KR101732532B1 - 단구 또는 nk 세포를 입수하는 방법 - Google Patents

단구 또는 nk 세포를 입수하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 세포 요법에 이용할 수 있는 세포를 말초혈로부터 분리해 증식시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 면역 세포 요법에 이용 가능한 충분한 수의 면역계 세포를 제공할 수 있다.

Description

단구 또는 NK 세포를 입수하는 방법{METHOD FOR OBTAINING MONOCYTES OR NK CELLS}
본 발명은 면역 세포 요법에 이용할 수 있는 세포를 말초혈로부터 분리해 증식시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 단구(monocyte) 또는 NK 세포를 말초혈로부터 분리해 증식시키는 방법에 관한 것이다.
면역 세포 요법인 NK 요법 및 단구 유래의 수지상 세포 요법은, 최근, 많은 의료 기관에서 실시되고 있다. 후천성 면역을 이용하는 수지상 세포 요법 및 선천성 면역을 이용하는 NK 요법은, 그 이점으로부터 조합 요법으로서 적용되는 경우도 많다.
지금까지 상기 조합 요법의 경우, 수지상 세포 및 NK 세포는 독립된 혈액으로부터 얻어지고 있다. 이후 수지상 세포로 분화시키는 단구는 아페러시스(apheresis; 성분 채혈)에 의해 성분 채취된다. 한편, NK 세포는 말초혈로부터 채취되어 증식된다. 따라서, 상기 조합 요법에는 일반적으로 2회의 채혈이 필요하다.
비특허 문헌 1: Castiello et al., Cancer Immunol. Immunother., 60: 457-466, 2011. 비특허 문헌 2: Zamai et al., J. Immunol., 178: 4011-4016, 2007.
그러나, 한번 채혈(특히 아페러시스)하는 것만으로도 환자에게 부담을 주기 때문에, 두 가지 채혈을 행하게 되면 환자에 대한 신체적인 부담은 한층 더 증대된다. 따라서, 면역 세포 요법에 있어서 환자에게 보다 부담이 적은, 단구 및 NK 세포를 얻기 위한 다른 방법이 요구되고 있다.
따라서, 이와 같은 과제를 감안하여, 본 발명은 환자의 부담을 경감하면서 면역 세포 요법에 이용 가능한 충분한 수의 면역계 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명에 따른 방법은 단구 또는 NK 세포를 입수하는 방법으로서, 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 말초혈로부터 단구를 분리해 단구 샘플을 회수하는 공정과, 단구를 분리한 후의 세포 집단을 NK 세포 샘플로서 회수하는 공정과, 상기 단구 샘플 또는 NK 세포 샘플을 배양해 단구 또는 NK 세포를 증식시키는 공정을 포함한다.
본 발명에 따르면, 환자의 부담을 경감하면서 면역 세포 요법에 이용 가능한 충분한 수의 면역계 세포를 제공할 수 있다.
도 1은 말초혈로부터 단구가 선택적으로 분리되고 있는 것을 확인한 FACS 해석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 단구를 선택적으로 분리한 후의 샘플에 NK 세포가 포함되어 있는 것을 확인한 FACS 해석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 배양 방법 및 종래의 배양 방법에 따라 증식시킨 단구 및 이 단구로부터 분화한 수지상 세포의 세포수의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 배양 방법 및 종래의 배양 방법에 따라 증식시킨 NK 세포의 세포수의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
도 5는 단구가 증식하고 있는 것(3일째)을 확인한 FACS 해석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 수지상 세포가 증식하고 있는 것을 확인한 FACS 해석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 NK 세포가 증식하고 있는 것을 확인한 FACS 해석의 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에 따른 방법은 단구 또는 NK 세포를 입수하는 방법으로서, 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 말초혈로부터 단구를 분리해 단구 샘플을 회수하는 공정과, 단구를 분리한 후의 세포 집단을 NK 세포 샘플로서 회수하는 공정과, 상기 단구 샘플 또는 NK 세포 샘플을 배양해 단구 또는 NK 세포를 증식시키는 공정을 포함한다.
즉, 본 발명에 따른 방법은, 적어도 어느 한쪽을 이후에 증식시키는 것을 전제로 하여, 말초혈로부터 단구 및 NK 세포를 분리하는 것을 포함한다. 따라서, 분리해 얻어지는 단구 및 NK 세포는 면역 세포 요법을 실시하기에 충분한 양일 필요가 없다. 본 발명에 따른 방법에 의하면, 소량의 말초혈로부터 분리된 단구 및 NK 세포를 증식시켜, 면역 세포 요법에 이용 가능한 충분한 수의 면역계 세포를 제공하는 것이 가능하다.
이하, 소량의 말초혈로부터 필요한 면역계 세포를 분리한 후에 면역 세포 요법에 이용 가능한 수까지 각 세포를 증식시키는 것을 예로 들어, 본 발명에 따른 방법에서의 처리에 대해 상세히 설명한다. 한편, 본 명세서에 사용될 때, 용어 "단구 샘플"은 단구를 주로 하는 세포 집단을 포함하고 있는 샘플을 가리킨다. 또한, 본 명세서에 사용될 때, 용어 "NK 세포 샘플"은 단구를 실질적으로 포함하지 않지만, NK 세포를 포함하고 있는 세포 집단의 샘플을 가리킨다.
