CN1142231A - 丰富的细胞外产物和其生产与使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了基于最丰富的病原体细胞外产物组合的疫苗和其使用与生产方法。不考虑其绝对分子免疫原性选择靶病原体的最普遍或主要丰富细胞外产物，并用作疫苗，以刺激哺乳动物宿主体内抗继后靶病原体感染的保护性免疫反应。可根据其各自的N末端氨基酸序列鉴定主要丰富细胞外产物并区分之。因为疫苗可包含细胞外产物的不同组合，所以本发明提供了宽范围有效的免疫治疗组合物。除了其他感染因子外，可使用如此产生的疫苗刺激对抗细胞内病原体特别是结核分枝杆菌的有效免疫反应。
Description
与相关申请的相互参照
本申请是1993年11月23日提交的序号为156，358的共同未决美国专利申请的部分继续申请，在此引用前者作为参考。与政府的关系
发本明是在政府支持下完成的，卫生部(the Department ofHealth and Human Services)给与的授权号为A1-31338。政府对本发明享有某些权利。
发明的领域
本发明总地涉及免疫治疗剂和抗病原性生物体如细菌、原生动物、病毒和真菌的疫苗。更具体的说，与基于表现有最大或最特异分子免疫原性之病原体亚单位或产物的现有的技术疫苗及免疫治疗剂不同，本发明使用由选择的病原体如结核分枝杆菌(Mycobat-terium tuberculosis)释放的最普遍或主要丰富的免疫原决定簇刺激哺乳动物宿主体内的有效免疫反应。因此，通过本发明产生的获得免疫性和免疫治疗活性是针对那些在病原体感染期间最常展现于被感染宿主细胞上的抗原标志的，而没有特别考虑所投用之化合物的相关或绝对免疫原性。
发明的背景
很早即已了解到，寄生微生物具有感染动物因而引起疾病并常常致使宿主死亡的能力。致病因子在整个历史上一直是死亡的主要原因并且继续使人遭受巨大痛苦。虽然近百年来在预防和治疗许多传染病中已取得了显著进展，但复杂的宿主-寄生物相互作用仍限制治疗手段的普遍有效性。各种疾病如结核复发，以及许多细菌和病毒抗药株的出现证明了在对抗由许多病原性载体展示之精细侵染机制中的困难。
在流行病学所涉及的主要病原因子中，已证明细胞内细菌在治疗或预防手段面前是特别难以处理的。包括分枝杆菌属和军团菌属在内的细胞内细菌在被感染宿主生物体的细胞内而不是细胞外完成其全部或部分生活周期。在世界范围内，每年有数百万人死于细胞内细菌感染并遭受巨大痛苦。由结核分枝杆菌引起的结核病是全世界传染病死亡的主要原因，每年有一千万新的病例并有两千九百万人死亡。另外，有数百万麻风病例是由细胞内细菌感染引起的。由细胞内致病因子传播的其他致衰弱性疾病包括皮肤和内脏利什曼病、南美洲锥虫病(恰加斯氏病)、李司忒氏病、弓形体病、组织胞浆菌病、沙眼、鹦鹉热、Q热以及包括Legionnaires氏病在内的军团菌病。目前，对于接触这些生物体的敏感个体来说，为预防致衰弱性感染所能采取的措施相对很少。
由于不能够有效地保护人群免于受结核侵染和由结核病引起的人类固有发病率和死亡率，所以结核病是人类面临的最重要的疾病之一。更具体地说，主要由结核分枝杆菌引起的人肺结核是发展中国家病人死亡的一种主要原因。由于能够在巨噬细胞和单核细胞内存活，所以结核分枝杆菌可以产生慢性细胞内感染。通过将其本身隐蔽在主要负责检出外来成分的细胞内并且继而激活免疫系统，结核分枝杆菌即可相对成功地侵犯宿主生物体的正常防御机制。因此这些同样的病原特征阻碍了抗结核感染之有效免疫治疗剂或疫苗的发展。同时结核杆菌相对比较容易培养及在实验室条件下观察。因此，结核分枝杆菌特别适合于证明本发明的原理和优点。
本领域技术人员将会理解，下文举例讨论的结核分枝杆菌绝不是用来限制本发明处理结核分枝杆菌的范围。同样，本文所述技术并不是限于治疗结核感染。相反，可使用本发明有利地提供用于对抗任何表达细胞外产物之病原因子的免疫决定簇并因而抑制那些生物体传染性传播的安全而有产的疫苗和免疫治疗剂。
据了解，目前大约有全世界人口的半数感染结核分枝杆菌，致使每年出现数百万肺结核病例。虽然这种疾病主要是在拉丁美洲、非洲和亚洲的发展中国家传播，但在第一世界国家也有较大的流行趋势。在美国的特定人群特别是贫困、免疫受损个体和来自高流行区域的移民也处于高危险发病的危险状态。在发达国家主要由于艾滋病流行，目前结核病的发生率也在不断增加，而且常常是以多药物抗性结核分枝杆菌的形式传播。
最近，在美国50个州中36个州报导了抗一种或多种药物的结核病。在纽约市，1991年检验的所有病例中有三分之一是抗一种或多种主要药物的。虽然非抗性结核病可以经长期使用抗生素得以治愈，但涉及药物抗性菌株的治疗前景仍是暗淡的。受抗两种或多种主要抗生素之菌株感染的病人死亡率约为50％。因此，特别需要抗结核分枝杆菌的这些变种的安全而有效的疫苗。
因为病原体在湿的或干燥的痰中仍可继续存活数周或数月，所以通过吸入气雾化的颗粒几乎总会发生结核分枝杆菌的最初感染。虽然原感染部位是在肺部，但这种生物体也可以感染骨、脾脏、脑膜及皮肤。根据特定菌株之毒力及宿主抵抗力的不同，感染及对组织的相应损伤可以很小或范围很大。在人类病例中，大多数接触到毒性菌株的个体的初始感染均受到控制。在初始攻击后获得性免疫的发展减少了细菌的增殖，从而使损伤愈合，大多数人没有症状但可能有传染性。
当结核分枝杆菌没有被经受感染的病人控制时，常常导致肺组织的广泛退化。在敏感个体中，通常在肺中的损伤是因为结核菌在肺泡或肺巨噬细胞内繁殖而形成的。随着该生物体繁殖，它们可通过淋巴系统扩散到远处淋巴结并通过血液系统扩散到肺顶，骨髓、肾脏和包绕脑的脑膜。主要由于细胞介导的超敏感性反应，与感染的严重程度成比例地产生特征性肉芽肿损伤或结核。这些损伤由周边有单核细胞、淋巴细胞和成纤维细胞的上皮样细胞组成。在大多数例子中，损伤或结核最终发生坏死并经受干络性坏死。
虽然结核分枝杆菌是一种重要的病原体，但分枝杆菌属的其他菌种也可引起动物包括人的疾病，并显然也包括在本发明的范围内。例如，牛分枝杆菌(M.bovis)与结核分枝杆菌密切相关并负责牛、猪、羊、马、狗和猫等家畜的结核感染。另外，牛分枝杆菌可通过肠道，特别是由消化牛奶而感染人。定位的肠道感染最终播散到呼吸道，之后出现短时结核病的典型症状。分枝杆菌属的另一个重要致病载体是造成数百万古老疾病麻风病病例的麻风分枝杆菌。引起包括人在内的动物疾病的其他分枝杆菌属细菌包括堪萨斯分枝杆菌(M.Kansasii)、鸟细胞内分枝杆菌(M.avium intracellulare)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、海分枝杆菌(M.marinum)、龟分枝杆菌(M.chelonei)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、溃疡分枝杆菌(M ulcer-ans)，田鼠分枝杆菌(M.microti)和瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)。病原分枝杆菌菌种在其各自DNA和相应蛋白质序列上表现有高度同源性，并且某些菌种如结核分枝杆菌和牛分枝杆菌又是密切相关的。
基于明显的实践的道德原因，在人体内确定实验组合物对这些病痛的效力的最初工作是不能实行的。因此，由于安全和费用的原因，在早期开发任何药物或疫苗中的常规方法是使用适当的动物模型。基于了解到免疫优势表位常常在不同种宿主中都是有活性的，而推测到实用实验动物模型的成功。因此，一个种例如啮齿动物或者豚鼠中的免疫原性决定簇一般在不同种如人体内也是有免疫反应性的。只有在充分地建立了适当的动物模型之后才能进行人体临床试用，以进一步证明疫苗在人体内的安全性和效力。
就结核分枝杆菌的肺泡和肺感染来说，豚鼠模型在许多方面十分接近于人体疾病的病理学。因此，本领域技术人员将会理解到，将这种疾病的豚鼠模型延推到人和其他哺乳动物是适当的。同人一样，豚鼠对低剂量气雾化人病原体结核分枝杆菌的结核性感染是敏感的。与初始感染通常受到控制的人不同，豚鼠在接触气雾化病原体后持续发展传播性疾病，而有利于继后的分析。另外，豚鼠和人均呈现以发展致密单核细胞硬化或在皮肤试验部位的硬化区域为特征的迟发性皮肤超敏性反应。最后，人和豚鼠的特征性结核损伤表现出包括存在朗汉氏巨细胞在内的相似形态学。因为豚鼠比人对初始感染更敏感，并且疾病进展更快，所以在使用这一动物模型的实验中，赋予的任何保护作用都将为在人或其他不太敏感的动物中可能产生的同样保护性免疫提供更强的指征。因此，仅仅为了解释而不是限制目的，本发明主要将以豚鼠作为哺乳动物宿主来加以证明。本领域技术人员将会理解到，可用包括人和家养动物在内的其他哺乳动物来实现本发明。
受到病原载体特别是细胞内微生物感染的任何动物或人都难以激发宿主免疫系统。虽然体液反应和相应的保护性抗体的产生可以有效地控制许多感染因子，但这些机制主要是对那些定位于身体中细胞外液内的病原体有效。特别是，调理抗体与细胞外的外来因子结合，从而使它们对吞噬作用敏感并继而在细胞内杀伤之。但对其他一些病原体则不是这种情况。例如，以前的研究表明，体液免疫反应对抗细胞内细菌如结核分枝杆菌的感染似乎没有起到明显的保护作用。然而，本发明可产生对靶病原体的有利的体液反应，照此，其效果即不只限于受刺激之免疫反应的任何特定成分。
更具体地说，抗体介导的防御作用似乎并不阻止细胞内病原体的初始感染，并且一旦细菌被掩蔽在宿主细胞内则将起不到防御功能。作为水溶性蛋白质，抗体可以穿过细胞外液和血液，但难以通过细胞的脂质膜迁移。另外，抗细菌表面结构之调理抗体的产生可能实际上帮助细胞内病原体进入宿主细胞。因此，任何抗细胞内因子如结核分枝杆菌的有效预防手段都应加入一种攻击性细胞介导的免疫反应成分，以导致抗原特异性淋巴细胞的迅速增殖，借以激活遭损的巨噬细胞或借助细胞毒性清除之。但正如下文中将要详细讨论的，诱导细胞介导的免疫反应并不等于诱导保护性免疫。虽然细胞介导的免疫可能是保护性免疫的先决条件，但按照本发明的技术生产疫苗，还需要进行动物攻击研究。
这种细胞介导的免疫反应一般包括两个步骤。第一步是用可将病原体的碎片输送到细胞表面上的特异性分子(主要组织相容性分子或称MHC分子)完成对被感染细胞的信号标记。这些MHC分子与已在被感染细胞内降解的细菌蛋白质的小片段结合，并将其呈现于细胞表面。它们在T细胞上的呈现刺激宿主的免疫系统，借以清除被感染的宿主细胞或诱导宿主细胞消灭定居在细胞内的所有细菌。
与大多数传染性细菌不同，包括结核分枝杆菌在内的分枝杆菌属细菌倾向于在液泡内增殖，而这些液泡实质上是通过膜与细胞的其余部分封离的。吞噬细胞天然形成这些保护性液泡而使它们对这类病原体的感染特别敏感。在这样的空泡中，细菌可有效地免于被降解，使免疫系统难于在被感染细胞的表面上呈现整合的细菌成分。然而，被感染细胞的MHC分子将移向液泡并收集所有游离的(释放的)细菌产物，或者移向宿主细胞中已输送了外来细胞外细菌产物的其他部位，以便在细胞表面上正常呈递这些产物。如以前证明的，外来细菌产物的呈递将诱发宿主免疫系统的适当反应。
细胞内病原体提出的涉及免疫系统的问题也构成了对疫苗开发的特殊挑战。迄今为正，抗分枝杆菌感染特别是抗结核分枝杆菌感染之有效疫苗的生产已使大多数研究者感到困惑。目前，广泛利用的抗细胞内病原体的疫苗只是活的减毒疫苗BCG(即强毒力牛分枝杆菌菌株疫苗)，以其作为对抗结核菌的预防工具。在1988年，世界卫生组织在印度进行的深入研究确定，最好的BCG疫苗的效率也如此的低以致于检测不到。尽管有这样成问题的效力，BCG疫苗仍一直在全世界结核病高发地区广泛使用。更严重的问题是，甚至已接种了BCG的人也常常产生对结核菌素的敏感性，从而否定用来进行结核病筛选和控制的最常用皮肤试验的有用性。
涉及使用活的减毒疫苗如BCG的另一个严重问题是可能在免疫低下病人体内引发致命性疾病。这些疫苗可对有受压抑的细胞介导性免疫的人造成一种特殊的危险，这是因为它们降低了对抗迅速增殖诱导之感染的能力。这样的个体包括因营养不良和恶劣生活条件而身体虚弱的人、器官移植接受者，以及受HIV感染者。就使用BCG疫苗来说，高危险个体还包括患有肺部疾患如肺气肿、慢性支气管炎、尘肺、矽肺或以前有结核病者。因此，应只限于在具有最大潜在收益的特殊人群中使用减毒的疫苗。
使用活减毒疫苗还可能产生其他不期望的副作用。因为活疫苗可在接受者体内再生，所以它们可以比非传染性疫苗产生更宽范围的抗体和更小的细胞介导的针对性免疫反应。这种鸟枪法常常会阻断针对那些最常参予细胞预防作用之分子结构的免疫反应。另外，使用有完整膜结构的活疫苗可诱导产生调理抗体，借以制成一种有效预防所需的外来体。因此，在宿主接触到靶微生物的毒性株之后，这些抗体的存在实际上可增加非减毒病原体在宿主细胞内的摄入，并在其中存活和增殖。再者，减毒的疫苗含有数千种不同的分子并因而更可能含有有毒的或能够在病人体内引发不利免疫反应的分子。与使用活疫苗有关的其他问题包括毒性逆转、天然传播接触、污染病毒和病毒干扰，以及难于实现标准化。
同样，非传染性疫苗如针对强抗原性膜结合结构的死微生物或常规第二代亚单位疫苗，在抑制细胞内细菌方面受到限制。与减毒疫苗一样，杀死的细菌也引发可抑制大多数有效的预防性决定簇的普遍反应。另外，死疫苗仍存在大量针对免疫系统的潜在抗原结构，从而增加毒性反应或免疫系统调理作用的可能性。包含膜结合结构的传统的亚单位疫苗(无论是合成的还是纯化的)也可能诱导强的调理作用，而有利于细胞内病原体进入巨噬细胞并在其中繁殖。抗细胞内表面抗原的死疫苗可通过增加细菌包涵的速率来增加病原因子的相对毒力。因此，在细胞内病原体的情况下可能不适于使用抗强抗原性细菌表面成分的常规减毒或死疫苗。
为了避免与使用传统疫苗相关的问题，已使用细胞外蛋白质或其免疫原性类似物发展了新的疫苗，借以刺激针对特异性细胞内病原体的保护性免疫。例如，本发明人的美国专利No.5,108,745(1992年4月28日公布)公开了产生抗亲肺军团菌(Legionella pneu-mophila)和结核分枝杆菌及其他细胞内病原体之保护性免疫的疫苗和方法。这些现有疫苗总地是基于最初衍生于蛋白质化合物的细胞外严物，所说的蛋白质化合物是由病原菌向细胞外释放到体外培养中的，以及由体内被感染宿主细胞内的细菌向细胞外释放的。如文中所公开的，这些疫苗是基于选择性鉴定那些能刺激抗哺乳动物宿主体内靶病原体之强免疫反应的细胞外产物或其类似物而制得的。
更具体地说，通过检测其在对感兴趣病原体有免疫性之哺乳动物体内引发强淋巴细胞增殖反应或皮肤迟发型超敏反应的能力，来筛选这些现有的候选细胞外蛋白质。虽然这种已公开的方法及相关疫苗避免了许多使用传统疫苗固有的缺点，但由于交叉反应性和宿主改变可能使对有效免疫制剂的选择复杂化而抵削免疫反应效果。因此，虽然分子免疫原性是有效疫苗的指标之一，但其他一些因素则可能使其在体内引发有效免疫反应中产生难以解决的问题。
更重要的是，已令人惊奇地发现，特别是就结核分枝杆菌来说，鉴定有效保护性免疫诱导疫苗的常规现有技术方法是很不方便而且可能是无效的。例如，对大批量结核分枝杆菌细胞外蛋白质进行SDS-PAGE分析，然后进行常规Western印迹分析的目的是鉴定这些细胞外成分中最具免疫原性的部分，结果产生了不一致的结果。已报导的试验没有鉴定出来应产生最强免疫原性反应的细胞外产物，并因而与原来的想法相一致，也就没有发挥其作为最有效疫苗的功能。结核分枝杆菌的许多细胞外产物都是本领域已知的，已经作了鉴定并且有些还测定了序列。另外，与任何外来蛋白质一样，可以显示这些已知化合物诱导了免疫反应。然而，本领域没有证据直接表明这些已知化合物可诱导如传统鉴定的保护性免疫。
因此，本发明的一个主要目的是提供疫苗或免疫治疗剂及其生产方法和在引发抗传染性细菌病原体之有效免疫反应中的应用，其并不依赖于传统疫苗考虑及基于高特异性、强免疫原可操作性的选择技术。
本发明的另一个目的是提供疫苗或免疫治疗剂及其用于在哺乳动物宿主体内赋予对抗包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟细胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌、非洲分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌在内之细胞内病原体获得性免疫的方法。
本发明的再一个目的是提供容易产生的疫苗和免疫治疗剂。其相对于死疫苗或减毒疫苗表现有降低的毒性。发明的概要
本发明通过提供用作疫苗和/或免疫治疗剂的化合物及其生产方法以在哺乳动物宿主体内产生抗病原体感染的保护性或治疗性免疫反应而实现了上述及其他目的。总地说来，本发明提供了诱导对抗细胞外化合物生成性传染载体之保护性或治疗性免疫反应的手段。虽然本发明的化合物对抗病原菌是特别有效的，但它们可用于产生保护性或治疗性免疫反应，以对抗生成主要丰富细胞外产物的任何病原体。
对本发明来说，术语“主要丰富的”应理解为一个认定那些由感兴趣的病原体以最大量释放之细胞外产物的相对术语。例如，就在各种不同培养条件下生长至光密度约为0.5的结核分枝杆菌而言，本领域技术人员可望获得10μg/mL数量级或更多的主要丰富细胞外产物。因此，于正常或热休克条件下生长的结核分枝杆菌的总共4mg/L细胞外产物的总产量中，大约100份已知细胞外产物中的约15至20份(单独或合并的)将构成总量的约90％。这些是期望包括于本发明范围内的主要丰富细胞外产物，并很容易作为SDS-PAGE凝胶中出现的宽带得以识别。另外，可进一步鉴定感兴趣的细胞外产物并根据氨基酸序列分析结果区别之。其余的细胞外产物比较少。本领域技术人员也将理解到，依据培养条件的不同，特异性主要细胞外产物的相对定量丰度可以有所变化。然而，在大多数情况下，个别主要丰富细胞外产物的认定将不会改变。
因此，本发明可用于保护哺乳动物宿主不受病毒、细菌、真菌或原生物物病原体感染。应提到的是，在某些情况下如在病毒感染中，可由受感染的宿主细胞产生主要丰富细胞外产物。虽然有对抗所有释放主要丰富细胞外产物的微生物，但本发明的疫苗和方法在产生抗细胞内病原体包括不同种和血清型结核分枝杆菌的保护性免疫中是特别有效的。本发明的疫苗作为治疗已有疾病的免疫治疗剂也是有效的。
