeptydu według niniejszego wynalazku do indukowania proliferacji lub wytwarzania cytokin można badać sposobami opisanymi powyżej.
Według innego aspektu niniejszy wynalazek umożliwia zastosowanie jednego lub więcej polipeptydów fuzyjnych do rozpoznawania gruźlicy przy zastosowaniu testu skórnego in vivo. W rozumieniu niniejszego opisu, „test skórny jest to dowolny test przeprowadzany bezpośrednio na pacjencie, u którego mierzy się reakcję nadwrażliwości typu późnego (DTH) (taką jak obrzęk, zaczerwienienie lub zapalenie skóry) po śródskórnym wstrzyknięciu jednego lub więcej polipeptydów, jak to opisano poPL 209 260 B1 wyżej. Takie wstrzyknięcie można wykonać stosując dowolny odpowiedni przyrząd, wystarczający do zetknięcia polipeptydu z komórkami skóry pacjenta, taki jak na przykład strzykawka tuberkulinowa lub strzykawka 1 ml.
Jest pożądanym, aby, reakcję mierzyć w co najmniej 48 godzin po wstrzyknięciu, a nawet po upływie od około 48 do około 72 godzin po wstrzyknięciu.
Reakcja DTH jest reakcją immunologiczną typu komórkowego, ostrzejszą u pacjentów eksponowanych uprzednio na antygen testowy (to znaczy, na immunogenną część zastosowanego polipeptydu lub jego odmiany). Reakcję można mierzyć wzrokowo, tak jak z wykorzystaniem linijki. Ogólnie, reakcję o średnicy ponad około 0,5 cm, korzystnie, ponad około 1,0 cm, uważa się za dodatnią, wskazującą na zakażenie gruźlicą, które może manifestować się, lub nie, jako czynna choroba.
Jest pożądanym, by polipeptydy fuzyjne według niniejszego wynalazku wytwarzać z przeznaczeniem do zastosowania jako test i skórny, w postaci kompozycji farmaceutycznych, zawierających polipeptyd i fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Kompozycje takie typowo zawierają jeden lub więcej powyższych polipeptydów w ilości od około 1 μg do około 100 μg, korzystnie od około 10 μg do około 50 μg w objętości 0,1 ml. Korzystnie, nośnik stosowany w takich kompozycjach farmaceutycznych stanowi roztwór soli fizjologicznej z odpowiednimi środkami konserwującymi, takimi jak fenol i/lub Tween 80™.
Zgodnie z kolejnym aspektem niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania polipeptydów do rozpoznawania gruźlicy. Zgodnie z powyższym dostarcza się sposobów wykrywania zakażenia M. tuberculosis w próbce biologicznej z zastosowaniem polipeptydów fuzyjnych, samych lub w połączeniu. W rozumieniu niniejszego opisu „próbka biologiczna jest dowolną zawierającą przeciwciało próbką pobraną od pacjenta. Korzystnie, próbkę stanowi krew pełna, plwocina, surowica, osocze, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz. Korzystniej próbkę stanowi próbka krwi, surowicy lub osocza, pobrana od pacjenta lub z pojemnika z krwią. Polipeptyd(y) stosuje się w teście, jak to opisano poniżej, w celu stwierdzenia obecności lub nieobecności przeciwciał przeciwko polipeptydowi (polipeptydom) w próbce względem z góry określonej wartości odcięcia. Obecność takich przeciwciał wskazuje na uprzednie uczulenie antygenami Mycobacterium, co może wskazywać na gruźlicę.
W wykonaniach, w których stosuje się więcej niż jeden polipeptyd fuzyjny, stosowane polipeptydy są korzystnie komplementarne (to znaczy jeden składowy polipeptyd będzie miał tendencję do wykrywania zakażenia w próbkach, w których zakażenie nie zostałoby wykryte przez drugi składowy polipeptyd). Polipeptydy komplementarne można zwykle zidentyfikować poprzez zastosowanie każdego polipeptydu oddzielnie w celu oceny próbek surowicy, uzyskanych z serii pacjentów, o których wiadomo, że są zakażeni M. tuberculosis. Po określeniu, dla których próbek wynik testu jest dodatni (jak to opisano poniżej) dla każdego polipeptydu, można wytwarzać preparaty łączące dwa lub więcej polipeptydów fuzyjnych, zdolne do wykrywania zakażenia w większości, lub we wszystkich badanych próbkach. Takie polipeptydy są komplementarne. Około 25-30% surowic od osób zakażonych gruźlicą daje wynik ujemny dla przeciwciał przeciwko poszczególnym białkom. Polipeptydy komplementarne można zatem stosować w połączeniu w celu poprawy czułości testu diagnostycznego.
Istnieje wiele znanych specjalistom w dziedzinie testów stosowania jednego lub więcej polipeptydów do wykrywania przeciwciał w próbce. Zob. na przykład Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; którą to publikację włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy. W korzystnym wykonaniu test obejmuje zastosowanie polipeptydu unieruchomionego na stałym podłożu w celu związania i usunięcia przeciwciała z próbki. Związane przeciwciało można następnie wykrywać stosując odczynnik detekcyjny, zawierający grupę reporterową. Do korzystnych odczynników detekcyjnych należą przeciwciała wiążące się z kompleksem przeciwciało/polipeptyd i z wolnymi polipeptydami, wyznakowanymi grupą reporterową (na przykład w teście semikompetycyjnym). Zamiast tego można stosować test kompetycyjny, w którym przeciwciało wiążące się z polipeptydem znakuje się grupą reporterową i umożliwia się związanie go z unieruchomionym antygenem po inkubacji antygenu z próbką. Zakres hamowania wiązania wyznakowanego przeciwciała z polipeptydem przez składowe próbki wskazuje na reaktywność próbki z unieruchomionym polipeptydem.
Podłoże stałe może być dowolną substancją stałą, znaną specjalistom, do której można przytwierdzać antygen. Podłoże stałe może na przykład stanowić zagłębienie testowe w płytce do mikromiareczkowania lub błona nitrocelulozowa lub inna korzystna błona. Zamiast tego podłoże może stanowić kulka lub krążek, włókno szklane, lateks lub materiał plastyczny, taki jak polistyren lub polichlorek winylu. Podłoże może również stanowić cząstka magnetyczna lub sensor włókna optycznego, tak jak to opisano na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych 5359681.