(말초혈로부터의 단구 샘플 및 NK 세포 샘플의 회수)
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은, 말초혈로부터 단구 샘플 및 NK 세포 샘플의 각각을 나누어 회수하는 공정을 포함하고 있다. 또한, 전술한 바와 같이, 상기 공정은 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용한 단구의 선택적인 분리를 통해 실시된다. 상기 항체는 자기 비즈 등의 운반체와 결합하고 있다. 항체와 결합하고 있는 운반체를, 단구를 포함하고 있는 샘플과 혼합한 후에, 항체를 개재해 단구와 결합하고 있는 운반체를 회수함으로써 단구 샘플을 얻을 수 있다. 대체적인 방법으로, 상기 항체는 비오틴에 의해 표식될 수 있다. 상기 방법에서는, 상기 항체를 표식하고 있는 비오틴에 대한 스트렙타아비딘(streptavidin)의 상호 작용을 이용해 단구를 분리할 수 있다.
여기에서, 상기 항체의 예로는, 안티-CD14 항체 및 안티-CD16 항체 등을 들 수 있다. 이들 항체는 일례이며, 당해 분야에 공지된 단구의 표면 마커에 특이적인 여러 가지의 항체가 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이 항체 및 운반체를 이용해 단구를 선택적으로 분리하는 방법으로는, Stem Cell Technologies사가 제공하고 있는 RoboSep 장치와 RoboSep Human CD14 Positive kit 또는 RoboSep negative Human monocyte kit 등을 조합한 방법을 들 수 있다. 상기 방법은 혈액 샘플로부터의 단구의 선택적인 분리를 거의 인간의 손을 거치지 않고 자동적으로 실시할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 방법에 있어서 매우 적합하다. Stem Cell Technologies사는, 상기 키트 외에, 사용할 항체를 유저가 선택해 시약과 조합하는 키트를 제공하고 있다. 따라서, 예로 든 항체와 상기 키트를 조합함으로써, RoboSep 장치를 이용해 혈액 샘플로부터의 단구 분리가 가능하다.
한편, RoboSep negative Human NK cell kit 또는 RoboSep Human CD56 Positive kit 등과 RoboSep 장치를 조합함으로써, 혈액 샘플로부터 NK 세포를 분리할 수 있다.
항체를 이용해 단구를 선택적으로 분리하기 전에, 말초혈은 부분적으로 분리되어 있는 것이 바람직하다. 말초혈로부터 단핵구 분획을 분리하는 피콜 용액을 이용한 밀도구배 원심분리에 의해, 말초혈이 미리 분리되어 있는 것이 바람직하다. 피콜 용액을 이용한 이와 같은 밀도구배 원심분리는 면역 세포 요법에 이용하는 NK 세포를 얻기 위한 일반적인 방법이기 때문에, 상세에 대해서는 특별히 설명하지 않는다.
한편, 상기 밀도구배 원심분리는, 단핵구 분획을 분리한 후에, 적절한 항체 및 사이토카인과 함께 상기 단핵구 분획을 배양해, 활성화시킨 T 임파구 및 NK 세포를 얻는 것을 목적으로 한 일반적인 방법이다. 즉, 본 발명에 따른 방법과 같이, 단구를 분리하고 증식시키기 전에 상기 밀도구배 원심분리를 실시하는 것은, 통상적으로는 행해지지 않았다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 전술한 바와 같이 하여 얻어진 단구 샘플에 어느 정도의 단구가 포함되어 있는지를 확인하는 것이 바람직하다. 얻어진 단구 샘플에서의 단구를 원하는 세포수까지 증식시키기 위해 필요한 배양 일수, 및 필요에 따라 수지상 세포로 분화시키는 배양 개시로부터의 일수를 미리 알 수 있다. 단구 샘플에 포함되어 있는 단구의 정도는 공지의 플로우 사이토미터 및 형광 표식된 안티-CD14 항체를 이용한 FACS 해석에 의해 확인할 수 있다. 사용되는 항체는 단구의 표면 마커에 특이적인 항체이면 된다. 따라서, 예를 들면, 단구를 분리하기 위한 전술의 항체를 형광 표식한 다음, FACS 해석에 사용할 수 있다.
후술하는 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은, 얻어진 단구 샘플 및 NK 세포 샘플을 배양하고, 단구 및 NK 세포의 각각을 선택적으로 독립해 증식시킨다. 따라서, 얻어진 단구 샘플 및 NK 세포 샘플의 각각은, 면역 세포 요법에 필요한 수보다 훨씬 적은 수의 원하는 세포(단구 및 NK 세포의 각각)를 포함하고 있기만 하면 된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 소량(예를 들면, 25 ㎖)의 말초혈을 필요로 한다. 즉, 단구의 분리에서 일반적인 대량(예를 들면 수백 ㎖ 내지 수 ℓ)의 채혈을 실시하지 않는다. 이 때문에, 본 발명에 따른 방법은, 면역 세포 요법에서 채혈에 의한 시간적 및 신체적인 부담을 큰 폭으로 경감시킨다.
본 명세서에서 소량의 말초혈은, 예를 들면 100 ㎖ 이하, 바람직하게는 75 ㎖ 이하, 보다 바람직하게는 50 ㎖ 이하, 가장 바람직하게는 25 ㎖ 이하의 말초혈을 의미한다. 채취되는 혈액이 적을수록 개체에 있어서의 부담은 경감된다. 그러나, 말초혈 중의 단구 및 NK 세포의 수는 개체의 신체적인 상태에 의존해 크게 다르므로, 채취되는 개체 상태 및 필요로 하는 세포수에 맞추어 채취하는 말초혈의 양은 적절하게 변경될 수 있다.
