CN102597768A - 临床前测试免疫调节药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明教导一种测试用于T-细胞活化的预期或已知免疫调节药物的方法，包括以下步骤：在体外使外周血单核细胞(PBMC)培养物与预定量的所述预期或已知免疫调节药物接触；以及当与所述预期或已知免疫调节药物接触时，使用读出系统观察用于T-细胞活化的所述PBMC培养物，其中调节PBMC预培养物的细胞密度使得所述PBMC能够细胞-细胞接触，并且其中培养所述PBMC预培养物至少12h。
Description
技术领域
本发明涉及测试用于T-细胞活化的预期或已知免疫调节药物的方法，包括以下步骤：在体外使外周血单核细胞(PBMC)培养物与预定量的所述预期或已知免疫调节药物接触；以及当与所述预期或已知免疫调节药物接触时，使用读出系统观察用于T-细胞活化的所述PBMC培养物，其中调节PBMC预培养物的细胞密度使得所述PBMC能够细胞-细胞接触，并且其中培养所述PBMC预培养物至少12h。本发明进一步涉及在体外测试减弱细胞因子风暴的药物的方法。
在本说明书中，引用了包括专利申请和厂家手册在内的许多文献。在不考虑这些文献公开的内容与本发明的可专利性相关的情况下，将其公开的全部内容在此都以引用的方式并入本文。尤其是，以引用的方式并入的所有引用文献的程度与将各个单独的文献具体地且单独地指出将以引用的方式并入的程度是相同的。
背景技术
在两种系统中临床前评价调节淋巴细胞活性的免疫治疗药物：动物模型，通常为啮齿动物，并且如果可能，为灵长类动物；和人外周血单核细胞(PBMC)的培养物。
通常使用PBMC，这是因为，首先，它们包含所有亚型的淋巴细胞和单核细胞，其次，它们可以很容易地从健康供体或从患者抽取的静脉血中得到。对这些PBMC的体外刺激被认为是预期免疫调节药物的体内活性的有用指示剂。
某些T-细胞活化剂，尤其是针对T-细胞抗原受体(TCR)的单克隆抗体(mAb)，例如，OKT3(第一个用于临床免疫抑制的mAb)，诱发促炎细胞因子的系统性释放(Abramowicz等，1989)。它们中最危险是TNF、干扰素-γ(IFN-γ)和IL-2。在接受mAb治疗的患者中，这种细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”的控制通常通过高剂量的皮质类固醇治疗来实现。
TGN1412是对通过人T-细胞表达的共刺激分子CD28具有特异性的lgG4亚类的人源化单克隆抗体(mAb)。由于与典型的CD28-特异性mAb不同，所以它被称作“CD28超拮抗剂”(CD28SA)，在没有T-细胞抗原受体(TCR)的协同作用的情况下它可以活化T-淋巴细胞(Hunig，2007)。TGN1412由现已不存在的TeGenero AG，Würzburg开发。
2006年3月13日，在伦敦的Northwick Park医院由独立的Parexel临床试验单位(Clinical Trial Unit)进行的第一次人体试验中，对健康人类志愿者静脉施用100μ/kg体重的TGN1412，导致了威胁生命的细胞因子释放综合征，只有将志愿者转移到医院的重症监护室后才控制住这种症状(Suntharalingam等，2006)。
由赞助者TeGenero AG提供的临床前研究显示，在使用鼠-CD28-特异性超拮抗剂的类似鼠模型中以及在接受比人类志愿者高至50倍剂量的自身TGN1412的猕猴中，没有发现所述“细胞因子风暴”的证据(Duff，2006)。此外，向人PBMC的培养物中加入TGN1412也没有导致细胞因子释放。所有关键的猴子和PBMC培养物试验由代表政府专家科学组行动的英国国家生物学标准和控制协会(British National Institute for Biological Standards andControl，NIBSC)在I期临床试验中重复进行，并证实了TGN1412在这些体系中的无毒特性(Duff，2006)。在TGN1412试验失败后三年，仍没有澄清为什么这种体外试验没有对人类志愿者经历的细胞因子风暴作出警告。
在注射CD28SA以后，啮齿动物和猕猴没有释放有毒的系统性细胞因子，显然是由于完整免疫系统对这种药剂的反应性的种间差异造成的，并且已经给出了针对这种差异的具体意见(Gogishvili等，2009；Nguyen等，2006；Schraven和Kalinke，2008)。
这些发现表明，由于物种特异性反应模式不同，即使灵长类动物模型对于人类对新药的反应性来说也不总是安全的预测者。
人类具有大约1012个T-淋巴细胞，在任何给定时刻在血液中循环的淋巴细胞还不到上述的百分之一。因此，培养的PBMC没有应答TGN1412，或者是由于与位于淋巴组织中的那些细胞(在志愿者中明显以细胞因子释放应答)相比在这些细胞中的功能缺陷导致的，或者是由于存在于淋巴器官中而不是血液中的细胞类型对TGN1412介导的T-淋巴细胞的活化的要求导致的。
