CN105445171A - 自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括：通过自然杀伤作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发自然杀伤细胞脱颗粒，再用流式细胞术检测自然杀伤细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a阳性的细胞占总自然杀伤细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度来评价其脱颗粒能力。本申请提供的自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，检测快速，通量大，准确度高，且人为因素影响较小。通过对天然刺激物的选择、效靶细胞配比及孵育时间等关键技术细节进行优选限定，建立了稳定规范的技术流程。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法。
背景技术
自然杀伤细胞(NaturalKillercell，NK细胞)是机体重要的天然免疫细胞。在机体的抗肿瘤、抗病毒感染中起重要作用。而且大量研究表明NK细胞参与了多种炎症性疾病及自身免疫性疾病的病理过程(如肝脏炎症与损伤，习惯性流产)。因此，NK细胞功能的检测对研究此类疾病的发生机理，协助诊断和指导治疗必不可少。
NK细胞胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒。NK细胞脱颗粒的能力与其细胞毒活性直接相关，脱颗粒功能检测反映了NK细胞的杀伤活性，对于细胞毒功能学研究具有重要意义，是医学基础及临床研究中的一项重要工作。
传统的对NK细胞脱颗粒的检测多形态法、酶释法、化学发光法或荧光法等，但这些方法具有检测速度慢、精度较低、准确性较差，带有检测者的主观因素等问题，使得检测结果不甚理想。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，所述的检测方法可解决现有技术检测速度慢、精度较低、准确性较差、检测结果容易受到检测者的主观因素影响等问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括：通过自然杀伤作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发自然杀伤细胞脱颗粒，再用流式细胞术检测自然杀伤细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a阳性的细胞占总自然杀伤细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度来评价其脱颗粒能力。
自然杀伤细胞(NaturalKillercell，NK细胞)通过自然杀伤性或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-DependentCell-mediatedCytotoxicity，ADCC)发挥细胞毒作用。NK细胞的自然杀伤活性来自其可以不依赖抗体识别靶细胞，无主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)限制，而且不会杀伤体内正常细胞。此外，NK细胞是能发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)的主要细胞。部分NK细胞表达IgGFc受体，通过与已结合在靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，起到杀伤这些靶细胞的作用。
NK细胞胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒。溶酶体相关膜蛋白1(CD107a)是囊泡膜蛋白的主要成分。NK细胞杀伤靶细胞时，毒性颗粒将到达细胞膜并与细胞膜融合(此时CD107a分子会被转运到细胞膜表面)，引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞的死亡。实验证明，静息状态下，NK细胞膜表面CD107a自发表达率很低，经靶细胞刺激后可以在其表面检测到CD107a表达的增加，因此，刺激后CD107a分子增加的幅度可反映NK细胞是否存在脱颗粒功能的缺陷或异常。CDl07a分子作为NK细胞脱颗粒的一种敏感标志，与细胞毒活性直接相关，可反映细胞毒性细胞杀伤活性水平。此外，与颗粒胞吐有关的基因缺陷导致了CD107a转移到细胞表面的功能受损。通过检测NK细胞表面表达的CD107a是鉴别是否存在颗粒胞吐功能缺陷的遗传性疾病的快速手段。
流式细胞术(FlowCytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。通过自然杀伤作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发NK细胞脱颗粒后，再使用流式细胞术对其CD107a分子增加的幅度进行检测，可以快速、精度地评价NK细胞的脱颗粒能力。
如上所述的检测方法，具体包括以下步骤：
1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞并计数调整细胞浓度；
2)、取自然杀伤细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度；
3)、将步骤1)中的所述外周血单个核细胞和步骤2)中的所述自然杀伤细胞天然靶细胞按体积等比混合，得到细胞混合液；将所述细胞混合液孵育后离心并弃上清，得到沉淀；
4)、加入流式染色缓冲液重悬步骤3)中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体并孵育；
5)、待孵育完成后离心，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；
6)、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
7)、统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
CD3(clusterofdifferentiation3，分化簇3)受体仅存在于T细胞表面，因而可用作T细胞的标志物；
CD56(clusterofdifferentiation56，分化簇56)又称为神经细胞粘附分子(N-CAM)，广泛存在于大部分的神经外胚层来源的细胞、组织和肿瘤中，包括视网膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、小细胞癌。也表达于一些中胚层衍生的肿瘤、自然杀伤细胞和NK淋巴瘤。本申请中CD56用作NK细胞的标志物；
CDl07a分子作为NK细胞脱颗粒的敏感标志物。
步骤4)中加入的三种抗体，CD3抗体(Mouseanti-HumanCD3MonoclonalAntibody,FITC)购自4abio公司，目录号为FHF003-100；CD56抗体【Anti-HumanCD56(NCAM)APC】购自eBioscience公司，目录号为17-0569-42了；CD107a抗体【Anti-HumanCD107a(LAMP-1)PE100tests】购自eBioscience公司，目录号为12-1079-42。
优选的，如上所述的检测方法，所述自然杀伤细胞天然靶细胞为K562细胞或P815细胞。
K562细胞是人白血病细胞，HLA-I类分子阴性，是从白血病急变期的患者的胸水中分离建立的，处于高度未分化阶段；该细胞是对自然杀伤细胞高度敏感的体外靶标，故而被广泛应用于这方面的研究。K562细胞作为NK细胞的天然靶细胞，可通过NK细胞的自然杀伤活性激活NK细胞脱颗粒；
P815细胞为肥大细胞瘤细胞，可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)激发自然杀伤细胞脱颗粒。
优选的，如上所述的检测方法，当所述自然杀伤细胞天然靶细胞为P815细胞时，在步骤3)中，孵育之前还需要在所述细胞混合液中加入抗人CD16抗体；
所述抗人CD16的抗体浓度为0.25～0.5μg/100μl。