단구 및 NK 세포를 분리하는 말초혈은, 단회 채취된 말초혈 또는 여러 차례로 나누어 채취된 말초혈의 혼합물일 수 있다. 전술한 바와 같이 필요로 하는 양이 적기 때문에, 본 발명에 따른 방법에서 말초혈은 통상적으로 단회 채취된다.
(단구의 증식)
본 발명에 따른 방법은, 회수한 단구 샘플에 포함되어 있는 단구를 선택적으로 증식시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 단구 샘플은 줄기세포의 증식 인자로서 알려져 있는 Flt-3L을 보충한 단구 증식용 배지를 이용해 배양된다. 당해 배지를 이용함으로써, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 일반적으로 행해지지 않았던 단구의 증식이 가능하게 된다.
상기 단구 증식용 배지는 단구의 유지에 사용되는 공지의 배지를 기본 배지로서 사용한다. 상기 기본 배지는, 실시예에 나타내는 바와 같이, Takara Bio사 등에 의해 시판되고 있거나, 시판중인 제품을 부분적으로 개변한 배지이거나, 또는 시판중인 제품과 유사한 조성을 갖고 있다. 상기 단구 증식용 배지는 단구의 자극(증식, 활성화 및 분화의 촉진)에 사용되는 공지의 사이토카인(예를 들면, GM-CSF)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 단구 증식용 배지는 바람직한 공지의 항생 물질에 의해 보충될 수 있다. 또한, 상기 단구 증식용 배지는 단구 샘플을 회수한 말초혈로부터 분리한 혈장(자기 혈장)을 더 포함할 수 있다. 상기 단구 증식용 배지에 대한 바람직한 다른 첨가물은, 단구의 유지 및 수지상 세포로의 분화에 사용되는 여러 가지의 첨가물이므로, 당업자에게 공지이다.
Flt-3L은, 예를 들면, 500 내지 5000 IU/㎖, 보다 바람직하게는 1000 내지 4000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 2000 IU/㎖의 농도로 상기 단구 증식용 배지에 포함되어 있다. GM-CSF는, 예를 들면, 500 내지 5000 IU/㎖, 보다 바람직하게는 1000 내지 2500 IU/㎖, 가장 바람직하게는 1000 IU/㎖의 농도로 상기 단구 증식용 배지에 포함되어 있다.
상기 단구 샘플은, 상기 단구 증식용 배지를 이용해 임의의 기간(원하는 양의 단구가 얻어질 때까지) 배양된다. 상기 기간은 얻어진 단구 샘플에 포함되어 있는 단구의 수에 따라 변경된다. 후술하는 실시예의 경우를 예로 들면, 상기 기간은, 예를 들면, 25 ㎖의 말초혈로부터 단구 샘플이 회수된 경우에 약 14일간이다. 상기 경우의 단구 샘플에서의 단구는, 약 14일간의 배양에 의해 예를 들면 약 1×107 세포까지 증식이 가능하다.
이상의 기재로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 따른 Flt-3L은 상기 단구 증식용 배지에 첨가되는 첨가제(예를 들면, 단구의 증식 촉진제)이다. 또한, 본 발명은 상기 단구 증식용 배지에 첨가되는 첨가제로서의, Flt-3L의 사용에 관한 것이다.
후술하는 바와 같이, 본 발명에 따른 방법에서, 배양 도중(예를 들면, 배양 3일째)에 단구를 수지상 세포로 분화시키는 인자가 배양물에 첨가될 수 있다. 즉, 반드시 단구만을, 예를 들면 약 1×107 세포까지 증식시킬 필요는 없다. 따라서, 이 경우, 단구만을 선택적으로 배양시키는 기간은 약 3일간이며, 배양 전체의 기간은 약 14일간이다. 면역 세포 요법에서 실제로 사용되는 것은 단구 유래의 수지상 세포이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서, 단구를 증식시키면서 실제로 사용하는 수지상 세포로 분화시키는 것이 바람직하다. 다음 항목에서, 단구를 증식시키면서 수지상 세포로 분화시키는 것에 대해 설명한다.
(수지상 세포로의 단구의 분화)
본 발명에 따른 방법에 있어서, 수지상 세포로의 단구의 분화는 사이토카인 등을 더 보충한 상기 단구 증식용 배지를 이용해 실시된다. 단구로부터 미성숙 수지상 세포로의 분화에서, 상기 단구 증식용 배지에 대해 더 보충되는 사이토카인은 일반적으로 IL-4 및 GM-CSF이다. 미성숙 수지상 세포로의 단구의 분화에 사용될 수 있는 IL-4 및 GM-CSF는 시판되고 있거나, 또는 IL-4 혹은 GM-CSF를 코딩하고 있는(재조합) 사람 유전자를 발현시킴으로써 얻어진다.
그리고, 미성숙 수지상 세포는, 항원을 포함하고 있는 생물학적 재료(예를 들면, 종양 세포(를 포함하고 있는 조직편), 종양 마커, 특정 질환의 병소부편(病巢部片) 및 바이러스 감염 세포 등), 또는 항원을 형성하는 생물학적 재료(예를 들면, 항원 펩티드, 단백질(장쇄 펩티드) 혹은 그 단편, 및 항원 핵산 등)를 이용해 펄스된다. 펄스를 받은 후의 미성숙 수지상 세포는 사이토카인, 생리 활성 물질 및 면역 활력제를 더 첨가한 배지에서 배양됨으로써 성숙 수지상 세포로 성숙한다.
