CN102850445B - 一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法。本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足提供一组敏感性和特异性高的结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法。本发明的技术方案为提供一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法，所述抗原为结核分枝杆菌菌体32-43KD分子量的多肽抗原组。结核分枝杆菌的破碎和溶解比较困难，导致菌体蛋白释放不完全，本发明设计了一套匀浆、超声、表面活性剂处理的程序，对结核分枝杆菌菌体进行破碎、溶解，总溶解率达90％以上，提高了抗原成份分析的可信性。并且本发明所得的结核分枝杆菌菌体特异性抗原敏感性和特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法。
背景技术
据2000年全国第四次结核病流行病学调查结果显示，结核病在我国仍是一个非常严重的公共卫生问题，卫生部近年来公布的全国法定报告传染病疫情结果显示，结核病发病数为第一位，可见结核病仍然是我国公共卫生的主要问题。
因此，对结核病诊断的研究具有重要的现实意义。目前研究结核病原菌（即：结核分枝杆菌）的重要目的之一是鉴定具有产生细胞免疫和体液免疫功能的分支杆菌抗原成分，用于发展新的结核疫苗和诊断方法。至今虽然对结核分枝杆菌抗原成份研究了50多年，但对其仍不是非常清楚。相比较而言，研究比较清楚的人型结核分枝杆菌抗原成分有ESAT-6、Ag85、12KD、16KD、19KD、38KD、65KD、71KD、88KD、MTB32、MPT63等多肽成分，这些抗原在结核分枝杆菌成份组成中具有一定的特异性。
目前诊断结核病的实验室技术有厚涂片抗酸染色、结核菌培养、ELISA技术、胶体金技术、DNA探针技术和PCR技术等。厚涂片抗酸染色、结核菌培养的阳性率只有30-40%。ELISA、胶体金技术已广泛应用于临床肺结核诊断，但是由于所用于检测的抗原成份不够理想，使抗体诊断阳性率只能达到50-80%左右，而且特异性比较差，不能满足临床的需要，因此寻找一种灵敏性强、特异性高的抗原成分成为当前结核病特异性抗体检测的首要任务。PCR技术是近年来发展起来的高新技术，但是受标本取材质量的影响，以及对非排菌病人、肺外结核病人无能为力，限制了PCR技术应用的范围。由于上述原因，研究、发展新的用于诊断的理想抗原及开发敏感性强、特异性高、实用性广泛、简单易行的检测方法，成为当前结核病特异性诊断的首要任务。
结核分枝杆菌菌体细胞壁20-40％的成份是由类脂质组成的，使结核分枝杆菌的破碎和溶解比较困难，导致菌体蛋白释放不完全，这也是结核杆菌抗原成份研究进展缓慢的原因之一。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，公开了一组灵敏性强、特异性高的结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法。
本发明的技术方案为提供一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原，所述抗原为结核分枝杆菌菌体32-43KD分子量的多肽抗原组。
本发明的另一技术方案为提供一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，包括以下步骤：
（1）使用玻璃匀浆器20-40分钟，使结核分枝杆菌菌体破碎；
（2）将菌体匀浆液超声裂解20-40分钟；
（3）将菌体裂解液经表面活性剂处理5分钟，所述表面活性剂包括质量百分数为1%的十二烷基硫酸钠和质量百分数为0.1%的巯基乙醇；
（4）菌体表面活性剂处理液经Sephacryl S-200凝胶柱分级分离；
（5）分级分离液再经Sephadex 75凝胶柱分级分离;
（6）电泳鉴定分级分离收集结核分枝杆菌菌体32-43KD多肽抗原组。
优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤1）中的菌体为结核分枝杆菌毒株、低毒株或无毒株。
优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤1）中的菌体为H37Ra减毒株菌体。