抗人CD16抗体购自4abio公司，目录号为FHU016-100。其作用为介导ADCC作用。
优选的，如上所述的检测方法：
在步骤1)中，所述细胞浓度为1.8～2.2×106/ml；
在步骤2)中，所述细胞浓度为1.8～2.2×106/ml。
优选的，如上所述的检测方法，在步骤3)中，孵育条件为：
于37℃，5％CO2培养箱中共孵育2.5～3.5h。
优选的，如上所述的检测方法，在步骤4)中，孵育条件为：
室温避光孵育15～25min。
优选的，如上所述的检测方法，所述流式染色缓冲液的配方为：
含有2.0％FBS和2.0mMEDTA的1×PBS溶液。
优选的，如上所述的检测方法，在步骤2)、步骤3)和步骤5)中：
所述离心的转速均为1200～1600rpm，离心时间均为4～6min。
优选的，如上所述的检测方法，在步骤4)中：
CD3、CD56的抗体的浓度为0.45～1.0μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.06～0.125μg/100μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本申请提供的自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，检测快速，通量大，准确度高，且人为因素影响较小。
2)、通过对天然刺激物的选择、效靶细胞配比及孵育时间等关键技术细节进行优选限定，建立了稳定规范的技术流程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例4中通过NK细胞天然靶细胞K562激发的NK细胞脱颗粒，进而通过流式细胞术进行检测的实验结果图，图A为激发前，图B为激发后；其中，Q1-UL象限代表CD3-CD56+CD107a-的细胞，Q1-UR象限代表CD3-CD56+CD107a+的细胞；
图2为本申请实施例5中通过抗人CD16抗体及靶细胞P815激发的NK细胞脱颗粒，进而通过流式细胞术进行检测的实验结果图，图A为激发前，图B为激发后；其中，Q1-UL象限代表CD3-CD56+CD107a-的细胞，Q1-UR象限代表CD3-CD56+CD107a+的细胞。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
S11、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；
S12、取自然杀伤细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度；
S13、将步骤S11中的所述外周血单个核细胞和步骤S12中的所述自然杀伤细胞天然靶细胞按体积等比混合，得到细胞混合液；将所述细胞混合液孵育后离心并弃上清，得到沉淀；
S14、加入流式染色缓冲液重悬步骤S13中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体并孵育；
S15、待孵育完成后离心，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；
S16、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
S17、统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
实施例2
自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
S21、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至1.8×106/ml；
S22、取自然杀伤细胞天然靶细胞K562并计数调整细胞浓度至1.8×106/ml；
S23、将步骤S21中的所述外周血单个核细胞和步骤S22中的所述自然杀伤细胞天然靶细胞按体积等比混合，得到细胞混合液；将所述细胞混合液于37℃，5％CO2培养箱中共孵育2.5h后1200rpm离心6min，弃上清，得到沉淀；
S24、加入流式染色缓冲液(PBS添加2.0％FBSand2.0mMEDTA)重悬步骤S23中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体室温避光孵育15min；CD3、CD56的抗体的浓度为0.45μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.06μg/100μl；
S25、待孵育完成后1200rpm离心6min，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；
S26、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
S27、统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
实施例3
自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
S31、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至2.2×106/ml；
S32、取自然杀伤细胞天然靶细胞P815并计数调整细胞浓度至2.2×106/ml；
S33、将步骤S31中的所述外周血单个核细胞和步骤S32中的所述自然杀伤细胞天然靶细胞按体积等比混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD16抗体(抗体的浓度为0.25μg/100μl)作为实验组，另一组作为对照组；将两组于38℃，6％CO2培养箱中共孵育3.5h后1600rpm离心4min，弃上清，得到沉淀；
S34、加入流式染色缓冲液(PBS添加2.0％FBSand2.0mMEDTA)重悬步骤S33中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体室温避光孵育25min；CD3、CD56的抗体的浓度为1.0μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.125μg/100μl；
S35、待孵育完成后1600rpm离心4min，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；
S36、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
S37、统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
实施例4
自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
S41、EDTA或肝素钠抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell，PBMC)，并计数，调整细胞浓度为2.0×106/ml悬液备用；
S42、取自然杀伤细胞天然靶细胞K562并计数调整细胞浓度至2.0×106/ml；
S43、按照效靶细胞混合比例PBMC:K562＝1:1的比例，取步骤S41中的PBMC100μl和步骤S42中的K562细胞100μl等比混合，得到细胞混合液200μl作为实验组；同时取200μlPBMC但不加K562细胞的作为对照组；
将所述两组细胞于37℃，5％CO2培养箱中共孵育3h后1400rpm离心5min，弃上清，得到沉淀；
S44、加入流式染色缓冲液(PBS添加2.0％FBSand2.0mMEDTA)重悬步骤S43中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体室温避光孵育20min；CD3、CD56的抗体的浓度为0.5μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.0625μg/100μl；
S45、待孵育完成后1400rpm离心5min，用1ml流式染色缓冲液洗涤沉淀；
S46、洗涤后用100μl流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