성숙 수지상 세포로의 분화에 사용되는 사이토카인, 생리 활성 물질 및 면역 활력제는, 예를 들면 IL-1β, IL-6, TNFα, PGE2 및 염화 피시바닐(picibanil chloride; OK432) 등이며, 이들은 모두 시판품으로서 입수 가능하거나, 또는 이들 사이토카인을 코딩하고 있는(재조합) 사람 유전자를 발현시킴으로써 얻어진다. 한편, 여기에서는, 미성숙 수지상 세포의 성숙 수지상 세포로의 분화에 있어서 최적인 사이토카인, 생리 활성 물질 및 면역 활력제의 조합을 들고 있다. 당해 분화에 있어서 필수의 조합은, 예를 들면 PGE2 및 OK432이다.
IL-1β는, 예를 들면, 2 내지 100 ng/㎖, 보다 바람직하게는 5 내지 50 ng/㎖, 가장 바람직하게는 10 ng/㎖의 농도로, 단구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 상기 단구 증식용 배지에 포함되어 있다. IL-6은, 예를 들면, 200 내지 6000 IU/㎖, 보다 바람직하게는 500 내지 4000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 1000 IU/㎖의 농도로, 단구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 상기 단구 증식용 배지에 포함되어 있다. TNFα는, 예를 들면, 2 내지 100 ng/㎖, 보다 바람직하게는 10 내지 50 ng/㎖, 가장 바람직하게는 20 ng/㎖의 농도로, 단구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 상기 단구 증식용 배지에 포함되어 있다. PGE2는, 예를 들면, 0.05 내지 5 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 1 ㎍/㎖의 농도로, 단구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 상기 단구 증식용 배지에 포함되어 있다. 염화 피시바닐은, 예를 들면, 0.005 내지 10 KE, 보다 바람직하게는 0.05 내지 5 KE, 가장 바람직하게는 0.1 KE의 농도로, 단구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 상기 단구 증식용 배지에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 25 ㎖의 말초혈로부터 단구 샘플이 얻어진 경우에, 전술한 바와 같이, 단구 샘플의 배양은 약 14일에 걸쳐서 실시된다. 이 경우, 단구를 미성숙 수지상 세포로 분화시키는 사이토카인은, 예를 들면 배양 3일째에 배지에 첨가된다. 상기 펄스는 예를 들면 배양 11일째에 실시된다. 펄스 후에 성숙 수지상 세포로의 분화를 유도하는 사이토카인 및 면역 활력제가 배지에 첨가된다. 배양 14일째에는, 원하는 수(예를 들면, 1×107 세포)의 수지상 세포가 얻어진다(실시예 2-1.을 참조).
이상의 기재로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 따른 Flt-3L은 수지상 세포를 얻기 위한 배지에 첨가되는 첨가제(예를 들면, 수지상 세포의 증식 촉진제)이다. 또한, 본 발명은 수지상 세포를 얻기 위한 배지에 첨가되는 첨가제로서 Flt-3L을 사용하는 것에 관한 것이다.
25 μ㎖의 말초혈로부터 단구 샘플이 얻어진 경우를 일례로 하여 단구의 증식 및 분화의 기간에 대해 설명했다. 그러나, 전술한 바와 같이, 얻어진 단구 샘플에 포함되어 있는 단구의 수에 따라, 배양의 기간은 연장 또는 단축될 수 있다. 이와 같은 배양의 기간의 설정은 당업자에게 경험적으로 알려져 있는 사항이다.
세포수는 임의의 시점에서, 예를 들면 트리판블루(trypan blue)를 이용해 카운트할 수 있다. 또한, 카운트한 세포 집단에 포함되어 있는 단구 및 수지상 세포의 비율은, 형광 표식한 안티-CD14 항체(단구) 및 안티-CD83 항체(수지상 세포)를 이용한 FACS 해석에 의해 결정할 수 있다. 따라서, 배양 및 분화 기간의 각각은, 세포수 및 세포종을 결정한 각 시점에서 임의로 변경될 수 있다.
수지상 세포는 체내의 이물(예를 들면, 바이러스 및 세균 및 이들의 단편)을 세포 내에 수용한다. 그리고, 수지상 세포는 항원(상기 이물 또는 그 이물의 처리물)을 다른 면역계의 세포에 제시함으로써, 당해 이물에 특이적인 면역 응답을 활성화시킨다. 따라서, 통상 수지상 세포에 이물로서 인식되지 않는 질환(예를 들면, 종양)에 특이적인 질환 마커(예를 들면, 종양에 있어서의 WT1)를 이용해 단구 유래의 수지상 세포를 펄스함으로써, 여러 가지 질환을 처치할 수 있는 수지상 세포를 입수할 수 있다.
(NK 세포의 증식)
본 발명에 따른 방법에 의하면, 회수한 NK 세포 샘플에 포함되어 있는 NK 세포는 바람직하게는 선택적으로 증식된다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, NK 세포 샘플은 NK 세포의 표면 마커를 인식하는 안티-CD56 항체를 보충한 NK 세포 증식용 배지를 이용해 배양된다. 당해 배지를 이용함으로써, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, NK 세포 샘플(단구를 분리한 나머지 세포 집단)에서의 NK 세포를 선택적으로 증식 가능하다.
