ES2313719T3 - Productos extracelulares abundantes y procedimiento de produccion y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN VACUNAS BASADAS EN COMBINACIONES DE PRODUCTOS EXTRACELULARES ESPECIALMENTE ABUNDANTES DE PATOGENOS Y METODOS PARA SU USO Y PRODUCCION. LOS PRODUCTOS EXTRACELULARES MAS FRECUENTES O ESPECIALMENTE ABUNDANTES DE UN PATOGENO DIANA SE SELECCIONAN SIN TENER EN CUENTA SU INMUNOGENETICA MOLECULAR ABSOLUTA Y SE UTILIZAN COMO VACUNAS PARA ESTIMULAR UNA RESPUESTA INMUNE PROTECTORA EN HUESPEDES DE MAMIFEROS CONTRA INFECCION SUBSECUENTE POR EL PATOGENO DIANA. LOS PRODUCTOS EXTRACELULARES ESPECIALMENTE ABUNDANTES PUEDEN CARACTERIZARSE Y DISTINGUIRSE POR SUS RESPECTIVAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS N-TERMINALES. COMO LAS VACUNAS PUEDEN COMPRENDER DIFERENTES COMBINACIONES DE PRODUCTOS EXTRACELULARES, MEDIANTE LA PRESENTE INVENCION SE PROPORCIONAN COMPOSICIONES INMUNOTERAPEUTICAS EFICACES DE AMPLIO RANGO. ADEMAS DE OTROS AGENTES INFECCIOSOS, LAS VACUNAS ASI PRODUCIDAS PUEDEN UTILIZARSE PARA ESTIMULAR UNA RESPUESTA INMUNE EFICAZ FRENTE A PATOGENOS INTRACELULARES Y EN PARTICULAR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Description

Productos extracelulares abundantes y procedimiento de producción y uso de los mismos.

Referencia cruzada a una solicitud relacionada

La presente solicitud es una continuación parcial de la solicitud de patente estadounidense Ser. N.º 156.358 también pendiente presentada el 23 de noviembre de 1993.

Referencia a los organismos oficiales

La presente invención se ha llevado a cabo gracias a la financiación estatal en virtud de la Beca n.º A1-31338 concedida por el Departamento de Salud y Servicios Humanos. El Estado tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia en general a las vacunas y agentes inmunoterapéuticos contra organismos patógenos como bacterias, protozoos, virus y hongos. De forma específica, y al contrario que las anteriores vacunas y agentes inmunoterapéuticos basados en subunidades o productos patógenos que mostraban la mayor inmunogenicidad o la inmunogenicidad molecular más específica, la presente invención utiliza los determinantes inmunogénicos prevalentes o mayoritariamente abundantes segregados por un patógeno seleccionado, como Mycobacterium tuberculosis, para estimular una respuesta inmune eficaz en hospedadores mamíferos. Por tanto, la inmunidad adquirida y la actividad inmunoterapéutica producida gracias a la presente invención están dirigidas a los marcadores antigénicos que se manifiestan más frecuentemente en células hospedadoras afectadas durante el transcurso de una infección patógena sin considerar especialmente la inmunogenicidad relativa o absoluta del componente
administrado.

Campo de la invención

Desde hace tiempo se reconoce que los microorganismos parásitos tienen la capacidad de infectar animales, lo que provoca enfermedades y, a menudo, la muerte del hospedador. Los agentes patógenos han sido una de las principales causas de muerte a lo largo de la historia, y aún siguen ocasionando un enorme sufrimiento.

Aunque en el último siglo se han vivido unos avances gigantescos en prevención y tratamiento de muchas enfermedades infecciosas, las complicadas interacciones entre parásitos y hospedadores aún limitan la eficacia universal de las medidas terapéuticas. Las dificultades para hacer un recuento de los sofisticados mecanismos invasivos de muchos vectores patógenos quedan probadas por la reaparición de varias enfermedades como la tuberculosis, así como por la aparición de cepas de bacterias y virus resistentes a los medicamentos.

Entre estos agentes patógenos que generan mayor preocupación epidemiológica, las bacterias intracelulares han demostrado ser especialmente resistentes al tratamiento con medidas terapéuticas o profilácticas. Las bacterias intracelulares, entre las que se incluye el género Mycobacterium y el género Legionella, completan la totalidad o parte del ciclo de su vida dentro de las células del organismo hospedador infectado, en lugar de en un medio extracelular. En todo el mundo, las bacterias intracelulares son las responsables de millones de muertes cada año y de un sufrimiento incalculable. La tuberculosis, provocada por Mycobacterium tuberculosis, es la principal causa de muerte por enfermedades infecciosas en todo el mundo, con 10 millones de nuevos casos y 2,9 millones de muertes al año. Asimismo, las bacterias intracelulares son responsables de millones de casos de lepra. Otras enfermedades debilitantes transmitidas por agentes intracelulares son la leishmaniosis cutánea y visceral, tripanosomiasis americana (la enfermedad de Chagas), listeriosis, toxoplasmosis, histoplasmosis, tracoma, psitacosis, fiebre Q y legionelosis, incluida la enfermedad de los Legionarios. En estos momentos, se puede hacer relativamente poco para evitar las enfermedades debilitadoras a los individuos susceptibles expuestos a estos organismos.

Debido a esta incapacidad para proteger de forma eficaz a las poblaciones frente a la tuberculosis, y debido a la morbidad y mortandad humana inherente provocada por la tuberculosis, ésta es una de las enfermedades más importantes a las que se enfrenta la humanidad. De forma más específica, la tuberculosis pulmonar humana, provocada principalmente por M. tuberculosis, es una de las causas principales de muerte en los países en vías de desarrollo. M. tuberculosis es capaz de sobrevivir dentro de los macrófagos y los monocitos, y puede producir una infección intracelular crónica. Al ocultarse dentro de las células principalmente responsables de la detección de elementos extraños y de la activación subsiguiente del sistema inmunitario, M. tuberculosis consigue evadir relativamente las defensas normales del organismo hospedador. Estas mismas características patógenas han evitado hasta ahora el desarrollo de un agente o vacuna inmunoterapéutico eficaz contra las infecciones tuberculares. Al mismo tiempo, los bacilos tuberculosos son relativamente fáciles de cultivar y observar en un laboratorio.

Actualmente se cree que aproximadamente la mitad de la población mundial está infectada con M. tuberculosis, y eso da lugar a millones de casos anuales de tuberculosis pulmonar. Aunque esta enfermedad es un problema sanitario especialmente agudo en los países en vías de desarrollo de Latinoamérica, África y Asia, también está siendo cada vez más frecuente en el primer mundo. En los Estados Unidos hay poblaciones específicas que presentan mayores riesgos, especialmente los individuos pobres e inmunodeprimidos de las zonas urbanas y los inmigrantes procedentes de zonas en las que la enfermedad goza de mucha presencia. Debido principalmente a la epidemia del SIDA, la incidencia de la tuberculosis está aumentando actualmente en los países desarrollados, a menudo en forma de M. tuberculosis resistente a múltiples medicamentos.

Recientemente, se ha detectado la resistencia de la tuberculosis a uno o más medicamentos en 36 de los 50 estados unidos. En la ciudad de Nueva York, un tercio de todos los casos analizados en 1991 resultó resistente a uno o más medicamentos principales. Aunque la tuberculosis no resistente puede curarse con un tratamiento largo con antibióticos, la perspectiva de las cepas resistentes a los medicamentos es sombría. Los pacientes infectados con cepas resistentes a dos o más antibióticos principales tienen un índice de mortalidad de alrededor del 50%. Por consiguiente, se necesita urgentemente una vacuna segura y eficaz contra dichas variedades de M. tuberculosis.

Las infecciones iniciales de M. tuberculosis se dan casi siempre mediante inhalación de partículas aerosolizadas, ya que el patógeno puede permanecer viable durante semanas o meses en un entorno húmedo o en esputo seco. Aunque el lugar principal de la infección son los pulmones, el organismo también puede causar la infección de huesos, bazo, meninges y piel. Según sea la virulencia de la cepa correspondiente y la resistencia del hospedador, la infección y el daño correspondiente a los tejidos puede ser menor o extensivo. En caso de los humanos, la infección inicial se controla en la mayoría de los individuos expuestos a cepas virulentas de la bacteria. El desarrollo de la inmunidad adquirida tras la exposición inicial reduce la proliferación bacteriana, y así permite que las lesiones sanen, y hace que el sujeto pase a ser prácticamente asintomático, pero con posibilidad de contagio.

Cuando M. tuberculosis no está controlado por el sujeto infectado, suele provocar la degradación extensiva del tejido pulmonar. En individuos susceptibles, las lesiones se suelen formar en el pulmón, dado que el bacilo tuberculoso se reproduce dentro de los macrófagos alveolares o pulmonares. Puesto que los organismos se multiplican, puede extenderse a través del sistema linfático hasta los nódulos linfáticos distales, y a través de la sangre hasta los vértices pulmonares, la médula, los riñones y las meninges que rodean el cerebro. Fundamentalmente como resultado de las reacciones de hipersensibilidad celular, las lesiones granulomatosas o tubérculos característicos se producen en igual proporción a la gravedad de la infección. Estas lesiones consisten en células epiteloides rodeadas por monocitos, linfocitos y fibroblastos. En la mayor parte de los casos, una lesión o tubérculo puede necrosarse y queda caseificada.

Por razones prácticas y morales obvias, es inviable aplicar el trabajo inicial en humanos para determinar la eficacia de las composiciones experimentales respecto a estos trastornos. Por consiguiente, en las primeras fases del desarrollo de todo medicamento o vacuna, el proceso habitual es aplicarlo en modelos animales adecuados por razones de seguridad y costes económicos. El éxito del uso de los modelos animales de laboratorio se basa en la idea de que los epítopos inmunodominantes son frecuentemente activos en diversas especies hospedadoras. Por ello, un determinante inmunogénico en una especie, por ejemplo un roedor o un cobaya, será por lo general inmunorreactivo en diferentes especies, como en los humanos. Únicamente después de que se hayan desarrollado lo suficientemente los modelos animales adecuados, los ensayos clínicos se llevarán a cabo en humanos para demostrar la seguridad y eficacia de una vacuna en los hombres.

Respecto de las infecciones alveolares o pulmonares por M. tuberculosis, el modelo de los cobayas se asemeja enormemente a la patología humana de la enfermedad en varios aspectos. Por consiguiente, los expertos en la materia entenderán que es adecuado extrapolar el modelo de cobayas de esta enfermedad a los humanos y otros mamíferos. En lo que respecta a los humanos, las cobayas son susceptibles de padecer una infección tuberculosa con dosis bajas del patógeno humano aerosolizado M. tuberculosis. Al contrario que los humanos, cuya infección inicial suele estar controlada, los cobayas desarrollan de forma constante la enfermedad, diseminada tras su exposición al patógeno aerosolizado, lo que facilita el análisis posterior. Asimismo, tanto los cobayas como los humanos presentan reacciones de hipersensibilidad cutánea retardada caracterizada por el desarrollo de endurecimiento celular mononuclear denso o zona rígida en el lugar de la prueba cutánea. Por ultimo, las lesiones tuberculosas características de los humanos y de los cobayas presentan una morfología similar que incluye la presencia de células gigantes de Langhans. Dado que los cobayas son más susceptibles a la infección inicial y al desarrollo de la enfermedad que los humanos, toda protección aportada en los experimentos que utilizan a este modelo animal ofrece una fuerte indicación de que esa misma inmunidad protectora puede generarse en el hombre o en otros mamíferos menos susceptibles. Por ello, a efectos únicamente de la explicación, y no a efectos de limitación, la presente invención se demostrará en primer lugar en el contexto ejemplar de los cobayas como hospedador mamífero. Los expertos en la materia apreciarán que la presente invención puede aplicarse en otros hospedadores mamíferos, entre los que se incluyen los humanos y los animales domésticos.

Todo animal o humano infectado con un vector patógeno y, especialmente, un organismo intracelular presenta un reto complicado para el sistema inmunitario del hospedador. Mientras que muchos agentes infecciosos pueden controlarse de forma eficaz gracias a la respuesta humoral y a la producción correspondiente de anticuerpos protectores, dichos mecanismos son eficaces principalmente sólo contra los patógenos situados en el fluido extracelular corporal. En especial, la opsonina se une con agentes extraños extracelulares, haciéndolos susceptibles de fagocitosis y de sufrir una subsiguiente muerte intracelular. Sin embargo, este no es el caso para otros patógenos. Por ejemplo, en estudios anteriores se ha indicado que la respuesta inmune humoral no aparece para desempeñar un papel protector significativo frente a las infecciones a través de bacterias como M. tuberculosis. No obstante, la presente invención puede provocar una respuesta humoral beneficiosa para el patógeno diana y, así, su eficacia no se ve limitada a un componente específico de la respuesta inmune estimulada.

De forma más específica, parece ser que las defensas mediante anticuerpos no evitan la infección inicial de patógenos intracelulares, y no son eficaces una vez que la bacteria está secuestrada dentro de las células del hospedador. Al ser proteínas solubles en agua, los anticuerpos pueden permear en el fluido extracelular y en la sangre, pero les resulta difícil moverse a través de las membranas lípidas de las células. Asimismo, la producción de opsonina frente a las estructuras de superficie bacteriana puede de hecho ayudar a que los patógenos intracelulares penetren en la célula hospedadora. De este modo, toda medida profiláctica eficaz frente a los agentes intracelulares como Mycobacterium debería incorporar un componente de respuesta inmune agresiva mediante células que provoque una rápida proliferación de linfocitos específicos para el antígeno que active los fagocitos afectados o los elimine de forma citotóxica. Sin embargo, tal y como se tratará más adelante, la inducción de una respuesta inmune celular no equivale a la inducción de una inmunidad protectora. Aunque la inmunidad celular puede ser un requisito previo para la inmunidad protectora, la producción de vacunas conforme a la doctrina que se desprende de esta invención requiere unas pruebas de tolerancia con animales.

Esta respuesta inmune celular suele constar de dos fases. La fase inicial señala que la célula está infectada, y la llevan a cabo unas moléculas especiales (de histocompatibilidad o moléculas MHC) que segregan fragmentos del patógeno a la superficie de la célula. Estas moléculas MHC se unen a pequeños fragmentos de proteínas bacterianas que se han degradado dentro de la célula afectada y las presenta en la superficie de la célula. Su presentación a las células T estimula el sistema inmunitario del hospedador para eliminar la célula hospedadora infectada o induce a la célula hospedadora para que erradique a toda bacteria que resida en su interior.

Al contrario que las bacterias más infecciosas, Mycobacterium, entre la que se incluye M. tuberculosis, tiende a proliferar en vacuolas que se aíslan sustancialmente del resto de la célula mediante una membrana. Los fagocitos forman de manera natural estas vacuolas protectoras haciéndolas especialmente susceptibles a la infección por esta clase de patógeno. En dichas vacuolas las bacterias están protegidas de la degradación de forma eficaz, lo que dificulta que el sistema inmunitario presente los componentes bacterianos integrales en la superficie de las células infectadas. No obstante, las moléculas MHC de las células infectadas se trasladarán a la vacuola y recogerán todo producto libre (liberado) bacteriano, o se trasladará a otros lugares de la célula hospedadora a donde se hayan transportado los productos bacterianos extracelulares extraños para presentarlos de forma normal en la superficie de las células. Tal y como se ha indicado anteriormente, la presentación de los productos bacterianos extraños provocará la respuesta adecuada por parte del sistema inmunitario del hospedador.

Los problemas que los patógenos intracelulares suponen para el sistema inmunitario también constituyen un reto especial para el desarrollo de la vacuna. Hasta hoy, a la mayoría de los investigadores se les ha escapado la producción de una vacuna eficaz contra las infecciones de Mycobacterium y, en especial, contra M. tuberculosis. En la actualidad, la única vacuna disponible de forma extensa contra los patógenos intracelulares es la vacuna viva atenuada BCG, una cepa no virulenta de M. bovis que se utiliza como una medida profiláctica contra el bacilo tuberculoso. Así, en 1988, unos estudios de la Organización Mundial de la Salud en India determinaron que la eficacia de las mejores vacunas BCG era tan leve que se consideraba imperceptible. A pesar de esta eficacia cuestionable, la vacuna BCG se ha utilizado extensamente en zonas de alta incidencia de tuberculosis en todo el mundo. Para complicar el asunto aún más, los individuos que han sido vacunados con la BCG suelen desarrollar una sensibilidad a la tuberculina que niega la utilidad de la prueba cutánea más común para la detección y control de la tuberculosis.

Otro problema grave que afecta al uso de la vacuna viva atenuada como la BCG es la posibilidad de iniciar una enfermedad con riesgo de muerte en pacientes con deficiencias inmunitarias. Estas vacunas suponen un riesgo especial para las personas con inmunidad celular deprimida debido a su capacidad disminuida para luchar contra una infección inducida de proliferación rápida. Entre dichos individuos se encuentran los debilitados por malnutrición y por unas condiciones de vida inferiores, los receptores de órganos transplantados y las personas afectadas con el VIH. En caso de la vacuna BCG, los individuos con alto riesgo también son aquellos con trastornos pulmonares como enfisema, bronquitis crónica, neumoconiosis, silicosis o tuberculosis previa. Así, el uso de las vacunas atenuadas está limitado dentro la población con el mayor beneficio potencial.

El uso de vacunas vivas atenuadas también puede producir otros efectos secundarios no deseados. Dado que las vacunas vivas se reproducen en el receptor, provocan una gama más amplia de anticuerpos y una respuesta inmune celular menos dirigida que las vacunas no infecciosas. A menudo este método forzoso tiende a ocluir la respuesta inmune dirigida a las estructuras moleculares más afectadas en la profilaxis celular. Además, el uso de las vacunas vivas con una membrana intacta induce la opsonina, que prepara un cuerpo extraño para la fagocitosis eficaz. De este modo, tras la exposición a las cepas virulentas del organismo diana, la presencia de dichos anticuerpos podría aumentar de hecho la captación de patógenos no atenuados en las células hospedadoras, donde podrán sobrevivir y multiplicarse. Asimismo, una vacuna atenuada contiene miles de especies moleculares distintas, y, por tanto, es más probable que contenga una especie molecular que resulte tóxica o que pueda provocar una respuesta inmune adversa en el paciente. Otros problemas con las vacunas vivas son la reversión de la virulencia, el contagio natural por contacto, los virus contaminantes y la interferencia viral y la dificultad para su normalización.

De forma similar, las vacunas no infecciosas, como los organismos muertos o vacunas convencionales de subunidades de segunda generación dirigidas a estructuras unidas a membrana fuertemente antigénicas, están limitadas en lo que respecta a la inhibición de las bacterias intracelulares. Al igual que las vacunas atenuadas, las bacterias muertas provocan una respuesta indiscriminada que puede inhibir los determinantes profilácticos más eficaces. De este modo, las vacunas muertas aún presentan grandes números de estructuras potencialmente antigénicas al sistema inmunitario, aumentando la posibilidad de reacciones tóxicas u opsonización por parte del sistema inmunitario. Las vacunas tradicionales de subunidades incorporan unas estructuras de membrana, ya sean sintéticas o purificadas, pueden inducir un efecto opsónico que facilite el acceso del patógeno intracelular a los fagocitos, dentro de los que se multiplican. Mediante el aumento del índice de la inclusión bacteriana, las vacunas muertas dirigidas a los antígenos de superficie intracelulares pueden aumentar la virulencia relativa del agente patógeno. Así, las vacunas convencionales atenuadas o muertas dirigidas contra los componentes de superficie bacteriana fuertemente antigénicos pueden estar contraindicadas en caso de patógenos intracelulares.