因此，急需在TGN1412细胞培养试验中再现在伦敦人类志愿者中观察到的细胞因子风暴以了解其机制并测试其对药理学抑制的敏感性。
从一个较广泛的观点来看，已知的人PBMC培养物没有以细胞因子释放应答可溶性TGN1412，表明这个体系没有以与人体内的完整免疫系统应答相同的方式应答激活所有淋巴细胞的药剂。修正这些缺陷不仅可以详细分析人CD28超拮抗剂(SA)(例如TGN1412)的作用，而且还可以在临床前开发中揭示其他似乎无毒药物的反应性。
发明内容
因此，本发明的技术问题是：针对潜在的细胞因子风暴，提供一种用于体外测试免疫调节药物(尤其是CD28SA)的改进方法。本发明进一步的目的是提供一种测试适于减弱细胞因子风暴的药物的方法。
为了解决上述第一个提及的技术问题，本发明教导了一种测试用于T-细胞活化的预期或已知免疫调节药物的方法，包括以下步骤：在体外使外周血单核细胞(PBMC)培养物与预定量的所述预期或已知免疫调节药物接触；以及当与所述预期或已知免疫调节药物接触时，使用读出系统观察用于T-细胞活化的所述PBMC培养物，其中调节PBMC预培养物的细胞密度使得所述PBMC能够细胞-细胞接触，并且其中培养所述PBMC预培养物至少12h。
在本发明一个优选实施方式中，所述读出系统观察所述PBMC培养物从PBMC释放至少一种细胞因子，观察细胞增殖，或者为另一种合适的读出系统，如基因表达的变化、蛋白质表达的变化和/或翻译后修饰的变化。
术语“免疫调节药物”优选是指例如通过活化或抑制淋巴细胞功能(尤其是T-细胞功能，如T-细胞抑制或活化)能够活化或抑制免疫系统的任何治疗药剂。在下文中提供免疫调节药物的具体实例。
术语“T-细胞活化”优选是指可以在不同类型的T-细胞之间稍微改变的T-细胞活化的机制。然而，在CD4+T细胞中的“双信号模型”可应用于大多数类型的T-细胞。更具体地讲，CD4+T细胞的活化通常通过如下途径进行：分别用在抗原呈递细胞(APC)表面上的主要组织相容性编码的抗原呈递分子和其结合的抗原肽以及B7家族成员结合在T细胞表面上的T细胞受体和CD28二者。为了产生有效的免疫应答，两种细胞-细胞接触通常都需要。例如，在没有CD28共刺激的情况下，单独的T-细胞受体信号会导致T-细胞无反应性。CD28和T细胞受体两者下游的其他信号途径包括许多本领域的技术人员已知的其他蛋白质。如在下文中描述的，通过细胞因子释放和/或细胞增殖，尤其是T-细胞的增殖，可以测定T-细胞的活化。
术语“外周血单核细胞(PBMC)”优选限定具有圆形核的任何血细胞，例如，淋巴细胞和单核细胞。这些血细胞在组织和血液之问再循环，并且为免疫系统中抵抗感染和适应入侵者的关键成分。PBMC的淋巴细胞群通常由T细胞(CD4和CD8阳性～75％)、B细胞和NK细胞(合计～25％)组成。可以通过本领域熟知的方法从全血样品中获得PBMC。例如，利用蔗聚糖梯度可以从全血中提取PBMC。蔗聚糖是根据密度将血液分层的亲水性多糖，单核细胞和淋巴细胞形成在血浆和蔗聚糖溶液之间的层。除了全肝素化血液作为原料以外，可以使用血沉棕黄层(通过离心全血得到的在红细胞之上的白细胞层)和作为血库中血小板浓缩液的副产物得到的白细胞减少室(leukoreductionchamber)内容物。
术语“预培养的”是指在没有免疫调节药物的情况下并且在与这些要测试的药物接触之前对PBMC培养物进行培养。培养PBMC的方法在本领域中是已知的并且还将在下文中描述。
术语“观察”包括用本领域已知的方法对至少一种细胞因子或(细胞)增殖(优选T-细胞增殖)浓度的定性、半-定量和定量测量，或者其他的细胞应答，如基因表达的变化、蛋白质表达的变化和/或翻译后修饰的变化，的定性、半-定量和定量测量。
本发明是基于以下令人惊奇的发现：通过标准方法制备的PBMC培养物，只是在与免疫调节药物接触之前进一步预培养预定的一段时间，就对通过与免疫调节药物接触引起的细胞因子释放突然显示敏感性，但在没有预培养过程的情况下与免疫调节药物接触不会引起细胞因子释放。本发明进一步基于以下的发现：通过使PBMC的细胞-细胞接触预定的一段时间可以提高这种预培养物的效果。换句话说，在加入免疫调节药物时，PBMC培养物不应是新制备的。
因此，本发明可用于预测个体对免疫调节药物(如TGN1412，将在后面作进一步详细解释)的反应性，以及预测免疫抑制药物(例如，皮质类固醇)控制不需要的反应的能力。本发明还可用于进一步了解CD28SA(即，CD28特异性超拮抗单克隆抗体)的作用模式。如上所述，CD28在T-细胞的表面上被表达，并且在生理条件下T-细胞活化通常需要通过CD28和TCR的共刺激，然而CD28的超拈抗抗体也能够使T细胞直接活化。此外，本发明可用于针对预期免疫调节药物的T-细胞活化潜能(包括细胞因子释放)，筛选预期免疫调节药物。因为在高密度预培养之后回收的PBMC很可能反映在淋巴器官中发现的T-细胞反应性的状况，并且上述PBMC应当与活化剂一起用于测试免疫抑制药物，这是因为循环的T-细胞因其“不活泼”的状态可以更容易被抑制，导致对这些药物功效的误导性结果。