PL 209 260 B1
Polipeptydy mogą być związane ze stałym podłożem przy zastosowaniu różnych sposobów znanych specjalistom w dziedzinie. W kontekście niniejszego wynalazku, termin „związany oznacza zarówno wiązanie niekowalencyjne, takie jak adsorpcja, jak i wiązanie kowalencyjne (które może być bezpośrednim wiązaniem między antygenem a grupami funkcyjnymi na podłożu lub może być połączeniem za pośrednictwem środka usieciowującego). Korzystne jest wiązanie poprzez adsorpcję do zagłębienia w płytce do mikromiareczkowania lub do błony. W takich przypadkach adsorpcję można osiągnąć poprzez zetknięcie polipeptydu, w korzystnym buforze, z podłożem stałym przez korzystny czas. Czas kontaktu jest różny w zależności od temperatury, jednak typowo wynosi od około 1 godziny do około 1 dnia. Ogólnie, zetknięcie zagłębienia plastykowej płytki do mikromiareczkowania (na przykład polistyrenowej lub z polichlorku winylu) z polipeptydem w ilości od około 10 ng do około 1 μg, korzystnie, około 100 ng, wystarcza do związania odpowiedniej ilości antygenu.
Kowalencyjne wiązanie polipeptydu ze stałym podłożem można ogólnie osiągać poprzez najpierw poddanie reakcji podłoża z odczynnikiem dwufunkcyjnym, który będzie reagował zarówno z podłożem, jak i z grupą funkcyjną, taką jak grupa hydroksylowa lub aminowa, na polipeptydzie. Na przykład polipeptyd można wiązać z podłożami o odpowiedniej powłoce polimerowej z zastosowaniem benzochinonu lub poprzez kondensację grupy aldehydowej na podłożu z grupą aminową i aktywnym wodorem na polipeptydzie (zob. na przykład Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, str. A12-A13).
W niektórych praktycznych wykonaniach wynalazku, testem jest enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA). Test ten można przeprowadzić najpierw stykając antygen polipeptydu fuzyjnego, unieruchomiony na podłożu stałym, zwykle na zagłębieniu płytki do mikromiareczkowania, z próbką, tak, że przeciwciała przeciwko polipeptydowi w próbce pozostawia się do związania z unieruchomionym polipeptydem. Niezwiązaną próbkę usuwa się następnie z unieruchomionego polipeptydu i dodaje się odczynnik reakcyjny zdolny do wiązania unieruchomionego kompleksu przeciwciało-polipeptyd. Następnie określa się ilość odczynnika detekcyjnego, który pozostaje niezwiązany z podłożem stałym, z zastosowaniem sposobu odpowiedniego dla danego odczynnika detekcyjnego.
Bardziej szczegółowo, po unieruchomieniu polipeptydu na podłożu, jak to opisano powyżej, pozostałe miejsca wiązania białka na podłożu typowo blokuje się. Można stosować dowolny odpowiedni środek blokujący, znany specjalistom, taki jak bydlęca albumina surowicy lub Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Unieruchomiony polipeptyd inkubuje się następnie z próbką i przeciwciało pozostawia się do związania z antygenem. Próbkę można rozcieńczać odpowiednim rozcieńczalnikiem, takim jak sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem (PBS) przed inkubacją. Ogólnie, odpowiedni czas kontaktu jest to taki czas, który wystarcza do wykrycia obecności przeciwciała w próbce zakażonej M. tuberculosis. Korzystnie, czas kontaktu jest wystarczający do osiągnięcia poziomu wiązania wynoszącego co najmniej 95% poziomu osiąganego w stanie równowagi między przeciwciałem związanym i niezwiązanym. Specjalista zauważy, że czas niezbędny do osiągnięcia stanu równowagi można łatwo określić poprzez poziom wiązania, zachodzącego w danym czasie. W temperaturze pokojowej zwykle wystarcza około 30-minutowy czas inkubacji.
Niezwiązaną część próbki można następnie usuwać poprzez płukanie podłoża stałego odpowiednim buforem, na przykład PBS zawierającym 0,1% Tween 20™. Następnie do podłoża stałego można dodawać odczynnik detekcyjny. Odpowiednim odczynnikiem detekcyjnym jest dowolny związek, wiążący się z unieruchomionym kompleksem przeciwciało-polipeptyd, który można następnie wykrywać różnymi sposobami znanymi specjalistom. Korzystnie, odczynnik detekcyjny zawiera środek wiążący (na przykład białko A, białko G, lektynę lub wolny antygen) sprzężony z grupą reporterową. Do korzystnych grup reporterowych należą enzymy (na przykład peroksydaza chrzanowa), substraty, kofaktory, inhibitory, barwniki, radionuklidy, grupy luminescencyjne, grupy fluorescencyjne, biotyna i cząstki koloidalne, takie jak koloidalne złoto i selen. Sprzęganie środka wiążącego z grupą reporterową można osiągać standardowymi sposobami znanymi specjalistom. Najczęstsze środki wiążące można również nabyć w stanie sprzężonym z rozmaitymi grupami reporterowymi z wielu źródeł handlowych (na przykład Zymed Laboratories, San Francisco, CA, i Pierce, Rockford, IL).
Odczynnik detekcyjny inkubuje się następnie z unieruchomionym kompleksem przeciwciałopolipeptyd przez czas wystarczający do wykrycia związanego przeciwciała. Odpowiedni czas można zwykle określić na podstawie zaleceń producenta lub poprzez badanie poziomu wiązania, zachodzącego w danym czasie. Następnie usuwa się niezwiązany odczynnik detekcyjny i wykrywa się związany odczynnik detekcyjny z zastosowaniem grupy reporterowej. Sposób stosowany do wykrywania grupy reporterowej zależy od natury grupy reporterowej. Dla grup radioaktywnych odpowiednie są na ogół
PL 209 260 B1 zliczanie scyntylacji lub metody autoradiograficzne. Do wykrywania barwników, grup luminescencyjnych i grup fluorescencyjnych można stosować metody spektroskopowe. Biotynę można wykrywać stosując awidynę, sprzężoną z inną grupą reporterową (zwykle grupą radioaktywną lub fluorescencyjną lub z enzymem). Enzymatyczne grupy reporterowe można zwykle wykrywać poprzez dodawanie substratu (zwykle przez określony czas) i następnie analizę spektroskopową lub inną produktów reakcji.