일반적으로, 면역 세포 요법에 사용되는 NK 세포는, NK 세포의 분화, 성숙, 활성화 및 증식을 유도하는 사이토카인(IL-2, IL-12 및 IL-15)을 포함하고 있는 배지를 이용해, 말초혈 유래의 단핵구 분획을 배양함으로써 증식한다. 그러나, 이와 같은 배지를 이용해 본 발명에 따른 NK 세포 샘플을 배양한 결과, NK 세포가 충분한 수까지 증식하지 않았다(실시예의 2-6.을 참조). 따라서, 지금까지 알려져 있는 NK 세포를 증식시키는 조건 및 방법은, 본 발명에 따른 방법에는 적용될 수 없다.
상기 NK 세포 증식용 배지는, NK 세포의 증식에 사용되는 공지의 배지를 기본 배지로서 사용하고 있다. 상기 기본 배지는, 실시예에 나타내는 바와 같이 Kohjin Bio사 등에 의해 시판되고 있거나, 시판중인 제품을 부분적으로 개변한 배지이거나, 또는 시판중인 제품과 유사한 조성을 갖고 있다. 상기 NK 세포 증식용 배지는, 통상의 NK 세포의 증식 및 활성화에 사용되는 IL-2, IL-12 및 IL-15를 포함할 수 있다. 또한, 지금까지 설명한 첨가물 이외의 상기 NK 세포 증식용 배지에 대한 첨가물은, 전술한 바와 같은 지금까지 알려져 있는 NK 세포를 증식시키는 조건 및 방법을 통해 당업자에게 공지이다.
안티-CD56 항체는, 예를 들면, 1 내지 200 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 10 내지 150 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 80 ㎍/㎖의 농도로, NK 세포를 증식시키고 활성화시키기 위한 상기 NK 증식용 배지에 포함되어 있다. 한편, 지금까지 안티-CD56 항체를 배지에 대해 직접적으로 첨가한다고 설명했지만, 임의의 지지체(예를 들면, 플라스틱 플라스코 및 디쉬)에 고정한 안티-CD56 항체(고상화되어 있는 안티-CD56 항체)를 사용할 수 있다. 고상화하는 경우, 상기 농도 범위는 사용하는 배지의 양에 대한 안티-CD56 항체의 사용량을 나타낸다. IL-2는, 예를 들면, 100 내지 3000 IU/㎖, 보다 바람직하게는 1000 내지 2000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 1750 IU/㎖의 농도로, NK 세포를 증식시키고 활성화시키기 위한 상기 NK 증식용 배지에 포함되어 있다. IL-12는, 예를 들면, 100 내지 5000 IU/㎖, 보다 바람직하게는 500 내지 3000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 2000 IU/㎖의 농도로, NK 세포를 증식시키고 활성화시키기 위한 상기 NK 증식용 배지에 포함되어 있다. IL-15는, 예를 들면, 100 내지 5000 IU/㎖, 보다 바람직하게는 500 내지 3000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 2000 IU/㎖의 농도로, NK 세포를 증식시키고 활성화시키기 위한 상기 NK 증식용 배지에 포함되어 있다.
NK 세포 샘플은, 전술한 단구 샘플과 동일한 기간에 걸쳐 배양될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 NK 세포 샘플은 상기 NK 세포 증식용 배지를 이용해 약 14일에 걸쳐 배양된다. 약 14일에 걸치는 배양에 의해, 예를 들면 NK 세포는 1×109 세포까지 증식 가능하다(실시예의 2-3.을 참조).
이상의 기재로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 따른 안티-CD56 항체는 NK 세포 증식용 배지에 첨가되는 첨가제(예를 들면, NK 세포의 증식 촉진제)이다. 또한, 본 발명은 NK 세포 증식용 배지에 첨가되는 첨가제로서의, 안티-CD56 항체의 사용에 관한 것이다.
배양물에서의 세포수는, 단구와 마찬가지로 트리판블루를 이용해 배양중의 임의의 시점에서 카운트된다. 이 때, 배양물의 세포 집단에서의 NK 세포의 비율은 형광 표식한 안티-CD56 항체를 이용한 FACS 해석에 의해 결정될 수 있다.
NK 세포의 통상적인 역할은, 주로 종양 세포 및 감염 세포를 공격하는 것이다. 따라서, 활성화시킨 NK 세포는 암 및 감염증의 처치에 유용하다. 따라서, 종양 마커를 이용한 펄스에 의해 수지상 세포를 성숙시켜, NK 세포와 함께 이용하면, 암에 대해 특히 뛰어난 치료 효과가 기대된다.
또한, 지금까지 설명한 대로, 본 발명에 따른 방법에 의하면, 면역 세포 요법에 있어서 충분한 수의 NK 세포 및 수지상 세포를 소량의 말초혈로부터 얻을 수 있다. 따라서, 환자에 대한 채혈에 따르는 시간적 및 신체적인 부담을 큰 폭으로 경감할 수 있다. 특히, 면역 세포 요법에 의한 암의 치료에서, 장기간에 걸쳐 여러 차례 면역 세포를 투여할 필요가 있는 경우가 많다. 이 때, 대량의 채혈은 환자에게 있어서 큰 부담일 뿐만 아니라, 환자의 상태에 따라서는 채혈이 불가능하여 치료 행위 그 자체를 연기 또는 중지하지 않을 수 없게 된다. 이와 같이, 본 발명에 따른 방법에 의하면, 환자의 부담을 경감한 후에 계속적인 면역 세포 요법의 실시를 용이하게 실현할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 개체(예를 들면, 사람)로부터 채취한 혈액에 포함되어 있는 유용한 면역계 세포를 분리해 증식시키는 방법이다. 본 발명에 따라 얻어진 단구는, 분화됨으로써 면역 세포 요법에 사용되는 수지상 세포를 제조하는 재료이다. 또한, 본 발명에 따라 얻어진 NK 세포 및 수지상 세포는, 면역 세포 요법에서 직접적으로 사용되는 세포(의약품)이다.