本发明人已令人惊奇地发现，用由细菌病原体细胞外释放的最丰富或主要丰富产物或其免疫原性类似物进行免疫可引发有效的免疫反应，而不考虑给药化合物的绝对免疫原性。由于它们是从微生物体内释放的并因而可被宿主分子利用来参予抗原加工和呈递，以及由于它们在感染期间在组织中的天然高浓度，所以病原因子的主要丰富细胞外产物比其他细菌成分更常受到加工并呈递于宿主免疫系统。就细胞内病原体来说，主要丰富细胞外产物呈现于被感染之宿主细胞表面上的主要免疫原性决定簇并因此而在周围环境中表现有更大的存在量。因此，抗病原微生物之主要丰富细胞外产物的获得性免疫允许宿主防御系统迅速检出隔离在宿主细胞内的病原体并有效地抑制它们。
更具体地说，由病原菌释放的主要丰富产物似乎是由吞噬细胞和其他宿主免疫系统机制以比不太普遍的或膜结合的病原成分更大的速率加工的，而不管它们各自的免疫原活性或特异性如何。当病原因子是一种与正常免疫活性隔绝的细胞内细菌时，这种免疫加工不一致性是特别重要的。借助于它们大量和连续地呈递于被感染之宿主免疫系统，最广泛的细菌细胞外产物或其免疫原性类似物可引发强烈的免疫反应，而大可不必顾及它们各自的分子免疫原性特征。
主要丰富细胞外产物是由靶病原体释放到周围环境中之蛋白质和其他分子实体的主要构成成分。最近的研究表明，在某些情况下单一主要丰富细胞外产物可占微生物释放之产物的达40％(重量)。更常见的是，个别主要丰富细胞外产物总计占传染性病原体释放之总产物的大约0.5％至25％。另外，可发现最多的5种或6种主要丰富细胞外产物占微生物释放之总质量的60％至70％。当然，本领域技术人员将会理解到，就所能释放的绝对或相对产物量来说，在不同时间里细胞外产物的相对水平可能有所波动。例如，pH、氧化剂、渗透性、热及对生物体的其他应力条件、生物周期的不同阶段、再生状态及周围环境的组成成分均可改变所释放之产物的组成和量。再者，在不同菌种间甚至在某个种的不同菌株间，细胞外产物的绝对和相对水平可能有很大不同。
就细胞内病原体来说，细胞外产物似乎可扩充能够检测和发挥抗含活细菌之巨噬细胞的抗微生物作用的特异性免疫淋巴细胞群体。此外，借助它们反复呈现于被感染细胞之表面上的能力，主要丰富的或主要的细胞外产物可具有有效抗原标志物的功能。因此，依据本发明的技术，进行疫苗接种并诱导针对病原菌之主要丰富细胞外产物或其免疫原等同决定簇的保护性免疫，当继后受到靶病原体感染时促进宿主免疫系统用强的细胞介导的成分建立迅速而有效的免疫反应。
与主要集中于生产疫苗并基于个别筛选之病原体成分的高度特异性的分子免疫原性来刺激免疫反应的现有技术免疫活动相反，本发明优先开发利用相对丰富的细菌细胞外产物或其免疫原性类似物(而不是它们的免疫原特异性)，用实际上可能比不太普遍的细胞外产物表现有更低免疫原特异性的化合物建立或诱导保护性免疫。就本公开来说，免疫原类似物是足以相似于至少一种由靶病原体表达的主要丰富细胞外产物或其部分，具有在继后受到靶病原体感染时刺激哺乳动物宿主体内之保护性免疫反应的任何分子或化合物。简单地说，本发明的疫苗是通过选择由特定病原体向细胞外释放的主要丰富产物(或能够刺激实质性等同免疫反应的分子类似物)并以相对纯的形式分离之而鉴定或产生的。然后可使用本领域已知的技术配制一种或多种分离的免疫反应性产物，并在受到靶离病原体感染之前免疫哺乳动物宿主，以引发所需的抗靶病原体的预防性免疫反应。
可以预见到的是，本发明的疫苗将由至少一个、两个或者可能甚至几个已充分限定的免疫原决定簇组成。从而，本发明可产生恒定的，标准化的疫苗，其可被开发、试验并相对容易和迅速地使用。另外，使用相当于主要丰富分泌产物或细胞外产物的几个充分限定的分子可大大降低与常规疫苗相关的有害副作用，并可消除对有效免疫原标志的可能的吸留。同样，因为本发明的疫苗不是一种减毒的或杀死的疫苗，所以在生产、纯化期间或在给药后可有效地消除感染的危险。因此，本发明的疫苗可以安全地用于免疫受损的个体，包括无症状结核病人和受到HIV感染的病人。再者，因为体液免疫反应是无例外地针对由靶病原体释放之产物的，所以几乎没有产生有害调理免疫成分的机会。因此，本发明可使受刺激的体液反应帮助从抗体敏感区域清除靶病原体。
本发明的另一个有利的方面是可以借以比较容易地收获、产生和继后纯化疫苗。例如，可用较小的工作量从包括结核分枝杆菌或牛分枝杆菌在内的靶病原体培养物中得到优势丰富的细胞外产物。因为所需的化合物在微生物生长期间被释放到培养基中，所以可利用常规技术从细菌体内和靶病原体的膜结合成分成中很容易地分离之。更好的是可从基因工程改造的生物体中产生并纯化本发明疫苗的所需免疫反应性成分，其中所说的生物体中已克隆了表达结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌或其他感兴趣之病原体的特定细胞外产物的基因。如本领域已知的，可以对这些工程化生物体进行修饰使之产生更高水平的选择的细胞外产物或经修饰的免疫原性类似物。或者，可以使用本领域已知的技术以化学方法合成免疫保护产物、其部分或其类似物。不管所利用的生产来源如何，均可使用分级分离、层析或其他纯化方法学及常规配制技术等常用生化手段分离优势或主要丰富细胞外产物的免疫原性成分并在其后配制成可释放的疫苗。
例如，在本发明的一个举例说明性实施方案中，靶病原体是结核分枝杆菌，从其他细菌成分中分离出由结核分枝杆菌释放到培养液中的主要丰富细胞外，产物并用于引发哺乳动物宿主的免疫反应。然后在基于动物的攻击实验中利用个别蛋白质或一类蛋白质鉴定那些可诱导保护性免疫，而使之适于按照本发明的技术用作疫苗的蛋白质。更具体地说，在培养并收获细菌之后，借助其物理丰度，通过离心和过滤从细菌内和其他成分中分离出主要的细胞外产物。必要时，再使用硫酸铵沉淀法对所得到的大量滤液进行分级分离，继之进行透析以得到通称为EP的细胞外产物的混合物。然后使用本领域已知和下文更充分描述的适当层析技术将经过透析之部分中的溶解的细胞外产物纯化到实质上的均一状态。
这些举例的方法生产出十四种单个的分子量在110至12千道尔顿(KD)的结核分枝杆菌主要细胞外蛋白质产物。纯化后各单个主要丰富细胞外产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳上展示出一条相当于其各自分子量的带，从而得以鉴定和制备相当于主要丰富细胞外产物的个别产物或各组产物，以用作本发明的疫苗。可使用本领域通用的技术检测它们各自的全部或部分氨基酸序列以进一步定性和区分纯化的主要丰富细胞外产物。序列分析也可为了解主要丰富细胞外产物间的可能的结构关系提供信息。
然后，可在一段时间内经多次皮下或皮内注射这些纯化的细胞外产物，通过本发明的技术免疫哺乳动物并在哺乳动物宿主系统中刺激获得性免疫。例如，注射一种或多种加于不完全弗氏佐剂中的纯化的主要丰富细菌细胞外产物，然后加在同样佐剂中进行第二次注射，约三周后可用以引发在继后用毒性病原体攻击后的保护性免疫反应。本发明范围和技术内的其他示例性免疫方法可包括在一定时间内注射加在Syntex Adjuvant Formulation(SAF)中的纯化的细胞外产物或其类似物，共注射3或4次。虽然系列注射一般更为有效，但一次投用选择的主要丰富细胞外产物或其免疫原性亚基或类似物也可产生预期的免疫反应，并期望该方法也包括在本发明的范围之内。
可使用认可的实验模型如豚鼠证明这些举例的免疫方法。例如将在下文中详细讨论的，经三次注射加在SAF佐剂中的细菌产物并建立对照动物的相应假免疫，以完成合用五种主要丰富细胞外产物(按前述方法从结核分枝杆菌中纯化的)对几只豚鼠的免疫。各蛋白质的剂量范围为100μg至2μg。末次免疫接种后，使所有动物同时接触传染性和潜在致死剂量的气雾化结核分枝杆菌并长时间监测之。与合用结核分枝相菌之主要丰富细胞外产物免疫的动物相比，对照组动物显示有明显的体重丢失。另外，在观察期间有半数对照组动物死亡，而所有经免疫的动物均未死于结核病。实验后进行的尸体解剖表明未免疫的对照组动物比受到保护的动物有更显著的集落形成单位(CFU)和其肺及脾脏中的相应损伤。试验测知合用另外十七种纯化的主要丰富细胞外产物具有免疫预防作用，从而证明本发明的范围，并可按照本发明的技术配制宽抗菌范围的疫苗。
但应强调的是，本发明并不限于合用分泌产物或细胞外产物。例如，几种可代用的实验方法证明，按照本发明的技术，单一丰富细胞外产物即具有诱导哺乳动物产生保护性免疫的能力。在各实验中，使用本文详述的层析方法从结核分枝杆菌中纯化单一主要丰富细胞外产物并用以免疫豚鼠。一个例子是使用含有纯化之丰富分泌产物(分子量相当于30KD)的佐剂组合物在多重实验中接种动物。在本发明的另一个实施例中，使用含有从结核分枝杆菌中分离的丰富细胞外产物(分子量相当于71KD)的佐剂组合物免疫接种不同的豚鼠。免疫后，使两组实验动物和适当的对照组动物接触致死剂量的气雾化结核分枝杆菌以确定疫苗效力。
更具体地说，在一次实验中，于6周时间里三次用100μg 30KD蛋白质(加在SAF中)免疫6只豚鼠。同时用相应量的细胞外蛋白质(EP)的批量制剂或缓冲液接种对照组动物。末次接种后3周，用致死剂量的气雾化结核分枝杆菌攻击动物并监测14周。30KD蛋白质免疫的豚鼠和整体细胞外产物制制免疫的豚鼠存活率分别为67％和50％(说明相对于EP，主要丰富细胞外产物的不可预料的优良效能)，而假免疫的动物则只有17％的存活率。实验终止后，杀死动物并检验活的结核菌。结果可见未经免疫的动物显示在肺和脾脏中有显著高浓度的结核分枝杆菌。
对那些用71KD蛋白质免疫的动物进行相似的实验。一项实验中，在三周时间里用含有100μg纯化的71KD蛋白质的SAF佐剂组合物两次免疫接种6只豚鼠。其他动物则用未纯化之细胞外蛋白质的整体制剂、或用作阳性对照的EP及用作阴性对照的缓中液作相似的免疫。接触致死量气雾化结核菌后，监测豚鼠体重6个月。再次用纯化形式的丰富细胞外产物免疫的动物产生了抗强毒力结核分枝杆菌的保护性免疫。这个阶段终了时，与实验组动物相比较，用缓冲液免疫的动物显示有明显的体重降低。另外，阳性对照组和71KD蛋白质免疫的动物存活率分别为63％和50％，而未经免疫的动物均在观察期结束前死亡。
值得注意的是，疫苗的配制对于本发明来说并不是关键性的，并且可作最佳化改动以利于给药。可以单独使用或者以任何设计好的方式联合使用从病原体主要丰富细胞外产物制得的纯化之免疫原性决定簇的溶液，以产生保护性免疫反应。可以单独投用纯化的蛋白质溶液，或者将其与佐剂混合配制后给药。用于本发明以提高选择的免疫原性决定簇之活性的特定示例性佐剂是SAF、含有单磷酰基脂质A的佐剂、弗氏不完全佐剂及含有死细菌的弗氏完全佐剂。可用于本发明的其他佐剂是油包水型乳剂、矿物盐(例如明矾)、核酸、嵌段聚合物表面活性剂及微生物细胞壁(肽糖脂)。虽然不限制本发明的范围，但相信由于佐剂可减慢抗原从注射部位释放，故可能提高免疫反应。
本领域技术人员在结合将在下文中首先给出的简要说明的附图，阅读了下面对本发明优选实施方案的详细描述后，将会全面了解本发明的其他目的、特征及优点。
附图的简要说明
图1显示4个标示为1A至1D的考马斯蓝染色的凝胶，说明如经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定的几种结核分枝杆菌主要丰富细胞外产物的纯化。
图2显示鉴定十二种结核分枝杆菌主要丰富细胞外产物的5个N末端氨基酸，及十四种这类产物的表观分子量。
图3列表显示三种结核分枝杆菌主要丰富分泌产物的延伸的N末湍氨基酸序列，这些产物是不能根据图2中所示的5个N末湍氨基酸来区别的。
图4是图解比较用纯化的结核分枝杆菌30KD主要丰富分泌产物免疫的豚鼠、用现有技术整体细胞外蛋白质制剂免疫的阳性对照组动物，以及未免疫的阴性对照组动物在接触致死量气雾化结核分枝杆菌后的存活率。
图5是图解比较用纯化的71KD主要丰富细胞外产物免疫的豚鼠，用现有技术中结核分枝杆菌整体细胞外蛋白质制剂免疫的阳性对照组动物，及未经免疫的阴性对照组动物在接触致死量气雾化结核分枝杆菌后的平均豚鼠体重。
图6是图解比较图5中用结核分枝杆菌的纯化的71KD主要丰富细胞外产物免疫的豚鼠、用现有技术中细胞外蛋白质的整体制剂免疫的阳性对照组动物，以及未免疫的阴性对照组动物在接触致死量气雾化结核分枝杆菌后的存活率。
图7是图解比较在第二次不同实验中用纯化的主要丰富71KD细胞外产物免疫的豚鼠和未免疫的阴性对照组动物在接触致死剂量气雾化结核分枝杆菌后的平均体重。
图8A和8B是图解比较在PPD+(结核分枝杆菌感染的指征)和PPD-人体中对举例的纯化之主要丰富71KD细胞外产物的淋巴细胞增殖反应。图8A是图示在淋巴细胞与该抗原保温后2天测得的数值，而图8B是图示在保温后4天测得的数值。
图9是图解比较用含有按本发明技术生产之联合的细胞外产物的疫苗免疫的豚鼠和未免疫的对照组动物在接触致死量气雾化结核分枝杆菌后的平均体重。
图10是图解比较用三个不同剂量的含有按本发明技术生产之联合的细胞外产物的疫苗免疫的豚鼠，和未免疫的对照组豚鼠在接触致死量气雾化结核分枝杆菌后的平均体重。
图11是图解比较用含有以六种不同方式组合之按本发明技术生产的细胞外产物的疫苗免疫的豚鼠，和非免疫的对照组豚鼠在接触致死量气雾化结核分枝杆菌后的平均体重。
发明的详细描述
本发明涉及化合物和其生产方法及其作为疫苗和免疫治疗剂对抗病原生物体的应用。更具体地说，本发明涉及由病原生物体释放的主要丰富细胞外产物或其免疫原性类似物的生产和作为疫苗或免疫治疗剂的应用，以及在哺乳动物宿主中产生抗感染之保护性免疫的相关方法。为便于描述，本申请中将这些化合物称为疫苗。
在举例说明性的本发明实施方案中，区分并随后纯化了结核分枝杆菌的主要丰富细胞外产物。用纯化形式的这些主要优势细胞外产物免疫豚鼠，而不必确定个别产物的特异分子免疫原性。另外，可以个别或联合使用纯化的细胞外产物，并以不同的剂量和给药途径进行免疫。本领域熟练技术人员将会理解到，可以利用上述战略以任何病原生物体或细菌去实践本发明的方法，因此本发明不特别限于抗结核分枝杆菌的疫苗和方法。
在这些举例的实施方案中，使用柱层析法分离和纯化结核分枝杆菌的主要丰富细胞外产物。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法确定细胞外产物的相对丰度并纯化之。在纯化疫苗成分后，单独或联合使用主要丰富细胞外产物免疫接种豚鼠，并在其后用结核分枝杆菌攻击动物。如将在下文中详细讨论的，除了在免疫后建立抗这些细胞外产物的预期的可检测反应外，本发明的疫苗还不可预见地在这些实验室动物体内引发对抗继后致死量气雾化结核分枝杆菌感染的有效免疫性。
虽然这些举例的实施方案使用了纯化形式的细胞外产物，但本领域技术人员会理解到可以使用通过重组技术生产的免疫原类似物或以本领域已知技术化学合成的其他形式的细胞外产物很容易地实现本发明。另外，可以使用主要丰富细胞外产物的免疫原性类似物、同系物或其选择的片段代替属于本发明范围和原则内的天然产物。
为使本领域技术人员进一步理解本发明，提供下列非限制性实施例，以举例说明鉴定、分离、生产和使用作为疫苗之主要丰富细胞外产物(单独和联合使用的)的方法。
实施例1
分离和生产结核分枝杆菌中的整体细胞外蛋白质(EP)
从美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collec-tion，Rockville，Md)得到结核分枝杆菌Erdman菌株(ATCC 35801)。将冻干的细菌重新悬浮在Middlebrook 7H9培养基(DifcoLaborato-ries，Detroit，Mich.)中并保持在Middlebrook7H10琼脂培养基上。按前已描述的方法使用Bacto Middlebrook 7h10琼脂(Difco)、OADCEnrichment Medium(Difco)、0.1％酪蛋白酶促水解物(Sigma)、和甘油制备7H11琼脂(Cohn，M.L.，Am.Rev.Respir.Dis.，98：295-296)。高压灭菌后，将琼脂散布于细菌培养皿(100×15mm)中并冷却之。
然后使用无菌技术铺敷结核分枝杆菌并在5％CO2-95％空气，100％湿度环境中37℃培养之。在7H11上培养7天后，从平皿上刮取菌落，以108CFU/ml悬浮在7H9培养液中并分装于1.8ml Nunc冷冻管(Roskilde，Denmark)中。用998ml蒸馏水和2ml甘油(SigmaChemical，Co.，St.Louis，MO.)再水合7.7g Bacto Middlebrook 7H9粉末以制备每升培养液，然后将混合物调到pH6.75并将培养液于121℃高压灭菌15分钟。然后缓慢冷冻等份的细胞并贮存于-70℃。在这些条件下贮存的细胞仍可无限期存活并可在需要时使用之。
从生长于上述Middlebrook 7H9培养液中的结核分枝杆菌培养物制得整体细胞外蛋白质(EP)制剂。重新配制后，于121℃下将150ml等份的培养液高压灭菌15分钟，并分散于排空的Co-star225cm2组织培养瓶中。融化按上文所述贮存于-70℃下的结核分枝杆菌细胞并用于接种7H11琼脂平皿。培养7天后，从平皿上刮取菌落，悬浮于几ml 7H9培养液中，并在水溶中进行超声处理以形成单细胞悬液。根据用Perkin-Elmer Junior35型分光光度计(Norwalk，Conn)检测结果，在初始光密度为0.05时以150ml等份无菌悬浮结核分枝杆菌细胞。然后在5％CO2-95％空气中将细胞于37℃保温3周，直至悬液显示有0.4至0.5的光密度。用这些培养物作为进一步在7H9培养液中培养的原菌液。在水溶中超声处理原菌液使之形成单细胞悬液。然后在7H9培养液中将结核分枝杆菌细胞稀释至初始光密度为0.05，并在5％CO2-95％空气中于37℃保温21/2-3周，直到光密度为0.4-0.5。分离培养物上清并相继通过0.8μm和0.2μm低蛋白质结合滤膜(Gelman SciencesInc，Am.Arbor，Mich.)过滤除菌。然后在带有10KD截留分子量Omega膜的Filtron Minisette超滤器中将上述滤液浓缩大约35倍，并在4℃下贮存之。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析整体细胞外蛋白质制剂揭示出有多条带的蛋白质组合物。得到40——95％硫酸铵沉淀的培养物滤液，制得整体细胞外蛋白质混合物(EP)。
实施例2
纯化结核分枝杆菌的基本主要丰富细胞外产物