W celu określenia obecności lub nieobecności przeciwciał przeciwko M. tuberculosis w próbce, sygnał wykryty z grupy reporterowej, która pozostaje związana z podłożem stałym, porównuje się zwykle z sygnałem odpowiadającym z góry określonej wartości odcięcia. W jednym korzystnym wykonaniu wartość odcięcia jest to średni sygnał uzyskany po inkubacji unieruchomionego antygenu z próbkami od pacjentów niezakażonych. Ogólnie, za wynik dodatni w kierunku gruźlicy uważa się taki wynik, gdy sygnał wytwarzany przez próbkę jest ponad trzy odchylenia standardowe ponad określoną wartość odcięcia. W innym korzystnym wykonaniu, wartość odcięcia określa się z zastosowaniem krzywej operacyjnej odbiorcy, stosując sposób Sackett i wsp., 1985, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., str. 106-107. Pokrótce, w tym wykonaniu wartość odcięcia można określać z wykresu par częstości wyników prawdziwie dodatnich (to znaczy, czułości) i fałszywie dodatnich (100%-swoistość), odpowiadających każdej możliwej wartości odcięcia dla wyniku testu diagnostycznego. Wartość odcięcia na wykresie, która jest najbliższa lewemu górnemu rogowi (to znaczy wartość, obejmująca największe pole) jest najdokładniejszą wartością odcięcia, i próbkę wytwarzającą sygnał wyższy od wartości odcięcia określonej tą metodą można uważać za dodatnią. Zamiast tego wartość odcięcia można przesunąć w lewo wzdłuż wykresu, w celu zminimalizowania odsetka wyników fałszywie dodatnich, lub w prawo, w celu zminimalizowania odsetka wyników fałszywie ujemnych. Ogólnie próbkę dostarczającą sygnał wyższy od wartości odcięcia, oznaczonej tą metodą, uznaje się za dodatnią w kierunku gruźlicy.
W pokrewnym wykonaniu przeprowadza się test w teście szybkiego przepływu lub test paskowy, w którym antygen jest unieruchomiony na błonie, takiej jak nitroceluloza. W teście przepływowym przeciwciała w próbce wiążą się z unieruchomionym polipeptydem w miarę przechodzenia próbki przez błonę. Następnie odczynnik detekcyjny (na przykład białko A - złoto koloidalne) wiąże się z kompleksem przeciwciało-polipeptyd, w miarę jak roztwór zawierający odczynnik detekcyjny przepływa przez błonę. Następnie można przeprowadzić wykrywanie związanego odczynnika detekcyjnego w sposób opisany powyżej. W teście paskowym jeden koniec błony, z którą związany jest polipeptyd, zanurza się w roztworze zawierającym próbkę. Próbka migruje wzdłuż błony przez region zawierający odczynnik detekcyjny i do obszaru unieruchomionego polipeptydu. Stężenie odczynnika detekcyjnego na polipeptydzie wskazuje na obecność w próbce przeciwciał skierowanych przeciwko M. tuberculosis. Typowo, stężenie odczynnika detekcyjnego w tym miejscu wytwarza wzorzec, taki jak linia, który można odczytywać wzrokowo. Nieobecność takiego wzorca wskazuje na ujemny wynik testu. Ogólnie ilość polipeptydu unieruchomionego na błonie dobiera się do wytwarzania wzorca odróżnialnego wzrokowo, gdy próbka biologiczna zawiera przeciwciała na poziomie wystarczającym do wywołania sygnału dodatniego w ELISA, jak to omówiono powyżej. Korzystnie, ilość polipeptydu unieruchomionego na błonie wynosi od 5 ng do około 1 μg, i więcej, korzystnie od około 50 ng do około 500 ng. Testy takie można typowo przeprowadzać z bardzo małą ilością (na przykład jedna kropla) surowicy lub krwi pacjenta.
Niniejszy wynalazek ilustrują zamieszczone poniżej następujące przykłady praktycznej realizacji rozwiązań według wynalazku.
P r z y k ł a d: Białka fuzyjne antygenów M. tuberculosis zachowują immunogenność poszczególnych składników
Materiał i metody
Wytwarzanie białek fuzyjnych
Sekwencje kodujące antygenów M. tuberculosis zmodyfikowano przez PCR w celu ułatwienia ich fuzji i późniejszej ekspresji białka fuzyjnego. Dokonano powielenia DNA, stosując 10 μl buforu 10X Pfu, 2 (ii 10 mM dNTP, po 2 μl każdego z primerów PCR w stężeniu 10 μΜ, 81,5 μl wody, 1,5 μl polimerazy DNA Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) i 1 μl DNA w stężeniu 70 ng^l (dla antygenu TbRa3) lub 50 ng/pl (dla antygenów 38 kD i Tb38-1). Dla antygenu TbRa3 denaturację w temperaturze 94°C prowadzono przez 2 minuty i następnie przez 40 cykli 96°C przez 15 sek. i 72°C przez 1 minutę, i wreszcie w 72°C przez 4 minuty. Dla antygenu 38 kD denaturację w 96°C prowadzono przez 2 minuty, i następnie prowadzono 40 cykli 96°C przez 30 sek., 68°C przez 15 sek. i 72°C przez 3 minuty, i na koniec 72°C przez 4 min. Dla antygenu Tb38-1, po denaturacji w temperaturze 94°C przez 2 minuty
PL 209 260 B1 prowadzono 10 cykli po 96°C przez 15 sekund, 68°C przez 15 sekund i 72°C przez 1,5 min., 30 cykli 96°C przez 15 sek., 64°C przez 15 sek. i 72°C przez 1,5, i na koniec 72°C przez 4 minuty.
Po trawieniu endonukleazą restrykcyjną w celu uzyskania pożądanych końców lepkich lub tępych dokonano ligacji polinukleotydu swoistego dla każdego polipeptydu fuzyjnego do plazmidu ekspresyjnego. Każdy powstały plazmid zawierał sekwencję kodującą poszczególnych antygenów każdego polipeptydu fuzyjnego. Stosowanymi wektorami ekspresyjnymi były pET-12b i pT7AL2ILl.