[정리]
본 발명에 따른 방법은 단구 또는 NK 세포를 입수하는 방법으로서, 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 말초혈로부터 단구를 분리해 단구 샘플을 회수하는 공정과, 단구를 분리한 후의 세포 집단을 NK 세포 샘플로서 회수하는 공정과, 상기 단구 샘플 또는 NK 세포 샘플을 배양해 단구 또는 NK 세포를 증식시키는 공정을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 단구 또는 NK 세포를 증식시키는 상기 공정은, 상기 단구 샘플을 Flt-3L을 포함하고 있는 제1 배지를 이용해 배양해, 단구를 증식시키는 공정인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법은, 상기 제1 배지에 GM-CSF 및 IL-4를 첨가함으로써, 단구를 증식시키면서, 단구를 수지상 세포로 분화시키는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 단구 또는 NK 세포를 증식시키는 상기 공정은, 상기 NK 세포 샘플을 안티-CD56 항체 또는 IFN-γ를 포함하고 있는 제2 배지를 이용해 배양해, NK 세포를 증식시키는 공정인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법은, 단구 또는 NK 세포를 증식시키는 상기 공정에 있어서, 상기 NK 세포 샘플을 안티-CD56 항체 또는 IFN-γ를 포함하고 있는 제2 배지를 이용해 배양해, NK 세포를 더 증식시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 제2 배지는 안티-CD56 항체를 포함하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 제2 배지는 IL-2, IL-12 및 IL-15를 더 포함하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 말초혈은 개체로부터 단회 채취되는 것이 바람직하다.
실시예
[1. 단회 채취의 말초혈로부터의 단구 및 NK 세포의 분리]
(1-1. 단구의 선택적인 분리 및 그 확인)
피콜 용액(GE 헬스케어사)을 이용한 밀도구배 원심분리(30분간, 900 g, 20℃)에 의해, 정상인으로부터 채취한 25 ㎖의 말초혈로부터 단구 분획을 분리했다. RoboSep 장치(Stem Cell Technologies사)를 이용해 얻어진 단구 분획으로부터 단구를 더 분리했다. 이 단구 분획으로부터의 단구의 분리에서, 단구를 선택적으로 분리하는 시약으로 RoboSep Human CD14 Positive kit(Stem Cell Technologies사)를 이용했다. 단구의 선택적인 분리에서의 순서 및 필요한 다른 시약의 전부에 대해, 상기 시약에 대응하고 있는 RoboSep 장치의 동작 프로그램 및 부속의 유저 메뉴얼에 따랐다.
이상의 조작에 따라 얻어진 시료의 일부를, 형광 표식된 안티-CD14 항체(BioLegend사, 단구의 세포 표면 마커에 대한 항체)와 혼합했다. 그리고, 이 혼합물에 포함되어 있는 단구의 정도를 BD FACSCalibur(등록상표) 플로우 사이토미터(일본 BD사)에 의해 조사했다. 이 FACS 해석의 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1은 CD14 양성 세포에 대해 FACS 해석한, 4분할 영역의 히스토그램을 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 시료에는 표면에 CD14를 발현하고 있는 단구가 주로 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
(1-2. NK 세포의 존재 확인)
1-1.에서 얻어진 단구의 나머지 세포 집단의 일부를, 형광 표식한 안티-CD56 항체(BioLegend사, NK 세포의 세포 표면 마커에 대한 항체)와 혼합했다. 그리고, 이 혼합물에 포함되어 있는 NK 세포의 정도를 BD FACSCalibur(등록상표) 플로우 사이토미터에 의해 조사했다. 이 FACS 해석의 결과를 도 2에 나타냈다. 도 2는 CD56 양성 세포에 대해 FACS 해석한, 4분할 영역의 히스토그램을 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 종래에는 폐기되던 세포 집단에 유용한 NK 세포가 포함되어 있는 것이 밝혀졌다.
이상과 같이, 단구만을 분리하는 종래의 방법 외에, 지금까지 폐기되던 세포 집단을 더 회수함으로써, 단회의 채혈에 의해 얻어진 소량의 말초혈로부터 단구 및 NK 세포의 각각을 나누어 입수 가능한 것을 알 수 있었다.
[2. 단구 및 NK 세포의 증식]
(2-1. 본 발명에 따른, 단구의 증식 및 수지상 세포로의 분화)
1-1.에서 분리한 단구를 증식시키고, 수지상 세포로 분화시켰다. 배양의 0 내지 3일째까지 1000 IU/㎖의 GM-CSF(Miltenyi Biotec사), 2000 IU/㎖의 Flt-3L(Cellgenix사), 50 ng/㎖의 겐타마이신 및 5%의 자기 혈장을, X-VIVO-15 배지(Takara Bio사)에 보충한 배지 A1를 이용해 단구를 선택적으로 증식시켰다. 3일째에 배지 A1에 1000 IU/㎖의 IL-4(Miltenyi Biotec사)를 첨가했다(배지 A2). 그리고, 배양을 11일째까지 계속함으로써 단구를 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다. 11일째에 미성숙 수지상 세포를 MUC1 펩티드(Thermo Fisher사), 또는 지질 소포(lipid vesicle)에 봉입되어 있는 WT1 등을 이용해 펄스했다. 그리고, 10 ng/㎖의 IL-1β(Miltenyi Biotec사), 1000 IU/㎖의 IL-6(Miltenyi Biotec사), 1 ㎍/㎖의 PGE2(Cayman Chemical사), 20 ng/㎖의 TNF-α(Miltenyi Biotec사) 및 0.1 KE의 염화 피시바닐(Chugai Pharmaceutical사)을 배지 A2에 첨가한 배지 A3을 이용해, 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시켰다. 이상에서의 모든 배양은 5% CO2 존재하의 37℃에서 실시했다. 배양의 0, 3, 6, 8, 11 및 14일째의 각각에서의 세포수(세포수/㎖)를 트리판블루 염색에 의해 결정했다. 결정한 세포수의 경시적 변화를 도 3에 나타냈다.
