CN107058223A - 一种用于免疫细胞培养的培养液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于免疫细胞培养的培养液，内容是在基础完全培养液中加入自体血浆、人血白蛋白、硫酸庆大霉素、免疫细胞生长因子白细胞介素‑2、碳酸氢钠、植酸、维生素C。本发明改良了现有市场销售的淋巴细胞培养液不稳定，培养的免疫细胞数量少，纯度低的缺点，可获得足量高活性免疫细胞。

Description

一种用于免疫细胞培养的培养液

技术领域

本发明涉及一种用于免疫细胞培养的培养液。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞等。免疫细胞和免疫器官组成免疫系统，保护机体不受侵害。人的免疫力在20岁的时候达到巅峰，40岁时只有巅峰时的1/2，到了70岁更是只剩下巅峰时期的1/10。免疫力下降意味着免疫细胞对抗病毒、细菌以及癌变的能力逐年降低，患病风险也相对提高。

免疫细胞异常，可能引起各种严重疾病，如系统性红斑狼疮，原因是体内有大量致病性自身抗体和免疫复合物而造成组织损伤。癌症的发生，原因是肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监控而进行无节制的生长。因此将健康时的免疫细胞储存，以供需要时再扩增并输回使用，成为当前医疗科技界的新选择。当发生癌症等疾病，可用存储的免疫细胞及时采取免疫细胞疗法治疗；同时，也可用来提高人体免疫力、抗衰老以及预防肿瘤。

免疫细胞疗法是继手术、放疗、化疗三大传统手段后的新支柱性治疗手段，旨在激活自身的免疫系统，依靠免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织的抗癌疗法，其最大的优势在于个体性、安全性、靶向性和高效性。

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，尤其对手术或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，其在临床应用中功效已得到充分证实。当CIK细胞在体外扩增至一定数量时，再回输至患者体内，采用CIK细胞杀伤达到抗肿瘤的目的。因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

CIK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，研究显示，随着抗肿瘤免疫细胞数量增加，对肿瘤的杀伤效果成线性增加。但是目前CIK细胞培养方法，获得高纯度，足够数量的CIK细胞非常困难。传统使用的白介素2、IFN-γ纯度低(20-30％)，扩增后的CIK细胞杀伤功能低下，不能满足临床需求。本发明在基础培养基基础上添加自体血浆、人血白蛋白、硫酸庆大霉素、白细胞介素-2、碳酸氢钠、植酸、维生素C，解决CIK数量和纯度的问题，能定向扩增激活CIK细胞，满足临床治疗需求。

发明内容

本发明实施的目的在于克服上述体外培养中常规培养液培养数量不足、纯度低问题，提供一种用于免疫细胞培养的培养基及应用。

本发明提供的用于免疫细胞培养的培养基，包括基础培养基、自体血浆、人血白蛋白、硫酸庆大霉素、白细胞介素-2、碳酸氢钠、植酸、维生素C。

所述基础培养基具体为GIBCOMedium CTS^TM培养基。培养基中含有L-谷酰酰胺，50μg/ml硫酸链霉素和10μg/ml硫酸庆大霉素。

附图说明

图1为在基础培养液培养时，培养的免疫细胞在4倍显微镜倍数下的生长状态。

图2为在本发明的培养液时，培养的免疫细胞在4倍显微镜倍数下的生长状态。

具体实施方案

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明，而非限制本发明。

本发明提出一种培养液培养免疫细胞，包括如下步骤：

1、培养基的配置：

1000ml基础培养液中含有以下成分：

2、人外周血体外分离获得单核细胞：

1)采集志愿者外周血50ml，抗凝剂为肝素钠，将采集到的血液在生物安全柜里转移到新离心管中，500g离心10min，离心完毕后，上层制备自体血浆，下层血细胞分离制备单核细胞。

2)将人外周血血细胞与生理盐水按照体积比(1-2)：1混合均匀，得稀释后的细胞悬液，将稀释后的细胞悬液缓慢加入含淋巴细胞分离液的离心管内，细胞悬液与分离液体积比为(1-2)：1。

3)将离心管转移至离心机，600g离心20min。

4)用移液管轻轻移去上清液，收集白膜层细胞，并用生理盐水离心洗涤两次，即得到外周血单个核细胞。

3、人外周血体外分离获得自体血浆：

1)采集志愿者外周血50ml，抗凝剂为肝素钠，将采集到的血液在生物安全柜里转移到新离心管中，500g离心10min，离心完毕后，上清液转移到新离心管中，封口膜密封。

2)离心管放入56℃恒温水浴锅中灭菌30-45min，水浴完毕后，用喷有75％酒精的无尘布拭擦离心管，900g离心10min，收集上清液，即为自体血浆。

4、培养观察：

1)对照组：用少量培养液重悬细胞，将细胞放置在基础培养液内，转移到T75培养瓶中，在37℃、5％CO₂的条件下培养。

2)实验组：用少量培养液重悬细胞，将细胞放置在本发明配制的培养液内，转移到T75培养瓶中，在37℃、5％CO₂的条件下培养。

3)培养第二天，添加细胞诱导因子100IU/μl IFN-γ和10IU/μl IL-1，定向诱导单核细胞。整个培养过程中，每隔一天，观察细胞生长状态，并根据细胞计数，添加培养液，调节细胞浓度为1～2×10⁶个/ml。