Dla kodowania jednego białka fuzyjnego (SEK NR ID: 1 i 2) (Fig. 1A i 2B) ligacji poddano trzy sekwencje kodujące dla antygenów Ra12, TbH9 i Ra35. Inne trzy sekwencje kodujące dla antygenów Erdl4, DPV i MTI poddano ligacji, aby kodowały drugie białko fuzyjne (SEK NR ID: 3 i 4) (Fig. 2). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów Tbra3, 38 kD i Tb38-1 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 5 i 6) (Fig. 3A-3D). Dwie sekwencje kodujące dla antygenów TbH9 i Tb38-1 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 7 i 8) (Fig. 4A-4D). Cztery sekwencje kodujące dla antygenów TbRa3, 38 kD, Tb38-1 i DPEP poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 9 i 10) (Fig. 5A-5J). Pięć sekwencji kodujących dla antygenów Erdl4, DPV, MTI, MSL i MTCC2 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 11 i 12) (Fig. 6A i 6B). Cztery sekwencje kodujące dla antygenów Erdl4, DPV, MTI i MSL poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 13 i 14) (Fig. 7A i 7B). Cztery sekwencje kodujące dla antygenów DPV, MTI, MSL i MTCC2 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 15 i 16) (Fig. 8A
8B). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów DPV, MTI i MSL poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 17 i 18) (Fig. 9A i 9B). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów TbH9, DPV i MTI poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 19 i 20) (Fig. 10A i 10B). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów Erdl4, DPV i MTI poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 21 i 22) (Fig. 11A i 11B). Dwie sekwencje kodujące dla antygenów TbH9 i Ra35 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 23 i 24) (Fig. 12A i 12B). Dwie sekwencje kodujące dla antygenów Ral2 i DPPO poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEK NR ID: 25 i 26) (Fig. 13A i 13B).
Białka rekombinacyjne ulegały ekspresji w E. coli z sześcioma resztami histydynowymi na części aminokońcowej z zastosowaniem wektora plazmidowego pET (pET-17b) i systemu ekspresyjnego polimerazy RNA T7 (Novagen, Madison, WI). Do ekspresji wysokiego poziomu stosowano szczep E. coli BL21 (DE3) pLysE (Novagen). Rekombinacyjne (His-Tag) białka fuzyjne oczyszczono z rozpuszczalnego nadsączu lub nierozpuszczalnego ciała wtrętowego 500 ml indukowanych IPTG hodowli poprzez chromatografię powinowactwa z zastosowaniem jednego etapu macierzy QIAexpress Ni-NTA Agarose (GjIAGEN, Chatsworth, CA) w obecności 8M mocznika. Pokrótce, 20 ml utrzymywanej przez noc hodowli nasyconej BL21, zawierającej strukturę pET, dodano do 500 ml pożywki 2xYT, zawierającej 50 μΐ/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu, hodowanej w temperaturze 37°C ze wstrząsaniem. Hodowle bakteryjne indukowano 2 mM IPTG przy OD 560 wynoszącej 0,3 i hodowano przez jeszcze 3h (OD - 1,3-1,9). Komórki zebrano z 500 ml hodowli poprzez odwirowanie i ponownie zawieszono w 20 ml buforu wiążącego (0,1 M fosforanu sodowego, pH 8,0; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) zawierającym mM PMSF i 20 μg/ml leupeptyny plus jedna tabletka całkowitego inhibitora proteazy (Boehringer Mannheim) na 25 ml. E. coli poddano lizie poprzez liofilizację i następnie krótką sonikację, następnie wirowano przy 12 k obr./min. przez 30 minut celem uzyskania granulacji ciał wtrętowych.
Ciała wtrętowe wypłukano trzykrotnie w 1% CHAPS w 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Etap ten znacznie zmniejszał zanieczyszczenie LPS. Ciało wtrętowe na koniec rozpuszczono w 20 ml buforu wiążącego, zawierającego 8 M mocznika lub 8 M mocznika dodano bezpośrednio do rozpuszczalnego nadsączu. Rekombinacyjne białka fuzyjne z resztami His-Tag zbiorczo związano z żywicą agarozową Ni-NTA (5 ml żywicy na 500 ml indukcji) poprzez kołysanie w temperaturze pokojowej przez 1 h i kompleks przepuszczono przez kolumnę. Przepływ prowadzono dwukrotnie na tej samej kolumnie i kolumnę płukano trzykrotnie 30 ml każdego z buforów płuczących (0,1 M fosforanu sodowego i 10 mM Tris-HCl, pH 6,3), zawierających również 8 M mocznika. Związane białko eluowano 30 ml 150 mM imidazolu w buforze płuczącym i zebrano frakcje 5 ml. Zebrano w pulę frakcje zawierające każde rekombinacyjne białko fuzyjne, dializowano przeciwko 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) związanego ponownie z macierzą Ni-NTA, eluowano i dializowano w 10 mM Tris-HCl (pH 7,8). Wydajność białka rekombinacyjnego waha się od 25 do 150 mg na litr indukowanej hodowli bakteryjnej z czystością ponad 98%. Przeprowadzono test rekombinacyjnych białek pod kątem zanieczyszczenia endotoksynami z zastosowaniem testu Limulus (BioWhittaker) i wykazano, że zawierały ich <10 E.U.Img.
PL 209 260 B1
Test proliferacji limfocytów T
Oczyszczone polipeptydy fuzyjne badano pod kątem zdolności do indukowania proliferacji limfocytów T w preparatach komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). PBMC od dawców, o których wiadomo było, że uzyskali wynik dodatni w teście skórnym PPD i dla których limfocytów T wykazano proliferację w reakcji na PPD i nie oczyszczone białka rozpuszczalne M. tuberculosis hodowano w RPMI 1640, uzupełnionym 10% surowicą ludzką od wielu dawców i 50 pl/ml gentamycyny. Oczyszczone polipeptydy dodano w dwóch egzemplarzach w stężeniu od 0,5 do 10 μg/ml. Po sześciu dniach hodowli w 96-zagłębieniowych płytkach o okrągłym dnie w objętości 200 pl, z każdego zagłębienia usunięto 50 pl pożywki dla oznaczenia poziomu IFN-γ, jak to opisano poniżej. Płytki poddano następnie impulsacji 1 pCi/zagłębienie trytowanej tymidyny przez kolejne 18 godzin, zebrano i oznaczono wychwyt trytu stosując gazowy licznik scyntylacyjny. Frakcje powodujące proliferacje w obu kopiach ponadtrzykrotnie przekraczającą proliferację obserwowaną w komórkach hodowanych w samej pożywce uznawano za dodatnie.
Test interferonu γ
Usunięto w warunkach jałowych śledziony myszy i wytworzono zawiesiny pojedynczych komórek w pełnej RPMI po lizie krwinek czerwonych. Posiano po 100 pl (2x10-5 komórek) na zagłębienie w 96-zagłębieniowej płaskodennej płytce do mikromiareczkowania. Hodowle pobudzano wskazanymi białkami rekombinacyjnymi przez 24 h i nadsącz testowano pod kątem IFN-γ.
