CN102304556A - 一种同时提取刺激两类t细胞的结核杆菌抗原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗结核感染免疫的技术领域，具体说是从结核杆菌同时提取可刺激αβT细胞和γδT细胞的蛋白类抗原的方法。本发明包括以下步骤：(1)将结核杆菌接种在苏通培养基培养2周后收集上清，经超滤柱(截留分子量3kDa)离心浓缩获取早期分泌蛋白，为刺激αβT细胞的抗原；(2)结核杆菌用含10％小牛血清苏通培养基再培养4周后收集菌体，加水高温处理后离心收集上清，先经超滤柱(截留分子量30kDa)离心，滤过液再经超滤柱(截留分子量3kDa)离心浓缩，获取截留的低分子蛋白成分为刺激γδT细胞的抗原。本发明的优点是：培养条件和操作较简便，能在短期内同时制备可刺激αβT细胞和γδT细胞的蛋白抗原。

Description

一种同时提取刺激两类T细胞的结核杆菌抗原的方法

技术领域

本发明属于抗结核分枝杆菌感染的细胞免疫学技术领域，具体地说是一种同时提取可刺激αβT细胞和γδT细胞增殖的结核杆菌蛋白质抗原的方法。

背景技术

由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的结核病，目前仍是发病率和病死率最高的传染病之一。然而迄今为止，关于结核病的发病机制，特别是机体对Mtb感染的免疫机制并未完全阐明。以前的大量研究报道证明T细胞特别是普通T细胞即αβT细胞(包括CD4T细胞和CD8T细胞)和巨噬细胞在抗结核杆菌感染的免疫保护作用中起着关键性的地位，因此对于探讨涉及免疫保护作用或致病性的结核杆菌的抗原也是集中在αβT细胞所识别的是抗原及其表位。但近年来，另外一类数量较少的T细胞即γδT细胞在抗结核感染免疫的中的保护作用，或者可能参与致病的作用，也已日益得到关注和重视。由于这类γδT细胞在识别抗原的方式与普通的αβT细胞有所不同，可以以MHC非限制性方式识别肽类和非肽类抗原。因此，多数研究者关注γδT细胞对非肽类抗原如磷酸类抗原的识别方式和机制，而对来自结核杆菌的蛋白多肽抗原的识别的研究报道较少。美国学者Boom曾报道来自结核杆菌的耐热性的低分子蛋白，可以特异性优先激活人γδT细胞的增殖。我们在十多年前就开始应用这种抗原探讨γδT细胞在抗原识别和激活后的信号转导的机制，以及比较这种抗原对结核病患者和健康个体的γδT细胞的激活和诱导凋亡作用方面的差异。由于最早报道的制备这种耐热性抗原的过程较漫长和繁琐，获得量不高，特别是各制备批次之间的活性差别较大。另外，在多数对αβT细胞识别结核杆菌分泌性抗原的研究也仅是关注少数蛋白抗原的表位，而不能从蛋白组学和抗原组学的角度深入了解αβT细胞对结核杆菌抗原库的识别。因此，对T细胞识别结核杆菌抗原库的研究需要重视这两类T细胞，即αβT细胞和γδT细胞所识别的抗原进行更为深入的探索研究，也就需要建立可以同时提取刺激αβT细胞和γδT细胞活化和增殖的结核杆菌抗原的方法，以满足对这两类T细胞所识别的抗原的实验研究需要。这对于全面和确切深入了解机体在结核杆菌感染的免疫保护作用和病理机制，有重要的学术探讨意义和临床实用价值。

发明内容

本发明目的在于建立一种实用而有效的从结核分枝杆菌同时提取可刺激两类T细胞增殖的蛋白质抗原的方法，其设计原理和操作方案是采用分步培养法和超滤技术批量制备结核分枝杆菌分泌性蛋白抗原和菌体耐热性低分子蛋白抗原，可分别有效地刺激αβT细胞和γδT细胞的增殖。本发明的方法包括以下步骤：

1.将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，如H37Ra)接种于不含血清或其他蛋白的结核杆菌液体培养基。通常用苏通氏液体培养基或者Middlebrook7H9，置37度温箱培养2周左右时，收集培养上清。此培养上清即为结核杆菌的早期培养上清，含有结核杆菌分泌性蛋白。