Para sortear los problemas relacionados con el uso de las vacunas tradicionales, se han desarrollado alternativas con proteínas extracelulares o sus análogos inmunogénicos para estimular inmunidad protectora contra patógenos intracelulares específicos. Por ejemplo, esta Patente de inventor estadounidense N.º 5.108.745, emitida el 28 de abril de 1992, revela vacunas y métodos de producción de inmunidad protectora contra Legionella pneumophila y M. tuberculosis, así como contra otros patógenos intracelulares. Estas vacunas según la técnica anterior se basan fundamentalmente en productos extracelulares derivados originalmente de componentes proteináceos segregados de forma extracelular por bacterias patógenas en un caldo de cultivo in vitro y segregados de forma extracelular por bacterias dentro de células hospedadoras infectadas in vivo. Tal y como se ha revelado en este documento, dichas vacunas se basan de forma selectiva en la identificación de productos extracelulares o sus análogos, que estimulan una respuesta inmune fuerte contra el patógeno diana en hospedadores mamíferos.

De forma más específica, estas proteínas extracelulares candidatas de la técnica anterior se examinaron mediante la determinación de su capacidad para provocar ya sea una fuerte respuesta proliferativa de linfocitos, ya sea una respuesta de hipersensibilidad cutánea retardada en mamíferos que eran inmunes al patógeno de interés. Aunque este método y las vacunas asociadas evitan muchos de los inconvenientes inherentes al uso de las vacunas tradicionales, los resultados conflictivos de respuesta inmunológica debidos a la reactividad cruzada y la variación del hospedador puede complicar la selección de los agentes inmunizadores eficaces. Así, mientras la inmunogenicidad molecular es una indicación de una vacuna eficaz, otros factores pueden complicar su utilización a la hora de causar una respuesta inmune eficaz in vivo.

Más importante aún, se descubrió de forma sorprendente que, especialmente en lo que respecta a M. tuberculosis, los métodos de la técnica anterior para identificar las vacunas de inducción de inmunidad protectora eficaz eran engorrosos y potencialmente ineficaces. Por ejemplo, los análisis SDS-PAGE masivos de la proteína extracelular M. Tuberculosis proseguidos por las técnicas Western Blot convencionales con el objetivo de identificar los más inmunogénicos de estos componentes extracelulares produjeron unos resultados nada coherentes. Las pruebas repetidas no consiguieron identificar qué producto extracelular produciría la mayor respuesta inmunogénica y, de forma coherente con la creencia de la técnica anterior, de este modo, funcionaría como la vacuna más eficaz. Muchos de los productos extracelulares de M. tuberculosis son bien conocidos entre los expertos en la materia, han sido identificados y, en ciertos casos, secuenciados. Además, como toda proteína extraña, puede demostrarse que estos componentes conocidos inducen una respuesta inmune. No obstante, nada de esta técnica indica directamente que alguno de estos componentes conocidos inducen una inmunidad protectora, tal y como se ha identificado de forma tradicional.

Por consiguiente, un objeto principal de la presente invención es facilitar vacunas o agentes inmunoterapéuticos y métodos para su producción y uso para provocar una respuesta inmune eficaz contra M. tuberculosis.

Otro objetivo de la presente invención es facilitar vacunas o agentes inmunoterapéuticos y métodos para su uso y para transmitir una inmunidad adquirida en un hospedador mamífero contra M. tuberculosis.

Un objetivo adicional de la presente invención es facilitar vacunas de fácil producción y agentes inmunoterapéuticos que presenten una toxicidad reducida relativa a las vacunas muertas o atenuadas.

Campo de la invención

La presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, cumple con lo mencionado anteriormente y con otros objetivos aportando componentes para su uso como vacunas y/o agentes inmunoterapéuticos y métodos para su producción para generar respuestas inmunes protectoras o terapéuticas en hospedadores mamíferos contra la infección por patógenos. En un aspecto amplio, la invención aporta los medios para inducir una respuesta inmune protectora o terapéutica contra vectores infecciosos que producen componentes extracelulares. Mientras los componentes de la presente invención son especialmente eficaces contra las bacterias patógenas, pueden utilizarse para generar una respuesta inmune protectora o terapéutica frente a cualquier patógeno que produzca productos extracelulares mayoritariamente abundantes.

A efectos de la presente invención, el término "mayoritariamente abundante" debería entenderse como un término relativo que identifica aquellos productos extracelulares liberados en la mayor de las cantidades por el patógeno de interés. Por ejemplo, respecto de M. tuberculosis crecido en diversas condiciones de cultivo a una densidad óptica de aproximadamente 0,5, cualquier experto en la materia debería esperar obtener alrededor de 10 \mug/L o más de un producto extracelular mayoritariamente abundante. Así, del ejemplo total de 4 mg/L de rendimiento total de producto extracelular para M. tuberculosis crecido en condiciones normales o de choque térmico, aproximadamente entre quince y veinte (solos o en combinación) de unos cien productos extracelulares conocidos constituirán aproximadamente el noventa por ciento de la cantidad total. Estos son los productos extracelulares mayoritariamente abundantes que se han incluido en el alcance de la presente invención y son rápidamente identificables como las bandas anchas que aparecen en los geles de SDS/PAGE. Además, los productos extracelulares de interés pueden caracterizarse y diferenciarse por secuencias de aminoácidos. Los productos extracelulares restantes son menores. Los expertos en la materia también apreciarán que la abundancia cuantitativa relativa de los productos extracelulares principales específicos puede variar en función de las condiciones de cultivo. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la identificación de un producto extracelular mayoritariamente abundante individual no variará.

Por consiguiente, la presente invención puede utilizarse para proteger a un hospedador mamífero contra las infecciones por los patógenos virales, bacterianos, fúngicos o protozoarios. Debería destacarse que en algunos casos, como en las infecciones virales, los productos extracelulares mayoritariamente abundantes pueden generarlos la célula hospedadora infectada. Mientras son activas frente a todos los microorganismos que segregan productos extracelulares mayoritariamente abundantes, las vacunas y métodos de la presente invención son especialmente eficaces a la hora de generar inmunidad protectora frente a los patógenos intracelulares, entre los que se incluyen varias especies y serogrupos del género Mycobacterium. Las vacunas de la presente invención también son eficaces como agentes inmunoterapéuticos para el tratamiento de las condiciones de enfermedad existentes.

Sorprendentemente, este inventor ha encontrado que la inmunización con los productos más o mayoritariamente abundantes segregados extracelularmente por los patógenos bacterianos o sus análogos inmunogénicos puede provocar una respuesta inmune eficaz independientemente de la inmunogenicidad absoluta del componente administrado. Debido a su liberación por parte del organismo y de ahí su capacidad para hospedar moléculas afectadas en el proceso y presentación del antígeno, y debido a su alta concentración natural en tejidos durante la infección, los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de un agente patógeno se procesan y presentan al sistema inmune del hospedador más a menudo que otros componentes bacterianos. En caso de los patógenos intracelulares, los productos extracelulares mayoritariamente abundantes son los determinantes inmunogénicos principales presentados en la superficie de las células hospedadoras afectadas y, por tanto, muestran una mayor presencia en el entorno de su alrededor. Por consiguiente, la inmunidad adquirida contra los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de un organismo patógeno permite que el sistema de defensa del hospedador detecte con rapidez los patógenos secuestrados en el interior de las células hospedadoras y los inhiba de forma eficaz.

Más especialmente, los productos principales o mayoritariamente abundantes liberados por las bacterias patógenas parecen ser procesados por fagocitos y otros mecanismos del sistema inmunitario hospedador a un índice mayor que los componentes patógenos de membrana o menos frecuentes, con independencia de su respectiva actividad inmunogénica o especificidad. Esta disparidad de inmunoprocesamiento es especialmente significativa cuando el agente patógeno es una bacteria intracelular secuestrada de la actividad inmune normal. En virtud de su presentación intensa y continua al sistema inmunitario infectado del hospedador, los productos extracelulares bacterianos más frecuentes o sus análogos inmunogénicos provocan una respuesta inmunitaria vigorosa independientemente de sus características inmunogénicas moleculares individuales.

Los productos extracelulares mayoritariamente abundantes son los constituyentes principales de las proteínas y otras entidades moleculares que segrega el patógeno diana en el entorno de su alrededor. La investigación actual indica que en algunas instancias, un producto extracelular mayoritariamente abundante puede constar de hasta un 40% del peso de los productos segregados por un microorganismo. Más a menudo, los productos extracelulares mayoritariamente abundantes individuales se encuentran entre el 0,5% y el 25% de los productos totales liberados por el patógeno infeccioso. Además, los cinco o seis productos extracelulares mayoritariamente abundantes más destacados pueden conformar entre el 60% y el 70% de la masa total segregada por un microorganismo. Por supuesto, los expertos en la materia apreciarán que los niveles relativos de productos extracelulares pueden fluctuar con el tiempo, igual que los productos de cantidad absoluta o relativa segregados. Por ejemplo, el pH, los oxidantes, la osmolalidad, el calor y otras condiciones de tensión del organismo, la fase del ciclo de vida, el estado de reproducción y la composición del entorno que lo rodea pueden alterar la composición y cantidad de productos segregados. Asimismo, los niveles absolutos y relativos de los productos extracelulares pueden diferir enormemente entre una especie y otra, e incluso entre cepas de la misma especie.

En caso de los patógenos intracelulares, los productos extracelulares parecen expandir la población de los linfocitos específicamente inmunes capaces de detectar y ejercer un efecto antimicrobiano contra los macrófagos que contienen bacterias vivas. De igual modo, en virtud de su aparición repetida en la superficie de las células infectadas, los productos extracelulares principales o mayoritariamente abundantes funcionan como marcadores antigénicos eficaces. Por consiguiente, conforme a la doctrina de la presente invención, la vacuna y la inducción de la inmunidad protectora dirigida a los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de una bacteria patógena o sus determinantes inmunogenéticamente equivalentes mueve al sistema inmunitario a crear una respuesta inmunitaria eficaz y rápida con un fuerte componente celular cuando resulta infectado subsiguientemente por el patógeno diana.

En contraste directo con las actividades de inmunización de la técnica anterior que se han centrado principalmente en la producción de vacunas y en la estimulación de respuestas inmunes basadas en la antigenicidad molecular altamente específica de los componentes patógenos individuales examinados, la presente invención explota de forma ventajosa la abundancia relativa de productos extracelulares bacterianos o sus análogos inmunogénicos (más que sus especificidades inmunogénicas) para establecer o inducir una inmunidad protectora con componentes que pueden exhibir en realidad una especificidad inmunogénica menor que otros productos extracelulares menos abundantes. A los efectos de esta declaración, un análogo inmunogénico es toda molécula o compuesto suficientemente análogo a al menos un producto extracelular mayoritariamente abundante expresado por un patógeno diana, o una fracción del mismo, como para tener la capacidad de estimular una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero tras la subsiguiente infección por el patógeno diana. En pocas palabras, las vacunas de la presente invención están identificadas o producidas mediante la selección del producto o productos mayoritariamente abundantes liberados extracelularmente por un patógeno específico (o análogos moleculares capaces de estimular una respuesta inmune sustancialmente equivalente) y aislándolos en una forma relativamente pura. La respuesta inmune profiláctica deseada para el patógeno diana puede conseguirse formulando uno o más de los productos inmunorreactivos aislados mediante técnicas bien conocidas en este sector y mediante inmunización de un hospedador mamífero antes de la infección por el patógeno diana.

Se espera que la presente invención consistirá en al menos uno, dos o quizás varios determinantes inmunogénicos bien definidos. Como resultado, la presente invención produce unas vacunas normalizadas y coherentes que pueden desarrollarse, probarse y administrarse con rapidez y facilidad relativas. Así, el uso de unas cuantas moléculas bien definidas correspondientes con los productos extracelulares o de secreción más abundantes reduce enormemente el riesgo de efectos secundarios adversos asociados con las vacunas convencionales, y elimina la posible oclusión de los marcadores inmunogénicos eficaces. De forma similar, dado que la presente invención no es una vacuna muerta o atenuada, el riesgo de infección durante la producción, purificación o tras su administración queda eliminado de forma efectiva. Así, las vacunas de la presente invención pueden administrarse de forma segura a los individuos con deficiencias inmunitarias, entre los que se encuentran los pacientes con tuberculosis asintomática y los infectados con el VIH. Además, dado que la respuesta inmune humoral se dirige exclusivamente a los productos liberados por el patógeno diana, hay muy pocas posibilidades de generar un componente inmune opsónico perjudicial. Por consiguiente, la presente invención permite que la respuesta humoral estimulada ayude a la eliminación del patógeno diana de las zonas susceptibles de los anticuerpos.

Otro aspecto beneficioso de la presente invención es la facilidad con la que las vacunas pueden producirse y recogerse, y purificarse posteriormente. Por ejemplo, los productos extracelulares predominantemente abundantes pueden obtenerse de los cultivos de M. tuberculosis sin demasiado esfuerzo. Dado que los componentes deseados se liberan al medio durante su crecimiento, pueden separarse rápidamente de los componentes de membrana e intrabacterianos del patógeno diana mediante las técnicas convencionales. Es preferible que los constituyentes inmunorreactivos deseados de las vacunas de la presente invención puedan producirse y purificarse a partir de organismos modificados genéticamente en los que se hayan clonado los genes que expresan los productos extracelulares específicos de M. tuberculosis. Como ya se conoce entre los expertos en la materia, dichos organismos modificados genéticamente pueden modificarse para producir unos niveles más altos de los productos extracelulares seleccionados o de sus análogos inmunogénicos modificados. De forma alternativa, los productos inmunoprotectores, fracciones de los mismos o análogos de los mismos, pueden sintetizarse químicamente mediante técnicas bien conocidas en este sector. Sea cual sea la técnica empleada, los componentes inmunogénicos de los productos extracelulares predominantes o mayoritariamente abundantes pueden separarse y a continuación formularse en vacunas suministrables mediante unos procesos bioquímicos comunes como el fraccionamiento, la cromatografía u otros métodos de purificación y técnicas de formulación convencionales.

Por ejemplo, en un modelo de ejemplo de la presente invención, el patógeno diana es M. tuberculosis, y los productos mayoritariamente abundantes liberados de manera extracelular por M. tuberculosis en el caldo de cultivo se separan de otros componentes bacterianos y se utilizan para provocar una respuesta inmune en hospedadores mamíferos. Las proteínas individuales o grupos de proteínas se utilizan entonces en los experimentos de prueba con animales para identificar aquellas que inducen la inmunidad protectora haciéndolas aptas para su uso como vacunas conforme a la doctrina de la presente invención. De forma más específica, tras el crecimiento y captación de las bacterias en virtud de su abundancia física, los productos extracelulares principales se separan de los intrabacterianos y otros componentes mediante centrifugación y filtrado. Si se desea, el filtrado masivo resultante se somete a fraccionación mediante precipitación de sulfato de amonio con la consiguiente diálisis para obtener una mezcla de productos extracelulares, denominados comúnmente PE. Los productos extracelulares solubilizados en las fracciones dializadas se purifican para su homogeneidad sustancial mediante técnicas cromatográficas adecuadas, tal y como se conoce entre los expertos en la materia, y esto se describe mejor más adelante.

Estos procesos ejemplares tienen como resultado la producción de catorce productos extracelulares principales proteináceos individuales de M. tuberculosis con unos pesos moleculares que oscilan entre los 110 kilodaltones (kDa) y los 12 kDa. Después de la purificación, cada producto extracelular mayoritariamente abundante individual muestra una banda que corresponde a su peso molecular respectivo cuando se somete a electroforesis en gel de poliacrilamida, lo que permite que los productos individuales o grupos de productos que corresponden a los productos extracelulares mayoritariamente abundantes sean identificados y preparados para su uso como vacunas conforme a la doctrina de la presente invención. Los productos extracelulares mayoritariamente abundantes purificados pueden además caracterizarse y distinguirse mediante determinación de la totalidad o parte de sus secuencias respectivas de aminoácidos a través de técnicas comunes entre los expertos en la materia. La secuencia puede facilitar información respecto de las relaciones estructurales posibles entre los productos extracelulares mayoritariamente abundantes.

Por consiguiente, la inmunización y la estimulación de la inmunidad adquirida en un sistema hospedador mamífero pueden conseguirse mediante la doctrina de la presente invención a través de una serie de inyecciones subcutáneas o intradérmicas de dichos productos extracelulares purificados a lo largo de un plazo de tiempo. Por ejemplo, la inoculación de un producto o productos extracelulares bacterianos mayoritariamente abundantes purificados en un adyuvante incompleto de Freund seguido de una segunda inoculación en el mismo adyuvante aproximadamente tres semanas después puede utilizarse para provocar una respuesta protectora tras la exposición subsiguiente al patógeno virulento. Otros protocolos de inmunización ejemplares dentro del ámbito y la doctrina de la presente invención pueden ser una serie de tres o cuatro inoculaciones de producto o productos extracelulares purificados o sus análogos en una formulación adyuvante SAF (syntax adjuvant formulation) durante un periodo de tiempo. Aunque una serie de inoculaciones puede probar, por lo general, una mayor eficacia, la administración única de un producto extracelular mayoritariamente abundante seleccionado o sus subunidades inmunogénicas o análogos pueden conferir la respuesta inmune deseada, y también se contempla como dentro del ámbito de la presente invención.

Dichos protocolos de ejemplo pueden demostrarse mediante modelos de laboratorio aceptados entre los expertos en la materia, como los cobayas. Por ejemplo, tal y como se tratará más adelante con mayor detalle, la inmunización de varios cobayas con una combinación de cinco productos extracelulares mayoritariamente abundantes (purificados a partir de M. tuberculosis, tal y como se ha tratado anteriormente) se consiguió con una serie de inmunización de tres inoculaciones de los productos bacterianos en el adyuvante SAF con la correspondiente inmunización simulada de los animales de control. Las dosis a modo de ejemplo de cada proteína se encuentran entre los 100 \mug y los 2 \mug. Tras la última vacuna, todos los animales fueron expuestos a una dosis infecciosa y potencialmente letal de M. tuberculosis aerosolizada, y fueron observados durante un largo periodo de tiempo. Los animales de control mostraban una pérdida significativa de peso en comparación con los animales inmunizados con la combinación de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis. Además, la mitad de los animales de control murieron durante el periodo de observación, mientras que ninguno de los animales inmunizados sucumbió a la tuberculosis. Las necropsias que se realizaron tras este experimento revelaron que los animales de control no inmunizados tenían más unidades formadoras de colonias (UFC) y mayor lesión correspondiente en los pulmones y en el bazo que los animales protegidos. Diecisiete combinaciones adicionales de productos extracelulares mayoritariamente abundantes proporcionaron inmunoprofilaxis cuando se probaron, demostrando así el alcance de la presente invención y la amplia gama de vacunas que pueden formularse conforme a la doctrina de la misma.

Sin embargo, debe hacerse hincapié en que la presente invención no está restringida a las combinaciones de productos extracelulares o de segregación. Por ejemplo, varios protocolos experimentales alternativos demuestran la capacidad de un único producto extracelular abundante para inducir inmunidad protectora mamífera conforme a la doctrina de la presente invención. En cada experimento, los cobayas fueron inmunizados con un único producto extracelular mayoritariamente abundante purificado a partir de PE M. tuberculosis mediante los protocolos de cromatografía detallados en este documento. En un ejemplo, los animales fueron vacunados en múltiples experimentos con una composición de adyuvante que contiene un producto de segregación purificado abundante con un peso molecular correspondiente a 30 kDa. En otro ejemplo de la presente invención, se vacunó a distintos cobayas con una composición adyuvante que contenía un producto extracelular abundante aislado a partir de M. tuberculosis con un peso molecular correspondiente a 71 kDa. Tras sus respectivas inmunizaciones, ambos grupos de animales y los controles adecuados se expusieron a dosis letales de M. tuberculosis aerosolizados para determinar la eficacia de la vacuna.