在本发明一个优选实施方式中，在没有免疫调节药物的情况下，并且在与要测试的免疫调节药物接触之前，通过在35℃～40℃，优选在36℃～38℃，储存PBMC培养物至少24h，优选至少36h，更优选至少45h来进行预培养步骤。
在本发明另一优选实施方式中，在预培养步骤期间，所述PBMC培养物的细胞密度至少为2＊106/ml，优选至少为5＊106/ml，更优选至少为107/ml。对于在组织培养容器表面的细胞密度，其应该至少为4＊105/cm2，优选至少为106/cm2，最优选至少为2＊106/cm2。所提供的数值可直接应用于由平孔组成的容器。在圆形孔或圆锥形孔中，总的密度会不同，因为在孔的底部细胞密度高，而在孔的上部细胞密度低。因此，上述给出的以体积测量的细胞密度应当是指任何形式容器的分体积，即给出的密度是以例如存在的总预培养物体积的至少10μl量的分体积形式提供的。如声明的，能够得到活细胞的细胞密度的任何其他的方法也包括在本发明中。在细胞-细胞接触中的细胞的最低数量优选为至少50.000。
在一个进一步优选的实施方式中，所述免疫调节药物为免疫刺激药物，如抗体，优选单克隆抗体。尤其地，所述单克隆抗体可为人CD28特异性超拮抗单克隆抗体。然而，不限于此，要测试的免疫调节药物还可选自凝集素，如刀豆素A(ConA)，或植物凝集素(PHA)；包含凝集素的天然提取物，如松果菊提取物(echinacea extract)(例如，Echinacin，Madaus，德国)，或槲寄生提取物(例如，Lektinol，Madaus，德国)；超抗原，如葡萄球菌肠毒素B(SEB)，葡萄球菌肠毒素A(SEA)，中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)；葡萄球菌生脓原，如葡萄球菌生脓肠毒素B(SPEB)；由支原体产生的超抗原，如支原体arthriditis(Mycoplasma arthriditis)；或者由黑鼠疫细菌产生的超抗原，如假结核耶尔森氏菌；由某些致病病毒产生的超抗原，如EBV或HIV-1。
在本发明另一优选实施方式中，所观察的细胞因子选自TNF、IFN-γ、IL-1-β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-21、IL-35和LT，以及它们的组合。
任选地，可以观察细胞的增殖，其中，如果在单位时间内细胞的数目增加了预定的量，就说明增殖了。本领域的技术人员通过常规的考虑可以选择所述量。在这个测定中增殖的细胞优选为PBMC，并且更优选T-细胞。
在测试用于T-细胞活化的预期或已知免疫调节药物的方法的进一步优选的实施方式中，所述PBMC培养物包含记忆T细胞。
如在本领域中所熟知的，记忆T细胞为已经预先遭遇和应答过它们的同源抗原的抗原-特异性T细胞的亚型。因此，在本领域中也使用术语抗原体验过的(antigen-experienced)T细胞。在这方面，进一步优选记忆T细胞为CD45RO+T细胞。本发明的发明人已经发现在本发明的方法中由PBMC释放的细胞因子主要是由包含在PBMC中的记忆T细胞释放的。
在与第二个提及的目的特别相关的进一步优选的实施方式中，在将所述PBMC培养物与已知的免疫调节药物，尤其免疫刺激药物，接触的同时，或者随后在预定的一段时间之后，或者在预定的一段时间之前，使所述预培养的PBMC培养物另外地与用于减弱至少一种细胞因子释放的预期药物(免疫抑制药物)接触，其中进一步观察细胞因子释放。所述预定的一段时间可以在10s至12h的范围内，优选在10s至1h的范围内。在PBMC培养物另外接触免疫抑制药物的情况下，应该了解，与将其中PBMC培养物单独地与预期或已知免疫调节药物接触的情形相比，可以测定免疫抑制效果。所述免疫抑制药物还可以单独地与预培养的PBMC培养物接触以例如测定其对天然的潜伏T细胞活化或非天然的提高的T细胞活化(例如，由免疫紊乱或环境因素引起)的抑制效果。
所述用于减弱细胞因子释放的预期药物优选选自皮质类固醇，包括，但不限于，地塞米松或者甲泼尼龙。
所述用于减弱细胞因子释放的预期药物可进一步为选自纳巴霉素或者钙神经素抑制剂(如环胞素A、Voclosporin或他克莫司)的另外的免疫抑制药物。
在这个优选实施方式中，可以在体外测试打算用于减弱细胞因子风暴的具体药物(免疫抑制药物)是否适于这一目的，尤其是，虽然免疫调节药物的施用浓度初步看来被认为能够防止细胞因子风暴，但在体内发生细胞因子风暴的情况。尤其地，本发明的这种变化使得能够创建免疫调节药物和减弱药物的匹配对，并且提供用于管理在体内试验中(尤其是对人的临床试验中)未预料的细胞因子风暴的安全手段。