2.将上述结核杆菌的早期培养上清，放入超滤柱(截留分子量3kDa)中，离心，4000r/min，40分钟，收集截留物后，再加少量(如0.5ml)洗涤超滤柱膜，收集残留液体与收集截留物合并，即为浓缩的结核杆菌分泌性蛋白，是特异性刺激αβT细胞活化和增殖的蛋白抗原。

3.将上述离心沉淀的结核杆菌加入含有约10％新生牛血清的结核杆菌液体培养基，如苏通氏液体培养基或者Middlebrook 7H9，或将菌体接种于结核杆菌的固体培养基，如罗-琴氏培养基，或Middlebrook 7H10和7H11等固体培养基，置于37度温箱培养5周左右，即约在32天至38天时收集菌体。

4.将上述收集的结核杆菌菌体加2倍体积纯水，在高压灭菌器，于115℃至121℃处理20或者30分钟，离心收集上清液，即为含有刺激αβT细胞和γδT细胞的蛋白抗原。

5.将上述高温处理的结核杆菌上清液，移入到超滤柱(截留分子量30kDa)，离心过滤，4000r/min，40～60分钟，收集截留物为富含刺激αβT细胞的大分子蛋白抗原，可与上述步骤2收集的结核杆菌分泌性蛋白合并一起，作为特异性刺激αβT细胞的蛋白抗原。

6.经上述超滤柱(30kDa)离心过滤后的滤过物，再放入超滤柱(截留分子量3kDa)离心，4000r/min，40分钟后，收集截留物，即为浓缩的富含低分子蛋白多肽组分，是特异性刺激γδT细胞活化增殖的耐热性低分蛋白抗原。

7 用结核杆菌早期分泌蛋白质抗原和菌体释放耐热性低分子蛋白抗原，在体外分别刺激人外周血αβT细胞和γδT细胞增殖，具体方法如下：

(1)人外周血采集后用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离获取单个核细胞，用含10％新生牛血清的RPMI1640培养液制备细胞悬液后放入24孔培养板，加入可刺激人αβT细胞的结核杆菌早期分泌蛋白质抗原，最适使用终浓度为5～10μg/ml，或者加入可刺激人γδT细胞活化增殖的结核杆菌菌体耐热性低分子蛋白抗原，最适使用终浓度为4～8μg/ml。(2)将培养板置于CO₂培养箱，于37℃，5％CO₂和饱和湿度下培养，(3)在培养开始或者培养3天后，加入人重组IL-2，终浓度为20～50u/ml，并每隔3～4天补充同样剂量的IL-2。(4)在培养过程中，每隔3～4天观察细胞增殖，根据细胞增殖程度分孔扩大培养；(5)在培养第7～9天时，或者更长天数时，取出扩增培养的细胞，通常大多数是T细胞，并计数扩增的细胞数量。(6)取出的扩增细胞用荧光标记单抗染色后，在流式细胞仪上检测T细胞表型，计算不同T细胞亚群，即αβT细胞中的CD4⁺T细胞和CD8T⁺细胞，以及γδT细胞的比例以及扩增的细胞数量，并计算扩增倍数。8.结核杆菌早期培养上清经过超滤柱离心浓缩的结核杆菌早期分泌蛋白质抗原，以及菌体释放耐热性蛋白抗原经过超滤柱离心浓缩分离后的低分子蛋白的分子量鉴定，通过应用常规的聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)，和快速蛋白液相层析系统(FPLC)进行。

本发明的方法的主要特点是：(1)重视和增加对刺激γδT细胞的蛋白多肽抗原的提取方法。(2)除了提取结核杆菌中特异性刺激αβT细胞分泌性抗原外，在提取刺激γδT细胞的抗原组分时，同时分离和收集能刺激αβT细胞的大分子蛋白抗原，扩大了刺激αβT细胞的抗原库。(3)在制备抗原时，采取不同的培养条件培养结核杆菌。为获取单纯的结核杆菌分泌性抗原时，用不含任何蛋白成分的基础液体培养基，如苏通氏液体培养基培养；在需要快速生长培养结核杆菌菌体时，则在培养基中添加含量较高的新生牛血清。(4)充分利用超滤的原理和技术，采用和组合不同截留分子量的超滤膜分离和浓缩刺激γδT细胞和αβT细胞的抗原。(5)缩短实验过程，充分利用和节省资源。