Más especialmente, en un experimento, seis cobayas fueron inmunizados con 100 \mug de proteína de 30 kDa en SAF en tres ocasiones durante un periodo de seis semanas. Los animales de control fueron vacunados simultáneamente con cantidades correspondientes de una preparación masiva de proteínas extracelulares (PE) o solución tampón. Tres semanas después de la vacuna final, se expuso a los animales a una dosis letal de M. tuberculosis aerosolizada, y se les observó durante un periodo de 14 semanas. Los cobayas inmunizados con 30 kDa y los inmunizados con el preparado extracelular masivo tuvieron una tasa de supervivencia del 67% y del 50%, respectivamente (lo que ilustra el rendimiento superior no esperado del producto extracelular mayoritariamente abundante frente a PE), mientras que los animales sometidos a inmunización simulada tuvieron una tasa de supervivencia de sólo el 17%. Una vez terminado el experimento, los animales fueron sacrificados, y se les examinó para buscar el bacilo tuberculoso viable. Inesperadamente, los animales no inmunizados mostraban unas concentraciones superiores muy marcadas de M. tuberculosis en los pulmones y en el bazo.

Se llevaron a cabo unos experimentos similares con dichos animales vacunados con proteína de 71 kDa. En un experimento, seis cobayas fueron inmunizados en dos ocasiones con una composición de adyuvante SAF que contenía 100 \mug de proteína de 71 kDa durante un periodo de tres semanas. Otros animales fueron inmunizados de forma similar con un preparado masivo de proteínas extracelulares no purificadas o PE para su uso como control positivo y con solución tampón para su uso como un control negativo. Tras la exposición a las dosis letales de bacilo tuberculoso aerosolizado, el peso de los cobayas se observó durante un periodo de tiempo de 6 meses. Una vez más, los animales inmunizados con la forma purificada del producto extracelular abundante desarrollaban una inmunidad protectora respecto de M. tuberculosis virulento. Al término de dicho periodo, los animales inmunizados con solución tampón mostraron una pérdida de peso significativa en comparación con los animales inmunizados. Así, mientras los controles positivos y los animales inmunizados con 71 kDa tenían unas tasas de supervivencia del 63% y del 50% respectivamente, todos los animales no inmunizados murieron antes de finalizar el periodo de observación.

Resulta importante destacar que la formulación de la vacuna no es crítica para la presente invención, y puede ser optimizada para facilitar su administración. Las soluciones de los determinantes inmunogénicos purificados derivaban de los productos extracelulares patógenos mayoritariamente abundantes pueden administrarse solas o en combinación de cualquier forma designada para generar una respuesta inmune protectora. Las soluciones de proteínas purificadas pueden entregarse solas o formuladas con un adyuvante antes de ser administradas. Los adyuvantes ejemplares específicos utilizados en la presente invención para mejorar la actividad de los determinantes inmunogénicos seleccionados son SAF, adyuvantes que contienen Lípido A Monofosforilo, adyuvante incompleto de Freund y adyuvante completo de Freund que contiene bacterias muertas. Los adyuvantes adicionales que pueden ser útiles en la presente invención son emulsiones de aceite en agua, sales minerales (por ejemplo, aluminio), ácidos nucleicos, surfactantes de polímero en bloque y paredes celulares microbianas (péptido glicolípidos). Sin que sirva de límite al alcance de la invención, se cree que los adyuvantes pueden magnificar las respuestas inmunes debido a la lenta liberación de antígenos desde el lugar de la inyección.

Breve descripción de los diseños

La Fig. 1 es una representación de 4 geles tintados con azul de coomasie, etiquetados de 1A a 1D, que ilustran la purificación de productos extracelulares ejemplares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis tal y como se identifica por la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).

La Fig. 2 es una representación tabular que identifica los cinco aminoácidos N terminales de doce productos extracelulares ejemplares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis, y del peso molecular aparente para catorce de dichos productos.

La Fig. 3 es una representación tabular de la secuencia extendida de aminoácidos N terminales de tres productos ejemplares de segregación mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis que no se distinguían de los cinco aminoácidos N terminales mostrados en la Fig. 2.

La Fig. 4 es una comparación gráfica de la tasa de supervivencia de los cobayas inmunizados con productos de secreción ejemplares purificados de 30 kDa mayoritariamente abundantes de M. Tuberculosis frente a los controles positivos inmunizados con un preparado masivo según la técnica anterior de proteínas extracelulares y controles negativos no inmunizados tras exposición a una dosis letal aerosolizada de M. tuberculosis.

La Fig. 5 es una comparación gráfica del promedio del peso corporal de los cobayas inmunizados con producto extracelular purificado de 71 kDa mayoritariamente abundante frente a los controles positivos inmunizados con un preparado masivo según la técnica anterior de proteínas extracelulares de M. tuberculosis y controles negativos no inmunizados tras exposición a una dosis letal aerosolizada de M. tuberculosis.

La Fig. 6 es una comparación gráfica de la tasa de supervivencia de los cobayas inmunizados en la Fig. 5 con productos extracelulares purificados mayoritariamente abundantes a modo de ejemplo de 71 kDa de M. Tuberculosis frente a los controles positivos inmunizados con un preparado masivo de proteínas extracelulares según la técnica anterior de M. tuberculosis y controles negativos no inmunizados tras exposición a una dosis letal aerosolizada de M. tuberculosis.

La Fig. 7 es una comparación gráfica del promedio del peso corporal de los cobayas inmunizados con producto extracelular ejemplar mayoritariamente abundante purificado de 71 kDa y los controles negativos no inmunizados tras exposición a una dosis letal aerosolizada de M. tuberculosis en un segundo experimento separado.

Las Fig. 8A y 8B son comparaciones gráficas de respuestas proliferativas de linfocitos al producto extracelular purificado de 71 kDa mayoritariamente abundante a modo de ejemplo en sujetos humanos PPD+ (indicativo de infección con M. tuberculosis) y PPD-. La Fig. 8A es un gráfico de los valores calculados 2 días después de la incubación de linfocitos con este antígeno, mientras que la Fig. 8B es un gráfico de los valores calculados 4 días después de la incubación.

La Fig. 9 es una comparación gráfica del peso corporal medio de los cobayas inmunizados con una vacuna que consta de una combinación de productos extracelulares producidos conforme a la doctrina de la presente invención, y controles no inmunizados tras la exposición a una dosis letal aerosolizada de M. tuberculosis.

La Fig. 10 es una comparación gráfica del peso corporal medio de los cobayas inmunizados con tres dosis diferentes de una vacuna que consta de una combinación de productos extracelulares producidos conforme a la doctrina de la presente invención y controles no inmunizados tras la exposición a una dosis letal aerosolizada de M. tuberculosis.

La Fig. 11 es una comparación gráfica del peso corporal medio de los cobayas inmunizados con vacunas que constan de seis combinaciones diferentes de productos extracelulares producidos conforme a la doctrina de la presente invención, y controles no inmunizados tras la exposición a una dosis letal aerosolizada de M. tuberculosis.

Descripción detallada

La presente invención está dirigida a compuestos y métodos para su producción y uso frente a organismos patógenos como vacunas y agentes inmunoterapéuticos. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la producción y uso de productos extracelulares mayoritariamente abundantes liberados por organismos patógenos o sus análogos inmunogénicos como vacunas o agentes inmunoterapéuticos, y a los métodos asociados para la generación de inmunidad protectora en hospedadores mamíferos frente a la infección. A estos compuestos nos referiremos como vacunas a lo largo de la presente solicitud a efectos de simplicidad.

En modelos de ejemplo, ilustrativos de la doctrina de la presente invención, se distinguieron y purificaron posteriormente los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis. Los cobayas fueron inmunizados con formas purificadas de estos productos extracelulares mayoritariamente frecuentes sin determinación de la inmunogenicidad molecular específica del producto individual. Así, las inmunizaciones a modo de ejemplo se llevaron a cabo únicamente mediante productos extracelulares purificados o en combinación, y con varias dosis y vías de administración. Los expertos en la materia reconocerán que la estrategia anterior puede utilizarse con todo organismo o bacteria patógena para poner en práctica el método de la presente invención y, por consiguiente, la presente invención no está limitada específicamente a vacunas y métodos dirigidos contra M. tuberculosis.

En estos modelos de ejemplo, los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis se separaron y purificaron mediante la columna cromatográfica. Se llevó a cabo una determinación de la abundancia relativa y purificación de los productos extracelulares mediante electroforesis en gel poliacrilamida. Tras la purificación de los componentes de la vacuna, se vacunó a los cobayas con los productos extracelulares mayoritariamente abundantes solos o en combinación, y se les expuso posteriormente a M. tuberculosis. Como se tratará con más detalle, además de desarrollar las respuestas evaluables esperadas a estos productos extracelulares tras la inmunización, las vacunas de la presente invención ofrecían de forma inesperada una inmunidad eficaz en estos animales de laboratorio frente a las subsiguientes dosis letales de M. tuberculosis aerosolizado.

Aunque dichos modelos de ejemplo utilizaban formas purificadas de los productos extracelulares, los expertos en la materia apreciarán que la presente invención podrá aplicarse de forma sencilla utilizando análogos inmunogénicos producidos gracias a medios recombinantes u otras formas de síntesis química a través de técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.

Los expertos en la materia entenderán mejor la presente invención a través de los siguientes ejemplos que no pretenden establecer límite alguno y que ilustran protocolos ejemplares para la identificación, aislamiento, producción y uso de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes (solos o en combinación), como las vacunas.

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Ejemplo 1

Aislamiento y Producción de Proteínas Masivas Extracelulares (PE) a partir de Mycobacterium tuberculosis

La cepa Erdman de M. tuberculosis (ATCC 35801) se obtuvo de la American Tissue Culture Collection (Rockville, Maryland). La bacteria liofilizada se reconstituyó en un medio de cultivo Middlebrook 7H9 (Difeo Laboratories, Detroit, Michigan), y se conservó en agar Middlebrook 7H11. El agar 7H11 se preparó utilizando agar Bacto Middlebrook 7H10 (Difco), con OADC Enrichment Medium (Difco), 0,1% hidrolizado enzimático de caseína (Sigma) y glicerol, tal y como ha descrito anteriormente Cohn (Cohn, M.L., Am. Rev. Respir. Dis. 98:295-296) y se ha incorporado aquí como referencia. Tras la esterilización en autoclave, el agar se dispensó en placas de Petri bacteriológicas (100 por 15 mm), y se preparó para su enfriamiento.

M. tuberculosis se colocó en placas mediante técnicas estériles y se cultivó a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2} y 95% de aire y una humedad del 100%. Tras el cultivo en 7H11 durante 7 días, las colonias se separan de las placas, se suspendieron en caldo 7H9 hasta 10^{8} CFU/ml, y se alicuotaron en criotubos de 1,8 ml Nunc (Roskilde, Dinamarca). Cada litro del caldo se preparó mediante la rehidratación de 4,7 g de polvo Bacto Middlebrook 7H9 con 998 ml de agua destilada y 2 ml de glicerol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) antes de ajustar la mezcla a un valor de pH de 6,75 y utilizando el autoclave con el caldo durante 15 minutos a 121ºC. Las células repartidas en alícuotas se congelaron lentamente y se conservaron a -70ºC. Las células conservadas en estas condiciones siguieron siendo viables de forma indefinida y se utilizaron a medida que se necesitaban.

Los preparados de proteína extracelular (PE) masivos se obtuvieron a partir de cultivos de M. tuberculosis cultivados en caldo Middlebrook 7H9, al igual que lo anterior. Tras la reconstitución, se sometieron 150 ml de alícuotas del caldo al autoclave durante 15 minutos a 121ºC, y se prepararon en matraces Co Star aireados de 225 cm^{2} de cultivo de tejido. Las células de M. tuberculosis se almacenaron a -70ºC, tal y como se describe en el párrafo anterior, y se descongelaron y se utilizaron para inocular placas de agar 7H11. Tras el cultivo durante 7 días, las colonias se separaron de las placas, se pusieron en suspensión en unos cuantos ml de caldo 7H9 y se sonicaron en baño de agua para formar una suspensión unicelular. Las células de M. tuberculosis fueron suspendidas en 150 ml de alícuotas estériles a una densidad óptica inicial de 0,05, tal y como determina un espectrómetro modelo Perkin-Elmer Junior 35 (Norwalk, Connecticut). Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2} y 95% de aire durante 3 semanas hasta que la suspensión mostraba una densidad óptica de 0,4 a 0,5. Estos cultivos se utilizaron como sustancia concentrada para los siguientes cultivos también en caldo 7H9. Las sustancias concentradas se sonicaron en baño de agua para formar una suspensión unicelular. Las células de M. tuberculosis se diluyeron en caldo 7H9 a una densidad óptica inicial de 0,05 y se incubaron a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2} y 95% de aire durante un periodo de entre 2 semanas y media a 3 semanas hasta que la suspensión presentaba una densidad óptica de 0,4 a 0,5. El cultivo del sobrenadante se sometió a decantación y esterilización por filtración secuencialmente a través de unos filtros de 0,8 \mum y 0,2 \mum de baja absorción de proteínas (Gelman sciences Inc., Ann Arbor, Michigan). El filtrado fue concentrado aproximadamente 35 veces en un Filtron Minisette con una membrana Omega con un límite de 10 kDa y conservado a 4ºC. El análisis del preparado de proteína extracelular masivo por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) reveló una composición de proteínas con múltiples bandas. La mezcla de proteína extracelular (PE) masiva se preparó mediante obtención de corte de sulfato de amonio 40%-95% del filtrado del cultivo.

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Ejemplo 2

Purificación de Productos Extracelulares Mayoritariamente Abundantes Principales de Mycobacterium tuberculosis

Se añadió sulfato de amonio (grado I, Sigma) al filtrado de cultivo estéril del Ejemplo 1 en concentraciones que oscilaban entre 10% y 95% a 0ºC, y se agitó suavemente para fraccionar las proteínas. La suspensión se transfirió a botellas de plástico y se centrifugó en un rotor basculante a 3.000 rpm en una centrifugadora Sorvall para sedimentar el precipitado resultante. Se decantó el fluido sobrenadante y, en función del producto de interés, el fluido sobrenadante o sedimento se sometió a una nueva purificación. Cuando el producto de interés se encontraba en el fluido sobrenadante, se llevó a cabo un segundo corte de sulfato de amonio aumentando la concentración de sal respecto de la del primer corte. Tras un periodo de suave agitación, la solución se centrifugó como ya se ha descrito para hacer que el producto deseado precipitara, y el segundo fluido sobrenadante se sometió a una nueva purificación.

Tras la centrifugación, las proteínas precipitadas se resolubilizaron en el tampón frío y se dializaron ampliamente en una membrana de diálisis Spectrapor (Spectrum Medical Industries, Los Ángeles, California) con un corte de un peso molecular de entre 6.000 y 8.000 para eliminar la sal. La concentración de la proteína extracelular se determinó por un test BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois) y los componentes de fracción se determinaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones se sometieron a columnas cromatográficas para su posterior purificación.

Utilizando el esquema general detallado inmediatamente antes de este párrafo, se purificaron catorce productos extracelulares a partir de un filtrado de proteína extracelular masivo obtenido por el proceso detallado en el Ejemplo 1. El proceso exacto de la precipitación de sulfato de amonio y el protocolo de la cromatografía se detallan a continuación para cada producto extracelular aislado.

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A. Producto Extracelular de 110 kDa

1.

Un precipitado de sulfato de amonio al 50%-100% obtenido de la forma explicada anteriormente.

2.

El precipitado resolubilizado se dializó y sometió a una columna de intercambio iónico QAE o DEAE de Sepharose CL-6B en una solución tampón de columna consistente en 10% de sorbitol, 10 mM fosfato de potasio, pH 7, 5 mM de 2-mercaptoetanol y 0,2 mM de EDTA, y se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio. Las fracciones que contenían proteína de 110 kDa eluyeron a aproximadamente 550 mM de sal y se recogieron a continuación.

3.

Las fracciones recogidas se sometieron a una columna de fraccionamiento S200 Sepharose en solución tampón PBS (phosphate buffered saline o solución tampón de fosfato salino). La proteína se eluyó como una proteína de 110 kDa homogénea.

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B. Producto Extracelular de 80 kDa

1.

El corte de sulfato de amonio al 0%-25% (1 hora a 0ºC) se desechó, y el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC) se conservó tal y como se ha tratado anteriormente.

2.

Una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) se cargó con Tris 25 mM, pH a 8,7 con 1 M de NaCl y equilibrada con Tris 25 mM, pH a 8,7, 10 mM de NaCl y la muestra de la proteína se dializó contra Tris 25 mM, pH a 8,7, 10 mM de NaCl y se sometió a la columna. La columna se lavó durante la noche con la misma solución tampón. Un primer gradiente de sal de entre 10 mM y 200 mM de NaCl en Tris 25 mM, pH a 8,7 se sometió a la columna para eluir otras proteínas. Un segundo gradiente de sal (de 200 a 300 mM de NaCl) se sometió a la columna, y la proteína de 80 kDa se eluyó a aproximadamente 275 mM de NaCl.

3.

Se cargó una columna Q-Sepharose HP con Tris 25 mM, pH a 8,7, 1 m de NaCl, y se reequilibró con Tris 25 mM, pH a 8,7, 10 mM de NaCl. La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, pH a 8,7, 100 mM de NaCl y se sometió a la columna. La columna se lavó en la misma solución tampón, y a continuación se eluyó con entre 200 y 300 mM de NaCl en Tris 25 mM, pH a 8,7.

4.

Las fracciones que contenían la proteína de 80 kDa se recogieron y dializaron contra Tris 25 mM, pH a 8,7, 10 mM de NaCl, y a continuación se concentraron en un concentrador Speed-Vac a entre 1 y 2 ml. La muestra de proteína se sometió a una columna Superdex 75, y se eluyó con Tris 25 mM, pH a 8,7, 150 mM de NaCl. La proteína de 80 kDa se eluyó como una proteína homogénea.

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C. Producto Extracelular de 71 kDa

1.

Se obtuvo un precipitado de sulfato de amonio al 40%-95% según el detalle anterior, a excepción de que el producto de 17 kDa se cultivó en un caldo 7H9 a pH 7,4 y a 0% de CO_{2}, y se sometió a choque térmico a 42ºC durante 3 horas una vez a la semana. El precipitado se dializó contra la solución tampón inicial (20 mM de Hepes, 2 mM de MgAc, 25 mM de KCl, 10 mM de (NH4)_{2}SO_{4}, 0,8 mM de DL-Ditiotreitol, pH a 7,0).

2.

El precipitado resolubilizado se sometió a una columna de ATP Agarosa equilibrada con la solución tampón inicial. El efluente se recogió y se volvió a someter a la columna de ATP Agarosa. La proteína de 71 kDa se fijó a la columna.

3.

A continuación, se lavó la columna de ATP Agarosa, primero con la solución tampón inicial, después, con 1 M de KCl y, a continuación, con la solución tampón inicial.

4.

La proteína homogénea de 71 kDa se eluyó de la columna con 10 mM de ATP, y se dializó contra una solución tampón de fosfato.

\vskip1.000000\baselineskip

D. Producto Extracelular de 58 kDa

1.

Se obtuvo un precipitado de sulfato de amonio al 25%-50% de la forma explicada anteriormente.

2.