在这方面，术语“细胞因子风暴”，在本领域中也被称作“超高细胞因子血症”，优选限定对除了其它症状以外以低血压、发热和/或发冷为特征并可能导致死亡的在患者体内的系统性炎症应答。细胞因子风暴据推测是由于在细胞因子和免疫细胞之间的未控制的正反馈回路引起的，导致高度提高的各种细胞因子水平。
在进一步的实施方式中，本发明涉及皮质类固醇、纳巴霉素和/或钙神经素抑制剂，其在施用抗人CD28特异性超拮抗单克隆抗体时用于治疗、减弱或防止细胞因子风暴的用途。
在优选的实施方式中，所述抗体为TGN1412。
所述抗体TGN1412的氨基酸序列已描述在WO-A22006/050949中。
在进一步优选的实施方式中，所述皮质类固醇为地塞米松和/或甲泼尼龙。
在进一步优选的实施方式中，所述钙神经素抑制剂为环胞素A、Voclosporin和/或他克莫司。
附图说明
以下通过实例和附图来详细解释本发明。附图显示：
图1：通过CD3-特异性mAb OKT3和来自人PBMC的CD28超拈抗剂TGN1412诱导细胞因子释放。
图2：通过2天的预培养从TGN1412不反应状态到TGN1412反应状态的连续转化。
图3：在预培养期间TGN1412-反应性的获得需要高细胞浓度。
图4：高密度预培养物中的TGN1412-反应性的获得需要两天的孵育。
图5：高密度培养物中的TGN1412-反应性的获得需要细胞-细胞接触。
图6：预培养的、但不是新鲜的PBMC以增殖应答TGN1412。
图7：CD45RO(记忆)CD4T-细胞为由OKT3和TGN1412两者释放的促炎性细胞因子的主源。
图8：由OKT3和TGN1412诱导的从高密度预培养的PBMC中的释放TNF的可比较动力学。
图9：TGN1412-反应性的获得被HLA抗原的mAb阻断。
图10：由OKT3和TGN1412诱导的细胞因子释放对皮质类固醇介导的抑制的可比较敏感性。
图11：在预培养的PBMC中增殖T-细胞应答ConA和PHA的增强。
图12：在预培养的PBMC中对破伤风/白喉类毒素的回忆应答的增强(A)，资料汇编来自六个单独供体(B)。
图13：在预培养的PBMC中增殖T细胞应答病毒肽的增强。
图14：在预培养的PBMC中增殖T细胞应答葡萄球菌肠毒素B的增强。
图15：在预培养的PBMC中增殖T细胞应答高CsA剂量的降低的抑制。
图16：通过TGN1412和OKT-3刺激诱导在新鲜的(A)和预培养的(B)T-细胞上的活化标志物。使用新鲜的(A)或者在高密度条件下预培养两天的(B)PBMC，收获以及使用1μg/ml OKT-3(黑线)、1μg/ml TGN1412(灰线)或者不使用刺激抗体(填充直方图)在标准(低密度)条件下重新刺激PBMC。18小时后，收获细胞并用对CD4、CD8、CD25和CD69具有特异性的mAb染色。显示了在CD4(左)或CD8(右)T-细胞上设门的CD25(顶部)和CD69(底部)的直方图。
具体实施方式
以下用实施例阐述本发明。
实施例1：比较实施例
为了诱导细胞因子释放，本发明以及该比较实施例使用PBMC刺激的标准体系，因为该体系被全世界的研究者用于研究人PBMC对免疫调节药剂的应答。该体系采用新鲜制备的PBMC，其是根据厂家的说明书在一个密度梯度(Lymphocyte Separation Medium LSM 1077，PAA Laboratories，Pasching，德国)上通过离心从肝素化的静脉血中分离的。或者，使用新鲜的白血球浓缩物作为蔗聚糖纯化的原料，基本上得到同样的结果，其中，新鲜的白血球浓缩物是作为在制备血小板浓缩物中作为副产物从白细胞减少体系室(CaridianGambro BCT，Lakewood，CO，美国)得到的(Dietz等，2006)。在96孔组织培养板(Greiner bio-one，Frickenhausen，德国)中培养PBMC，其中，在0.2ml的补充有10％自体血清或者市售可得的混合AB血清(PAA Laboratories)的富集RPMI 1460培养基(GIBCO/Invitrogen，长岛，纽约，美国)中刺激2x 105个细胞，结果基本上是一样的。当使用市售可得的混合AB血清时，为了确保获得可比较的结果，与自体血清相比，应该对混合AB血清进行预测试。
在这种组织培养体系中，使用由TheraMab GmbH，Würzburg提供的可溶性TGN1412对新分离的PBMC进行刺激。这与伦敦试验(Suntharalingam等，2006)期间使用的GMP-质量批次是相同的。作为诱导细胞因子释放的阳性对照，使用临床级的OKT3(“Muromonomab”，Janssen-Cilag，Neuss，德国)，众所周知，其既能在体外也能在患者体内引起细胞因子释放(Abramowicz等，1989)。24小时后，根据厂家的说明书通过细胞因子微球分析(CBA)技术(Becton Dickinson，Moutain View，CA，美国)分析在TGN1412试验(Suntharalingam等，2006)的志愿者的血浆中检测到的包括主要促炎因子和抗炎因子的一组细胞因子。