附图说明。

图1.结核杆菌分泌性蛋白的电泳结果

结核杆菌的早期培养上清，经过超滤柱(截留分子量3kDa)离心浓缩后的分泌蛋白，在SDS-PAGE凝胶上电泳，经过考马斯亮兰染色后的条带，显示含有多个蛋白组分，右侧为蛋白分子量标准。

图2.结核杆菌菌体耐热性蛋白成分经超滤柱分离为大分子和低分子两个组分结核杆菌菌体高温处理上清含释放的菌体混合蛋白，经过两种不同截留分子量超滤柱的超滤，浓缩和分离为大分子蛋白组分和低分子蛋白组分。图中显示不同蛋白样品在快速蛋白液相层析系统(FPLC，AKTA Explorer 100)上检测结果图。

(A)图为结核杆菌菌体耐热性蛋白混合组分，超滤柱过滤前样品，显示含有大分子蛋白组分和低分子蛋白组分。(B)图为结核杆菌耐热性蛋白混合组分，经过超滤柱(截留分子量30kDa)超滤后的截留物，为含有大分子蛋白组分，有刺激αβT细胞增殖的活性；(C)图显示的是结核杆菌耐热性蛋白混合组分经过超滤柱(截留分子量30kDa)超滤离心的滤出物，再在超滤柱(截留分子量3kDa)超滤离心收获的截留物，显示含有低分子量(约在10～14kDa)的蛋白组分，有特异性刺激人γδT细胞的增殖的抗原活性。

图3，人外周血单个核细胞用结核杆菌耐热性抗原刺激后γδT细胞的增殖人外周血分离获取的单个核细胞，用不同批次结核杆菌耐热性菌体抗原(5μg/ml)和(或单加)rhIL-2(50u/ml)，每3～4天分孔传代并补加50u rhIL-2以维持细胞生长，培养第9天时收获细胞。用荧光标记单抗(抗CD3mAb，抗TCRγδmAb)检测γδT细胞在扩增细胞中比例。图中显示的为一次代表性的流式检测分析图：(A)和(B)分别代表未加抗原和IL-2组，和单纯加IL-2培养组，(C)、(D)、和(E)分别代表不同批次有较高活性(低分子蛋白含量高)的耐热菌体抗原，(F)为活性稍低(低分子蛋白含量低)抗原批次的刺激结果。

图4，结核杆菌分泌性抗原刺激人外周血CD4⁺T细胞的增殖

人外周血分离出单个核细胞后在用贴壁粘附法和尼龙毛柱分离技术获取单核细胞和纯化T细胞，用活细胞荧光染料CFSE标记T细胞后，加结核杆菌分泌性抗原(Mtb-SAg)刺激和添加IL-2扩增培养，于第11天收集细胞用荧光标记单抗(抗CD3和抗CD4)染色后在流式细胞仪上检测。(A)图显示流式检测分析图，显示CFSE荧光降低的CD4⁺T细胞为增殖细胞，其中(a)，(b)和(c)分别为单纯T细胞组，纯化T细胞+单核细胞组，和纯化T细胞+树突状细胞(DC)组。(B)显示的统计结果，以增殖细胞比例和增殖指数表示上述三组实验的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例1是采用分步培养法大量制备结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原和菌体耐热性抗原，包括以下步骤：

1.将结核杆菌菌体种子湿重50克接种于200ml的苏通氏液体培养基内，于37℃培养箱内静止培养2周，经4000转/分离心30分钟以收获结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原，经考马斯亮蓝G-250法测定早期培养滤液的蛋白质浓度，其浓度大约为700μg/ml。

2.将培养2周的结核杆菌培养液内添加终浓度为10％的新生牛血清，再继续于37℃培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分离心30分钟以收获结核杆菌菌体。将菌体依次经生理盐水洗涤2次，再用两倍体积的蒸馏水重悬浮细菌，将菌体经121℃高压蒸汽处理30分钟，以获取结核杆菌耐热性蛋白质抗原，采用此方法收获的结核杆菌耐热蛋白质抗原的浓度大约为500μg/ml。

3 采用超滤柱离心超滤法收获提取结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原和菌体耐热性蛋白质抗原。首先将结核杆菌早期培养滤液经超滤柱(截留分子量为3kDa)在4000转/分离心60分钟超滤，以浓缩收获结核杆菌早期分泌蛋白，可用于体外显著优先刺激人αβT细胞大量活化增殖。