El precipitado resolubilizado se dializó y se sometió a una columna DEAE-Sepharose CL-6B o QAE-Sepharose, y se eluyó con NaCl. Las fracciones recogidas que contenían la proteína de 58 kDa se eluyeron a aproximadamente 400 mM de NaCl.

3.

Las fracciones recogidas se sometieron a continuación a una columna de fraccionamiento de tamaño Sepharose CL-6B. La proteína se eluyó a aproximadamente 670.000-700.000 Daltones.

4.

La proteína eluída se sometió a una columna de tiopropil-sepharose. La proteína homogénea de 58 kDa se eluyó a aproximadamente entre 250 y 350 mM de 2-mercaptoetanol. La proteína eluída se controló mediante SDS-PAGE, y presentó la única banda que se muestra en la Fig. 1A, Col. 2.

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E. Producto Extracelular de 45 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio al 0-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 2,5 mM, pH a 8,7 con 1 M de NaCl, y se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna. La columna se lavó durante la noche con la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de sal (entre 10 mM y 200 mM) en solución tampón Tris 25 mM, pH a 8,7. La proteína de 45 kDa se eluyó a aproximadamente 40 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna Q-Sepharose HP (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y se reequilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado usando la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó a continuación con entre 10 y 150 mM de NaCl en Tris 25 mM, pH a 8,7.

4. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 45 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de someterlas a concentración a 1 ml en un concentrador Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con Tris 25 mM, 150 mM de NaCl, pH a 8,7. El producto se eluyó como una proteína homogénea. La proteína eluída se controló mediante SDS-PAGE, y dio como resultado la única banda que se muestra en la Fig. 1B, Col. 2.

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F. Producto Extracelular (A) de 32 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio de 0%-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y a continuación se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó en Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con la subsiguiente solución tampón durante una noche.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de sal (entre 10 mM y 200 mM) en solución tampón Tris 25 mM, pH a 8,7. La proteína de 32 kDa se eluyó a aproximadamente 70 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 32 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de concentrar la muestra de proteína a 1 ml en un concentrador Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a continuación a una columna Superdex 75 equilibrada con 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH a 8,7, y se eluyó con esta solución tampón. El producto de 32 kDa se eluyó como una proteína homogénea.

4. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna Q-Sepharose HP (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y se reequilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado en la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de 100-300 mM de NaCl. Etiquetada como 32A, la proteína homogénea se eluye a aproximadamente 120 mM de NaCl, y se presenta como una única banda en la Fig. 1B, Col. 4.

\vskip1.000000\baselineskip

G. Producto Extracelular (B) de 32 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio de 0%-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y a continuación se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó en Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado en la misma solución tampón durante una noche.

c.

Se preparó un gradiente de sal preliminar de 10 mM a 200 mM de NaCl en Tris 25 mM, pH a 8,7, y se eluyeron varias proteínas. Tras el equilibrado de la columna, se preparó un segundo gradiente de sal (200 a 300 mM de NaCl). La proteína de 32 kDa se eluyó a aproximadamente 225 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna Q-Sepharose HP (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y se reequilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado en la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de 200-300 mM de NaCl en la misma solución tampón.

4. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 32 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de concentrar la muestra de proteína a 1 ml en un concentrador Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con Tris 25 mM, 150 mM NaCl, pH a 8,7, y se eluyó con la misma solución tampón. El producto de 32 kDa, etiquetado como 32B para distinguirlo de la proteína de 32 kDa separada mediante el protocolo H, se eluyó como una proteína homogénea, y se presenta como una única banda en la Fig. 1B, col. 3.

\newpage

\global\parskip0.940000\baselineskip

H. Producto Extracelular de 30 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio al 0-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y a continuación se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó en Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado en la misma solución tampón durante una noche.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de sal (entre 10 mM y 200 mM) en solución tampón Tris 25 mM, pH a 8,7. La proteína de 30 kDa se eluyó a aproximadamente 140 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 30 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de concentrar la muestra de proteína a 1 ml en un concentrador Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH a 8,7, y se eluyó con esta solución tampón. El producto de 30 kDa se eluyó como una proteína homogénea y se presenta como una única banda en la Fig. 1B, col. 5.

\vskip1.000000\baselineskip

I. Producto Extracelular de 24 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio al 0-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y a continuación se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó en Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con la subsiguiente solución tampón durante una noche.

c.

Se preparó un gradiente preliminar de sal de 10 mM a 200 mM de NaCl en Tris 25 mM, pH a 8,7, y se eluyeron varias proteínas. Tras el equilibrado de la columna, se preparó un segundo gradiente de sal (200 a 300 mM de NaCl). La proteína de 24 kDa se eluyó a aproximadamente 250 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna Q-Sepharose HP (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y se reequilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado en la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de 200-300 mM de NaCl en la misma solución tampón.

4. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 24 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de concentrar la muestra de proteína a 1 ml en un concentrador Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con Tris 25 mM, 150 mM NaCl, pH a 8,7, y se eluyó con la misma solución tampón. El producto de 24 kDa se eluyó como una proteína homogénea y se presenta como una única banda en la Fig. 1B, col. 7.

\vskip1.000000\baselineskip

J. Producto Extracelular de 23,5 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio al 0-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 con 1 M de NaCl y se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna antes del subsiguiente lavado durante la noche con la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de sal (entre 10 mM y 200 mM) en solución tampón Tris 25 mM, pH a 8,7. La proteína de 23,5 kDa se eluyó a aproximadamente 80 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna Q-Sepharose HP con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y se reequilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado en la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó a continuación con entre 100 y 300 mM de NaCl en Tris 25 mM, pH a 8,7.

d.

Se repitieron los pasos 3a a 3c.

4. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 23,5 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de concentrar la muestra de proteína a 1 ml en un concentrador Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con Tris 25 mM, 150 mM NaCl, pH a 8,7, y se eluyó con la misma solución tampón. El producto de 23,5 kDa se eluyó como una proteína homogénea. La proteína eluída se controló mediante SDS-PAGE, y dio como resultado la única banda que se muestra en la Fig. 1B, Col. 6.

\vskip1.000000\baselineskip

K. Producto Extracelular de 23 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desecharon los cortes de sulfato de amonio de 0%-25% (1 hora a 0ºC) y de 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio de 60%-95%.

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Bis-Tris 50 mM, pH a 7,0 que contenía 1 M de NaCl, y se equilibró con Bis-Tris 50 mM, 100 mM de NaCl, pH a 7,0.

b.

La muestra de proteína se dializó contra una solución tampón Bis-Tris 50 mM, pH a 7,0, 100 mM de NaCl, y se sometió a la columna antes de lavar la columna durante la noche con la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó con un gradiente linear de entre 100 a 300 mM de NaCl en Bis-Tris 50 mM, pH a 7,0.

d.

Se recogieron las fracciones que contenían la proteína de 23 kDa que se eluyeron a aproximadamente 100-150 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Las fracciones de proteína se dializaron contra Tris 25 mM, pH 8,7, 10 mM de NaCl, y se concentraron a 1-2 ml en un concentrador Savant Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con Tris 25 mM, 150 mM de NaCl, pH a 8,7. El producto se eluyó como una proteína homogénea, tal y como se muestra en la Fig. 1B, Col. 8.

\vskip1.000000\baselineskip

L. Producto Extracelular de 16 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio de 0%-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 2,5 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y a continuación se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó en Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado con la misma solución tampón durante una noche.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de sal (entre 10 mM y 200 mM) en solución tampón Tris 25 mM, pH a 8,7. La proteína de 16 kDa se eluyó a aproximadamente 50 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 16 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de concentrar la muestra de proteína a 1 ml en un concentrador Speed-Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con Tris 25 mM, 150 mM NaCl, pH a 8,7, y se eluyó con la misma solución tampón. El producto de 16 kDa se eluyó como una proteína homogénea. La proteína eluída se controló mediante SDS-PAGE, y dio como resultado la única banda que se muestra en la Fig. 1B, Col. 9.

\vskip1.000000\baselineskip

M. Producto Extracelular de 14 kDa

1. {}\hskip0,3cm a.

Se desechó un corte de sulfato de amonio de 0%-25% (1 hora a 0ºC).

b.

Se conservó el corte de sulfato de amonio al 25%-60% (durante la noche a 0ºC).

2. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna DEAE CL-6B (Pharmacia) con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y a continuación se equilibró con Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado durante la noche en la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó con un gradiente de sal (entre 10 mM y 200 mM) en solución tampón Tris 25 mM, pH a 8,7. La proteína de 14 kDa se eluyó a aproximadamente 60 mM de NaCl.

3. {}\hskip0,3cm a.

Se cargó una columna Q-Sepharose HP con Tris 25 mM, pH a 8,7 que contenía 1 M de NaCl, y se reequilibró con 25 mM de NaCl, pH a 8,7.

b.

La muestra de proteína se dializó contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7, y se sometió a una columna con el subsiguiente lavado en la misma solución tampón.

c.

La columna se eluyó a continuación con entre 10 y 150 mM de NaCl en Tris 25 mM, pH a 8,7.

d.

Se repitieron los pasos 3a a 3c.

4. {}\hskip0,3cm a.

Se recogieron las fracciones que contenían producto de 14 kDa, y se mezclaron y dializaron contra Tris 25 mM, 10 mM de NaCl, pH a 8,7 antes de concentrar la muestra de proteína a 1 ml en un concentrador Speed Vac.

b.

El concentrado se sometió a una columna Superdex 75 equilibrada con 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH a 8,7, y se eluyó con esta solución tampón. El producto de 14 kDa se eluyó como una proteína homogénea. La proteína eluída se controló mediante SDS-PAGE, y dio como resultado la única banda que se muestra en la Fig. 1C, Col. 2.

\vskip1.000000\baselineskip

N. Producto Extracelular de 12 kDa

1.

Se obtuvo un precipitado de sulfato de amonio de 0%-10% (durante la noche a 4ºC).

2.

El precipitado resolubilizado se sometió a una columna de fraccionamiento de tamaño S200 Sephacryl, eluyendo la proteína como una molécula de 12 kDa.

3.

Las fracciones de proteína se sometieron a una columna de intercambio iónico DEAE Sepharose CL-6B o QAE-Sepharose, y se eluyeron con un gradiente de NaCl, tal y como se ha descrito con anterioridad. Las fracciones que contenían dos proteínas homogéneas con pesos moleculares de aproximadamente 12 kDa se eluyeron a aproximadamente 300-350 mM de NaCl, y se recogieron posteriormente. Las proteínas se etiquetaron como 12A y 12B, y se purificaron como un doblete mostrado en la Fig. 1D, col. 2.

Tal y como se ha ilustrado en el perfil de SDS-PAGE de la Fig., 1, las proteínas extracelulares principales o mayoritariamente abundantes de M. Tuberculosis fueron purificadas a homogeneidad mediante el uso de los protocolos detallados en los Ejemplos 2A a 2N anteriores. Más especialmente, la Fig. 1 ilustra cuatro geles de acrilamida 12,5% a modo de ejemplo desarrollados utilizando SDS-PAGE y etiquetados como 1A, 1B, 1C y 1D. El estándar en el pocillo 1 de los geles 1A-1C tiene proteínas con pesos moleculares de 66, 45, 36, 29, 24, 20, y 14 kDa. En gel 1D, el estándar en el pocillo 1 contiene proteínas con pesos moleculares de 68, 45, 31, 29, 20, y 14 kDa. Los pocillos que contienen los productos extracelulares purificados respectivos muestran básicamente una banda en el peso molecular indicado de la proteína individual. Debería destacarse que en el gel 1D, la proteína de 12 kDa funciona como un doblete visible en el pocillo 2. El análisis de la secuencia muestra que la banda inferior de 12 kDa (o la banda de 12B kDa) es equivalente a la banda superior de 12 kDa (o la banda de 12A kDa), excepto en que le falta el primer 3 aminoácidos N terminal.

En la Fig. 2 se muestra un siguiente análisis de estos productos extracelulares mayoritariamente abundantes individuales de ejemplo. Más especialmente, la Fig. 2 es una compilación tabular de los datos de la secuencia N terminal obtenida a partir de dichos productos extracelulares purificados que muestran que la mayor parte de los productos aislados son de hecho distintos. Las proteínas 32A, 32B y 30 tienen todas los mismos 5 aminoácidos N terminales, por lo que fue necesaria una posterior secuencia para caracterizarlos y diferenciarlos por completo. La Fig. 3 muestra las secuencias de aminoácidos N terminales extendidas para estos tres productos de secreción purificados. Los distintos aminoácidos de las posiciones 16, 31 y 36 demuestran que estas proteínas aisladas son diferentes entre sí, a pesar de su similitud en el peso molecular.

Además de las proteínas 30, 32A y 32B, se determinaron las secuencias de aminoácidos N terminales extendidas de otros productos extracelulares mayoritariamente abundantes para facilitar los datos estructurales primarios y para revelar las posibles relaciones entre las proteínas. La secuencia se llevó a cabo en los productos extracelulares purificados conforme al Ejemplo 2 mediante las técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Las variaciones de longitud de la secuencia de aminoácidos N terminal, determinadas para cada producto extracelular individual, se muestran debajo como identificadas por el peso molecular aparente de la proteína intacta, y se representan mediante las abreviaturas estándar de una letra para los aminoácidos producidos de forma natural. Para mantener las normas de escritura convencionales, las secuencias N terminales se escriben de izquierda a derecha en dirección desde el amino-terminal hasta el carboxi-terminal. Se remarcan aquellas posiciones en las que la identidad del aminoácido determinado es menor que otras. Cuando el aminoácido de una posición en especial se desconoce o es ambiguo, la posición en la secuencia se representa con un guión. Por último, cuando dos aminoácidos están separados por una barra oblicua, significa que el componente correcto no se ha identificado explícitamente y cualquiera puede ocupar dicha posición en esa secuencia.

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1

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2

Estos datos de secuencia, combinados con las propiedades físicas establecidas mediante SDS-PAGE, permiten que estos de productos extracelulares mayoritariamente abundantes representativos de la presente invención puedan caracterizarse y distinguirse. El análisis descrito indica que estas proteínas constituyen la mayor parte de los productos extracelulares de M. Tuberculosis, con los productos de 71 kDa, 30 kDa, 32A kDa, 23 kDa y 16 kDa que comprenden aproximadamente el 60% del peso del producto extracelular disponible total. Se estima asimismo que la proteína de 30 kDa puede constituir hasta el 25% del peso del producto total segregado por M. Tuberculosis. Así, los productos extracelulares mayoritariamente abundantes individuales de ejemplo de M. Tuberculosis útiles para la práctica de la presente invención pueden oscilar entre aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 25% del peso total de los productos extracelulares.

Tal y como se ha tratado con anterioridad, dado que los análisis según la técnica Western Blot tradicionales fueron incapaces de identificar de forma coherente los productos extracelulares específicos más inmunogénicos, este inventor decidió analizar la inmunogenicidad de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes basándose en su abundancia y en la consiguiente facilidad de identificación y aislamiento. Sorprendentemente, se descubrió que estos productos extracelulares mayoritariamente abundantes inducen unas respuestas inmunes eficaces inesperadas que le han llevado a este inventor a deducir que pueden funcionar como vacunas. Este descubrimiento sorprendente llevó al desarrollo de la teoría funcional no limitante de esta invención, tratada con anterioridad. Para demostrar la eficacia de la presente invención, se llevaron a cabo experimentos adicionales utilizando productos extracelulares mayoritariamente abundantes individuales y combinaciones de los mismos en diversas dosis de ejemplo para inducir una inmunidad protectora en los modelos de laboratorio aceptados entre los expertos en la materia. Más especialmente, los productos extracelulares mayoritariamente abundantes individuales purificados se utilizaron para inducir una inmunidad protectora en cobayas sometidos a M. Tuberculosis. Una vez demostrado que dichas proteínas eran capaces de inducir una inmunidad protectora, se probaron mediante distintas vías de administración combinaciones de cinco productos extracelulares mayoritariamente abundantes purificados. En especial, el producto extracelular abundante de 30 kDa se utilizó para inducir la inmunidad protectora en el modelo animal aceptado, al igual que la forma purificada del producto extracelular de 71 kDa. Al igual que con los productos extracelulares mayoritariamente abundantes individuales de ejemplo, las vacunas de combinación de cinco productos extracelulares mayoritariamente abundantes también ofrecía protección contra la exposición a dosis letales de M. Tuberculosis. Los resultados de los diversos estudios de estas vacunas de ejemplo de la presente invención se detallan más abajo.

Se utilizaron cobayas específicos de raza Hartley machos y libres de patógeno (Charles River Breeding Laboratories, North Wilmington, Massachusetts) en todos los experimentos que implicaban exposiciones al aerosol o inmunogénicas con M. Tuberculosis. Los animales se ubicaron de dos en dos o de tres en tres en jaulas de acero inoxidable, y se les facilitaba acceso libre al agua y al pienso habitual para cobayas. Tras la llegada del animal a las instalaciones, los cobayas se sometían a observación durante al menos una semana antes del inicio de cada experimento para garantizar su estado de salud.

Los experimentos iniciales se llevaron a cabo utilizando productos extracelulares mayoritariamente abundantes individuales que se creía que se encontraban entre el 3% y el 25% de las proteínas extracelulares totales habitualmente presentes. Estos experimentos demuestran que los productos extracelulares mayoritariamente abundantes causan una respuesta inmune eficaz. Más especialmente, los productos extracelulares aislados de 30 kDa y 71 kDa mostraron ser individualmente capaces de generar una respuesta inmune celular que protegía a los cobayas tras la exposición a dosis letales de M. Tuberculosis, de la siguiente forma:

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Ejemplo 3

Prueba Cutánea de proteína purificada de 30 kDa para la inmunidad celular de Cobayas inmunizados con 30 kDa

Para ilustrar que se puede inducir una respuesta inmune evaluable a través de formas purificadas de productos extracelulares abundantes, se llevó a cabo un ensayo de hipersensibilidad cutánea. Los cobayas fueron inmunizados con el producto purificado de secreción de 30 kDa de M. tuberculosis mayoritariamente abundante de ejemplo según el Ejemplo 2, y se creía que constaba de aproximadamente el 25% del producto extracelular total de M. tuberculosis. En tres experimentos independientes, los cobayas fueron inmunizados tres veces en tres semanas distintas con 100 \mug de proteína de 30 kDa sustancialmente purificada en adyuvante SAF. Los animales de control fueron inoculados de forma similar con solución tampón en SAF. Tres semanas después de la última inmunización, los cobayas fueron sometidos a la proteína de 30 kDa de ejemplo en un ensayo de hipersensibilidad cutánea.

Se afeitó el lomo de los cobayas y se les administraron inyecciones intradérmicas de 0,1, 1 y 10 \mug de proteína de 30 kDa, con resultados de eritema (enrojecimiento de la piel) y endurecimiento evaluado a las 24 horas, tal y como se muestra en la Tabla A de más abajo. Los datos se facilitan en valores medios evaluado para el grupo \pm error típico de estimación (SE o standard error), tal y como se determina mediante los métodos tradicionales. ND indica que este aspecto particular de la invención no se ha llevado a cabo.

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TABLA A

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3

4

Tal y como se muestra en la Tabla A, los cobayas inmunizados con el producto de secreción de 30 kDa de ejemplo presentaban una fuerte respuesta inmune celular, tal y como se demuestra con el eritema y endurecimiento marcados. Por el contrario, los animales de control presentaron una respuesta mínima.

Para confirmar la inmunorreactividad del producto de secreción de 30 kDa y para demostrar su posibilidad de aplicación a la tuberculosis infecciosa, los cobayas no inmunizados fueron infectados con M. tuberculosis y se sometieron a esta proteína de la siguiente forma.