优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤1）中使用玻璃匀浆器匀浆30分钟。
优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤2）为将菌体匀浆液超声裂解30分钟。
本发明的优点是：本发明提供一组敏感性和特异性高的结核分枝杆菌菌体特异性抗原。结核分枝杆菌菌体细胞壁20－40％的成份是由类脂质组成的，使结核分枝杆菌的破碎和溶解比较困难，导致菌体蛋白释放不完全，这也是结核杆菌抗原成份研究进展缓慢的原因之一。本发明设计了一套匀浆、超声、表面活性剂处理的程序，对结核分枝杆菌菌体进行破碎、溶解。总溶解率达90％以上，提高了抗原成份分析的可信性。
附图说明
图1：从左到右分别为13种分支杆菌标准菌株菌体多肽SDS-PAGE区带图谱，1、H37Rv株，2、H37Ra株，3、Bovis株，4、BCG株，5、鸟分枝杆菌，6、偶然分枝杆菌，7、耻垢分枝杆菌，8、草分枝杆菌，9、次要分枝杆菌，10、不产色分枝杆菌，11、堪萨斯分枝杆菌，12、革登分枝杆菌，13、土地分枝杆菌；
图2：结核病人血清中结核分枝杆菌多肽抗原相应抗体谱检测结果；
图3：H37Rv毒株和H37Ra减毒株菌体抗原免疫印迹分析，其中A、H37Rv株，B、H37Ra株；
图4：结核分枝杆菌菌体抗原组分纯化鉴定图谱
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
实施例
1、应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹技术分析结核分枝杆菌菌体多肽抗原成份：
结核分枝杆菌菌体多肽抗原经SDS-PAGE多肽成份可按分子量大小分成35－40条区带，与牛型结核分枝杆菌等多种分支杆菌对比分析，证明人型结核分枝杆菌毒株（H37Rv）与减毒株（H37Ra）菌体多肽成份基本上一致；牛型结核分枝杆菌毒株（Bovis）和减毒株（BCG）菌体多肽成份基本上一致，主要多肽成份分子量为76KD、65KD、45-60KD、30-43KD、26-28KD、25KD、16KD等。人型和牛型结核分枝杆菌菌体多肽除一条区带外，基本相似，这条区带区别在于：人型结核分枝杆菌这条多肽区带分子量为28KD，而牛型结核分枝杆菌为27KD。其余分支杆菌多肽区带差异较大，随菌种不同，各自区带不同。我们建立了十三种分支杆菌标准菌株的菌体多肽SDS-PAGE区带图谱如图1所示，从左到右分别为1-13种分支杆菌标准菌株菌体多肽SDS-PAGE区带图谱，用于鉴定非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌。1、H37Rv株，2、H37Ra株，3、Bovis株，4、BCG株，5、鸟分枝杆菌，6、偶然分枝杆菌，7、耻垢分枝杆菌，8、草分枝杆菌，9、次要分枝杆菌，10、不产色分枝杆菌，11、堪萨斯分枝杆菌，12、革登分枝杆菌，13、土地分枝杆菌。
结核病人、正常人血清标本经免疫印迹技术分析表明，结核病人血清中含有结核分枝杆菌多肽抗原成份的多种相应抗体，随个体和病程的不同有较大差别，比较集中的是32-43KD多肽组抗体，25KD多肽抗体和28KD多肽抗体，如图2所示。正常人血清分析表明，部分血清标本中含有少数结核分枝杆菌多肽抗体，抗体主要针对高分子量多肽成份，无规律性。
2、结核分枝杆菌H37Rv毒株和H37Ra减毒株菌体抗原免疫原性分析：
用同份结核病人血清对结核分枝杆菌H37Rv毒株和H37Ra减毒株菌体抗原进行免疫印迹分析，结果表明H37Rv毒株和H37Ra减毒株菌体抗原具有相同的免疫原性，抗体谱如图3所示。优选H37Ra减毒株来提取菌体抗原，避免毒株的危险。
3、结核分枝杆菌菌体32-43KD抗原组的纯化：
应用二级凝胶分子筛层析柱技术纯化H37Ra减毒株菌体32-43KD抗原组份，纯化鉴定图谱如图4所示。
纯化工艺流程：
1）菌体破碎（玻璃匀浆器，匀浆30分钟）；
2）菌体匀浆液超声裂解（200W，30分钟）；
3）菌体裂解液表面活性剂处理（1%十二烷基硫酸钠、0.1%巯基乙醇处理5分钟）；
4）菌体表面活性剂处理液经Sephacryl S-200凝胶柱分级分离；凝胶柱分离相缓冲液为：0.1M PH8.0Tris-HCl，含0.2%十二烷基硫酸钠。