4.将培养4周收获的结核杆菌菌体经121℃高压蒸汽处理30分钟，收获菌体释放蛋白，将此耐热蛋白质抗原先经超滤柱(截留分子量为30 kDa)在4000转/分离心60分钟超滤，将其离心过滤液再经超滤柱(截留分子量为3 kDa)在4000转/分离心60分钟超滤浓缩，以收获提取到结核杆菌耐热蛋白质抗原，此抗原可用于体外显著优先刺激人γδT细胞的大量活化增殖。

5.结果：采用本发明方法制备的每100ml的结核杆菌早期培养滤液浓缩获得的早期分泌性蛋白质抗原的量约为69mg。表明早期分泌性蛋白质抗原的损耗很少。而每100 ml的经高压蒸汽处理菌体悬液而制备的菌体释放蛋白溶液，经超滤提取的菌体耐热性蛋白质抗原的量达到48 mg，也表明该蛋白质抗原的损耗很少。

实施例2

本实施例1是用结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原和菌体耐热性蛋白质抗原分别体外刺激人外周血αβT细胞和γδT细胞后显著大量活化和增殖。具体操作包括以下步骤：

1.采集健康人外周血经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离获得的单个核细胞放入24孔细胞培养板内，调整细胞密度为1x10⁶/ml，每孔加入1 ml，每孔添加人IL-2 50 u/ml和不同浓度的结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原和结核杆菌菌体耐热性蛋白质抗原，于胞37℃ 5％CO₂温箱中培养。根据细胞生长情况，结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原刺激组，自培养开始后每2至3天细胞分孔扩大培养；而结核杆菌菌体耐热性蛋白质抗原刺激组，则于培养后第6至8天后才开始细胞分孔扩大培养。各组均应每3天向培养液内添加人IL-2 50 u/ml。定期计数观察细胞增殖情况，于培养第12天收获各组细胞，记录扩增细胞悬液体积和计数扩增细胞总数。

2.用流式细胞仪对扩增T细胞亚群的检测和计算扩增倍数。取上述培养扩增12天的细胞，用含5％新生牛血清和0.1％叠氮钠的PBS溶液洗涤2次，调整细胞密度为1x10⁶/ml，每个检测管内加入50μl细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗CD3-FITC，抗TCRαβ-PE、抗TCRγδ-PE)染色，置4℃染色30分钟，用上述PBS溶液离心洗涤2次，加含1％多聚甲醛的PBS溶液固定后，在流式细胞仪上检测，数据文件采用WinMDI软件分析。

3 结果：(1)结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原和菌体耐热性蛋白质抗原浓度对扩增人淋巴细胞亚群的影响：经结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原刺激培养的人外周血αβT细胞扩增比例显著高于结核杆菌菌体耐热性蛋白质抗原刺激组，随着早期分泌性蛋白质抗原的刺激剂量增加，其刺激人αβT细胞活化增殖的活性也逐渐增加，其最适刺激剂量为10μg/ml，培养增殖的人αβT细胞占总扩增细胞的比例高达85％，而人γδT细胞增殖比例很低，仅为2％。与此相反，经结核杆菌菌体耐热性蛋白质抗原刺激培养的人外周血γδT细胞扩增比例显著高于结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原刺激组，随着菌体耐热性蛋白质抗原的刺激剂量增加，其刺激人γδT细胞活化增殖的活性液逐渐增加，其最适刺激剂量为5μg/ml，培养增殖的人γδT细胞占总扩增细胞的比例高达80％，而人γδT细胞增殖比例很低，仅为8％。

(2)结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原和菌体耐热性蛋白质抗原浓度对人外周血淋巴细胞中αβT细胞和γδT细胞亚群的绝对扩增倍数：经结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原刺激培养的人外周血αβT细胞绝对扩增数量显著高于结核杆菌菌体耐热性蛋白质抗原刺激组，随着早期分泌性蛋白质抗原的刺激剂量增加，其刺激人αβT细胞活化增殖的活性也逐渐增加，在其最适刺激剂量10μg/ml时，在6个健康个体中，培养增殖的人αβT细胞的绝对扩增倍数高达182倍至270倍。与此相反，经结核杆菌菌体耐热性蛋白质抗原刺激培养的人外周血γδT细胞绝对扩增倍数显著高于结核杆菌早期分泌性蛋白质抗原刺激组，随着菌体耐热性蛋白质抗原的刺激剂量增加，其刺激人γδT细胞活化增殖的活性也逐渐增加，在其最适刺激剂量5μg/ml时，在6个健康个体中，培养增殖的人γδT细胞绝对扩增细胞倍数高达430倍至510倍。