도 3(Flt-3L 첨가)에 나타낸 바와 같이, 0일째에 7.4×105 세포였던 세포가 배양 14일 후에는 1.05×107 세포까지 증식하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이상에서 단구로부터 분화해 증식한 수지상 세포의 수는 1.05×107 세포였다. 따라서, 단회 채취의 25 ㎖의 말초혈로부터 면역 세포 요법에 충분한 수의 수지상 세포를 얻을 수 있었다.
(2-2. 증식시킨 세포종의 확인)
2-1.에서 배양한 3 및 14일째의 각각에서, 증식하고 있는 세포의 종류를 FACS 해석에 의해 확인했다. 3일째 배양물의 일부를 형광 표식된 CD14 항체(BioLegend사)를 이용해 조사했다. 14일째 배양물의 일부를 형광 표식된 안티-CD11c 항체(BD사) 및 형광 표식된 안티-CD83 항체(eBioscience사)를 이용해 조사했다. 모든 FACS 해석은 BD FACSCalibur(등록상표) 플로우 사이토미터(일본 BD사)를 이용해 실시했다. 이들 FACS 해석의 결과를 도 5 및 6에 나타냈다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 3일째 배양물에는 실질적으로 단구만이 포함되어 있는 것을 알 수 있었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 14일째의 배양물에는 실질적으로 성숙 수지상 세포만이 포함되어 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 2-1.에서의 증식 및 분화는 원하는 대로 진행되고 있는 것으로 확인되었다.
(2-3. 단구를 자극하는 공지의 인자를 이용한 단구의 배양)
2-1.과는 별도로 1-1.의 조작을 다시 행하여 단구를 분리했다. Flt-3L을 배지에 첨가하지 않는 점을 제외하고 2-1.과 같은 조건에서 분리한 단구를 배양했다. 이 배양의 각 시점에서의 세포수를 도 3에 나타냈다. 도 3(Flt-3L 비첨가)에 나타낸 바와 같이, 단구의 분화를 유도시키는 일반적인 이 방법에서는, 배양 14일째에 2.8×106/㎖까지 밖에 세포가 증식하지 못하였다.
이상과 같이, 본 발명에 따른 방법에서는, 지금까지 단구의 증식에 작용하는 것이 알려지지 않았던 인자를 이용함으로써, 의료 용도로 충분한 수의 성숙 수지상 세포를 얻을 수 있었다.
(2-4. NK 세포의 선택적 증식)
1-1.에서 얻어진 세포 집단을 다음과 같이 배양했다. 배양 0일째에서, 200 IU/㎖의 IL-12(Miltenyi Biotec사), 2000 IU/㎖의 IL-15(Cellgenix사), 80 ㎍/㎖의 안티-CD56 항체(BioLegend사) 및 5%의 자기 혈장을 KBM502 Medium(Kohjin Bio사)(1750 IU/㎖의 IL-2를 미리 포함하고 있다)에 보충한 배지를 이용해, 5% CO2 존재하의 38℃에서 24시간에 걸쳐 임파구를 활성화시켰다. 그리고, 5% CO2 존재하의 37℃로 배양 조건을 변경해, 14일째까지 세포를 배양했다. 배양 0, 3, 6, 8, 11 및 14일째의 각각에서의 세포수(세포수/㎖)를 트리판블루 염색에 의해 결정했다. 결정한 세포수의 경시적 변화를 도 4에 나타냈다.
도 4(IL-2, anti-CD56, IL-12, IL-15)에 나타낸 바와 같이, 0일째에 9.6×106 세포였던 세포수가 배양 14일 후에 8.8×108 세포까지 증가하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이상에서 증식한 NK 세포의 수는 대략 109 세포였다. 따라서, 단회 채취의 25 ㎖의 말초혈로부터 면역 세포 요법에 충분한 수의 NK 세포를 얻을 수 있었다.
(2-5. 증식시킨 세포종의 확인)
2-4.의 배양 14일째에 증식하고 있는 세포의 종류를 FACS 해석에 의해 확인했다. 각 배양물의 일부를 형광 표식된 안티-CD56 항체(BioLegend사)를 이용해 조사했다. FACS 해석을 BD FACSCalibur(등록상표) 플로우 사이토미터(일본 BD사)를 이용해 실시했다. 이 FACS 해석의 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 최종적으로 NK 세포만을 실질적으로 포함하고 있는 배양물을 얻을 수 있는 것이 확인되었다.
(2-6. IL-2만을 증식 인자로서 이용한 NK 세포의 증식)
2-4.와는 별도로 1-1.의 조작을 다시 행해, NK 세포를 포함하고 있는 세포 집단을 얻었다. IL-2만을 증식 인자로서 이용하는 점을 제외하고 2-4.와 같은 조건으로 이 세포 집단을 배양했다. 배양의 각 시점에서의 세포수를 도 4에 나타냈다. 도 4(IL-2)에 나타낸 바와 같이, 이 방법에서는 배양 14일째에 4.6×107 세포까지 밖에 세포수가 증가하지 못하고 있어, 충분한 세포를 얻을 수 없었다.