0℃下以10％至95％的浓度向实施例1的无菌培养物滤液中加硫酸铵(I级，Sigma)，并轻轻搅拌以分级分离蛋白质。将悬浮移入塑料瓶中，用RC3B Sorvall离心机在大直径料桶转子中3,000rpm离心以分离所得到的沉淀物。倒出上清液并根据所需产物不同进一步纯化上清液或沉淀产物。在感兴趣的产物含在上清液中时，经增加上述第一次沉淀的盐浓度，完成对上清液的第二次硫酸铵沉淀。在轻轻搅动溶液后按上述方法离心以沉淀所需产物，并对第二上清液进行进一步的纯化。
离心后，将沉淀的蛋白质重新溶解在适当的冷缓中液中并在具有6,000至8,000截留分子量的Spectrapor透析膜(Spectrum Medi-calIndustries，Los Angeles，California)中彻底透析以除盐。用双辛可酸蛋白质检测法(Pierec Chemical Co.，Rockford，Illinois)检测细胞外蛋白质浓度，并使用SDS-PAGE检测各部分成分。将各部分加于层析柱上进一步纯化之。
使用上文简要的一般流程，从按实施例1所述方法制得的总体细胞外蛋白质滤液中纯化出十四种细胞外产物。以下就所分离的每种细胞外产物详细描述确切的硫酸铵沉淀方法和层析方法。A.110KD细胞外产物
1.按上述方法得到50——100％硫酸铵沉淀物。
2.透析重新溶解的沉淀物并上样于DEAE Sepharose CL-6B或QAE Sepharose离子交换柱上，其中柱缓冲液由10％山梨醇、10mM磷酸钾(pH7)、5mM 2-巯基乙醇和0.2mM EDTA组成，并用氯化钠梯度洗脱。在约550mM盐浓度时洗脱含110KD蛋白质的部分并收集之。将收集的部分上样于在PB5(磷酸盐缓冲盐水)中的S200 Sepharose大小分收分离柱中。作为均质110KD蛋白质洗脱该蛋白质。B.80KD细胞外产物
1.弃去0-25％硫酸铵沉淀部分(0°，1小时)并按上文讨论的方法保留25-60％硫酸铵沉淀部分(0℃过夜)。
2.用含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)装填DEAE CL-6B柱(pHarmacia)，并用25mM Tris(Ph8.7)、10mM NaCl平衡之，将蛋白质样品对25mM Tris透析并加样于柱上。用同样缓冲液洗柱过夜，使加在25mM Tris(pH8.7)中的10mM至200mM NaCl的第一盐梯度通过柱以洗脱其他蛋白质。使第二盐梯度(200至300mM NaCl)通过柱并在大约275mM NaCl处洗脱80KD蛋白质。
3.用25mM Tris(pH8.7)，10mM NaCl装Q-Sepharose HP柱并重新平衡到25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl。将蛋白质样品对25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl透析并上柱。在同样缓冲液中洗柱，然后用加在25mM Tris(pH8.7)中的200-300mM NaCl洗脱。
4.收集含有80KD蛋白质的部分并对25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl透析，然后在Speed-Vac浓缩器中浓缩到1-2ml。将蛋白质样品加样于Superdex 75柱上并用25mM Tris(pH8.7)、150mM NaCl洗柱。作为均一蛋白质洗脱80KD蛋白质。C.71KD细胞外产物
1.按上述方法制得40-95％硫酸铵沉淀物，但不同的是在7H9培养液(pH7.4)中，于0％CO2环境下培养71KD产物，并于42℃热休克3小时，每周一次。将沉淀物对初始缓冲液(InitialBuffer；20mM Hepes、2mM MgAc、25mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.8mM DL-二硫苏糖醇，pH7.0)透析。
2.将重新溶解的沉淀物加样于初始缓冲液平衡过的ATP A-garose柱上。收集流出物并再次上ATP Agarose柱。71KD蛋白质结合于柱上。
3.首先用初始缓冲液，再用1M KCl，然后用初始缓冲液洗ATPAgarose柱。
4.用10mM ATP从柱上洗脱均质71KD蛋白质并对磷酸盐缓中
液透析。D.58KD细胞外产物
1.按上述方法得到25-50％硫酸铵沉淀物。
2.透析重新溶解的沉淀物并加于DEAE-SepharoseCL-6B或QAE-Sepharose柱上，然后用NaCl洗脱。收集在大约400mM NaCl处洗脱的含58KD蛋白质的部分。
3.然后使收集的部分过Sepharose CL-6B柱。在大约670-700,000道尔顿处洗脱该蛋白质。
4.将洗脱的蛋白质上硫丙基-琼脂糖柱。在大约250-350mM2-硫基乙醇处洗脱均质58KD蛋白质。使用SDS-PAGE监测洗脱的蛋白质并在凝胶上展示出如图1A第2栏所示的单一带。E.45KD细胞外产物
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀物(0℃下1小时)。
b.保留25-60％硫酸铵沉淀物(0℃下过夜)。
2.a.用含有1M NaCl的2.5mM Tris(pH8.7)装DEAE CL-6B柱(Pharmacia)并用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡该柱。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析并上柱。然后用同样缓冲液洗柱过夜。
c.用加在25mM Tris，pH8.7缓冲液中的盐梯度(10mM至200mM)洗脱柱。在大约40mM NaCl处洗脱45KD蛋白质。
3.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7填充Q-SepharoseHP柱(Pharmacia)并再次用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同样缓中液洗柱。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)中的10-150mM NaCl洗脱柱。
4.a.收集含45KD产物的部分，合并后对25mM Tris，10mMNaCl，pH8.7透析，然后在Speed Vac浓缩器中浓缩至1ml。
b.将浓缩物加于用25mM Tris，150mM NaCl，pH8.7平衡过的Superdex75柱上。作为均质蛋白质洗脱该产物。使用SDS-PAGE监测洗脱的蛋白质并可见如图1B第二栏中所示的单一带。F.32KD细胞外产物(A)
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀物(0℃，1小时)。
b.保留25-60％硫酸铵沉淀物(0℃，过夜)。
2.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7装填DEAE CL-6B柱，然后用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同样缓中液洗柱过夜。
c.用加在25mM Tris，pH8.7缓冲液中的盐梯度(10mM至200mM)洗脱柱。在大约70mM NaCl处洗脱32KD蛋白质。
3.a.收集含32KD产物的部分，合并并对25mM Tris，10mMNaCl，pH8.7透析，然后在Speed-Vac浓缩器中将蛋白质样品浓缩到1ml。
b.然后使所得浓缩物通过已用25mM Tris，150mM NaCl，pH8.7平衡过的Superdex75柱，并用该缓中液洗脱。作为均质蛋白质洗脱32KD产物。
4.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7装填Q-SepharoseHP柱(Pharmacia)，并再次用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析并上柱，然后用同样缓冲液洗柱。
c.用100-300mM NaCl梯度洗脱柱。在大约120mM NaCl处洗脱作为均质蛋白质的标记的32A，并给出如图1B，栏4中所示的单一带。G.32KD细胞外产物(B)
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀部分(0℃1小时)。
b.保留25-60％硫酸铵沉淀部分(0℃过夜)。
2.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7装填DEAE CL-6B柱(Pharmacia)，然后用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同样缓冲液洗柱过夜。
c.过加在25mM Tris，pH8.7中的10mM至200mM NaCl的第一盐梯度以洗脱各种蛋白质。平衡柱后，过第二盐梯度(200至300mM NaCl)。在大约225mM NaCl处洗脱32KD蛋白质。
3.a.将含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7充入Q-SepharoseHp柱(Pharmacia)中，并再次用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱，然后在同样缓冲液中洗柱。
c.用加在同样缓中液中的200-300mM NaCl梯度洗脱柱。
4.a.收集含有32KD产物的部分，合并后对25mM Tris，10mMNaCl，pH8.7透析，然后在Speed-Vac浓缩器中将蛋白质样品浓缩到1ml。
b.然后将浓缩物过已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡的Superdex75柱，并用同样缓中液洗脱。作为均一蛋白质洗脱标记为32B的32KD产物，以将其与使用方法H分离的32KD蛋白质区分开，该产物在凝胶电泳上显示如图1B栏3所示的单一带。H.30KD细胞外产物
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀物(0℃1小时)。
b.保留25-60％硫酸铵沉淀物(0℃过夜)。
2.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7填入DEAE CL-6B柱(Pharmacia)，然后用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同样缓冲液洗柱过夜。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)缓冲液中的盐梯度(10mM至200mM)洗脱。在大约140mM NaCl处洗脱30KD蛋白质。
3.a.收集含30KD产物的部分，合并后对25mM Tris，10mMNaCl，(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac浓缩器中将蛋白质样品浓缩到1ml。
b.然后将浓缩物上样于用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡过的Superdex75柱上并用该缓中液洗脱。作为均质蛋白质洗脱30KD产物，并显示为如图1B，栏5上所示的单一带。I.24KD细胞外产物
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀物(0℃，1小时)。
b.保留25-60％硫酸铵沉淀物(0℃过夜)。
2.a.将含有1M NaCl的25mM Tris，(pH8.7)填入DEAE CL-6B柱(Pharmacia)，然后用25mM Tris，10mM NaCl，(pH8.7)平衡。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl，(pH8.7)透析，上柱并用同样缓冲液洗柱过夜。
c.使加在25mM Tris(pH8.7)中的10mM至200mM NaCl的第一盐梯度通过柱以洗脱各种蛋白质。平衡柱后加入第二盐梯度(200至300mM NaCl)。在大约250mM NaCl处洗脱24KD蛋白质。
3.a.将含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)加于Q-SepharoseHp柱(Pharmacia)中，并用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡之。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，上柱后用同样缓冲液洗柱。
c.用加在同样缓冲液中的200-300mM NaCl梯度洗脱柱。
4.a.收集含有24KD蛋白质产物的部分，合并后对25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac浓缩器中将蛋白质样品浓缩到1ml。
b.将浓缩物加样于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡过的柱上并用同样缓冲液洗脱。作为均质蛋白质洗脱24KD产物，并显示为如图1B，栏7上所示的单一带。J.23.5KD细胞外产物
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀物(0℃1小时)。
b.保留25-60％硫酸铵沉淀物(0℃过夜)。
2.a.将含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)充入DEAE CL-6B柱(Pharmacia)上，然后用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡柱。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，上柱后用同一缓冲液洗柱过夜。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)缓中液中的盐梯度(10mM至200mM)洗脱柱。在大约80mM NaCl处洗脱23.5KD蛋白质。
3.a.将含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)充入Q-SepharoseHP柱，并再次用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡之。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，上柱后用同一缓冲液洗柱。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)中的100-300mM NaCl洗脱柱。
d.重复步骤3a至3c。
4.a.收集含有23.5KD产物的部分，合并并对25mM Tris，10mMNaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac浓缩器中将蛋白质样品浓缩到1ml。
b.然后将浓缩物上样于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡过的Superdex75柱上，并用同样缓冲液洗脱。作为均质蛋白质洗脱23.5KD产物。使用SDS-PAGE监测洗脱的蛋白质，并产生出如图1B，栏6所示的单一带。K.23KD细胞外产物
1.a.弃去0-25％硫酸铵(0℃小时)和25-60％硫酸铵(0℃过夜)沉淀的部分。
b.保留60-95％硫酸铵沉淀物。
2.a.将含有1M NaCl的50mM Bis-Tris(pH7.0)加到DEAE CL-6B柱(Pharmacia)上，并用50mM Bis-Tris，100mM NaCl(pH7.0)平衡之。
b.将蛋白质样品对加有100mM NaCl的50mM Bis-Tris(pH7.0)缓中液透析并上柱，然后用同一缓冲液洗柱过夜。
c.用加在50mM Bis-Tris(pH7.0)中的100至300mM NaCl线性梯度洗脱柱。
d.收集含有大的100-150mM NaCl处洗脱之23KD的蛋白质的部分。
3.a.将蛋白质部分对25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl透并在Savant Speed Vac浓缩器上浓缩到1-2ml。
b.将浓缩物上样于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)、平衡过的Superdex75柱上。作为均质蛋白质洗脱如图1B，栏8中所示的蛋白质产物。L.16KD细胞外产物
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀物(0℃，1小时)。
b.保留25-60％硫酸钠沉淀物(0℃过夜)。
2.a.将含有1M NaCl的2.5mM Tris(pH8.7)充入EDAE CL-6B柱(Pharmacia)中，然后用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡之。
b.将蛋白质样品对含有10mM NaCl的25mM Tris，(pH8.7)透析并上柱，然后用同一缓冲液洗柱过液。
c.用加在25mM Tris，(pH8.7)缓冲液中的盐梯度(10mM至200mM)洗脱柱。在大约50mM NaCl处洗脱16KD蛋白质。
3.a.收集含有16KD产物的部分，合并后对25mM Tris，10mMNaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-vac浓缩器中将蛋白质的
样品浓缩到1ml.