S47、实验结果如图1所示；统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度(即所述实验组与所述对照组的差值)用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
表1实施例4检测结果
实施例5
自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
S51、EDTA或肝素钠抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell，PBMC)，并计数，调整细胞浓度为2.0×106/ml悬液备用；
S52、取自然杀伤细胞天然靶细胞P815并计数调整细胞浓度至2.0×106/ml；
S53、按照效靶细胞混合比例PBMC:P815＝1:1的比例，取步骤S51中的PBMC200μl和步骤S52中的P815细胞200μl，混合重悬，终体积为400μl，混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD16抗体(抗体的浓度为0.5μg/100μl)作为实验组，另一组作为对照组；将两组于37℃，5％CO2培养箱中共孵育3h后1400rpm离心5min，弃上清，得到沉淀；
S54、加入流式染色缓冲液(PBS添加2.0％FBSand2.0mMEDTA)重悬步骤S53中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体室温避光孵育20min；CD3、CD56的抗体的浓度为0.5μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.0625μg/100μl；
S55、待孵育完成后1400rpm离心5min，用1ml流式染色缓冲液洗涤沉淀；
S56、洗涤后用100μl流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
S57、实验结果如图2所示；统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度(即所述实验组与所述对照组的差值)用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
表2实施例5检测结果
实施例6
自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
S61、EDTA或肝素钠抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell，PBMC)，并计数，调整细胞浓度为2.0×106/ml悬液备用；
S62、分别取自然杀伤细胞天然靶细胞K815和K562并计数，两组均调整细胞浓度至2.0×106/ml；
S63、按照效靶细胞混合比例PBMC:P815＝1:1的比例，取步骤S61中的PBMC200μl和步骤S62中的P815细胞200μl，混合重悬，终体积为400μl，混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD16抗体(抗体的浓度为0.5μg/100μl)作为实验组1，另一组作为对照组1；
按照效靶细胞混合比例PBMC:K562＝1:1的比例，取步骤S61中的PBMC100μl和步骤S62中的K562细胞100μl等比混合，得到细胞混合液200μl，将其作为实验组2；同时取200μlPBMC但不加K562细胞的作为对照组2；
将实验组1、2，对照组1、2分别于37℃，5％CO2培养箱中共孵育3h后1400rpm离心5min，弃上清，得到沉淀；
S64、加入流式染色缓冲液(PBS添加2.0％FBSand2.0mMEDTA)重悬步骤S63中得到的四组沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体室温避光孵育20min；CD3、CD56的抗体的浓度为0.5μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.0625μg/100μl；
S65、待孵育完成后1400rpm离心5min，用1ml流式染色缓冲液洗涤沉淀；
S66、洗涤后用100μl流式染色缓冲液分别重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
S67、统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在实验组1与对照组1之间的变化幅度、及实验组2与对照组2之间的变化幅度，用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括：通过自然杀伤作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发自然杀伤细胞脱颗粒，再用流式细胞术检测自然杀伤细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a阳性的细胞占总自然杀伤细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度来评价其脱颗粒能力。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；
2)、取自然杀伤细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度；
3)、将步骤1)中的所述外周血单个核细胞和步骤2)中的所述自然杀伤细胞天然靶细胞按体积等比混合，得到细胞混合液；将所述细胞混合液孵育后离心并弃上清，得到沉淀；
4)、加入流式染色缓冲液重悬步骤3)中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体并孵育；
5)、待孵育完成后离心，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；
6)、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；
7)、统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞天然靶细胞为K562细胞或P815细胞。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，当所述自然杀伤细胞天然靶细胞为P815细胞时，在步骤3)中，孵育之前还需要在所述细胞混合液中加入抗人CD16抗体；
所述抗人CD16抗体的浓度为0.25～0.5μg/100μl。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：
在步骤1)中，所述细胞浓度为1.8～2.2×106/ml；
在步骤2)中，所述细胞浓度为1.8～2.2×106/ml。
6.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在步骤3)中，孵育条件为：
于37℃，5％CO2培养箱中共孵育2.5～3.5h。
7.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在步骤4)中，孵育条件为：
室温避光孵育15～25min。
8.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流式染色缓冲液的配方为：
含有2.0％FBS和2.0mMEDTA的1×PBS溶液。
9.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)、步骤3)和步骤5)中，所述离心的转速均为1200～1600rpm，离心时间均为4～6min。
10.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在步骤4)中：
CD3、CD56的抗体的浓度为0.45～1.0μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.06～0.125μg/100μl。
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