5）分级分离液再经Sephadex 75凝胶柱分级分离；凝胶柱分离相缓冲液为：0.1M PH8.0Tris-HCl，含0.2%十二烷基硫酸钠。
结核分枝杆菌菌体32-43KD多肽抗原组是与结核病特异性诊断相关的成份，经上述“3、结核分枝杆菌菌体32-43KD抗原组的纯化”步骤得到的结核分枝杆菌菌体32-43KD多肽抗原组其对结核病诊断的敏感性为0.9012左右，特异性为0.9639左右，可见这一成份在结核病诊断中具有一定的应用价值。
实验方法：
（1）将纯化的抗原组用0.05M PH8.0Tris-HCl稀释到0.45mg/ml，线性包被在硝酸纤维膜表面，42℃干燥后切成宽约2mm小条，备用。
（2）将小条放入印迹槽内，加入0.5ml缓冲液作用2分钟，加入10ul血清标本作用30分钟，洗涤两次。
（3）加入抗人IgG-HRP抗体，作用30分钟，洗涤两次。
（4）加入底物显色5分钟，出现颜色条带为阳性结果，阴性不出现条带。
a.结核患者血清特异性抗体检测结果：
1390例结核患者检测结果见表1结核患者结核特异性抗体检测结果。结果表明检测结核特异性抗体对结核病诊断总敏感性为0.8892，对菌阳结核病人敏感性可达0.9297，对肺外结核病人诊断敏感性可达0.8923。
表1
| 例数 | 阳性数 | 阴性数 | 敏感性 | |
| 菌阳结核病人 | 512 | 476 | 36 | 0.9297 |
| 菌阴结核病人 | 618 | 528 | 90 | 0.8544 |
| 合计 | 260 | 232 | 28 | 0.8923 |
| 合计 | 1390 | 1236 | 154 | 0.8892 |
b.健康人群和临床非结核病患者血清中结核特异性抗体检测结果：
1600例健康人群血清标本和750例临床非结核病患者（其中肺癌病人350例、自身免疫性疾病病人200例、肝炎病人100例、其它感染性疾病病人100例）血清标本检测结果见表2：健康人群和临床非结核病人结核特异性抗体检测结果。结果表明，检测结核特异性抗体实验的特异性为0.9553，尤其对正常儿童组特异性达0.9700，并且实验结果不受卡介苗接种的影响。
表2
| 例数 | 阳性数 | 阴性数 | 特异性 | |
| 中青年组 | 600 | 20 | 580 | 0.9667 |
| 老年组 | 500 | 25 | 475 | 0.9500 |
| 儿童组 | 500 | 15 | 485 | 0.9700 |
| 非结核病人组 | 750 | 45 | 705 | 0.9400 |
| 合计 | 2350 | 105 | 2245 | 0.9553 |
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用玻璃匀浆器20-40分钟，使结核分枝杆菌菌体破碎；
（2）将菌体匀浆液超声裂解20-40分钟；
（3）将菌体裂解液经表面活性剂处理5分钟，所述表面活性剂包括质量百分数为1%的十二烷基硫酸钠和质量百分数为0.1%的巯基乙醇；
（4）菌体表面活性剂处理液经Sephacryl S-200凝胶柱分级分离；
（5）分级分离液再经Sephadex75凝胶柱分级分离
（6）电泳鉴定分级分离收集结核分枝杆菌菌体32-43KD多肽抗原组。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）中的菌体为结核分枝杆菌毒株、低毒株或无毒株。
3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）中的菌体为H37Ra减毒株菌体。
4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）中使用玻璃匀浆器匀浆30分钟。
5.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）为将菌体匀浆液超声裂解30分钟。
6.一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原，其特征在于，所述抗原为如权利要求1-5任一项所述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法制备的结核分枝杆菌菌体32‐43KD分子量的多肽抗原组。
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