b.然后将浓缩物上样于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡过的Superdex75柱上，并用同一缓冲液洗脱之。作为均一蛋白质洗脱16KD产物。使用SDS-PAGE监测洗脱的蛋白质并形成如图1B，栏9中所示的单一带。M.14KD细胞外产物
1.a.弃去0-25％硫酸铵沉淀物(0℃，1小时)。
b.保留25-60％硫酸钠沉淀物(0℃过夜)。
2.a.将含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)充填到EDAE CL-6B柱(Pharmacia)上，然后用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析并上柱，然后在同一缓冲液中洗柱过液。
c.用加在25mM Tris，(pH8.7)缓冲液中的盐梯度(10mM至200mM)洗脱柱。在大约60mM NaCl处洗脱14KD蛋白质。
3.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，(pH8.7)填充Q-SpeharoseHP柱，并重新用25mM NaCl(pH8.7)平衡。
b.将蛋白质样品对25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析并上柱，然后用同样缓中液洗柱。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)中的10-150mM NaCl洗脱柱。
d.重复步骤3a至3c.
3.a.收集并合并含有14KD产物的部分，对25mM Tris，10mMNaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac浓缩器中将蛋白质的样品浓缩到1ml.
b.然后将浓缩物加样于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡过的Superdex75柱上，并用该缓冲液洗脱。作为均一蛋白质洗脱14KD产物。使用SDS-PAGE监测洗脱的蛋白质并呈现为如图1C，栏2中所示的单一带。N.12KD细胞外产物
1.得到0-10％硫酸铵沉淀物(4℃过夜)。
2.将重新溶解的沉淀物上样于S200 Sephacryl大小分级分离柱上，并洗脱12KD蛋白质分子。
3.将蛋白质部分加样于DEAE-Sepharose CL-6B或QAE-Sepharose离子交换柱上，并按前述方法用NaCl梯度洗脱。在大约300-350mM NaCl处洗脱含有分子量约为12KD之两种均质蛋白质的部分，并收集之。该蛋白质标记为12A和12B，并作为如图1D，栏2所示的双带纯化之。
如图1的SDS-PAGE图形中举例显示的，使用实施例2A-2N中详述的步骤将结核分枝杆菌的基本或主要丰富细胞外蛋白质纯化到均质性。更具体地说，图1图解显示使用SOS-PAGE展现的并标记为1A、1B、1C和1D的四个举例的12.5％丙烯酰胺凝胶。凝胶1A-1C泳道1中的标准品包括分子量为66、45、36、29、24、20和14KD的蛋白质。凝胶1D中，泳道1上的标准品含有分子量为68、45、31、29、20和14KD的蛋白质。含有各自纯化之细胞外产物的泳道基本上显示具有个别蛋白质已报导分子量的一条带。应注意的是，在凝胶1D中，泳道2上可见12KD蛋白质为双重带。序列分析显示，下方12KD带(或12B KD带)等同于上方12KD带(或12AKD带)，不同的是其缺少前3个N末端氨基酸。
图2中提供了对这些个别主要丰富细胞外产物的进一步分析结果。更具体地说图2是列表比较从这些纯化之细胞外产物得到的N末端序列数据，显示大部分分离的产物确实是不同的。蛋白质32A、32B和30都具有相同的5个N末端氨基酸，因此，为了充分鉴定和区分这些产物须作进一步的序列分析。图3显示这三种纯化的分泌产物的延伸的N末端氨基酸序列。位置16、31和36上不同的氨基酸证明，尽管这些分离的蛋白质的分子量相似，但它们是彼此不同的。
除了蛋白质30、32A和32B外，还检测了其他主要丰富细胞外产物的延伸的N末端氨基酸序列，以提供一级结构数据并找出这些蛋白质间的可能的关系。使用本领域已知的技术对按照实施例2所述方法纯化的细胞产物进行序列测定。下表中给出由完整蛋白质的表观分子量认定的，并使用标准的单字母缩写字代表天然氨基酸的，用于确定每种细胞外产物的不同长度的N末端氨基酸序列。为了与已建立的记录规则一致，以氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写N末端序列。在已确定之氨基酸的认定不太肯定的位置下方旬有横线。有特殊位置的氨基酸是未测出或不明确的，在序列中的这一位置用短线代表。最后，两个氨基酸由一斜线分开是表示正确组成尚未被明确鉴定并且可能由任一个氨基酸占据该序列中的这一位置。蛋白质 N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30 3512KD FDTRL MRLED EMKEG RYEVR AELPG VDPDK DVDTM
40 45
VRDGQ LTIKA ERT
5 10 15 20 25 3014KD ADPRL QFTAT TLSGA PFDGA S/NLQGK PAVLW
5 10 15 20 25 3016KD AYPIT GKLGS ELTMT DTVGQ VVLGW KVSDL
35 40 45
F/YKSTA VIPGY TV - EQ QI
5 10 15 2023KD AETYL PDLDW DYGAL EPHIS GQ
5 1023.5KD APKTY - EELK GTD
5 10 15 20 25 30 3524KD APYEN LMVPS PSMGR DIPVA FLAGG PHAVY LLDAF
40 45 50 55 60
NAGPD VSNWV TAGNA MMTLA - KGIC/S
5 10 15 20 25 30 3530KD FSRPG LPVEY LQVPS PSMGR DIKVQ FQSGG NNSPA
40
VYLLD
5 10 15 20 25 30 3532A KD FSRPG LPVEY LQVPS PSMGR DIKVQ FQSGG ANSP-
40
LYLLD
5 10 15 2032B KD FSRPG LPVEY LQVPS A-MGR DI
5 10 15 20 25 3045KD DPEPA PPVPD DAASP PDDAA APPAP ADPP-
5 10 15 2058KD TEKTP DDVFK LAKDE KVLYL
571KD ARAVG I
580KD TDRVS VGN
5 10 15 20110KD NSKSV NSFGA HDTLK V-ERK RO
这一序列数据，再结合使用SDS-PAGE确定的物理性质，即可得以鉴定并区分本发明的这些有代表性的主要丰富细胞外产物。所描述的分析结果表明，这些蛋白质构成了包括71KD、30KD、32AKD、23KD和16KD产物的，约占可利用之总细胞外产物60％(重量)的大部分的结核分枝杆菌细胞外产物。进一步估测到，30KD蛋白质可能构成由结核分枝杆菌释放之总产物重量的至多25％。因此，在本发明的实践中使用的结核分枝杆菌个别主要丰富细胞外产物可以从细胞外产物总重量的大约0.5％至大约25％。
如上文所讨论的，由于了解到传统的Western印迹分析法不能恒定地鉴定最具免疫原特异性的细胞外产物，所以本发明人决定基于它们的丰度来分析主要丰富细胞外产物的免疫原性，并进而易于鉴定和分离之。结果令人惊奇地发现，这些主要丰富细胞外产物诱导了不可预见的有效免疫反应，致使发明人得出它们可能有疫苗功能的结论。这一令人惊奇的发现导致了如上文讨论的本发明的非限制性功能理论的发展。
为了证明本发明的效率，使用各种不同剂量的单一主要丰富细胞外产物和其组合进行附加实验，以在常规采用的实验室动物模型体内诱导保护性免疫。更具体地说，使用纯化的单一主要丰富细胞外产物在继后受到结核分枝杆菌的豚鼠体内诱导保护性免疫。使用不同的给药途径对五种纯化之主要丰富细胞外产物的不同组合进行相似地试验，结果显示这些蛋白质能够诱导保护性免疫。特别是使用30KD丰富细胞外产物与纯化形式的71KD细胞外产物一样在认可的动物模型体内诱导保护性免疫。与个别举例的主要丰富的细胞外产物一样，五种主要丰富细胞外产物的组合疫苗也赋予了对抗致死量结核分枝杆菌攻击的保护作用。对本发明的这些疫苗所作的各项研究的结果如下所述。
在包括用结核分枝杆菌进行免疫原或气雾攻击在内的所有实验中均使用无特异病原体的雄性Hartley品系豚鼠(Charles RiverBreeding Laboratories，North Wilmington，Massachusetts)作为动物模型。将动物分2或3只圈养在不锈钢笼内并之自由接近标准的豚鼠食物和水。在进入动物设施后，至少观察豚鼠一周，然后再开始每项实验，以确保动物健康。
使用估计占通常存在的总细胞外产物之3％-25％的个别主要丰富细胞外产物进行最初的实验。这些实验证明主要丰富细胞外产物可引发有效的免疫反应。更具体地说，所分离的30KD和71KD细胞外产物均显示能够产生在豚鼠接触致死量结核分枝杆菌后保护动物的细胞介导的免疫反应。
实施例3
用纯化的30KD蛋白质进行皮肤试验以检测30KD免疫之豚鼠的细胞介导的免疫反应
进行皮肤超敏感性试验以举例说明可由纯化形式的丰富细胞外产物诱导可检测的免疫反应。用按照实施例2所述方法纯化并椐信含有大约25％结核分枝杆菌总细胞外产物的主要丰富结核分枝杆菌30KD分泌产物免疫豚鼠。在三个独立的实验中，每隔三周用加在SAF佐剂中的100mg实质上纯化的30KD蛋白质豚鼠免疫三次。依同样方法将加在SAF中的缓冲液注射给对照组动物。末次免疫后三周用30KD蛋白质攻击豚鼠以进行皮肤超敏感性试验。
剃掉豚鼠背部毛并经皮内注射投用0.1、1和10μg 30KD蛋白质，24小时后检查所产生的红斑(皮肤红色)和硬结，结果如下列表A中所示。数据使用传统方法以各组的平均测定值±标准误差(SE)表示。ND表示未作本发明的这一特殊方面的实验。
表A
对30KD蛋白质的红斑反应(mm)(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1μg 1.0μg 10.0μg实验1免疫组 6 1.2±0.5 3.9±0.8 6.9±1.0对照组 5 ND ND 3.0±0.9实验2免疫组 6 0.5±0.5 5.4±0.7 8.1±0.6对照组 3 0±0 2.5±0 1.7±0.8实验3免疫组 6 ND 1.7±1.1 6.2±0.3对照组 3 ND ND 2.0±0.0
对30KD蛋白质的硬结反应(mm)(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1.μg 1.0μg 10.0μg实验1免疫组 6 0±0 3.3±0.3 5.6±0.9对照组 5 ND ND 1.6±1.0实验2免疫组 6 0±0 3.8±0.7 4.9±1.2对照组 3 0±0 0.8±0.8 1.7±0.8实验3免疫组 6 ND 1.1±1.1 4.7±0.4对照组 3 ND 0±0 0±0
如表A所示的显著红斑和硬结所证实的，用30KD分泌产物免疫的豚鼠表现出强的细胞介导的免疫反应。相反，对照组动物则表现很小的反应。
为了进一步证实30KD分泌产物的免疫反应性并显示其对传染性结核病的可应用性，用结核分枝杆菌感染非经免疫的豚鼠并用该蛋白质攻击动物。
实施例4
检测结核分枝杆菌感染之豚鼠的细胞介导的免疫反应的纯化之30KD蛋白质试验
为了获得用于实验中感染豚鼠所需的细菌，首先将结核分枝杆菌培养于7H11琼脂上并通过豚鼠肺传代一次以保证它们是有毒力的。为此，用含有大约5×104个细菌/ml的加在7H9培养液中之10ml细菌悬液的气雾剂攻击豚鼠。豚鼠发病后，杀死动物并切除包含明显的结核分枝杆菌损伤的肺。将每叶肺研碎并在7H11琼脂上培养7天至10天。从平皿上刮取细菌，在含有10％甘油的7H9培养液中稀释，在水浴中超声处理以得到单细胞悬液，并以大约2×107个活菌/细胞的浓度于-70℃缓慢冷冻。经融化细菌悬液并在7H11琼脂上培养悬液的系列稀释液来检测冷冻之细胞的存活率。刚好在攻击之前，融化一小瓶细菌细胞并在7H9培养液中稀释到所需的浓度。
使豚鼠在一特殊设计的有机玻璃气雾室中接触活结核分枝杆菌的气雾。气雾室大小为14×13×24英寸，并在相反侧面上包括两个6英寸直径的门以用来引入或放出豚鼠。气雾入口位于小室顶盖的中心。真空泵(Gast Mfg.Co.，Benton Harbor，Michigan)于301b/英寸2的速度将空气送到气雾喷射管单元(Mes Inc.，Burbank，Cali-fornia)并从10ml细菌悬液产生气雾。一个0.2μm呼吸循环过滤单元(Pall Biomedical Inc.，Fajardo，Puerto Rico)位于小室的一端，用以平衡装置内部和外部的压力。为安全考虑，用全部置于层流罩内的小室进行气雾攻击。
使动物接触病体原气雾30分钟，在此期间完全排出气雾器中的细菌悬液。每次从含有大约5.0×104细菌颗粒/ml的10ml悬液产生气雾。先前的研究已显示，接触这一浓度细菌的未受保护豚鼠均发生了感染。气雾感染后，将豚鼠圈养在置于层流安全罩(AiroClean Engineering Inc.，Edgernont，Pernnsylvania)内的不锈钢笼中并观察疾病征象。在整个实验期间，动物可自由接近标准的豚鼠食物和水。
在该实验中，杀死被感染的豚鼠并检测在对各种浓度之30KD蛋白质反应中出现的脾淋巴细胞增殖情况。更具体地说，按Brie-man和Horwitz(J.Exp.Med.164：799-811；列为本文参考文献)所述方法制备并纯化脾淋巴细胞。将加在含有青霉素(100v/ml)、链霉素(100μg/ml)和10％胱牛血清(GIBCO)之RPMI 1640(GIBCOLaboratories，Grancl Island，New York)中的淋巴细胞调到107/ml的终浓度，并在微量试验孔(96孔圆底组织培养板；Falcon Labware，Oxnard，California)中以100ml的总体积，在5％CO2-95％空气和100％湿度条件下于37℃与不同浓度的纯化30KD分泌产物一起保温2天。使用未被感染的动物作为阴性对照。保温结束时，向各孔内加入0.25μCi〔3H〕胸腺嘧啶(New England NaClear，Boston，Mas-sachusetts)并在5％CO2-95％空气和100％湿度环境下将细胞继续于37℃保温2小时。使用多样品自动细胞收获器(Skatron Inc.，Sterling，Vinginia)洗各小孔，并使流出物通过过滤垫(Skatron)。将代表分立微量试验孔的滤垫部分放在闪烁瓶中，并加入2ml EcoscintH液体闪烁混合液(National Diagnostics，Manyille，New Jersey)。在3闪烁计数器(Beckman Instruments Inc.，Fullerton，Califotnia)中检测β粒子发射。
对1和10μg/ml分离的30KD分泌蛋白质检测得自被感染和未被感染豚鼠的组织样品。然后监测样品掺入〔3H〕胸苷的能力。下列表B中给出了这些检测的结果。
数据是本公开目的作为刺激指数给出的，其定义为：与抗原一起保温的淋巴细胞的平均〔3H〕胸苷掺入/没有加抗原保温的淋巴细胞的平均〔3H〕胸苷掺入。
表B对30KD蛋白质的刺激指数
豚鼠状态 n 0.1.μg/ml 10.0μg/ml
感染的 6 2.2±0.2 9.7±4.6
对照组 6 1.5±0.3 2.0±0.8
如表B中所示，被感染动物的细胞表现出对30KD蛋白质的强反应，即在对该主要丰富分泌产物的反应中出现明显的剂量依赖性脾淋巴细胞增值。相反，未被感染的动物则只显示很少的淋巴细胞增值。因此，30KD分泌产物可在结核分枝杆菌感染的哺乳动物体内明显的诱导细胞介导的免疫反应。
为了举例说明本发明疫苗的保护性方面，用纯化的30KD蛋白质免疫豚鼠并按下述方法使动物接触结核分枝杆菌。
实施例5
用气雾化的结核分枝杆菌攻击30KD蛋白质免疫的豚鼠
如前所述，以三周间隔用加在SAF中的100μg 30KD分泌蛋白质将动物免疫三次。用加在SAF中的120μg整体EP免疫对照组豚鼠，或用加在图一佐剂中的缓冲液进行假免疫。末次免疫后三周，按实施例4中所述方法用气雾化结核分枝杆菌攻击动物。监测三组动物的存活率，并图解显示于表4中。下列表C中给出了攻击后14周确定的绝对死亡率。
表C
豚鼠状态 存活数/受攻击数 百分存活率30KD免疫的 4/6 67％
EP免疫的 3/6 50％
假免疫的 1/6 17％
如图4中所示：用30KD蛋白质免疫三次的豚鼠受到保护而免于死亡。用30KD蛋白质免疫的豚鼠约有67％存活，而只有17％假免疫的对照组豚鼠存活。
还监测了被免疫动物的体重保留情况(数据未示出)，并进一步说明掺入了按本发明教导由病原菌生产主要丰富细胞外产物的疫苗的预防能力。虽然被免疫动物似乎保留其体重，但假免疫动物的高死亡率使得在被免疫动物和对照组动物之间不可能作出图解比较。
在得出体重监测研究的结论之后，杀死存活的动物并检测每只动物右肺和脾中的活结核分枝杆菌。将动物浸在2％酚衍生物溶液(National Laboratiories，Montvale，New Jersey)中，并无菌切除肺和脾脏。肉眼观察计数肺中大体初级表面损伤的数目。用研钵和杵及90目Norton Alunduin(Fisher)在10ml 7H9中制备各器官匀浆，在7H9中系列稀释组织匀浆液，并以每滴0.1ml的悬液滴大小在7H11琼脂的复制平皿上培养各稀释液，以检测右肺和脾脏中结核分枝杵菌的集落形成单位(CFU)数目。所有平皿均保持在模式保温箱小室中，并在5％CO2、95％空气及100％湿度条件下于37℃保温12至14天。使用该方法进行检测试验，结果以平均集落形成单位(CFU)±标准误差(SE)表示并示于下列表D中。
表D
平均CFU±SE
豚鼠状态 n 右肺 脾
30KD免疫的 4 3.4±1.7×107 7.7±3.9×106
假免疫的 1 1.8×108 8.5×107
对数差 0.73 1.04