使用的OKT3和TGN1412两者的浓度都为1μg/ml，这落入在伦敦TGN1412试验期间在志愿者的循环中达到的估计浓度范围内(Duff，2006)。没有在此示出的两种抗体的多次滴定显示所述浓度在生物应答的最佳范围内。
图1A显示在新鲜的PBMC中可溶性TGN1412不能诱导细胞因子释放。相反，OKT3能非常有效地诱导TNF、IFN-γ和IL-2(已知它们均导致了细胞因子释放症状的病理表现)以及抗炎细胞因子IL-10。通过蔗聚糖密度离心分离从健康供体分离PBMC并以106/ml在96孔平底组织培养板中在0.2ml的补充有10％AB血清的RPMI 1640培养基中培养24小时。在24小时孵育后通过细胞因子微球分析技术分析在上层清液中的细胞因子。使用终浓度为1μg/ml的单克隆抗体。显示了三次试验平均值和标准偏差。
TGN1412不能而OKT3能够在这种标准PBMC培养物中诱导这些和其他的细胞因子(未显示)的释放已被10个以上的单独供体重现，这与由TeGeneroAG提交并在关于I期临床试验的安全性的科学专家组的报告中重现的数据相符(Duff，2006)。
实施例2：在预培养后通过TGN1412应答
对于图1B的试验，在24孔平底组织培养板中将从健康供体得到的PBMC在1.5ml培养基中以107/ml培养2天，然后再冲洗和重新调整到106/ml。使用这些细胞进行与实施例1描述的相同的试验。
图1B显示，令人惊奇地，在没有明显刺激的情况下，通过简单地预培养PBMC 2天可以恢复对TGN1412的应答性。当在2008年12月4日制备细胞时，得到的PBMC的数目超过了用于本试验的所需数目，将过剩的细胞在37℃下在培养基中储存两天。当使用这些储存的细胞进行与先前使用新鲜细胞完全相同的试验时(图1A)，令人完全意想不到的事情发生了：现在TGN1412诱导了如OKT3可比较级别的细胞因子释放。图1B提供了这种试验的实例。
因此进一步研究了重现性和机理基础。
实施例3：关键观察的重现性
图2概括了对于7个单独健康供体，预培养对对TGN1412的反应性的影响。显示了来自7个单独健康供体的数据，每个用一个符号表示。抗体刺激和预培养的条件如图1。当对OKT3应答和TGN1412应答两者都存在供体-特异性的变化时，很明显，在所有的情况下，新鲜的供体细胞不能以细胞因子释放应答TGN1412刺激，而在2天预培养以后这种不应状态消失了。如通过由伦敦TGN1412试验的志愿者所经历的细胞因子风暴的级别的巨大差异所阐述的(Suntharalingam等，2006)，可以预期供体-特异性的变化。
实施例4：新方法的优化
图3-5描述了确定在外周血T-细胞中获得对TGN1412的敏感性的参数。
对于图3的试验，将PBMC以106/ml(左柱)或者107/ml(右柱)培养2天，然后如图1所述在以106/ml用TGN1412进行刺激。
对于图4的试验，在图1给出的条件下用OKT3或TGN1412刺激新鲜的PBMC(三柱中的左柱)和以107/ml预培养24小时(三柱中的中柱)或48小时(三柱中的右柱)的PBMC 24小时。
对于图5的试验，在1.5ml培养基中以高密度(107/ml，三柱中的右柱)或以低密度(106/ml，三柱中的左柱或中柱)培养PBMC两天。如在三柱中的中柱显示的组中，这些低密度培养物另外包含具有半透膜的插入物，在所述插入物上以高密度培养另外的PBMC(膜下106/ml，膜上107/ml，三柱中的中柱)。按照图1所描述的条件重新刺激和分析细胞。
如上所示，通过在具有10％自体血清或者市售可得的AB血清的培养基中预培养，PBMC获得了对TGN1412的敏感性。我们测试了以下参数在获得TGN1412敏感性中的作用。
细胞密度。与其中以106/ml或2×105/cm2的培养孔中培养细胞的标准PBMC刺激分析不同，在10倍高的密度下“放置(parking)”2天。图3显示，在继代培养中在高密度(107/ml或2×106/cm2)而不是在低密度(106/ml或2×105/cm2)预培养的PBMC诱导了对TGN1412的反应性。由于需要细胞密度和两天的培养，为了给细胞提供充足的养分，在24小时以后用新鲜的预热的培养基谨慎地替换一半的培养基。
时间。图4显示，经过2天的预培养之后取得了对TGN1412的完全反应性(可与对OKT3的反应性相比较)。1天的预培养仅导致了反应性适中的提高。
