CN105176926A

CN105176926A - 一种体外培养扩增nk细胞的方法

Info

Publication number: CN105176926A
Application number: CN201510608389.2A
Authority: CN
Inventors: 张燕; 程双凤; 张赞
Original assignee: Shanghai Ke Laixun Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Ke Laixun Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明涉及一种NK细胞的体外培养扩增方法，具体为一种用自体外周血单个核细胞在体外培养大量扩增NK细胞的方法，该方法利用A群链球菌制剂作为刺激剂，激活NK细胞，并联合细胞因子IL-2共同刺激培养NK细胞，使获得的NK细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而能够满足临床的需要。具体为将自体外周血单个核细胞接种在无血清培养液中培养，加入A群链球菌制剂和IL-2进行诱导活化增殖。本发明操作简单便捷，仅通过A群链球菌制剂和IL-2两种制剂就实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增掊数、流式表型和细胞毒性，又大大降低了NK细胞的培养成本，使用推广简单易行。

Description

一种体外培养扩增NK细胞的方法

[技术领域]

本发明涉及一种用自体外周血单个核细胞在体外培养大量扩增NK细胞的方法。

[背景技术]

1975年，科学家在研究T细胞对靶细胞的杀伤特性时，首次鉴定出一群能够在T、B细胞缺失的条件下直接杀伤肿瘤细胞的细胞。由于这群细胞对靶细胞的识别无MHC限制性，杀伤活性不需预先免疫致敏，故命名为自然杀伤细胞(NatureKillercells，NKs)。NKs属淋巴细胞谱系，是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞，在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。由于NKs在人外周血中的含量极低及肿瘤组织中分布频率较低，占外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)不到15％，仅占外周血淋巴细胞的5-20％，极大的限制了NKs作为过继免疫细胞在临床上的应用。

目前关于NKs的常用的扩增技术如下表：

因此，发明一种实用高效、成本低、技术简单、可快速体外大量扩增人外周血NK细胞的方法，对于NK细胞大规模临床应用，以提高病人免疫力并杀伤肿瘤细胞是非常重要的。

[发明内容]

本发明的主要目的在于解决现有技术中NK细胞扩增倍数低、纯度不高、技术操作复杂、成本高等问题。

为了实现上述目的，本发明提供一种体外培养扩增NK细胞的方法，通过A群链球菌制剂和IL-2的组合来刺激PBMC使其诱导分化成NK细胞。

具体包括以下步骤：

a.将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在细胞培养瓶或细胞培养袋中；

b.加入浓度为0.01～2KE/mL的A群链球菌制剂、100～1000U/mL的IL-2到培养液中，置入37℃培养箱中培养；

c.每3～4天根据计数结果补液；

d.14～21天即可收获大量、高细胞毒活性的NK细胞。

所述的外周血单个核细胞的优选浓度为2.0×10⁶/mL。

A群链球菌制剂优选浓度为0.02KE/mL。

IL-2优选浓度为1000U/mL。

本发明的有益效果是：利用A群链球菌制剂作为刺激剂，直接激活NK细胞，并联合细胞因子IL-2共同刺激培养NK细胞，使获得的NK细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而能够满足临床的需要。同时与细胞因子组合法相比细胞性能更优，与免疫磁珠分选法、包被法等相比培养成本大大降低，与饲养层细胞刺激法相比风险大大降低，技术操作简单易行。所以本发明从临床实际应用可行性出发，在考虑安全性、有效性的前提下，综合衡量了细胞来源、应用的培养基类型、试剂因子组合以及NK细胞临床上实际应用时患者可接受成本等各方面综合衡量，以期为实现NK细胞在临床过继免疫治疗中的大规模应用、提高临床疗效并减轻患者经济负担奠定基础。

[附图说明]