Poziom IFN-γ w nadsączu analizowano poprzez sandwichową ELISA, stosując pary przeciwciał i sposoby dostępne w PharMingen. Wytworzono krzywe standardowe, stosując rekombinacyjne cytokiny mysie. Płytki ELISA (Corning) powlekano 50 pl/zagłębienie (1 pg/ml, w 0,1 M dwuwęglanowego buforu powlekającego, pH 9,6) wychwytującego cytokiny mAb (szczurzego IFN-γ skierowanego przeciwko antygenom mysim (PharMingen, nr kat. 18181D) i inkubowano przez 4 h w temperaturze pokojowej. Wytrząśnięto zawartość płytki i zablokowano PBS-0,05% Tween, 1,0% BSA (200 pl/zagłębienie) przez noc w temperaturze 4°C i przepłukano do 6X w PBS-0,1% Tween. Następnie przez 2 h w temperaturze pokojowej dodawano normy (mysie IFN-γ) i próbki nadsączu, rozcieńczonego w PBS-0,05% Tween, 0,1% BSA. Płytki przepłukano w powyższy sposób i następnie inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej ze 100 pl/zagłębienie drugiego Ab (biotynowane szczurze przeciwciało skierowane przeciwko mysiemu IFN-γ (nr kat. 18112D, PharMingen) w ilości 0,5 pg/ml, rozcieńczone w PBS-0,05% Tween, 0,1% BSA. Po przepłukaniu płytki inkubowano ze 100 pl/zagłębienie streptawidyny-HRP (Zymed) w rozcieńczeniu 1:2500 w PBS-0,05% Tween, 0,1% BSA w temperaturze pokojowej przez 1 h. Płytki przepłukano po raz ostatni i wywołano 100 pl/zagłębienie substratu TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna, Kirkegaard i Perry, Gaithersburg, MD) i reakcję zahamowywano po wywołaniu koloru stosując H2SO4, 50 pl/zagłębienie. Oznaczano absorbancję (OD) w 450 nm, stosując 570 nm jako referencyjną długość fali i określano stężenie cytokin z zastosowaniem krzywej standardowej.
Wyniki
Reakcje immunologiczne wywołane białkami trifuzyjnymi
Trzy sekwencje kodujące M. tuberculosis wprowadzono do wektora ekspresyjnego celem wytworzenia białka fuzyjnego. Antygeny, oznaczone jako Ra12, TbH9 i Ra35 wytworzono jako jedno rekombinacyjne białko fuzyjne (Fig. 1A i 1B). Antygeny Erdl4, DPV i MTI wytworzono jako drugie białko fuzyjne (Fig. 2). Oba białka fuzyjne poddano oczyszczeniu powinowactwa do zastosowania w testach in vitro i in vivo.
Oba białka fuzyjne badano pod kątem ich zdolności do pobudzania reakcji limfocytów T u sześciu osób PPD+. Przy pomiarze proliferacji limfocytów T oba białka fuzyjne wykazywały podobny wzorzec reaktywności, jak ich poszczególne składowe (Fig. 14A-14F). Podobny wynik uzyskano przy pomiarze wytwarzania IFN-γ (Fig. 15A-15F). Na przykład pacjent D160 zareagował na antygeny TbH9 i MTI oddzielnie. Pacjent D160 zareagował również na białka fuzyjne, zawierające te antygeny (Fig. 14B i 15B). Przeciwnie, u pacjenta. D160 nie obserwowano reakcji limfocytów T na inne antygeny oddzielnie. Inny pacjent, D201, który nie zareagował na antygeny Erdl4, DPV ani MTI oddzielnie, nie reagował również na białko fuzyjne zawierające te antygeny. Należy zauważyć, że gdy reakcje limfocytów T na poszczególne składowe obu białek fuzyjnych nie były szczególnie silne, białka fuzyjne stymulowały reakcje równe lub wyższe, niż reakcje pobudzane przez poszczególne antygeny w większości przypadków.
Białko trifuzyjne Ra12-TbH9-Ra35 badano również jako immunogen in vivo. W tych doświadczeniach białko fuzyjne wstrzykiwano w poduszki łap myszy celem uodpornienia. Każda grupa po trzy myszy otrzymywała białko w innym preparacie adiuwantu: SBASlc, SBAS2 (Ling i wsp., 1997, Vaccine
PL 209 260 B1
15:1562-1567), SBAS7 i Al(OH)3. Po dwóch podskórnych uodpornieniach w odstępie trzech tygodni zwierzęta tydzień potem uśmiercono i zebrano ich drenujące węzły chłonne do zastosowania jako komórki reagujące w testach proliferacji limfocytów T i wytwarzania cytokin.
Niezależnie od tego, który adiuwant stosowano do immunizacji, indukowano silną proliferację limfocytów T przeciwko TbH9 przy stosowaniu go jako pojedynczy antygen (Fig. 16A). Słabsze reakcje indukowano przeciwko Ra35 i Ra12 (Fig. 16B i 16C). Przy stosowaniu białka fuzyjnego Ra12-TbH9Ra35 jako immunogenu obserwowano reakcję podobną do reakcji przeciwko pojedynczym składowym.
Przy pomiarze wytwarzania cytokin, adiuwanty SBASlc i SBAS2 dawały podobne reakcje IFN-γ (Fig. 17) i IL-4 (Fig. 18). Jednakże połączenie SBAS7 i wodorotlenku glinu dało najsilniejszą reakcję IFN-γ i najniższy poziom wytwarzania IL-4 dla wszystkich trzech antygenów. W odniesieniu do humoralnej reakcji przeciwciał in vivo, Fig. 19A-19F ukazują, że białko fuzyjne wywoływało reakcje swoiste dla antygenu, zarówno IgGi, jak i IgG2, przy stosowaniu z dowolnym z trzech adiuwantów.