如表D中所示，用30KD分泌蛋白质免疫限制了肺和脾中结核分枝杆菌的生长。虽然用于比较目的数据只是从一只存活的假免疫动物得到的，但四只存活的30KD蛋白质免疫的动物肺中的CFU比存活的假免疫动物低0.7对数值，而脾脏中CFU比存活的假免疫动物低1个对数值。基于以前证明的CFU计数与死亡率间的高度相关性，存活的动物在肺和脾脏中很可能比在进行CFU分析前即已死亡的动物有较少的CFU数目。被免疫动物的肺和脾脏中这种CFU数的降低再次明确地证明了本发明的范围和可操作性。
还以其分离的形式试验了另一种结核分枝杆菌主要丰富细胞外产物即71KD细胞外产物的免疫保护潜作用，以证明其免疫保护能力。
实施例6
用纯化的71KD蛋白质对整体EP制剂免疫的豚鼠进行皮肤试验
为了证明71KD蛋白质在动物体内引发有效免疫反应的能力，使用这种分离的主要丰富细胞外产物以皮肤超敏感性试验法对用整体结核分枝杆菌制剂免疫的豚鼠进行皮肤试验。如上所述，整体EP将赋予动物以抗结核分枝杆菌感染的获得性免疫，但反应程度比用本发明的疫苗小些。
用120μg按实施例1中所述方法制备的整体EP制剂以三周间隔免疫豚鼠两次。在不完全弗氏佐剂中制备用于免疫接种的疫苗，且假免疫动物只接受缓冲液以代替EP。末次免疫接种后三周剃掉各组豚鼠背部的毛，并经皮内注射0.1、1.0和10μg的71KD蛋白质以进行皮肤试验。使用10.0μg缓冲液作为对照，且所有注射的总体积均为0.1ml。24小时后测量红斑和硬结的直径，结果示于下列表E中。各组试验的结果均以平均测量值±使用传统方法求得的标准误差(SE)来表示。
表E
对71KD的红斑反应(mm)(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1μg 1.0μg 10.0μg
免疫的 4 6.5±0.7 11.9±1.4 18.9±2.2
对照组 3 2.5±1.4 5.0±2.9 11.8±2.1
对71KD的硬结反应(mm)(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1.μg 1.0μg 10.0μg免疫的 4 3.6±1.1 6.8±1.1 18.9±0.8对照组 3 0.7±0.7 3.7±0.9 7.8±1.0
被免疫动物的反应几乎是单独用缓冲液攻击之豚鼠反应的两倍，并且与用整体EP攻击之动物的反应差不多(所说的整体EP)相同于用来免疫动物的EP)(数据未示出)。
为了进一步证实纯化的71KD主要丰富细胞外产物引发细胞介导的免疫反应，杀死整体EP免疫的豚鼠，并检测在对各种浓度71KD蛋白质反应中的脾淋巴细胞增殖情况。使用未免疫的动物作为对照。按照实施例4的方法将淋巴细胞与71KD蛋白质一起或不加71KD蛋白质保温2天，然后检测它们掺入〔3H〕胸苷的能力。
数据以按实施例4中所述法计算的刺激指数表示。该71KD蛋白质攻击的结果示于下列表F中。
表F
对71KD的刺激指数(平均值±SE)豚鼠状态 n 00.1.μg/ml 0.1μg/ml 1.0μg/ml免疫的 4 1.5±0.1 2.3±0.5 8.1±2.2对照组 2 1.7±0.6 1.6±0.4 2.5±0.6
对ED的刺激指数(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.01.μg/ml 0.1μg/ml 1.0μg/ml免疫的 4 1.5±0.1 2.2±0.3 5.3±1.4对照组 2 1.4±0.2 1.5±0.2 1.2±0.1
如表F中所示，淋巴细胞增殖试验的刺激指数与皮肤超敏感性试验中得到的结果差不多。71KD和整体EP试验样品均显示出比对照组高2或3倍的反应，表明分离的71KD主要丰富细胞外产物能够在用结核分枝杆菌提取物免疫之动物体内引发细胞介导的免疫反应。但应再次强调的是，纯化的主要丰富的或基本的细胞外产物没有与现有技术中的疫苗或整体制剂相关的问题，并且更容易合成及商业化生产优于观有技术的本发明的疫苗。
更具体地说，不可能很容易地通过现代分子生物学技术大批量制造整体制剂。商业化生产这些含有所有细胞外产物的非精制整体制剂的任何方法应包括大量培养靶病原体或密切相关种的病原生物体并收获所得到的上清液。这种生产方法很容易被靶病原体、毒性副产物或其他寄生因素污染。另外，这些制剂中的许多免疫原性决定簇很可能会在被免疫群体的敏感者体内引发毒性免疫反应。使用这些非精制的整体制剂还会导致不能有效地进行目前用于结核筛选和控制的最通用皮肤试验。
相反，可以使用高产率转化的宿主以相对高的安全性大量生产本发明的疫苗。同样，可以相同的，容易实现批量标准化的方法生产本发明的疫苗，这正好与变化范围较宽的整体细胞外产物的生产相反。再者，由于呈递给宿主免疫系统的免疫原性决定簇的数目相当小，所以大大降低了毒性反应和导致通用筛选试验无效的机会。
实施例7
对71KD蛋白质免疫之豚鼠的纯化71KD蛋白质皮肤试验
在证明分离的71KD主要丰富细胞外产物在整体EP免疫的动物体内产生细胞介导的免疫反应之后，即显示纯化形式的这种主要丰富细胞外产物能够在71KD免疫的动物体内诱导细胞介导的免疫反应。
以三周间隔期，用加在SAF中的100μg纯化的71KD蛋白质接种豚鼠两次。以同样的程序用加在SAF中的缓冲液假免疫对照组动物。末次免疫后三周用1和10μg分离的71KD蛋白质皮内攻击两组动物。24小时后测量所产生的红斑和硬结大小，结果示于下列表G中。
表G
对71KD的红斑反应(mm)(M均值±SE)
豚鼠状态 n 0μg 1.0μg 10.0μg
经免疫的 3 0±0 6.5±1.5 15.0±1.5
对照组 3 0±0 2.7±1.3 6.7±1.3
对71KD的硬结反应(mm)(平均值±SE)
豚鼠状态 n 0μg 1.0μg 10.0μg
经免疫的 3 0±0 3.0±1.0 9.3±0.3
对照组 3 0±0 0±0 1.3±1.3
在经免疫动物中，硬结和红斑形成的程度远大于未经免疫的对照组动物，证明接种本发明的疫苗引发了强的抗71KD蛋白质的细胞介导的免疫反应。
为了进一步证实这种丰富细胞外产物本身按照本发明的技术诱导有效免疫反应的能力，进行了淋巴细胞增殖试验。杀死如表G中所示经过免疫的动物，并使用实例4中确定的方法进行脾淋巴细胞增殖试验。用0.1、1和10μg/ml分离的71KD蛋白质攻击得自71KD蛋白质免疫之豚鼠和对照组豚鼠的组织样品，并监测它们掺入〔3H〕胸苷的能力。按前述方法计算刺激指数。这些试验的结果示于下列表H中。
表H
对71KD的刺激指数(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1μg/ml 1.0μg/ml 10.0μg/ml经免疫的 3 4.0±1.3 5.6±2.5 12.2±5.1对照组 3 1.3±0.3 1.3±0.3 3.2±1.5
与皮肤超敏感性试验一样，71KD蛋白质免疫动物显示了对纯化的71KD蛋白具有比假免疫对照组动物更高的反应。虽然可以预期外源蛋白质带来的后果，但这些结果清楚地表明主要丰富细胞外产物具有诱导细胞介导之免疫反应的能力。
在确认分离的主要丰富细胞外蛋白质将诱导有效的细胞介导之免疫反应后，进行如下所述的进一步的实验，以证实这种抗结核菌的反应是交叉反应性的。
实施例8
用纯化的71KD蛋白质攻击感染结核
分枝杆菌的豚鼠
按实施例4中所述方法用气雾化结核分枝杆菌感染未经免疫的豚鼠。利用纯化的蛋白质衍生物(PPD-CT68；Connaught Laborato-ries Ltd.)作为阳性对照的保证被感染动物出现作为结核分枝杆菌感染指征的细胞介导的免疫反应。广泛用于检测结核病接触的Mantoux试验中的PPD一般是以硫酸铵分级分离法制备的，并包含有平均分子量的为10KD的小蛋白质的混合物。对PPD的免疫反应实质上是与使用按实施例1中所述方法分离的整体EP部分引发的免疫反应相似的。
感染后三周，用0.1、1和10μg举例的纯化之主要丰富71KD细胞外蛋白质皮内注射攻击豚鼠。用未感染的动物作为对照并用分离的蛋白质进行相似地攻击。24小时后测量红斑和硬结大小，结果示于下列表I中。
表I
对71KD的红斑反应(mm)(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1μg 1.0μg 10.0μg感染的 7 9.5±1.7 13.4±1.3 19.7±1.3对照组 6 2.3±2.3 3.5±2.2 7.8±1.9
对71KD的硬结反应(mm)(平均值±SE)
豚鼠状态 n 0.1μg 1.0μg 10.0μg
感染的 7 5.3±1.8 8.7±1.6 13.4±1.1
对照组 6 0±0 0.8±0.8 0±0
如表I中所示，在用本发明纯化的主要丰富细胞外蛋白质攻击的被感染动物体内出现了强免疫反应。这种反应中就红斑形成来看比未感染动物大3至4倍，就硬结形成来看比未感染动物强10倍，从而进一步证实该优势71KD细胞外蛋白质可在结核分枝杆菌感染的动物体内诱导强的细胞介导的免疫反应。
为了进一步证实这些结果，杀死被感染和未被感染的动物，并按照实施例4的方法进行淋巴细胞增殖试验。检测这两组豚鼠的组织样品对0.1、1和10μg/ml分离之71KD蛋白质和PPD的细胞增殖反应。按前述方法监测这些样品掺入〔3H〕胸苷的能力，结果示于下列表J中。
表J
对71KD的刺激指数(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1μg/ml 1.0μg/ml 10.0μg/ml感染的 3 2.4±0.5 6.2±1.8 29.1±16.2对照组 3 1.1±0.1 2.6±0.8 18.2±6.1
对PPD刺激指数(平均值±SE)豚鼠状态 n 0.1μg/ml 1.0μg/m1 10.0μg/ml感染的 3 1.0±0.1 4.0±1.5 11.4±3.4对照组 3 0.9±0.2 0.9±0.03 1.5±0.3
同皮肤敏感性试验的结果一致，表J显示被感染的组织比未经免疫样品的刺激指数高得多。更具体地说，被感染动物对71KD蛋白质的平均峰值刺激指数比未经感染的对照组动物高2倍，对PPD则比未经感染的对照组动物高3倍，表明本发明的主要丰富细胞外蛋白质疫苗在结核分枝杆菌感染的动物体内诱导了强的细胞介导的免疫反应。
在证明纯化的71KD主要丰富蛋白质和结核分枝杆菌间的这种交叉反应性后，进行下一步实验以证明这些按本发明所述方法纯化的主要丰富细胞外产物的样品可刺激有效的免疫反应。
实施例9
用气雾化的结核分枝杆菌攻击
71KD蛋白质免疫的豚鼠
为了证明主要丰富或基本细胞外蛋白质疫苗的免疫保护能力，间隔三周用100μg按实施例2所述方法纯化的主要丰富71KD蛋白质将豚鼠免疫两次。用120μg实施例1的整体EP或缓中液免疫对照组动物。免疫所有动物时均使用SAF佐剂。末次免疫后3周，用10μg 71KD蛋白质对已用71KD蛋白质免疫的豚鼠进行皮肤试验，以估计是否发展了细胞介导的免疫反应。然后按实施例4中所述方法用气雾化结核分枝杆菌感染对照组动物及71KD蛋白质免疫的豚鼠。感染后6个月内监测并称量动物体重。
将图5所示曲线相比较可见假免疫的动物体重降低，而71KD和整体EP免疫的动物显示相对正常的体重增加。各组的数据均以平均体重±SE表示。同样动物的死亡率曲线示于图6中。下列表K中报告了该项研究的绝对死亡率。
表K
豚鼠的状态 存活数/受攻击数 百分存活率71KD免疫的 3/6 50％EP免疫的 5/8 62.5％假免疫的 0/6 0％
体重丢失曲线和死亡率清楚地表明，本发明的主要丰富细胞外蛋白质赋予了预防性免疫反应。未经免疫的动物在监测期间结束前100％死亡的事实进一步证实了这一点。
实施例10
用气雾化结核分枝杆菌攻击71KD蛋白质
免疫的豚鼠
进行相似的实验以证实以前实施例的结果，并显示投用基本细胞外蛋白质可在动物体内引发保护性免疫反应。在该实验中，再次以3周间隔期用100μg 71KD细胞外蛋白质(加在SAF中)将豚鼠免疫三次。对照组豚鼠用加在SAF中的缓冲液进行假免疫。末次免疫后3周用气雾化结核分枝杆菌攻击动物，并每周测体重，共监测13周。计算每组6只豚鼠的平均体重±SE，并图解显示于图F中。该曲线表明在监测期间假免疫动物丧失了大量体重，而经过免疫的动物则保持相当恒定的体重。因为体重丧失或“消耗”是结核病的典型症状之一。所以这些结果表明结核菌在被免疫动物体内的生长和增殖受到了本发明疫苗的抑制。
通过接种分离形式的丰富细胞外产物已在豚鼠中引发了保护性免疫，进行下一步的实验以证明本发明疫苗的种间免疫反应性，并进一步证实豚鼠模型的有效性和可应用性。
实施例11
用纯化的71KD蛋白质试验PPD阳性病人
的细胞介导的免疫
为了估计人对71KD主要丰富蛋白质之免疫反应的细胞介导的成分，按照上文实施例4中所述的标准淋巴细胞增殖检测法，研究得自PPD阳性和PPD阴性个体的外周血淋巴细胞对该蛋白质的增殖反应。阳性PPD或结核菌素反应作为以前接触过结核分枝杆菌的指征，是本领域熟知的。在两天和四天时检测增殖反应和相应的〔3H〕胸苷掺入。这些研究的数据示于图8A和8B中。图8A显示两天后对不同剂量水平71KD蛋白质的反应；图8B显示四天时的同样反应。
如图8A和8B中图解显示的，PPD阳性个体的平均峰值刺激指数比PPD阴性个体对71KD蛋白质的反应高两倍，对PPD的反应高三倍。在PPD阳性个体中，对71KD蛋白质和对PPD的峰值刺激指数间存在着线性相互关系，证明结核分枝杆菌的最优势或主要的丰富细胞外产物在以前接触过结核分枝杆菌的人体内刺激了强的细胞介导的反应。这一数据同见于豚鼠的反应性特征相符，并进一步证明豚鼠模型可应用于研究其他经受感染的哺乳动物。
因此，同以前讨论的30KD蛋白质一样，抗主要丰富71KD细胞外产物之强免疫反应的发展证明了本发明的宽范围，事实表明71KD产物也可在人体内有效地刺激细胞介导的免疫反应。
另外，应强调的是，本发明不只限于结核分枝杆菌的细胞外产物和使用71KD蛋白质。本发明的技术还可适用于如实施例中证明的任何主要丰富细胞外产物。
完成进一步的研究，以确定是否会用结核分枝杆菌的主要丰富细胞外产物也会提供保护性免疫。总地说来，这些研究是利用以各种不同剂量的疫苗，并以3或4周间隔期经皮内或皮下免疫三次的豚鼠进行的，其中所说的疫苗含有以不同方式组合的加在SAF中的5种纯化的结核分枝杆菌细胞外蛋白质。
用于免疫程序的标记为组合I的第一种蛋白质组合包括按实施例2中所述方法纯化的71KD、32A KD、30KD、23KD和16KD蛋白质。相信这种组合含有高达60％的正常存在于结核分枝杆菌培养物上清中的总细胞外蛋白质。图2中用星号标示选择用于组合I的这些蛋白质。经皮内注射与佐剂SAF一起投用含有100μg、20μg或2μg各蛋白质的组合I疫苗。另外在相似实验中使用含有20μg各蛋白质的组合I疫苗。以相同程序用等体积SAF和缓冲液免疫阴性对照豚鼠，并使用120μg按实施例1所述方法制备的整体细胞外蛋白质制剂(加在SAF中)免疫阴性对照豚鼠。所有注射体积均使用缓中液调到标准体积。
实施例12
组合I免疫的豚鼠对用组合I疫
苗攻击的反应
进行皮肤超敏感性试验，以确定动物在接种基本细胞外产物的组合I混合物后是否发展了可检测的免疫反应。在豚鼠背部剃毛后皮内注射1.0μg和10.0μg同样组合的五种纯化的细胞外蛋白质。使用10.0μg缓冲液作为对照并且所有注射均以0.1ml的总体积进行。注射后24小时测量皮肤试验部位红斑和硬结的直径。
测量结果示于下列表L中。数据均以各组的平均测定值±以传统方法确定的标准误差(SE)表示。ND表示未进行这一特定的检测。
表I
豚鼠状态 红斑(mm) (平均值±SE)
nP D 1.0μg 10.0μg
经免疫的 6 0 11.4±4.6 17.4±2.6
对照组 6 0 ND 6.0±0.5
硬结(mm) (平均值±SE)
nP D 1.0μg 10.0μg
经免疫的 6 0 7.3±0.8 11.6±1.2
对照组 6 0 ND 4.2±0.3
这些数据清楚地证明，接种疫苗的动物产生了抗组合I细胞外蛋白质的强细胞介导的免疫反应。经过免疫的豚鼠的红斑和硬结测量值几乎比对照组动物大三倍。
实施例13
对抗气雾化结核分枝杆菌的组合I疫苗免疫保护性分析
末次免疫后三周，用气雾化结核分枝杆菌(Erdman菌株)攻击用于前述超敏感性试验的豚鼠，并每周测动物体重连续10周。按实施例4中所述方法进行该气雾攻击。同时用气雾化结核分枝杆菌攻击6只用100μg组合I的基本细胞外产物免疫的动物，以及同样大小组的阴性和阴性对照组动物。阳性对照组三次免疫接种加于SAF中的120μg EP。
解剖观察期间结束前即已死亡的动物并检查其大体结核病损伤的迹象。研究期间终了时发现所有动物均有这样的损伤。
经重复进行方差分析(ANOVA)，分析气雾攻击后免疫组和对照组动物平均体重间的差异。经双尾Fisher精确试验分析攻击后免疫组和对照组豚鼠的存活率差异。数据是每组6只豚鼠的平均体重±标准误差(SE)。
攻击后每周体重测量的结果示于图9中。与用组合的细胞外产物免疫的豚鼠相比，假免疫的动物体重减少了其总体重的15.9％。阴性对照组的体重与合用五种纯化之细胞外蛋白质免疫的动物体重相似。攻击前直接取标准化体重。经重复检测ANOVA，发现组合I疫苗免疫的动物和假免疫的动物之间有显著性差异，p＜0.0000001。
攻击后十周半确定死亡率。所有三只假免疫动物均在攻击后的十和十周半之间的三天内死亡。下列表M中给出了死亡率监测结果。
表M
豚鼠状态 存活数/受攻击数 百分存活率
联合免疫的 6/6 100％
EP免疫的 5/6 83％
假免疫的 3/6 50％
在得出体重监测研究的结论之后，经引发高碳酸血症处死存活的动物，并使用实施例5所述方法检测每只动物右肺和脾中的活结核分枝杆菌数。下列表N中给出了包括三只在实施的最后一周死亡的动物的计数结果，并且数值以平均集落形成单位(CFU)±标准误差(SE)表示。
表N
平均CFU±SE豚鼠状态 n 右肺 脾假免疫的 6 8.9±5.4×107 1.3±0.7×107免疫的 6 3.4±1.7×106 1.8±0.6×106EP免疫的 6 1.7±0.7×107 5.0±2.8×106
使用联合的纯化蛋白质免疫的动物与假免疫的动物肺内细菌浓度间的对数差为1.4，而脾内细胞浓度的对数差为0.9。将经过免疫动物的尸体解剖组织与假免疫的对照组动物的组织并列比较，大体观察可见前者肺内结核损伤明显降低。用实施例1的整体细胞外制剂(EP)免疫的阳性对照组动物与用纯化之细胞外蛋白质的组合I混合物免疫的动物相比，前者肺中细胞计数比后者多0.7个对数值，脾中细菌计数值比后者多0.5个对数值。