4)在培养的第11天时收集对照组细胞和实验组细胞，用血液分析仪进行细胞计数，计算细胞总量，并用流式细胞分析仪进行细胞比例的分析。

结果：

a.使用本发明中的培养液，培养至11天时，细胞数量明显高于基础培养液，且达到显著性差异，说明本发明中的培养液能有效的提高细胞数量。附图为倒置显微镜4倍下细胞生长状态。图1为基础培养液培养的免疫细胞的生长状态，图2为使用本发明的培养液培养的免疫细胞的生长状态。

b.使用本发明中的培养液，实验组CD3⁺CD8⁺、CD3⁺CD56⁺比例高于对照组，表明使用本发明中的培养液，单核细胞诱导成CIK细胞纯度提高。表1为流式细胞检测结果比较。

表1

组别	CD3+CD8+	CD3+CD56+
			对照组	52.6％±1.64	18.5％±1.38
实验组	89.6％±0.89	41.2％±1.17

与现有培养基相比，本发明具有如下优点：

1、本发明在培养液中添加自体血浆，解决动物血清异源、质量不稳定影响培养问题，而且自体血浆中含有促进细胞生长的各种激素和生长因子等更有利于细胞生长。

2、本发明在培养液中添加人血白蛋白和碳酸氢钠，减少细胞代谢过程对PH变化的影响，维持细胞生长内环境稳定，高活率生长。

3、本发明在培养液中添加维生素C，维持细胞代谢的稳定性和清除细胞代谢产生的自由基等氧化物质。

4、本发明在培养液中添加植酸，作为一种抗氧化剂，能有效的解决培养液中各成分因开封氧化而降解的问题，保证培养液各成分的稳定。

5、本发明在培养液中添加硫酸庆大霉素，提高抗生素的浓度，能更有效的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，确保培养细胞的安全性。

本发明提供的培养液含有自体血浆、人血白蛋白、硫酸庆大霉素、白细胞介素-2、碳酸氢钠、植酸、维生素C，最大限度的模拟细胞生长内环境，保证细胞培养效果。应用本发明提供的培养液培养免疫细胞，可满足细胞遗传学研究、临床治疗需求，如治疗各种实质性肿瘤。

本发明培养液成分的添加，部分探索过程见表2，每种成分都做单因素试验，以确定最优的组合。取细胞悬液计数，时间为培养的第11天。

表2

由上表可知，仅用基础培养液培养，第11天，细胞数量为(3.90±0.42)×10⁹个，当添加抗生素硫酸庆大霉素、缓冲剂碳酸氢钠、抗氧化剂植酸和维生素C稳定细胞培养液酸碱度后，细胞的数量为(4.32±0.35)×10⁹个，增幅不大。当在此基础上添加自体血浆后，细胞数量为(4.83±0.26)×10⁹个、添加人血白蛋白后，细胞数量为(4.94±0.86)×10⁹个，添加白细胞介素-2后，细胞数量为(4.88±0.64)×10⁹个。当自体血浆和人血白蛋白混合加入后，细胞数量约为(5.86±0.38)×10⁹个，自体血浆和白细胞介素-2混合加入后，细胞数量约为(5.75±0.29)×10⁹个，人血白蛋白和白细胞介素-2混合加入后，细胞数量约为(5.75±0.29)×10⁹个。当自体血浆、人血白蛋白和白细胞介素-2均加入基础培养液后，细胞数量约为(7.04±0.24)×10⁹个，约为在基础培养液培养数量的2倍，说明本发明中添加的成分能有效提高细胞数量。

Claims (6)

1.一种免疫细胞培养液，其特征在于，是在基础培养液中含有自体血浆、人血白蛋白、硫酸庆大霉素、白细胞介素-2、碳酸氢钠、植酸、维生素C。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞培养液，其特征在于，是在基础培养液中含有：

3.根据权利要求1所述的免疫细胞培养液，其特征在于，是在基础培养液中含有：

4.根据权利要求1所述的免疫细胞培养液，其特征在于，所述基础培养液为GIBCOMedium CTS^TM培养基。

5.根据权利要求1所述的免疫细胞培养液，其特征在于，取注射液类，直接按体积比在无菌环境下加到基础培养液中，混合均匀后待用；从人外周血中获取免疫细胞，用配制的培养液重悬免疫细胞，并接种到T75培养瓶中进行培养，在培养过程中用特定细胞因子进行诱导培养。

6.根据权利要求5所述的免疫细胞培养液，其特征在于，所使用的细胞因子为100IU/μlIFN-γ和10IU/μl IL-1。