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Ejemplo 4

Prueba de la Proteína de 30 kDa Purificada para Respuestas Inmunes Celulares de los Cobayas infectados con M. tuberculosis

Para obtener las bacterias para su uso en experimentos que precisan de la infección de los cobayas, se cultivó primero M. tuberculosis en agar 7H11, y se transfirió a un pulmón de cobaya para comprobar su virulencia. A tal efecto, los cobayas se expusieron a aerosol con 10 ml de suspensión de bacteria en caldo 7H9 con aproximadamente 5 x 10^{4} bacterias/ml. Una vez los cobayas enfermaron, los animales fueron sacrificados y se les extirparon los pulmones, que presentaban lesiones sobresalientes por M. tuberculosis. Cada pulmón se tritura y se cultiva en agar 7H11 durante un periodo de entre 7 y 10 días. Las bacterias se separaron de las placas, fueron diluidas en caldo 7H9 que contenía glicerol 10%, sonicadas en baño de agua para obtener una suspensión unicelular, y congeladas lentamente a -70ºC a una concentración de aproximadamente 2 x 10^{7} bacterias/ml viables. La viabilidad de las células congeladas se evaluó descongelando la suspensión bacterial y cultivando diluciones seriadas de la suspensión en agar 7H11. Justo antes de una exposición, se descongeló un vial de células bacterianas y se diluyó en la concentración deseada en caldo 7H9.

Los cobayas se expusieron a aerosoles de M. tuberculosis viable en una cabina de Lucite especialmente diseñada para el aerosol. La cabina de aerosol medía 14 por 13 por 24 pulgadas, y tenía dos portales de 6 pulgadas de diámetro en los lados opuestos para introducir o sacar a los cobayas. La entrada del aerosol estaba situada en el centro del techo de la cabina. Una bomba de vacío (Gast Mfg. co., Benton Harbor, Michigan) expulsaba aire a 30 psi a una unidad Nebulizador-Venturi (Mes Inc., Burbank, California), y se generaba un aerosol a partir de una suspensión de 10 ml de bacilos. Se colocó un filtro de 0,2 \mum para el circuito respiratorio (Pall Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rico) en uno de los extremos de la cabina para equilibrar la presión interna y externa del conjunto. Para una mayor seguridad, las exposiciones al aerosol se llevaron a cabo con la cabina colocada completamente en el interior de una cabina de flujo laminar.

Los animales fueron sometidos a exposición al aerosol patógeno durante 30 minutos, tiempo durante el cual se agotaba por completo la suspensión de los bacilos en el nebulizador. Cada aerosol se generaba a partir de una suspensión de 10 ml que contenía aproximadamente 5,0 x 10^{4} partículas bacterianas por ml. Los estudios anteriores demostraron que la exposición de los cobayas a esta concentración de bacterias producía infecciones constantes en animales no protegidos. Tras la infección con el aerosol, los cobayas se ubicaron en jaulas de acero inoxidable situadas en un recinto de seguridad con cabina de flujo laminar frente a riesgos biológicos (Airo Clean Engineering Inc., Edgemont, Pensilvania) y se observaron signos de enfermedad. Los animales, durante todo el experimento, tuvieron acceso libre al agua y al pienso habitual para cobayas.

En este experimento, los cobayas infectados fueron sacrificados y se evaluó la proliferación de linfocitos esplénicos en respuesta a varias concentraciones de la proteína de 30 kDa. Más específicamente, los linfocitos esplénicos se obtuvieron y purificaron como se describe en Brieman and Horwitz (J. Exp. Med. 164:799-811), que se adjunta al presente documento a modo de referencia. Los linfocitos se ajustaron a una concentración final de 10^{7} ml en RPMI 1640 (GIBCO Laboratories, Grand Island, Nueva York) que contenía penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y suero fetal bovino 10% (GIBCO), y se incubaron con varias concentraciones de producto de secreción de 30 kDa purificado en un volumen total de 100 \mul en pocillos Microtest (placa de cultivo de tejido de 96 pocillos fondo redondo; Falcon Labware, Oxnard, California) durante 2 días a 37ºC con 5% de CO^{2} y 95% de aire y a una humedad del 100%. Los animales no infectados se utilizaron como controles negativos. Al finalizar el periodo de incubación, se añadieron 0,25 \muin^{3} de [^{3}H] timidina (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) a cada pocillo, y las células se volvieron a incubar durante 2 horas a 37ºC con 5% de CO^{2} y 95% de aire y a una humedad del 100%. Se utilizó un recolector automático de células de múltiples muestras (Skatron Inc., Sterling, Virginia) para lavar cada pocillo, y el efluente pasó a través de un Filtermat (Skatron). Las secciones del Filtermat que representaban pocillos separados de microtest se colocaron en viales de centelleo, y se añadió un cóctel de centelleo líquido de 2 ml de Ecoscint H (National Diagnostics, Manville, Nueva Jersey). La emisión de partículas beta se evaluó en un contador de centelleo beta (Beckman Instruments Inc., Fullerton, California).

Las muestras de tejido de los cobayas infectados y no infectados se analizó frente a 1 y 10 \mug/ml de proteína de secreción de 30 kDa aislada. Las muestras se controlaron para comprobar su capacidad de incorporar [^{3}H] timidina. Los resultados de dichos ensayos se tabularon y presentaron en la Tabla B que aparece más abajo.

Los datos se facilitaron a modo de índice de estimulación que, a los efectos de este documento, se define como: incorporación media de [^{3}H] timidina de linfocitos incubados con antígeno/incorporación media de [^{3}H] timidina de linfocitos incubados sin antígeno.

TABLA B Índices de estimulación de 30 kDa (promedio \pm SE)

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5

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Tal y como se muestra en la Tabla B, las células de los animales infectados presentaban una fuerte respuesta a la proteína de 30 kDa de ejemplo, como manifestaba la proliferación de linfocitos esplénicos dependientes de la dosis en respuesta a la exposición a este producto de secreción mayoritariamente abundante. Por el contrario, los animales de control no infectados presentaban poca proliferación de linfocitos. Por consiguiente, el producto de secreción de 30 kDa induce claramente una respuesta inmune celular en mamíferos infectados con M. tuberculosis.

Para ilustrar los aspectos de protección de las vacunas de la presente invención, los cobayas fueron inmunizados con proteína de 30 kDa purificada y se expusieron a M. tuberculosis de la siguiente forma:

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Ejemplo 5

Exposición de los Cobayas Inmunizados con 30 kDa a M. tuberculosis Aerosolizado

Como antes, los animales fueron inmunizados tres veces en tres intervalos semanales con 100 \mug de la proteína de 30 kDa de ejemplo en SAF. Los cobayas de control fueron inmunizados con 120 \mug de EP masivo en SAF o sometidos a inmunización simulada con solución tampón en el mismo adyuvante. Tres semanas después de la última inmunización, los animales se expusieron a M. tuberculosis aerosolizada, tal y como se describe en el Ejemplo 4. Los índices de supervivencia para los tres grupos de animales se controlaron y se presentan de forma gráfica en la Fig. 4. La mortalidad absoluta se determinó en 14 semanas tras la exposición, tal y como se presenta en la Tabla C a continuación.

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TABLA C

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6

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Tal y como se muestra en la Fig. 4, los cobayas inmunizados tres veces con la proteína de 30 kDa estaban protegidos contra la muerte. Aproximadamente el 67% de los cobayas inmunizados con la proteína de 30 kDa sobrevivieron, mientras que sólo sobrevivió el 17% de los cobayas de control sometidos a inmunización simulada.

El aumento de peso de los animales inmunizados también se controló (datos no reflejados) e ilustra asimismo la capacidad profiláctica de las vacunas que cuentan con productos extracelulares mayoritariamente abundantes producidos por las bacterias patógenas, tal y como se desprende de la presente invención. Mientras que los animales inmunizados parecían mantener el peso, el alto índice de mortalidad de los animales sometidos a la inmunización simulada impedía la comparación gráfica entre los animales inmunizados y los animales de control.

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Tras la conclusión del estudio del control de peso, los animales supervivientes se sacrificaron, y se analizó el pulmón derecho y el bazo de cada animal para buscar M. tuberculosis viable. Los animales se introdujeron en una solución Amphyl 2% (National Laboratories, Montvale, Nueva Jersey), de forma que los pulmones y el bazo se les extirpaban de manera antiséptica. El número de lesiones superficiales primarias macroscópicas de los pulmones se enumeró mediante inspección visual. Las unidades formadoras de colonias (UFC) de M. tuberculosis del pulmón derecho y bazo se determinaron mediante homogeneización de cada órgano en 10 ml de 7H9 con mortero y pilón y 90-mesh Norton Alundum (Fisher), diluyendo considerablemente el tejido homogeneizado en 7H9 y cultivando las diluciones en placas dobles de agar 7H11 mediante el uso de gotas de 0,1 ml/gota. Todas las placas se introdujeron en incubadoras modulares y se incubaron entre 12 y 14 días a 37ºC con un 5% de CO_{2} y 95% de aire y una humedad del 100%. El ensayo se llevó a cabo mediante este protocolo, y los resultados del recuento se reflejan en la Tabla D siguiente en términos de promedio de unidades formadoras de colonias (UFC) \pm error típico de estimación
(SE).

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TABLA D Promedio UFC \pm SE

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7

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Tal y como se muestra en la Tabla D, la inmunización con la proteína de secreción de ejemplo de 30 kDa limitó el crecimiento de M. tuberculosis en el pulmón y en el bazo. Aunque, a efectos comparativos, sólo estaban disponibles los datos del único animal sobreviviente sometido a inmunización simulada, los cuatro animales inmunizados con 30 kDa que sobrevivieron tenían un log de 0,7 UFC menos en los pulmones y 1 log de UFC menos en el bazo que el animal superviviente sometido a inmunización simulada. Basándonos en las demostraciones previas de alta correlación entre el recuento de UFC y mortalidad, el animal superviviente tenía menos UFC en los pulmones y en el bazo que los animales que murieron antes de que pudiera llevarse a cabo un análisis de UFC. De nuevo, esta reducción de UFC en los pulmones y bazo de los animales inmunizados demuestra a modo de conclusión el alcance y la capacidad operativa de la presente invención.

El potencial inmunoprotector de otro producto extracelular mayoritariamente abundante de M. tuberculosis, el producto extracelular de 71 kDa, se sometió a ensayo en su forma aislada para demostrar su capacidad inmuno-
protectora.

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Ejemplo de referencia 6

Pruebas Cutáneas de Proteína de 71 kDa Purificada en Cobayas Inmunizados con un Preparado de EP Masivo

Para demostrar el potencial de la proteína de 71 kDa para provocar una respuesta inmune eficaz en animales, se utilizó este producto extracelular mayoritariamente abundante aislado para efectuar la prueba cutánea en cobayas inmunizados con un preparado masivo de proteínas extracelulares (PE) de M. tuberculosis en un ensayo de hipersensibilidad cutánea. Tal y como se ha tratado anteriormente, el PE masivo transmite inmunidad adquirida contra la infección por M. tuberculosis, pero en una extensión menor a la de las vacunas de la presente invención.

Los cobayas fueron inmunizados en dos ocasiones con un intervalo de tres semanas, con 120 \mug de un preparado de PE masivo preparado tal y como se ha detallado en el Ejemplo 1. La vacunación se preparó en un adyuvante incompleto de Freund con animales sometidos a inmunización simulada que recibían una solución tampón en lugar de PE. Tres semanas después de la última vacuna, se afeitó el lomo a los cobayas de cada grupo y se llevó a cabo una prueba cutánea con una inyección intradérmica de 0,1, 1,0 y 10 \mug de proteína de 71 kDa. Se utilizaron 10,0 \mug de solución tampón como control, y todas las inoculaciones se efectuaron utilizando un volumen total de 0,1 ml. Los diámetros del eritema y el endurecimiento se evaluaron transcurridas 24 horas con los resultados mostrados en la Tabla E siguiente. Los datos se facilitan en valores medios evaluados para el grupo \pm error típico de estimación (SE), tal y como se determina mediante los métodos tradicionales.

TABLA E

8

Las respuestas de los animales inmunizados prácticamente dobló la respuesta de los cobayas expuestos únicamente a la solución tampón, y resultaron comparables a las respuestas de los animales expuestos a PE masivos idénticos a los utilizados para inmunizar a los animales (los datos no se muestran).

Para confirmar que el producto extracelular mayoritariamente abundante de 71 kDa purificados del ejemplo ocasiona unas respuestas inmunes celulares, los cobayas inmunizados con PE masivos fueron sacrificados, y se evaluó la proliferación esplénica de linfocitos en respuesta a varias concentraciones de la proteína de 71 kDa. Los animales no inmunizados se utilizaron como controles. Tras el protocolo del Ejemplo 4, se incubaron los linfocitos con y sin la proteína de 71 kDa durante 2 días, y a continuación se sometieron a ensayo para evaluar su capacidad de incorporar [^{3}H] timidina.

Los datos se reflejan en términos de índices de estimulación calculados como en el Ejemplo 4. Los resultados de esta exposición a la proteína de 71 kDa se muestran en la Tabla F siguiente.

TABLA F

9

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Tal y como se muestra en la Tabla F, los índices de estimulación para el ensayo de la proliferación de linfocitos se comparó con los resultados obtenidos en el ensayo de hipersensibilidad cutánea. Tanto las muestras ensayadas de PE masivo y de 71 kDa mostraban respuestas entre dos y tres veces superiores a aquellas obtenidas con los controles que indican que el producto extracelular mayoritariamente abundante de 71 kDa aislado del ejemplo es capaz de provocar una respuesta inmune celular en animales inmunizados con extractos de M. tuberculosis. No obstante, debemos hacer de nuevo hincapié en que el producto extracelular purificado principal o mayoritariamente abundante no cuenta con ninguno de los problemas asociados con las composiciones de la técnica anterior o masivas, y se puede adaptar con mayor rapidez a la producción de vacunas sintéticas y comerciales de la presente invención, superior a las de las técnicas anteriores.

Más especialmente, la preparación masiva no puede fabricarse fácilmente a gran escala mediante las técnicas biomoleculares modernas. Toda producción comercial de estos preparados no refinados masivos que contienen todos los productos extracelulares implicaría que se cultivaran cantidades enormes del patógeno diana o de especies estrechamente relacionadas y recoger el fluido sobrenadante resultante. Dicha metodología de producción es muy susceptible de contaminación por el patógeno diana, subproductos tóxicos y otros agentes parásitos. Asimismo, el amplio número de determinantes inmunogénicos en dicho preparado es mucho más probable que provoque una reacción inmune tóxica en un segmento susceptible de la población inmunizada. La utilización de estos preparados no refinados masivos también niega el uso de las pruebas cutáneas más habituales utilizadas actualmente para la detección y control de la tuberculosis.

En contraposición directa, las vacunas de la presente invención pueden producirse en serie con seguridad relativa utilizando hospedadores transformados de alto rendimiento. De forma similar, las vacunas de la presente invención pueden producirse de modo idéntico, con facilidad para conseguir lotes normalizados a diferencia de una producción variable más amplia de productos extracelulares masivos. Además, dado que el número de determinantes inmunogénicos presentados al sistema inmunitario hospedador es relativamente pequeño, las reacciones tóxicas y la posibilidad de invalidar los ensayos habituales de detección queda muy reducida.

Ejemplo de referencia 7

Pruebas Cutáneas de Proteína de 71 kDa Purificada en Cobayas Inmunizados con 71 kDa

Tras demostrar que el producto extracelular mayoritariamente abundante aislado de 71 kDa del ejemplo genera una respuesta inmune celular en animales inmunizados con PE masivo, se mostró que la forma purificada de este producto mayoritariamente abundante era capaz de inducir una respuesta inmune celular en animales inmunizados con 71 kDa.

Los cobayas fueron vacunados dos veces con 100 \mug de proteína de 71 kDa purificada en SAF con un intervalo de tres semanas. Los animales de control fueron sometidos a inmunización simulada con solución tampón en SAF con el mismo calendario de administración. Transcurridas tres semanas tras la última inmunización, ambos grupos de animales fueron expuestos intradérmicamente a 1 y 10 \mug de proteína de 71 kDa aislada. El eritema resultante y los endurecimientos se evaluaron transcurridas 24 horas con los resultados mostrados en la Tabla G siguiente.

TABLA G

10

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El alcance del endurecimiento y del eritema era mucho mayor en los animales inmunizados que en los animales de control no inmunizados, lo que demuestra que se había iniciado una respuesta inmune celular fuerte a la proteína de 71 kDa.

Se llevaron a cabo ensayos de proliferación de linfocitos para confirmar aún más la capacidad del producto extracelular abundante para inducir su propia respuesta inmune eficaz. Los animales inmunizados que se muestran en la Tabla G fueron sacrificados, y se llevaron a cabo ensayos de proliferación esplénica de linfocitos mediante el protocolo establecido en el Ejemplo 4. Las muestras de tejido extraídas de los cobayas inmunizados con 71 kDa y de los cobayas de control fueron expuestas a la proteína aislada de 71 kDa de 0,1 1 y 10 \mug/ml, y se controló su capacidad para incorporar [^{3}H] timidina. Los índices de estimulación se calcularon tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos ensayos se reflejan en la Tabla H siguiente.

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TABLA H Índice de estimulación por 71 kDa (promedio \pm SE)

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Al igual que con el ensayo de hipersensibilidad cutánea, los animales inmunizados con 71 kDa presentaban una respuesta mucho mayor al 71 kDa purificado que los animales de control sometidos a inmunización simulada. Aunque se esperaba esto de una proteína extraña, estos resultados demuestran con claridad que un producto extracelular mayoritariamente abundante tiene capacidad para inducir una respuesta inmune celular.

Tras establecer que la proteína extracelular mayoritariamente abundante aislada inducirá una respuesta inmune celular eficaz, se llevaron a cabo más experimentos para confirmar que dicha respuesta es de reacción cruzada contra el bacilo de la tuberculosis de la siguiente forma.

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Ejemplo de referencia 8

Exposición de los Cobayas Infectados con M. Tuberculosis a la Proteína de 71 kDa Purificada

Los cobayas no inmunizados fueron infectados con M. tuberculosis aerosolizado, tal y como se explica en el Ejemplo 4. El derivado proteico purificado (PPD-CT68i Connaught Laboratories Ltd.) se utilizó como control positivo para garantizar que los animales infectados estaban presentando una respuesta inmune celular indicativa de M. tuberculosis. PPD, extensamente utilizado en la prueba de Mantoux para la exposición a la tuberculosis, suele estar preparado con fraccionamiento de sulfato de amonio, y consta de una mezcla de pequeñas proteínas que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kDa. Las respuestas inmunes a PPD son sustancialmente análogas a las provocadas por las fracciones de PE masivas aisladas en el Ejemplo 1.

Tres semanas después de la infección, los cobayas fueron inoculados intradérmicamente con 0,1, 1 y 10 \mug de la proteína extracelular de 71 kDa mayoritariamente abundante purificada del ejemplo. Los animales no infectados utilizados como animales de control también fueron expuestos a la proteína aislada. El alcance del eritema y el endurecimiento se evaluaron transcurridas 24 horas con los resultados mostrados en la Tabla I siguiente.

TABLA I

12

Tal y como se muestra en la Tabla I, existen unas respuestas inmunes fuertes en los animales infectados expuestos a la proteína extracelular mayoritariamente abundante purificada del ejemplo de la presente invención. Estas respuestas son del orden de entre tres y cuatro veces mayor para el eritema y más de diez veces mayor para el endurecimiento que aquellas de los animales infectados, lo que confirma que la proteína extracelular de 71 kDa abundante induce una respuesta inmune celular fuerte en los animales infectados con M. tuberculosis.