对细胞-细胞接触的要求。为获得对TGN1412的反应性，在PBMC的预培养期间对高细胞密度的要求可能是由于对细胞-细胞接触的需要和/或由于对需要达到某一浓度来促进反应状态成熟的可溶性因子的作用的需要。使用transwell系统(Corning incorporated，Lowell，MA，美国)，其中通过允许可溶性因子扩散的8μm-孔的膜使在高密度培养的细胞与在低密度培养的细胞分离，图5显示需要细胞-细胞接触。
实施例5：新方法的其他特征
图6显示预培养的、但不是新分离的PBMC在应答TGN1412时增殖。如图1A和B所描述的分别制备和培养新鲜的和预培养的PBMC。在第3天，加入1μCi的3H-胸苷，16小时后收获培养物并进行液体闪烁计数。除了细胞因子释放之外，多克隆T-细胞活化还导致增殖，这可以以引入(在此以氚化胸苷引入)的放射性来衡量。从图6可以看出，OKT3刺激两者(新鲜的和预培养的PBMC)的增殖，而TGN1412仅能够诱导预培养的PBMC的增殖。因此，增殖也可用作读出。
图7显示，在预培养的PBMC中，TGN1412从CD4记忆细胞释放促炎细胞因子。用1μg/ml的OKT3或TGN1412刺激2天高密度预培养的PBMC18小时。一般来说，用15至20小时(优选16至18小时)之间的时段来代替18小时也是可以的。在培养的最后4小时期间，加入5μg/ml的布雷菲德菌素A来阻断细胞因子的细胞输出。在用结合有荧色物的CD4和CD45RO(记忆标志物)mAb对细胞表面进行染色以后，将细胞固定、透化和用TNF-左板-或IFN-γ-右板-的mAb(全部来自BD Pharmingen，Mountain View，CA，美国)染色。在BD Calibur流式细胞仪上获得15.000活门事件(1ive-gated events)并且使用FlowJo软件(Three Star Inc.，Ashland，OR，美国)分析数据。在患者中由OKT3诱发细胞因子风暴是众所周知的现象，并且这种药物提供的附加信息(Muromonomab，Janssen-CILAG)明确地警告了这种综合征。为了比较两种重要的促炎细胞因子TNF和IFN-γ在应答OKT3和TGN1412时的细胞源，使用药物布雷菲德菌素A(Sigma Aldrich，Steinheim，德国)通过Golgi仪器封锁它们的传输将它们保留在细胞中，并通过将固定和透化后的细胞分别用荧光TNF-和IFN-γ-特异性mAb(Becton Dickinson，Mountain View，CA，美国)进行细胞内染色来展现。同时，测定刺激后的PBMC的细胞表面的表型。因此鉴定出主要的产生细胞因子的T-细胞亚型，CD4T-细胞，并进一步细分为原初(CD45RO-)和记忆(CD45RO+)亚型。图7显示，在新鲜和预培养的两种PBMC中，OKT3和TGN1412主要在CD4记忆亚型中引起细胞因子产生。
图8显示，当用OKT3或TGN1412诱导时，TNF从预培养PBMC中的释放遵循同样的动力学。高密度预培养的PBMC按照图1B中的方法制备并用1μg/ml的OKT3或TGN1412刺激。在指示的时间收获上层清液并按照图1中的方法分析TNF含量。在体内，当用OKT3或TGN1412诱导时，TNF(“细胞因子风暴”最重要的促炎细胞因子)的释放遵循同样的动力学(Abramowicz等，1989；Suntharalingam等，2006)。因此，在两种mAb之间将TNF在预培养PBMC中的释放动力学进行比较并发现实质上是一致的。
实施例6：在高密度预培养期间诱导对TGN1412的反应性的机理基础：自体-MHC识别
不受限于理论，本实施例提供关于本发明的功能信息。根据对大鼠进行的研究，有人已经提出，通过在淋巴器官(淋巴结，脾脏等)中的T-细胞抗原受体(TCR)对主要组织相容性复合物(MHC；人类的HLA)的分子识别激发(prime)TCR以在稍后抗原遭遇期间提高信号(Stefanova等，2002)。这种方法被称作“MHC-扫描”并且描述组织固有T-细胞的TCR与在它们相邻细胞上的HLA分子的不断相互作用，其与它们包含的肽无关(Stefanova等，2002)。当合适的抗原肽遇到TCR时，这种相互作用导致TCR的激发(priming)以及有利于全T-细胞活化的信号平台的组装。该方法在本领域中也被称作“增强的(tonic)”TCR信号。因为发明人的实验室早先已经发现CD28超拮抗剂信号通过放大弱TCR信号起作用(Dennehy等，2007)，所以猜测正是这种激发信号(priming signals)的丧失使循环的T-细胞(其与淋巴器官中情形不同，没有细胞-细胞接触)对TGN1412的刺激没有应答。这通过在以10μg/ml的两天预培养(mAbs 646-2.6和Tü39，Becton-Dickenson)期间包括阻断能够与所有的人HLA I类和II类分子反应的mAb进行测试。
图9显示，HLA I类以及在较小程度上HLA II类特异性mAb能够阻断TGN1412反应性的获得，说明了细胞的TCR获得这种反应性需要HLA识别。如图1B所给出的进行PBMC的高密度预培养。向一些高密度预培养物中，以10μg/ml加入HLA I类或HLA II类的mAb。