实施例14
皮内和皮下投用低剂量组合I疫苗
所产生的免疫保护作用分析
虽然实施例13证实以每种蛋白质(30＋32A＋16＋23＋71KD)100μg的剂量，用组合I蛋白质每隔4周皮内注射免疫动物三次可产生免疫保护作用，但还需作另外的研究以证明低剂量特别是各20μg或2μg的组合I蛋白质的免疫保护能力。按实施例13中所述方法，以3周间隔期用组合I蛋白质(30＋32A＋16＋23＋71KD)与SAF一起皮内注射免疫豚鼠4次。每次免疫时动物均接受20μg或2μg每种蛋白质。对照组动物是利用前述方法进行假免疫的。末次免疫后3周，用气雾化结核分枝杆菌攻击动物并在9周内每周测动物体重。所有经过免疫的动物均存活到实验结束时，而一只假免疫动物在实验结束前死亡。如下示结果所表明的，既使剂量比实施例13中使用的剂量低5倍甚至50倍，仍可保护被免疫动物免于遭受气雾化结核分枝杆菌的攻击，并且皮内和皮下途经给药都是有效的。
与用每种蛋白质各20μg的组合I疫苗免疫的豚鼠相比，假免疫的动物在9周实验期间体重丢失总体重的12％(攻击之前标定体重)。与用每种蛋白质各3μg的组合I疫苗免疫的豚鼠相比，假免疫的动物丢失了其标定的总体重的11％。因此，用低剂量组合I蛋白质皮内注射免疫的豚鼠在遭受结核分枝菌气雾攻击后可能阻止体重的丢失。
同样，用低剂量组合I蛋白质皮内注射免疫的豚鼠可对抗与结核分枝杆菌浸染脾脏有关的过度脾肿大。如表O中所示，用每种蛋白质各20μg或2μg的组合I蛋白质免疫的动物平均脾重分别为4.6±1.29和4.0±0.89(平均值±SE)，而假免疫的动物脾脏称重量平均为1.96±1.8g，或高达前者的2倍以上。
表O
脾脏重量(g)
豚鼠的状态 n 平均值±SE
假免疫的 5 9.6±1.8
免疫的(20μg) 6 4.6±1.2
免疫的(2μg) 6 4.0±0.8
用低剂量组合I蛋白质皮内免疫的豚鼠在其脾脏中也有较少的结核分枝杆菌CFU计数。如表P中所示，在用各20μg或2μg的组合I蛋白质免疫之豚鼠的脾脏中，CFU计数分别比假免疫动物平均少0.6和0.4个对数值。
表P
脾脏中的CFU豚鼠状态 n 平均值±SE 对数差假免疫的 5 3.1±2.3×106免疫的(20μg) 6 8.1±2.4×105 -0.6免疫的(2μg) 6 1.2±0.6×106 -0.4
此外，用组合I蛋白质皮下免疫的豚鼠也可阻止体重丢失，脾肿大及结核分枝杆菌在脾脏中的生长。在与实施例14所述者相同的实验中，还以3周间隔期用20μg组合I蛋白质经皮下而不是皮内免疫豚鼠4次。这些动物几乎同使用20μg组合I蛋白质经皮内免疫的动物一样免遭攻击。
实施例15
组合I和组合II免疫的豚鼠对组合I
和组合II攻击的反应
进行附加研究以确定是否结核分枝杆菌主要丰富细胞外蛋白质产物的其他组合也可提供保护性免疫。一项研究是利用含有两种组合即组合I(71、32A、30、23和16KD)和组合II(32A、30、24、23和16KD)的疫苗免疫豚鼠。相信组合II中含有高达62％的正常存在于结核分枝杆菌培养物上清中的总细胞外蛋白质。用含有100μg各种蛋白质的组合工或II(加在SAF中)免疫动物(每组6只)4次(每次间隔3周)。按同样程序用等体积SAF和缓冲液假免疫阴性对照组动物。
按实施例12中所述方法对动物进行皮肤迟发型超敏感性试验，以确定动物在疫苗接种后是否产生了可检测的免疫反应。用组合II免疫的动物在对组合II之皮肤试验的反应中产生16.8±1.3mm(平均值±SE)大小的红斑和12.8±1.2mm大小的硬结；而假免疫的动物在对组合II的反应中只出现1.3±0.8mm大小的红斑和0.3±0.3mm大小的硬结。可见，组合II免疫之动物红斑比对照组动物大12倍，硬结比对照组大40倍。相比之下，组合I免疫的动物在对组合I皮肤试验的反应中出现21.3±2.0mm红斑和15.8±0.1mm硬结。而假免疫的动物在对组合I的反应中只出现6.4±0.8mm红斑和2.6±0.7mm硬结。可见，组合I免疫的动物红斑比对照组大3倍，硬结比对照组大6倍。就组合II蛋白质来说，与对照组的差异甚至比组合I蛋白质与对照组的差异还大。
在同样的实验中，用低剂量组合II蛋白质(每种蛋白质各20μg)也产生了对组合II强皮肤超敏感性反应。在对组合II的反应中它们出现有21.0±2.0mm的红斑和15.3±0.9mm的硬结，而假免疫的动物则只出现如上面提到的1.3±0.8mm的红斑及0.3±0.3mm的硬结。可见，用低剂量组合II蛋白质免疫的动物，其红斑比对照组大16倍，硬结比对照组大50倍，与对照组差异甚至比用高剂量组合II蛋白质免疫的动物还大。
实施例16
组合I和II疫苗抗气雾化结核分枝
杆菌的免疫保护分析
末次免疫后3周，按实施例13中所述用气雾化结核分枝杆菌(Erdman菌株)攻击用于前述超敏感性试验的豚鼠，并每周测体重连续7周。同实施例13中一样，每组6只动物。在攻击后的前7周内，假免疫的动物平均体重丢失19.5g。相反，用组合II疫苗(每种蛋白质各100μg)免疫的动物则体重增加了52.4g，并且用低剂量(每种蛋白质各20μg)组合II蛋白质免疫的动物平均体重增加67.2g。相比之下，用组合I免疫的动物体重增加了68g。可见，与用组合II(100μg)免疫的豚鼠相比，假免疫的动物总体重降低了11％。与用低剂量(20μg)组合II免疫的豚鼠相比，假免疫的动物总体重降低了14％。与用组合I免疫的动物相比，假免疫的动物总体重也降低了14％。
实施例17
用组合III至VII免疫的豚鼠对用同样
疫苗或其成分攻击的反应
进行附加实验以证明各种结核分枝杆菌主要丰富细胞外产物之组合的有效性。在这些实验中，用含有2种或多种按实施例2所述方法纯化之主要丰富细胞外产物的组合疫苗经皮内注射免疫Hart-ley型豚鼠。经SDS-PAGE检测，根据其表观分子量鉴定这些纯化的细胞外产物。用如下组合的主要丰富细胞外产物免疫豚鼠。
组合 蛋白质组分
III 30＋32A＋32B＋16＋23
IV 30＋32A
V 30＋32B
VI 30＋16
VII 30＋23
VIII 30＋71
IX 30＋23.5
X 30＋12
XI 30＋24
XII 30＋58
每种组合疫苗各含有100μg所列的每种蛋白质。调整组合疫苗的体积，并加在佐剂SAF中进行皮内注射。如前所述，以3周间隔期将豚鼠免疫4次。
进行皮肤超敏感性试验以确定动物是否在用组合III至XII疫苗接种后发展了可检测的免疫反应。对每组6只豚鼠背部剃毛并皮内注射与用于免疫这些动物时所使用者有同样组合的纯化的细胞外产物。为进行这一攻击，注射以各10μg的量组合的蛋白质。所有的注射均使用0.1ml的总体积完成。还用组合III至XII蛋白质，并以各个组合中每种蛋白质均为10μg的量对已只用SAF免疫的假免疫对照组动物进行皮肤试验。在按实施例3中所述方法注射后24小时测量皮肤试验部位红斑和硬结的直经。
这些测量的结果示于下列表Q中。所有数据以该组的平均测量值±使用传统方法确定的标准误差(SE)表示。
表Q皮肤反应的直径(mm)疫苗组合 皮肤试验组合 红斑 硬结III III 12.2±2.0 6.8±0.8IV IV 9.9±0.5 6.3±0.2V V 13.0±1.1 8.1±0.7VI VI 19.2±1.2 12.4±0.5VII VII 14.3±1.0 8.7±0.4VIII VIII 18.9±1.1 12.6±0.8IX IX 17.0±0.9 12.1±0.9X X 19.3±1.4 13.6±1.2XI XI 18.3±1.2 12.4±0.8XII XII 17.7±0.9 14.0±1.2假 III 4.8±0.9 2.0±0.0假 IV 4.3±1.1 2.0±0.0假 V 5.0±0.5 2.0±0.0假 VI 4.5±0.3 2.0±0.0假 VII 4.5±0.3 2.0±0.0假 VIII 3.3±0.3 2.3±0.3假 IX 3.7±0.3 2.0±0.0假 X 3.7±0.4 2.0±0.0假 XI 3.7±0.2 2.0±0.0假 XII 3.8±0.2 2.0±0.0
这些结果清楚地证明产生了对抗各种组合的纯化细胞外蛋白质的强细胞介导的免疫反应。就所有组合来说，免疫的豚鼠显示出红斑大的至少是对照组的2倍，通常是3倍或更大。此外，对于所有的组合，免疫的豚鼠的硬结大小至少是对照组的3倍。
实施例18
组合III-XII蛋白质抗气雾化结核
分枝杆菌的免疫保护性分析
为了证明这些举例组合的纯化细胞外产物的预防效果，在使用实施例4的程序进行最后一次免疫之后三周，用结核分枝杆菌攻击已用组合III至XII蛋白质免疫的豚鼠。
与较早得到的结果相一致，在受到攻击后所有用组合III至XII免疫的豚鼠均得以保护而免于死亡。在攻击后第4周，6只假免疫的动物中有2只(33％)死亡，相比之下用组合IV-XIII蛋白质免疫的动物则均未死亡，而用组合III蛋白质免疫6只动物中只有1只(17％)死亡。攻击后10周，假免疫的动物有50％已死亡，相对地用组合IX和XII免疫的动物没有死亡(0％)，用组合III、IV、V、VI、X和XI免疫的各组6只动物中有1只死亡(17％)，用组合VIII免疫的动物中5只有1只死亡(20％)，而在用组合VII免疫的动物中6只有2只死亡(33％)。
尸体剖检在观察期间结束前死亡的豚鼠，并检查其大体结核病损伤的迹象。发现在研究结束时所有动物均有损伤。
在得出死亡率研究的结论之后，经高碳酸血处理杀死存活的动物并使用实施例5的方法检查每只动物脾脏中的活结核分枝杆菌数。结果以平均集落形成单位(CFU)数连同从假免疫动物开始的对数降低值形式示于下列表R中。CFU值后面的星号指示各组中一只动物的脾脏CFU计数值为O。为计算目的，将0计数看作为103CFU/脾或3log。
表R
脾脏中的CFU疫苗组 (平均log数) 从假免疫的对数降低值III 5.99 .5IV 5.41 1.1V 6.27 .3VI ＜5.80* ＞.7VII ＜5.61* ＞.9VIII 6.47 .1IX ＜5.85* ＞.7X ＜5.74* ＞.8XI 5.93 .6XII 6.03 .5假 6.53 --
用组合III、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、IX、X、XI、和XII免疫的动物脾脏中平均结核分枝杆菌集落形成单位数至少比假免疫的对照组动物低0.5log值。特别是证明组合VI和VII尤为有效，大约使集落形成单位平均数降低10倍。用组合V和VIII免疫的动物脾脏中平均集落形成单位(CFU)数分别比假免疫的对照组低0.3和0.1log值。按照本发明的技术免疫的动物器官中集落形成单位的这种显著降低，再一次说明本发明在免疫保护上的可操作性。
实施例19
用三种不同剂量的组合XIII免疫的豚鼠
对组合XIII攻击的反应
为了进一步限定本发明的可操作性和范围，并证明其他组合方式的纯化之细胞外产物的效力，按前述方法以不同的疫苗接种剂量免疫豚鼠。具体地说，用50μg、100μg和200μg定为组合XIII并包含30KD、32(A)KD和16KD蛋白质的另外组合的3种主要丰富细胞外产物免疫动物。同前述实施例一样，以3周间隔期用加在SAF中的不同剂量的组合XIII蛋白质皮内免疫各组动物4次。
进行皮肤超敏感性试验以确定免疫后动物是否产生了可检测的免疫反应。给动物背部剃毛后皮内注射每种纯化之细胞外产物各含10.0μg的组合XIII蛋白质。注射的总体积均为0.1ml。对假免疫的对照组动物也用同样剂量的组合XIII进行皮肤试验。注射后24小时测量皮肤试验部位上红斑和硬结的直经。
结果以各组的平均测量值±按传统方法确定的标准误差(SE)表示并示于下列表S中。
表S
皮肤反应的直径(mm)疫苗组合 疫苗剂量 红斑 硬结
XIII 50 17.8±1.3 13.2±1.0
XIII 100 11.2±0.9 7.3±0.4
XIII 200 10.0±0.7 7.0±0.4
假 0 5.7±0.5 0.2±0.2
这些结果再次清楚地证明，在用三种不同剂量组合XIII免疫的各组动物体内产生了强的抗组合XIII的细胞介导的免疫反应。经过免疫的动物表现有比对照组大2至3倍的红斑。更明显地是，在所有病例中，经过免疫的动物出现了比表现有最小反应的对照组动物至少大35倍的硬结。
实施例20
三种不同剂量的组合XIII抗气雾化结核
分枝杆菌的免疫保护分析
为了进一步证明不同剂量的本发明疫苗的保护性免疫功能，末次免疫后3周用气雾化结核分枝杆菌攻击用于前述皮肤超敏感性试验的受到免疫的豚鼠(每组6只)。使用实施例4中所详述的方法进行气雾攻击。同时攻击12只假免疫的对照组动物。
攻击后每周测定体重的结果显示于图10中并分别给出了用三种不同剂量的组合XIII免疫的各组豚鼠受到保护而免于体重丢失的情况。用较高剂量组合XIII(100和200μg)免疫的动物实际上显示有体重的净增加，用较低剂量组合XIII(50μg)免疫的动物显示了相对小的体重丢失。相反，假免疫的动物在攻击后几周内体重约减少总体重的22％，并在10周观察期间里平均体重减少182g。
下列表U显示了经受免疫的动物和对照组动物的百分体重改变，其中改变值是将攻击结束时的平均体重减去攻击开始时的平均体重并将所得结果除以攻击开始时的平均体重而求得的。相似地，百分保护作用则是从被免疫动物的平均百分体重增加或减少值中减去对照组动物的平均百分体重减少值而求得的。
表U
免疫原 剂量 ％体重改变 ％免于体重丧失
组合XIII 50 -4％ 18％
组合XIII 100 +7％ 29％
组合XIII 200 +5％ 27％
假免疫 - -22％ -
表U所示的结果表明，比经过免疫的动物相比，假免疫的动物丢失了相当量的体重(18％-29％)。图10提供了在10周监测期间，以每周间隔将各组经免疫动物对假免疫动物作图，图解说明各组动物的净体重丢失情况。因为体重丢失或“消耗”是结核病的典型病征之一，所以这些结果说明结核菌在经过免疫之动物体内的生长和增殖受到了三种不同剂量的本发明组合疫苗的抑制。
实施例21
组合XIV-XVIII疫苗抗组合XIX-XVIII攻击
的免疫保护分析
为了进一步证明本发明的范围和可按本发明技术配制之有效疫苗的宽范围，在豚鼠中试验了组合XIV至XVIII这五种附加的组合疫苗。根据以SDS-PAGE方法测得的表观分子量来认定这些纯化的细胞外产物，并给出各组合疫苗的组成如下：
组合 蛋白质组成
XIV 30、32A、16、32B、24、23、45
XV 30、32A、16、32B、24、23、45、23.5、12
XVI 30、32A、16、32B、24、23
XVII 30、32A、16、32B、24、71
XVIII 30、32A、32B
I 30、32A、16、23、71
除了使用新的组合疫苗和适当的对照之外，本实验系列中还使用了组合I。用各种蛋白质各50μg的组合XIV或XV，以及各种蛋白质各100μg的组合I、XVI、XVII和XVIII(均加于SAF佐剂中)经皮内注射免疫豚鼠。每次注射间隔3周，共免疫动物4次。
疫苗接种后按前述方法进行皮肤超敏感性试验，以确定动物是否已发展了可检测的免疫反应。给豚鼠背部剃毛并给予皮内注射原用于免疫这些动物的同样组合的纯化的细胞外蛋白质。每次攻击注射含有10μg各种蛋白质的适当的组合疫苗。注射的总体积均为0.1ml。也用同样剂量各组合蛋白质对假免疫的动物进行皮肤试验。注射后24小时按实施例3中所述方法测量皮肤试验部位上红斑和硬结的直径。
这些测量的结果以平均测量值±按传统方法确定的标准误点(SE)表示，并示于下列表V中。
表V
皮肤反应的直径(mm)
疫苗组合 皮肤试验组合 红斑 硬结
XIV XIV 13.3±0.7 9.1±0.4
XV XV 10.4±0.4 6.5±0.4
XVI XVI 8.0±1.8 5.1±1.0
XVII XVII 9.4±0.9 6.1±1.1
XVIII XVIII 13.6±1.2 8.7±0.7
I I 10.0±0.3 6.7±0.2
假 XIV 5.5±1.6 0.4±0.2
假 XV 6.1±0.5 0.4±0.2
假 XVI 4.6±1.4 0.4±0.2
假 XVII 5.7±1.2 0.2±0.2
假 XVIII 2.1±1.1 0±0
假 I 6.0±1.2 0.6±0.2
这些结果清楚地证明，经免疫的动物产生了抗组合XIV至XVIII，以及抗组合I的强细胞介导的免疫反应。经受免疫的动物表现有约为对照组动物红斑两倍大小的红斑。更明显的是，在所有病例中，经过免疫的动物出现比只表现有最小反应之假免疫组动物至少大10倍的硬结。
实施例22
组合XIV-XVIII和组合I抗气雾化结核分枝
杆菌的免疫保护分析
为了进一步证实实施例21之组合疫苗的免疫反应性并证明它们对抗传染性结核病的可应用性，末次免疫后三周用气雾化结核分枝杆菌攻击用于前述皮肤超敏感性试验的经过免疫的豚鼠，并按实施例4的方法监测其体重。对用于实施例20中的12只假免疫的对照组动物也进行同样地攻击。这些攻击的结果图解显示于图11中并直接示于下列表W中。
将攻击结束时的平均体重减去攻击开始时的平均体重，并将所得结果除以攻击开始时的平均体重，以确定百分体重改变。相似地，从经过免疫之动物平均百分体重增加或减少量中减去对照组动物平均百分体重减少量，以确定百分保持作用。
表W
免疫原 ％体重改变 ％免于体重丧失
组合XIV 3％ 25％
组合XV -4％ 18％
组合XVI -15％ 7％
组合XVII -11％ 11％
组合XVIII -12％ 10％
组合I -11％ 11％
假 -22％
如表W中所示，用各组合疫苗免疫的豚鼠受到保护而避免体重丢失。受到假免疫的动物约丢失了其总计体重的22％。相反，组合疫苗的预防作用则导致其中一个试验组体重增加，而其他组则降低了体重丢失量。具体地说，用组合XIV免疫的动物体重增加了3％，而用其他组合免疫的动物则只减少了其总计体重的4％至15％。
这些结果示于图11中，其中就气雾化攻击后各组动物的净体重增加或减少以每周测定值作图。图11中显示的这种经受免疫动物和假免疫动物间的统计学上的显著性差异为使用本发明的组合疫苗产生免疫保护反应提供了进一步的证据。
实施例23
用三种不同的佐剂免疫的豚鼠体内的
细胞介导的免疫反应性
为了进一步证明本发明疫苗配制品的广泛适用性和通用性，使用不同的佐剂进行免疫原性研究。具体地说使用三种不同的佐剂即Syntex佐剂配方I(SAF)、不完全弗氏佐剂(IFA)和含单磷酰脂质A的佐剂(MPL)分别配制三种不同的免疫原即纯化的30KD蛋白质、组合I(30、32A、16、23、71)和组合XIII(30、32A、16)蛋白质。已知这些佐剂与免疫原一起使用时可增强生物体的免疫反应性。