Para corroborar aún más estos resultados, los animales infectados y no infectados fueron sacrificados y sometidos a un ensayo de proliferación de linfocitos conforme al protocolo del Ejemplo 4. Las muestras de tejido de ambos grupos de cobayas se sometieron a ensayo frente a 0,1, 1 y 10 \mug de proteína de 71 kDa aislada y PPD. Las muestras se sometieron a observación para comprobar su capacidad de incorporar [^{3}H] timidina, como ya se describió con los resultados de los ensayos presentados en la Tabla J siguiente.

TABLA J

13

Al igual que con los resultados del ensayo de sensibilidad cutánea, la Tabla J muestra que los índices de estimulación eran mucho mayores para el tejido infectado que para las muestras no infectadas. Más especialmente, el índice de estimulación máximo medio de los animales infectados era dos veces mayor para la proteína de 71 kDa del ejemplo y tres veces mayor para el PPD que para los controles no infectados, lo que confirma que se indujo una respuesta inmune celular fuerte en animales infectados con M. tuberculosis por parte de las vacunas de proteína extracelular mayoritariamente abundante del ejemplo.

Tras esta demostración de reacción cruzada entre la proteína mayoritariamente abundante de 71 kDa purificada de ejemplo y M. tuberculosis, se llevaron a cabo otros experimentos para demostrar que podría estimularse una respuesta inmune eficaz por estas muestras purificadas del ejemplo de los productos extracelulares mayoritariamente
abundantes.

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Ejemplo de referencia 9

Exposición de los Cobayas Inmunizados con 71 kDa a M. tuberculosis Aerosolizado

Para demostrar la capacidad inmunoprotectora de las vacunas con proteína extracelular principal o mayoritariamente abundante del ejemplo, a los cobayas se les inmunizó dos veces, con un intervalo de tres semanas, con 100 \mug de la proteína de 71 kDa mayoritariamente abundante de ejemplo conforme al Ejemplo 2. Los animales de control fueron inmunizados con 120 \mug de PE masivo del Ejemplo 1 o solución tampón. Todos los animales fueron inmunizados utilizando el adyuvante SAF. Tres semanas después de la última inmunización, los cobayas inmunizados con la proteína de 71 kDa del ejemplo se sometieron a una prueba cutánea con 10 \mug del material para el que había que evaluar si se había desarrollado una respuesta inmune celular. Los animales de control y los cobayas inmunizados con 71 kDa fueron infectados con M. tuberculosis aerosolizado, tal y como se detalla en el Ejemplo 4. Tras la infección, los animales fueron observados y pesados durante seis semanas.

El gráfico de la Fig. 5 contrasta la pérdida de peso experimentada por el grupo sometido a inmunización simulada con el aumento de peso relativamente normal mostrado por los animales inmunizados con 71 kDa y PE masivo. Los datos son los pesos medios \pm error típico de estimación (SE) para cada grupo. Las curvas de mortalidad para los mismos animales se muestran en el gráfico de la Fig. 6. Los índices de mortalidad absoluta para el estudio se detallan en la Tabla K siguiente.

TABLA K

14

Tanto las curvas de pérdida de peso como los índices de mortalidad muestran claramente que las proteínas extracelulares mayoritariamente abundantes proporcionan una respuesta inmune profiláctica. Y sobre esto hace hincapié el hecho de que el 100% de los animales no inmunizados muriera antes de finalizar el periodo de control.

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Ejemplo de referencia 10

Exposición de los Cobayas Inmunizados con 71 kDa a M. tuberculosis Aerosolizado

Se ha llevado a cabo un experimento similar para verificar los resultados del ejemplo anterior y demostrar que la administración de una proteína extracelular principal de ejemplo puede proporcionar una respuesta inmune protectora en animales. En este experimento, los cobayas fueron de nuevo inmunizados tres veces, en intervalos de 3 semanas, con 100 \mug de la proteína extracelular de 71 kDa en SAF. Los cobayas de control fueron sometidos a inmunización simulada con solución tampón en SAF. Tres semanas después de la última inmunización, los animales fueron expuestos a M. tuberculosis aerosolizado y se pesaron durante 13 semanas. Se calcularon los pesos medios \pm el error típico de desviación (SE) para cada grupo de 6 cobayas, y están representados gráficamente en la Fig. 7. Esta curva muestra que los animales que se sometieron a inmunización simulada perdían una cantidad considerable de peso durante el periodo de control, mientras que los animales inmunizados mantenían un peso corporal bastante constante. Dado que la pérdida de masa corporal o "consumo" es uno de los efectos secundarios clásicos de la tuberculosis, estos resultados indican que el crecimiento y la proliferación del bacilo tuberculoso en los animales inmunizados quedaron inhibidos por la vacuna del ejemplo.

La inmunidad protectora se había desarrollado en los cobayas a través de la vacuna con producto extracelular abundante en forma asilada, y se llevaron a cabo experimentos para demostrar la inmunorreactividad interespecies de las vacunas, y para confirmar aún más la validez y aplicación del modelo de los cobayas.

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Ejemplo de referencia 11

Ensayo sobre la Inmunidad Celular de los Humanos con PPD positivo con Proteína de 71 kDa Purificada

Para evaluar el componente celular de una respuesta inmune humana a la proteína mayoritariamente abundante de 71 kDa del ejemplo, se estudió la proliferación de los linfocitos en sangre periférica de los individuos con PPD positivo y PPD negativo respecto del estudio de la proliferación habitual de linfocitos reflejada en el Ejemplo 4 anterior. Una respuesta al PPD positivo, o tuberculina, se conoce bien entre los expertos en la materia como un indicador de una exposición previa a M. tuberculosis. La respuesta de proliferación y la incorporación correspondiente de [^{3}H] timidina se evaluaron a los dos y a los cuatro días. Los datos de estos estudios se muestran en las Fig. 8A y 8B. La Fig. 8A muestra la respuesta a varios niveles de 71 kDa transcurridos dos días, mientras que la Fig. 8B muestra las mismas respuestas a los cuatro días.

Tal y como ilustran las Fig. 8A y 8B, el índice de estimulación de pico media de individuos con PPD positivo era dos veces mayor que la de la proteína de 71 kDa, y tres veces mayor que el PPD de los individuos con PPD negativo. Entre los individuos con PPD positivo, existe una correlación lineal entre los índices de estimulación pico de la proteína de 71 kDa del ejemplo y el PPD, lo que demuestra que hay una respuesta inmune celular estimulada por los productos extracelulares mayoritariamente o más abundantes de M. tuberculosis en humanos previamente expuestos a M. tuberculosis. Estos datos corresponden al perfil de la reacción observada en los cobayas, y confirma la aplicación del modelo de los cobayas a otros mamíferos sometidos a la infección.

Así, al igual que con la proteína del ejemplo de 30 kDa tratada anteriormente, el desarrollo de una fuerte respuesta inmune al producto extracelular de 71 kDa mayoritariamente abundante demuestra el amplio alcance de la presente invención, tal y como se prueba por el hecho de que el producto de 71 kDa es también eficaz para estimular una inmunidad celular en humanos.

De nuevo, debe hacerse hincapié en que la presente declaración no se limita a los productos extracelulares de M. tuberculosis o al uso de la proteína de 71 kDa del ejemplo. De hecho, las demostraciones de la presente declaración pueden aplicarse a todo producto extracelular mayoritariamente abundante, tal y como se demuestra en los ejemplos.

Se han llevado a cabo unos estudios adicionales para poder determinar si las combinaciones de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis también ofrecerían una inmunidad protectora. En general, estos estudios utilizaron cobayas inmunizados ya sea de forma intradérmica o subcutánea con varias dosis de vacunas que constaban de combinaciones de 5 proteínas extracelulares purificadas de M. tuberculosis en SAF tres veces, con intervalos de 3 o 4 semanas.

La primera combinación proteica utilizada para el proceso de inmunización, etiquetado como Combinación I, consistía en proteínas de 71 kDa, 32A kDa, 30 kDa, 23 kDa y 16 kDa purificadas conforme a los protocolos descritos en el Ejemplo 2. Esta combinación se cree que comprende hasta el 60% de la proteína extracelular total normalmente presente en los sobrenadantes del cultivo de M. tuberculosis. Estas proteínas seleccionadas para su uso en la combinación I están identificadas con un asterisco en la Fig. 2. La vacuna con la combinación I contenía 100 \mug, 20 \mug o 2 \mug de cada proteína, y se administró de forma intradérmica con el adyuvante SAF. La vacuna de la combinación I que contenía 20 \mug de cada proteína también se administró de forma subcutánea en experimentos similares. Los cobayas de control negativo fueron sometidos a inmunización simulada con volúmenes equivalentes de SAF y solución tampón con el mismo calendario de administración, mientras que los controles positivos fueron inmunizados con 120 \mug del preparado de proteína extracelular masivo del Ejemplo 1 en SAF. Todos los volúmenes de inyección fueron normalizados con solución tampón.

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Ejemplo 12

Respuesta de los Cobayas Inmunizados con la Combinación I Frente a Exposición a la Vacuna de la Combinación I

Para determinar si los animales habían desarrollado una respuesta inmune evaluable tras la vacuna con la mezcla de productos extracelulares principales de la Combinación I, se llevó a cabo un ensayo de hipersensibilidad cutánea. A los cobayas se les afeitó el lomo, y se les inyectó intradérmicamente con 1,0 \mug y 10,0 \mug de la misma combinación de las cinco proteínas extracelulares purificadas. Se utilizaron 10,0 \mug de solución tampón como control, y todas las inoculaciones se efectuaron utilizando un volumen total de 0,1 ml. Los diámetros del eritema y el endurecimiento de las zonas de las pruebas cutáneas se evaluaron a las 24 horas de la inoculación.

Los resultados de estas evaluaciones se reflejan en la Tabla L siguiente. Los datos se facilitan de nuevo en valores medios evaluados para el grupo \pm error típico de estimación (SE), tal y como se determina mediante los métodos tradicionales. ND indica que este aspecto particular del experimento no se ha llevado a cabo.

TABLA L

15

Los datos demuestran con claridad que los animales vacunados generan una fuerte respuesta inmune celular a las proteínas extracelulares de la Combinación I. Los cobayas inmunizados presentan unas evaluaciones de eritema y endurecimiento casi tres veces mayores a las de los animales de control.

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Ejemplo 13

Análisis Inmunoprotector de la Vacuna de la Combinación I Frente a M. tuberculosis Aerosolizado

Tres semanas después de la última inmunización, los cobayas utilizados para el ensayo anterior de hipersensibilidad fueron expuestos a M. tuberculosis aerosolizado de la cepa Erdman, y se pesaron todas las semanas durante 10 semanas. Esta exposición al aerosol se llevó a cabo mediante el protocolo del Ejemplo 4. Seis animales inmunizados con 100 \mug de los productos extracelulares principales de la Combinación I, junto con unos grupos de igual tamaño de controles positivos y negativos, se expusieron de forma simultánea a M. tuberculosis aerosolizado. Los controles positivos fueron inmunizados tres veces con 120 \mug de PE en SAF.

Los cobayas que murieron antes de finalizar el periodo de observación fueron sometidos a necropsia y examinados para buscar pruebas de lesiones tuberculares graves. Dichas lesiones se encontraron en todos los animales que murieron durante el estudio.

Las diferencias entre los animales de control e inmunizados en perfiles de peso medio tras la exposición al aerosol se analizaron mediante repetidos análisis de variación (ANOVA) de las evaluaciones. Las diferencias entre los cobayas inmunizados y de control supervivientes tras la exposición se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher de dos colas. Los datos son los pesos medios \pm error típico de estimación (SE) para cada grupo de seis cobayas.

Los resultados de las determinaciones de peso semanales tras la exposición se muestran en la Fig. 9. Comparados con los cobayas inmunizados con la combinación de productos extracelulares, los animales sometidos a inmunización simulada perdieron el 15,9% de su peso corporal total. Los pesos de los controles positivos eran similares a los de los animales inmunizados con la combinación de cinco proteínas extracelulares purificadas. Los pesos corporales se normalizaron inmediatamente antes de la exposición. La diferencia entre los animales inmunizados con la Combinación I y los controles sometidos a inmunización simulada era muy significativa, con p. <.0000001 por las evaluaciones ANOVA repetidas.

La mortalidad se determinó diez semanas y media después de la exposición. Los tres animales sometidos a inmunización simulada iban muriendo consecutivamente cada tres días entre diez y diez semanas y media después de la exposición. Los resultados de mortalidad del experimento se reflejan en la Tabla M siguiente.

TABLA M

16

Tras la finalización del estudio de control de peso, los animales supervivientes fueron sacrificados por hipercapnia, y se analizó el pulmón derecho y el bazo de cada animal para buscar M. tuberculosis viable mediante el protocolo del Ejemplo 5. Los resultados del recuento, incluidos los 3 animales que murieron la última semana del experimento, se reflejan en la Tabla N siguiente en términos de promedio de unidades formadoras de colonias (UFC) \pm error típico de estimación (SE).

TABLA N

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La diferencia de log entre la concentración de bacilos en el pulmón de los animales inmunizados con la combinación de proteínas purificadas y la de los animales sometidos a inmunización simulada era de 1,4, mientras que la diferencia de log de los bacilos en el bazo era de 0,9. Paralelamente, a simple vista durante la necropsia, los animales inmunizados presentaban unas lesiones marcadamente inferiores del pulmón ocasionadas por la tuberculosis en comparación con los animales de control sometidos a inmunización simulada. Los animales de control positivo inmunizados con el preparado extracelular (PE) masivo del Ejemplo 1 presentaban 0,7 log más bacilos en el pulmón y ,5 log más bacilos en el bazo que los animales inmunizados con la mezcla de la Combinación I de proteínas extracelulares purificadas.

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Ejemplo 14

Análisis de Inmunoprotección de la Vacuna de la Combinación I a Bajas Dosis a Través de Administración Intradérmica y Subcutánea

Mientras que el Ejemplo 13 confirmaba que las proteínas de la Combinación I demostraban inmunoprotección en animales inmunizados intradérmicamente con 100 \mug de cada proteína (30 + 32A + 16 + 23 + 71) 3 veces, con intervalos de 4 semanas, se llevó a cabo un estudio alternativo para demostrar la capacidad inmunoprotectora de bajas dosis de proteínas de la Combinación I, especialmente de 20 \mug o 2 \mug de cada proteína. Al igual que en el Ejemplo 13, los cobayas (6 animales por grupo) fueron inmunizados con las proteínas de la Combinación I (30 + 32A + 16 + 23 + 71) intradérmicamente en SAF 4 veces con un intervalo de 3 semanas. Los animales recibieron bien 20 \mug de cada proteína por inmunización, o bien 2 \mug de cada proteína por inmunización. Los animales de control fueron sometidos a inmunización simulada utilizando el protocolo anterior. Tres semanas después, los animales fueron expuestos a M. tuberculosis aerosolizadas, y fueron pesados semanalmente durante 9 semanas. Todos los animales inmunizados sobrevivieron hasta el final del experimento, aunque un animal sometido a inmunización simulada murió antes de terminar el experimento. Tal y como ilustran los siguientes resultados, las dosis 5 veces e incluso 50 veces menores a las del Ejemplo 13 protegían a los animales inmunizados a M. tuberculosis aerosolizado, y resultó eficaz tanto la vía de administración intradérmica como subcutánea.

En comparación con los cobayas inmunizados con 20 \mug de cada proteína de la Combinación I, los animales sometidos a inmunización simulada perdieron el 12% de su peso corporal total durante las 9 semanas del experimento (los pesos se normalizaron justo antes de la exposición). En comparación con los cobayas inmunizados con 2 \mug de cada proteína de la Combinación I, los animales sometidos a inmunización simulada perdieron el 11% de su peso corporal total normalizado. Así, los cobayas inmunizados intradérmicamente con pocas dosis de las proteínas de la Combinación I estaban protegidos contra la pérdida de peso tras la exposición al aerosol con M. tuberculosis.

De forma similar, los cobayas inmunizados intradérmicamente con bajas dosis de las proteínas de la Combinación I también estaban protegidos contra la esplenomegalia asociada con la diseminación de M. tuberculosis en el bazo. Tal y como se muestra en la Tabla O, mientras que los animales inmunizados con 10 \mug o 2 \mug de cada proteína de la Combinación I tenían unos bazos que pesaban una media de 4,6 \pm 1,2 g y 4,0 \pm 0,8 g (Promedio \pm error típico de desviación (SE)) respectivamente, los bazos de los animales sometidos a inmunización simulada pesaban una media de 9,6 \pm 1,8 g (Tabla 1) o más del doble como mucho.

TABLA O

18

Los cobayas inmunizados intradérmicamente con bajas dosis de las proteínas de la Combinación I también tenían menos UFC de M. tuberculosis en el bazo. Tal y como se muestra en la Tabla P, cuando se comparan con los animales sometidos a inmunización simulada, los cobayas inmunizados con 20 \mug o 2 \mug de cada proteína de la Combinación I tienen en el bazo una media de 0,6 y 0,4 menos UFC log, respectivamente.

TABLA P

19

Además, los cobayas inmunizados subcutáneamente con las proteínas de la Combinación I también estaban protegidos contra la pérdida de peso, la esplenomegalia y el crecimiento de M. tuberculosis en el bazo. En el mismo experimento descrito en el Ejemplo 14, los cobayas también fueron inmunizados subcutáneamente en lugar de intradérmicamente con 20 \mug de proteínas de la Combinación I, 4 veces, con intervalos de 3 semanas. Estos animales estaban protegidos frente a la exposición casi tanto como los animales inmunizados intradérmicamente con 20 \mug de las proteínas de la Combinación I.

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Ejemplo 15

Respuesta de los Cobayas Inmunizados con la Combinación I y la Combinación II frente a la Exposición a la Combinación I y la Combinación II

Se han llevado a cabo unos estudios adicionales para poder determinar si otras combinaciones de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis también ofrecerían una inmunidad protectora. Un estudio utilizó cobayas que fueron inmunizados con una vacuna que constaba de dos combinaciones (Combinación I (71, 32A, 30, 23, y 16) y Combinación II (32A, 30, 24, 23, y 16). Se considera que la Combinación II comprende hasta un 62% de la proteína extracelular total normalmente presente en los sobrenadantes de M. tuberculosis. Los animales (6 por grupo) fueron inmunizados cuatro veces con 100 \mug de cada proteína de la Combinación I o II en SAF, con intervalos de 3 semanas. Los animales de control negativo fueron sometidos a inmunización simulada con volúmenes equivalentes de SAF y solución tampón con el mismo calendario de administración.

Al igual que en el Ejemplo 12, los animales se sometieron a ensayos de hipersensibilidad cutánea retardada para determinar si los animales desarrollaban una respuesta inmune evaluable tras la inoculación. Los animales inmunizados con la Combinación II tenían un eritema de 16,8 \pm 1,3 mm (Promedio \pm SE) y un endurecimiento de 12,8 \pm 1,2 mm como respuesta a la exploración cutánea con la Combinación II, mientras que los animales sometidos a inmunización simulada únicamente tenían un eritema de 1,3 \pm 0,8 mm y un endurecimiento de 0,3 \pm 3 mm como respuesta a la Combinación II. Por tanto, los animales inmunizados con la Combinación II presentaban un eritema más de 12 veces mayor y un endurecimiento más de 40 veces mayor que los animales de control. A modo de comparación, los animales inmunizados con la Combinación I presentaban un eritema de 21,3 \pm 2,0 mm y un endurecimiento de 15,8 \pm 0,1 mm como respuesta a la prueba cutánea con la Combinación I, mientras que los animales sometidos a inmunización simulada únicamente presentaban un eritema de 6,4 \pm 0,8 mm y un endurecimiento de 2,6 \pm 0,7 mm como respuesta a la Combinación I. Por lo tanto, los animales inmunizados con la Combinación I presentaban un eritema más de 3 veces mayor y un endurecimiento más de 6 veces mayor que los animales de control. La diferencia de los animales de control para las proteínas de la Combinación II era aún mayor que la de las proteínas de la Combinación I.