这个发现强烈地建议TCR与在稠密叠集的淋巴器官中的HLA分子的相互作用是如伦敦试验的志愿者所经历的对TGN1412的强烈反应性的前提，并且在体外通过高密度培养物模拟了这种情形，因此将已经失去细胞-细胞接触的循环T-细胞的反应性恢复到淋巴器官中T-细胞的反应性。这还解释了为什么不但在预培养的PBMC中而且在新鲜的PBMC中观察到了对OKT3的应答。因为与TGN1412相反，OKT3自身处理TCR，所以不需要通过与HLA-分子的相互作用来“激发”该受体。HLA I类和II类特异性mAb阻断获得对TGN1412反应性的能力差别通过以下事实解释：在PBMC培养物中90％以上的可利用HLA分子是I类。
实施例7：测试皮质类固醇控制TGN1412介导的细胞因子释放的能力
通常通过使用高剂量的皮质类固醇防止或干涉来治疗OKT3诱导的细胞因子风暴(Goldman等，1989)。到目前为止，由于没有分析系统存在，还不能测试TGN1412诱导的细胞因子释放对皮质类固醇的敏感性。因此我们使用所述新方法来比较在新鲜和预培养的PBMC中的细胞因子释放对地塞米松(“Dex”，Sigma-Aldrich)的敏感性。
图10显示，TGN1412诱导的细胞因子释放对皮质类固醇敏感。如图1B所描述制备高密度预培养细胞并且用mAb刺激。需要指出的是，以给出的终浓度包括地塞米松，在24小时培养后测量细胞因子。
所使用的最高剂量(1μM)完全抑制了通过OKT3和TGN1412两者诱导的细胞因子释放，并且在低十倍剂量(100nM)时也几乎完全抑制了。这强烈地建议如临床用于OKT3-治疗的患者那样通过适当的皮质类固醇药物治疗可以控制TGN1412诱导的细胞因子释放。
实施例8：对促有丝分裂凝集素的反应性
通常使用促有丝分裂凝集素刀豆素A(ConA)和植物凝集素(PHA)来测试在PBMC制品中T-细胞的反应性。这些凝集素通过它们结合到糖部分的一个或多个细胞表面糖蛋白起作用。图11显示，对于这两种凝集素，如果按照以上方案将PBMC预培养两天，则会极大地提高增殖T-细胞的应答。
实施例9：抗原-特异性回忆应答
作为有意识的疫苗接种或天然感染的结果，特异性针对给定的微生物抗原的T-淋巴细胞频率增加到其中在体外重新刺激使得能够检测增殖应答的水平。这种抗原的经典例子为白喉毒素和破伤风毒素。这类制剂通常被用来评估个体的疫苗接种状态。为此目的，由Sanofi Pasteur以单一制剂提供这两种毒素。图12A说明了，的确，通过将PBMC在高密度预培养两天极大地提高了对破伤风毒素/白喉毒素的回忆应答。在图12B中，汇编了来自六个个人供体的数据。*表示具有统计学的意义p＜0.05。
实施例10：CD8T-细胞对源自巨细胞病毒的肽的应答
对破伤风毒素和白喉毒素的回忆应答解决了CD4T-细胞的疑问。为了测试CD8T-细胞的回忆应答是否也受在高细胞密度预培养的影响，对预先暴露到巨细胞病毒的HLAA2阳性个体的PBMC使用用针对该个体的CD8T-淋巴细胞的HLAA2呈递的肽进行刺激。作为读出，选择分泌IFN-γ的CD8T-细胞的数目，因为已知这种CD8记忆T-细胞在通过抗原受体刺激时快速地分泌IFN-γ。使用所谓的酶联免疫斑点试验进行量化，其中在涂敷IFN-γ反应性单克隆抗体的过滤膜上培养PBMC。然后，使用第二种、酶标记的mAb显色由此在24h孵育期间捕获的IFN-γ，并且底物由无色转变为有色。如图13所示，将PBMC在高细胞密度预培养两天极大地提高了分泌IFN-γ的细胞应答病毒肽的频率。
实施例11：对“超抗原”葡萄球菌肠毒素B的应答
某些细菌分泌所谓的超抗原，与常规的抗原的情况相比(在未免疫的个体中，1/100.000)，这种超抗原通过它们的抗原受体能够刺激大很多部分的T-淋巴细胞(5-20％)。因此，使用PBMC可以在体外测量对这种超抗原的增殖应答。图14显示，在高密度预培养PBMC两天也极大地提高了这个分析的敏感性。
实施例12：测试免疫抑制药物
当使用新鲜的而不是预培养的PBMC时，会错误判断免疫调节药物的效力。环孢素A(CsA)是广泛使用的免疫抑制药物，其在T-细胞抗原-受体的信号转导途径中起作用。因此，循环T-细胞的信号能力的降低可以翻译为对这种药物的敏感性的提高。图15显示，情况确实如此：当新鲜的和预培养的PBMC(来自相同的原始制剂)都应答用OKT3诱导的TCR刺激时，预培养的PBMC不像新鲜的PBMC那样容易被高CsA剂量抑制(p＜0.03)。
实施例13：诱导在细胞表面上的T细胞活化标志物
图16显示用TGN1412和OKT-3刺激在新鲜的(A)和预培养的(B)T-细胞上诱导活化标志物。使用新鲜的(A)或者在高密度条件下预培养两天的(B)PBMC，收获以及使用1μg/ml OKT-3(黑线)、1μg/ml TGN1412(灰线)或者不使用刺激抗体(填充直方图)在标准(低密度)条件下重新刺激PBMC。18小时后，收获细胞并用CD4、CD8、CD25和CD69特异性mAb染色。显示在CD4(左)或CD8(右)T-细胞上设门的CD25(顶部)和CD69(底部)的直方图。