Oprócz tego myszy C57B1/6 immunizowano połączeniem dwóch struktur ekspresyjnych, z których każda zawierała sekwencję kodującą Ra12-TbH9-Ra35 (Mtb32A) lub Erdl4-DPV-MTI (Mtb39A) jako szczepionkami DNA. Uodpornione zwierzęta wykazywały znaczną ochronę przeciwko gruźlicy po późniejszej ekspozycji aerozolowej na żywe bakterie. W oparciu o te wyniki wytworzono fuzyjną strukturę sekwencji kodujących Mtb32A i Mtb39A, a produkt przez nie kodowany testowano w modelu długotrwałej ochrony na świnkach morskich. W tych badaniach świnki morskie uodparniano pojedynczym rekombinacyjnym białkiem fuzyjnym lub mieszaniną białek Mtb32A i Mtb39A w preparatach zawierających adiuwant. Fig. 20A-20C ukazują, że świnki morskie uodpornione białkiem fuzyjnym w SBAS1c lub SBAS2 były lepiej chronione przed rozwojem gruźlicy po późniejszej ekspozycji w porównaniu ze zwierzętami uodpornionymi dwoma antygenami w mieszaninie z tym samym preparatem adiuwantów. Białka fuzyjne w preparacie SBAS2 zapewniały zwierzętom najlepszą ochronę. Tak więc białka fuzyjne różnych antygenów M. tuberculosis można stosować jako immunogeny w preparatach szczepionek skuteczniejsze, niż mieszanina poszczególnych składników.
Reakcje immunologiczne wywołane białkami bifuzyjnymi
Sposobami rekombinacyjnymi wytworzono bifuzyjne białko fuzyjne, zawierające antygeny TbH-9 i Tb38-1 bez sekwencji zawiasowej. Badano zdolność białka fuzyjnego TbH9-Tb38-1 do indukowania proliferacji limfocytów T i wytwarzania IFN-γ. Stosowano PBMC od trzech dawców: u jednego dawcy wykazano uprzednio reakcję na TbH9, lecz nie na Tb38-1 (dawca 131); u innego wykazano reakcję na Tb38-1, lecz nie na TbH9 (dawca 184) i u jeszcze innego wykazano reakcję na oba antygeny (dawca 201). Wyniki tych badań wykazują funkcjonalną aktywność obu antygenów w białku fuzyjnym (Fig. 21A i 21B, 22A i 22B, i 23A i 23B).
Białko tetrafuzyjne reagowało z surowicami pacjentów z gruźlicą
Wytworzono sposobami rekombinacyjnymi białko fuzyjne, zawierające antygen TbRa3, 38KD, Tb38-1 i DPEP. Badano reaktywność tego białka tetrafuzyjnego, oznaczonego jako TbF-2 z surowicami chorych zakażonych M. tuberculosis, metodą ELISA. Wyniki tych badań (Tabela 1) dowodzą, że w białku fuzyjnym działają niezależnie wszystkie cztery antygeny.
Dla specjalisty w dziedzinie będzie zrozumiałym, że kolejność poszczególnych antygenów w każdym białku fuzyjnym można zmieniać i że można oczekiwać porównywalnej aktywności, pod warunkiem, że każdy z epitopów pozostaje funkcjonalnie dostępny. Ponadto można stosować okrojone postacie białek zawierających aktywne epitopy do tworzenia białek fuzyjnych.
PL 209 260 B1
T a b e l a 1
Reaktywność białka fuzyjnego TbF-2 z surowicą pacjentów z gruźlicą (TB) i reaktywność z surowicą prawidłową (PR)
Nr surowicy | Stan | TbF OD450 | Stan | TbF-2 OD450 | Reaktywność | ||||
Stan | 38kD | TbRa3 | Tb38-1 | DPEP | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
B931-40 | TB | 0.57 | + | 0.321 | + | - | + | - | + |
B931-41 | TB | 0.601 | + | 0.396 | + | + | + | + | - |
B931-109 | TB | 0.494 | + | 0.404 | + | + | + | ±± | - |
B931-132 | TB | 1.502 | + | 1.292 | + | + | + | + | ±± |
5004 | TB | 1.806 | + | 1.666 | + | ±± | ±± | + | - |
15004 | TB | 2.862 | + | 2.468 | + | + | + | + | - |
39004 | TB | 2.443 | + | 1.722 | + | + | + | + | - |
68004 | TB | 2.871 | + | 2.575 | + | + | + | + | - |
99004 | TB | 0.691 | + | 0.971 | + | - | ±± | + | - |
107004 | TB | 0.875 | + | 0.732 | + | - | ±± | + | - |
92004 | TB | 1.632 | + | 1.394 | + | + | ±± | ±± | - |
97004 | TB | 1.491 | + | 1.979 | + | + | ±± | - | + |
118004 | TB | 3.182 | + | 3.045 | + | + | ±± | - | - |
173004 | TB | 3.644 | + | 3.578 | + | + | + | + | - |
175004 | TB | 3.332 | + | 2.916 | + | + | + | - | - |
274004 | TB | 3.696 | + | 3.716 | + | - | + | - | + |
276004 | TB | 3.243 | + | 2.56 | + | - | - | + | - |
282004 | TB | 1.249 | + | 1.234 | + | + | - | - | - |
289004 | TB | 1.373 | + | 1.17 | + | - | + | - | - |
308004 | TB | 3.708 | + | 3.355 | + | - | - | + | - |
314004 | TB | 1.663 | + | 1.399 | + | - | - | + | - |
317004 | TB | 1.163 | + | 0.92 | + | + | - | - | - |
312004 | TB | 1.709 | + | 1.453 | + | - | + | - | - |
380004 | TB | 0.238 | - | 0.461 | + | - | ±± | - | + |
451004 | TB | 0.18 | - | 0.2 | - | - | - | - | ±± |
478004 | TB | 0.188 | - | 0.469 | + | - | - | - | ±± |
410004 | TB | 0.384 | + | 2.392 | + | ±± | - | - | + |
411004 | TB | 0.306 | + | 0.874 | + | - | + | - | + |
421004 | TB | 0.357 | + | 1.456 | + | - | + | - | + |
528004 | TB | 0.047 | - | 0.196 | - | - | - | - | + |
A6-87 | PR | 0.094 | - | 0.063 | - | - | - | - | - |
A6-88 | PR | 0.214 | - | 0.19 | - | - | - | - | - |
A6-89 | PR | 0.248 | - | 0.125 | - | - | - | - | - |
PL 209 260 B1 cd. tabeli 1
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
A6-90 | PR | 0.179 | - | 0.206 | - | - | - | - | - |
A6-91 | PR | 0.135 | - | 0.151 | - | - | - | - | - |
A6-92 | PR | 0.064 | - | 0.097 | - | - | - | - | - |
A6-93 | PR | 0.072 | - | 0.098 | - | - | - | - | - |
A6-94 | PR | 0.072 | - | 0.064 | - | - | - | - | - |
A6-95 | PR | 0.125 | - | 0.159 | - | - | - | - | - |
A6-96 | PR | 0.121 | - | 0.12 | - | - | - | - | - |
odcięta | 0.284 | 0.266 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (53)
- Zastrzeżenia patentowe1. Immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową zgodną z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową substytucję, addycję i/lub delecję.