En el mismo experimento, los animales inmunizados con una dosis menor de proteínas de la Combinación II (20 \mug de cada proteína frente a 100 \mug) también desarrollaron una fuerte hipersensibilidad cutánea a la Combinación II. Presentaban un eritema de 21,0 \pm 2,0 mm y un endurecimiento de 15,3 \pm 0,9 mm como respuesta a la Combinación II, mientras que los animales sometidos a inmunización simulada únicamente presentaban un eritema de 1,3 \pm 0,8 mm y un endurecimiento de 0,3 \pm 0,3 mm, tal y como se ha reflejado anteriormente. Por consiguiente, los animales inmunizados con una dosis más baja de las proteínas de la Combinación II presentaban un eritema 16 veces mayor y un endurecimiento más de 50 veces mayor que los animales de control, una diferencia que era aún mayor para los animales inmunizados con dosis más altas de las proteínas de la Combinación II.

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Ejemplo 16

Análisis Inmunoprotector de la Vacuna de la Combinación I y II Frente a M. tuberculosis Aerosolizado

Tres semanas después de la última inmunización, los cobayas utilizados para el ensayo anterior de hipersensibilidad fueron expuestos a M. tuberculosis aerosolizado de la cepa Erdman como en el Ejemplo 13, y se pesaron todas las semanas durante 7 semanas. Al igual que el Ejemplo 13, había 6 animales en cada grupo. Durante las primeras 7 semanas posteriores a la exposición, los animales sometidos a inmunización simulada perdieron una media de 19,5 g. Por el contrario, los animales inmunizados con la Combinación II (100 \mug de cada proteína) ganaron 52,4 g, y los animales inmunizados con la Combinación II a una dosis más baja (20 \mug de cada proteína) ganaron una media de 67,2 g. A modo de contraste, los animales inmunizados con la Combinación I ganaron 68 g. Así, comparados con los cobayas inmunizados con la Combinación II (100 \mug), los animales sometidos a inmunización simulada perdieron el 11% de su peso corporal total. Comparados con los cobayas inmunizados con la Combinación II a una dosis más baja (20 \mug), los animales sometidos a inmunización simulada perdieron el 14% de su peso corporal total. Comparados con los animales inmunizados con la Combinación I, los animales sometidos a inmunización simulada también perdieron el 14% de su peso corporal total.

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Ejemplo 17

Respuesta de los Cobayas Inmunizados con las Combinaciones III a XII frente a una Exposición a la misma Vacuna o sus Componentes

Se llevaron a cabo unos experimentos adicionales para demostrar la eficacia de diversas combinaciones de productos extracelulares mayoritariamente abundantes de M. tuberculosis. En estos estudios, los cobayas de tipo Hartley fueron inmunizados intradérmicamente con vacunas que comprendían combinaciones de 2 o más productos extracelulares mayoritariamente abundantes purificados igual que en el Ejemplo 2. Los productos extracelulares purificados se identifican utilizando su peso molecular aparente tal y como queda determinado por SDS-PAGE. Los cobayas fueron inmunizados con las siguientes combinaciones de productos extracelulares mayoritariamente abundantes:

100

Cada vacuna de combinación incluía 100 \mug de cada proteína enumerada. Las vacunas de combinación se ajustaron volumétricamente y se inocularon intradérmicamente en el adyuvante SAF. Como anteriormente, los cobayas fueron inmunizados cuatro veces, con intervalos de tres semanas.

Se llevó a cabo un ensayo de hipersensibilidad cutánea para determinar si los animales habían desarrollado una respuesta inmune evaluable tras la inoculación de las Combinaciones III a XII. Se afeitó el lomo a los grupos de seis cobayas y se les inoculó intradérmicamente la misma combinación de productos extracelulares purificados frente a los que estaban inmunizados. Para esta exposición se les inyectaron 10 \mug de cada una de las proteínas de la combinación. Todas las inoculaciones se llevaron a cabo utilizando un volumen total de 0,1 ml. Los controles sometidos a inmunización simulada, que habían sido inmunizados con SAF, únicamente se sometieron a pruebas cutáneas con las Combinaciones III a XII usando de nuevo 10 \mug de cada proteína en la combinación respectiva. Los diámetros del eritema y el endurecimiento de las zonas de las pruebas cutáneas se evaluaron transcurridas 24 horas tras la inoculación, tal y como se describe en el Ejemplo 3.

Los resultados de estos ensayos se reflejan en la Tabla Q siguiente. Los datos se facilitan de nuevo en valores medios evaluados para el grupo \pm error típico de estimación (SE), tal y como se determina mediante los métodos tradicionales.

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TABLA Q

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Los resultados demuestran con claridad que se ha generado una fuerte respuesta inmune celular para cada una de las combinaciones de proteínas extracelulares purificadas. Los cobayas inmunizados presentaban un eritema de al menos dos veces y normalmente de 3 veces o más que el de los controles para todas las combinaciones. Además, los cobayas inmunizados presentaban un endurecimiento de al menos 3 veces más que el de los controles para todas las combinaciones.

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Ejemplo 18

Análisis Inmunoprotector de las Combinaciones III-XII Frente a M. tuberculosis Aerosolizado

Para demostrar la eficacia profiláctica de estas combinaciones de productos extracelulares purificados de ejemplo, los cobayas inmunizados con las Combinaciones III a XII se expusieron a M. tuberculosis tres semanas después de la última inmunización según el protocolo del Ejemplo 4.

De forma coherente con los resultados previos, los cobayas inmunizados con las Combinaciones III a XII estaban todos protegidos frente a la muerte tras la exposición. Transcurridas 4 semanas tras la exposición, 2 de los 6 animales sometidos a inmunización simulada murieron (33%), comparados con los 0 animales de los grupos inmunizados con las Combinaciones IV-XII, y con el único de 6 animales (17%) del grupo inmunizado con la Combinación III. Transcurridas 10 semanas tras la exposición, el 50% de los animales sometidos a inmunización simulada murieron, comparados con las 0 muertes de los animales de los grupos inmunizados con las Combinaciones IX y XII (0%), la única de 6 (17%) muertes en los animales de los grupos inmunizados con las Combinaciones III, IV, V, VI, X y XI, 1 muerte de 5 (20%) de los animales inmunizados con la Combinación VIII, y las 2 de 6 muertes (33%) de los animales inmunizados con la Combinación VII.

Los cobayas que murieron antes de finalizar el periodo de observación fueron sometidos a necropsia y examinados para buscar pruebas de lesiones tuberculares graves. Se encontraron lesiones en todos los animales que murieron durante el estudio.

Tras la finalización del estudio de mortalidad, los animales supervivientes fueron sacrificados por hipercapnia y se analizó el bazo de cada animal para buscar M. tuberculosis viable mediante el protocolo del Ejemplo 5. Los resultados del recuento se reflejan en la Tabla R siguiente en términos de promedio de unidades formadoras de colonias (UFC) junto con el descenso de log de los animales sometidos a inmunización simulada. El asterisco junto al valor de UFC indica que el recuento del bazo fue igual a cero en un animal de cada grupo. A los efectos de cálculo, los recuentos iguales a cero se tratan como 10^{3} UFC por bazo o 3 log.

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TABLA R

21

Los animales inmunizados con las Combinaciones III, IV, VI, VII, IX, X, XI, y XII presentaban en el bazo un promedio de al menos 0,5 log menos de unidades formadoras de colonias de M. tuberculosis que los controles sometidos a inmunización simulada. En especial, las Combinaciones IV y VII probaron ser especialmente eficaces para reducir el promedio del número de unidades formadoras de colonias en aproximadamente un múltiplo de diez. Los animales inmunizados con las Combinaciones V y VIII presentaban en el bazo un promedio de 0,3 y 0,1 log menos, respectivamente, de unidades formadoras de colonias (UFC) que los controles sometidos a inmunización simulada. Esta reducción tan brusca en las unidades formadoras de colonias de los animales inmunizados conforme a las doctrinas de la presente invención ilustra una vez más la capacidad de operación inmunoprotectora de la presente invención.

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Ejemplo 19

Respuesta de los Cobayas Inmunizados con 3 Diferentes Dosis de la Combinación XIII frente a una Exposición con la Combinación XIII

Para definir aún más la capacidad de operación y el alcance de la presente invención, así como para demostrar la eficacia de las combinaciones adicionales de los productos extracelulares purificados, los cobayas fueron inmunizados al igual que anteriormente con dosis alternativas de vacunas. Específicamente, con 50 \mug, 100 \mug y 200 \mug de una combinación alternativa de 3 productos extracelulares mayoritariamente abundantes identificados como la Combinación XIII y que constan de proteínas de 30 kDa, 32(A) kDa y 16 kDa. Al igual que con los ejemplos anteriores, los grupos de animales fueron inmunizados intradérmicamente 4 veces, con intervalos de 3 semanas, con las dosis alternativas de la Combinación XIII en SAF.

Se llevó a cabo un ensayo de hipersensibilidad cutánea para determinar si los animales habían desarrollado una respuesta inmune evaluable tras la inoculación. Se afeitó el lomo de los animales y se les inoculó intradérmicamente la Combinación XIII que contenía 10,0 \mug de cada uno de los productos extracelulares purificados. Todas las inoculaciones se llevaron a cabo utilizando un volumen total de 0,1 ml. Los controles sometidos a inmunización simulada también se sometieron a una prueba cutánea con la misma dosis de la Combinación XIII. Los diámetros del eritema y el endurecimiento de las zonas de las pruebas cutáneas se evaluaron a las 24 horas de la inoculación.

Los datos se facilitan en la Tabla S siguiente en términos de valores medios evaluados para el grupo \pm error típico de estimación (SE), tal y como se determina mediante los métodos tradicionales.

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TABLA S Diámetro de la reacción cutánea (mm)

22

Una vez más, estos resultados muestran claramente que en los animales inmunizados con cada una de las tres dosis de la Combinación XIII se generó una respuesta inmune celular fuerte a la Combinación XIII. Los animales inmunizados presentaban un eritema de alrededor de dos y tres veces más que la de los controles. Más notablemente aún, los animales inmunizados presentaban un endurecimiento de al menos 35 veces más que las de los animales de control que presentaban una respuesta mínima en todos los casos.

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Ejemplo 20

Análisis de Inmunoprotección de la Combinación XIII en Tres Dosis Diferentes frente a M. tuberculosis Aerosolizado

Para demostrar aún más los aspectos de inmunidad protectora de las vacunas de la presente invención en diversas dosis, los cobayas inmunizados (6 por grupo) utilizados para la prueba anterior de hipersensibilidad cutánea fueron expuestos a M. tuberculosis aerosolizado tres semanas después de la última inmunización. La exposición al aerosol se llevó a cabo mediante el protocolo detallado en el Ejemplo 4. Simultáneamente se expuso un grupo de control de 12 animales sometidos a inmunización simulada.

Los resultados de las determinaciones de peso semanales tras la exposición se representan gráficamente en la Fig. 10 y muestran por separado que los cobayas inmunizados con cada una de las tres dosis de la Combinación XIII estaban protegidos frente a la pérdida de peso. Los animales inmunizados con dosis más altas de la Combinación XIII (100 y 200 \mug) mostraban de hecho una ganancia neta de peso, y los animales inmunizados con una dosis más baja (50 \mug) mostraban una pérdida de peso relativamente pequeña. Por el contrario, los animales sometidos a inmunización simulada perdieron aproximadamente el 22% del peso corporal total en las semanas inmediatamente posteriores a la exposición, y sufrieron una pérdida media de 182 g a lo largo de las 10 semanas del periodo de
observación.

La Tabla U siguiente ilustra el porcentaje de la variación de peso para los animales inmunizados y de control, tal y como se determina tomando el peso medio del final de la exposición, sustrayendo el peso medio del inicio de la exposición y dividiendo el resultado por el peso medio del inicio de la exposición. De forma similar, el porcentaje de la protección se determinó sustrayendo el porcentaje medio de la pérdida de peso de los animales de control del porcentaje medio de la ganancia o pérdida de peso de los animales inmunizados.

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TABLA U

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La Tabla U muestra que los animales sometidos a inmunización simulada perdieron una cantidad considerable de peso (18% - 29%) a lo largo del periodo de observación en comparación con los animales inmunizados. La Fig. 10 ofrece una ilustración más gráfica de la pérdida neta de peso para cada grupo de animales inmunizados frente a los animales de control marcada en intervalos semanales a lo largo de las diez semanas del periodo de observación. Dado que la pérdida de masa corporal o "consumo" es uno de los efectos secundarios clásicos de la tuberculosis, estos resultados indican que el crecimiento y la proliferación del bacilo tuberculoso en los animales inmunizados quedaron inhibidos por las tres diferentes dosis de la vacuna de la combinación del ejemplo de la presente
invención.

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Ejemplo 21

Análisis Inmunoprotector de las Combinaciones XIV-XVIII frente a la Exposición a las Combinaciones XIV-XVIII

Para demostrar aún más el alcance de la presente invención y la amplia gama de vacunas eficaces que pueden formularse conforme a la doctrina de la misma, se probaron cinco vacunas de combinación adicionales (Combinaciones XIV a XVIII) en cobayas. Identificada por el peso molecular aparente de los productos extracelulares purificados determinados mediante SDS-PAGE, la composición de cada una de las vacunas de las combinaciones se facilita a continuación.

101

Además de las vacunas con las nuevas combinaciones y los controles adecuados, la Combinación I también se utilizó con esta serie de experimentos. Los cobayas fueron inmunizados intradérmicamente con 50 \mug de cada proteína de la Combinación XIV o XV, y con 100 \mug de cada proteína de las Combinaciones I, XVI, XVII y XVIII, todas en adyuvante SAF. Los animales fueron inmunizados un total de cuatro veces con cada inoculación en intervalos de tres semanas.

Se llevó a cabo un ensayo de hipersensibilidad cutánea para determinar si los animales habían desarrollado una respuesta inmune evaluable tras la inoculación mediante el protocolo tratado anteriormente. Se afeitó el lomo a los cobayas y se les inoculó intradérmicamente la misma combinación de proteínas extracelulares purificadas frente a las que estaban inmunizados. Para cada exposición, se inoculó la vacuna de la combinación adecuada que contenía 10 \mug de cada proteína. Todas las inoculaciones se llevaron a cabo utilizando un volumen total de 0,1 ml. Los controles sometidos a inmunización simulada también se sometieron a una prueba cutánea con la misma dosis de cada combinación. Los diámetros del eritema y el endurecimiento de las zonas de las pruebas cutáneas se evaluaron a las 24 horas de la inoculación, tal y como se describe en el Ejemplo 3.

Los datos se facilitan en la Tabla V siguiente en términos de valores medios evaluados para el grupo \pm error típico de estimación (SE), tal y como se determina mediante los métodos tradicionales.

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TABLA V

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Estos resultados demuestran claramente que se ha generado una fuerte respuesta inmune celular fuerte para las Combinaciones XIV a XVIII y, al igual que anteriormente, para la Combinación I. Los animales inmunizados presentaban un eritema aproximadamente dos veces mayor que los animales de control. Más notablemente aún, los animales inmunizados presentaban un endurecimiento de al menos 10 veces más que el de los animales de control sometidos a inmunización simulada, que presentaban una respuesta mínima en todos los casos.

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Ejemplo 22

Análisis Inmunoprotector de las Combinaciones XIV-XVIII y de la Combinación I Frente a M. tuberculosis Aerosolizado

Para confirmar la inmunorreactividad de las vacunas de combinación del Ejemplo 21 y para demostrar su aplicación a la tuberculosis infecciosa, los cobayas inmunizados utilizados para las pruebas de hipersensibilidad cutánea anteriores se expusieron a M. tuberculosis aerosolizado tres semanas después de la última inmunización, y se les observó mediante el protocolo del Ejemplo 4. También fue expuesto de forma similar un grupo de control de 12 animales sometidos a inmunización simulada, el mismo que el utilizado en el Ejemplo 20. Los resultados de esta exposición se representan gráficamente en la Fig. 11, y se muestran en la Tabla W siguiente.

El porcentaje de la variación de peso se determinó tomando el peso medio del final de la exposición, sustrayendo el peso medio del inicio de la exposición y dividiendo el resultado por el peso medio del inicio de la exposición. De forma similar, el porcentaje de la protección se determinó sustrayendo el porcentaje medio de la pérdida de peso de los animales de control del porcentaje medio de la ganancia o pérdida de peso de los animales inmunizados.

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TABLA W

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Tal y como se muestra en la Tabla W, los cobayas inmunizados con cada una de las vacunas de las combinaciones estaban protegidos frente a la pérdida de peso. Los animales sometidos a inmunización simulada perdieron aproximadamente el 22% de su peso corporal combinado total. Por el contrario, el efecto profiláctico de las vacunas de la combinación dieron como resultado una ganancia de peso para uno de los grupos de la prueba y una cantidad reducida de pérdida de peso en los otros. Más específicamente, los animales inmunizados con la Combinación XIV mostraron una ganancia de peso del 3%, mientras que los animales inmunizados con las otras combinaciones únicamente perdieron entre el 4% y el 15% de su peso combinado total.

Estos resultados se muestran gráficamente en la Fig. 11, que representa las determinaciones de peso semanal en términos de ganancia o pérdida neta de peso para cada grupo de animales tras la exposición aerosolizada. Esta diferencia estadísticamente significativa entre la pérdida neta de peso para los animales inmunizados y los controles sometidos a inmunización simulada en la Fig. 11 aporta una nueva prueba para la respuesta inmunoprofiláctica generada por las vacunas de combinación de la presente invención.

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Ejemplo 23

Inmunidad Celular en Cobayas Inmunizados con Tres Adyuvantes Diferentes

Para demostrar aún más la amplia aplicación y versatilidad de las formulaciones de la vacuna de la presente invención, se llevaron a cabo unos estudios inmunogénicos utilizando distintos adyuvantes. En especial, tres inmunógenos diferentes, proteína purificada de 30 kDa, Combinación I (30, 32A, 16, 23, 71) y Combinación XIII (30, 32A, 16), estaba formulada cada una utilizando tres adyuvantes diferentes: Syntex Adjuvant Formulation I (SAF), adyuvante de Freund incompleto (IFA) y Monofosforil Lípido A con adyuvante (MPL). Dichos adyuvantes son conocidos por aumentar la respuesta inmune de un organismo cuando se administran con un inmunógeno.

Los cobayas fueron inmunizados intradérmicamente con 100 \mug de cada proteína que comprendía las Combinaciones I y XIII, y aproximadamente 100 \mug de proteína de 30 kDa purificada en cada una de las tres formulaciones de adyuvante diferentes. Los cobayas fueron inmunizados con cada formulación un total de tres veces con inoculaciones en intervalos de tres semanas.

Tras la inmunización, se llevó a cabo una prueba de hipersensibilidad cutánea para determinar si los cobayas habían desarrollado una respuesta inmune evaluable. A los cobayas se les afeitó el lomo y se les inoculó intradérmicamente el mismo inmunógeno para el que habían sido inmunizados. Para la exposición, se inocularon 10 \mug de cada proteína en las Combinaciones I a XIII o 10 \mug de proteína de 30 kDa purificada en un volumen total de 100 ml. A los cobayas sometidos a inmunización simulada, vacunados con uno de los tres adyuvantes, se les sometió a una prueba cutánea con cada una de las formulaciones inmunogénicas que contenían el mismo adyuvante. Los diámetros del eritema y el endurecimiento de las zonas de la prueba cutánea se evaluaron a las 24 horas de la exposición, tal y como se describe en el Ejemplo 3.