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Claims (14)
1.一种测试用于T-细胞活化的预期或已知免疫调节药物的方法，包括以下步骤：在体外使外周血单核细胞(PBMC)培养物与预定量的所述预期或已知免疫调节药物接触；以及当与所述预期或已知免疫调节药物接触时，使用读出系统观察用于T-细胞活化的所述PBMC培养物，其中调节PBMC预培养物的细胞密度使得所述PBMC能够细胞-细胞接触，并且其中培养所述PBMC预培养物至少12h。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述读出系统观察所述PBMC培养物从PBMC释放至少一种细胞因子，观察细胞增殖，或者为另一种合适的读出系统，如基因表达的变化、蛋白质表达的变化和/或翻译后修饰的变化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在没有免疫调节药物的情况下，并且在与要测试的免疫调节药物接触之前，通过在35℃～40℃，优选36℃～38℃，储存PBMC培养物至少24h，优选至少36h，更优选至少45h来进行预培养步骤。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在预培养步骤期间，所述PBMC培养物的细胞密度至少为2＊106/ml，优选至少为5＊106/ml，更优选至少为107/ml，或者至少为4＊105/cm2，优选至少为106/cm2，最优选至少为2＊106/cm2。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述免疫调节药物为免疫刺激药物，如抗体，优选单克隆抗体，尤其人CD28特异性超拮抗单克隆抗体，或者选自凝集素，如刀豆素A(ConA)，或植物凝集素(PHA)；包含凝集素的天然提取物，如松果菊提取物，或槲寄生提取物；超抗原，如葡萄球菌肠毒素B(SEB)，葡萄球菌肠毒素A(SEA)，中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)；葡萄球菌生脓原，如葡萄球菌生脓肠毒素B(SPEB)；由支原体产生的超抗原，如支原体anthriditis；或者由黑鼠疫细菌产生的超抗原，如假结核耶尔森氏菌；由某些致病病毒产生的超抗原，如EBV或HIV-1。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所观察的细胞因子选自TNF、IFN-γ、IL-1-β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-21、IL-35和LT，以及它们的组合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在将所述PBMC培养物与已知免疫调节药物，尤其免疫刺激药物，接触的同时，或者随后在预定的一段时间之后，或者在预定的一段时间之前，使所述预培养的PBMC培养物另外地与用于减弱至少一种细胞因子释放的预期药物接触，其中进一步观察细胞因子释放。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述预定的一段时间在10s至12h的范围内，优选在10s至1h的范围内。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述用于减弱细胞因子释放的预期药物为皮质类固醇。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述用于减弱细胞因子释放的预期药物为选自纳巴霉素或者如环胞素A、Voclosporin或他克莫司的钙神经素抑制剂的免疫抑制药物。
11.皮质类固醇、纳巴霉素和/或钙神经素抑制剂，其用于治疗、减弱或防止在施用抗人CD28特异性超拮抗单克隆抗体时的细胞因子风暴的用途。
12.用于根据权利要求11中所述用途的皮质类固醇和/或钙神经素抑制剂，其中，所述抗体为TGN1412。
13.用于根据权利要求11或12中所述用途的皮质类固醇和/或钙神经素抑制剂，其中，所述皮质类固醇为地塞米松和/或甲泼尼龙。
14.用于根据权利要求11-13中任一项中所述用途的皮质类固醇和/或钙神经素抑制剂，其中，所述钙神经素抑制剂为环胞素A、Voclosporin和/或他克莫司。
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