Claims (10)

1.一种从结核分枝杆菌同时提取可刺激两类T细胞增殖的蛋白质抗原的方法，其特点是采用分步培养法和超滤技术制备结核分枝杆菌分泌性蛋白抗原和菌体耐热性低分子蛋白抗原，可分别刺激αβT细胞和γδT细胞的增殖。本发明的方法包括以下步骤：

(1)将结核分枝杆菌接种于不含血清或其他蛋白的结核杆菌液体培养基，置37度温箱培养2周左右时，收集培养上清。

(2)将上述结核杆菌的早期培养上清经过超滤柱(截留分子量3kDa)离心收集截留物，即为浓缩的结核杆菌分泌性蛋白，是刺激αβT细胞增殖的蛋白抗原。

(3)将上述离心沉淀的结核杆菌加入含有5～15％动物血清的结核杆菌液体培养基，或将菌体接种于适合于培养结核杆菌的固体培养基，置于37度温箱培养4周～6周时收集菌体。

(4)将上述收集的结核杆菌菌体加入1至3倍体积纯水，在高压灭菌器设置于105℃至123℃处理10至30分钟，离心收集上清液，即为含有刺激αβT细胞和γδT细胞的蛋白抗原。

(5)将上述高温处理的结核杆菌上清液先经超滤柱(截留分子量30kDa)离心过滤，收集的截留物为富含刺激αβT细胞的大分子蛋白抗原。

(6)经上述超滤柱(30kDa)离心过滤后的滤过物，再经超滤柱(截留分子量3kDa)离心后，收集截留物，即为浓缩的富含低分子蛋白多肽组分，是特异性刺激γδT细胞活化增殖的耐热的低分蛋白抗原。

2.根据权利要求1所述的用于制备刺激两类T细胞抗原的结核分枝杆菌，是指各种来自人型或者其他动物(如牛型)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)。

3.根据权利要求1中所述的两类T细胞，来是指人类或者其他哺乳类动物的两类T淋巴细胞，即αβT细胞和γδT细胞。αβT细胞是指其抗原识别受体，或称T细胞受体(TCR)由α链和β链组成，而γδT细胞是指其TCR由γ链和δ链组成。

4.根据权利要求1中(1)和(3)所述的结核杆菌液体培养，是指不含血清或其他蛋白成分的特别适合于培养结核杆菌的培养液，如(但不仅限于)苏通氏培养基和Middlebrook 7H9等。

5.根据权利要求1中(3)所述的适合于培养结核杆菌的固体培养基，是指类似于(但不仅限于)罗-琴氏培养基和Middlebrook 7H10和7H11等固体培养基。

6.根据权利要求1中(3)所述的“含有5～15％动物血清”，通常为(但不仅限于)小牛血清，新生牛或胎牛血清，合适的血清浓度是10％。

7.根据权利要求1中(1)所述的“培养2周左右”，合适的时间是培养14～16天。(3)中所述的“培养4～6周”，合适的时间是5周左右，或32天至38天。

8.根据权利要求1中(4)所述的“1至3倍体积纯水”，其合适的体积是压积菌体的2倍体积；“高压灭菌器于105℃至123℃处理10至30分钟”，其合适的条件是115℃至121℃，20分钟至30分钟。

9.根据权利要求1中(2)和(5)所述的“经过超滤柱......离心收集“，其离心条件根据生产超滤柱厂家的使用说明操作，通常的离心条件是4000r/min，30分钟至60分钟。

10.根据权利要求1中(2)、(5)和(6)所述的“经过超滤柱......离心，收集截留物”，是指经过离心后留在超滤柱膜表面的少量液体，含有浓缩的蛋白组分，并可在取出后再加适量(如0.2至0.5ml)纯水洗涤超滤膜后，以收获残留的浓缩蛋白组分。这两部分截留物两者合并一起即为浓缩的蛋白组分。

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