이상으로부터, 말초혈로부터 분리한 NK 세포를 선택적으로 증식시켜 원하는 정도의 수를 얻기 위해서는 IL-2만으로는 불충분하고, IL-12, IL-15 및 안티-CD56 항체 중 어느 하나가 적어도 필요하다는 것이 분명했다.
본 실시예로부터 분명한 바와 같이, 불과 25 ㎖의 단회 채취의 말초혈로부터 면역 세포 요법에 충분한 양의 수지상 세포 및 NK 세포의 각각을 얻을 수 있었다. 따라서, 검사를 목적으로 하는 정도의 양의 말초혈로부터 2 종류의 유용한 면역계 세포를 대량으로 얻을 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 방법은, 수지상 세포 및 NK 세포를 이용한 면역 세포 요법의 유용성을 높일(채혈을 받는 대상에 있어서의 시간적 및 신체적인 부담을 큰 폭으로 저감시킬) 수 있다.
본 발명은 전술한 각 실시 형태 및 실시예로 한정되지 않고, 특허 청구의 범위에 개시하는 범위에서 여러 가지의 변경이 가능하고, 다른 실시 형태 및 실시예에 각각 개시된 기술적 수단을 적절하게 조합하여 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
산업상의 이용 가능성
본 발명은 여러 가지 질환에 대한 면역 세포 요법에 이용할 수 있다.

Claims (9)

  1. (A) 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 말초혈로부터 단구를 분리해 단구 샘플을 회수하는 공정; 및,
    (B) 상기 단구 샘플을 배양해 단구를 증식시키는 공정;
    을 포함하며,
    상기 (B)의 단구를 증식시키는 공정은 상기 단구 샘플을 Flt-3L 및 GM－CSF를 포함하는 제1 배지를 이용하여 배양해 단구를 증식시키는 공정인, 단구를 입수하는 방법.
  2. 삭제
  3. (A) 말초혈로부터, 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 단구를 분리해 단구 샘플을 회수하는 공정; 및
    (B) 상기 단구 샘플을 배양해, 단구를 증식시키는 공정;
    을 포함하며,
    상기 (B)의 단구를 증식시키는 공정은, 상기 단구 샘플을 Flt-3L 및 GM－CSF를 포함하는 제1 배지를 이용하여 배양해, 단구를 증식시키는 공정이며,
    (C) 상기 제1 배지에 IL-4를 첨가함으로써, 단구를 증식시켜, 단구를 수지상 세포로 분화시키는 공정을 더 포함하는, 수지상 세포를 입수하는 방법.
  4. (A) 말초혈로부터, 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 단구를 분리하고, 단구를 분리한 후의 세포 집단을 NK 세포 샘플로서 회수하는 공정; 및
    (B) 상기 NK 세포 샘플을 배양해, NK 세포를 증식시키는 공정;
    을 포함하며,
    상기 (B)의 NK 세포를 증식시키는 공정은, 상기 NK 세포 샘플을, 안티-CD56 항체 또는 IFN-γ를 포함하는 제2 배지를 이용하여 배양해, 상기 NK 세포를 증식시키는 공정인, NK 세포를 입수하는 방법.
  5. (A) 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 말초혈로부터 단구를 분리해 단구 샘플을 회수하는 공정;
    (B) 단구를 분리한 후의 세포 집단을 NK 세포 샘플로서 회수하는 공정; 및
    (C) 상기 단구 샘플 및 NK 세포 샘플을 배양해 단구 및 NK 세포를 증식시키는 공정;
    을 포함하며,
    상기 (C)의 공정은 상기 단구 샘플을 Flt-3L 및 GM－CSF를 포함하는 제1 배지를 이용하여 배양해 단구를 증식시키고,
    안티-CD56 항체 또는 IFN-γ를 포함하고 있는 제2 배지를 이용해 상기 NK 세포 샘플을 배양해 NK 세포를 더 증식시키는 공정인, 단구 및 NK 세포를 입수하는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제2 배지는 안티-CD56 항체를 포함하는, NK 세포를 입수하는 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 제2 배지는 IL-2, IL-12 및 IL-15를 더 포함하는, NK 세포를 입수하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 말초혈은 개체로부터 단회 채취된 말초혈인, 단구를 입수하는 방법.
  9. (A) 말초혈로부터, 단구의 표면 마커에 특이적인 항체를 이용해 단구를 분리해 단구 샘플을 회수하는 공정;
    (B) 단구를 분리한 후의 세포 집단을 NK 세포 샘플로서 회수하는 공정; 및
    (C) 상기 단구 샘플 및 NK 세포 샘플을 배양해, 단구 및 NK 세포를 증식시키는 공정;
    을 포함하며,
    상기 (C)의 공정은, 상기 단구 샘플을 Flt-3L 및 GM－CSF를 포함하는 제1 배지를 이용하여 배양해, 단구를 증식시키고, 안티-CD56 항체 또는 IFN-γ를 포함하고 있는 제2 배지를 이용해 상기 NK 세포 샘플을 배양해 NK 세포를 더 증식시키는 공정이고,
    (D) 상기 제1 배지에 IL-4를 첨가함으로써, 단구를 증식시켜, 단구를 수지상 세포로 분화시키는 공정을 더 포함하는, 수지상 세포 및 NK 세포를 입수하는 방법.
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