分别用加在三种不同佐剂配方中的含每种蛋白质各100μg的组合I和XIII，以及大约100μg纯化的30KD蛋白质，经皮内注射免疫豚鼠。用每种配方共免疫豚鼠三次，每次间隔三周。
免疫后进行皮肤超敏感性试验，以确定豚鼠是否已发展了可检测的免疫反应。将豚鼠背部剃毛并给予皮内注射原用来免疫它们的相同的免疫原。攻击时，以100ml的总体积注射含每种蛋白质各10μg的组合I和XIII或10μg纯化的30KD蛋白质。用含有相同佐剂的各种免疫原配制品对已接种三种佐剂之一的假免疫的豚鼠进行皮肤试验。攻击后24小时按实施例3所述方法测量皮肤试验部位之红斑和硬结的直径。
这些测量的结果示于下列表X中，同前面讨论的数据一样，这些结果也以各组的平均测量值±按统计学方法确定的标准误差(SE)表示。
表X
皮肤反应的直径(mm)
疫苗 佐剂 皮肤试验试剂 红斑 硬结
30 SAF 30 10.7±1.6 5.8±1.5
30 IFA 30 8.8±0.7 4.6±0.7
30 MPL 30 10.2±1.7 5.3±1.5
XIII SAF XIII 7.3±0.5 4.1±0.5
XIII IFA XIII 6.8±0.9 3.5±0.5
XIII MPL XIII 6.3±0.4 3.4±0.3
I SAF I 6.9±0.6 4.0±0.3
I IFA I 6.8±0.2 3.6±0.3
I MPL I 7.4±0.4 3.9±0.5
假 SAF 30 0.7±0.7 1.0±0
假 IFA 30 0±0 0±0
假 MPL 30 0±0 0±0
假 SAF XIII 1.0±1.0 1.0±0
假 IFA XIII 0±0 0.3±0.3
假 MPL XIII 0±0 0±0
假 SAF I 4.7±0.3 1.0±0
假 IFA I 2.0±1.0 0.7±0.3
假 MPL I 1.0±1.0 0.7±0.3
如表X中给出的数据所示，本发明的组合疫苗和纯化的细胞外产物当与不同的佐剂一起配制时，引发了强的细胞介导的免疫原性反应。此外，对于各自的免疫原来说，三种佐剂中的每一种均提供了大致相同的免疫原反应。一般说来，经过免疫的动物出现约比对照组动物大7至10倍的红斑，而硬结大小则约比对照组动物大4至6倍。
本发明的疫苗与不同的佐剂联合使用以引发强免疫原反应的能力，有利于实现疫苗最佳化。即是说，可以主要基于稳定性、没有副作用、低成本和容易贮存等辅助性标准来选择用于按本文所述技术生产有效疫苗配制品的佐剂。当开发可在相对原始条件下广泛使用的疫苗配制品时，这些及其他一些并不与刺激免疫反应直接相关的标准是特别重要的。
实施例24
组合XIX-XXVIII对抗组合XIX-XXVIII攻击
的免疫保护分析
使用十种其他方式的组合疫苗即组合XIX至XXVIII产生免疫反应，以进一步证明本发明的宽范围。除了使用这些新的组合疫苗和适当的对照外，还使用组合IV和XIII作为阳性对照以引发豚鼠的免疫反应。根据以SDS-PAGE方法测得的表观分子量认定纯化的细胞外产物，并给出各组合疫苗的组成如下：
组合 蛋白质组成
XIX 30，32A，23
XX 30，32A，23.5
XXI 30，32A，24
XXII 30，32A，71
XXIII 30，32A，16，23
XXIV 30，32A，16，23.5
XXV 30，32A，16，24
XXVI 30，32A，16，71
XXVII 30，32A，16，32B
XXVIII 30，32A，16，45
IV 30，32A
XIII 30，32A，16
豚鼠总共免疫4次，每次注射的间隔期为3周。用于免疫动物的各组合疫苗均由加在SAF佐剂中的各100μg的每种蛋白质组成，以提供0.1ml的总注射体积。
使用实施例3中所述方法进行皮肤超敏感性试验以确定动物是否在接种选择的组合疫苗后发展了可检测的免疫反应。给豚鼠背部剃毛并给予皮内注射原用来免疫它们的同样组合纯化的细胞外蛋白质。用于攻击动物的蛋白质组合由各10μg每种蛋白质组成。还使用同样剂量的各组全蛋白质对经过假免疫的对照组动物进行皮肤试验。按实施例3所述，注射后24小时测量皮肤试验部位红斑和硬结的直径。
所得测量结果以各组动物的平均测定值±标准误差表示，并示于下列表Y中。
表Y
皮肤反应的直径(mm)
疫苗组合 皮肤试测组合 红斑 硬结
XIX XIX 8.5±0.6 3.9±0.3
XX XX 8.2±0.3 3.7±0.3
XXI XXI 11.1±1.1 4.5±0.4
XXII XXII 9.4±0.8 4.3±0.4
XXIII XXIII 8.3±1.1 3.0±0.3
XXIV XXIV 8.5±0.9 3.4±0.5
XXV XXV 7.9±0.5 3.2±0.4
XXVI XXVI 8.9±0.7 3.3±0.5
XXVII XXVII 7.2±1.0 2.8±0.5
XXVIII XXVIII 8.5±0.5 2.8±0.3
IV IV 9.0±0.9 4.1±0.3
XIII XIII 9.4±0.9 4.3±0.3
假 XIX 4.0±2.6 1.0±0
假 XX 1.3±1.3 1.0±0
假 XXI 3.5±1.0 1.3±1.3
假 XXII 1.3±1.3 1.0±1.0
假 XXIII 0±0 1.0±0
假 XXIV 0±0 1.0±0
假 XXV 0±0 1.0±0
假 XXVI 2.3±2.3 2.0±1.0
假 XXVII 0±0 1.0±0
假 XXVIII 2.0±1.2 1.0±0
假 IV 2.8±1.6 1.0±0
假 XIII 1.5±1.5 1.0±0
表Y中给出的结果表明，当用同样的免疫原攻击时产生了抗组合XIX至XXVIII的强细胞介导的免疫反应。与前述情况相同，组合IV和XIII也引发了强细胞介导的免疫反应。经过免疫的豚鼠所呈现的红斑至少是相应假免疫对照组动物的两倍，并证明有一般比对照组动物大四倍以上的反应。同样，经过免疫的动物所呈现的硬结至少是未免疫的对照组动物的两倍，并且一般都大3至4倍。在按照本发明的技术免疫的动物中产生了实质上更强的免疫反应再次说明了本发明组合疫苗的免疫保护可操作性。
本领域技术人员将会理解到本发明疫苗和方法的其他一些优点。例如，由于是将个别化合物或经过选择的高度纯化之分子的组合用作目的疫苗，而不是使用整个细菌或其成分，所以本发明的疫苗与现有技术中的减毒或死菌疫苗相比，其很少有可能引发毒性反应。另外，本发明的分子疫苗不会象活菌那样威胁到免疫受损的个体。事实上，可以将本发明的组合物为治疗目的用于受感染的个体，以刺激抗病原因子的特异性免疫反应。
选择性使用主要丰富细胞外产物或其免疫原类似物也可阻止调理性体液反应的发展，从而可减少细胞内细菌的致病作用。由于按本发明方法产生的保护性免疫是针对未结合的蛋白质的，所以任何调理性反应都将仅仅导致吞噬或破坏主要丰富细胞外产物，而不是加速包含寄生菌。此外，选择性使用纯化的细胞外产物可减少产生某种不良反应的可能性，由于这一反应将不能利用那些基于宿主对免疫原剂的识别的广泛使用的筛选和控制技术。与现有技术中的疫苗不同的是，仍可使用由病原体表达的，但不包括在按本发明方法制得的疫苗中的免疫反应性分子进行筛选试验。使用这样的免疫原决定簇将只能在那些已接触了靶病原体的个体内引发允许进行适当检测的反应。
与现有技术疫苗的减毒细菌及细菌成分相反，本发明的另一个优点是很容易大量获得并很容易利用本领域已知的技术分离出纯化的细胞外产物。由于对于大多数感兴趣的病原体来说，本发明的免疫反应性产物都是天然释放到细胞外环境介质中的，所以简化了除去细胞内污染物及细胞碎片的程序。此外，由于使用最优势或主要的丰富细胞外产物或其免疫原类似物刺激所需的免疫反应，所以在大多数生产系统中一般均可提高可收获产物的表达水平及培养物浓度。因此，不管使用什么生产方式，均可通过层析或超滤等常规生物化学方法很容易地完成对所需产物的大批量分离。用于本发明之免疫原决定簇的固有属性和分子特征在很大程度上有利于生产出恒定一致的、标准化的、适于大批量应用的高质量组合物。
另外，使用基于靶病原体之最优势或主要的丰富细胞外产物的免疫原性质的纯化分子化合物，还可相对容易地大批量合成产生本发明的免疫活性疫苗成分。例如，可以使用重组DNA技术将感兴趣的细胞外产物或其它疫原类似物克隆到非病原性宿主细菌中，并可安全地收获之。可以使用本领域已知的分子克隆技术，分离相当于感兴趣之细胞外产物、其类似物或其片段的DNA，并借助插入到宿主细胞如大肠杆菌中的高表达载体表达之。举例的技术可见于IIR.Anon，Synthetic Vaccines31-71(1987)，Tam et al，Incorporationof T and B Epitopes of the Circumsporozoite Protein in a ChemicallvDefined Synthetic Vaccine Against Malaria，171 J.Exp.Med.299-306(1990)，以及Stover et al，Protective Immunity Elicited bv Recom-binant Bacille Calmette-Guerin(BCG)Expressing Outer Surface Pro-tein A(OspA)Lipoprotein：A Candidate Lyme Disease Vaccine，178 J.Exp.Med197-209(1993)。
同样，可以使用普通实验室技术和自动序列分析技术，以相对纯的形式大批量化学合成细胞外蛋白质、其类似物、同源物或免疫反应性蛋白质亚单位。这种生产模式对于构建相当于细胞外产物之抗原决定簇的肽亚单位或较低分子量类似物是特别有吸引力的。生产较小蛋白质亚单位的技术是本领域已知的，并可见于II R.Anon，Syn-thetic Vaccine15-30(1987)；A.Streitwieser，Jr.Introduetion to Or-ganic Chemistry 953-55(3rd ed.，1985).可代用的技术可参见Gross et al，“Nonenzymatic cleavage of Peptide Bonds：The Methion-ine Residues in Boyine Pancreatic Ribonuclease”，237；The Journal ofBiological Chemistry No.6(1962)；Mahoney，“Migh-Yield Cleavageof Tryptophanyl Peptide Bonds by O-Iodosobenzoic Acid”，18，Bio-chemistry No.17(1979)，以及Shoolnik et al.，“Gowococcal Pili”，159，Journal of Experimental Medicine(1984)。也可以使用其他免疫原技术如使用肽、核苷酸或其他分子如模拟物分子的抗独特型或定向分子进化，以产生有效的、能够产生所需预防性反应的免疫反应性化合物。利用裸DNA作为疫苗的现有技术可见于Robinson，Pro-tection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunizationwith a Hemagglutinin-Expressing Plasmid DNA，11 Vaccine 9(1993)；Ulmer et al.，Heterologous Protection Against Influenza bvInjection of DNA Encoding a Varal Protein，259，Science(1993)。另外，Tao et al.，Idiotype/Granuloeyte-Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma，362Nature(1993)中公开了融合强免疫原性蛋白质尾部的技术；还有，Good et al.，Human T-Cell Recognition of the Circumsporozoite Pro-tein of Plasmodium Faiciparum：Immunodominant T-Cell DomainsMap to the Polymorphic Regions of the Molecule，85，Proc，Natl.A-cad，Sci.USA(1 988)和Gao et al.，Identification and Characterizationof T Halper Epitopes in the Nucleoprotein of Innuenza A Virus，143，The Journal of Inomunology No.9(1989)中描述了T细胞表位基因图。
由于许多细菌属都表现有同源性，所以前述实施例只是举例说明而不是限制本发明的范围和内容，也不是将本发明限制到分枝杆菌属或其中的特定种或血清型或单独抗结核病的疫苗。还应再次强调的是，微生物的DNA和相应蛋白质的种间同源性的普通存在，使本发明的疫苗有可能诱导交叉反应性免疫。因为主要丰富细胞外产物的免疫优势表位可提供对抗选定菌属之其他种和血清型攻击的交叉反应性免疫，所以本领域技术人员将会认识到，可使用一个种的细胞外产物或免疫原类似物发展对抗另一个种之微生物感染的疫苗。
例如，牛分枝杆菌和结核分枝杆菌间有90％至100％的同源性，并且在引发免疫反应方面是有高度交叉反应性的。因此，基于牛分枝杆菌或其他分枝杆菌的丰富细胞外产物的疫苗可提供对抗结核分枝杆菌感染的不同程度的保护作用，并且反之亦然。因此，使用适当的主要丰富细胞外产物之高度同源的免疫原决定簇，提供对抗同一菌属之几个种细菌的免疫预防性反应应考虑包括于本发明的范围内。
还应强调指出的是，可以按许多不同的形式使用为实践本发明而选择的免疫原性决定簇，借以引发有效的免疫反应。因此，向宿主免疫系统呈递选择之主要丰富细胞外产物的一个或多个免疫原决定簇不是很严格的，可以为有利于其生产或给药而改变之。例如，可以使用全部细胞外产物或其包括前述肽、蛋白质亚单位、免疫原性类似物和同系物的任何免疫刺激部分来配制本发明的疫苗。只要能够引发有效的免疫预防反应，主要丰富细胞外产物及其分子类似物的较小蛋白质亚单位均包括在本发明的范围内。此外，重组蛋白质产物例如融合蛋白质或通过已知的分子重组技术修饰的细胞外产物在总体上是与本发明的技术相容的。再者，免疫原上产生的所选择的免疫活性决定簇的类似物，例如抗独特型抗体、或使用定向进化技术衍生的肽及核苷酸也包括于本发明的范围内。
同样，免疫原剂的配制和向宿主免疫系统的呈递并不限于蛋白质或其类似物在佐剂中制成的溶液。例如，衍生于适当细胞外蛋白质的免疫原决定簇可以在不同种的非病原性的细菌、噬菌体、支原体或病毒上表达并用重组技术修饰。在这种情况下，可配制完整的活生物体并用于刺激所需的反应。相反，当在敌对环境中进行大规模疫苗接种时，可能需要很稳定的没有加入佐剂或添加剂的配方。另外，当经受冻干或口服给药或胶囊包裹等苛刻条件时，疫苗配制应有利于保持活性成分的稳定性和免疫反应性。因此，本发明包括大量根据产物的预期用途而定的含目的疫苗之免疫原决定簇的不同配方。
本领域技术人员将会理解到，可利用常规实验来确定各种病原体和宿主的疫苗剂量。目前，据信，最低适用剂量将是0.1μg数量级，但对于适当的系统来说，2.0μg、20.0μg、100μg剂量，甚至1mg剂量可能是最适宜的。可使用本领域已知的任何常规免疫技术和次序投用适当的剂量。
本领域技术人员还可认识到，本发明可以用其他特定形式来体现，而不背离本发明的精神或其中心思想。本发明说明书中只是公开了其举例性的实施方案，对其进行的其他改动应属于本发明范围内的。因此，本发明不只限于本文详述的特定实施方案。确切地说，本发明待批权利要求才明确限定了本发明的范围和内容。
序列表(1)一般信息：
(i)申请人：
(ii)发明名称：丰富的细胞外产物和其生产与使用方法
(iii)序列数：
(iv)通信地址：
(A)收信人：
(B)街道：
(C)城市：
(D)州：
(E)国家：
(F)邮编：
(v)计算机可读的形式：
(A)介质类型：Floppy盘
(B)计算机：IBM PC兼容性
(C)操作系统：
(D)软件：
(vi)目前申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
(A)名称：
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(C)参考号/卷号：
(ix)电讯信息：
(A)电话：
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20 25 30Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp
35 40
Claims (60)
1.用于在哺乳动物宿主体内激发抗分枝杆菌属传染性病原体之有效免疫反应的疫苗接种剂，所说的疫苗接种剂包含：
选自结核分枝杆菌110KD蛋白质、80KD蛋白质、71KD蛋白质、58KD蛋白质、45KD蛋白质、32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质、23.5KD蛋白质、23KD蛋白质、16KD蛋白质、14KD蛋白质和12KD蛋白质的至少一种主要丰富细胞外产物。
2.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富的细胞外产物是结核分枝杆菌110KD蛋白质或其具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20
NSKSV NSFGA HDTLA V-ERK RO的免疫反应性同系物或片段，其中从左至右为氨基到羰基末端方向。
3.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌80KD蛋白质或其具有N末端氨基酸序列。
5
TDRVS VGN的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