Los resultados de estos ensayos se reflejan en la Tabla X siguiente. Tal y como se ha tratado anteriormente, los datos se facilitan en valores medios de evaluación para el grupo \pm error típico de estimación, tal y como se determina mediante el uso de las técnicas estadísticas aceptadas.

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TABLA X

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Tal y como se desprende de los datos presentados en la Tabla X, las vacunas de combinación y los productos extracelulares purificados de la presente invención ofrecen una fuerte respuesta inmunogénica celular cuando se formulan con diferentes adyuvantes. Además, cada uno de los tres adyuvantes aportaba prácticamente la misma respuesta inmunogénica para cada inmunógeno respectivo. En general, los cobayas inmunizados presentaban unos eritemas con diámetros de aproximadamente entre siete y diez veces mayores a los de los cobayas sometidos a inmunización simulada, mientras que los endurecimientos fueron de aproximadamente entre cuatro y seis veces mayores que los evaluados en los animales de control.

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La posibilidad de la presente invención para provocar una fuerte respuesta inmonogénica en combinación con diferentes adyuvantes facilita la optimización de la vacuna. Es decir, los adyuvantes utilizados para producir unas formulaciones de vacunas eficaces conforme a las doctrinas del presente documento pueden seleccionarse basándose ampliamente en la consideración de criterios secundarios, como la estabilidad, ausencia de efectos secundarios, coste y facilidad de almacenamiento. Estos y otros criterios, no relacionados directamente con la estimulación de una respuesta inmune, son especialmente importantes cuando se desarrollan formulaciones de vacunas para un uso muy difundido en condiciones relativamente primitivas.

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Ejemplo 24

Análisis Inmunoprotector de las Combinaciones XIX-XXVIII frente a la Exposición a las Combinaciones XIX-XXVIII

El extenso alcance de la presente invención se ha demostrado ampliamente a través de la generación de una respuesta inmune utilizando diez vacunas de combinación adicionales, las Combinaciones XIX a XXVIII. Además de las vacunas de las nuevas combinaciones y de los controles adecuados, las Combinaciones IV y XII también se utilizaron como controles positivos para provocar una respuesta inmune en cobayas. Identificada por el peso molecular aparente de los productos extracelulares purificados determinados mediante SDS-PAGE, la composición de cada una de las vacunas de las combinaciones se facilita a continuación.

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102

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Los cobayas fueron inmunizados un total de cuatro veces con cada inoculación en intervalos de tres semanas. Cada vacuna de combinación utilizada para inmunizar a los animales estaba formada por 100 \mug de cada proteína en adyuvante SAF para aportar un volumen total de 0,1 ml.

Utilizando el protocolo tratado en el Ejemplo 3, se llevó a cabo una prueba de hipersensibilidad cutánea para determinar si los animales habían desarrollado una respuesta inmune evaluable tras la inoculación de la vacuna de combinación seleccionada. Se afeitó el lomo a los cobayas y se les inoculó intradérmicamente la misma combinación de proteínas extracelulares purificadas con las que estaban inmunizados. Las combinaciones de proteína utilizadas para exponer a los animales consistían en 10 \mug de cada proteína. Los controles sometidos a inmunización simulada también se sometieron a una prueba cutánea con la misma dosis de cada combinación. Al igual que en Ejemplo 3, los diámetros del eritema y el endurecimiento de las zonas de las pruebas cutáneas se evaluaron a las 24 horas de la inoculación.

Los resultados de estas mediciones se presentan en la Tabla Y siguiente, reflejados en términos de valores medios de evaluación para los grupos de animales \pm error típico de estimación.

TABLA Y

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Estos resultados reflejados en la Tabla Y demuestran de forma explícita que se ha generado una fuerte respuesta inmune celular frente a las Combinaciones XIX a XXVIII cuando se exponen a los mismos inmunógenos. Al igual que anteriormente, también se provocó una fuerte respuesta inmune celular por las Combinaciones IV y XIII. El eritema que presentaban los cobayas inmunizados era al menos dos veces, y generalmente se ha demostrado que era más de cuatro veces, mayor que la reacción provocada en los animales de control sometidos a inmunización simulada correspondientes. De forma similar, el endurecimiento que presentaban los animales inmunizados era de al menos dos, y por lo general de tres a cuatro veces, mayor que la de los controles no inmunizados. La respuesta inmune sustancialmente más fuerte generada entre los animales inmunizados conforme con las doctrinas de la presente invención ilustra una vez más la capacidad de operación inmunoprotectora de las vacunas de combinación de la presente invención.

Los expertos en la materia también apreciarán los beneficios adicionales de las vacunas y de los métodos de la presente invención. Por ejemplo, dado que los componentes individuales o las combinaciones seleccionadas de las especies moleculares altamente purificadas se utilizan para las vacunas objeto más que las bacterias en su totalidad o los componentes de las mismas, las vacunas de la presente invención son considerablemente menos probables de provocar una respuesta tóxica en comparación con las vacunas según la técnica anterior con bacterias atenuadas o muertas. Además, las vacunas moleculares de la presente invención no son potencialmente letales para los individuos con deficiencias inmunitarias. De hecho, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse con fines terapéuticos para estimular una respuesta inmune directa a un agente patógeno en un individuo infectado.

El uso selectivo de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes o sus análogos inmunogénicos también evitan el desarrollo de la respuesta humoral opsonizante que puede aumentar la patogénesis de bacterias intracelulares. Dado que la inmunidad protectora generada por esta invención está dirigida a las proteínas libres, toda respuesta opsónica tendrá como resultado la fagocitosis y la destrucción del producto extracelular mayoritariamente abundante, en lugar de la inclusión acelerada de las bacterias parásitas. Además, el uso selectivo de los productos extracelulares purificados reduce la posibilidad de generar una respuesta que impida el uso de las técnicas de detección y control basadas en el reconocimiento de agentes inmunogénicos por parte del hospedador. A diferencia de las vacunas según la técnica anterior, las pruebas de detección aún podrían llevarse a cabo utilizando una molécula inmunorreactiva que está expresada por el patógeno, pero no incluida en las vacunas realizadas conforme a la presente invención. El uso de un determinante inmunogénico tal únicamente podría provocar una respuesta en aquellos individuos que habían sido expuestos al patógeno diana permitiendo que se tomen las medidas adecuadas.

Otra ventaja de la presente invención es que los productos extracelulares purificados se obtienen con facilidad en grandes cantidades y se aíslan rápidamente mediante las técnicas conocidas por los expertos en la materia, en contraposición a las bacterias atenuadas y componentes bacterianos de las vacunas de las técnicas anteriores. Dado que los productos inmunorreactivos de la presente invención se liberan de forma natural de forma extracelular al medio que lo rodea en la mayoría de los organismos de interés, se simplifica la eliminación de los contaminantes intracelulares y fragmentos celulares. Así, como los productos extracelulares más prominentes o mayoritariamente abundantes o sus análogos inmunogénicos se utilizan para estimular la respuesta inmune deseada, los niveles de expresión y las concentraciones de cultivo del producto susceptible de captación son generalmente elevados en la mayoría de los sistemas de producción. Por consiguiente, sea cual sea la forma de producción que se emplee, el aislamiento a gran escala de los productos deseados puede obtenerse fácilmente a través de los procesos bioquímicos rutinarios, como la cromatografía o la ultrafiltración. Estos atributos inherentes y las características moleculares de los determinantes inmunogénicos utilizados en la presente invención facilitan enormemente la producción de una composición coherente, normalizada y de alta calidad para su uso a gran escala.

De forma alternativa, el uso de componentes moleculares purificados basados en las propiedades inmunogénicas de los productos extracelulares más predominantes o mayoritariamente abundantes de los patógenos diana también facilita relativamente la generación sintética a gran escala de los componentes inmunorreactivos de la vacuna de la presente invención. Por ejemplo, los productos extracelulares de interés o sus análogos inmunogénicos pueden clonarse en una bacteria hospedadores no patógena mediante la tecnología de ADN recombinante y recogerse con seguridad. Las técnicas de clonación molecular bien conocidas entre los expertos en la materia pueden utilizarse para aislar y expresar el ADN correspondiente en los productos extracelulares de interés, sus homólogos o cualquiera de sus segmentos en vectores de alta expresión seleccionados para su inserción en bacterias hospedadores, como la Escherichia coli. Pueden encontrarse técnicas a modo de ejemplo en II R. Anon, Synthetic Vaccines 31-77 (1987), Tam et al, Incorporation of T and B Epitopes of the Circumsporozoite Protein in a Chemically Defined Synthetic Vaccine Against Malaria, 171 J. Exp. Med. 299-306 (1990), y en Stover et al, Protective Immunity Elicited by Recombinant Bacille Calmette-Guerin (BCG) Expressing Outer Surface Protein A (OspA) Lipoprotein: A Candidate Lyme Disease Vaccine, 178 J. Exp. Med. 197-209 (1993).

De forma similar, las proteínas extracelulares, sus análogos, homólogos o subunidades de proteínas inmunorreactivas pueden sintetizarse químicamente a gran escala en una forma relativamente pura mediante técnicas comunes de laboratorio y a través de la tecnología de secuenciador automatizado. Esta forma de producción es especialmente atractiva para construir subunidades de péptidos o análogos con un peso molecular inferior correspondientes a determinantes antigénicos de los productos extracelulares. Entre los expertos en la materia se conocen técnicas a modo de ejemplo para la producción de subunidades proteicas menores, y pueden encontrarse en II R. Anon, Synthetic Vaccines 15-30 (1987), y en A. Streitwieser, Jr., Introduction to Organic Chemistry 953-55 (3rd ed. 1985). Se pueden encontrar técnicas alternativas en Gross et al, Nonenzymatic Cleavage of Peptide Bonds: The Methionine Residues in Bovine Pancreatic Ribonuclease 237 The Journal of Biological Chemistry No. 6 (1962), Mahoney, "High-yield Cleavage of Tryptophanyl Peptide Bonds by o-Iodosobenzoic Acid," 18 Biochemistry No. 17 (1979), y en Shoolnik et al, "Gonococcal pili," 159 Journal of Experimental Medicine (1984). Otras técnicas inmunogénicas, como las relacionadas con idiotipos o la evolución molecular directa mediante péptidos, nucleótidos u otras moléculas como miméticos también pueden utilizarse para generar compuestos eficaces inmunorreactivos capaces de producir la respuesta profiláctica deseada. Las técnicas anteriores a esta para la utilización de ADN desnudo como vacuna pueden encontrarse en Robinson, Protection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunization with a Hemagglutinin-Expressing Plasmid DNA, 11 Vaccine 9 (1993), y en Ulmer et al., Heterologous Protection Against Influenza by Injection of DNA Encoding a Viral Protein, 259 Science (1993). De forma alternativa, algunas técnicas para la fusión de una cola de proteína fuertemente inmunogénica se ha plasmado en Tao et al., Idiotype/Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma, 362 Nature (1993), y para la cartografía de los epítopos de células T en Good et al., Human T-Cell Recognition of the Circumsporozoite Protein of Plasmodium Falciparum: Immunodominant T-Cell Domains\cdotMap to the polymorphic Regions of the Molecule, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), y Gao et al., Identification and. Characterization of T Helper Epitopes. in the Nucleoprotein of Influenza A Virus, 143 The Journal of Immunology No.9 (1989).

Debería volver a hacerse hincapié en que la prevalencia de la homología entre especies en el ADN y en las proteínas correspondientes de los microorganismos permite a las vacunas de la presente invención inducir una inmunidad reactiva cruzada. Dado que los epítopos inmunodominantes de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes pueden aportar una inmunidad protectora cruzada contra la exposición con otros serogrupos y especies de los géneros seleccionados, los expertos en la materia apreciarán que las vacunas destinadas contra una especie pueden desarrollarse mediante los productos extracelulares o sus análogos inmunogénicos de otras especies.

Por ejemplo, M. bovis está entre el 90% y el 100% de homología con M. tuberculosis, y tiene una característica de gran reacción cruzada en lo que respecta a provocar respuestas inmunes. Por consiguiente, las vacunas basadas en productos extracelulares abundantes de M. bovis u otras Micobacterias pueden aportar varios grados de protección contra la infección por M. tuberculosis y viceversa. Así, se contempla para aportar una respuesta inmunoprofiláctica contra varias especies bacterianas del mismo género mediante un determinante inmunogénico altamente homólogo de un producto extracelular mayoritariamente abundante adecuado.

También debemos hacer hincapié en que el determinante inmunogénico seleccionado para llevar a cabo la presente invención puede utilizarse en muy distintas formas para causar una respuesta inmune eficaz. Así, la presentación de uno o más determinantes inmunogénicos de productos extracelulares mayoritariamente abundantes seleccionados al sistema inmunitario del hospedador no es crítico y puede alterarse para facilitar su producción o su administración. Por ejemplo, las vacunas de la presente invención pueden formularse mediante productos extracelulares enteros o cualquier fracción inmunoestimulante de los mismos, entre los que se incluyen péptidos, subunidades proteicas, análogos y homólogos inmunogénicos, tal y como se cita anteriormente. Las subunidades más pequeñas de proteína de los productos extracelulares mayoritariamente abundantes y de sus análogos moleculares se encuentran dentro del alcance de la presente declaración siempre que provoquen una inmunoprofilaxis eficaz. Además, los productos proteicos recombinantes como las proteínas de fusión o los productos extracelulares modificados mediante técnicas recombinantes moleculares conocidas son totalmente compatibles con la doctrina de la presente invención. Asimismo, los análogos generados de forma inmunogénica de los determinantes inmunoactivos seleccionados, como los anticuerpos anti idiotipos, o los péptidos y nucleótidos derivados mediante evolución dirigida también están dentro del alcance de la invención.

De igual modo, la formulación y presentación del agente inmunogénico al sistema inmunitario del hospedador no se limita a las soluciones de proteínas o sus análogos en adyuvante. Por ejemplo, el determinante inmunogénico derivado de las proteínas extracelulares adecuadas puede expresarse en una especie diferente de bacterias, fagos, micoplasma o virus que es no patógeno y está modificado mediante la tecnología recombinante. En tales casos, el organismo vivo entero puede formularse y utilizarse para estimular la respuesta deseada.

Por otro lado, los programas de vacunación a gran escala en ambientes hostiles pueden necesitar unas formulaciones muy estables sin aditivos ni adyuvantes complicados. Además, la formulación de la vacuna podría estar dirigida a facilitar la estabilidad o inmunorreactividad del componente activo cuando se somete a condiciones hostiles, como la liofilización o la administración oral o la encapsulación. Por consiguiente, la presente invención incluye unas formulaciones infinitamente diferentes de los determinantes inmunogénicos que comprenden las vacunas objeto en función del uso previsto del producto.

Los expertos en la materia apreciarán que las dosis de la vacuna deberían determinarse para cada patógeno y hospedador mediante los experimentos rutinarios. Actualmente se cree que la dosis práctica más baja será del orden de 0,1 \mug, aunque también pueden ser óptimas para el sistema pertinente las dosis de 2,0 \mug, 20,0 \mug, 100 \mug e incluso de 1 mg. La dosis adecuada puede administrarse mediante las técnicas y secuencias convencionales de inmunización conocidas entre los expertos en la materia.

Los expertos en la materia también apreciarán que la presente invención puede materializarse en otras formas específicas. Por consiguiente, la presente invención no se limita a los modelos especiales que se han descrito con detalle en este documento. Al contrario, debe hacerse referencia al hecho de que las reivindicaciones adjuntas son indicativas del alcance y contenido de la presente invención.

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1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Horwitz, Marcus A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Productos Extracelulares Abundantes y Métodos para su Producción y {}\hskip4,7cm Uso.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Kurt A. MacLean

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2029 Century Park East, Suite 3800

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Los Ángeles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 90067

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

SOPORTE DE LECTURA INFORMÁTICO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS.

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: Patent In Release #1.0. Versión 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN: 424

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

ABOGADO/INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Maclean, Kurt A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.118

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 104-223

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DATOS DE CONTACTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 310-788-5000

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 310-277-1297

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. N.º 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,3cm

42

Claims (6)

1. Un agente de vacunación para su uso en la estimulación de una respuesta inmune protectora, en un hospedador mamífero, contra el patógeno infeccioso Mycobacterium tuberculosis; dicho agente de vacunación consta de:

al menos una proteína extracelular mayoritariamente abundante purificada y aislada de Mycobacterium tuberculosis, seleccionada a partir del grupo consistente en proteína de 30 kDa y 32A kDa, donde dicha proteína de 30 kDa de Mycobacterium tiene una secuencia de aminoácidos N terminal que comprende residuos de 1 a 40 de SEC. ID N.º 15, y dicha proteína de 32A kDa de Mycobacterium tiene una secuencia de aminoácidos N terminal que comprende los residuos FSRPG LPVEY LQVPS PSMGR DIKVQ FQSGG ANSP- LYLLD.

2. El agente de vacunación de la reivindicación 1 donde dicha proteína extracelular principal Mycobacterium es la proteína extracelular principal Mycobacterium de 30 kDa.

3. El agente de vacunación de la reivindicación 1 donde dicha proteína extracelular principal Mycobacterium es la proteína extracelular principal Mycobacterium de 32A kDa.

4. Un agente conforme a la Reivindicación 1; dicho agente consta de una mezcla de proteínas extracelulares mayoritariamente abundantes aisladas y purificadas de Mycobacterium tuberculosis, seleccionadas del grupo consistente en:

proteína de 30 kDa y proteína de 32A kDa;

proteína de 30 kDa y proteína de 23,5 kDa;

proteína de 30 kDa y proteína de 16 kDa;

proteína de 30 kDa y proteína de 32A kDa y proteína de 16 kDa;

proteína de 30 kDa y proteína de 32A kDa y proteína de 23,5 kDa;

proteína de 32A kDa, proteína de 30 kDa, proteína de 24 kDa, proteína de 23 kDa y proteína de 16 kDa;

proteína de 32A kDa, proteína de 32B kDa; proteína de 30 kDa y proteína de 23 kDa y proteína de 16 kDa;

proteína de 32B kDa y proteína de 30 kDa; y

proteína de 30 kDa y proteína de 23 kDa;

donde dicha proteína de 24 kDa de M. tuberculosis tiene una secuencia de aminoácidos N terminal que consta de los residuos APYEN LMVPS PSMGR DIPVA FLAGG PHAVY LLDAF NAGPD VSNWV TAGNA MMTLA -KGIC/S, dicha proteína de 23,5 kDa de M. tuberculosis tiene una secuencia de aminoácidos N terminal que consta de los residuos APKTY -EELK GTD, dicha proteína de 23 kDa de M. tuberculosis tiene una secuencia de aminoácidos N terminal que consta de los residuos AETYL PDLDW DYGAL EPHIS GQ, dicha proteína de 32B kDa de M. tuberculosis tiene una secuencia de aminoácidos N terminal que consta de los residuos FSRPG LPVEY LQVPS
A-MGR DI, dicha proteína de 16 kDa de M. tuberculosis tiene una secuencia de aminoácidos N terminal que consta de los residuos AYPIT GKLGS ELTMT DTVGQ VVLGW KVSDL F/YKSTA VIPGY TV-EQ QI.

5. El agente de la reivindicación 1 o 4 que también consta de un adyuvante.

6. El agente de la reivindicación 1 o 4, donde el mamífero hospedador es un humano.