CN102191219A - 一种高效制备cik细胞的方法 - Google Patents

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本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于采用如下制备步骤：初步分离淋巴细胞；采用洗液两次洗涤；调节淋巴细胞浓度；培养：将调节好浓度的淋巴细胞加入已包被CD3抗体的细胞瓶内培养24小时，再加入IFN-γ试剂1ml，IL－1β试剂1ml培养48小时得CIK细胞；扩大培养；收集。本发明同现有技术相比，采用先包被CD3抗体，后加入INF-γ，并打破常规使用IL-1β，通过包被使得细胞更持久的接触抗体，用量少激活效果更好；本发明制备的CIK细胞，细胞毒活性明显高于现有CIK细胞30%以上，解决了CIK细胞繁殖能力差、细胞活性低的问题，并大大降低了成本。

Description

一种高效制备CIK细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种高效制备CIK细胞的方法。
背景技术
以前的制备方法中多采用在人外周血单个核细胞中先加IFN-r 激活，24小时后，再加其它细胞因子如CD3 、PHA、IL-2、IL –1α，3天后扩大培养，这种方法制备出来的CIK细胞繁殖能力差、细胞毒活性低，而且成本低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，突破常规的采用了不同的细胞因子加入顺序，即，采用先包被CD3抗体，后使用INF-γ的顺序；同进采用不同的洗液，并以IL－1β替代IL－1α来刺激细胞增加。
为实现上述目的，设计一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于采用如下制备步骤：（1）初步分离淋巴细胞：取人浓缩白细胞，用人淋巴细胞分离液分离淋巴细胞以2000rpm，离心20分钟，然后先吸出上层血浆，灭活备用，再吸取下层富含淋巴细胞的白环层；（2）两次洗涤：在吸取的富含淋巴细胞的溶液中加入洗液，再以1500rpm离心10分钟，弃上清，取沉淀的细胞，完成第一次洗涤；再在获取的沉淀的细胞中加入洗液，以1500rpm离心10分钟，弃上清，取沉淀的细胞，即淋巴细胞，从而完成对淋巴细胞的两次洗涤，并计数；（3）调节淋巴细胞浓度：用基本培养基调节淋巴细胞浓度至2～3×106个/ml；（4）培养：将调节好浓度的淋巴细胞加入已包被CD3抗体的细胞瓶内培养24小时，再加入IFN-γ试剂1ml，IL－1β试剂1ml培养48小时得CIK细胞；（5）扩大培养：将生长活力为100％的CIK细胞转入175cm2细胞培养瓶内，用CIK培养基进行扩大培养，每48～72小时扩大培养一次，至15-20天；（6）收集：将细胞活力大于98％的CIK细胞收集汇总，然后进行如下洗涤：将收集汇总的CIK细胞以1500rpm离心10分钟，弃上清取底部沉淀细胞；再在获取沉淀细胞中加入洗液重复上述洗涤2～3次，获得的沉淀细胞用200目过滤器过滤，取过滤下来CIK细胞，计数CIK细胞总数及细胞活力；（7）将CIK细胞悬浮于100ml　0.9%的生理盐水中，加入2×105单位的IL－2和10ml的白蛋白，混合均匀后，封口得最终成品。
所述的洗液为500ml的0.9%生理盐水中加入5U/ml的肝素，再加入80 U /ml的庆大霉素混合而成。
所述的基本培养基为采用在GT-T551培养基500ml中加入肝素5 U/ml、庆大霉素80 U/ml、两性霉素30ng/ml，再加入上述灭活备用的上层血浆所构成，所加入的上层血浆在基本培养基中占的体积百分比为1%。
所述的CIK培养基为采用在500ml的基本培养基中加入1000 U/ml 的IL-2所构成。
所述的CD3抗体浓度为2ug/ml，先用包被液包被于细胞瓶底部。
所述的IFN-γ试剂的浓度为1000 U/ml。
所述的IL－1β试剂的浓度为500 U/ml。
本发明同现有技术相比，采用先包被CD3抗体，后加入INF-γ，并打破常规使用IL-1β，通过包被使得细胞更持久的接触抗体，用量少激活效果更好，加入IL-1β可以增强刺激作用，并使细胞收获后的细胞表型检测CD3+CD56+表达得更好，扩增倍数提高2倍的同时，减少了因大剂量使用细胞因子所产生的毒副作用；本发明制备的CIK细胞，细胞毒活性明显高于现有CIK细胞30%以上，而且细胞毒活性可维持2～3周，CIK细胞最高杀伤率出现在培养的第12～15天，细胞的杀伤性更强，临床使用效果更好，解决了CIK细胞繁殖能力差、细胞活性低的问题，并大大降低了成本。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步地说明。
实施例
本发明中采用如下制备方法：
一、 初步分离淋巴细胞：
取人浓缩白细胞，用人淋巴细胞分离液分离淋巴细胞以2000rpm，离心20分钟，然后先吸出上层血浆，灭活备用，再吸取下层富含淋巴细胞的白环层。
二、两次洗涤：
在吸取到的富含淋巴细胞的溶液中加入洗液，再以1500rpm离心10分钟，弃上清，吸取沉淀的细胞，完成第一次洗涤；再在所吸取的沉淀的细胞中加入洗液，以1500rpm离心10分钟，弃上清，吸取沉淀的细胞，即淋巴细胞，从而完成对富含淋巴细胞溶液的两次洗涤，得到淋巴细胞，并计数；所述的洗液为500ml的0.9%生理盐水中加入肝素5 U/ml、再加庆大霉素80U/ml混合而成。
三、调节淋巴细胞浓度：
用基本培养基调节淋巴细胞浓度至2～3×106个/ml；基本培养基为在500ml的GT-T551培养基中加入肝素5 U/ml、庆大霉素80 U/ml、两性霉素30ng/ml，再加入上述灭活备用的上层血浆所构成，所加入的上层血浆在基本培养基中占的体积百分比为1%。
四、培养：
将2ug/ml 的CD3抗体用pH值为7.4的包被液先包被于细胞瓶底部，然后将调节好浓度的淋巴细胞加入已包被CD3抗体的细胞瓶内培养24小时，再加入浓度为1000 U/ml的IFN-γ试剂，浓度为500 U/ml的IL－1β试剂培养48小时。
五、扩大培养：
将生长活力为100％的CIK细胞转入175cm2细胞培养瓶内，用CIK培养基进行扩大培养，每48～72小时扩大培养一次，至15-20天；CIK培养基为采用在500ml的基本培养基中加入1000 U/ml 的IL-2所构成。
六、收集CIK细胞：
将细胞活力大于98％的CIK细胞收集汇总，然后进行如下洗涤：收集汇总CIK细胞，以1500rpm离心10分钟，弃上清取底部沉淀细胞；再在沉淀细胞中加入洗液重复上述洗涤2～3次后最终获得的沉淀细胞，用200目过滤器过滤，获得从过滤器过滤下来的CIK细胞，并计数获得的CIK细胞总数及细胞活力。
七、将过滤后的CIK细胞悬浮于100ml生理盐水中，再加入2×105单位的IL－2和10ml的白蛋白，混合均匀后，封口，即得成品。