- 2. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową zgodną z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną substytucję aminokwasową.
- 3. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową zgodną z resztami aminokwasów 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16.
- 4. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16, przy czym sekwencja ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową substytucję, addycję i/lub delecję.
- 5. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 4, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną substytucję aminokwasową.
- 6. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 5, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16.
- 7. Polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową zgodną z resztami sekwencji SEK NR ID: 16, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową substytucję, addycję i/lub delecję.
- 8. Polinukleotyd według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową zgodną z resztami 9 do 710 sekwencji SEK NR ID: 16.
- 9. Polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową zgodnie z SEK NR ID: 15 lub sekwencją kodującą ten sam produkt genowy.
- 10. Polinukleotyd według zastrz. 9, znamienny tym, że składa się z sekwencji nukleotydowej zgodnie z SEK NR ID: 15 lub z sekwencją kodującą ten sam produkt genowy.
- 11. Polinukleotyd według zastrz. 10, znamienny tym, że składa się z sekwencji nukleotydowej zgodnie z SEK NR ID: 15.
- 12. Polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 16, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na DPV, MTI i MTCC2 w teście proliferacji komórek T lub teście wytwarzania interferonu gamma.
- 13. Polinukleotyd według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugą sekewncją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 16, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd zdolny do wywołania odpoPL 209 260 B1 wiedzi immunologicznej na DPV, MTI i MTCC2 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma.
- 14. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 7 do 13.
- 15. Polipeptyd według zastrz. 14, znamienny tym, że jest w fuzji z drugim polipeptydem heterologicznym.
- 16. Kompozycja farmaceutyczna do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zakażenia M. tuberculosis, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 6.
- 17. Kompozycja farmaceutyczna do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zakażenia M. tuberculosis, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w zastrz. 14 lub 15.
- 18. Kompozycja farmaceutyczna do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zakażenia M. tuberculosis, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 7 do 13.
- 19. Wektor ekspresyjny zawierający polinukleotyd określony w jednym zastrz. 7 do 13.
- 20. Wektor ekspresyjny według zastrz. 19, znamienny tym, że jest wektorem wirusowym.
- 21. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 6 i adiuwant.
- 22. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz. 14 lub 15 i adiuwant.
- 23. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 7 do 13 i adiuwant.
- 24. Polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 6, 14 lub 15 do zastosowania w leczeniu lub w zapobieganiu zakażeniom M. Tuberculosis.
- 25. Polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 7 do 13 do zastosowania w leczeniu lub w zapobieganiu zakażeniom M. Tuberculosis.
- 26. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 6, 14 lub 15, znamienny tym, że prowadzi się rekombinowaną ekspresję polinukleotydu określonego w jednym z zastrz. 7 do 13.
- 27. Izolowana komórka gospodarza, w której zachodzi rekombinacyjna ekspresja polipeptydu określonego w zastrz. 1 do 6, 14 lub 15.
- 28. Immunogenny polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową delecję, addycję i/lub substytucję.
- 29. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 28, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 24, przy czym ta sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasowa delecję, addycję i/lub substytucję.
- 30. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 28, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasowa SEK NR ID: 24.
- 31. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 29, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 24.
- 32. Immunogenny polipeptyd, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową zgodną z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym ta sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową delecję, addycję i/lub substytucję.
- 33. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym sekwencja aminokwasowa ewentualnie zawiera jedną konserwatywną aminokwasową delecję, addycję i/lub substytucję.
- 34. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasowa zgodną z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24.
- 35. Immunogenny polipeptyd według zastrz. 33, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej zgodnej z resztami 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24.
- 36. Polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd określony w jednym z zastrz. 28 do 35.
- 37. Polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową SEK NR ID: 23 lub sekwencję kodującą ten sam lub funkcyjnie odpowiedni produkt genowy.
- 38. Polinukleotyd składający się z sekwencji nukleotydowej SEK NR ID: 23 lub sekwencji kodującej ten sam lub funkcyjnie odpowiedni produkt genowy.
- 39. Polinukleotyd składający się z sekwencji nukleotydowej SEK NR ID: 23.PL 209 260 B1
- 40. Polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, przy czym polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma.
- 41. Polinukleotyd według zastrz. 40, znamienny tym, że zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 24, przy czym polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub teście wytwarzania interferonu gamma.
- 42. Polinukleotyd zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w umiarkowanie ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej reszty 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub wytwarzania interferonu gamma.
- 43. Polinukleotyd według zastrz. 42, znamienny tym, że zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z drugą sekwencją nukleotydową, która jest komplementarna do trzeciej sekwencji nukleotydowej kodującej reszty 9 do 596 sekwencji SEK NR ID: 24, przy czym pierwsza sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej na TbH9 i TbRa35 w teście proliferacyjnym limfocytów T lub wytwarzania interferonu gamma.
- 44. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd określony w zastrz. 36 do 43.
- 45. Polipeptyd według zastrz. 44, znamienny tym, że jest w fuzji z drugim polipeptydem heterologicznym.
- 46. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz. 28 do 35, 44 lub 45.
- 47. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 36 do 43.
- 48. Wektor ekspresyjny zawierający polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 36 do 43.
- 49. Wektor ekspresyjny według zastrz. 48, znamienny tym, że jest wektorem wirusowym.
- 50. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz 28 do 35, 44 lub 45 i adiuwant.
- 51. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 36 do 43 i adiuwant.
- 52. Izolowana komórka gospodarza, w której zachodzi rekombinacyjna ekspresja polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 28 do 35, 44 lub 45.