4.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌71KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5
ARAVG I的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
5.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌58KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20
TEKTP DDVFK LAKDE KVLYL的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
6.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌45KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
DPEPA PPVPD DAASP PDDAA APPAP ADPP-的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
7.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌32BKD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20
FSRPG LPVEY LQVPS A-MGR DI的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
8.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌32AKD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
FSRPG LRVEY LQVPS PSMGR DIKVQ FQSGG
35 40
ANSP- LYLLD的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
9.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌30KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
FSRPG LPVEY LQVPS PSMGR DIKVQ FQSGG
35 40
NNSPA VYLLD的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
10.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌24KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
APYEN LMVPS PSMGR DIPVA FVAGG PHAVY
35 40 45 50 55 60
LLDAF NAGPD VSNWV TAGNA MMTLA-KGIC/S的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
11.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌23.5KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10
APKTY -EELK GTD的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
12.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌23KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20
AETYL DPLDW DYGAL EPHIS GQ的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
13.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌16KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25
AYPIT GKLGS ELTMT DTVGQ VVLGW
30 35 40 45
KVSDL F/YKSTA VIPGY TV-EQ QI的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
14.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌14KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30ADPRL QFTAT TLSGA PFDGA S/NLQGK PAVLW的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
15.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的至少一种主要丰富细胞外产物是结核分枝杆菌12KD蛋白质或具有N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25
FDTRL MRLED EMKEG RVEVR AELPG
30 35 40 45
VDPDK DVDIM VRDGQ LTIKA ERT的免疫反应性同系物或片段，其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
16.权利要求1的疫苗接种剂，其中所说的是以类似于所说病原体之至少一种所说主要丰富细胞外产物的至少一种化合物选自于包括肽、同系物、融合蛋白质、糖基化物及其免疫学上可接受的盐的类似物。
17.权利要求1的疫苗接种剂，其进一步包含佐剂组合物。
18.能够在哺乳动物宿主中发动免疫反应的，实质上纯的结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物，或其免疫反应性类似物或同系物。
19.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约12KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
FDTRL MRLED EMKEG RYEVR AELPG VDPDR
35 40 45
DVDIM VRDGQ LTIKA ERT其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
20.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约14KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
ADPPL QFTAT TLSGA PFDGA S/NLQK PAVLW其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
21.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约16KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25
AYPIT GKLGS EITMT DTVGQ VVLGW
30 35 40 45
KVSDL F/YKSTA VIPGY IV-EQ QI其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
22.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约24KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
APVEN LMVPS PSMGR DIPVA FLAGG PHAVY
35 40 45 50 55 60
LLDAF N AGPD VSNWV TAGNA MMTLA-KGIC/S其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
23.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约45KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列
5 10 15 20 25 30
DPEPA PPVPD DAASP PDDAA APPAP ADPP-其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
24.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约58KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列
5 10 15 20
TEKTP DDVFK LAKDE KVLYL其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
25.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约80KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列
TDRVS VGN其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
26.权利要求18的实质上纯的，结核分枝杆菌的主要丰富细胞外蛋白质产物或其免疫反应性类似物或同系物，其中该蛋白质产物具有如经SDS-PAGE测得的大约110KD的表观分子量，并具N末端氨基酸序列。
5 10 15 20
NSKSV NSFGA MDTLK V-ERK RQ其中从左到右为氨基末端至羧基末端方向。
27.用于在哺乳动物宿主体内发动抗分枝杆菌属传染性病原体之有效免疫反应的组合疫苗，所说的组合疫苗含有：
选自结核分枝杆菌110KD蛋白质、80KD蛋白质、71KD蛋白质、58KD蛋白质、45KD蛋白质、32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、32KD蛋白质、24KD蛋白质、23.5KD蛋白质、23KD蛋白质、16KD蛋白质、14KD蛋白质和12KD蛋白质的多种主要丰富细胞外产物。
28.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质、23KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
29.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质、23KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
30.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质和30KD蛋白质的混合物。
31.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32BKD蛋白质和30KD蛋白质的混合物。
32.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌30KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
33.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌30KD蛋白质和23KD蛋白质的混合物。
34.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌71KD蛋白质和30KD蛋白质的混合物。
35.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌30KD蛋白质和23.5KD蛋白质的混合物。
36.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌30KD蛋白质和12KD蛋白质的混合物。
37.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌30KD蛋白质和24KD蛋白质的混合物。
38.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌58KD蛋白质和30KD蛋白质的混合物。
39.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌45KD蛋白质、32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质、23KD蛋白质、16KD蛋白质的混合物。
40.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌45KD蛋白质、32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质、23.5KD蛋白质、23KD蛋白质、16KD蛋白质和12KD蛋白质的混合物。
41.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质23KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
42.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌71KD蛋白质、32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
43.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、32BKD蛋白质和30KD蛋白质的混合物。
44.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD和16KD蛋白质的混合物。
45.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD蛋白质和23KD蛋白质的混合物。
46.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD和23.5KD蛋白质的混合物。
47.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD和24KD蛋白质的混合物。
48.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD蛋白质和71KD蛋白质的混合物。
49.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD蛋白质、23KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
50.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD蛋白质、23.5KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
51.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
52.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌71KD蛋白质、32AKD蛋白质、30KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
53.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
54.权利要求27的组合疫苗，其中所说的组合疫苗包含结核分枝杆菌45KD蛋白质、32AKD蛋白质、30KD蛋白质和16KD蛋白质的混合物。
55.免疫哺乳动物宿主以对抗分枝杆菌属传染性病原体的方法，所说的方法包括：
提供含有足以类似于多种主要丰富细胞外产物的化合物之混合物的组合疫苗，其中所说的主要丰富细胞外产物选自于具有刺激抗所说病原体继后感染之有效免疫反应能力的结核分枝杆菌110KD蛋白质、80KD蛋白质、71KD蛋白质、58KD蛋白质、45KD蛋白质、32AKD蛋白质、32BKD蛋白质、30KD蛋白质、24KD蛋白质、23.5KD蛋白质、23KD蛋白质、16KD蛋白质、14KD蛋白质和12KD蛋白质；以及
给所说的哺乳动物宿主投用预防有效量的所说的组合疫苗。
56.权利要求55的方法，其中所说的传染性病原体选自结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟细胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、麻风分枝杆菌、非洲分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。
57.权利要求55的方法，其中所说的足以类似于所说病原体之所说多种主要丰富细胞外产物的多种化合物是合成产生的。
58.权利要求55的方法，其进一步包括在所说的投用步骤之前加佐剂组合物配制所说的组合疫苗的步骤。
59.权利要求55的方法，其中所说的哺乳动物宿主是人。
60.权利要求55的方法，其中所说的哺乳动物宿主是选自狗、猫、牛、羊、马和猪的家畜动物。
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