Claims (7)

1.一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于采用如下制备步骤：（1）初步分离淋巴细胞：取人浓缩白细胞，用人淋巴细胞分离液分离淋巴细胞以2000rpm，离心20分钟，然后先吸出上层血浆，灭活备用，再吸取下层富含淋巴细胞的白环层；（2）两次洗涤：在吸取的富含淋巴细胞的溶液中加入洗液，再以1500rpm离心10分钟，弃上清，取沉淀的细胞，完成第一次洗涤；再在获取的沉淀的细胞中加入洗液，以1500rpm离心10分钟，弃上清，取沉淀的细胞，即淋巴细胞，从而完成对淋巴细胞的两次洗涤，并计数；（3）调节淋巴细胞浓度：用基本培养基调节淋巴细胞浓度至2～3×106个/ml；（4）培养：将调节好浓度的淋巴细胞加入已包被CD3抗体的细胞瓶内培养24小时，再加入IFN-γ试剂1ml，IL－1β试剂1ml培养48小时得CIK细胞；（5）扩大培养：将生长活力为100％的CIK细胞转入175cm2细胞培养瓶内，用CIK培养基进行扩大培养，每48～72小时扩大培养一次，至15-20天；（6）收集：将细胞活力大于98％的CIK细胞收集汇总，然后进行如下洗涤：将收集汇总的CIK细胞以1500rpm离心10分钟，弃上清取底部沉淀细胞；再在获取沉淀细胞中加入洗液重复上述洗涤2～3次，获得的沉淀细胞用200目过滤器过滤，取过滤下来CIK细胞，计数CIK细胞总数及细胞活力；（7）将CIK细胞悬浮于100ml　0.9%的生理盐水中，加入2×105单位的IL－2和10ml的白蛋白，混合均匀后，封口得最终成品。
2.如权利要求1所述的一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于：所述的洗液为500ml的0.9%生理盐水中加入5U/ml的肝素，再加入80 U /ml的庆大霉素混合而成。
3.如权利要求1所述的一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于：所述的基本培养基为采用在GT-T551培养基500ml中加入肝素5 U/ml、庆大霉素80 U/ml、两性霉素30ng/ml，再加入上述灭活备用的上层血浆所构成，所加入的上层血浆在基本培养基中占的体积百分比为1%。
4.如权利要求1所述的一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于：所述的CIK培养基为采用在500ml的基本培养基中加入1000 U/ml 的IL-2所构成。
5.如权利要求1所述的一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于：所述的CD3抗体浓度为2ug/ml，先用包被液包被于细胞瓶底部。
6.如权利要求1所述的一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于：所述的IFN-γ试剂的浓度为1000 U/ml。
7.如权利要求1所述的一种高效制备CIK细胞的方法，其特征在于：所述的IL－1β试剂的浓度为500 U/ml。
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