- 53. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 28 do 35, 44 lub 45, znamienny tym, że prowadzi się rekombinowaną ekspresję polinukleotydu określonego w jednym z za-
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/056,556 US6350456B1 (en) | 1997-03-13 | 1998-04-07 | Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection |
US09/223,040 US6544522B1 (en) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL209260B1 true PL209260B1 (pl) | 2011-08-31 |
Family
ID=22834762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL386292A PL209260B1 (pl) | 1998-04-07 | 1999-04-07 | Immunogenny polipeptyd, kodujący go polinukleotyd, polipeptyd,sposób wytwarzania polipeptydu, zawierająca immunogenny polipeptyd kompozycja farmaceutyczna, zawierający polinukleotyd wektor ekspresyjny, kompozycja szczepionki oraz komórka gospodarza |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6544522B1 (pl) |
EP (2) | EP2383342A1 (pl) |
JP (1) | JP4516616B2 (pl) |
AR (2) | AR020066A1 (pl) |
CO (1) | CO5070585A1 (pl) |
CZ (1) | CZ302852B6 (pl) |
NO (1) | NO20120234L (pl) |
PL (1) | PL209260B1 (pl) |
TW (1) | TWI223001B (pl) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6290969B1 (en) * | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
US6592877B1 (en) | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
US6458366B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
US7087713B2 (en) * | 2000-02-25 | 2006-08-08 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
PL202844B1 (pl) * | 1998-04-07 | 2009-07-31 | Corixa Corp | Immunogeniczny polipeptyd, polinukleotyd, polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, wektor ekspresji, kompozycja szczepionki, polipeptyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis, polinukleotyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis i sposób wytwarzania polipeptydu |
US8143386B2 (en) * | 1999-04-07 | 2012-03-27 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
AU779846B2 (en) * | 1999-10-07 | 2005-02-17 | Corixa Corporation | Methods of using a mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of heterologous proteins |
US7009042B1 (en) * | 1999-10-07 | 2006-03-07 | Corixa Corporation | Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins |
US7311922B1 (en) | 1999-10-07 | 2007-12-25 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
SI1542732T1 (sl) * | 2000-06-20 | 2010-01-29 | Corixa Corp Csc The United Sta | Fuzijski proteini Mycobacterium tuberculosis |
US7026465B2 (en) * | 2002-02-15 | 2006-04-11 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis |
US8475735B2 (en) * | 2004-11-01 | 2013-07-02 | Uma Mahesh Babu | Disposable immunodiagnostic test system |
KR101255870B1 (ko) * | 2004-11-16 | 2013-04-17 | 아에라스 글로벌 티비 백신 파운데이션 | 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 다가 백신 |
WO2006060484A2 (en) * | 2004-12-01 | 2006-06-08 | Gene Therapy Systems, Inc. | Tuberculosis nucleic acids, polypeptides and immunogenic compositions |
ATE530569T1 (de) | 2005-07-01 | 2011-11-15 | Forsyth Dental In Ry For Children Fa | Assays zum nachweis von tuberkulose- antigenen, und impfstoffe |
WO2007041539A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Transcutaneous Technologies, Inc. | Iontophoresis apparatus and method for the diagnosis of tuberculosis |
US8708320B2 (en) | 2006-12-15 | 2014-04-29 | Air Products And Chemicals, Inc. | Splashguard and inlet diffuser for high vacuum, high flow bubbler vessel |
MX2012008790A (es) | 2010-01-27 | 2012-08-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigenos de tuberculosis modificados. |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5330754A (en) | 1992-06-29 | 1994-07-19 | Archana Kapoor | Membrane-associated immunogens of mycobacteria |
DK79793D0 (da) | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | Diagnostic test |
DK79893D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | New vaccine |
ES2313719T3 (es) | 1993-11-23 | 2009-03-01 | The Regents Of The University Of California | Productos extracelulares abundantes y procedimiento de produccion y uso de los mismos. |
ES2185762T3 (es) * | 1995-03-13 | 2003-05-01 | Secr Defence | Vacunas contra la peste. |
ES2262595T3 (es) | 1995-09-01 | 2006-12-01 | Corixa Corporation | Compuestos y metodos para la inmunoterapia y diagnostico de la tuberculosis. |
MX9801687A (es) | 1995-09-01 | 1998-11-29 | Corixa Corp | Compuestos y metodos para el diagnostico de tuberculosis. |
US6555653B2 (en) * | 1997-05-20 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use |
-
1998
- 1998-12-30 US US09/223,040 patent/US6544522B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-04-07 CZ CZ20100086A patent/CZ302852B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 EP EP10182762A patent/EP2383342A1/en not_active Withdrawn
- 1999-04-07 EP EP10182700A patent/EP2397555A1/en not_active Withdrawn
- 1999-04-07 PL PL386292A patent/PL209260B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 AR ARP990101583A patent/AR020066A1/es unknown
- 1999-04-07 CO CO99020328A patent/CO5070585A1/es unknown
- 1999-04-26 TW TW088105532A patent/TWI223001B/zh active
-
2003
- 2003-02-05 US US10/359,459 patent/US7064195B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-06-06 JP JP2008149834A patent/JP4516616B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-07-22 AR ARP080103186A patent/AR067658A2/es unknown
-
2012
- 2012-03-01 NO NO20120234A patent/NO20120234L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TWI223001B (en) | 2004-11-01 |
NO20120234L (no) | 2000-11-30 |
AR020066A1 (es) | 2002-04-10 |
US6544522B1 (en) | 2003-04-08 |
EP2383342A1 (en) | 2011-11-02 |
CO5070585A1 (es) | 2001-08-28 |
EP2397555A1 (en) | 2011-12-21 |
AR067658A2 (es) | 2009-10-21 |
JP4516616B2 (ja) | 2010-08-04 |
US20040013677A1 (en) | 2004-01-22 |
US7064195B2 (en) | 2006-06-20 |
JP2009000107A (ja) | 2009-01-08 |
CZ302852B6 (cs) | 2011-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2326598C (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
US7335369B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
JP4516616B2 (ja) | Mycobacteriumtuberculosis抗原の融合タンパク質およびその使用 | |
US8143386B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
JP4382160B2 (ja) | 結核の免疫治療および診断のための化合物および方法 | |
JP2002503683A (ja) | 結核の免疫療法および診断のための化合物および方法 | |
CA2405247A1 (en) | Tuberculosis antigens and methods of use thereof | |
US6465633B1 (en) | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis | |
ZA200005505B (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis and their uses. | |
MXPA00009803A (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis | |
US20020197265A1 (en) | Methods and compounds for the treatment of immunologically - mediated diseases of the respiratory system using mycobacterium vaccae | |
SA08290425B1 (ar) | بروتينات اندماج مولدات ضد المتفطرة السلية واستعمالاتها |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130407 |