图1是本发明NK细胞培养扩增的生长曲线；

图2是本发明NK(CD3-CD16+CD56+)细胞培养第14天和21天的增殖倍数；

图3是本发明NK(CD3-CD16+CD56+)细胞培养第14天的流式表型；

图4是本发明NK(CD3-CD16+CD56+)细胞培养第21天的流式表型；

图5是本发明NK细胞培养第14天和21天对肿瘤细胞K562的杀伤活性。

[具体实施方式]

下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

实施例1

1.外周血单个核细胞(PBMC)的分离和NK细胞的培养

通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞(PBMC)，将采集的血样转至离心管，700g离心分离10min，吸取上层血浆培养时备用；用0.9％生理盐水将血样标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll分离液上，900g离心20min；吸取分液界面乳白色单个核细胞层，用0.9％生理盐水洗涤离心2次；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至2.0×10⁶/mL。

加入0.02KE/mL的A群链球菌制剂、1000U/mL的IL-2和5％的自体血清，置入37℃培养箱中培养。每3～4天根据计数结果补加含1000U/mLIL-2的NK无血清培养基，维持细胞浓度在1.0×10⁶/mL左右，14～21天后即可得到大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞(图1)。其中，NK(CD3-CD16+CD56+)细胞增殖倍数14天达56.8倍，21天达354.2倍(图2)。

二、对上述培养的NK细胞进行免疫表型以及细胞杀伤活性检测

1、免疫表型检测

分别取第0、14、21的细胞，吸入1.5mLEP管，每管约含1.0×10⁶细胞，2000rpm离心3分钟后弃去上清，细胞重悬在100μLPBS中，加入荧光标记抗体(BDSimultest^TMCD3/CD16+CD56)，4℃避光孵育30分钟；用PBS洗涤2遍，弃去上清；用0.3mLPBS将细胞重悬，用流式细胞仪C6进行检测分析。NK(CD3-CD16+CD56+)流式表型第14天时可达75.7％，第21天时可达88.6％(图3和图4)。

2、细胞杀伤活性检测

取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为8×10⁵cells/mL，每孔取50μL铺于96孔培养板中。取本发明制备的细胞调密度为8×10⁵cells/mL、4×10⁶cells/mL、8×10⁶cells/mL、1.6×10⁷cells/mL，加入96孔培养板中，每孔50μL，使效靶比分别为1:1、5:1、10:1、20:1，每组设三个复孔。接种方式如下：

实验组(a值)：K562(50ul)+NK(50ul)

对照组(b值)：K562(50ul)+RPMI1640(50ul)

(c值)：NK(50ul)+RPMI1640(50ul)

空白组(d值)：RPMI1640(100ul)

将接种好的细胞，置于37℃、5％CO2条件下共培养24小时后，每孔加10μLCCK-8试剂，摇匀，37℃、5％CO2条件下继续培养3小时，酶标仪450nm波长测吸光度(A450)。按下式计算杀伤活性：杀瘤效率＝[1－(a值－c值－d值)/(b值－d值)]×100％。结果显示本发明制备的NK细胞对K562细胞株具有较高的杀伤活性，在10:1、20:1的效靶比下第14天杀伤率即可达到100％；在5:1的效靶比下第14天杀伤率可达到90％以上，第21天杀伤率可达到100％；在1:1的效靶比下第14天和21天的杀伤率均低于50％，但第21天的杀伤率显著高于第14天(如图5及表1所示)。

表1NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性

Claims

1.一种体外培养扩增NK细胞的方法，其特征在于通过A群链球菌制剂和IL-2的组合来刺激PBMC使其诱导分化成NK细胞。

2.如权利要求1所述的体外培养扩增NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

c.每3～4天根据计数结果补液；

d.14～21天即可收获大量、高细胞毒活性的NK细胞。

3.如权利要求2所述的体外培养扩增NK细胞的方法，其特征在于所述的外周血单个核细胞的浓度为2.0×10⁶/mL。

4.如权利要求2所述的体外培养扩增NK细胞的方法，其特征在于A群链球菌制剂浓度为0.02KE/mL。

5.如权利要求2所述的体外培养扩增NK细胞的方法，其特征在于IL-2浓度为1000U/mL。